Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Характеристика аллелофонда у различных пород овец по микросателлитам

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Характеристика аллелофонда у различных пород овец по микросателлитам"

На правахрукописи

ОЗЕРОВ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ

Характеристика аллелофонда у различных пород овец по микросателлитам

03.00.15 - Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 2004

Работа выполнена в лаборатории генетики животных отдела сертификации и экологических исследований в животноводстве Всероссийского государственного научно-исследовательского института животноводства (ВИЖ)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Марзанов Н.С.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Новиков А.А.

кандидат биологических наук, доцент Мяндина Г.И.

Ведущее учреждение:

Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина (МГАВМиБ)

Защита состоится -гг- __ 2004 года, в 15 часов, на

заседании диссертационного совета Д 212.203.05 при Российском университете

дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.8., медицинский факультет.

Факс:(095)433-51-31

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Российского университета дружбы народов по адресу: 117198, г. Москва, ул. Миклухо-Маклая, д.6.

«/д " /шАм

Автореферат разослан 2004 года.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, доцент

О.Б. Гигани

2004-4 26001

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В настоящее время существует 9 типов различных систем генетических маркеров (Roychoudhury А.К., Nei M, 1988; COGNOSAG Workshop Report, 1992; Марзанов Н.С., 1991, 1994; Lauvergne J.J. et al., 1996; Терлецкий В.П., 1999; Cockett N.E. et al., 2001). Практически все виды домашних жвачных изучены с помощью этих систем, за исключением ДНК-маркеров. Наиболее информативными оказались открытые в последнее десятилетие генетические маркеры, принадлежащие к повторяющейся фракции геномной ДНК — микросателлиты, демонстрирующие необычайно высокий уровень полиморфизма (Tautz D., 1989; Vogt P., 1990; Weber J.L., 1990; Goldstein D., Schlotterer C, 1999; Tapio M. et al., 2000; Zhao S. et al., 2000). Микросателлиты являются нейтральными маркерами, это делает возможным их использование для оценки генетического разнообразия популяций. Они так же подходят для проведения исследований на достоверность происхождения потомства, теста на диагностику эффекта «бутылочного горлышка» в популяции, генетической категоризации пород. Микросателлиты наследуются из поколения в поколение и обладают относительно высокой скоростью мутаций, что позволяет использовать их при оценке дивергенции и установления эволюционно-генетических связей между популяциями.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование различных пород овец России и Украины с использованием микросателлитов в качестве генетических маркеров. В связи с этим решали следующие задачи:

1. Создать банк ДНК различных пород овец.

2. Дать характеристику пород овец по частотам встречаемости аллелей и генотипов с использованием 16 микросателлитных маркеров.

3. Определить общность аллелей и генотипов овец различных пород.

4. Дать характеристику различных пород овец по эффекту "бутылочное горлышко'".

5. Провести анализ происхождения и исторических связей овец России и

Научная новизна и практическая значимость работы, реализация результатов исследований. Впервые проведены исследования по изучению полиморфных локусов микросателлитов овец. Создан банк ДНК овец. Изучен аллелофонд у 10 пород овец по 16 микросателлитным маркерам. Определен уровень генетического разнообразия, показан уровень гетерозиготности. Дана характеристика 10 пород овец по показателям Б-статистики: определен коэффициент инбридинга для каждой породы; показан уровень межпородного и внутрипородного разнообразия. Проведены исследования на установление идентичности пород. Установлен эффект "бутылочного горлышка" у овец грозненской породы. Определены генетические расстояния у 10 пород овец России и Украины и на их основе построена дендрограмма. Проведена оценка генетических дистанций с помощью анализа основных компонент и на базе этих данных построена трехмерная диаграмма.

Положения, выносимые- на защиту. Разработка методов выявления микросателлитных маркеров для оценки аллелофонда пород овец России и Украины, определение общности аллелей и генотипов у различных пород овец. Оценка генетического разнообразия пород овец Российской Федерации и Украины.

Украины.

Установление происхождения и историко-генетических связей между породами овец России и Украины

Апробация работы. Результаты исследований доложены и одобрены на ученых советах Всероссийского ГНИЙ животноводства РЛСХН (2000-2003) и сельскохозяйственного института МТТ Агрифуд Ресерч (Йокиоинен, Финляндия) (2002-2003).

Публикация материалов. По материалам диссертации опубликовано 2 научные работы.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, обсуждения, выводов, практических предложений, списка использованной литературы. Материал изложен на 113 страницах машинописного текста, содержит 30 таблиц, 30 рисунков, 2 диаграммы. Список литературы включает 120 источников, в том числе 99 на иностранных языках.

2 . МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Материалом для изучения служили образцы крови от 10 различных пород овец (п=400). Исследования проводили в течение 2001-2003 гг. на базе лаборатории генетики животных ВИЖа и лаборатории генетики животных МТТ Агрифуд Ресерч (Финляндия) по схеме представленной на рис. 1.

Рис. 1. Общая схема исследований

Выделение ДНК проводили солевым методом с использованием протеиназы-К (Miller S., 1988; Kantanen J.. 1999) в условиях лаборатории генетики животных ВГНИИ животноводства.

К 2,5 мл свежей или размороженной крови добавляли l,5 мл гемолизирующего буфера, после чего помещали пробирки в ледяную ванну на 2G минут, затем их центрифугировали 2G минут при 3GGG об/мин. После центрифугирования налосадочную жидкость удаляли, и добавляли к осадку 2 мл буфера, содержащего G,Gl5 M NaCl и G,G24 M EDTA, 6g мкл протеиназы К (1G мг/мл) и 6g мкл 1G% SDS. Смесь инкубировали при 3l°C в течение 36 часов После инкубации в термостате к содержимому добавляли G,5 мл насыщенного NaCl и 2 мл смеси хлороформ : изоамиловый спирт (24:1) и центрифугировали 20 минут при 4GGG об/мин. После этого переносили верхний слой, содержащий ДНК в отдельную стеклянную пробирку. ДНК осаждали 2 объемами 98% этанола Осадок промывали l0% этанолом, подсушивали на воздухе и растворяли в 500 мкл ТЕ-буфера. Образцы ДНК замораживали и хранили при -20°С в морозильнике.

Концентрацию выделенной ДНК и содержание белка в образцах измеряли на приборе GeneQuant (RNA/DNA calculator) фирмы Pharmacia Biotech (Швеция). Содержание ДНК доводили до концентрации 10 нг/мкл пропорциональным добавлением деионизированной воды.

П^ проводили на амплификаторах PTC-100 (Programmed Thermal Controller) и PTС-200 (Preliner Thermal Cycler) фирмы Finnzymes (Финляндия) в 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 10,5 мкл Н2О, 2,5 мкл ЮхП^ буфера, 2,5 мкл dNTP, 2,0 мкл каждого праймера (10 пмоль/мкл), диназим 0,5 мкл и 5,0 мкл ДНК в концентрации 10 нг/мкл. Условия проведения П^ приведены в табл. 1.

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК проводили в течение 5 часов в б % полиакриламидном геле в 0,6 M TBE (0,66 M Tris-основания, 0,5 M Н3ВОз, 0,6 мM EDTA) с lM мочевины, при напряжении поля 1500 В, силе тока 60 мА, мощности 30 Вт и температуре 54°С, на приборе ALF Express automated DNA sequencer (Pharmacia, Швеция) в институте MTT Агрифуд Pесерч (Йокиоинен, Финляндия). В каждую лунку вносили амплификат (0,8-1,2 мкл), краситель и внутренний маркер (inside marker - Sizer, Pharmacia, Швеция). Пары микросателлитов - INRAG23 и BM4621; MсM52l и OarVHl2; ОагНН4! и MAF214 разделяли одновременно в одном и том же геле. На одну из дорожек наносили стандартный маркер размера. Амплификат ДНК референтного животного вносили на 2 дорожки. Гель просматривался автоматически He-Ne лазером с длиной волны 632,5 нм. Для идентификации аллелей исследуемых локусов микросателлитов использовали программу ALF Win Fragment Analyser 1.00.36.

Иногда при компьютерном анализе геля появлялись артефакты и неточности в виде выпуклой или вогнутой линии, поэтому в последующем проводили ручную коррекцию распечатки, основанную на показателях размеров аллелей ДНК, полученных из крови от референтных животных для того или иного локуса микросателл ита.

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза проводили на приборе MegaBace 500 (Amersham BioSiences, США). Исследования проводили следующим образом: для микросателлитов I группы -BM1314. BM6506 и OarFCB128, в каждый капилляр загружали смесь амплификатов ДНК в количестве 1 мкл для одновременного исследования 3-х локусов микросателлитов, для II группы - BM8125 и BM0l5l, исследования проводили по маркирующим системам 2-х локусов; III группу микросателлитов - BM6526, OarFCB48 каждый в отдельности. При подготовке П^-продукта для анализа на этом приборе использовали флюоресцентно-меченые праймеры. Для идентификации

аллелей исследуемых локусов микросателлит о в использовали программу MegaBace Genetic Profiler 1.5. Поскольку компьютерный анализ иногда дает некорректное отображение величины аллелей, последующую коррекцию проводили вручную, согласно длине аллелей ДНК референтного животного для исследуемых локусов микросателлитов.

