Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ХАРАКТЕРИСТИКА КОАЦЕРВАТНЫХ СИСТЕМ ПО РАЗМЕРАМ КАПЕЛЬ И ИХ УСТОЙЧИЮСТИ

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ХАРАКТЕРИСТИКА КОАЦЕРВАТНЫХ СИСТЕМ ПО РАЗМЕРАМ КАПЕЛЬ И ИХ УСТОЙЧИЮСТИ"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ни. А.Н. SAXA

ГЛАДШШН Кирилл Львович

XAPAKTEFWCШСА КОАЦЕРВАТНЫХ СИСТЕМ ПО РАЗМЕРАМ КАПЕЛЬ И ИХ УСТОЙЧИВОСТИ

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой отесан» кандидата биологически* наук

Москва - 197*

<ґ" /о

1С-

АКАДЕМИЯ НАУК СССР ОРДЕНА ЛЕНИНА ИНСТИТУТ БИОХИМИИ ИИ. А.Н. БАХА

На правах рукописи

ГЛАДИЛ МП Ккрши Кыювич

ХАРАКТЙРИСША КОАЦКРЙАТНЫХ СИСТЕМ 00 РАЗМЕРАМ КАПЕЛЬ И ИХ УСТУЙЧМВОСЮ!

0S.00.04 - биохимия

АВЇОРьФЬРАЇ диссертации на соискание ученой степени кандидата Оиологических наук

Москва - 1974

Работа выполнена в лаборатории эволюционной биохимия и субклеточных структур Ордена Ленина Института биохимии ни. А.н. Баха АН СССР

Научные руководители; доктор биологических наук Т.н. Евреииоаа академик А.й. Опарин .

Официальные оппоненты; доктор хииических наук В.Н. Измайлова кандидат биологически! Наук т.к. Павловская

На официальный отзыв работа направлене на кафедру органической и биологической химии Московского государственного педагогического института ни, В.й. Ленина

седании Ученого совета Ордена Ленина Института биохимии ни. А.Ц. Баха АН ССС** (Цоскъа, Ленинский проспект, 33)

С диссертацией иохко ознакоииться в библиотеке Института

Просим прислать Вани отзывы и замечания по адресу: 117071, Иоеква, В-71, Ленинский проспект, 33. Институт биохимии им. А,Н. Баха АН СССР, ученому секретари» Института, кандидату биологических наук л.Н, Дьячкову.

Автореферат разослан " " ноября 1974г. Защита диссертации состоится " /9" декабря 1974г.

на за-

Гидрофильные коацераатные системы представляют собой жидкие двухфазные коллоидные системы, состоящие из ко ац ер ватных капель и окружащей их равновесной валкости. Они образуются при смешивании растворов различных полимерных веществ, молекулы которых имеют противоположные заряды при выбранной значении рН. Процесс образования системы сопровождаемся значительной концентрацией иолекул в коацерватных каплях. Ковц ентрационн ая способность капель, как это установлено в работах Т.Н. ЕврекиовоЙ, зависит от их размеров.

В теории академика А.К, Опарина о происхождении жизни коа-церватные капли рассматриваются как модель предклеточных структур - проб ион юв, не посредствен ко предшествовавших возникновении простеймих организмов. Предбиологический отзор таких фаэово-обособленных систем должен был происходить во их устойчивости, способности концентрировать различные соединения и характеру протекающих в них каталитических процессов. Включение в эти системы катализаторов, в том числе ферментов, превращают капли в термодинамически открытые си с теш. В результате про те кап-;я каталитических реакций химический состав капель иояет претерпевать изменения.

Однако, все известные коацерватные системы (более 220) были, как правило, неустойчивы: капли сливались, образуя слои. В 1968 г. Т.Н. Евреивовой и А. Бейлк была получена первая устойчивая система с уч^тиеи поли фен оло к сддазы и ее субстрата пирокатехина: фермент окислял субстрат до хинонов, которые стабилизировали капли, - эти капли хранились годами. Затем Т.К. Ев-реиновой и Т.Б. Иаконтовой были получены стабильные системы из. гистона и гуммиарабика и из гастона и ДШС при помоци перокси-даэы и ее субстратов пирогаллола к о-диашгэидаиа. Эти иескедо-

вания дали возможность подойти к ресенип вопроса об устойчивости коацерватных систем.

При получении многокомпонентных коацерватных систем с участием ферментов для моделирования в каплях лервкчиых форц оЗие-на веществ наиболее существенными будут те реакции, б результате которых образуются вещества, стабилизирующие кагаш, а также процессы синтеза полимерных соединений, остающихся в каплях, что долано приводить к увеличению их размеров. Для экспериментального маблэдения этих явлении и оценки эффективности проводимых в коацерватных системах ферментативных реакций могут быть привлечены следующие параметры системы; средний размер капель и их число как функция вреыепи и состава системы.

Следует подчеркнуть, что различные коадерватные системы начинает в последние годы все шире использоваться для нужд народного хозяйства: фракционирования различных веществ, приготовления фармацевтических препаратов, крашения тканей и других целей. Технологические показатели всех этих процессов также существенно зависят от размеров коацерватных капель.

До сих пор исследование размеров коацерватных капель проводилось при помощи различных микроскопкческих методов (Квреи-вова Т.Н. и др., 1966-К72). Несмотря на цепну» инфор нацию, получаемую этими методами, необходимость приготовления специальных препаратов ликает возможности следить за целый рядом процессов, происходящих в коацерватных системах - за повелением капель во взвеси, С другой стороны, определение размеров частиц дисперсной фазы в различных системах проводилось при помощи разных вариантов метода светорассеяния (Г.Un, У. Хеллер, к.Я. Слоник, Й.В. Цулейкин, Б.Л. Фихыан, Ь.К. Кленин, В.ІІ. Измай-

- Э -

лова в Др.}, однако, диаметр измерявшие при этой частиц Ев превосходил 2-3 ики. Первой задачей данное работа явилась разработка варианта метода светорассеяния, который позволил бы исследовать системы о более крупными каплями {диаметром до 10 шш) и бистро определять непосредственно в системах средние размеры н чнедо «алель, а также следить 8а изменением этих характеристик системы под влиянием различных факторов, в той числе, и ферментативных процессов. Представлялось существенным ВЫЯСНИТЬ также применимость данного варианта метода к измерению размеров некоторых биологических объектов - субклеточных структур я бак* тервй.

