Гормональный баланс растений. Методы его изучения и регулирования

Курапов, Павел Борисович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гормональный баланс растений. Методы его изучения и регулирования
ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гормональный баланс растений. Методы его изучения и регулирования"

На правах рукописи

КУРАПОВ Павел Борисович

ГОРМОНАЛЬНЫЙ БАЛАНС РАСТЕНИЙ Методы его изучения и регулирования

Специальность 03.00.12 — Физиология растений

Автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

МОСКВА 1996

Работа выполнена в лаборатории регуляторов роста и развития сельскохозяйственных растений отдела сельскохозяйственной биотехнологии Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Якушкина Н. И., доктор биологических наук, профессор Полевой В. В., доктор биологических наук Власов П. В.

Ведущая организация — Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии.

в .... часов на заседании диссертационного совета Д. 120.35.07 в Московской сельскохозяйственной академии имени К. А. Тимирязева.

Адрес: 127550, г. Москва, Тимирязевская ул., д. 49. Ученый совет ТСХА.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной библиотеке ТСХА.

Защита состоится

1996 г.

Автореферат разослан

1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических

Лосева

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

1.1. Актуальность темы.

Природные и синтетические фиторегуляторы являются мощнейшим средством управления онтогенезом растений, они находят широкое применение з биотехнологии сельскохозяйственных растений и практическом растениеводстве. Фиторегуляторы - важное средство регулирования темпов? роста и развития растений, их продуктивности и качества урожая (Чайлахян 1982). В современном растениеводстве фиторегуляторы применяются также для повышения устойчивости агроценозов к неблагоприятным факторам внешней среды и позволяют существенно облегчить ряд технологических операций (Муромцев и др. 1987, Кораблева 1990).

К настоящему времени известно (Кофели 1987, Кулаевз 1994, Деева 1995, Якушкина 1995, Jackson 1993), что экзогенные фиторегуляторы воздействуют на растения путем изменения в них уровня и соотношения эндогенных фитогормонов. В этой связи, для их эффективного применения требуется детальное знание исходного соотношения фитогормонов и методов управления этим гормональным равновесием (балансом). На этой основе создается возможность применять регуляторы' роста и развития растений в целях значительного и с минимальными потерями повышения продуктивности сельскохозяйственных растений и качества сельскохозяйственной продукции.

Гормональная система растений является одной из главных составляющих регуляторных механизмов, обеспечивающих согласованное функционирование клеток, тканей, органов и растений в целом. Фитогор'моны выполняют также регуляторную функцию в процессах покоя, старения, поглощения и транспорта веществ, а также адаптации растений к внешним воздействиям.

Понятие гормонального баланса включает в себя динамику изменения состава и соотношения фитогормонов в онтогенезе. Соотношение эндогенных гормонов в растении постоянно меняется, при этом фитогормсны находятся в динамическом равновесии, поддерживаемым как за счет их транспорта (Trewavas 1983, Canny 1985), так и за счет взаимопревращения свободных и связанных форм (Кудоярова 1996, Bandurski 1979, 1991). Характерной особенностью этого равновесия является его чрезвычайная подвижность и чувствительность к внешним воздействиям. Анализ литературных данных показал, что на содержание фитогормонов могут в частности влиять такие внешние факторы как температура окружающей среды (Полевой В.В. и Полевой A.B. 1992), влажность воздуха (Lppez-Carbonell е.а. 1993) и почвы (Якушкина и Бахтенко 1991, El-Jaafari, o.a. 1993), освещенность (Potter & Rood 1993), промышленные загрязнения (Srivastava 1985), химические препараты (фиторегуляторов, гербициды), электромагнитное излучение (Ковалев 1995), механическиэ повреждения растений (Grochowska o.a. 1984), повреждения растений вредителями и болезнями

(Кислин 1991,1.993). Таким образом, практически любое внешнее воздействие приводит к изменению соотношения эндогенных фитогормонов в растении. Увеличивая или сокращая биосинтез отдельных фитогормонов растение адаптируется к внешнему воздействию. При этом соотношение фитогормонов может изменяться очень быстро, и эти изменения удается зафиксировать уже через час после воздействия на растение (Кепс!е е.а. 1992)., а иногда и раньше (Кийоуагоуа е.а. 1990). Существенным недостатком этих' работ является то, что в них изучалось, как правило, изменение концентрации одного, реже двух гормонов и определенную трудность представляет сопоставление разрозненных данных полученных разными авторами. В то же время, рядом авторов показано, что внешние воздействия могут изменять концентрации отдельных фитогормонов. Хорошо известны обширные литературные данные о взаимовлиянии гормонов в растениях, однако, об участии гормона в регуляторных процессах большинство авторов судят на основании изменений под влиянием экзогенных внесений и в меньшей степени по его эндогенному содержанию.

В литературе имеется обширный материал по.качественному и количественному анализу эндогенных фитогормонов (Мазин 1977, Кефели и Кислин, 1982, Сгог1ег & Оиг!еу 1989, Нес1с1еп 1993). Однако, в подавляющем большинстве работ авторы анализируют лишь одну, реже две группы фитогормонов. Работы, в которых количественно изучали три группы фитогормонов, очень редки (Кудоярова, 1996), и ни в одной работе не описано одновременное определение гиббереллиновых (ГК), абсцизовой (АБК), ин-долилуксусной (ИУК) кислот, цитокининов и этилена.

Поэтому исследование полного гормонального баланса растения в одном эксперименте особенно актуально, для чего необходимо создать комплексную методику, позволяющую анализировать полный гормональный баланс в каждой пробе растительного материала. Детальный анализ соотношения фитогормонов создает предпосылки для разработки методов управления с помощью фиторегуляторов гормональным балансом для целей практического растениеводства и создания эффективных технологий хранения сельскохозяйственной продукции.

1.2. Цель и задачи исследований.

Основная цель работы состоит в разработке методов изучения (контроля) и регулирования (управления) гормонального баланса растений для повышения их продуктивности и устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, а также снижения потерь при хранении сельскохозяйственной продукции.

В процессе достижения поставленной цели решались следующие задачи:

а) разработка комплексной высокопроизводительной методики анализа фитогормонов в одной навеске растительного материала;

б) апробация разработанной Методики определения фитогормонов на различных растениях (ячмень, картофель, пшеница, мята, наперстянка, дайкон, стахис, кормовая свекла, виноград, яблоня);

в) изучение характера взаимосвязи и взаимовлияния фитогормонов в растениях;

г) исследование изменения фитогормонального баланса при введении "предшественников фитогормонов в биосинтезе;

д) изучение динамики фитогормонов в онтогенезе ярового ячменя и кормовой свеклы;

е) изучение суточной динамики фитогормонального баланса растений ячменя;

ж) сопоставление фитогормонального баланса и процессов формирования вторичных метаболитов в лекарственных растениях;

з) разработка принципов регулирования гормонального баланса растений для повышения урожайности и качества сельскохозяйственной продукции и снижения потерь при хранении;

и) обоснование возможности применения гормональных тестов при селекционном отборе высокопродуктивных и устойчивых форм и сортов растений уже на ранних этапах онтогенеза.

1.3. Защищаемые положения

1. Теоретическое обоснование роли гормонального баланса растений и основы его формирования.

2. Принципы применения экзогенной регуляции гормонального баланса растений как для решения конкретных задач повышения продуктивности, устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды и снижения потерь при хранении, так и для целей селекции.

3. Комплексный метод анализа гормонов растений, позволяющий определить качественный и количественный состав пяти групп фитогормонов (гиббереллины, абсцизовая и индолилуксусная кислоты, цитокинины, этилен) в одной, сравнительно небольшой (до 50 г сырой массы) пробе.

1.4. Научная новизна.

Разработана комплексная высокопроизводительная и универсальная методика анализа фитогормонов. Проведенные с ее использованием многолетние исследования позволили выявить основные принципы формирования и сформулировать критерии экзогенного управления гормональным балансом растений. Эти критерии были апробированы для решения конкретных практических задач, таких как подавление "цветушности" дайкона, стимуляции продуктивности бессемянных сортов винограда, активации вторичного метаболизма у лекарственных растений, повышение продуктивности сельскохозяйственных растений и их устойчивости к неблагоприятным факторам внешней среды, а также получению более качественной сельскохозяйственной продукции и снижению потерь при ее хранении.

Впервые быЛа детально изучена суточная динамика фитогормоно-нального баланса ячменя и онтогенетическая динамика фитогормонов ячменя и свеклы.

Путем введения в растение мевалоновой кислоты впервые изучено влияние этого предшественника в биосинтезе фитогормонов на гормональный баланс растений.

На примере лекарственных растений (мята, наперстянка) впервые продемонстрирована тесная взаимосвязь гормонального баланса растений и формированием пула вторичных метаболитов.

Выявлены различия в сортовой отзывчивости ячменя связанные с гормональным балансом.

1.5. Использование результатов исследований.

Метод гормонального баланса был использован при создании технологии выращивания дайкона (ВНИИССОК, 1993-1995 гг.), хранения клубней стахиса, применении регуляторов роста для стимуляции биосинтеза биологически-активных веществ в лекарственных растениях (наперстянка, мята), увеличении выхода эргоалкалоидов из спорыньи (ВИЛАР, 1993-1995 гг.).

Результаты исследований использованы НПО "Прогноз" (г. Тула)"и ГОСНИИАС при разработке образцов генератора электромагнитных излучений для применения в индивидуальных и фермерских хозяйствах.

Материалы по влиянию регуляторов роста на гормональный статус растений и их продуктивность используются в лекциях для студентов и включены в учебное пособие "Сельскохозяйственная биотехнология"..

1.6. Апробация результатов исследований.

Основные результаты исследований по теме диссертации докладывались и обсуждались на международных конференциях Plant metabolism regulation (Варна 1990), 8-th Congress of plant physiology (Антверптен 1992.), Регуляторы роста растений (Москва 1991,1993, 1995), Новые и нетрадиционные растений (Пущино 1995), Физиология и биохимия этилена (Пущино 1995), Эффективность регуляторов роста (Краснодар 1990), Методы комплексной оценки продуктивности растений (Лесной городок 1994), симпозиумах по брассиностероидам (Минск 1991, 1993, 1995), втором съезде физиологов растений Белоруссии (Минск 1995), ежегодных научных конференциях ТСХА (Москва 1993, 1994, 1995), втором ежегодном симпозиуме "Физико-химические основы физиологии растений (Пенза 1996), совещании по применению физиологических методов в селекции и растениеводстве (Немчиновка 1994), втором совещании по пестицидам (Черноголовка 1990), конференциях по совершенствованию преподавания физиологии растений (Смоленск 1993, Орел 1994), конференции по регуляторам роста (Киев 1992), второй межвузовской конференции по влиянию физических и химических факторов на рост и развитие сельскохозяйственных культур (Орехово-Зуево 1996).