Таблица 1

Праймеры микросателлитов и условия проведения ГЩР

м Локус

] ВМ0757

2 ВМ1314

3 ВМ4621

. ВМ6506

4

5 BM6Î26

6 ВМ3125

7 1NRA023 g MAF214 9 MAF48 |0 MAF65

, МсМ527

12 OARFCB128

13 OAKFCB304 OarFCB48

14

15 OartIH47

16 OarVH72

Прямой н обратный праймеры

TGG AAA CAA TGT AAA CCT GGG

TTG AGC CAC CAA GGA ACC

TTC CTC CTC TTC TCT CCA AAC

АТС TCA AAC GCC AGT GTG G

CAA ATT G AC TTA TCC TTG GCT G

TGT AAC ATA TGG GCT GCA TC

GC A CGT GGT AAA GAG ATG GC

AGC AAC TTG AGC ATG GCA С

CAT GCC AAA CAA TAT CCA GC

TGA AGG TAG AGA GCA AGC AGC

CTC TAT CTG TGG AAA AGG TGG G

GGG GGT TAG ACT TCA ACA TAC G

GAG TAG AGC TAC AAG ATA AAC TTC

TAA СТА CAG GGT GTT AGA TGA ACT CA

GGG TGA TCT TAG GGA GGT TTT GGA GG

A AT GCA GGA GAT CTG AGG CAG GGA CG

GGA AAC CAA AGC CAC TTT 1 CA G AT GC

AGA CGT G AC TGA GCA ACT AAG TAC G

AAA GGC CAG AGT ATG CAA TTA GGA G

CCA CTC CTC CTG AGA ATA TAA CAT G

GTC CAT TGC CTC AAA TCA ATT С

AAA CCA CTT GAC TAC TCC CCA A

CAG CTG AGC AAC TAA GAC ATA CAT GCG

ATT AAA GCA TCT TCT CTT TAT TTC CTC GC

CCC TAG GAG CTT TCA ATA AAG AAT CGG

CGC TGC TGT CAA CTG GGT CAG GG

GAG TT A GT A CAA GGA TGA CAA GAG GCA С

GAC TCT AGA GGA TCG CAA AGA ACC AG

TTT ATT GCA AA CTC TCT TCC TAA CTC CAC С

GTA ACT TAT TTA AAA AAA TAT CAT ACC TCT TAA GG

CTC TAG AGG АТС TGG AAT GCA AAG CTC

GGC CTC TCA AGG GGC AAG AGC AGG

Условия амплификация

5 мин X 94°С. 30 х[20 с х9<ГС, 20

с X 48вС, 30 с X 60°С]

5 мин X 94°С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 55°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94°С, 30 х(20 с х94°С. 20

сх48°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94°С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94°С. 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94 °С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94°С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60-С]

5 мин X 94°С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С)

5 мин X 94°С. 30 х(20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94аС. 30 х[20 с х94°С, 20

с х 48°С, 30 с х 60°С]

5 мин X 94°С, 30 х(20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94°С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94-С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

5 мин X 94°С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48пС, 30 с X 60°С)

5 мин X 94°С, 30 х[20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

J мин X 94 °С, 30 х(20 с х94°С, 20

с X 48°С, 30 с X 60°С]

Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза проводили на приборе MegaBace 500 (Amcrsham BioSiences, США). Исследования проводили следующим образом: для микросателлитов I группы -ВМ1314, ВМ6506 и OarFCB128, в каждый капилляр загружали смесь амплификатов ДНК в количестве I мкл для одновременного исследования 3-х локусов микросателлитов, для II группы - ВМ8125 и ВМ0757, исследования проводили по маркирующим системам 2-х локусов; III группу микросателлитов - ВМ6526, OarFCB48 каждый в отдельности. При подготовке ПЦР-продукта для анализа на этом приборе использовали флюоресцентно-меченые праймеры. Для идентификации аллелей исследуемых локусов микросателлитов использовали программу MegaBace Genetic Profiler 1.5. Поскольку компьютерный анализ иногда дает некорректное отображение величины аллелей, последующую коррекцию проводили вручную,

согласно длине аллелей ДНК референтного животного для исследуемых локусов микросателлитов.

Статистическую обработку результатов проводили с использованием программ Arlequin 2.0, Bottleneck 1.2, Fstat 2.9.1, Dispan, Genepop 3.2a, PCAgen 1.2.1.Частоты аллелей, значения FIS, FST, Fff генетическое равновесие по Харди-Вайнбергу для каждого локуса подсчитывали с использованием программы Fstat 2.9.1 (Weir B.S., Cockerhara S.S., 1984). Равновесие Харди-Вайнберга в популяциях определяли на основе программы GenePop 3.2a (Rousset F., Raymond M., 1995). Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность в популяциях по каждому маркеру были определены с помощью программы Arlequin 2.O. Эффект «бутылочного горлышка» (bottleneck) рассчитывали с помощью программы Bottleneck 12 (Comuet G.M., Luikart G., 1997). Анализ индивидуальности пород проводили с помощью программы Structure (Piitchard J. et al., 2000). Генетические расстояния между породами и i-енетическое дерево были построены с использованием программы Dispan (Nei M., 1972). Трехмерная диаграмма, показывающая генетические расстояния между породами, была построена на основе данных, полученных с помощью программы PCAgen I.2.I. Для оценки данных генетических исследований локусов микросателлитов и характеристики 10 пород овец в нашей работе использовали показатели F-статистики Райта (Weir В., Cockerham С, 1984) - FIS, FST, Frr.

Определение коэффициента инбридинга (FIS), показывающего снижение уровня гетерозиготности отдельной особи, вызванное не случайным скрещиванием в исследуемой породе проводили по формуле:

где

Н = уровень гетерозиготности отдельной особи в исследуемой породе;

Hs = ожидаемый уровень гетерозиготности отдельной особи в равномерно случайно скрещивающейся породе;

Нт = ожидаемый уровень гетерозиготности отдельной особи в равномерно случайно скрещивающейся тотальной популяции. Определение индекса фиксации (FST), показывающего снижение уровня гетерозиготности в породе, вызванное случайным генетическим дрейфом провоттитти по_гЬопмуле:

Нт - Hs Нт

Общий коэффициент инбридинга (Fu), показывающий снижение уровня гетерозиготности особи относительно тотальной популяции определяли по формуле:

Для оценки показателя отклонения от равновесия по Харди-Вайнбергу использовали вероятностный тест - "probability test" (Haldane J., 1954; Weir В., 1990; Guo S., Thompson E., 1992). При этом с достоверностью при показателе Р<0,05 тест расценивали как положительный, что свидетельствовало об отклонении от равновесия Харди-Вайнберга. В случае, когда показатели Р были меньше 0,05 применяли коррекцию по Бонферрони (Holland В., Copenhaver M., 1988; Holm S., 1979; Seaman M. et al., 1991).

Fst=-

Для подсчета числа эффективных аллелей ^ использовали формулу:

где Na - число эффективных аллелей в локусе,

Са- гомозигот ность по исследуемому локусу.

Для оценки информативности локусов микросателлитов использовали показатель PIC, согласно которому при Р1С>0,5 - локус расценивается как высокоинформативный; при 0,5>P100,25 - как достаточно информативный; а при Р1С<0,25 - малоинформативный (Неагп СМ , 1992, Vaiman D., 1994).

3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристика 16 локусов микросателлитов у различных пород овец. Исследования за последние годы показали, что все генетические маркеры делят на 3 следующие группы: генетические маркеры первого порядка (группы крови; полиморфизм белков и ферментов крови и молока; антигены Главного комплекса гистосовместимости I класса; антигены тромбоцитов; аллотипы белков сыворотки крови). К генетическим маркерам II порядка или анонимным генетическим маркерам относятся полиморфные системы ДНК, - это микросателлиты и антигены Главного комплекса гистосовместимости II класса К генетическим маркерам III порядка относятся маркирующие системы, которые связаны с хозяйственно-полезными или морфологическими признаками (Лмерханов Х.Л, Марзанов Н.С., 1999; Марзанов Н С, 2002) Исследованные нами 16 локусов относятся к анонимным, поскольку не известны полностью их генетическая и фенотипическая функции, и их аллели обозначаются в виде цифр, соответствующих числу нуклеотидов в каждом гене.

На рис. 2 в качестве примера представлена фотография, полученная при анализе нами продуктов амплификации ДНК овец в 6% полиакриламидном геле по локусу OarVH72. В нем показаны результаты электрофореза, где видны как гомозиготные, так и гетерозиготные особи по данному локусу, а также полосы внутреннего и внешнего стандартных маркеров.

Рис. 2 Разделение в 6% полиакриламидном геле амплифицированных образцов ДНК овец по локусу OarVH72: дорожки 1-28 - ДНК овец: 1-5, 9, 12-14, 16-18, 22-25, 27, 28 - гетерозиготные особи; 6-8. 10, 11, 15, 19-21, 26 - гомозиготные особи; 29 -длина внутреннего стандартного маркера (internal marker), 30 - длина внешнего стандартного маркера (external marker)

В табл. 2 представлены данные результатов анализа 16 микросателлитных локусов.