В данной работе мы ставили перед собой цель исследовать зависимость размера коацерваткых капель и их устойчивости в различных системах о* химического состава, концентрации компонентов и действия ферментов пероксидаэы и по линуклеотидфосфорила-вы. Выбор ферментов был обусловлен тем, что относительно первого из них было известно стабилиаируодее действие продуктов катализируемой им реакции на ряд коацерватных систем, а относительно второго - увеличение размеров индивидуальных капель при синтезе в них поли оцениловой кислоты. 1

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ I. Химические, препараты I* Для получения коадерваткых систем, несодеравен* ферменты, использовали: альЗумины - яичный (Рсазаш), а такхе сыворотки крови быка (Реапщ) и человека (А««?«/); гистон зобной железы теленка, любезно предоставленный Т.В. ИамоктовоЯ (1б£ азота на сухой вес); протаминсульфат из сперм лосося (сальшли) фирмы 3<АцсАагс/( I ДНК фирмы &ОН% полиаяек:'ювую кислоту

- + -

(по ли А) я полиуркдиловую кислоту (полиу> фирмы R»ana{ ; гуммиарабик фирмы M*rtk ; полифосфаты со средник числом полимеризации 40 (полвФад) и 290 (полиФ^), любезно предоставлев-ныв а.С. Кулаевыи н U.C. Крицкии; МФ фирмы олеат

натрия фирмы Baker ChemUal Со Î краситель нильский синий (Рваиш),

2- Для получения ковцерватных систем с участием ферментов использовали дополнительно: фермент пероксидазу (І.ІІ.І.7) корней хрена фирмы Light . (препарат лиофильно высуиенный, уд. активность 52Ô ед/ur) и ее субстраты - пирогаллол (1,2,8 -триоксибенэол), о-диваиоадин (4*, 4* - диаш?во-3',3' - дииегон-сибифенвл) фирш Ш и бензидин ( h , п' -дкашнодифенид) » пере кристаллизованный из спирта; особо чистый азид натрия для ингибирования фермента, а также све*е перегнанный иетанол для растворения о-дианиэидина л бензидине: фермент полинуклеомд-фосфорилаэу (2,7.7.8) иэ /УгоМясґгг viwlanJii, уд. активность 8,6 у.е. (I мг белка препарата катализировал использование 8,6 шшолей ЛДФ при синтезе пол и А за 30 мин. яри 87°С), любезно предоставленная л. Ф. Орловским, и из Escherichia toU , уд. активность 15,1 у.е., любезно предоставленная U. Таной.

П, Состав коааерватных систем А. Без участия Ферментов Л. I. Белок-белаовые системы

1. ГКСТ0Н-АЛЬБУМИН ЯИЧНЫЙ, рН 6,0 (в »и): НгО дистиллированная 0,375; 1% альбумин яичный 0,5; 155 г исток 0,1; 0,5$ КОН 0,025.

2. Г.'СТОа-АДЬБУЛИН СЫВДРСЯтеЙ ШИЛ, рН 6,0 (в ил.): Н^О дистиллированная 0,235; Т& альбумин сывороточный бычий 0,5; 1% гистон 0,1; 0,5% КОН 0,025 или Н^О дистиллированная

0,37; 0(5 е. яагрий-ацетатный буфер рН 6,0 - 0,01; 0,5$ КОН 0,02; 1$ альбумин снворототай бичий 0,5; 1% пістон 0,1.

А.2. В елкаво-яуклеияа вь;? ,си

3. ГИСШ-ДНК, ра 6,0 (я из,): Н^О дистил. 0,45; 0,5 Я натрий-ацегатный буфер рН 6,0 - 0,її 0,5? ДНК 0,2; 1$ гиотон 0,25.

4. ГИСгаКгШВДВШШШЯ КИСЛОТА рН 6,0 (я МЛ,}: Я20 дкс-тил. 0,ё;0,5 в 'натрий-ацетатный буфер рН 6,0 - 0,1; 0,5$ полиА 0,2; 1$ гистон 0,1.

5. ШСТОН-ООЛИУРИДНЛОадЯ КИСЛОТА, рЯ 6,0 (в ил.}: Н20 Дяй-ш, 0,6; 0,5 в ватриЙ-ацеїаїшй буфер рИ 6,0 - 0,1; 0,5$ пола? 0,2; 1$ гнетон 0,1.

А.З. Селково-углеаоаные системы

$. АЛШШШ СЫВОРОТКИ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА-ГЭТШАР АБИК, рН 3,4 (а ш): К20 яистяд. 0,25; 0,5 а иаірнй-ацететный буфер рй 3,40,2; альЗушш 0,25; 1$ гуммиарабик 0,3.

7. ГИСТОН-ГШШАРАШС, 1« 6,0 (В ши}і Н20 Діістші. 0,45; 0,5 в натряй-ацетатныйбуфер рК 6,0 - 0,1; 0,67$ гушкарабкк 0,25; 1$ гистон 0,2.

7а. ГИСТОН-ГШИАРАИК, рй 8,0 (а ЮИїКЛ, 0,58;

буфер рН 8,0 (1,5 II трио-НС І. + 0,01 Ы вврсен) 0,02; 0,67$ гуммиарабик 0,2; I $ гистон 0,2. Зла анасяения прачка устойчивости системы о поливундеотндфофрмеой ()£ п/п 27} в с ист сиу ?а добавляла в различных сочетаниях: 2,0$ И$С12 О,ОЙ; 2,ЕС АДФ рН 8,0-0,25; 0,01 И фосфатный буфер рН 8,0-0,25 (количество Н20 в этих случаях уменьшив для сохранена* величним конечное концентрации кошонентов састеш).

А.4» релирво-углеводво-олеатные сиотдц^

3. ГИСГОН-ГУМШЛГЛШС-ОЛЕЛТ, рв 6,0 <в ш): Н^ диеты.

0,3; 0,5 я ватрий-ацетатный буфер рН 6,0 ~ 0,1; 0,6756 гушма-рабкх 0, Э; К гас юн 0,3; 0,5$ олеат натрия 0,05.

9. ГИСГОН-ГУЦШАРАБИК-ОЛЕАТ - ШЬИШЙ СИНИЙ, їй 6,0 (в мл)і в20 лясіял. 0,5 н ивтрмй-вцетагный вуфер рН 6,0 -0,1; 0,671 румыиарабик 0,25; Ей Гистон 0,3; 0,556 олеаї натрия 0,05; 3% нильский синий 0,04.

