Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика и механизм функционирования рецепторов тиреоидных гормонов на плазматических мембранах

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Характеристика и механизм функционирования рецепторов тиреоидных гормонов на плазматических мембранах"

РГ6 од

2 6 ЛПР ШЗКАДОШ НАУК РЕСПУБЛИКИ УЗБЕКИСТАН

ИНСТИТУТ шохидои

На правах рукописи

ЯКОВЛЕВА Наталья Николаевна

ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕХАНИЗМ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ДОПОРОВ ТИРЕОИДНЫХ ГОРМОНОВ НА ПЛАЗМАТИЧЕСКИХ [МЕМБРАНАХ

03.00.04 - биологическая химия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

ТАШКЕНТ - 1993 г.

Диссертационная работа выполнена в Институте биохимии Академии наук Республики Узбекистан.

НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:

член-корр. АН РУз, профессор Т.С.СААТОВ

кандидат биологических наук Ф.Я.ГУЛЯМОВА

ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:

доктор биологических наук, профессор А.А.АБДУКАРНМОВ кандидат биологических наук С.Н.ДАЛИМОВА

Ведущее учреждение: Ташкентский Государственный университет

Зашита состоится „1993 г°Да в час

на заседании специализированного Совета Д 015.16.21 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук при Институт биохимии АН РУэ (700125, г. Ташкент, проспект М.Горького, Ьб).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института • биохимии АН РУо.

Автореферат разослан "

Учёный секретарь специализированного Совета, доктор биологических наук

С.А.БУРХАНОЯ

ОБЩ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

.... •i-.^НМЮЛ м-

■■ *l.f HI I' '

Актуальност¡__проблемы. Учение о рецепторах станов. последнее

:я одним из валснвПших разделов биохимии и молекулярн<$,?б|^оло);ии. играет исключительно важную роль в изучении процессов .Ъшнояоя -■иости, в понимании михонинмов гоме.огтама и натогннегт радличинч 'Леваний. '

Всесторонние исследования механизмов действия гормонов шито-(ой железы за последние 2Ü лет привели к созданию теории.рсали-iи их биологической активности. Основное положение ?тоЙ теории ¡ano с понятием "рецепторы", которые ответственны за;специфимес-связывание тиреоидных гормонов и преобразование гормонального 1ала в тот или иной вид биохимической и физиологической.реакции. Основой механизма действия тиреоидню гордонов считр££ря вза-юйствие их с ядерными или митохондриальиыми рецепторами. ( Tata, 2; Lennon et al., 1903; Nunes, ^OfeKi^shi^efc, _ ).

uto вопрос, в какой форме тиреоидрь^.r^^Qi^^Mí^ffijj'ilvrpb •ок, окончательно не решён. Hl{9f¡ ¿. -

Долгое время считалось, что тиреоидные гормоны, имея сравни-.но небольшую молекулярную массу...и, в-, силу своей гидрофобности, отдельно свободно диффундируют в клетку, осуществляя своё влияние ;з внутриклеточные структуры ( 3terling et al., 1У75; Као et al., l). Установлено также, что на уровне плазматических,мембран ПШ (сходит декодирование тироксина (Т^Х, и образующиеся, при.этом мо-глы трийодтиронина (Тд) внедряются ,внутрь клетки (, Viaaer( 1988). зторые авторы утверждают, что в мембране клетки Т^ и.Tg- связыва-i с белковыми фракциями, которые но электрофоретической подви&нос-:холнн с преальоумином сыворотки крови, отмечая большее сродство i этой белковой фракции, чем Тд (Аблукаримой, Т979;;:Мирахмедов и , 1963),

-'пвизпя мембранную теорию действия тиреоидных гормонов. ClharM. reñatii (1979), показали наличие связьшшо'лих; мест! для Т^ и Тд на аенных ПМ печени крыс. Дальнейшие многочисленные исследования, зрлённме в атом направлении, подтвердили наличие рецепторов для

джднкх roxm-y-io:> на ПМ клеток печени, йиброелнетоя, лимфоцитов и гьлиаяымх клою.ч моличных ::-.елёз 'v''lwe oí. ui.. »¿»хЛ<?Ы

. 4 fV, ; A1 :' - .'VI oí .4.1... ГУ."]«'. ".1 , . 11ЯП;