Таблица 2

Локусы микросателлит о в, использованные в работе, значения PIC, F|S, число эффективных аллелей и результаты теста на отклонение от равновесия по

Харди-Вайнбергу

Локус PIC Число зффестивных аллелей (Na) X2 df Р Fis

MAF65 0,779 4,83 17,9 20 0,5956 -0,056

ОагНН47 0,806 3,01 23,2 20 0,1829 0,053

MAF214 0,602 2,12 55,1 20 0,0001 0,190

ВМ4621 0,895 7,04 10,5 20 0,9586 0,007

INRA023 0,873 8,33 15,6 20 0,7399 -0,012

Оа г VI172 0,784 3,62 16,3 20 0,7009 0,001

МсМ527 0,820 4,69 21,9 20 0,3437 0,025

OarFCB304 0,815 5,75 14,5 20 0,8060 -0,082

MAF48 0,770 4,01 26,2 20 0,1593 0,012

ВМ6526 0,765 4,39 20.3 20 0,4409 -0,020

ВМ6506 0,664 3,02 14,6 20 0,7980 -0,002

BM8I25 0,633 3,00 29,6 20 0,0774 -0,106

ВМ1314 0,857 5,05 29,8 20 0,0732 0,027

ВМ0757 0,748 4,17 26,1 20 0,1623 0,008

OarFCB48 0,800 4,48 8,9 20 0,9844 -0,012

OarFCB128 0.776 4,35 22,0 20 0.3413 0,021

Как видно из данных табл. 2 изученные локусы микросателлитов являются высокоинформативными (Р100,5). Все локусы находятся в состоянии генетического равновесия по Харди-Вайнбергу (Р>0,05), за исключением локуса MAF214 (Р<0,05), что также подтверждается значением Fis для этого локуса, которое указывает на 19% дефицит гетерозигот в нем.

3.2. Определение числа аллелей и гетерозиготности у исследованных пород овец. Проведенный анализ показал наличие высокого полиморфизма у 10 пород овец по всем 16 локусам микросателлитов (табл. 3).

На основе представленных данных табл. 3 видно, что число встречаемых аллелей по каждому локусу от 8 (локус MAF214) до 23 (локус 0arFCB304). Наименьшее количество аллелей - 2 - было обнаружено у овец грозненской породы по локусу ОагНН47. Наибольшее количество аллелей установлено у овец ставропольской породы - 15 - по локусу ВМ4621. Анализ по 16 микросателлитным локусам показал, что овцы горнокарпатской породы обладали наибольшим количеством аллелей (J43), тогда как наименьшее их число было выявлено у представителей грозненской популяции (68) Всего по всем породам и локусам микросателлитов было обнаружено 207 аллелей.

Таблица 3

Число аллелей у различных пород овец по 16 локусам микросателлитов

Породы РМ | РОМ 1 ГК | КАР | ЭД | ГР | ОПР | СОК | СТ | ЦГ | Всего

Локусы:

МАК5 8 8 8 6 6 4 6 6 4 10 11

ОагНН47 9 8 9 8 5 2 6 10 7 8 14

\1AF214 3 4 6 4 4 3 4 7 5 4 8

ВМ4621 15 7 13 14 8 7 5 11 15 11 19

ШКА023 И 9 11 11 9 7 7 12 7 10 16

ОагУН72 7 6 8 5 4 4 5 8 7 9 10

МсМ527 6 6 9 10 5 4 5 8 7 9 11

ОагРСВ304 9 9 13 11 7 4 6 9 12 12 23

МАГ48 5 4 7 5 6 4 6 8 5 7 10

ВМ6526 9 5 8 9 7 4 3 11 8 6 14

ВМ6506 8 3 7 4 3 2 4 6 5 7 9

ВМ8125 5 6 8 5 7 4 3 6 5 6 9

ВМ1314 10 7 13 10 8 6 6 13 9 12 16

ВМ0757 6 8 5 6 5 4 5 6 5 6 10

ОагРСВ48 8 6 10 8 6 5 7 9 8 10 14

ОагГСВШ 6 7 8 8 4 4 7 8 6 8 13

Всего аллелей: 125 103 143 124 94 68 85 138 115 135 207

Примечание: РМ - ромни-марш, РОМ - романовская, ПС - горнокарпатская, КАР -каракульская, ЭД - эдильбаевская, ГР - грозненская, ОПР - опаринская, СОК -сокольская, СТ - ставропольская, ЦТ — цигайская.

Большинство генетиков-популяционистов предпочитают использовать гетерозиготность в качестве меры генетической изменчивости популяций. Это надежная мера изменчивости, поскольку она служит оценкой вероятности того, что два аллеля данного локуса, взятые наугад из генофонда популяции окажутся различными. Каждая гамета любого организма несет в каждом локусе аллель, который можно рассматривать в качестве случайно изъятого из популяции (Айала Ф., 1984). Наши исследования показали высокий уровень гетерозиготности пород по тестированным локусам микросателлитов (табл. 4). Так, например, по породе ромни-марш из ГПЗ «Котовский» Рязанской области, которая длительное время разводится в виде замкнутой популяции данный показатель составил в среднем 0,73367, у романовской - 0,71654, грозненской - 0,72396, ставропольской - 0,74944, сокольской - 0,80583, каракульской - 0,78633, эдильбаевской - 0,77121, опаринской - 0,70952, горнокарпатской - 0,79613, цитайской -0,77799 (табл. 4).

Однако, гетерозиготность не отражает степени генетической изменчивости в популяциях где часто происходят инбредные скрещивания. В данных популяциях, число гомозигот будет больше, чем в популяциях со случайным скрещиванием, при одинаковых частотах всех аллелей в обоих случаях (Лйала Ф., 1984). Поэтому для точной оценки изменчивости популяции вводится показатель ожидаемой гетерозиготности. который рассматривает уровень аллельиого разнообразия (Животовский Л.Л., 1991).

Наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность у 10 пород овец

Ожидаемая гетсрозиготность определяется на основании частот аллелей, в предположении случайного скрещивания в популяции (Айала Ф., Кайгер Дж., 1988). В наших исследованиях уровень наблюдаемой гетерозиготности у тестированных пород овец мало отличается от уровня ожидаемой гетерозиготности, что свидетельствует о статистической достоверности этих показателей. Самый высокий уровень гетерозиготности был установлен у Сокольских и горнокарпатских овец. Казалось бы, большинство популяций- закрытые, а некоторые породы, как опаринская, в данный момент исчисляются десятками голов, тем не менее, имеют высокий уровень встречаемости числа аллелей и высокий уровень гетерозиготности. Все это еше раз подтверждает высокую приспособленность вида Ovis.

33. Оценка генетического равновесия по Харди-Вайибергу в исследованных популяциях овец. Полагают, что популяции сельскохозяйственных животных в условиях панмиксии, если на них не действует отбор, находятся в равновесии по Харди-Вайнбергу неограниченно долго. Закон Харди-Вайнберга справедлив, прежде всего, для панмиктической популяции. Вместе с тем, это обстоятельство не останавливает исследователей от использования его и на так называемых "не панмиктических" популяциях сельскохозяйственных животных (Машуров A.M., 1985). Оправданием такого подхода является тот факт, что закон Харди-Вайнберга в этом случае позволяет найти как бы точку отсчета того, в какой мере эта популяция отличается от панмиктической и на этом фоне определить на каких генотипах в наибольшей степени сказывается действие отбора и определить его направленность.

Популяцию домашних овец нельзя назвать панмиктической, поскольку на них действует как искусственный, так и естественный отбор. Вместе с тем, проведенные многочисленные исследования дают возможность полагать о возможности применения различных статистических методов при оценке состояния той или иной популяции (Марзанов Н.С., 1994).

Анализ генетического равновесия у 10 пород овец представлен в табл. 5.

Генетическое равновесие но Харди-Вайнбергу у различных пород овец Российской Федерации и Украины

Породы Хг Df Р

Ромни-марш - 33.3 32 0,4019

Романовская 33,1 32 0,4148

Горнокарпатская 38,3 32 0,2046

Каракульская 44,0 32 0,0773

Эдильбаевская 25,5 32 0,7849

Грозненская 19,5 30 0,9282

Опаринская 25,6 32 0,7802

Сокольская 46,5 32 0,0469

Ставропольская 34,4 32 0,3557

Цигайская 52,2 32 0,0137

Как видно из табл. 5 у всех исследованных пород не было выявлено статистически значимого нарушения генетического равновесия по Харди-Вайнбергу (Р > 0,05). На основе полученных результатов, можно заметить, что в Сокольской и цигайской породах наблюдающиеся значения Р меньше 0,05 (стандартный уровень статистической достоверности составил - 5%). Однако при применении коррекции по Бонферрони, относительно 5%, деленных на 16 использовавшихся маркирующих систем: 0,05/16=0,003125, получаем новый уровень статистической достоверности, 0,03%, что подтверждает отсутствие нарушения генетического равновесия по Харди-Вайнбергу у двух пород.

3.4. Анализ внутрипопуляционного генегического разнообразия у различных пород овец методом F-статистики. Показатели FB (коэффициент инбридинга, показывает снижение уровня гетерозиготности у особей в породе), Frr (общий коэффициент инбридинга, показывает уровень снижения гетерозиготности у особи относительно тотальной популяции), FST (индекс фиксации, показывает уровень гетерозиготности каждой породы относительно гетерозиготности тотальной популяции) отражают наличие или возможность появления инбридинга в популяции. Исследование пород овец по этим признакам имеет немаловажное значение, поскольку в овцеводстве чаще всего применяется массовая селекция в силу особенностей разведения и содержания данного домашнего скота.

Исходя из данных табл. 6 видно, что значения коэффициента инбридинга (FK) далеки от единицы для всех маркеров и пород овец. Общие значения Fis для исследованных пород овец указывают на низкую вероятность инбридинга.

Отрицательные показатели F1S у ромни-марш, романовской, грозненской, ставропольской и цигайской пород свидетельствуют об избытке гетерозигот среди исследованных представителей этих популяций соответственно на 1,1% - у ромни-марш; 1,8% - у романовской; 2,6% - у грозненской; 1,1% - у ставропольской; 1,5% - у цигайской. Однако, и положительные и отрицательные значения коэффициента инбридинга (FIS) достаточно малы (менее 0.05), за исключением каракульской породы (FIS=0,082), и поэтому их нельзя рассматривать как статистически достоверные показатели по отношению к избытку или дефициту гетерозигот у исследованных популяций овец. Проведенный нами дополнительный тест для каракульской породы

овец показал, что полученное ранее значение Рв не может рассматриваться как статистически достоверное по отношению к избытку гомозигот в этой породе.