А.5. Беяково-полифосфатвые сиотеш '

10. САЛКШ-ШШФОСШ(Щ, рН 6,0 (б ця.): я20 дистил. 0,3; 0,5 * ватрий-ацет атный буфер рН 6,0 - 0,1; салышк 0,5; 2,5% помну,, рН 6,0 - 0,1,

IX. С АЛ ЫЖН-ШЛЙС02ФАТ (29С?, рН 6,0, (в пл.): Н20 дисіил. 0,55; 1,5 и трис-НСбуфер, рН 8,0 - 0,1; 1,056 сальшш 0,25; 2,5$ пошФ^д 0,1.

Б. уорц^рь^тные системы с перокоидагой 5.1. Белок-Белковые системы'

12. ГИСТОН-АЛЬБТОЖ ЯИЧНЫЙ - ПіІОКСИДАЗ А-ШРОГАЛЛОЛ-ЮТПУ-Р0ГА2ЛИН, рН 6,0 <в ил): Н^О дистил. 0; 1,0% яичный альбуйна 0,5; 0,ОЕ» пероксидаэа 0,05; 1,0$ гистон 0,1; 0,556 КОН 0,02!?; 0,5? Н20^ 0,1; 0,2? пирогаллол 0,25; 0,26$ азид натрия 0,05 (через 30 сек.).

13. ГИСТОН-АЛЬБУМІН ЯИЧНЫЙ - перокСИДАЭА-О-ДИ АНИЗИДШ-ОКИС-ЛЕйНЫД о-ДКАНКЗИДШ, рН 6,0 (в мл): Н£0 дистил. 0,205; 1% шин) ааъЗушя 0,5; 0,01% пероксидаэа 0,02; 1% гистон 0,1; 0,5£ КОН 0,025} 0,5% Н202 0,1; 0,53» о-дианиэидин (в иетаноле) 0,05; 0,2б£ аавд натрия 0,05 (через 30 сек).

14. ПСЇОН-МШ&Ш СИЬОРОТОЧіШЯ ЕИЧИЙ - ІШРОКСИД АЗА-ЩРО-ГЯаЮ-ПїИВГЇОГЛГЛКИ, рН 6,0 (я мл): «20 диетил. 0,075; 1% аздЗукеи шзореточний бычий 0,5; пероксидаэа 0,1; Ті гис-

- ? -

ток 0,1; 0,5?j Ш 0,025; 0,5й Н202 0,lî 0,5% пирогаллол 0,1; 0,26% азид натрия 0,05 (через 30 сек.) или Н^О дистил. 0,12; 0,5 н натрий-ацетатный буфер, рН 6,0 - 0,01; 0,5%.КОН 0,02;

альбумин сывороточный бычий 0,5; О,OIS леронсидаэа 0,05; 1,0% гистон 0,1; 0,5% H2ûg 0,1; 0,5% пирогаллол 0,1; 0,26% азид натрия 0,05 (через 30 сек),

15. ГИСТОН-АЛЬВУШЇН ШаОРОЗДЧКЫЗ ШЧі^ДІШИЗідайЧЖ'-їСДБН-НЫЙ о-ДКAllifiЗИДІШ, рН 6,0 (в мл): К^О дистил. 0,185; 1,0% аль-буыин сывороточный бычий 0,5; 0,01% лероксвдаза 0,04; 1,0/5 гио-а'Он 0,1; 0,5% КОН 0,025; 0,5% К202 0,1; 0,5% О-диаиизадан (в метаноле ) 0,05; 0,26% азид натрия 0,05 (через 30 секУ илц Jij>0 дистил. 0,17; 0,5 а язтрий ацетатный буфер рН 6,0 - 0,01; 0,5%

КОВ 0,02; 1,0$ альЗушік сывороточный бычиК 0)5; 0,01% перокси-даза 0,05; 1,0% гистон 0,1; 0,5% н202 Її 0,5% о-днанизндіш <8 иетансле) 0,05; 0,26/i азид натрия 0,05 (через 30 сек).

Б.2. |елково-нуклеИ1ЮЕь;а системы с пероксидазоП

16. ГИС ЇШ-ДВК-ПЕРОК СЦД A3 А- ГШ РО Г АЛ Л ОЛ *ПУРПУР0 ГАЛЛ Ш, рН 6,0 (в ыл): HgO дистил. 0,05; 0,5 я н^трий-ацетагный буфер, рН 6,0 - 0,1; 0,5% ДНК 0,2; 0,01% пероксидаза 0,05; .1% гистон 0,25; 0,5% HgOj 0,1; 0,2% пирогаллол 0,25; 0,26% азид натрия 0,05 (через 30 сек).

17. гисюн-дш-п арок с ;їл аз A-û-д;: а; ш зі-хі і нжасгіп нк я о-діц-НМЗИДИН, pu 6,0 (в мл): Н20 дйсїил. 0,25; 0,5 н натрий-ацетатный буфер рН 6,0 -0,1; 0,5% да 0,2; 0,01% пероксидаэа 0,05; 1% гистон 0,25; 0,5% Н^Од 0,1; 0,S% о-диашізидіїи (в иетансле) 0,05; 0,26% азид натрия 0,05 (через ЗО сак),

16, ПІСТОН-ПСДЦАЦВіШОВАЙ КІіШТА-Пгітееі'ДАЗА-ГКРСГШОІ-ПУРПУРОШЛИН, рн 6,0 (в ил)! Н20 длетая. 0.& С,5 d аатрий-

ацетатный буфер, рН 6,0 - 0,1} 0,5% пол«А 0,2; О,ОСЕ пероксида-эа 0,03} 1$ гисюн 0,1; 0,5% И202 0,1; 0,2% пирогаллол 0,25; 0,26$ азид натрия 0,05 (через 80 сек),

19. ГИСТОН-ПОЛШЕШОВАЯ КИСЛОТА-ПЕРОКСИДАЭА-0-ДИАНИЗИДШ-ОКИСЛЕННЫЙ о-ДИАНИЗИДИЙ, ря 6,0; (л ш): Я£0 дне тил. 0,4; 0,5

а ватрвй-ацетатиыя буфер, рН 6,0-0, ідеволиА 0,2; 0,0025% лерск-сядаза 0,05;Вгяск»н 0,1; 0,5« Н^2 0>1} 0_дианиавдии (в цв-

ганоде) 0,05; 0,26? азид натрия 0,05 {черва 30 сек).