... : ■ , ■ ., I ).••'■/! ; . - ji. .-'.i . : r, ! . , , /К; I ,

Несмотря № большое количество работ, выполненных с целью и: чыщц различных физико-химических характеристик внутриклеточных рецецторов тиреоиднцх гормонов,и исследования рецепций гормонов товидно* желеэц на ЯК еТЭИВЧНРИХ органов, лрирода эти* рецепторе не выяснена до конца и эксщэрнментедьный материал, накопченный * сегадндащи* день, не достаточно чётко ответить на вагц

о рцщи мембранной рецепции 9 цеханизце действие гормонов щитовил щедеаы, '

0 связи о этим, исследования по выделению, очистке и функци ной характеристике белков, связывающих тиреоидные гормоны на ИМ, лаются весьма актуальными как для выяснения роли мембранной реце # Механизме действие тиреоидных гормонов, так и для изучения пат неэа эндокринных заболеваний, обусловленных нарушением чувствиге ности клеток-мишеней к гормонам щитовидной железы (гипотиреоз, г иертиреоз),

• Цель и задачи работу.- Целью работы явилось получение высоко! щенного рецептора тироксина из ЦЫ печени крыс.

Длд достижения этой цели были поставлены следующие эксперим< Тальные задачи: ,

- Исследовать связывание тироксина 0 рысокоочищецными (Ы не" ни крыс.

- Изучить влияние физиологических доз тироксина И различное тиреоидного статуса организма на активность системы АС-сА*1Р в выс коочцщенных фракциях ПОД Цеч§ни крыс.

Выделить и очистить рецептор тироксина из [11.1, исследовать свойства и условия проявления биологической активности.

.Научная новизна работы, С помощью аффинной хроматографии раз работай метод выделения и очистки белка, связывающего тироксин ин 1Ш.' Впервые нами из ПМ печени крыс выделен и очищен рецептор тира ■сипа. Определены молекулярная масса, аминокислотный состав и пара метры функционирования рецептора. Осуществлён процесс встраивания рецептора в. фосфолипидную мембрану и восстановления его функциона ной активности.

11а основании данных исследований показано, что конформацня р цептора, обеспечивающая его взаимодействие с тироксином на мембра определяется и стабилизируется окружающими линицными попакулам и.

Научно-практическая ценность работы, Основные результаты настоящей работы позволяют сформировать положение о важной роли "мембранного этапа" в процессе рецепции тиреоидных гормонов й вычленить его как отдельную стадию в реализаций их биологического действия, а также являются теоретическим обосновакчем целесообразности и перспектива ;и дальнейших исследований, направленных на Выявление изменения структуры и функций рецептора В условиях гипо - и гиперти-реоза.

Методические приёмы, выработанные в процессе данного исследования, могут быть рекомендованы при работе, связанной с изучением ре-цепторных белков плазматических мембран.

Апробация работы. Результаты работы доложены на III Всесоюзном симпозиуме ilo биохимии лкпидов (Алма-Ата, I9B7), на Iii Всесоюзном съезде эндокринологов (Ташкент, 1989), на X объедийённом симпозиуме биохимических обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности" (Ташкент, 19СЭ).

Публикации. По теме диссертаций опубликовано 4 печатные работы.

Объём и структура работы. Диссертационная работа изложена на 1 116 стр. машинописи, состоит из введения» обзора литературы, "описания методой исследования, изложения полученных результатов й Их обсуждения, Баключения, 'выводов iTсписка цитируемой литературы (217 ссылок), иллюстрирована 12 рисунками и 7 таблицами.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования служили самцы беспородных белых крыс массой 150-200 г.

Высокоочищенные ГШ из ткани печени крыс выделяли по методу Ray (1970) в модификации Воейкова (1976)♦ внося свои изменения. Чистоту выделенных мембран определяли по увеличению активности мар- • кёрных ферментов (ö'-нуклеотидазы и АТРаэы) в процессе очистки. Все. процедуры осуществляли при 4°С. Белок в пробах определяли по методу Lomfy et al», (1951). .'".'■

Связывание Т4 с высокоочишенными ПМ печени крыс й очййенным мембранным рецептором Т4 определяли радиолигандным методом с Использованием метода Gharbi, iorresani (1979).

Активность аденилатциклаэы определяли по методу Sutherland et al (1974). Уровень активности аденилатциклаэы рассчитывали но

3 / '

степени наработки проекта реакции - сАЫР.