Таблица 6

Общие показатели коэффициента инбридинга (Р18) у 10 пород овец по 16 локусам микросателлиюв

Породы Fis

Ромни-марш -0,011

Романовская -0,018

Горнокарлатская 0.006

Каракульская 0,082

Эдильбаевская 0.013

Грозненская -0,026

Опаринская 0,021

Сокольская 0,020

Ставропольская -0,011

Цигайская -0,015

Показатель FST ДЛЯ всех локусов подсчитывали как средневзвешенный но всем популяциям, и он варьировал от 0,034 (ВМ1314) до 0,091 (ОагНН47) (табл 7)

Таблица 7

Средневзвешенные показатели FST И FIT ДЛЯ 10 пород овец по 16 микросателлитным локусам

Локус Fsr F,T

MAF6S 0,061 0,008

ОатНН47 0,091 0,139

MAF214 0,051 0,231

ВМ4621 0,051 0,057

INRA023 0,043 0,031

OarVH72 0,049 0,051

McMS27 0,053 0,077

FCB304 0,065 -0,011

MAF48 0,066 0,077

ВМ6526 0,036 0,017

BM6S06 0,056 0,054

ВМ8125 0,062 -0,038

ВМ1314 0,034 0,060

BM7S7 0,049 0,056

FCB48 0,048 0,037

FCB128 0,043 0,062

Все 0,053 0.055

Среднее значение FST ПО 16 локусам для всех пород составило 5,3%. Это говорит о том, что 94,7% всей изменчивости обусловлено внутри породным разнообразием и только 5,3% приходится на межпородное разнообразие. Это достаточно высокий показатель по сравнению с популяциями крупного рогатого скота (Fsr=H,4%) и коз (FST=14,3%), где внутрипородное разнообразие было соогветственно 88,6% и 85,7%, что оказалось ниже, чем у исследованных нами овец (Kantanen J., 1999; Barker J. et a!., 2001).

Показатель общего коэффициента инбридинга (F|T) для всех локусов микросателлитов подсчитывали как средний по всем исследованным популяциям. Его значение, составившее 0,055, указывает на относительно небольшой дефицит гетерозигот в 5,5% у исследованных овец по отношению к тотальной популяции. Однако, несмотря на это полученные данные свидетельствуют о низком уровне инбридинга во всех 10 исследованных породах овец России и Украины.

3.5. Определение эффекта «бутылочного горлышка» в исследованных породах овец. Эффект «бутылочного горлышка» в популяции — это относительно короткий период времени, когда в силу определенных, непредсказуемых экстремальных ситуаций выживает небольшое количество животных от начальной численности популяции. Вследствие этого теряется большая часть оригинального генетического разнообразия. Чаще всего «бутылочное горлышко» вызвано изменениями окружающей среды. Обнаружение популяций, недавно перенесших состояние «бутылочного горлышка» является очень важным, так как этот процесс приводит к увеличению демографической стохастичности и инбридинга, потере генетического разнообразия, фиксации «вредных» аллелей, и, в конечном итоге, снижает адаптационные возможности и увеличивает вероятность исчезновения данной популяции (Frankel О., Soule M, 1981; Lande R., 1988, 1994; Leberg P., 1990; Hedrick P., Miller P., 1992; Frankham R., 1995; Cornuet J.-M, Luikart G., 1997; Luikart G., Cornuet J.-M., 1998)

В нашей работе мы использовали показатель количественного распределения аллсльных частот, который наглядно показывает популяции, перенесшие резкое снижение численности. Согласно этому тесту нами все аллели были разделены на 10 групп по част агам встречаемости: первая группа с частотами 0-0,1; вторая 0,1 - 0,2; третья 0,2 - 0,3 и т.д. В популяциях не подверженных эффекту «бутылочного горлышка» наблюдалось г-образное распределение аллсльных групп, тогда как в обратной ситуации отмечалось нарушение этого распределения.

Результаты анализа девяти пород овец: ромни-марш, ставропольской, цигайской, опаринской, горнокарпатской, каракульской, романовской, сокольской и эдильбаевской, показали наличие г-образного распределения аллельных групп, что говорит об отсутствии эффекта «бутылочного горлышка» в этих популяциях. Полученные результаты в качестве примера приводятся на диаграмме 1 по данным породы ромни-марш.

Диаграмма 1

Распределение аллельных групп у овей породы ромни-марш 0 600 0 500 0 400 0 300

0 200 I—

1

I

0 100 f

I

i r 0 000 —

01 02 0} 04 OS 06 07 OS D9 10

Напротив, в грозненской породе четко прослеживается нарушение г-образного распределения аллелей. На диаграмме 2 представлены полученные результаты, где наблюдается потеря редких атлелей с частотами встречаемости от 0 до 0,1. Представленный материал свидетельствует о том, что грозненская порода или, скорее всего, исследованное стадо овец подверглось резкому снижению численности за последние годы или на использование в нем одних и те же баранов-производителей или их потомков. Мы считаем необходимым проведение дополнительных исследований по данному явлению на большем поголовье овец грозненской породы.

Диаграмма 2

Нарушение г-образного распределения аллельных групп у овец грозненской

породы

3.6. Компьютерное моделирование для идентификации чистоты пород.

Процедура компьютерного моделирования для идентификации пород показывает, насколько далеко находится друг от друга каждая из популяций, при условии независимого наследования микросателлитов (РгНсЪап! I К. е! а1, 2000). Как видно из табл. 8, анализ полученных результатов по 16 локусам микросателлитов показал

значительную идентичность особей в породе. От 98,6% до 99.8% животных попали в ту же породу, из которой они были взяты при проведении моделирования. Эгот результат свидетельствует о высокой индивидуальности каждой из исследованных пород.

Таблица 8

Результаты компьютерного моделирования на идентичность и принадлежность

особей к породе

Популяция 2

Популяция 1 Ромни-марш Романовская Горнокарпатская Каракульская Эдильбаевская | Грозненская Опаринская Сокольская Ставропольская Цигайская

Ромни-марш 997 0 0 1 0 0 0 1 0 0

Романовская 0 998 0 0 0 0 1 0 0 0

Горнокарпатская 1 1 995 0 1 0 0 1 0 1

Каракульская 0 0 0 998 0 0 0 0 0 0

Эдильбаевская 0 0 0 0 997 0 0 0 0 1

Грозненская 0 0 0 2 4 986 0 0 5 2

Опарииская 2 0 0 0 1 2 992 1 0 1

Сокольская 0 0 1 1 0 0 0 995 0 1

Ставропольская 0 0 1 0 0 2 0 0 995 1

Цигайская 0 2 2 0 2 2 0 1 0 991

3.7. Дифференциация пород овец на основе расчета генетических расстояний. Оценка генетических расстояний между породами показала, что наименьшие дистанции были выявлены между цигайскими и горнокарпатскими овцами (0,09) и между цигайской и сокольской породами (0,1), что объясняется историей их создания (табл. 9). Формирование горнокарпатской породы проходило в гористой части Карпат (Львовская, Черновицкая, Ивано-Франковская и Закарпатская области) при непосредственном участии цигайских баранов (Сулыма Я.Ф., 1963). В результате скрещивания цигайских баранов с местными грубошерстными овцами было установлено, что в горных районах наиболее продуктивными и лучше приспособленными к местным условиям относятся помеси с неоднородной полугрубой длинной шерстью с косичным строением руна. Помесные животные желательного типа с полугрубой шерстью начали разводить в «себе», чтобы создать здесь массив овец, дающих хорошую полугрубую шерсть, пригодную для изготовления на Украине высококачественных ковров и других изделий (Литовченко Г.Р., Есаулов П.А., 1972).

Как показали исследования Люцканова П.И. (1990), часть стад каракульских овец республики Молдова создавались на базе цигайских овец. Возможно и сокольская порода на Украине, хотя и является каракульской породой, формировалась аналогичным образом.

Генетические дистанции между породами России и Украины

РМ РОМ ГК КАР ЭД ГР ОПР ; СОК СТ цг

РМ 0,0000 1

РОМ 0,2664 0,0000 1

гк КАР ЭД ' 0,1258 0,2103 0,2403 0,2341 0,2484" 0,0000 ; 0,2092 ' 0,0000 1 1 _ _ - _ . —

0,2953 0.226Г 0,2515 '0,0000

ГР 0,2857 0,3140 0,2652 0,2590 0,3253 0,0000, 1

ОПР 0,1647 0,2840 0,1945 1 0,2292 , 0,2557 0,2728 ,0,0000 1

сок 0,1571 0,1926 0,2483 0,1091! 0,1959 0,2165 0,2969 0,2064 0,0000j_ 0.192 Г 0,2281; 0,1680 ■ 0,0000

СТ ЩГ 0,2359 0,1492 0,2141' 0,2774 I

0,1275 0,1960 0,0878 0,2049 10,1990 0,2557 0,16391 0,1030 0,1406 0,00001

Примечание: РМ - ромни-марш, РОМ - романовская, ПС - горнокарпатская, КАР -каракульская, ЭД - эдильбаевская, ГР - грозненская, ОПР - опаринская, СОК -сокольская, СТ - ставропольская, ЦГ-цигайская

Наибольшее генетическое расстояние было отмечено между грозненской и романовской породами (0,31) и грозненской и эдильбаевской породами (0,32). Между остальными породами генетические дистанции варьировали в пределах от 0,12 до 0,30.