20. ГИСТОИ-ПОЛИЩДМОВАЙ КИСЛОТА-ИЕРОКСИДАЗА-ПИРОГШОЛ-ГОРПУРО ГАЛЛИЯ і рН 6,0; (я их): Н^О днстнд, 0,2; 0,5 н натркй-ацетатный буфер, рН 6,0-0,1; 0,5$ полжУ о,2; 0,0136 парокемдаза 0,05; 1,0$ гистоа 0,1; 0,5% ЙгОг 0,1; 0,2% пирогаллол 0,25; 0,26% азид натрия 0,05 (через 80 сак).

Л. ГЙСГОН-ПОЛЙУРШШЛОВАЯ КИСЛОТА-ПБРОКСИД АЗА-О-ДИАНИЗИДИН* ОКИСЛЕННЫЙ о-ДИАНЙЗИДИН, рН 6,0; (в ид): Н^О дистнд, 0,4; 0,5 в . яатряй-ацетатный буфер, рН 6,0 - 0,1; 0,5% ВолиУ 0,2; 0,0025% пероксидааа 0,05; 1,0%гистон о,іі 0,5% н202 0,1; 0,5% о-диаам-вядва (я метаноле) 0,05; 0,26% азид натрил 0,05 (через 30 сёк).

Б.З. Брдново-углаводиые система с реруксидааой

22. гаСТОН-І7ШІИАРАБИК~ПШ)КСИДАЗА-ШПЮГАЛЛ€ЛЧ1УРІ1УР0ГАЛЛИН, їй б,0;(в іш); Я^О дистил. 0,05; 0,5 н натрий-ацетатный буфер рН.й,0 - О,ЗДЯ-уыияарабин 0,25; 0,01% перовсидаза 0,05;Ягнстов 0,2; 0,5% Н202 0,1; 0,2% пирогаллол 0,25; 0,26% азид натрия 0,05 (через 80 нее). -

28. ШТ0Н-ГУ1ШАРАБШ[-ПЕР0КСИДАЗА-о-ДИАНИЗШШ-К)НИСЛЕШШЙ о-ДИАНИЗйДИН, рН 6,0; (в мл): Я^О дистил. 0,25; 0,5 я натрий* ацетатный буфер, рН 6,0 - 0,1; 0,67% гушенарабик 0,25; 0,01% па-роксидааа 0,05; 1% рнехон 0,2; 0,5% Н20г 0,1; 0,5% о-дианизидин

(s метаноле) OtOS; 0,26$ азид ватрия 0,05 (черва 80 сек).

г*, шсгон-гпгмиараеик-пероксйдаз а-бшзйдин-оішслшш в БЕНЗИДИН, рН 6,0} (В мл)ї я20 днстил. 0,25; 0,5 S натрвй-ецетат-ный буфер, рц 6,0 - 0,1; 0,67? гуммиарабик 0,25; О,Olí пероксм-дага 0,05; 1,0% пютон 0,2; Ú,5ÍH202 0,1; 0,5% бензидин (в метаноле) 0,05; 0,26% азид ватрия 0,05 (через ВО сед),

Б.4. Еелково-поянФфсаатные системы о п^р^ксцдарой

25. САЛЬШШ-ПОЛИФОСФАТ (40) ПЕРОКСИДЛЗА-о-ДИАЙИЗШШ-'ОКИС-ІШШЙ о-ДИАНЙЗИДИН, рН 6,0; (в мл); (¡¿О диствл. 0,85; 0,5 В натрий-ацетатный буфер, рН 6,0 - 0,1; 1,0? саль мин 0,25; 0,0025% пероксидаза 0,05; 2,5% полиФ^, рН 6,0 - 0,1; 0,5% H¿02 ОД; 0,5% о-дианнзидин (в метаноле) 0,05; 0,26% 6 s ид натрия 0,05 (через 90 сек).

26. САЯЬМИН-ГОЛИФОСМТ (290) ПЕРОКСЩЩА-о-ДИАІІИЗИДИН-f-ОКИСЛЕННЫЙ о-ДИШШДИН, рН 8,0; (s ш); Н£0 диоти. 0,85} 1,5 M трие-всг буфер, рН 8,0 - 0,1; 1,0% еальюш 0,25; 0,0025% пв-роксндава 0,05; 2,5% полиФ^ф, рН 8,0 - 0,1; 0,5% Hj02 0,1; 0,5% о-диавизидин (в метаноле) 0,05; 0,26% азид натрия 0,05 (через 30 сек),

В. Коааерватвне системи с пояннтп^отмлбосФормдзоа

27. ГИСТО Н-ГУиМЙ А" АБШС-ПОЛИЙШЕО ШДФОСФОРИЛ A3A-ПОЛ И АДЕ-ЙИЛОВАЯ НВСЛОХА-ОРТ040СФАТ, рН 8,0; (В мл)! Н20дастал. 0,295; буфер pïj 8.0 1,5 II (трис-НСІ t 0,01 II версен) 0,02; 0,25% по-ликуклаотвдфосфорилаза (по белку) 0,01; 0,67% гуммиарабик 0,2; 1,0% гиотон 0,2} 2,1% Ш, рН 8,0 - 0,25; 2,0% М$Сіж 0,025,

Среди перечисленных выше 27 различных во химическому составу кооцервахных систем - 10 приготовлено по прописям;Кережво-

вой Т.Н. {19-Збг.) - и 2; реповой Т.Н. и Мамонтовой Т.В. (1972г.)-ИЙ 3,7,16.Г?,22,23;Вунгенберг-де-Йокгу (Випделбегу Ж 7опд , 1930 3-Й 6 и Орловскому А.Ф. (1Э7^г,) 7а и 27; остальные IV полученыии наки впервые;

- в Кй 3,<t,ó,7, 16-18 и 23 концентрацию компонентов варьировали от 1/И до 4-х - кратной ло отношения к указанным выше;

- системы Ж 12-15, 18-21 к 24-26 стабилизированы паки впервые.