Экспериментальный гипертиреоз у крыс вызывали путём внутрибрю-шинного введения Т^ в дозе I мг/кг массы тела животного ежедневно . в течение 5 дней и забивали на 6-ой день после последней инъекция. Эксперименты на тиреоидэктомированных животных проводили через 7 недель после удаления щитовидной железы.

Ферментное ингибирование изучали при предварительной инкубации ГШ в течение,I часа при 22-24^С в присутствии фосфолипазы Ag или трипсина. Частичное удаление липидов из мембранных препаратов" проводили по методу Rethy et al. (1972),-используя органические растворители.

Выделение и очистку рецептора тироксина из ITJ П-ч^ни крис осу— шествляли с помощью аффинной хроматографии. Аффинный сорбент синтезировали путём последовательного присоединения эппхясргидрпна и Т,, к сефарозе по методу, предложенному Свиридовым и др., ([989). ол>\-~ трофорез белков в пластинах с линейным градиентом (IO-I&*) ПААГ (по-лиакриламидный гель) с SDS (додецилсульфа.® натрия) проводили но методу Laemmli (1970). Аминокислотный состав очищенного рецептора Т. определяли по методу Cohen et al, (1988) с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии аминокислот в виде фенилтиокарб';-ыильных производных. .Определение сиаловых кислот в молекуле рецептора Т/, проводили, используя однозтапный резорциновый метод,'предложенный Svcnnerholm (1957).'Реконструкцию очищенного рецептора осуиз -ствляли, используя липосомы, полученные из общих фосфояипидов IL.1, используя общепринятые методы реконструкции рецепторов.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУВДЬШЕ

Белки, рецептирующие тиреоидные гормоны, в большом Количестве находятся в различных компартментах клетки - ядре, митохондриях'к цитозоле. В связи с этим, изучение связывания Т^ с ГШ клеток пег' чени и получение фракций очищенного рецйптора Т^ из мембран диктуют иеобходимост использования препаратов, изолированных ГМ в достаточно чистом виде,

В'выделенных нш.сл препаратах ПМ клеток печени обогащение маркерном и ферментами 5 ■ -нуклеотидазой и АТРазой было а 10-40 раз выше а сравнении с■ гомосенатом. О чистоте выделенных мембран судили твкжо по отсутствии) карпшшшшм, характерного для мембран мнтихонд-

рий, и высокому уровню сфингомиелина, установленному нами при определении фосфолилидного состава ИМ.

I"

Исследование рецепции тироксина на Ш.

! • •^¿.•шки мембранной рецепции титоксинэ было установлено.

■■'-•о .. .. евчоь-впиие (lcJI)T.j устанавливалось через I чпе и

оеТо-.-, "" —«<••• я течение 2-х часовой инкубации как при 4JC,

' ; . i ...О v

Связывание плазматическими меыбранаыи характеризуют специфич-

■ ■ t ¡и ><•■■".' СпенифмчнсгП' "йя.'лл.'снил

1. " 1 /¡.^ : _ .:!.j;í:; ч^.м ;:0лпчес7'Г"- чОраКНМХ бел-

«■fir от 50- до 250 мкг/мл d опытах с добавлением избытка немеченого

т-лпипна imiívuaUnJiiu,,!« ¿'„".ZCZ. <

•íoHKyрентный анализ показал значительное подавление сьноьшашш I'Т г мембранами при добавлении я среду стабильных Т^ и Тд. Ре-рспшшй Т^ (р'^з1 бил наименее активным п конкуренции за связывающие места. Добавление Тд в- концентрации 10~^М приводило к вытеснению лишь 45Í меченого тироксина, что, по-видимому, говорит о различных участках связывания для двух гормонов на ГШ. Такое предположение вые-казинолось ч другими исследователями ( Gharbi et al., 1979; Krenning — . ! ¡ ; nUK'tSaWli, что 7-;, и T,¡ ::ересекппт гслеточ-

■<-■-.-к. г.-;- т^лпг-ц^ртнце системч и. '/кпзияаям на b.?jt-

■ V" ¡:: :'-">• : .ч "'Т';-. >•' - •■i'1., ¡"¡члето'-чюго ATP -.у) ом преиееое.