1.7. Публикации результатов исследований.

Автором опубликовано 138 печатных работ, в том числе по теме диссертации 54 работы, включая брошюру "Регуляторы роста растений" (коллектив авторов) и монографию "Физиологические основы селекции" (коллектив авторов), получено два патента.

Автор благодарит сотрудников Лаборатории регуляторов роста и развитая сельскохозяйственных растений ТСХА к.б.н. И.В.Скоробогатову, к.б.н. Н.Л.Карсункину, Г.Л.Сорки ну, А.Г.Сиушеву, Е.И.Сальникову, Т.А.Козик, к.с/х.н. С.И.Слепичева, Б.Е.Бумажного, Л.И.Бойценюка, д.б.н. В.М.Ковалева за помощь в проведении экспериментальных исследований.

Особую признательность автор выражает д.б.н., академику РАСХН В.С.Шевелухе за постоянное внимание и поддержку работы.

Автору хочется помянуть добрым словом покойного И.К.Блиновского, бывшего руководителя Лаборатории регуляторов роста и развития сельскохозяйственных растений некоторые идеи которого реализованы в настоящей работе.

2. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Объекты исследования

1. Яровой ячмень (Hordeum vulgare L.): сорта Зазерский 85, Носовский 9, Московский 3, Донецкий 8, Волгарь, Ноктюрн, Омский 86, Целинный 213.

2. Озимая пшеница (Triticum durum Desf.): сорт Мироновская 808.

3. Картофель (Solanum tuberosum L): сорт Невский.

4. Мята перечная (Mentha arvensis L.): сорта Москвичка, Лекарственная 4, Медичка, Прилукская 6.

5. Наперстянка шерстистая (Digitalis lanata Ehrh.) и наперстянка пурпуровая (Digitalis purpurea L).

6. Дайкон (Raphanus sativus L. var. longipinnatus Bailey): сорта Клык слона, Дракон, Spring Teller.

7. Стахис (Stachys sieboldii Miq.): сорта Ракушка.

8. Яблоня (Malus domestica Borkh.): сорта Антоновка обыкновенная, Уэлси.

9. Виноград (Vitis vinifera L.): сорта Хусайне и Кишмиш черный.

10. Кормовая свекла (Beta vulgaris L.): сорта Эккендорфская желтая.

2.2. Методы исследования

Лабораторные и полевые и опыты проводили в 1988 - 1995 гг. Полевые опыты с картофелем, яровым ячменем и озимой пшеницей выполнены в учхозе "Михайловское", со стахисом и дайконом - во ВНИИССОКе, с кормовой свеклой и яблоней в ТСХА, с лекарственными растениями в ВИЛА-Ре. Почвы полей - дерновоподзолистые, среднесуглинистые, уровень естественного плодородия средний. Повторность опытов 4-х кратная, размещение делянок рендомизированное, площадь опытных делянок 25 м3. Опыты

на винограде проводили в НПО "Дагагровинпром" на плодоносящих виноградниках. Культура винограда привитая, орошаемая, неукрывная. Схема посадки 4x2 м, система ведения кустов трехпроволочная вертикальная шпалера, форма кустов - двуплечий кордон на высоком штамбе. В течение вегетации проводились агротехнические мероприятия согласно общепринятой технологии выращивания этих культур. Учеты проводили весовым методом отбора проб, непосредственно перед уборкой в сроки соответствующие данным культурам. Обработку растений фиторегуляторами проводили путем опрыскивания. Контрольные растения опрыскивались водой.

Вегетационные опыты проводились на базе Лаборатории регуляторов роста и развития сельскохозяйственных растений Отдела сельскохозяйственной биотехнологии ТСХА, (Москва). Вегетационные опыты проводили в сосудах Митчерлиха объемом 6 л. Субстратом служила дерново-подзолистая почва, перемешанную с равным количеством торфа. Комплексное удобрение вносили в количестве 6 г на сосуд (Ы 20%, Р205 37%, К20 12%). В течение всего вегетационного периода влажность почвы поддерживалась весовым методом на уровне (60-70% от ПВ). В каждом сосуде выращивали 10 растений злаков и по одному растению картофеля или наперстянки. Образцы для определения фитогормонов отбирали во всех опытах в одно и тоже время (10 часов утра). Определение качественного и количественного содержания фитогормонов проводилось в одной навеске растительного материала.

Исследования по хранению клубней стахиса проводили в хранилище ВНИИССОКа. Клубни хранили 8 месяцев при температуре 2-4° С и при относительной влажности воздуха 85-90 % (Кононков и др., 1992 г.).

Анализ фитогормоиов (гиббереллины, абсцизовая кислота, индоли-луксусная кислота, цитокинины, этилен) выполнен по оригинальной методике, позволяющей анализировать большое количество проб. Химические анализы проводили в 3-4 повторностях для не менее, чем трех биологических проб. Ошибка методов определения фитогормонов во всех случаях не превышала 20 %. Фиксацию и хранение образцов для определения фитогормонов осуществляли охлажденным 80% метанолом.

Для проведения препаративной жидкостной хроматографии гиббе-реллинов сухой остаток растворяли в 3 мл начальной подвижной фазы и по 1 мл этого раствора вводили в инжектор жидкостного хроматографа фирмы "Вю^ошс" (ФРГ). В качестве неподвижной фазы использовали ис(1го$огЬ ООС-18. той же фирмы. Хроматографирование проводили на препаративной колонке 12,5x0.8 см в градиентном режиме, используя в качестве начальной подвижной фазы смесь воды, ацетонитрила и уксусной кислоты (160:40:1) с постепенным добавлением смеси ацетонитрила. и .уксусной кислоты (200:1). Скорость подачи подвижной фазы 2 мл/мин. Фракции, содержащие гиббереллины, упаривали, обрабатывали диазометаном и сили-лирующим агентом (раствор ВБТРА в ацетонитриле) и анализировались методом ГЖХ-МС.

ГЖХ-МС исследование гиббереллинов (ГК) и абсцизовой кислоты (АБК) проводили на приборе Kraios MS-25-RFA. Режим работы масс-спектрометра стандартный: ионизирующее напряжение 50 эВ, ток эмиссии катода 400 мкА, ускоряющее напряжение 4 кВ, температура источника 250° С. Хроматографирование проводили на капиллярной колонке CP-SIL 8 СВ -25,^, внутренний диаметр 0,32 мм. Программа температур 120 °С -» 10 град/мин -> 210 °С (1 мин.) -* 5 град/мин 250 °С (5 мин.) 45 град/мин -> 270 °С. Температура инжектора 220 °С. Газ-носитель - Не.

ВЭЖХ цитокининов проводили на приборах НРР-5001 (Чехия) и Beckman (Австрия). Условия хроматографирования: колонка фирмы Waters длиной 15 и диаметром 0,4 см, размер частиц 5 мм, заполненная "Ultrasphere С-18". Элюэнт - 50%-ный водный метанол, детектирование проводили при Х=254 нм, давление 1,0-1,3 кРа. Времена удерживания и площади пиков соединений, выходящих из колонки определялись автоматически с помощью интегратора CR-6A (Shimadzu). Для ВЭЖХ АБК использовали жидкостной хроматограф фирмы "Biotronic". Хроматографирование проводили на колонке размером 8x50 мм, заполненной поливинилпиролли-доном (0,47 г, Polyclar AT), с УФ-детектором (Хв„,лит=254нм). В качестве элюэнта применяли смесь вода-этилацетат-метанол-уксусная кислота (250:15:12:4), скорость элюции 1 мл/мин.

Для определения интенсивности выделения этилена свежие растительные образцы массой 40-50 г помещали в герметичные стеклянные емкости с пробками из самоуплотняющейся резины и выдерживапи в темном месте 4 часа при комнатной температуре, затем шприцем отбирали пробы газовой среды для определение этилена методом ГЖХ. Условия хроматографирования следующие: хроматограф "Carlo Erba 5300", колонка - 1200x3 мм, сорбент - "Хромосорб 107" (80-100-меш), газ-носитель азот с давлением на входе колонки 1 атм., детектор пламенно-ионизационный, расход водорода - 40 мл/мин., температура испарителя и колонки - 60 °С, температура детектора -100 °С, время удерживания этилена - 2 мин.

Состав эфирных масел мяты изучали методом ГЖХ и ГЖХ-МС по методике разработанной доц. Л.Б.Дмитриевым (ТСХА). Содержание сердечных гликозидов анализировали методом тонкослойной хроматографии (ТСХ), используя пластинки фирмы Merck и денситометр Shimadzu DR-2 (Япония). Окрашивающий реагент - раствор ксантгидрола.

Иммуноферментный анализ (ИФА) АБК, индолилуксусной кислоты (ИУК) и зеатина/зеатинрибозидя проводили в лунках полистирольного планшета. На первом этапе конъюгат гормона сорбировали на твердой фазе в течение 1,5 часов при температуре 37°С. После трехкратной промывки физиологическим раствором, содержащим 0,05 % твина-20, в лунки вносили антисыворотку к гормону, разведенную физиологическим раствором, содержащим 0,5 % бычьего сывороточного альбумина и 0,05 % твина-20, вместе с раствором стандарта гормона или растительным экстрактом. После инкубации (1 час 37°С) количество антител, специфически связан-

ных на планшете, определяли с помощью бараньих антител против иммуноглобулинов кролика, меченых пероксидазой. Для оценки активности пе-роксидазы использовали смесь следующего состава: 0.4 мг/мл орто-фенилендиамина в 0,06 М фосфатно-цитратном буфере pH 5,3, содержащем 0,006 % перекиси водорода. Оптическую плотность раствора после фиксации серной кислотой измеряли на автоматическом сканере Behring EL 311 (ФРГ). Для работы использовали наборы фирмы Idetek (США) и Института биологии Уфимского научного центра РАН.

При проведении аналитических работ использовали следующие вещества стандарты: зеатин (Z), зеатин-рибозид (ZR), дигидрозеатин (DHZ), дигидрозеатинрибозид (DHZR), изопентениладенин (IPA), гибберелловую (A3), абсцизовую и индолилуксусную кислоты и глюкозу производства фирмы Serva.