Ш. Методы исследования числа к размеров капель

I. Цатоя светорассеяния основан Согласно формуле Г. Ни -(I)) на зависимости оптической плотности системы от количества взвешенных в ней частиц, а так же от относительных размеров светорассеиващих частиц и длины волны света;

j)*AÍ1ZN/AP (i).

где D~ оптическая плотность системы, к - коэффициент пропорциональности, V ' средний обьеи частиц, А/ - число частиц в I мл, л - длина волны света в окружающей частицы среде, Р - показатель степени, зависящей от относительных размеров частиц и длины волны света.

Последовательность операции при определении размеров капель и их числа заключалась в следущем:

I) Изыерение оптических плотностей системы на спектрофотометре при двух длинах волн - £)f при Л ? и J)¿ при Я2 f 2> Расчет величины показатели р по формуле;

p- lf (D,/Dz)/Lg (Аг /Л,) (2), 3) Определение относительного размера капель оС по таблице зависимом» o¿ о i р

fc) расчет среднего диаметра капель по формуле:

где л* - показатель преломления равновесной жидкости}

5) Расчет среднего объема коацерватных капель со формудеї

б) Определение величины функции £ ( о<£ ), входящей 9 формулу (5), по таблицам;

?) Расчет числа капеяь в I ил системы па формуло)

где і - толщина кюветы.

При этом, опубликованные в то время таблиц» повволяли определять средний диаметр капель, не превышающий мкм, что ж 2-8 раза ыенькв теоретически возможного и необходимого для наших целей, Зля расширения воякожностей метода наш бымо пожучено в общем вида решение вадачи о подборе аппроксимирующих функций по способу средних и проведены соответствующие расчеты по трем составленным для ЦБК МИР-2 программам. В результате была достигнута возможность определения среднего размера капель диаметром до II ыкм.

Однако, приведенная выше стандартная последовательность расчетов требовала неоправданно длительного времени для получения конечных результатов, что значительно ограничивало возможности ислольеовавиа метода, Для преодоления этой трудности были подоораны функции, аппроксимирующие зависимости «¿от р {табл. I) и £ ( аС ) (табл. 2), составлена программа к ври помощи ЦВМ ШІР-2 по формулам (2-5) м подобранным функциям (см. табл. I к 2) рассчитаны таблицы для определения средних раамв-ров и числа капель.

Таблица I.

функция, алпроксишфусщие зависимость о6{ р)

Интервал- ' функция *>С (р)« 1 ¡Погрешность ап-|прокоимэции, %

0,1</>< 1,3 85,803ц/(р + г) 1,2

1.94р< 1,5 49,1990 - 18,6556 р 0.7

1.5<р<117 53,«00 - 21,5072. р 0,6

67,5686 - 29.7204р 0,7

2.0</><Э,9 ^(4.95411,62451) 1,5

Таблица 2.

функция, аппроксимирующие зависимость ¿Г {об )

Интервал Функция К ( ) ■ (Погрешность %

I ос 7 0,0013162 оС 4,36127 3,2

ч ос гь 0,0038173 Ы. Э'7ЭТ6 0.9

25 «6 41 10(4,3665 - 3?,в122/об) 1.1

^аЯлица, р. (Фрагмент!

для определения средних размеров и числа капель ' по отноиенив оптичзских плотностей системы при длинах волн I и 1,3 шт.

; а/А - Диаметр, { 0б«м, мкм I мкм3 ! А. ! ил I

• 1-М I 12 х:« # • • 10,02 527 9,88 505 9,74 484 9,61 464 9.47 446 « » » • * • 0,452 0.468 0.484 0,501 0,518 • ф»

По приведенной выше таблице 3 средние размеры коацерват-ных капель определятся непосредственно по отношение оптических плотностей системы при двух длинах волн света,- а число капеяь в I мл рассчитывают по формуле:

м(п,+1>гШ (б>

Возможность использования двух длин волн доопределения параметров системы была проверена экспериментально. Данные об оптической плотности с нот ем при различных длинах волн, заключенных между выбранными нами крайними значениями, лежат на сдвой прямой, наклон которой численно равен р , для определения величины р достаточно анать оптические плотдоот« системы при любых двух длинах волн*

О <¡4 а8$ 1,о Ш 1,15 1,1 Г,гу лз

-0,1 -о,*

-41

-О, г 191>

Гистоы - г</ммаара£их.

Гисто*-ДНК

СаЛЬГНЛН -/»»ЛИ

Рис. I. Зависимость оптической плотности (Х>) для различных систем от длины волнм овета (Л ).

Использование же только двух длив волн позволяет следить за процессами, сравнительно быстро протекающими в коацерватных системах. Необходимая точность определения параметров системы обеспечивалась соответствующим числом (5-10) параллельных »-сперимеятов.

2, Метод быстрой оценки рап'амвтров распределения микроструктур fio paaiiqpqif. предложенный С. А, Салтыковым, основан на той, что изображение множества капель, подлежащих измерении, проецируется случайным образом на сетку из параллельных, равноотстоящих линий. При атом капли разделяет на классы по размерам в зависимости от числа перечисленных или линий сетки. Шаг специальных окулярных сеток, любе»но предоставленных С.Б, Степановым, измеряли при помощи проецирования на них линейки обьекта-ыик-рометра. Абсолютные величины диаметров любого класса получали умножением числа перечисленных линий на шаг сетки. По данный измерений характеристики ассиметрии и эксцесса распределений расчитавы яа ЦШ ШР-2.

3. ЧикроДотографический метод использовали для определения распределения капель по диаметрам в неустойчивых коацерват-ных системах.

t-j руатистическая обработка экспериментальных данных проводилась по методу малых выборок. Необходимые расчеты выполнялись на цви ш-г,

5. Исследован^ биологических объектов проводили с цель» выяснения особенностей использования разработанного нами варианта метода светорассеяния для измерения размеров микроструктур и характеристика их.

ресцр^іеленид ядер и крахмальных зерен исследовали во фракциях, ядер зародышей пшеницы Краснозерная, любезно предоставленных H.A. Васильевой с сотрудниками. При этом установлено сходство характера распределения крахмальных зерен.и коацерват-ных капель - оба типа распределения близки к Максвелловскому (рис. 2, см. рис. 9), в то время, как распределение ядер близко

к нормальному.

Рис.2. Распределе-

нии в них ядер и крахмальных зерен, сопоставление паиных микроскопического анализа содержания ядер с отношением оптических ПЛиТЯООТей суспензии структур выявило тесную корреляции этих величин н позволило рассчитать таблицу для определения чистоты фракций при помощи метода светорассеяния (табл.