;>. 'Су..-. m;uuv\ man г па присутствие двух :ш:о« с»я-'¡'^ :n lü.í ;:гчг!Ч1 кру с (рис.!. , Нервы!'! тин хзтк~ ' •';'.--¡l¡;votoa ееодггвп! и iiv;cjkc?í емкость«).второй тип - низким

Г-здстрсм и «чсоксй емкостью, но с трудом поддающийся насиаению. Ре-узьазты иазтх исследований соответствует данным ( Pliam efe ai.. (1977), Gharbi et al ., (1981). :

Ъодиркиятые нами попытки г.снольэопать электрофорез в ПААГ для • (•лентпйжкашш белков Í!i4. еяламваодмх тироксин, оказались бсзуслеш-ними: в процессе электрофореза

высвобождался из комплекса со езлзываюшим белком даже в отсутствии SDS .

РисЛ. Связывание тироксина с ПМ печени крыс в координатах Окэтчарда.

По оси абсцисо - количество связанного гормона (пкг Т4/ЮО мкг белка ПМ), по оси ординат В7и ,' где и - концентрация свободного гормона (пкг). Ка выражена в МСЁ -в пкмоль Т4/мг белка.

Влияние триписна, фосфолипазы А^ и частично^ делигщдизацин на связывание тироксина с 1Ы. *

Для характеристики биохимической природы компонентов ПМ клеток печени, связывающих Т4, бцла поставлена с педаль пая серия экспериментов, в которой изучалось связывание гормона при действии на мембрану трипсина, фосфолипазы. А^ И частичной делипидизации.

При предварительной инкубации ПМ с фосфолипазой А^' и частично}! делипидизации (М, мы' наблодали ингнбирование специфического связыва Ния Т^ на 30-501, причём, практически полностью исчезали места связывания с высоким сродством. Полученные Данные свидетельствуют оО активном участии липвдов во взаимодействии горюна с рецепторов.

Связывающий компонент ПМ состоит (по крайней, мере частично.) из

6 - '

¡елка, поскольку обработка трипсином, нарушавшая целостность ¿Н -•рупп, приводит к снижению способности связывать Т^ на 60-70% (таб-

!ица I).

Таблица I.

Подг- ,'г>акие модифицирующими агентами специфического связывания с ПМ клеток печени крыс.(в % от максимумап=8).

Ингибитор

1 Специфическое связывание

Трипсин

20 мкг/мл 50 мкг/мл

Фосфолипаза Ао 50 :.1кг/мл 100 мкг/мл

Мягкая делипидиэация Без дейстг !я ингибитора

27,9 + 9,3 22,2 ± 4,7 *

58,4 í 5,1 42,0 ± 6,7 *

79¿3 + 3,7 100

* - достоверно по сравнению с Контролем (Р<0,05)

Аналогичную картину наблюдали Segal at al., (1986), исследуя влияние трипсинизации на связывание 3,5,3'-трийодтиронина, при инкубации ПМ тимоцитов с различными концентрациями трипсина.

Подавление специфического связывания, в случае модификации ли-пиднога состава мембранных препаратов, наблюдалось при исследовании рецепции ряда других гормонов ( Cuatreoasas, 1972j ЛевиДж., 1979).

На важную роль фосфолипидов ПМ в проявлении активности физиологически активных пептидов указывали и другие авторы ( Ginsberg et al. ' 1332} Parese, 1984; Каори и др., 1985;Кульберг, 1987), предло-

жившие гипотезу, согласно которой лиганды» сзязываясь с фосфолипида-ии мембран, преобретают конформацию, необходимую для их взаимодействия с рецепторами, что служит причиной активности этих пептидов только при наличии фосфолипидов мембран.

Влияние тироксина на активность аденилатциклазы.

Один из главных путей действия гормонов с поверхности клеток осуществляется через взаимодействие гормон-рецепторных комплексов с меыбршн"д« ферментом аденилатциклазой (АС), в результате чего образуется сАМР - универсальный посредник действия гормонов на клетку.

Аденилатцикяаза активируется многими гормонами,- и, в частности, гипоталамическими нейрогорыонами, тройными гормонами гипофиза и т.д., рецепторы которых расположены на ПМ ( Robinson et al„( 1971i Шаляпина и др: , 1986). Исключение составляют инсулин и соматостатин, которые ингибируют АС при взаимодействии с рецептором на'ПМ ( Czech et al. 1905 s Сергеев и др., 1987).

В отношении тиреоидных гормонов считается, что основой механизма их действия является взаимодействие с ядерными и митохондриальиы--ми рецепторами ( Aranda et al., 1984; Sterling et al., 1989 ).