При разработке методики и изучении транспорта фитогормонов применялись изотопномеченные по углероду препараты A3, АБК, ИУК производства фирмы Amerstiam (Великобритания). Активность измеряли на счетчике Mark-2 или Rack Beta Spectral 1219 (фирма "LKB Wallac", Швеция) и выражали в распадах за минуту, используя стандартные кривые гашения.

Экспериментальные данные статистически обработывались с использованием программ Statgraf и Excel.

2.3. Условия проведения опытов.

1988 г. отличался низкими температурами в мае - начале июня и избыточным наличием осадков в начале вегетации, хотя в дальнейшем погодные условия были достаточно благоприятными для роста и развития растений. В 1989 году в течение всего вегетационного периода температура и влажность были нестабильными. Влажность почвы и воздуха в начале вегетации была низкой, во второй половине вегетации высокая температура днем (30° С) сменялась резкими похолоданиями в ночное время (до 18° С), выпадали обильные грозовые осадки. Подобные резкие колебания температуры и значительные осадки отмечались до конца вегетации. Метеоусловия вегетационного периода 1990 года характеризовались пониженной температурой и дефицитом влаги в первой половине вегетации и большим ее избытком во второй половине вегетационного периода. 1991 год отличался обилием осадков и их неравномерным распределением по месяцам и декадам. Для полевых исследований достаточно благоприятными были 1992, 1994 и 1995 годы. Для вегетационного периода 1993 года были характерны обилие осадков vi пониженные по сравнению со среднемноголет-ними данными температуры в течение всего вегетационного периода.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Разработка комплексного метода ънализа фитогормонов.

При разработке комплексного метода анализа фитогормонов мы исходили из предположения, что соотношение эндогенных гормоноо в расте-

нии постоянно меняется. Система гормонального баланса находится в динамическом равновесии. Характерной особенностью этого равновесия является его чрезвычайная подвижность и чувствительность к внешним воздействиям. Практически любое внешнее воздействие приводит к изменению соотношения эндогенных фитогормонов в растении. Ответной реакцией растения на внешние раздражители является увеличение или сокращений' биосинтеза отдельных фитогормонов, таким образом, чтобы по возможности компенсировать это воздействие и вернуть систему гормонального баланса к равновесию, поддерживая гормональный гомеостаз.

Наличие в биосинтезе фитогормонов общих предшественников и известное расположение "метаболических вилок" позволяют в ряде случаев предположить, каким образом внешнее воздействие будет изменять гормональный баланс. Исходя из общих принципов химической кинетики следует ожидать, что экзогенное увеличение концентрации одного из фитогормонов будет смещать гормональный баланс, подавляя биосинтез этого гормона и стимулируя образование другого (или других) фитогормонов. Исходя из этого, зная исходное соотношение фитогормонов и способы действия каждого из них можно предложить методы целенаправленного влияния на физиологические процессы, включая регуляцию роста и развития растений.

В связи с чрезвычайной лабильностью гормонального равновесия в растении анализ фитогормонов особенно важно проводить из одной навески растительного материала. Образцы опытных и контрольных растений следует отбирать строго одновременно, что позволит исключить ошибки, связанные со случайными, неконтролируемыми факторами. Для получения полной картины состояния фитогормонального баланса растений отборы следует проводить в разных органах, в динамике по фазам развития или срокам хранения. Для выполнения большое количество анализов с минимальными затратами необходимо, т.е. что называется "поставить анализ фитогормонов на поток".

Поэтому, в первую очередь мы разработали оригинальную комплексную высокопроизводительную и высокочувствительную методику анализа пяти групп фитогормонов в одной навеске растительного материала, что позволяет исключить случайные ошибки связанные с отбором проб. Разработанная нами аналитическая процедура применима или легко модифицируема для изучения фитогормонов в растениях разных видов и форм и дает возможность анализировать большое количество проб.

Первоначально методика разрабатывалась для анализа АБК и ГК в побегах яблони, затем она была расширена для определения цитокининов, ИУК и этилена у других растений.

Для оценки точности методов и при их разработке использовались изотопно-меченые индикаторы.

Схема выделения и анализа фитогормонов

Определение этилена, метод

Образец растительного мате- ГЖХ

риала

_Лиофилизация_

_I_

| Экстракция 80% метанолом |

_I_

| Фильтрование и упаривание метанольного экстракта до водного остатка |

Количественное определение эндогенных гиббереллинов в образцах растительного происхождения - это сложная и трудоемкая задача. Часто используемый на практике метод биотестирования хотя и имеет опреде-

ленные достоинства (высокая скорость, простота и доступность), но и обладает существенными недостатками (низкая воспроизводимость, отсутствие селективности по отдельным гиббереллинам, приблизительность количественной оценки). Кроме того, методом биотестирования определяется не абсолютное содержание ГК, а их активность в данном биотесте (Кефели 1973). Описанные в литературе методики анализа фитогормонов в растительных образцах методами ГЖХ и ГЖХ-МС требуют многостадийной предварительной очистки и концентрирования. Способ очистки во многом зависит от выбора объекта исследования и возможностей экспериментатора. Многие известные методики анализа гиббереллинов из-за своей трудоемкости на стадиях выделения и концентрирования не пригодны для серийного анализа большого количества образцов.

Поэтому при разработке методики пригодней для серийного количественного определения эндогенных гиббереллинов, в качестве метода анализа мы выбрали хромато-масс-спектрометрию в модификации селективного ионного детектирования (SIM). Применение методики SIM позволяет уменьшить количество стадий предварительной очистки и концентрирования экстрактов растительных образцов за счет высокой селективности и чувствительности метода. Для получения удовлетворительных хроматографических характеристик образцы растительных экстрактов анализировались в виде их триметилсилиловых (ТМС), метиловых (Me) и ТМС-Ме эфиров. Метиловый эфир АБК существенно отличается по времени удерживания (Rt) от метиловых эфиров гиббереллинов и легко определяется в рамках этого метода в одной пробе с ГК.

По литературным данным (Муромцев, Чкаников, Кулаева, Гамбург 1987) содержание гиббереллинов и АБК в растениях составляет 20-400 нг/г сырой массы, а других органических .кислот - нескольких десятков мг/г. Сложность разработки методики состояла в том, чтобы на фоне мажорных веществ надежно определить содержание минорных компонентов. Нам удалось, варьируя скорость газа-носителя и температурную программу, подобрать такие условия, при которых большая часть мажорных компонентов имеет время удерживания существенно большее или меньшее, чем гиббе-реллины и АБК. Как правило, перед проведением хромато-масс-спектрального исследования проводят двухстадийную хроматографи-ческую очистку растительных экстрактов с использованием ВЭЖХ. Однако, это неприемлемо для серийного анализа, главным образом из-за своей трудоемкости и большого расхода дорогостоящих растворителей, поэтому в качестве предварительной очистки растительных образцов мы использовали экстракцию. Этот метод представляется нам предпочтительнее для проведения серийных анализов, так как он позволяет проводить анализ одновременно большого количества образцов в стандартных условиях.

Оптимизацию методики мы проводили с использованием радиоактивных меченых препаратов АБК и гиббереллинов по следующим пара-

метрам: значения рН водного раствора, время экстракции и соотношение экстрагентов.

Чувствительность методики составляет 1 нг на 1 г сырой массы по АБК и ГК. Зависимость концентрации этих веществ от величины ионного тока носит линейный характер в диапазоне 1-10000 нг. Воспроизводимость составила 4.7%, точность анализа 18.7%.

Различные гиббереллины обладают и различной активностью в биотестах (Серебряков 1977, Жирмунская 1984). Это объясняется тем, что метаболизм гиббереллина зависит не только от вида растения, но и от органа или стадии его развития. Мы предположили, что активны именно те экзогенные гиббереллины, которые свойственны данному растению т.е. выра- , батываются и участвуют в процессах метаболизма этого конкретного растения и, именно, на них в наибольшей степени реагирует система рецепторов. Другие "чужие" гиббереллины должны быть биологически менее активны и обработка ими растения не должна приводить к каким либо заметным эффектам.

Для проверки этого предположения нами проведено биотестирование на гиббереллиновую активность ряда гиббереллинов, выделенных нами из известного препарата "Гиббереллин кристаллический". Разделение и очистка гиббереллинов проводилась методам ВЭЖХ, а их идентификация методом ГЖХ-МС. Биотестирование осуществлялось на двух традиционных объектах - гипокотилях огурца и салата.

Известно, что в листьях салата идентифицированы гиббереллины А1, А8, А19 и А20 (ТоуотаБи е.а. 1993), а в семенах этого растения содержатся А1, эпи-А1, А17 и А19 (Реагсе е.а. 1987). В тоже время, семена тыквенных содержат А4, А24, А25, А43 (Серебряков 1979). Из препарата "Гиббереллин кристаллический", представляющего собой продукт жизнедеятельности гриба С1ЬЬеге11а ^'¡Киго1, мы выделили и идентифицировали следующие гиббереллины: А1, АЗ, А4, А7, А9, А13, А14, А16, А20, А42, а также их изомеры. Как и следовало ожидать, салат и огурец по-разному реагируют на различные гиббереллины. Наибольший эффект в биотесте мы наблюдали при обработке гипокотилей огурца раствором содержащим гиббереллин А4, тогда как активность гиббереллинов А1 и АЗ была минимальной. В тоже время, на салате наибольшую активность показали именно А1 и А20 (Табл. 1).

Активность других гиббереллиноз также проявлялась, хотя и в меньшей степени, чтр свидетельствует о низкой селективности салатного биотеста, который и является предпочтительным при работе на растениях с неизвестным составом гиббереллинов.

При разработке методики определения цитокининов мы использовали два независимых метода: высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) и иммуно-ферментный анализ в модификации конкурентного связывания (ИФА). Параллельно двумя этими методами анализировали содержание зеатина и заетинрибозида в растениях ячменя, обработанных

брассинолидами. Результаты этих сравнительных экспериментов представлены в таблице 2.

Таблица 1.