Таблица

Таблица для определения чистоты ядерных фракций по отношению оптических плотностей при длинах волн 0,8 и 1,0 мкы

Ъ/в* 1,45 1,40 1,35 1,80 1,25 1,20 1,15 1,10

Частота Фракции,% 71 75 79 83 ' 87 91 "5 95

Использование разработанного нами варианта метода светорассеяния позволяет в сотни раз по сравнения с микроскопическим методом сократить время, необходимое для определения чистоты ядерной фракции, а также следить ла эффективность*) -очистки ядер в процессе фракционирования.

- к -

Определенна средних размеров агрегатов бактериальных мембран было проведено методом светорассеяния для термофильного микроорганизма В ас і Сіп і ^«сдоЗДттгуїЬ&^препарвтн мембран лвЗеэно предоставлены Д.Н. Островским с сотрудниками). Установлено «вменение степени . згрегацки мембран на границах температурного интервала роста этого микроорганизма, «то связало, очевидно ( с перестройкой молекулярной организация мембран при этих условиях (рис. 3).

У0

I

б ч*

чо

Рис. 3. Зависимость от температуры среднего диаметра агрегатов момбрав Васіииі ^ іеагьіЬегтор л»/мі.

уо зо

ГйО* С

Если получениие в даинои случае результаты окажутся справедливыми к для других микроорганизмов, то При помощи этого метода можно будет легко определять температурные интервалы к оотималънуо температуру роста микроорганизмов.

- 17 -РЕЗУЛЬТАТЫ

2. Исследование устойчивости коадеоватны? нр

содержащих йермсита

Критерием устойчивости коацерватных систем является длительность сохранения индивидуальных коацерватаых капель* Исчезновение капель коже? происходить в результате их растворе-икя, расслоения системы, или образования фковкуяятов (хлопьев). Хахдыв из этих процессов легко регистрировать при помою метода светорассеяния.

В Ю различных по химическому составу коацерваишх системах, относящихся х 5 группам (белск-бедиои>й, белково-яуядеа-новой, белково-углеводной, белково-углеводно-олеатной я беяко-во-полифосфзтаоя) исследовано изменение во времени среднего я суммарного объемов коацерватных капель и их числа при помощи метода светорассеяния. При этом во всех коацерватных системах, кроне альбуиии-содержащих, установлено постоянство во времени суммарного объема коадерватных капель.

В системах, содержащих альбумины, особенно альбумин сывороточный, ухе в первые шшуты существования системы наблвдает-ся увеличение суммарного объема коацерватвых капель, связанное с увеличением содержания в них воды* а затеи уменъсенпе объема дисперсной фазы в результате растворения коацерватвых капель (рис, 4). Максимумы на кривых среднего и суммарного объемов соответствует соотбякио системы о максимально обводненными каплями, причем их относительный сдвиг объясняется различной скорость» увеличения размеров отдельных индивидуальных капель. За время, исчисляемое минутами (на препаратах) и часами (во взвеси) коацерватные капли полностью растворяются, это позволяет

N Ю*

мкм*

10

-.г

зо «««

Рис. Изменение во времени среднего С V ) и суммарного (V/ ) объемов коацерватных купель и их числа (ЛП » системе Гиотон - альбумин сывороточный бычий, рН 6,0.

рассматривать воацерватные системы с участием альбуминов как переходное к гомогенному раствору состояние системы, образующейся при смешивании растворов исходных компонентов. Большая устойчивость систем с яичным альбумином по сравнению с системами, соде рва ними сывороточный альбумин, по-вид иному, нмет: бить следствием различий пространственных структур этих белков.

Во всех системах в первые минуты после их образования наб-лвдается интенсивная коалесценция коацерватных капель, приводящая к увеличению их среднего объема и уменьиению в результате

слияния числа капель. Скорость коалесценции капель существенно зависит от концентрации исходных компонентов (рис. 5). Моделирование этого процесса на ЦВМ ЖР-2 показало, что скорость коалесценции коацерватных капель (в белково-нуклеиновых и бел-ково-угдезодных системах)может бытъ описана уравнениями, аналогичными уравветяи II. Сиолуховского для коагуляции (слипания частиц) в гидрофобных дисперсных коллоидных системах:

(7),

где /У - число капель в X мл системы, К - константа коалесценции, величина которое зависит от химического состава системы и концентрации компонентов.

Для большинства систем коалесценции капель характерна в течение всего времени их существования. Укрупнение капель ускоряет их оседание, а дальнейная коалесценция капель приводит к образованию коацерватвого слоя за время, исчисляемое часами.

Однако, в ряде систем начальный период интенсивной коалесценции заканчивается и система переходит в относительно стационарное состояние, К таким системам относятся белково-углеводно-олеатные системы, особенно с красителем нильским синим. Период стационарности с резким замедлением коалесценции наступает через несколько минут (рис. б). Оседание капель происходит достаточно быстро (10-15 мин), но осадок легко взмучивается. Образование коацерватного слоя происходит лить через несколько дпеИ. Устойчивость системы в данном случае обусловлена бифилышми свойствами и поверхностной активность!) олеата натрия, снижающего поверхностную анергию капель, а также сульфатными группа-' ми нильского синего, заряды которых могу; создавать энергетический барьер, препятствующий сближению и слияние капель.

.N40* 10

}оо ■ юо~ 100

Г7 Средний о5%Ім

Ы^О*

6

N'10*

10

V

тої"

л*

150

V /•ЛГЛ1

300

гоо Средний «¿ієн капель

100.

Средний

оіїі'м капель

5 ямч

———з-1——г--

Рис.5. Изменение во вранеим среднего обгена ( V ) и числа ( Н ) капель в систем» Гнстон-гуммиарабик, рН6,0:а - 2-кратная, б-однократная и в - половинная концентрация исходных растворов.

N ■гое

ю ■

5-

Суммарный капель V/

Число «оацербатнь/я ха/ге/>* N

Средний

Ш

гго

О.*

?0 чин

Рис. 6. Изменение вс времени среднего ( V ) я суммарного С \У) объемов коацерватныг капель и их числа (N ) в системе Гистон - гуммиарабик - олеат - нильский синий, рн 6,0.