Дерево генетических расстояний представлено на рис 3. Исследованные породы формируют три группы кластеров' одна из ветвей сформирована двумя мериносовыми популяциями овец (грозненской и ставропольской), что объясняется их общей продуктивной направленностью Вторая - цигайской, сокольской и горонокарпатской породами.

Рис.3. Дендрограмма кластеров анализируемых порол овец

Третью ветвь составляют полутонкорунные породы овец - опаринская и ромни-марш, что объяснимо тоже. Опаринская порода создавалась в условиях Кировской области путем скрещивания местных грубошерстных овец с баранами породы ромни-марш.

Остальные три породы составляют собственные ветви: эдильбаевская, мясо-сального направления по продуктивности от слова «Итиль», что в переводе означает старое название реки Волга. Романовская порода шубно-мехового направления продуктивности, по одним данным создана на территории Ярославской и других прилегающих областей, по другим - пришла вместе с монголо-татарами и длительное время разводится в себе на территории Центральной России (Марзанов Н.С., Магомадов ТА., 1997). Каракульская порода, известная за рубежом больше как астраханская, является одной из древних пород на территории бывшего СССР, и издавна разводилась вместе с романовской и эдильбаевской на берегах реки Волги.

Для дополнительной оценки полученной информации по аллельным частотам и дендрограммы был использован анализ основных компонент, на основе которого построена трехмерная диаграмма. Три оси, PCI, PC2 и РСЗ, учитывают соответственно 27,9%, 17,9% и 11,5% наблюдаемой генетической изменчивости. В силу определенной методической специфики, компоненты РС1, 2 и 3 учитывают только 65,7% общей генетической изменчивости.

Рис. 4. Анализ генетических связей исследованных пород овец по трем компонентам: PCI, PC2 и РСЗ

Трехмерная диаграмма, основанная на данных анализа основных компонент, показывает, что цигайская, сокольская и горнокарпатская породы близки друг к другу. По двум компонентам породы опаринская и ромни-марш так же близки друг к другу, как и грозненская и ставропольская породы (рис. 4).

Дальше от всех остальных располагается романовская порода. В целом эти результаты соответствуют данным, полученным при опенке генетических расстояний (рис. 3). Каракульские овцы по двум компонентам расположены ближе к

эдильбаевской породе. Такое расположение этих двух пород можно объяснить тем, что каракульские овцы издавна разводились вместе с эдильбаевскими на берегах реки Волги. Есть и другая гипотеза, которая объясняет происхождение каракульских овец от эдильбаевской породы. Однако, следует учитывать и третий факт того, что информативность анализа основных компонент только около 66%.

ВЫВОДЫ

1. Создан банк ДНК 10 пород овец Российской Федерации и Украины. Проведены исследования по 16 локусам микросателлитов. Обнаружено 207 аллелей, из них: 11 аллельных вариантов локуса MAF65; 14 - ОагНН47; 8 - MAF214; 10 - OarVH72; 11 - МсМ527; 10 - MAF48; 23 - 0arFCB304; 14 - OarFCB48; 13 - OarFCB128; 19 -ВМ4621; 10 - ВМ0757; 16 - ВМ1314; 9 - ВМ6506; 14 - ВМ6526; 9 - ВМ8125 и 16 -INRA023.

2. Уровень гетерозиготности исследованных локусов микросагеллитов составил от 53,0% (MAF214) до 88,0% (INRA023). Средний уровень гетерозиготности был равен 75,2%. Все использованные локусы микросателлитов для оценки полиморфизма (PIC) являются высокоинформативными.

3. Уровень наблюдаемой гетерозиготности у каждой из исследованных пород овец не отличался статистически достоверно от уровня ожидаемой гетерозиготности. Эти данные и показатели F-статистики свидетельствуют о низкой вероятности инбридинга во всех исследованных породах овец по микросателлитам.

4. Показатель «индекса фиксации» (FST) свидетельствует о высоком внутрипородном разнообразии (94,7%) исследованных пород овец, которое выше чем у крупного рогатого скота (88,6%) и коз (85,7%).

5. Изучение эффекта «бутылочного горлышка» показало потерю редких аллелей у овец грозненской породы, что указывает на резкое снижение численности за последние годы исследованного стада или на использование в нем одних и тех же баранов-производителей или их потомков.

6. Проведение исследований на идентичность показало, что все 10 изученных пород овец обладают четко выраженной индивидуальностью, что позволяет использовать микросателлиты для их генетической категоризации.

7. При оценке генетических расстояний изученные породы овец образовали три кластера, первый из которых сформирован грозненской и ставропольской породами, второй - ромни-марш и опаринской, третий - цигайской, Сокольской и горнокарпатской породами. Каракульская и эдильбаевская по трехкомпонентному анализу оказались близки друг к другу, что связано с общностью их происхождения. Наиболее удаленной от остальных оказалась романовская порода.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Рекомендуется использование в овцеводстве метода анализа по микросателлитам и статистических программ Arlequin, Bottleneck, Dispan, Fstat, GenePop, Structure для генетической категоризации пород, оценки аллслофонда, определения генетических расстояний, уровня гетерозиготности, показателей F-статистики Райта, эффекта «бутылочного горлышка» у широко разводимых и локальных пород овец.

СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Озеров М.Ю., Марзанов Н.С., Насибов М.Г., Кантанен Ю., Тапио М. Генетический профиль у различных пород овец по микросателлитам // Вестник Российской академии сельскохозяйственных наук. - 2003. - №5. - С.72-75.

2. Озеров М.Ю., Марзанов Н.С., Насибов М.Г., Кантанен Ю. Эффект «бутылочного горлышка» при характеристике пород овец // Материалы международной научно-практической конференции по проблеме: «Повышение конкурентоспособности животноводства и задачи кадрового обеспечения». -Быково. - 2003. - Вып. 9. - С. 152156.

ОЗЕРОВ МИХАИЛ ЮРЬЕВИЧ [РОССИЯ1

"ХАРАКТЕРИСТИКА АЛЛЕЛОФОИДА У РАЗЛИЧНЫХ ПОРОД ОВЕЦ ПО МИКРОСАТЕЛЛИТАМ".

В работе впервые представлены новые методы скрининга для оценки генетического профиля различных пород овец России и Украины. Создан банк ДНК 10 пород овец Российской Федерации и Украины и проведены исследования по 16 локусам микросателлитов. Средний уровень гетерозиготности исследованных локусов микросателлитов был равен 75,2%.

Оценка исследованных пород овец по показателям наблюдаемой и ожидаемой гетерозиготности и F-статистики свидетельствует о низкой вероятности инбридинга и высоком внутрипородном разнообразии (94,7%) у изученных пород. Был выявлен эффект «бутылочного горлышка» у овец грозненской породы. Все 10 изученных пород овец обладают четко выраженной индивидуальностью, что позволяет использовать микросателлиты для их генетической категоризации.

При оценке генетических расстояний изученные породы овец образовали три кластера, первый из которых сформирован грозненской и ставропольской породами, второй - ромни-марш и опаринской, третий - цигайской, сокольской и горнокарпатской породами. Каракульская и эдильбаевская по трехкомпонентному анализу оказались близки друг к другу, что связано с общностью их происхождения. Наиболее удаленной от остальных оказалась романовская порода.

MIKHAIL Y. OZEROV [RUSSIA]

"THE CHARACTERISTICS OF THE ALLELIC POOL OF DIFFERENT SHEEP BREEDS USING MICROSATELLITES".

In the present study, a microsatellite analysis lor an assessment of genetic profile of different sheep breeds in Russia and Ukraine is introduced lor the first time. The DNA bank of 10 Russian and Ukrainian sheep breeds was created and genetic variation of the breeds were studied using 16 microsatellite loci. The average heterozygosity of studied mirosatellite loci was 75,2%.

The results of observed and expected heterozygosity and F-statistics (intrabreed FJS estimates) showed the low probability of inbreeding. FST estimate indicated that genetic differences between the breeds explained 5,3 % ofthe total genetic variation. The bottleneck test indicated a loss oflow-frequency alleles in Grozney breed (the bottleneck effect). All 10 investigated sheep breeds have well defined individuality that allows to use microsatellites for their genetic categorization.

The sheep breeds were grouped into 3 clusters: the first cluster was formed by Grozney and Stavropol breeds, the second - by Romney-Marsh and Oparino breeds and the third - by Tsigai, Sokolakaya and Carpathian Mountain breeds. Karakul and Edilbaev breeds were close to each other according to the principal components analysis, this can be explained by the common origin of these breeds. Romanov sheep showed divergence from the other breeds.

». 1442

РНБ Русский фонд

2004-4 26001

Издательство РУЦ ЭБТЖ 142132, Московская обл., Подольский р-н, п Дубровицы Тел. (8-27) 65-14-24, (8-27) 65-14-07

Сдано в набор 15 01 04. Подписано в печать 16.01.04 Заказ № 2. Уч -изд. л 1,0 Тираж 150 экз.