Относительное Активность в биотестах. %

Гиббереллин содержание в

смеси, ГЖХ-МС, % Гипокотили огурца Гипокотили салата

А9+изомеры 0.4 106 109

А14+изомеры 0.6 103 104

А20 0.1 110 150

А4+изомеры 2.7 152 123

А7 0.6 106 107

А13+ изомеры 4.3 102 105

А16 1.4 110 113

АЗ+изомеры 68.8 134 157

А1 20.7 124 180

А42 Следы 104 101

Проведенные исследования позволяют сделать следующие выводы: метод ИФА использованный для определения транс-зеатина и транс-зеатинрибозида высокоспецифичен, высокочувствителен и дает хорошую сходимость результатов. Преимуществом ВЭЖХ является то, что он позволяет одновременно анализировать разные цитокинины в растительных образцах.

Таблица 2.

Содержание цитокининов в экстрактах ячменя сорта Зазерский 85 (мкг/г

сух.массы)

Обработка препаратом, доза мг/сосуд Зеатин Метод ВЭЖХ Зеатинрибозид Метод ИФА Зеатин+Зеатинрибозид

Брассинолид-214

10 0,3±0,1 9,2±1,1 14,1+3,0

20 0,4±0,1 6,2±1,3 7,0±2,5

30 - ■ 5,5±1,0 8,8±2,6

40 - 5,2±1,1 7,0±2,4

50 - 9,5±1,4 8,8±2,7

Эпибрассинолид

10 0,6+0.2 14,5±2,3 13,4±2,9

20 - 6.8+1,6 7,0±2,1

30 - 9,8±1,4 7,0±2,0

40 - 6,411.3 7,0±2,0

50 1,0±0,3 7,4±1,5 8,8±2,5

Контроль 0,3+0,1 6,7±1.6 5,6+1,0

При разработке методики определения АБК в растительном материале нами были апробированы три независимых метода анализа: ВЭЖХ, ГЖХ-МС (SIM) и метод иммуноферментного анализа в модификации конку-

рентного связывания ( Mertens 1983). Метод ВЭЖХ, основаный на использовании дляанализа колонок малого объема, был разработан сотрудником Лаборатории регуляторов роста и развития сельскохозяйственных растений Б.Е.Бумажным. Метод ГЖХ-МС (SIM) основан на детектировании метилового эфира абсцизовой кислоты. Этот метод позволяет анализировать ГК и АБК одновременно в одной пробе. Селективное ионное детектирование проводили по ионам, характерным для метилового эфира АБК.

Сравнительный анализ результатов экспериментов по определению содержания АБК различными методами в нескольких образцах ячменя приведен в таблице 3.

Таблица 3.

Обработка Метод анализа

растении

ИФА | ВЭЖХ | ГЖХ-МС (SIM)

Контроль 50±12 43±6 56±10

Эпин 50 2,0±1,0 2,7±0,3 2,8±0,7

мкг/сосуд

Для проведения серийного анализа мы использовали в основном метод ИФА, который дает удовлетворительные результаты и менее трудоемок по сравнению с физико-химическими методами.

Определение содержания ИУК в растительном материале выполняли методом иммуноферментного анализа в модификации конкурентного связывания (Mertens 1983). Для повышения чувствительности анализа индо-лилуксусная кислота анализировалась в виде ее метилового эфира.

Для определения интенсивности выделения этилена использовали метод газовой хроматографии. Растительный материал помещали в герметичные флаконы и выдерживали в темном месте в течение 4 ч при комнатной температуре. Затем медицинским шприцем отбирали пробы газовой среды для определения, этилена и вводили в инжектор газового хроматографа.

Таким образом, разработанная нами методика позволяет определять качественный и количественный состав пяти основных групп фитогормонов (ГК, АБК, ИУК, цитокинины, этилен) в одной, небольшой (до 50 г сырой массы) пробе. Высокая селективность и чувствительность используемых на последней стадии анализа методов позволяет существенно упростить аналитические процедуры. Все это дало нам возможность проводить серийный анализ большого количества образцов растительного материала. Методика достаточно универсальна и применима для анализа растений различных ■ видов и их органов.

3.2. Формирование гормонального баланса растений.

Динамика отдельных фитогормонов обстоятельно изучена во многих работах. Вместе с тем в литературе отсутствуют обобщенные данные об изменении гормонального баланса растений в процессе вегетации. Эти исследования очень важны, так как многие процессы жизнедеятельности растений регулируются одновременно несколькими гормонами, действующей по принципу синергизма или антагонизма (Кулаева 1982). Как уже отмечалось, из-за повышенной динамичности фитогормонального баланса следует анализировать содержание фитогормонов в одной пробе растительного материала. Это необходимо для получения адекватной картины, отражающей реальный фитогормональный баланс. К сожалению, подобные данные в литературе отсутствуют.

Как известно, рост и развитие растений определяется суточными и онтогенетическими ритмами (Шевелуха 1992). С целью изучения изменения фитогормонального баланса в связи с этими естественными ритмами нами получены экспериментальные данные о суточной и онтогенетической динамике фитогормонов в листьях и стеблях ячменя и листьях кормовой свеклы.

3.2.1. Суточная динамика фитогормонов ячменя.

Для того, чтобы оценить подвижность (лабильность) системы гормонального баланса мы проследили за суточной динамикой соотношения эндогенных фитогормонов в растениях ячменя.

Основные закономерности суточной динамики роста однолетних злаков детально изучены и подробно обсуждены в обстоятельной монографии Шевелухи (1992). Известно, что линейная скорость роста ячменя в течении суток меняется по кривой бпизкой к синусоиде. Максимум в росте приходится на дневное время (15-18 часов), а минимальный рост соответствует 4-5 часам утра. Суточная термо- и светопериодичность создает условия, при которых ночная скорость роста ячменя в среднем за весь период вегетации оказывается примерно в полтора раза ниже дневной. Очевидно, что суточные ритмы приводящие к такому значительному изменению скорости роста происходят на фоне существенного изменения соотношения гормонов.

Суточная динамика содержания фитогормонов в яровом ячмене сортов Зазерский 85 и Московский 3 изучалась в условиях вегетационного опыта. Содержание фитогормонов анализировали каждые два часа, параллельно измеряли температуру и влажность воздуха.

Изменение ИУК характеризуется двумя максимумами. Дневной совпадает с минимальной влажностью и наибольшей температурой воздуха. Второй максимум соответствует темновому периоду. Эта динамика характерна для жаркого ясного дня, когда температура воздуха днем и ночью существенно отличается (рис.1).

Рис. 1. Динамика ИУК в листьях ячмо»« (фаза к/щония)

Uxicacwl

10 12 14 15 18 20 22 24 2

Бромя суток, час.

Рис. 2. Суточная динамика выделения этилена из ячменя (фаза развития третьего листа)

I 10 12 14 1* II 30 14 2 * I

Время суток, час

В пасмурный день, когда дневная и ночная температура и влажность воздуха практически постоянны, наблюдается лишь один максимум ИУК в ночные часы. Эти результаты хорошо согласуются с данными испанских исследователей (Lopoz-Carboneil o.a. 1992), которые изучая суточную динамику ИУК в листьях японской фатсии, показали, что в фитотроне'уровень ИУК максимален в конце темнового периода, а через 4 часа после включения света концентрация этого фитогормона снижалась в пять раз. При естественном же изменении температуры и влажности в условиях вегетаци-

онного опыта кривая изменения ИУК имеет два максимума, совпадающие с минимальной влажностью воздуха. Биосинтез этилена в листьях, как известно, связан с уровнем ИУК , причем показано, что максимальное выделение этилена наступает через 3-6 часов после обработки растений раствором ИУК (Муромцев и др. 1987). В наших опытах максимальное выделение этилена наблюдалось в 10-12 часов дня, таким образом максимумы ИУК и этилена отстоят друг от друга на 6-8 часов (рис. 2).

Рис. 3. Суточная динамика цитокининов в ячмене (фаза кущения)

18 20 22 Время суток, час.

—Зазерский"] а - Московский

а 1 Ü-о а

24 2 4 б

Как известно, цитокинины и ИУК активируют деление и стимулируют рост клеток листа. Днем в период наибольшего роста (Шевелуха 1992) содержание этих гормонов максимально (рис. 3).

Абсцизовая кислота - во многих случаях выступает как ингибитор ростовых процессов, поэтому следует ожидать, что минимум ее содержания будет совпадать с фазой наиболее активного роста растения. Действительно, в наших опытах самый низкий уровень АБК соответствовал 15-18 часам. В течение суток содержание этого фитогормона менялось в 7-10 раз (рис. 4.)

В ряде работ (Муромцев и др. 1987) отмечена положительная корреляция между интенсивностью роста растений и содержанием в них гиббе-реллинов. По нашим данным максимальное содержание ГК в листьях ячменя соответствует периоду наиболее активного роста растения и минимального уровня АБК, т.е. 14-16 часам. К вечеру уровень ГК снижается, опускаясь до минимума в ночные часы (рис.4). В одном из опытов с растениями ячменя в фазе развития третьего листа, проведенном в сухую жаркую погоду, гормональный баланс растений немедленно отреагировал на температурный стресс резким снижением уровня ГК и синхронным ростом АБК (рис. 5).

Рис. 4. Суточная динамика АБК и ГК в ячмене сорта Московский (фаза развития третьего листа)

И 20 22 24

Время суток, час.

Рис.5. Суточная динамика АБК и ГК в ячмене сорта Зазерский {фаза развития третьего листа)

Время суток, час.

Таким образом, результаты проведенного нами исследования еще раз наглядно продемонстрировали чрезвычайную подвижность фитогормо-нального равновесия и тесную взаимосвязь между фитогормонами в системе гормонального баланса. Существует определенная функциональная зависимость между суточной динамикой гормонального баланса и происходящими при этом ростовыми процессами. При этом на соотношение фи-тогормонов существенно влияют такие внешние факторы, как температура и влажность воздуха, освещенность и т.п.

3.2.2. Онтогенетическая динамика фитогормонов ячменя.

В вегетационных опытах проведены исследования гормонального баланса в онтогенезе восьми сортов ячменя, резко отличающихся по происхождению и морфофизиологическим показателям.

Эти сорта ячменя районированы в различных климатических зонах России, Белоруссии, Украины и Казахстана. Сорта отличаются по скорости созревания, высоте растений, урожайности, устойчивости к засухе, болезням и другим стрессовым факторам. Образцы для определения фитогор-

монов отбирались по фазам (формирование третьего листа, начала выхода в трубку, трубкование, конец трубкования, начало цветения, цветение). Эти фазы охватывают И-1Х этапы онтогенеза. Средние данные отображающие онтогенетическую динамику фитогормонов ячменя и ростовые характеристики представлены в табл. 4..