хх>

т

V/

0-

сА*» IV

N

Средним каплль

Число яодч'Р'»'"''«* капель

/V

ю го за чо л? (о то $о эо то

Рис. 7. Изменение во времени среднего ( V ) и суммарного ( V/) объемов БОацерватних капель и их числа ( N) в системе Пистон - гумми - АДФ и Иу2*, рН 8,0.

В пользу последнего предположения свидетельствует также замедление коалесценции в система гистон-гуммиарабик болыиш содержанием гуммиарабика, что, как известно, обуславливает одноименный (отрицательный) варяд коацерватных капель. Аналогичное явление наблщалн в системах сальшш-полифосфат,

Наябольвей устойчивостью обладают капли о поли^осфатаии и в комплексом АДФЧі/* (Рио. 7), что представляет безусловный интерес в связи с биологическими функциями этих соединений. Такие капли способны сохраняться в течение месяцев и легко выдерживают центрифугирование в течение 5-15 пин при 500-1000 у , Устойчивость зтнх систем связана, по всей видимости, с наличием сильно диссоциирующих групп и особых расположением аарядов в полифосфатах и фосфатных группах нуклеотидов.

Проведенное исследование позволяет равделигь все изученные ковцерватине системы без участия ферментов на три группы по их устойчивости:

- неустойчивые системы о растворяющимися каплями*(альбуиин-содержацие оиотамы);

- оиотемы о более устойчязыии каплями, но в результате осе-дання а ноадеоценцим коацерватных капель происходит обравовенне коацервахного слоя}

системы устойчивые, осадки капель в которых легко оуспен-даруртся в течение длительного времени.

2. Зрйстряе пероксидааы щ й?ац§рватнр?; ща.я)?

Действие пероксидааы исследовали в в различных по своему соотаву коацерватных системах. Установлена возможность стабилизация любых коацерватЕшх систем, в том числе и содержащих альбумины, продуктами ферментативного окисления пирогаллола и о-диа-ияандина.

Г и Стон - a/tbSynun

V 14*«» N •10« W я»1 V f4KMt N •Ю* W Mft*

Л»- S- N г-...... ■ ■ SCO- S - е-

г»- ir г,*- 7. и- IS'

и/. •

s 1 ¿ мин . i

^ S пин

Пурпур О г а /глин---j— Окисленным о-дианижидин

Mtn?

toco-

• ÍQ* S-

vv

N V

w

mht*1

tso-

Ы v/

•10* я*'

to- го N ,------- ,

У- Ü . . -

w.---

о г о г

Гисоизн - поли/!

Рис. 8. Изменение во времени среднего ( V ) н суммарного ( V/ ) объемов коадерваткых капель, их числа (Ы ) в зависимости от продукта реакции, катализируемой пероксидаэой, в системах Гисто;* -альбумин сывороточный Зычий, рй 6,0 и Гистоа -полиА, рй 6,0,

Srtw

Обнаружено различное отноюеияе ноацерватных систем в га-висимостн от их состава к продуктах окисления пирогаллола и о-двааязвдияа. tas, коацерватнне системы, содержащие альбумины,.. в три чяоле и сывороточный, лучше стзбилизирувюл пурпурогадли-нок (продуктом окисления пирогаллола). Из всех изученных систем только система с полинуклеотидами лучше стабилизировались окисленным о-дяаниэидивом, чек курлурогаллином (рис. 8)« при этом для получения крущшх капель приходились уменьшать концевгра-цио фермента в S-XO раа по сравнении с другими системами^ в противном скучав капли стабилизировались настолько быстро и сильно, что крупные капли не успевали образоваться из мелких в резуль-' тате их коалесценции. Химический механизм стабилизации капель продуктами окисления пирогаллола и о-диацизвдина представляет собоИ самостоятельную тему и требует дальнейшего выяснения. Показано также стабилизирувдее действие продуктов окисления бев-зидваа. Стабилизированные капли сохраняются годами.

*

8. Зависимость числд и размеров коацепрзуиых капдл^ от конц^д^рации компонентов

Зависимость параметров системы от концентрации компонентов всоледовалв в 10 различных по составу коацерватввх системах, в том числе а о участием пероксидеэы. Установлено, что при увеля-чеааи концентрации исходных растворов в любой из исследованных

п

сиотем обраэуптся капля больвих размеров. Аналогичная картина наблюдается и при увеличении концентрации одного из компонентов (рис. 9), однако, количество капель при атом уменшается. Уменьшение числа капель набввдается также при уменьшении концентрация исходных растворов обоих полимерных соединений.

Расчеты параметров распределения на ЦВН НИР-2 подтвердили

Рис. Зависимость распределения коааематвых капель по диаметру (<*) и средних диаметров (л) от концентрации компонентов (указана на графиках; I - концентрация, давнее в лро.иси) в системах: (в) - Гистоп-гуммиарабик. рН С,0 к ф Гистон-падяА-пероксидвэв-пярогаллод-пурпу-рогаллин, рН 6,0; 1 концентрация гуммиарабика в 1,4 раза больше, чей укавшие в прописи.

достоверное отличи« распределения коацерватных капель от нормального распределения и указали аа большое сходство с распределением Максвелла. При увеличении концентрации исходных растворов величины показатели вссинетрин и эксцессс (положительный) распределения увеличивайтея.

Действие яолинуклеотидфосфорилазы исследовали в белково-углеводаой коацерватной системе. Установлено« что фершкгатав-ный синтез полиадениловой кислоты сопровождается увеличение»

Рис. 10. Изменение во времени среднего ( V ) и суммарного (W) объемов коацерватных капель и их числа ( N ) в системе Ристон-гуммиарабмя-полинуклеотндфосфорилаза Е. coU - - полиА - 4>н;- рН 8,0; 3?°С.

Рис. II. Изменение во времени среднего ( v ) и суммарного (уу) объемов коацерватных капель и их числа (Л/ ) в системе Ги стон-гуммиарабик-по линукл еотидфосфорилаэв А. vírte¿a1<Л*í - - полиА-Фи, рН 8,0;

37° С.