Несмотря на то, что в последние годы появились работы, доказывающие наличие рецепторов тиреоидных гормонов и в мембране клеток (Alderson et al 19Q5* Frenvo et al., 19S9| Michalac et al»,1989i Goncalves et al., 1990 ), вопрос о действии гормонов щитовидной._же-лезы на систему АС-сАМР остаётся дискуссионным.

Результаты наших опытов по связывании тироксина с высокоочишен-пыми Ш печени крыс, описанные в предыдущем разделе, позволяют предположить тесную функциональную связь между рецептором тироксина н АО системой. ' -

Для.подтверждения этого предположения нами проведено исследование изменения активности АС при различном функциональном состоянии щитовидной железы и в зависимости от физиологических доз тироксина на аысокоочищенных ГШ печени крыс.

Установлено (таблица 2), что гипертиреоз повышает базальную активность АС на 52$. У тиреоидэктомированных животных наблюдалось падение активности АС на 63&.

При добавлении тироксина к ПМ нормальных крыс в дозе 10"%, активность АС повышалась на 32%, тироксин в концентрации 10~®М активировал АС на 54$. Данные опытов представлены В таблице 3. Как видно из таблицы 3, у тиреоидэктомированных животных наряду с резким подавлением базальной активности (на 63,4$) аденилатциклазы ГШ, почти полностью исчезает её отзывчивость к тироксину, что, по-видимому, «вязано с уменьшением количества рецепторов этого гормона на мембране три гшютнрео:ч!.

. ' • В •

Таблица 2.

Активность АС в высокоочищенной фракции ПМ нормальных, гипертиреоид-

ных и тиреоидэктомированных крыс (пМ сАМР/мг белка/мин т=6).

Показатель

условия | Контроль ! Гипертиреоз ! Гипотиреоз

Активное;-ь АС

22,7 + 2,8

34,7 + 1,3м

8,3 + 1,2*

а - достоверно по сравнению с контролем (Р < 0,05)

Таблица 3.

Влияние различных доз тироксина на активность АС а высокоочищенной Фракции ПМ нормальных и тиреоидэктомированных крыс (пМ сАМР/мг белка/мин п =6)

^ Вид Í

Груп^аоздействия !

"Г I

Контроль !

животных

Т^М

I.

Норма Гипотиреоз

22,7 + 2,8 ' 30,0 + 1,6s 35,1 + 2,1й 8,3 + 1,2 8,2 + 0,9 8,7 + 1,1

« ~ достоверно по сравнению' с контролем (Р < 0,05)

Наши данные коррелируют с результатами исследований других авторов ( Levey,'1976} Далимова, 1982; Segal, 1989 ), изучавших влияние Тд на активность системы АС-сАМР на: грубых фракциях ПМ.

Таким образом, наши данные и данные ряда исследователей свидетельствуют, что аденилатциклазная система играет определённую роль в гзханизме действия тиреоидных гормонов, а большое активирующее влияние тиреоидного статуса организма на АС систему связано с тем, что ПМ печени крыс обладают высоким сродством к гормонам щитовидной :;елезы.

Эффект Тд на активность системы ЯС-eA..íP убеждает в том, что

• . труженные пьи-окоспеци Личные Г^-связываюшие участки, локализованные в ИМ líiit,.^, печени является не чем инчм, как рецепторами Т.^.

о .

Очистка рецептора, связывающего тироксин из ПМ печени крыс.

Очистку рецептора тироксина из ПМ печени крыс осуществляли методом аффинной хроматографии.

В качестве агента, модифицирующего и активирующего полисахарид-ную матрицу сефарозы 4В, использовали эпихлоргидрин.

При выборе способа активации матрицы руководствовались следующими положениями.

При непосредственном присоединении тироксина к сефарозе, активи роеанной бромцианоы, возникают стерические препятствия коип'зксооб-разованив иммобилизованного гормона и рецептора, а химическая связь меаду матрицей и тироксином обладает повышенной лабильностью.

Характеризуя химическую структуру аффинного сорбента, полученного в результате активирования сефарозы 43 эпихлоргидрином, следует отметить, что молекула Т^ отделена от поверхности полисахаридной матрицы алифатической пространственной вставкой из трёх углеродных атомов, т.е. иммобилизована через длинную 2,3-эпоксипропакси группу. Длинная пространственная вставка обладает собственными абсорбционными свойствами, а присоединённый к ней лиганд легко доступен для Т^-связывающих белков (Свиридов и др., 1989),

Полученные нами после обработки сефарозы 4В эпихлоргидрином активированные матрицы содержали 20-25 мкмоль эпоксигрупп на I мл геля.