На ранних этапах онтогенеза, в фазу активного роста листья и стебли ячг.теня характеризуются высоким содержанием всех фитогормонов. К фазе трубкования рост растений замедляется и уровень фитогормонов снижается. Переход растений к цветению связан с резким увеличением уровня ци-токининов.

Таблица 4.

Динамика содержание фитогормонов ячменя по фазам развития растения,

среднее по восьми сортам (нг/г сух, массы)

Фитогормон Формиро- Начало Трубкование Конец Начало Цветение

вание выхода в труб- цветения

третье- трубку кования

го листа

Листья

ИУК 1180+250 293 ^45 186+33 25±4 42±8 8±3

Цитокинины 39±7 5119 3016 4+1 8+2 216+35

гк 1410±270 522*78 463+69 378±58 284135 188±30

АБК 21 ±4 11-3 9+3 8+2 7±2 8 ±2

Этилен, нг/г 19+4 6-1 4-1 3 + 1 1+0,3 2±0,7

сыр.м. в час Стебли

ИУК 293:42 6619 60±8 35±6 32+5

Цитокинины 45 '6 17+4 2+0,6 4±1 220+33

ГК 556-48 322+37 340+39 31 ±5 132±23

АБК 1212 9±2 9 ±2 9+2 10+2

Высота 19,8±3,2 39,1 ±5,3 57,516,0 64,416,7 67,2±7,0 69,7±7,1

растений, см

3.2.3. Онтогенетическая динамика фитогормонов свеклы.

В классических работах Стебута И.А. и Прянишникова Д.Н. (1951) указывается на существование в развитии растения "ключевых" (переломных) моментов, совпадающих с гранями между основными периодами онтогенеза: начальное формирование, усиленный рост и отложение продуктов в запас. У однолетних растений разных семейств существуют два таких перелома, а у двулетних четыре. Активация роста приурочена к первой или третьей критической фазе, апикальное торможение ко второй или четвертой. Существование этих критических фаз не может не отразиться на фитогор-мональном балансе и, следовательно, на отзывчивости растений к действию фиторегуляторов. Действительно, в работах Архангельского (1967, 1988). были выявлены критические фазы онтогенеза кормовой свеклы, при прохождении которых в условиях нечерноземной и центральной черноземной зон наблюдается сильная положительная реакция растений на приме-

нение физиологически активных соединений. Эти переломы строго совпадают с границами между периодами онтогенеза, отмеченными И.А.Стебутом и Д.Н.Прянишниковым.

Таблица 5.

Динамика содержания фитогормонов в листьях свеклы по фазам, нг/г

сыр.массы.

Фазы развития ГК ИУК Зеатин/зеатин- АБК

рибозид

Первый год жизни

Начальное 2-я пара настоящих листьев, 202±17 16±2 36±4 8±1

9.07.94

формиро- 3-я пара настоящих листьев. "378±24 34±3 9±2 17±2

9.07.94

вание Формирование 7-го листа, 414±47 64 ±7 31 ±5 12±1

9.07.94

Усиленный Формирование 8-го листа, 750±86 7±1 27±4 23±3

рост Смо- . 9.07.94

массы Формирование 12-го листа, 99±11 4±1 21 ±3 20±3

19.07.94

25.08.94 414±32 27±3 4±1 43±5

6.09.94 336±38 6±1 5±1 55±6

Накопление 16.09.94 750±67 6±1 360±51 45±5

питательных 26.09.94 137±15 150±18 250±44 66±7

веществ 6.10.94 132±15 42±5 17±3 140±20

Уборка 12.10.94 152±18 22±3 18±3 36 ±4

Второй год жизни

'Фаза,розетки 14.06.95 448163 23±2 7±1 580±69

'Фаза'бутониэации 3.07.95 511±41 900±78 380±45 600±78

Фаза цвете ния 13.07.95 386±40 600±65 180±23 290±31

¡Проведенное нами детальное изучение фитогормонального баланса •свеклы показало, что при прохождении этих ключевых моментов фитогор-■мональный баланс существенно меняется. Так, период активного роста характеризуется повышением уровня гиббереллинов в листьях свеклы. Максимальное содержание этого фитогормона зафиксировано нами как раз в переломный момент связанный с окончание фазы начального формирования и перехода к периоду усиленного роста биомассы. Второй переломный момент, связанный к переходу к периоду активного накопления углеводов в корнеклубнеплодах характеризуется также максимумом гиббереллинов и цитокининов. Во второй год жизни свеклы переломный момент это переход из фазы розетки к фазе формирования цветоноса. В этот период повышается уровень гиббереллинов, ИУК и цитокининов (табл. 5). •

Таким образом, на примере ярового ячменя и свеклы показано, что в процессе вегетации при прохождении переломных моментов наблюдается существенное изменение гормонального баланса растений, а целенаправленное применение экзогенных рогуляторов роста именно в эти "ключевые"

периоды и дает, как показали многочисленные исследования различных авторов, максимальный эффект.

з.3. Генетический контроль гормонального баланса растений.

Известно, что рост и развитие растений определяются главным образом такими факторами, как генетическая и гормональная регуляции. Усиливай или ослабевая процессы роста и развития эти системы регуляции взаимодействуя с факторами внешней среды и опредепяют тип морфогенеза

и, в конечном итоге, структуру, продуктивность и качество урожая.

Таким образом, селекционер при создании новых форм с различными ростовыми характеристиками и морфофизиологическими признаками изменяет и формирует в них новый гормональный баланс, варьируя динамику фитогормонов, и таким образом формирует новые высокопродуктивные и устойчивые сорта. Отсюда возникает возможность использовать фито-гормональные тесты, проводимые на ранних этапах онтогенеза, для отбора перспективных высокопродуктивных и устойчивых форм и сортов растений.

К примерам такого подхода следует отнести работы Кефели, Пруса-ковой (1985) и Третьякова (1993) где предложено включить в систему такого первичного отбора показатели содержания стимуляторов и ингибиторов роста в тканях проростков, скорости изменения стимупирующей активности на ингибиторную, характера изменения фитогормонального баланса на внешние воздействия (стрессы) и т.п.

С целью выявления фитогормонов, формирующих устойчивость растений к засухе, нами в вегетационных опытах была исследована дина-

Вс 6 У(хтьИЖвпс1ъя(ялояраза«ь>(Сфтсв

мика изменения гормонального баланса у восьми сортов ярового ячменя, отличающихся по своим морфофизиологическим показателям и засухоустойчивости (Донецкий 8, Носовский 9, Зазерский 85, Московский 3, Волгарь, Ноктюрн, Омский 86, Целинный 213, ряд по возрастанию засухоустойчивости).

В фаз<- формирования третьего листа растения всех изученных сортов хар ^ризуются высоким содержанием ИУК, причем наиболее высокий ее уровень отмечен у засухоустойчивых форм (рис. 6). Много цитокининов обнаружено в листьях и стеблях в начальный период вегетации у всех изученных нами сортов, их величина затем снижается к фазе трубкования. Однако у всех сортов, а особенно у засухоустойчивых, в фазе цветения мы наблюдали резкое увеличение концентрации этого фитогормона.

Рис. 7. Содержание гибберелгнжо" :| листьях ячменя.

Фазы развития

Более скороспелые и засухоустойчивые сорта характеризуются высоким уровнем ГК в фазе формирования третьего листа, затем содержание ГК снижается, причем этот эффект минимален у ячменя районированного в более благоприятных климатических зонах (рис. 7). В наших опытах не выявлено сортовых особенностей в содержании АБК и этилена.

Таким образом показано, что уровень ГК и ИУК тесно связан с сортовыми особенностями ярового ячменя и фазами развития растений. Сорта ячменя районированные в засушливых зонах генетически предрасположены к быстрому формированию мощной корневой системы, что обуславливает поддержание высокого уровня ИУК на ранних этапах онтогенеза. Повышенное содержание ГК в этот же период связано с тем, что растения вынуждены ускоренно сформировать стебель до наступления засухи. Создание новых форм растений с различными морфофизиологическими показателями и продуктивностью генетически связано с изменением в них гормонального баланса. Это обстоятельство позволяет использовать метод гормональных тестов о качестве одного из способов отбора перспективных форм растений уже на ранних этапах онтогенеза.

3.4. Экзогенная регуляция гормонального баланса растений.

3.4.1. Роль мевалоновой кислоты е формировании гормонального баланса растений.

Для подтверждения взаимосвязи и взаимовлияния фитогормонов в системе гормонального баланса мы изучили влияние обработок растений мевалоновой кислотой на уровень и соотношение фитогормонов.

0 Наличие в биосинтезе фитогормонов общего предшественника - мевалоновой кислоты, а также известное расположение "метаболических вилок" позволяет предположить возможность влияния этого соединения на содержание фитогормонов ( Ра1ш е.а. 1990, РЫппеу е.а. 1990, 2еечааП е.а. 1990). Экзогенное увеличение концентрации одногоиз фитогормонов может смещать гормональный баланс растения. Имеющиеся в литературе данные подтверждают это предположение. Так, обработка растений гиббе-реллинами приводит к увеличению количества эндогенных ауксинов за счет усиления синтеза ИУК из триптофана или самого гиббереллина (Гамбург 1976, 1990). В других работах сообщается о стимуляции биосинтеза этилена в листьях шпината и салата под действием гиббереллина АЗ, бензиладенина или АБК (АЬагот 1989; РЫ1о5орИ-Нас!а» е.а. 198Э). Экзогенные фитогормоны активируют АЦК-синтазу и превращение аминоцик-лопропанкарбоновой кислоты в этилен. В то же время установлено, что экзогенный этилен повышает содержание АБК в листьях риса, а цитокини-ны стимулируют образование ауксина в растениях (Гамбург 1990 г.).

Мевалоновая кислота является предшественником фитогормонов в биосинтезе, и при обработке ею растений следует ожидать увеличения их содержания. Действительно, по данным наших опытов, меченая 14С мевалоновая кислота трансформировалась в основном в гиббереллины (табл.6).

Таблица 6.

Распределение радиоактивной метки по фракциям фитогормонов выде-

ленных из листьев (распады/мин-10 3).

Фитогормоны 1 с\гг." I 7 сут.' | 30 сут '

Картофель

Гиббереллины 89+4 8,9+0,9 1,0+0,4

АБК 1,0+0.5 1,0+0.4 1,0+0.5

Цитокинины 8,1+0,9 1,0+0,5 1,0 + 0,5

Ячмень

Гиббереллины 131+8 17+2,3 1,0+0,3

АБК + ИУК 1,0+0,3 2,7+0,6 1,0+0,4

Цитокинины 9,4+0,6 1,6+0,6 5,8 + 0,7

'Время после обработки.