Данная система обладает устойчивостью, обусловленной присутствием ь ней субстрата и кофактора действия фермента - комплекса (рис. 12), Однако, устойчивость еистэиы с поли-нуклеотидфосфорилазой и ее суботратоы больше, чей гисхон-гушша-' рабиковоЗ системы с АЯФ-Ну2*: индивидуальные капли сохраняются в ней-на несколько месяцев дольше. Эта особенность может быть обусловлена образованней в результате реакции ортофосфата, которые оказывает значительное стабилизирующее действие на гиг-тон-гуммиаребяяовую сиотему. Стабилизирующее действие фосфата связано, по всей аддииосга, с его заряде» и взаимодействием в

Рис. 12. Изменение во времени среднего объема коацерватиых • капель ( V } в системе - Рдсток-гумциарабик (I) с

"адф (г), да к (3) к и^2+ (4)

ВЫВОДЫ

1. Для характеристики нет церватных систеи по степени устойчивости, а также числу и размеру капель находящихся во взве-иеняои состоянии в коацерватных системах, нами Сші разработав вариант метода светорассеяния; показаны преиьгувдества использования данного варианта для определения чистоты фракции субклеточных структур и подбора оптимальных условии для выращивании микроорганизмов.

2. При разработке данного варианта метода, составлен набор из 7 програш для ЦШ МИР-2 и рассчитаны таблицы, позволившие в десятки раз сократить время определения средних размеров и числа коацерватных капель, субклеточных структур и микроорганизмов по данный светорассеяния; кроме того предложен способ исключения систематической онибки измерений.

3. Подучены и исследованы 27 коацерватных систем, различных по химическому составу; из них стабилизировано б новых систем.

В зависимости от устойчивости исследованные системы можно разделить на следующие группы;

А. Нестабилизированные системы -

а. Системы неустойчивые, капли в котопых растворяются за время, исчисляемое десятками минут - системы, в состав которых входят альбумины, особенно сывороточный альбумин;

б. Системы с. более устойчивыми каплями, которые, хоалес-цируя, образуют за несколько часов коацерватный слой, - это системы, в состав которых входят гистон и гуммиарабик или гне-тон и полинуклеотвды;

в. Системы устойчивые - время существования купель от

нескольких дней до месяцев; по степени возрастания устойчивости они могут быть расположены в следугаем порядке: гистон-гуммиа-рабшс-охеатные, гистон-гушыарабик-нукяеотйдвые, проташн-поли-фосфатвне.

Б, Стабилизированные системы сохраняются годами; установлена возможность стабилизации коацерватных систем любого состава, в тон числе и содержащих альбумины, с помощь» продуктов катализируемого пероксидазой окисления пирогаллола и о-дианиэидкка; отмечена преимущественная стабилизация систем, содержащих альбумины, пурлурогаллкном, а систем с полинуклеотцдами - окисленным о-дканизндином; показано стабнл и вирувдее действие продуктов окисления бензидине.

5, Продемонстрировано, что ферментативный синтез полиаде-ннловой кислоти в коацервахной системе сопровождается увеличением среднего и оумиарвого обьемов капель.

6. Результаты работы показали возможность быстрой региотра-

г

ции влияния на коацерватные системы различных факторов; химического состава, концентрации соединений, солей, температуры, действия ферментов и других, что имеет значение для усовершенствования коацерватных систем как предклеточных моделей.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

1. Гладили» Я.Л. Кинетика образования коацерватных капель. Второй Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы докладов на симпозиумах, "ФАН", ІЕИКеят, 1969, стр. 20.

2. Гладилин К.Л, 0 некоторых особенностях математической обработки результатов биохимических экспериментов. Докл. № СССР. № I, 226, 1972.

3. Гладилин К.Л, Изучение устойчивости коацерватных капель.

В сб. ".Проблемы возникновения и сущности жизни". "Наука", а., 1973, стр. 115.

Гладилин К,Л., Орловский А.Ф., Евреинова Т.Н., Опарин А.И., Определение средних размеров и количества коадерватных капель по спектру Тиндаля. Докл. All СССР, 20$. ü 4, 995, 1972.

5. Гладилин К.Л., Орловский А.Ф., Кетод подбора аппроксимирующих функций. Докл. АН СССР, 211. К; I, 230, 1973.

6» EvT«lnove Т.К., GlötflliP- K.I.,, stephenov 9.В., Khnrrnuho* V.W., Action of the o*tdo-r«<iucteeee In eoacerv»-te eye tens, Afcatr. of the It International Biochemical Соп^хевв^ STockiwln, 197J,p.4? 5,

7. Гладилии K.J!., Орловский А.Ф., Мамонтова Х.ь., Бврсинова Т.Н., Характеристика коацервэтных скстеы но числу и размеру капель. Биофизика, XIX. Ii 2, 260,

8. Гладилиü К.Л., Стефанов С.Б., Орловски»; A.i,, Хотчеысов В.Л.,

Васильева U.A., Островский Д.Н., Иврекнова Т.Н.. Определение

размеров субклеточных структур и коадерватных капель оптическими методами. Тезисы до,-ладов на Всесоюзном совещании

"Проблемы автоматизации анализа изображений микроструктур".

Пущино, 12-18 мая 1974.

9. Гладил ин . ji., орловский А.4>., Кирпотии Д.Б. О квантово-ме-ханическои подходе к проблемам происхождения жизни. Третий Всесоюзный биохимический съезд. Тезисы докладов на симпозиумах. Рига, 14-IS октября, 1974,*7у>.

10. Орловский А.®., Гладилин К.Л., Бухласва о.Н., Евреинова Т.Н., Действие полинуклеоткдфосфорилазы в белково-углеводиоН коа-церва'тной системе. Материалы Ш Всесоюзного биохимического съезда, г. Рига, It-I8 октября, , i>'o.

Материалы диссертации бмли доложены автором на:

1, Всесоюзно!! иколе-конфсрещии по эволюционное биохимии, Цоа-

жпнка, март 1969г.

2. Втором Всесоюзном биохимическом съезде, г. Ташкент, октябрь 1969г.

3» 1У Международном биофизическом конгрессе, г. Москва, 7-14 августа 1972г.

4, Всесоюзной совещании "Проблемы автоматизации анализа изображений микроструктур", г. Пунино, 12-18 мае, 1974г.

5. I Всесоюзной конференция по использованию малых ЭВМ, г. Обнинск, 1-6 июля 1574г.

■ 6. Международном семинаре "Происхождение жизни", г. Ыоснва, 2-7 августа 1974г.

7. Третьем Всесоюзном биохимическом съезде, г. Рг.га, 14-19 октября 1974г.