Аффинный сорбент, синтезированный на основе.этой матрицы, содержал 1,5-2,0 мкмоль на I мл геля.

Рецептор тироксина содержится в тканях печени в чрезвычайно малых количествах. Всего 0,08 мг рецепторного белка присутствует в гомогенате печени 50 крыс, содержащем около П2г белка. Это составляет лишь 0,7 X 10~%- общего белка, содержащегося в гомогенате печени и около 1,5 X Ю~% белка ПМ. Таким образом, для получения чистого рецептора тироксина Необходима очистка В 800000 раз,

В качестве детергента, солюбилизирутацего ПМ, нами был использован 1% тритон Х-100.

При аффинной хроматографии 0,0о"' тритонового экстракта Ш печени крыс на сеферозе-Т^ были обнаружены следующие фракции (рис,2.), которые анализировались методом электрофореза в градиентном (Ю-15^) ПААГ в присутствии ЗГ)*! (рис.3, 4).

Фракция I представляла собой бзлки 1У, фракция 2 - основую масс}

А-280

• Рис.2. Аффинная хроматография на Т^-сефароза 0,05$ трито-Нового экстракта ПМ печени крыс. Стрелками обозначено: а - нанесение исходного

экстракта, б - перерыв в элюции на 30 минуг, в - с колонки буфером А, г - промывание

колонки с ТИ ИпНСОз рН-9, д - элюция 1мМ КаОН, рН-П, е -• промывание колонки буфером А.

белков, которая не взаимодействовала с аффинным сорбентом. Последующее промывание колонки буфером, содержащим 0,1М НаНСС^ (рН-З), приводило к появлению в элюате небольшого количества белков, неспе-цифическн взаимодействующих с лигандом (фракция 3) (рис.З). Во фракции л -4), собранной при элюции Тд-свфароян Ог007М ЫаОЯ (рН-П): в(. ¡"лея гомогенный компонент, который положительно реагировал с реактивом Фолина-Чикальтео, что говорит о его белковой природе, и который является (согласно методу очистки) рецептором тироксина. Все элвируюшие растворы содержали 0,05$ тритон Х-100.

Молекулярную массу очищенного рецептора определяли путём построения графика зависимости -югарифмоп молекулярных масс белков от

I

* в.-;;' а 6 в

Рис.3. Электрофорез в градиентном (10-15%) ПААГ с збэ фракций, полученных после аффинной хроматографии белков ПМ печени крыс, а - исходный 0,05% тритоновый экстракт ПМ, , фракция I; б - несорбированные белки экстракта, фракция 2; в - неспецифически ; сорбированные белки, фракция 3.

логарифмов их злектрофоретической подвижности (рис.5), используя белки-маркёры: бычий сывороточный альбумин (БСА)(67кДа), химотрип-синоген А (25 кДа), цитохром С (12 кДа). Было установлено, что молекулярная масса очищенного рецептора тироксина равна 40 кДа.

Химическая природа рецептора тироксина.

Рецептор тироксина является интегральным мембранным белком, про но связанным с липидным бислоем, поскольку он может быть извлечён из мембраны только солябилизацией в неионных детергентах таких,«¡и: тритон Х-ЮО,

г

t

ii.

•веж®®*

^ ' i i

а e

Рис.4. Электрофорез в градиентном (10-1%) ПААГ

с SBS мембранного рецептора тироксина, полученного после аффинной хроматографии, а - бс!гп~маркёры; БОА (б? кДа>, химотркп-

о.гпогеа Л (25 кДа), цитахрои С (12 кДа^; о - рецептор, связывающий тироксин на ПМ печени крыс.

Он фактически нерастворим в воде к после снижения концентрации детергента в результате интенсивного диализа склонен к агрегации.

Осиспгие данные о химическое природе рецептора тироксина полу-чени б зкспе ::-;ентах по определению нешичил углвводо* в молекуле рецептора- и по растеплению рецептора фермента«.».

Результаты экспериментов позволяют предполагать, что белок, связывающий тироксин, является глияопротенном. Так проба на углеводы с сульфофенолом оказалась положительной, Сивзговке кислотц р молекуле рецептора поставляв? о,С*',',

Как было показано ранее, инкубация ИМ печени крыс с протеоли-тическим ферментом трипсином приводила к подавлению специфического

а

1,5 А,6 1,7 4,8 9 1$ X

Рис.5. График зависимости логарифма молекулярной массы Т^-связываюшего белка от логарифма его электро-форетической подвижности.