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Озеров, Михаил Юрьевич

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Зоологическая, территориальная и производственная классификация овец

1.2. Краткая история по терминологии и номенклатуре микросателлитов

1.3. Распределение микросателлитов по геному человека и животных

1.4. Функциональная роль микросателлитов

1.5. Мутационные механизмы изменений в микросателлитах

1.6. Применение микросателлитов для исследования сельскохозяйственных животных

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Реактивы, ферменты, растворы и материалы

2.2. Породы овец

2.3. Список микросателлитных маркеров

2.4. Выделение и проверка концентрации ДНК

2.5. Полимеразная цепная реакция

2.6. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК в полиакриламидном геле

2.7. Разделение фрагментов ДНК методом капиллярного электрофореза

2.8. Программы и методы статистической обработки результатов

ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Характеристика 16 локусов микросателлитов

3.2. Определение числа аллелей и гетерозиготности у изученных пород овец

3.3. Оценка генетического равновесия по Харди-Вайнбергу в исследованных популяциях овец

3.4. Анализ внутрипопуляционного генетического разнообразия у различных пород овец методом Б-статистики

3.5. Определение эффекта «бутылочного горлышка» в 87 исследованных породах овец

3.6. Компьютерное моделирование для идентификации чистоты исследованных пород овец

3.7. Дифференциация пород овец на основе расчета генетических расстояний

ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Характеристика аллелофонда у различных пород овец по микросателлитам"

Актуальность темы. В настоящее время существует 9 типов различных систем генетических маркеров (Roychoudhury А.К., Nei М., 1988; COGNOSAG Workshop Report, 1992; Марзанов Н.С., 1991, 1994; Lauvergne JJ. et al., 1996; Терлецкий В.П., 1999; Cockett N.E. et al., 2001). Практически все виды домашних жвачных изучены с помощью этих систем, за исключением системы ДНК-маркеров. Наиболее информативными оказались открытые в последнее десятилетие маркеры, принадлежащие к повторяющейся фракции геномной ДНК - микросателлиты, демонстрирующие необычайно высокий уровень полиморфизма (Tautz D., 1989; Vogt P., 1990; Weber J.L., 1990; Goldstein D., Schlotterer С., 1999; Tapio M. et al., 2000; Zhao S. et al., 2000). Микросателлиты являются нейтральными маркерами, это делает возможным их использование для оценки генетического разнообразия популяций. Они так же подходят для проведения теста на достоверность происхождения потомства, теста на диагностику эффекта «бутылочного горлышка» в популяции, генетической категоризации пород. Микросателлиты наследуются из поколения в поколение и обладают относительно высокой скоростью мутаций, что позволяет использовать их при оценке дивергенции и установления эволюционно-генетических связей между популяциями.

Цель и задачи исследования. Целью работы являлось исследование различных пород овец России и Украины с использованием микросателлитов в качестве генетических маркеров. В связи с этим решали следующие задачи:

1. Создать банк ДНК различных пород овец.

2. Дать характеристику пород овец по частотам встречаемости аллелей и генотипов с использованием 16 микросателлитных маркеров.

3. Определить общность аллелей и генотипов овец различных пород.

4. Дать характеристику различных пород овец по эффекту "бутылочное горлышко".

5. Провести анализ происхождения и исторических связей овец России и

Украины.

Научная новизна и практическая значимость работы, реализация результатов исследований. Впервые проведены исследования по изучению полиморфных локусов микросателлитов овец. Создан банк ДНК овец. Изучен аллелофонд у 10 пород овец по 16 микросателлитным маркерам. Определен уровень генетического разнообразия, показан уровень гетерозиготности. Дана характеристика 10 пород овец по показателям Б-статистики: определен коэффициент инбридинга для каждой породы; показан уровень межпородного и внутрипородного разнообразия. Проведены исследования на установление идентичности пород. Установлен эффект "бутылочного горлышка" у овец грозненской породы. Определены генетические расстояния у 10 пород овец России и Украины и на их основе построена дендрограмма. Проведена оценка генетических дистанций с помощью анализа основных компонент и на основе этих данных построена трехмерная диаграмма.

Положения, выносимые на защиту. Разработка методов выявления микросателлитных маркеров для оценки аллелофонда пород овец России и Украины, определение общности аллелей и генотипов у различных пород овец. Оценка генетического разнообразия пород овец Российской Федерации и Украины. Установление происхождения и историко-генетических связей между породами овец России и Украины.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и одобрены на ученых советах Всероссийского ГНИИ животноводства РАСХН (20002003) и сельскохозяйственного института МТТ Агрифуд Ресерч (Йокиоинен, Финляндия) (2002-2003).

Публикация материалов. По материалам диссертации опубликовано 2 научные работы.

Объем работы. Диссертационная работа состоит из введения, трех глав, обсуждения, выводов, практических предложений, списка

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Озеров, Михаил Юрьевич

выводы

1. Создан банк ДНК 10 пород овец Российской Федерации и Украины. Проведены исследования по 16 локусам микросателлитов. Обнаружено 207 аллелей, из них: 11 аллельных вариантов локуса МАР65; 14 -ОагНН47; 8 - МАР214; 10 - ОагУН72; 11 - МсМ527; 10 - МАР48; 23 -ОагБСВ304; 14 - ОагРСВ48; 13 - ОагРСВ128; 19 - ВМ4621; 10 - ВМ0757; 16 - ВМ1314; 9 - ВМ6506; 14 - ВМ6526; 9 - ВМ8125 и 16-1ША023.

2. Уровень гетерозиготности исследованных локусов микросателлитов составил от 53,0% по локусу МАБ214 до 88,0% по локусу ГЫ11А023. Средний уровень гетерозиготности был равен 75,2%. Все использованные локусы микросателлитов для оценки полиморфизма (Р1С) являются высокоинформативными.

3. Уровень наблюдаемой гетерозиготности у каждой из исследованных пород овец не отличался статистически достоверно от уровня ожидаемой гетерозиготности. Эти данные и показатели Б-статистики свидетельствуют о низкой вероятности инбридинга во всех исследованных породах овец по микросателлитам.

4. Показатель «индекса фиксации» (Р$т) свидетельствует о высоком внутрипородном разнообразии (94,7%) исследованных пород овец, которое выше чем у крупного рогатого скота (88,6%) и коз (85,7%).

5. Изучение эффекта «бутылочного горлышка» показало потерю редких аллелей у овец грозненской породы, что указывает на резкое снижение численности за последние годы исследованного стада или на использование в нем одних и те же баранов-производителей или их потомков.

6. Проведение исследований на идентичность показало, что все 10 изученных пород овец обладают четко выраженной индивидуальностью, что позволяет использовать микросателлиты для их генетической категоризации.

7. При оценке генетических расстояний изученные породы овец образовали три кластера, первый из которых сформирован грозненской и ставропольской породами, второй - ромни-марш и опаринской, третий -цигайской, сокольской и горнокарпатской породами. Каракульская и эдильбаевская по трехкомпонентному анализу оказались близки друг к другу, что связано с общностью их происхождения. Наиболее удаленной от остальных пород оказалась романовская.

1. Рекомендуется использование в овцеводстве метода анализа по микросателлитам и статистических программ Arlequin, Bottleneck, Dispan, Fstat, GenePop, Structure для генетической категоризации пород, оценки аллелофонда, определения генетических расстояний, уровня гетерозиготности, показателей F-статистики Райта, эффекта «бутылочного горлышка» у широко разводимых и локальных пород овец.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Озеров, Михаил Юрьевич, п. Дубровицы, Московской обл.

1. Айала Ф. Введение в популяционную и эволюционную генетику. М.:Мир.- 1984.-232с.

2. Айала Ф., Кайгер Дж. Современная генетика. М.: Мир. Т.З - 1988. -335с.

3. Амерханов Х.А., Марзанов Н.С. Генетики работают на будущее // Племенное дело. 1999. - №1 (октябрь). - С.7-9.

4. Воронцов H.H. О работах по советско-американской программе «Систематика и эволюция голарктических млекопитающих» // Биологические исследования на Дальнем Востоке. Владивосток. - 1985.- С.23-28.

5. Воронцов H.H., Гаспарян K.M. Генофонд диких баранов в отдаленной гибридизации // Природа. 1988. - №4. - С.49-53.

6. Ерохин А.И., Ерохин С.А. Динамика овец и коз в мире и странах СНГ // Овцы, козы, шерстяное дело. 2002. - №2. - С.42-43.

7. Животовский Л.А. Популяционная биометрия. М.: Наука. 1991. - 271с.

8. Литовченко Г.Р., Есаулов П.А. Овцеводство. М.:Колос. 1972. - Т.2. -566с.

9. Люцканов П.И. Группы крови овец и их использование в селекции // Автореф. дис. канд. с.-х. наук. Л. 1990. - 22с.

10. Марзанов Н., Саморуков Ю. Как нам спасти вымирающие виды животных // Животноводство России. 2003. - №3 - С.8-9.

11. Марзанов Н.С. Иммунология и иммуногенетика овец и коз. Кишинев: Штииница.- 1991.-238с.

12. Марзанов Н.С. Лекция: «Генетические маркеры у свиней». Дубровицы. -2002. 7с.

13. Марзанов Н.С. Физиологические маркеры крови овец и коз: теоретические и прикладные аспекты их применения // Автореф. дис. докт. биол. наук. Дубровицы. 1994. - 37с.

14. Марзанов Н.С., Магомадов Т.А. Аллелофонд овец романовской породы // Сельскохозяйственная биология. 1997. - №2. - С.37-41.

15. Машуров A.M. Генетические маркеры в селекции животных. М.:Наука. -1980.-320с.

16. Озеров М.Ю., Марзанов Н.С., Насибов М.Г., Кантанен Ю., Тапио М. Генетический профиль у различных пород овец по микросателлитам // Вестник Российской Академии Сельскохозяйственных Наук. 2003. - №5. - С.72-75.

17. Столповский Ю.А. Консервация генетических ресурсов сельскохозяйственных животных: проблемы и принципы их решения. М.: «Эребус». 1997.- 112 с.