Общее содержание эндогенных фитогормонов в растениях, обработанных мевалоновой кислотой, было значительно выше, чем в контрольных (табл. 7). При этом в наибольшей степени возрастала концентрация эндогенных гиббереллинов. Уже через сутки после обработки значительно увеличивалось их содержание в листьях всех изученных нами растений. В последующие сутки количество этого фитогормона в листьях постепенное

снижалось, тогда как в стеблях его уровень увеличивался. Через неделю содержание гиббереллинов в обработанных растениях в целом уменьшалось, а через месяц этот показатель был близок к контрольному.

Таблица 7.

Влияние мевалоновой кислоты на гормональный баланс растений.

Время после обработки, сутки Часть растения Содержание фитогормонов, % к контролю

Гиббереллины | АБК Цитокинины ИУК

Ячмень

Опыт 1

1 листья+стебли 196 100 121

7 листья+стебли 120 123 -

30 листья+стебли 100 114 118

Опыт 2

1 стебли 100 - - -

листья 270 99 138 -

7 стебли 105 97 - -

листья 150 113 167 189

30 стебли 101 - 100 • 98

листья 110 100 106 98

• Картофель

Опыт 1

1 листья+.стебли 186 115 108

■7 листья+стебли 123 106 98

30 листья+стебли 105 125 113

Опыт 2

1 стебли 188 100 103 • 136

листья 339 118 103 189

7 стебли 157 102 106 122

листья 118 100 105 111

30 стебли 103 100 108 100

листья 100 100 100 100

Озимая лшени А а

1 стебли 98 179 108 126

листья 500 482 298 128

7 стебли 142 -

листья 165 -

30 стебли 125 183

листья 106 218 -

Следует отметить высокую отзывчивость на обработку мевалоновой кислотой гормонального баланса озимой пшеницы сорта Мироновская-808 по сравнению с-яровым ячменем. Опрыскивание мевалоновой кислотой ярового ячменя приводило, главным образом, к увеличению содержания гиббереллинов, а соответствующая обработка пшеницы к существенному повышению количества не только ГК, но и других фитогормонов (цитокининов, АБК и ИУК). Нами установлено существенное увеличение содержания АБК в листьях и стеблях озимой пшеницы уже через сутки после обработки мевалоновой кислотой. Высокий уровень АБК сохранялся довольно длительное время, в отличие от гиббереллинов, содержание кото-

рых резко снижалось. Можно предположить, что а озимой пшенице АБК метаболизирует значительно медленнее, чем гиббереллины. Результаты экспериментов с мевалоновой кислотой еще раз показали количественную взаимосвязь фитогормонов и их предшественников, а также лабильность фитогормонального баланса растений в целом. Таким образом, одним из способов управления гормональным балансом может стать контроль за биосинтезом не только самих фитогормонов, но и их предшественников.

3.4.2. Роль фитогормонов в биосинтезе вторичных метаболитов.

Для достижения максимальной биопродуктивности лекарственных растений существенное значение имеют физиолого-биохимиче-ские средства, модифицирующие и усиливающие реализацию генетического потенциала продуктивности растений в пределах нормы реакции генотипа. Такими средствами экзогенной регуляции экспрессии генов могут служить регуляторы роста растений. Как правило, они не могут быть спменены другими традиционными приемами возделывания культур и являются резервами повышения урожая и его качества, когда возможности агротехники, удобрений, орошения и т.п. уже исчерпаны. Применение ретардантов повышает содержание биологически активных веществ (БАВ) в лекарственном растительном сырье (алкалоиды, стероиды, сердечные .ликозиды, терпеноиды) (Шаин 1993,1996).

Изучение гормонального статуса и знание особенностей интеграции процессов первичного и вторичного метаболизмов дает возможность разработать подходы для целенаправленного использования фиторегулято-ров для повышения продуктивности лекарственных растений.

На ключевых этапах онтогенеза лекарственных растений можно выявить и уточнить влияние гормональной регуляции на интеграцию первичного и вторичного метаболизма с целью повышения содержания биологически активных веществ в фитосырье. В предварительных испытаниях показано, что в процессах интеграции первичного и вторичного метаболизма, экзогенная регуляция донорно-акцепторных отношений лекарственных и эфиромасличных растений приводила к увеличению содержания биологически активных веществ в сырье на 15-80 %. Это определяет стратегию регуляции продукционного процесса и формирования максимальной биопродуктивности, как интегрального показателя высоких уровней урожайности и концентрации БАВ в фитосырье.

В многолетних исследованиях ВИЛАР (Шаин 1989) показано, что повышение продуктивности лекарственных растений при применении синтетических регуляторов роста достигается за счет, во-первых, стимуляции наращивания биомассы листьев на ранней стадии развития и, во-вторых, ингибированием ростовых процессов на заключительной этапе онтогенеза для активизации биосинтеза гликозидов. Только при управлении обеими переменными биопродуктивности, можно добиться оптимального их сочетания и увеличить сбор биологически-активных веществ (БАВ) с еди-

ницы площади культивируемых лекарственных растений. Для этого необходимо установить зависимость между процессами биосинтеза первичных метаболитов и процессами накопления в растениях БАВ, представляющих собой, как правило, продукты вторичного метаболизма. Указанная зависимость сложна и недостаточно изучена, особенно на уровне целого растения (Бузук и Ловкова 1989 г.). В связи с этим особого внимания заслуживает установление связи между выраженностью ростовых процессов, определяемых гормональным балансом, и накоплением БАВ.

В этой связи нами было проведено изучение влияния гормональной регуляции на интеграцию первичного и вторичного метаболизма с целью повышения содержания биологически-активных веществ в фитосырье наперстянки шерстистой и пурпуровой.

Наперстянка шерстистая и наперстянка пурпуровая - двухлетние травянистые растения. Листья наперстянки пурпуровой или красной достигают длины 20 см, а наперстянка шерстистая характеризуется короткими (до 10 см) листьями. Первая из них выращивается в более теплых районах (Северный Кавказ), а вторая может произрастать и севернее (Украина). На первом году жизни они образуют розетку прикорневых листьев, а на втором - одиночные прямостоячие слабооблиственные стебли. Лекарственным сырьем служат листья, которые собирают у растений первого года жизни в период максимального развития розетки. В листьях наперстянки шерстистой содержатся основные первичные (нативные) гликозиды: лантанозиды А, В и С, а в пурпурной наперстянке накапливаются пурпуреагликозиды А и В и глюкогиталоксин. Медицинское значение имеют лантанозиды А, В и С и пурпурогликозиды А и В. В результате ферментативных процессов первичные гликозиды трансформируются в более стойкие вторичные гликозиды: дигитоксин, гитоксин и дигоксин. Листья наперстянки используются как лекарственное сырье для получения препаратов сердечно-сосудистого действия - целанида, дигоксина и ацетилдигитоксина.

Проведенные исследования показали, что содержание фитогормонов в растениях меняется в период вегетации в значительных пределах и зависит от условий выращивания. Так, у контрольных растений уровень АБК увеличивается с возрастом растения и достигает максимума к концу вегетации. Концентрация же гиббереллинов скачала повышается и достигает наибольшей величины в середине вегетационного периода, а перед уборкой их содержание минимально. Уровень этилена в целом выше в молодых растениях, хотя тенденция его снижения к концу вегетации выражена не столь ярко, особенно у наперстянки шерстистой. Однако, содержание ИУК и цитокининов практически не меняется в течение вегетации. Этот факт можно объяснить тем, что на первом году жизни растения наперстянки постоянно находится в фазе розетки. Опрыскивание наперстянки раствором ГК приводит во всех изученных нами случаях к повышению уровня ИУК в обработанных растениях, по сравнению с контрольными в среднем на 6070 %. При этом высокий уровень указанных фитогормонов поддерживается

у обработанных растений в течение двух с половиной месяцев после воздействия. Максимальное повышение урозня цитокининов для обоих видов наперстянки приходится на 14 день после применения ГК.

Увеличение содержания цитокининов в листьях наперстянки после обработки ГК составляет в среднем 30-40 % и этот уровень сохраняется до конца вегетации.

Через сутки у обработанных раствором гиббереллинз растений концентрация АБК увеличивается, особенно у наперстянки пурпуровой. Возрастание АБК при обработке растений ГК надо рассматривать как ответную реакцию на стресс. Однако, уже через две недели, когда уровень ГК снижается, растения адаптируются и содержание АБК нормализуется.

Через сутки после опрыскивания содержание ГК в обработанных растениях примерно в триста раз выше контрольных, однако эта разница постепенно сокращается к концу вегетации (рис. 8). Опрыскивание раствором 2-ХЭФК повышает концентрацию этилена в растениях в десятки раз, особенно в первые дни после применения этиленпродуцента. Причем, наблюдается явная зависимость концентрации этилена от дозы 2-ХЭФК. В последующем уровень этилена в растении снижался.

В растениях обработанных только 2-ХЭФК наблюдался повышенный уровень ИУК и цитокининов по сравнению с контролем и пониженная концентрация АБК. Однако, растения выращенные на высоком фоне ГК и обладающие повышенной биомассой и большей оводненностью по иному реагировали на эту обработку. В них снижается только содержание ИУК. В растениях наперстянки пурпурной через сутки после опрыскивания кампо-заном активно накапливается стрессовая АБК, уровень которой затем постепенно снижается. Наперстянка шерстистая более устойчива в этом отношении к воздействию 2-ХЭФК, чем наперстянка пурпуровая.

В наших опытах действие кампозана изучалось также на растениях, которые были ранее обработаны ГК, так и без обработки эгим препаратом. Растения выращенные на высоком фоне ГК имели более интенсивное лис-тообразование, увеличенную длину листа и повышенное содержание влаги, особенно в листьях наперстянки пурпуровой.

Изучение динамики накопления гликозидов в растениях наперстянки показало, что во всех случаях обработка ГК снижает их содержание, особенно этот эффект заметен у наперстянки пурпуровой. Обработка 2-ХЭФК повышает уровень гликозидов в листьях наперстянки пурпуровой уже через сутки после опрыскивания этиленпродуцентом, однако, затем их уровень снижается по сравнению с контрольными растениями. Наперстянка шерстистая характеризуется большей устойчивостью к стрессам, ее гормональная система менее подвижна и труднее выводится из равновесия под воздействием экзогенных регуляторов роста, поэтому эффект применения фиторегуляторов носит в этом случае пролонгированный характер, и максимальное содержание гликозидов отмечается через неделю после опрыскивания растений 2-ХЭФК.