связывания с рецептором на 60-70%, что указывает на важную

роль белкового компонента рецептора в связывании с гормоном.

Изменение фосфолипидного окружения рецёптора при обработке ПМ фосфолипаэой приводило к ингибированию свявывания тироксина на 30-50$, следовательно, рецептор тироксина обладает лиПофильными свойствами и тесно связан с фосфолипйдами- 1М.

Результаты исследования аминокислотного оостава очищенного рецептора представлены нами в таблице 4; Как ' видно из данных таблицы 4,.очищенный рецептор состоит из 322-х аминокислотных остатков, обогашён нейтральными И кислыми аминокислотами и беден основными остатками. Такой состав согласуется с предположением о том, что рецептор связан в мембране ионными связями с основными белками (или липидами). Он удерживается в мембране за счёт своих гидрофобных • взаимодействий, о чём говорит высокое содержание гидрофобных остат-

- Таблица 4.

Аминокислотный.состав очищенного рецептора тироксина.

7........................ f

Тип ¡ , Аминокислота ! Число остатков

аминокислоты f j на молекулу белка

Основные Lys 12

Hi3 3

Arg II

Всего: 20

Лиелые Aap 31 '

aiu 32

Всего: 63

Нейтральные Thr II

Ser 27

Pro 12

. Gly 43

Ala 23

Зсего: IIS

Гидрофобные Iíet 9

Val 18

113 41

Leu 31

Tyr 10

íhfi 6

Всего: 117

iö

ков в молекуле рецептора. • •

Дальнейшее изучение химических и физических свойств рецептора тироксина и механизма его функционирования на мембране остаются ватными проблемами наших будущих исследований. '

Исследование связывающих свойств очищенного рецептора тироксина.

Под термином рецептор понимают мембранный компонент ткани-мишени, специфически связывающий соответствующий гормон; в результате образования комплекса гормон-рецептор запускается цепь реакций, завершающаяся проявлением гормонального действия.

Чтобы строго доказать, что данная структура является рецептора;, необходимо очищенный рецептор реконструировать в присутствии мембранных компонентов и показать сохранение его биологической активности (ЛевиДк., 1979; Кульберг, 1937).

Как указывалось выше, тироксин с ггсошш средством связывается с ILí печени крыс.

Исследования по изучению связывания, выполненные на препаратах очищенного рецептора тироксина,показали, что в процессе очистки с помощью аффинной хроматографии на Т^-сефарозе, рецептор теряет способность связывать гормон. По-видимому, рецептор тироксина макет инициировать гормональные эффекты лишь в том случае, если он входит в состав мембран,, где находится в соответствующем для прояг'.гмш егс биологической активности окружении.

Практически все рецепторы мембраны - интегральные белки,с выраженными- гидрофобными • свойствами. Поэтому в процессе солюбилизации мембраны детергентами-нарушаются белок-липидные взаимодействия, изменяется конформацня рецептора, поскольку, специфическая укладка полипептидных цепей всех интегральных и некоторых периферических бел ков мембраны определяется и стабилизируется окружающими липиднами молекулами. Известно, что полное удаление лшшдов из биологических "мембран сопровождается инактивацией большинства мембранных белков

даже в присутствии детергента Г Warren ek al., "1974; Robinson et -1., 1980 ). -

Поскольку, делипидизация белков, происходящая при их очистке на аффинных сорбентах, представляет серьёзную проблему, чтобы'ре-нить её, ряд авторов предлагает добавлять липиды в исследуемые фрак-

ции или в элюируюшие растворы ( Jane et al., 1982; Levitaki, 1985; Финдлей и др., 1990). .

С целью восстановления биологической активности считанного рецептора, ми также попытались провести его реконструкция, встроив очищенный Оелок в фосфолипилные липосомы, полученнпе экстракцией

^ос.{лчйпияов из П.4 печени крыс.

В результата встраивание рецептора в фосфоднпиднул мембрану н 1блидалось сосстаиовление его евязывалдей активнаv:i. Пргдставлсн-ime в таблице 5 результаты показывай?, что реконст^уироваший рецептор характеризуется нштболее высоким специрлческим (- Г-Т;, который в тфесчзте на I мкг белка IU печени крьс, «кыю в 14 раз превышает захват гормона плазматическими мембранами, содержа-

Таблица 5.