18. Сулыма Я.Ф. Результаты скрещивания горнокарпатских овец с баранами цигайской породы // Сб. тр. Горского СХИ «Горное овцеводство». Орджоникидзе.- 1963.

19. Тапильский И.А., Семин A.A., Сидельников В.А. О кучугуровских овцах (Местные овцы Воронежской обл.) // Овцы,козы,шерстяное дело. 1997. -№5-6.- С. 37-38.

20. Эрнст Л.К., Дмитриев Н.Г., Паронян H.A. Генетические ресурсы сельскохозяйственных животных в России и сопредельных странах. Санкт-Петербург. 1994. - 473с.

21. Achmann R., Brem G. Parentage control in Austrian domestic mountain sheep (Ovis aries) using DNA microsatellite analysis // Animal Genetics.-1998.-Vol.29-P. 12-13.

22. Barker J.S.F., Tan S.G., Moore S.S., Mukherjee T.K., Matheson J.-L., Selvaraj O.S. Genetic variation within and relationships among populations of Asian goats (Capra hircus) // J. Anim. Breed. Genet. 2001. - Vol. 118. - P.213-233.

23. Beckman J.S., Weber J.L. Survey of human and rat micro satellites // Genomics. 1992. - Vol.12. - P.627-631.

24. Brais B., Bouchard J.-P., Xie Y.-G., Rochefort D.L., Chretien N. et al. Short GCG expansions in the PABP2 gene cause oculopharingeal muscular distrophy //Nature Genetics. 1998.-Vol. 18.-P. 164-167.

25. Bredbacka P., Koskinen M.T. Polymorphism of microsatellite loci used in parentage testing in Finnish Ayrshire and Hoi stein populations // Animal Genetics. 1998. - Vol. 29. - P. 10-11

26. Buchanan F.C., Adams L.J., Littlejohn R.P., Maddox L.F., Crawford A.M. Determination of evolutionary relationships among sheep breeds using microsatellites // Genomics. 1994. - Vol.22. - P. 347-403.

27. Buchanan F.C., Crawford A.M. Ovine dinucleotide repeat polymorphism at the MAF214 locus // Animal Genetics. 1992. - Vol.23. - P.394.

28. Buchanan F.C., Crawford A.M. Ovine microsatellites at the OarFCBll, OarFCB128, OarFCB193, OarFCB266 and OarFCB304 loci // Animal Genetics. 1993. - Vol.24. - P. 145.

29. Buchanan F.C., Galloway S.M., Crawford A.M. Ovine microsatellites at the OarFCB5, OarFCB19, OarFCB20, OarFCB48, OarFCB129 and OarFCB226 loci // Animal Genetics. 1994. - Vol.25. - P.60.

30. Buchanan F.C., Swarbrick P.A., Crawford A.M. Ovine dinucleotide repeat polymorphism at the MAF48 locus // Animal Genetics. 1991. - Vol.22. -P.379-380.

31. Campuzano V., Montermini L., Molto M.E., Pianese L., Cossee M., Cavalcanti F. et al. Friedreich's Ataxia: autosomal recessive disease caused by an intronic GAA triplet repeat expansion // Science. 1996. - Vol.271. - P. 1423-1427.

32. Cockett N.E., Shay T.L., Smit M. Analysis of the sheep genome // Physiol. Genomics. 2001. - Vol.7. - P.69-78.

33. Cornuet J.-M., Luikart G. Description and power analysis of two tests for detecting recent population bottlenecks from allele frequency data // Genetics. -1997. Vol.144. - P.2001-2014.

34. Crawford A.M., Cuthbertson R.P. Mutations in sheep microsatellites // Genome research. 1996. - Vol.6. - P.876-879.

35. Dallas J.F. Estimation of the microsatellite mutation rates in recombinant inbred strains of mouse // Mammalian genome. 1992. - Vol.3. - P.452-456.

36. Deka R., Shiver M.D., Yu L.M., Aston C., Chackraborty R., Ferrel R. Conservation of human chromosome 13 polymorphic microsatellite (CA)n repeats in chimpamzees // Genomics. 1994. - Vol.22. - P.226-230.

37. Dib C., Faure S., Fizames C., Samson D., Drouot N., Vignal A. et al. A comprehensive genetic map of the human genome based on 5264 microsatellites //Nature. 1996. - Vol.380. - P. 149-152.

38. Diez-Tascon C., Littlejohn R.P., Ameida P.A.R., Crawford A.M. Genetic variation within the Merino sheep breed: analysis of closely related populations using microsatellites // Animal Genetics. 2000. - Vol.31. - P.243-251.

39. Dover G.A. Molecular drive: a cohesive mode of species evolution // Nature. -1982. Vol.299.-P.l 11-117.

40. Eichler E.E., Kunst C.B., Lugenbeel K.A., Ryder O.A., Davidson D., Warren S.T. et al. Evolution of the cryptic FMR1 CGG repeat // Nature Genetics. -1995.-Vol.11.-P.301-307.

41. Ellegren H. Mutation rates at porcine microsatellite loci // Mammalian Genome.- 1995.-Vol.6.-P.376-377.

42. Ellegren H., Moore S., Robinson N., Byrne K., Ward W., Sheldon B. Microsatellite evolution a reciprocal study of repeat lengths at homologous loci in cattle and sheep // Molecular Biology and Evolution - 1997. - Vol.14. -P.854-860.

43. Field D. and Wills C. Long, polymorphic microsatellites in simple organisms // Proceeding of the Royal Society of London B. 1996. - Vol.263. - P.209-215.

44. Frankel O.H., Soule M.E. Conservation and evolution // Cambrige University Press. Cambrige. - U.K. - 1981.

45. Frankham R. Inbreeding depression: a threshold effect // Conservation Biology.- 1995.- Vol.9. -P.792-799.

46. Freudenreich C.H., Stavenhagen J.B., Zakian V.A. Stability of a CTG/CAG trinucleotide repeat in yeast is dependent on its orientation in the genome // Molecular and Cell Biology. 1997. - Vol.17. - P.2090-2098.

47. Genzini E., Blasi M., Capuano M., Lanza A., Senese C. Amplification of seven microsatellites for parentage identification in Itailan buffalo // Animal Genetics.- 1998. V.29. - P. 10.

48. Gillies S.D., Folsom B., Tonegawa S. Cell-type specific enchancer element associated with a mouse MHC gene // Nature. 1984. - Vol.310. - P.594-597.

49. GOGNOSAG Workshop Report // Animal Genetics. 1992. - Vol.23. - N2. -P.188-192.

50. Goldstein D.B., Schlotterer C. (eds.) Microsatellites. Evolution and applications. Oxford University Press. 1999. - 342 p.

51. Gortari M.J., Frecking B.A., Kappes S.M., Leymaster K.A., Crawford A.M., Stone R.T., Beattie C.W. Extensive genomic conservation of cattle microsatellite heterozygosity in sheep // Animal Genetics. 1997. - Vol.28. -P.274-290.

52. Guo S.W. and Thompson E.A. Performing the exact test of Hardy-Weinberg proportions for multiple alleles // Biometrics. 1992. - Vol.48. - P.361-372.

53. Haldane J.B.S. An exact test for randomness of mating // J. Genet. 1954. -Vol.52.-P.631-635.

54. Hancock J.M. Simple sequences in a 'minimal' genome // Nature Genetics. 1996. Vol. 13 P. 14-15.

55. Hancock J.M. The contribution of slippage-like processes to genome evolution // Journal of Molecular Evolution. 1995. - Vol.41. - P. 1038-1047.

56. Hayes T.E., Dixon J.E. Z-DNA in the rat somatostatin gene // Journal of Biological Chemistry. 1985. - Vol.260. - P.8145-8156.

57. Hedrick P.W., Brussard P.F., Allendorf F.W., Beardmore J.A., Orzack S. Protein variation, fitness, and captive propagnation // Zoo Biology. 1986. -Vol.5. -P.91-99.

58. Hedrick P.W., Miller P.S. Conservation genetics: techniques and fundamentals // Ecological Applications. 1992. - Vol. 2. - P.30-46.

59. Henderson S.T. and Petes T.D. Instability of simple sequence DNA in Saccharomyces cerevisiae // Molecular and Cell Biology. 1992. - Vol.12. -P.2749-2757.

60. Henry H.M., Penty J.M., Pierson C.A., Crawford A.M. Ovine microsatellites at the OarHH35, OarHH41, OarHH44, OarHH47 and OarHH64 loci // Animal Genetics. 1993. - Vol.24. - P.222.

61. Hino O., Testa J., Buetow K., Taguchi T., Zhou Y., Bremer M. et al. Universal mapping probes and the origin of human chromosome 3 // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1993. - Vol.90. - P.730-734.

62. Holland B.S., Copenhaver M. Improved Bonferroni-type multiple testing procedures // Psychological Bulletin. 1988. - Vol.104. - P. 145-149.

63. Holm S. A simple sequentially rejective multiple test procedure // Scandinavian Journal of Statistics. 1979. - Vol.6. - P.65-70.

64. Hulme D.J., Silk J.P., Redwin J.M., Barendse W., Beh K.J. Ten polymorphic ovine microsatellites // Animal Genetics. 1994. - Vol.25. - P.434-435.

65. Jeffreys A.J., Tamaki K., MacLeod K., Monckton D.G., Neil D.L., Armour J.A.L. Complex gene convertion events in germline mutation at human minisatellites // Nature Genetics. 1994. - Vol.6. - P.136-145.