Рис. 8. Гормональный баланс наперстянки красной, обработанной 0,025 % раствором ГК

Пути биосинтеза таких фитогормонов как АБК и ГК тесно переплетены с путями биосинтеза терпеноидов. Наличие общих предшественников (гераниол, фарнезилпирофосфат и геранилгераниолпирофосфат) и близкое расположение "метаболических вилок" позволили предложить способ целенаправленного изменения состава эфирного масла мяты в сторону увеличения выхода ментола под действием экзогенных регуляторов роста.

Для проверки этого предположения мы в 1994-1995 г. детально изучили гормональный баланс и состав эфирных масел пяти сортов мяты (Лекарственная, Москвичка, Кубанская, Медичка и Прилукская 6).

Мята - это многолетнее травянистое растений листья которого содержат до 2,75 % эфирного масла. Главной составной частью этого масла является ментол, кроме ментола масло содержит ментон, пинены, лимонен, дитерпен, фелландрен, ценеол, пулегон, жасмон и эфиры ментола с уксусной и валериановой кислотами. В медицине применяется препарат из листьев и эфирного масла. Наиболее ценным составляющим масла является ментол, обладающий обезболивающим, спазмолитическим, антисептическим, ветрогонным, противовоспалительным, дезодорирующим и освежающим действием.

В наших опытах растения мяты опрыскивались растворами ГК, 2-хлорэтилфосфоновой кислоты (2-ХЭФК) и хлорхолинхлорида (ССС). Через неделю после обработки надземная часть растений срезалась и в ней определяли содержание фитогормонов и состав эфирного масла (ГЖХ и ГЖХ-МС). Предуборочная обработка ретардантами (хлорхолинхлорид, кампозан) различных сортов мяты приводила к значительным изменениям в направлении биосинтеза эфирного масла, что отражалось на его составе. В эфирных маслах высокоментольных сортов мяты (Москвичка, Лекар-

ственная-4, Медичка, Кубанская) содержание ментона - предшественника ментола уменьшается в 1,2-1,4 раза (от 15-18 до 9-12 %) в зависимости от сорта. Снижается содержание монотерпеновых углеводородов. Одновременно несколько повышается относительное содержание l-ментола, изо-ментола и сесквитерпеновых углеводородов (по ß-кариофилену в 1,2-1,4 раза) и ацетатов.

Таблица 8.

Изменение состава основных компонентов эфирного масла мяты под дей-

Год Сорта Вариант обработки

опыта мяты Контроль ССС, ССС, Кампозан Кампозан Гибберел-

0,075 % 0.5 Го 0,03-0,05 % 0.1 % лин

Изомеры ментона*

1995 Москвич 12,1610,23 7,58+0,08 7,6610.08 9,3210,10 7,4310,05 ка

1994 ....."— 18,01-0,17 12,3910,10 12,9О1О,09 15.9810,17

1995 Лекарст- 16,44+0,20 12,6110,11 13,49+0,14 11,39±0,12 10,5810,11 венная

1994 ------— 19,70+0,21 ТЗ.ббЮЛ-1 13,23г0,14 ' 15,2410,20

1995 Прилукс 32,39+0,34 25,67+0,28 27,65+0,30 24,03±0,22 25,6710,30 кая-6

1994 .....45,72±0,48 28,86-0,31 29.30i0.34 35,11+0.33

1995 Кубанс- 26,8610,22 25,2210,30 21,8710,27 24,1510,27 24.63г0,23 кая-6

1994 Медичка 17,33+0,13 13,5110,16 14,3910.16 18,1910.24

Изомеры ментола"

1995 Москвич 81,82±0,98 84,5110,56 84,38Ю,89 84,14±0,90 86,8710,92 ка

1994 ....."— 79,9010,89 83,1110,67 83,7910,99 81,0310,95

1995 Лекарст 77,6910,67 80,32+0,78 79,97+0,59 81,73±0,77 84,0710,98 венная

1994 -—"— 73,9310,87 80,2810,79 80,8810,87 81,1910,79

1995 Прилукс 49,51+0,34 55,96Ю,64 54,7710,42 58,6810,60 55,9610,58 кая-6

1994 ....."—- 40,8510,45 60,14+0,73 59,2810,64 53,0110,61

1995 Кубанск 63,12Ю,76 66,2610,83 59,1110,60 60,84±0,71 67,30+0,65 ая-6

1994 Медичка 78,73+0,83_80.68Ю,88_79.93Ю.80 77,0610,67

*) Изомеры ментона: сс-Ментон + изо-Ментон

**) Изомеры ментола: Ментилзцетат + нео-Ментол + 1-Ментол + изо-Ментол

Значительно более четко эти изменения в составе эфирного масла проявляются на примере низкоментольного сорта мяты (Прилукская-6). Содержание ментона в этом случае снижается с 42 до 26 %, суммарное количество монотерпеновых углеводородов падает з 1,5 раза, зато заметно увеличивается количество I- ментола (с 34 до 43 %) и ментилацетата (с 2,7 до 5,3 %).

Стимулятор роста - гиббереллин также действует на состав масел.

Действие этого фиторегулятора аналогично действию ретардантов. Под действием ГК снижается содержание в эфирном масле ментона и повышается уровень ментола и ментилацетата. Результаты анализов представлены в таблице 8. Обработки снижают содержание в эфирном масле лимонена и повышают в 1,2-2 раза уровень сесквитерпенов (Р-кариофиллен, ментилацетат).

Ментол, гиббереллины и АБК, имеют общего предшественника в биосинтезе. Анализ гормонального баланса показап, что действие на растения мяты как гиббереллина, так и ретардантов подавляет биосинтез эндогенных ГК и смещает это равновесие, стимулируя синтез ментола и (или) повышая уровень АБК. При этом у высокоментольных сортов мяты, где генетически биосинтез ментола максимален, обработка ГК значительно повышала уровень АБК, а в низкоментольном сорте уровень АБК близок к контролю, однако в этом случае изменение содержания ментола значительно (табл. 9, 10 ). Обработка растений фиторегуляторами проводилась за 7 дней до уборки.

Таблица 9.

Содержание гиббереллинов в растениях мяты._

Дата Вариант Содержание гиббереллинов, мкг/г сырой массы

Лекарствен ная Московская Прилукская Кубанская Медичка

20,07.94 Контроль 4,910,7 4,810,6 3,410,9 6,0+0,8

ССС 0,1 % 1,910,6 0,310,1 0,710,15 0,3210,18

Кампозан 0.25% 2,110.6 0,410,15 2,35+0.45 0,1010.08

ГК 0,25% 135,6 + 11.8 137,6+25,1 116,0+18.8 112.5125,5

14.07.95 Контроль 1310,8 1,4+0,8 12+1,9 5.710,9

ССС 0,1 % 1,910,9 1,1 10,6 5,5+0,5 0,710,8

ССС 0,75 % 4,610,9 1.110.5 9,210,3 1,010,8

Кампозан 0,1 % 2,2+0,8 1,4+0,4 1.3+0.7 1,0±0,2

Кампозан 3,110,7 1,910,1 1,7+0.4 2,5+0.4

0,05%

Таблица 10.

Содержание абсцизовой кислоты в растениях мяты._

Дата Вариант Содержание АБК иг/г сырой массы

Лекарств енная Московская Прилукская Кубанская Медичка

8,4+0,8 10,2+0,6 7,2±1,2 11,111,6

7,1+0,5 15+2 5,3+0,6 16,8+2,0

9,0+0,3 11,810 2 11,7+2,3 12,3±2,7

114+12 69+9 6,6+0,6 39+4

4818 1518 4716 27+9

27019 67+6 1715 63+8

19010,9 59±5 4913 21+8

590+0,8 19+4 13017 1912

280+0,7 1810,1_88+4_4714_

20.07.94 Контроль ССС 0,1 % Кампозан 0,25% ГК 0,25%

14.07.95 Контроль ССС 0,1 % ССС 0,75 %

Кампозан 0,1 % Кампозан 0,05 %

3.4.3. Регуляция гормонального баланса эпибрассинолидом.

В 1991-1994 гг. мы провели ряд работ по изучению влияния наиболее активного из известных брассиностероидов - эпибрассинолида (эпина) на гормональный баланс, транспорт ассимилятов и продуктивность ярового ячменя, озимой пшеницы и картофеля. Под влиянием эпина мы наблюдали в динамике изменение содержания фитогормонов в растениях. В наибольшей степени обработка эпином сказывается на уровне ауксина. Уже через сутки

Рис. 9. Содержание фитогормонов в побегах ячменя, обработанных эпином в фазе конец трубкования

ИУК Гиббереллины-Цитокйнины Этилен АБК

Дни после обработки

Рис. 10.Содержание фитогормонов а растениях картофеля (листья+стебли), обработанных эпином

Дни после обработки

фптсгормона снижался и через месяц достигал контрольного уровня (рис. 9,11). В отличие от злаков, у картофеля этот эффект не столь значителен, однако он носит пролонгированный характер (рис. 10). Обработка эпином несколько повышала урсвеньгиббереллинов особенно этот эффект заметен у картофеля. Количественные изменения уровня цитокининов, АБК и

этилейа были незначительны.

В тоже время известно, что повышение уровня ауксинов, активизирует флоэмный транспорт ассимилятов. Исходя из этого положения у растений обработанных эпином следует ожидать повышенную транспортную активность.

Нами было изучено влияние эпина на транспорт глюкозы из клеток листа к клеткам органов-акцепторов. С этой целью на один из листьев наносили раствор, содержащий 14-С глюкозу, а затем исследовали распределение метки по органам растения. Оказалось, что обработка растений эпином стимулирует транспорт глюкозы, причем направление и динамика этого процесса различны картофеля и злаков (рис. 12. 13).

Рис. 11. Содержание фитогормонов в побегах озимой пшеницы, обработанной эпином

ИУК Цнто«инииы ГибС«Р«ЛЛины

Рис. 12. Распределение меченой 14-С глюкозы в растениях ячменя, обработанных эпином

200 -150 -100 ■ 50 -

-50 ■

□ Стебель и листья ниже обработанного листа

□ Стебель и колос выше обработанного листа

.(00 -1-

Дни после нанесения метки

Рис. 13 Распределение меченой 14-С глюкозы а растениях картофеля обработанных эпином

200 .