Специфическое связывание (^IVLj с Ш печени крыс и с восстановленным рецептором (имп/мин на мкг белка в пробе и=10).

—---------------------]-------—--------Г--------

Фракции' | Специфическое !

связывание

■ ¡h ' ¿29, С? } :

ivCa'üJjiinn.IUiUe !!:'r.,',CCi- ,

Р*_-!^-Пт.чр, ; ..^Т'р::^:•г "а

.'niuJCü'..; ' ГкГ!0,,;0 t ilii'/JG" ii.ju

.>; ■■ дос-.'оверно по ерзвнешш с ¡¡ьлзмьаниь» на ¡и (»' (, и,'У, •

Однако, вполне возможно, что вяяимопействие тироксина с рекон-

^ I . ' , еущес.¿'жл-.по г и бкого

ьзишодггЛетши - ¿«и ае рецептором, палодящим^я а составе на-

тивной мембраны. Тем не.менее, выявление и характеристика любого фактора, который принимает участие в специфическом связывании горыо рОЦИГГОрОМЯ, ПГ*С0Ц!ШрГ.8аННШи С ы.-ибранзии, С ТуЬКЦ ЗрсИИд ¡¡рс.К-.:о';л'аеи!«гс ма>:ьни,!г,1 вс£<:?гня Г"*аво*.а, прелстчвдж'Г большей интерес.

Итак, анализ литературных данных и результаты соОотвенннх иесле-Опалий о |.-.<.-яскуллрни/. м-"ч'ошлпах. дейстък,! тир-епиыьи I -рс.гни.ь иозбо-

г'ы- г. -ы! чип-, ч^rj ¡иасс.м-.'с.чил зд/лзт&ыа.» сдома роилыиырм !|м.зио-

югической активное ги тиреоидин? гормонов, нкяччод-яая связывании их

с цитозольными рецепторами и активацию гормон-рецепторным комплексом процессов транскрипции является неполной. Можно утверждать, что "мембранный путь" также играет важную роль в процессе рецепции тиреоидных гормо нов, что позволяет вычленить его как отдельную стадию в реализации активности гормонов щитовидной железы.

ВЫВОДЫ

1. Доказано существование рецепторов, ответственных за специфическое связывание тироксина на высокоочищенных препаратах ГШ печени крыс.

2. На высокоочищенных ПМ печени крыс установлено, что тироксин сти мулирует активность системы АС-сАМР.

3. Впервые методом аффинной хроматографии выделен и очищен рецептор тироксина из ПМ печени крыс. Установлено, что очищенный рецептор является гликопротеином с молекулярной массой 40 кДа, состоит из 322-х остатков аминокислот и удерживается в мембране за счёт гидрофобных взаимодействий.

4. Выявлено, что высокоочишенный рецептор теряет способность связывать тироксин вследствии делипидизации в процессе очистки.Связывающая способность рецептора восстанавливается путём встраивания его в искусственную фосфолипидную мембрану, что указывает на важную роль мембранных липидов в реализации гормонального эффекта тироксина. •

Список опубликованных работ по теме диссертации.

1. Взаимосвязь между ФЛ составом ПМ клеток печени и мозга и рецепцией тироксина / Ф.Я. Гулямова, Б. Зайнутдинов ,. Н. Яковлева^ 0. Каха-рова // Тез. докл. III Всесоюзн. симп. по биохимии липидов. id., 1987.

- С.50. • . ." .

2. Гулямова Ф.Я., Яковлева Н., Кахарова 0. Особенности связывания тиреоидных гормонов ПМ // Матер. III Всесоюзн. съезда эндокринологов. Ташкент, 1989. -С.Э8. ; . -'

3. Кахарова 0.» Гулямова Ф.Я., Яковлева Н. 0 природе тироксинсвя-зываюших участков на ПМ //Тез. докл. X объединенного сими, 'биохим. обществ СССР-ГДР "Механизмы регуляции клеточной активности". -М.,1989.

-с.36. . • .

. 4. Мембранная рецепция тиреоидных гормонов / Я.Х. Туракулов., Т.С. Саатов., 4.Я. Гуйямова» H.H. Яковлева // Биохимия. -1991, -Т.56, вып.б.--C.839-Ö45.

IB