66. Kantanen J. Genetic diversity of domestic cattle (B. taurus) in North Europe. Joensuu. 1999. - lOOp.

67. Kashi Y., King D., Soller M. Simple sequence repeats as a source of quantitative genetic variation // Trends in Genetics. 1997. - Vol.13. - 74-78.

68. Koller E., Hayman A.R., Trueb B. The promoter of the chicken a2 (VI) collagen gene has features characteristic of house-keeping genes and of proto-oncogenes // Nucleic Acids Research. 1991. - Vol.19. - P.485-491.

69. Kunzler P., Matsuo K., Schaffner W. Pathological, phisiological and evolutionary aspects of short unstable DNA repeats in the human genome // Biological Chemistry Hoppe Seyler. 1995. - Vol.376. - P.201-211.

70. Kwiatkowski D.J., Henske E.P., Weimer K., Ozelius L., Gusella J.F., and Haines J. Construction of GT polymorphism map of human 9q // Genomics. -1992. Vol.12. -P.229-240.

71. Lagercrantz U., Ellegren H., Andersson L. The abundance of various polymorphic microsatellite motifs differs between plants and vertebrates // Nucleic Acid Research. 1993. - Vol.21. - 1111 -1115.

72. Lande R. Genetics and demography in biological conservation // Science. -1988. Vol.214. - P.1455-1459.

73. Lande R. Risk of population extinction from fixation of new deleterious mutations // Evolution. 1994. - Vol.48. - P. 1460-1469.

74. Lauvergne J.J., Dolling C.H.S., Renieri C. Mendelian inheritance in sheep // Camerino. Italy. - 1996. - 214p.

75. Leberg P.L. Influence of genetic variability on population growth: implications for conservation // Journal of Fish Biology. 1990. - Vol.37(A). - P.193-195.

76. Levinson G., Gutman G.A. High frequencies of short frameshifts in poly-CA/TG tandem repeats borne by bacteriophage M13 in Escherichia coli K-12 // Nucleic Acid Research. -1987. Vol.15. - 5323-5328.

77. Lue N.L., Buchman A.R., Kornberg R.D. Activation of yeast RNA polymerase II transcription by a thymidine-rich upstream element in vitro // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1989. - Vol.86. - P.486-490.

78. Luikart G., Cornuet J.-M. Empirical evaluation of a test for identifying recently bottlenecked populations from allele frequency data // Conservation Biology. -1998.-Vol.12.-P.228-237.

79. Maleviciute J., Baltrenaite L., Miceikiene I. Domestic cattle breed diversity in Lithuania // Veterinary Medicine and Zootechnics. 2002. - Vol.20. - P.87-91.

80. Marzanov N.S. State and prospects of merino sheep breeding in the Russian Federation // Proceedings of the 6th world merino conference. Budapest. -Hungary. 2002. - P.44-49.

81. McKeon C., Schmidt A., de Crombrugghe B. A sequence conserved in both the chicken and mouse a2 (I) collage promoter contains sites sensitive to SI nuclease // Journal of Biological Chemistry. 1984. - Vol.259. - P.6636-6640.

82. Miller S.A., Dykes D.D., Polesky H.F. A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells // Nucleic Acid Research. 1988. -Vol. 16.-P.1215.

83. Morral N., Nunes V., Casals T. And Estivill X. CA/GT microsatellite alleles within the cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) gene are not generated by unequal crossingover // Genomics. 1991. - Vol.10. -P.692-698.

84. Nei M. Genetic distances between populations // Am. Nat. 1972. - Vol.106. -P.283-292.

85. Nielsen R. A likelihood approach to population samples of microsatellite alleles // Genetics. 1997. - Vol.146. - P.711-716.

86. Pierson C.A., Hanraham V., Ede A .J., Crawford A.M. Ovine microsatellites at the OarVH34, OarVH41, OarVH58, OarVH61 and OarVH72 loci // Animal Genetics. 1993. - Vol.24. - P.224.

87. Polli M., Del Bo L., Ceriotti G., Longeri M., Zanotti M. Genetic distances of seven cattle breeds of the Italian Alpine area by microsatellites // Animal Genetics. 1998. - Vol.29. - P. 9-10.

88. Pritchard J.K., Stephens M., Donnelly P. Inference of population structure using multilocus genotype data // Genetics. 2000. - Vol.155. - P.945-959.

89. Rousset F., Raymond M. Testing heterozygote excess and deficiency // Genetics. 1995. - Vol.140. - P. 1413-1419.

90. Schug M.D., Mackay T.F.C., Aquadro C.F. Low mutation rates of microsatellite loci in Drosophila melanogaster // Nature Genetics. 1997. -Vol.15-P.99-102.

91. Schug M.D., Wetterstrand K.A., Gaudette M.S., Lim R.H., Hutter C.M., Aquadro C.F. The distribution and frequency of microsatellite loci in Drosophila melanogaster // Molecular Ecology. 1998. - Vol.7. - P.57-69.

92. Seaman M.A., Levin K.R. and Serlin R.C. New developments in pairwise multiple comparisons: Some powerful and practicable procedures // Psychological Bulletin. 1991. - Vol.110. - P.577-586.

93. Shen L.-P., Rutter W.J. Sequence of the human somatostatine gene // Science. -1984.-Vol.224.-P.168-170.

94. Sia E.A., Jinks-Robertson S., and Petes T.D. Genetic control of microsatellite stability // Mutation Recearch. 1997. - Vol.383. - P.61-70.

95. Stallings R.L. CpG supression in vertebrale genomes does not account for the rarity of (CpG)n microsatellite repeats // Genomics. 1992. - Vol.17. - P.890-891.

96. Stallings R.L. Distribution of trinucleotide microsatellites in different categories of mammalian genomic sequence: implications of human genetic diseases // Genomics. 1994. - Vol.21. - P. 116-121.

97. Stallings R.L., Ford A.F., Nelson D., Torney D.C., Hildebrand C.E., Moyzis R.K. Evolution and distribution of (GT)n repetitive sequences in mammalian genomes//Genomics. 1991. - Vol.10. -P.807-815.

98. Strand M., Prolla T.A., Liskay R.M., Petes T.D. Déstabilisation of tracts of simple repetitive DNA in yeast by mutations affecting DNA mismatch repair // Nature. 1993. - Vol.365. - P.274-276.

99. Suraokar M., Bradley A. Genetics: Targeting sheep // Nature. 2000. -Vol.405-P. 1004-1005.

100. Sutherland G.R., Richards R.I. Simple tandem DNA repeats and human genetic disease // Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA. 1995. - Vol.92. - P.3636-3641.

101. Tapio M., Miceikiene I., Kantanen J. Microsatellite and blood proteindiversity in the sheep breeds of Finland and North-Western Russia // Animalth

102. Genomics: Synthesis of Past, Present, and Future Directions. 27 International Conference on Animal Genetics. Minnesota. 2000. - P.78.

103. Tautz D. Hypervariability of simple sequences as a general source for polymorphic DNA markers // Nucleic Acids Research. 1989. - Vol.17. - P. 6463-6471.

104. Tautz D., Renz M. Simple sequences are ubiquitous repetitive components of eukariotic genomes // Nucleic Acids Research. 1984. - Vol.12 - P.4127-4138.

105. Vaiman D., Imam-Chali M., Moazami-Goudarzi K., Guerin G., Nocart M., Grobs C., Leveziel H., Saidi-Mehtar N. Conservation of a synthenic group of microsatellite loci between cattle and sheep // Mammalian Genome. -1996. P. 676-683.

106. Valle G. TA-repeat microsatellites are closely assosiated with ARS consensus sequence in yeast chromosome III // Yeast. 1993. - Vol.9. - P.753-759.

107. Vankan D.M., Hefford C.G., Faddy M.J. Efficacy and reliability of paternity testing in cattle using DNA microsatellites // Animal Genetics. 1998. - Vol.29. -P. 9.

108. Vogt P. Potential genetic functions of tandem repeated DNA sequence blocks in human genome are based on highly conserved chromatine folding code // Human Genetics. 1990. - Vol.84. - P.301-336.

109. Weber J.L. and Wong C. Mutation of human short tandem repeats // Human Molecular Genetics 1993. - Vol.2. - P. 1123-1128.

110. Weber J.L. Informativeness of human (dC-dA)n*(dG-dT)n polymorphisms // Genomics. 1990. - Vol.7. - P. 524-530.

111. Weir B.S. Genetic data analysis // Sinauer Publ., Sunderland. MA. 1990.

112. Weir B.S., Cockerham C.C. Estimating F-statistics for the analysis of population structure // Evolution. 1984. - Vol.38. - P.1358-1370.

113. Wilson, D. E., and Reeder D. M. (eds.). Mammal Species of the World // Smithsonian Institution Press. 1993. - 1206 p.

114. Wintero A.K., Fredholm M., Thomsen P.D. Variable (dG-dT)n*(dC-dA)n sequences in the porcine genome // Genomics.-1992.-V. 12.-P.281 288.

115. World Watch List for domestic animal diversity. FAO. - 2000. - Rome. -725 p.

116. Wright J.M. Mutation at VNTRs: Are minisatellites the evolutionary progeny of microsatellites? // Genome. 1994. - Vol.37. - P.345-347.

117. Zhao S., Yang L., Li K., Yu M., Liu B. Analysis of genetic variation amongfive Chinese indigenous goat breeds by using bovine and ovine microsatellitesth

118. Animal Genomics: Syntesis of Past, Present, and Future Directions. 27 International Conference on Animal Genetics. Minnesota. 2000. - P.3.1. БЛАГОДАРНОСТИ