150 ;

с 100 1

о.

X 50 т

* 0 •

-50 1

-Ю0 !

пл

П Листья и стебли выше обработанного листа | ПЛистья и стебли нижо !

обработанного листа ' О Клубни 1

Дни после нанесения метки

У растений ячменя и пшеницы преобладает отток меченого препарата в колос, причем максимума этот процесс достигал уже через сутки, а затем постоянно ослабевал, при этом этот процесс у ячменя носит более выраженный характер. У картофеля обработка эпином активизировала накопление радиоактивной метки в нижней части растения и клубнях, при этом ее содержание в органах акцепторах возрастало постоянно в течение месяца Различная динамика накопления ассимилятов в органах-акцепторах растений, обработанных эпином должна сказаться на их продуктивности. Кратковременный (пиковый) всплеск активности должен менее всего отразиться на таком суммарном факторе, как продуктивность и, наоборот, пролонгированный эффект должен вызвать ее максимальный рост. Исходя из этих общих положений следовало ожидать, что действие эпина в наибольшей степени скажется на росте продуктивности картофеля, затем озимой пшеницы, а для ярового ячменя эффект будет минимальным (табл. 11).

Данные, приведенные в таблице, полностью подтверждают это предположение. Так, прибавка урожая у растений картофеля, обработанных эпином, была наибольшей и в разные годы составила 22-25 %. Для пшеницы эта величина была ниже и достигала 8-22 %, в то время, как у ячменя нами не зафиксировано роста продуктивности растений обработанных эпином, по сравнению с контролем.

Таблица 11.

Влияние Эпина на урожайность ячменя, картофеля и озимой пшеницы

Год опыта Вариант Урожайность ц/га

Ячмень | Пшеница | Картофель

Первый год Контроль 35,2 36,0 400,2

Злин 34,6" 44,2 498,2

НОР« 2,7 5,4 57,0

Второй год Контроль 22,6 ' 36,0 306,2

Эпин 22,0 38,9 373,7

НСРо, 1,5 4,6 47,0

3.4.4, Гормональный баланс и экзогенная регуляция цветения дай-

кона.

Дайкон, одно-двухлетнее растение из семейства капустных - дальневосточный родственник широко распространенных у нас редьки и редиса.

Это растение длинного дня и при продолжительности светового дня 15 и более часов ускоряется формирование генеративных органов (цветков и плодов) и сдерживается образование вегетативных органов (корнеплодов). В условиях Нечерноземья дайкон интенсивно цветет уже на первый год, что, естественно, существенно снижает урожай корнеплодов. Расширение посевов дайкона сдерживается в настоящее время отсутствием набора сортов для средней полосы России. Эту проблему можно решать двумя путями - первый из них связан с селекцией новых сортов растений слабо реагирующих на длину светового дня. Этот путь, хотя и полностью решает проблему "цветушности" дайкона, однако он требует многолетних селекционных опытов. Второе направление связано с применением фиторегуляторов, способных изменить гормональный баланс у существующих сортов, подавить цветение и направить онтогенез в сторону образования корнеплода.

Рис. 14 Гормональный баланс дайкона. выращенного при различном световом дне

100

80 | иук 60 -

40 20

Цитокинины

шт..

-тсП ЙШ JMd

t I Уровень фитогормома в фазе двух пар настоящих листьео

I-1То же через неделю

Количество цветущих растений

С целью реализации этого направления мы изучили гормональный баланс растений дайкона четырех сроков посева. Предполагалось, что знание гормонального баланса растений выращенных в условиях светового дня разной длины, позволит разработать приемы управления развитием растений с помощью фиторегуляторов. Смещение под их действием гормонального баланса может привести к сдвигу пути развития растений в сторону увеличения выхода семян или к росту урожайности корнеплодов.

Из данных приведенных на рис. 14 видно, что количество цветущих растений в первый и второй сроки посева в 1993 году составило 87-100%, а в третий и четвертый от 0 до 27 % в зависимости от сорта (нами изучено поведение трех сортов Spring Teller, Дракон и Клык слона). Пробу на изуче-

ние гормонального баланса отбирали на ранних этапах онтогенеза, до начала формирования цветоноса (первый отбор - две пары настоящих листьев, второй отбор - фаза розетки до стрелкования). Полученные в этих опытах данные по состоянию гормонального баланса растений дайкона, выращенных в условиях различного светового дня показывают, что сокращение светового дня на три часа приводит к достоверному снижению уровня ауксинов и цитокининов (в 2-3 раза), значительному (в 4-10 раз) увеличению концентрации АБК и изменению динамики формирования уровней 'ГК. Так, если при длинном световом дне, при переходе от фазы двух пар настоящих листьев к фазе розетки, уровень ГК растет (ожидается формирование цветоноса), то у растений не формирующих цветоносы этот уровень снижается. Исходя из вышеизложенного, растения дайкона разных сроков посева были обработаны АБК, 2-ХЭФК, ССС, а поздних сроков посева - ГК, гетероауксином и 6-бензиламинопурином (6-БАП).

Рис. 15. Влияние обработок регуляторами роста на количество цветущих растений дайкона (третий срок ■ посева).

80 т 70 ! 60 т 50 { 40 130 | 20 10 0

ь_п

гИ

гЬ

о о о

с <

Обработки АБК, 2-ХЭФК и ССС снижали количество цветущих растений, гетероауксин и синтетический аналог цитокининов 6-БАП не изменяли уровень "цветушности", а опрыскивание гиббереллином существенно увеличивало количество цветущих растений (рис. 15).

Таким образом, анализ гормонального баланса и действия фиторегу-ляторов, позволяет сделать вывод, что гормонами, определяющими переход растений дайкона ;< цветению являются ГК и АБК. Повышение уровня ГК в листьях предшествует переходу растений к фазе цветения, а блокировка биосинтеза ГК ретардантами подавляет этот процесс. В то же время повышение уровня АБК предшествует переходу растений к фазе формирования корнеплодов лишь в пределах нормы реакции данного генотипа.

3.4.5. Влияние ретардантов на баланс гиббереллинов в побегах яблони

Для определения качественного состава эндогенных гиббереллинов

(ГК) в образцах растительного происхождения необходимо проведение комплексных исследований, сочетание методов биотестирования, жидкостной и газо-жидкостной хроматографий, масс-спектрометрии.

Мы провели идентификацию эндогенных гиббереллинов, содержащихся в стеблях и листьях яблони. Объектом исследования были выбраны 12-летние деревья яблони сорта Антоновка обыкновенная.

Оказалось, что в однолетних побегах яблони содержатся четыре гиб-береллина А1, A3, А5 и А7. Соотношение идентифицированных гиббереллинов в смеси следующее: А5 - 83,4, А7 - 7,2, A3 - 6,8, А1 - 2,5. '

Известно, что для стимуляции ростовых процессов в яблоне с наибольшим успехом используются препараты содержащие гиббереллины A4 и А7 (Elfving 1985, Curry 1983, Greene 1980, Eccher 1982 и многие другие). Это еще раз подтверждает высказанное нами ранее предположение, что обработки растений следует проводить лишь теми гиббереллинами, которые участвуют в процессах метаболизма данного растения. В этом случае эффект применения гиббереллинов будет максимальным. Применение ретардантов, тормозящих рост растений - важный элемент современных биотехнологий. В этой связи определенный интерес представляют исследования механизма действия ретардантов, в частности, их влияние на качественный и количественный состав эндогенных гиббереллинов, с активностью которых связан рост стебля.

Мы изучили изменение содержания гиббереллинов в однолетних побегах яблони под действием высокоэффективных ретардантов - хлорхо-линхлорида (ССС) и кампозана-М (действующее начало - 2-ХЭФК). Первый из них как известно, подавляет биосинтез ГК, а второй не оказывает на него заметного действия..

Растения обрабатывались ССС в концентрации 0,6 %, кампозаном -0,2 % и их смесью 0,4% + 0,2 % (по д.в.). Опрыскивание проводилось дважды: через две и три недели после цветения. Для анализа использовали обезлиственные побеги яблони. Параллельно с изучением динамики содержания гиббереллинов, регистрировалась динамика роста побегов при обработке ретардантами (рис. 16). Препараты, как и следовало ожидать, тормозили рост побегов, однако, к концу вегетации их влияние сглаживалось. С помощью метода (хроматографическая очистка + биотесты на проростках салата) показано, что ретарданты влияют на количество гиббереллинов в побеге яблони (рис. 17). Вначале обработка ретардантами и их смесью вызывала кратковременное снижение уровня гиббереллинов, затем их содержание увеличивалось, а затем постепенно снижалось и достигало уровня контроля, что коррелировало с динамикой роста побегов (рис. 16). Вероятно вызванный обработкой ретардантами стресс через какое-то время компенсируется активным биосинтезом гиббереллинов, что и находит свое отражение в динамике ростовых процессов. Применение ретардантов на яблоне сначала тормозит ростовые процессы, а затем по мере активизации биосинтеза гиббереллинов рост побегов уско-

ряется и, в итоге общая длина обработанных ретардантами побегов достигает контрольных. Результаты, полученные в течение двухлетних испытаний, хорошо согласуются между собой. Наряду с испытаниями, проведенными на 12-летних деревьях яблони, которые, как можно было предположить, менее отзывчивы на воздействия ретардантами, мы изучили влияние обработок препаратами регуляторов роста на содержание эндогенных гиббереллинов в однолетних побегах молодых активно растущих деревьев.

Рис. 16. Динамика роста однолетних побегов яблони при обработке ретардантами

14.ИЮН 22.ИЮН 7.ИЮЛ 21 Июл 11 Ааг 12 Окт

Сроки отбора образцов

Рис. 17. Содержание эндогенных гиббереллинов в побегах яблони при обработке ретардантами

Как и следовало ожидать, эффект, наблюдавшийся нами ранее при работе с 12-летними деревьями, на 3-летних был более выражен.

3.4.6. Изменение состава гиббереллинов при завязывании винограда.

Хорошо известно, что обработка гиббереллинами особенно эффективна на бессемянных сортах винограда (кишмиш), причем наибольший эффект дает опрыскивание винограда в фазе цветения раствором, содержащим смесь гиббереллинов А4+А7 (Смирнов и др. 1993)

Мы про вели хромато-масс-спектрометрическое исследование гиббе-реллинов, выделенных из растений винограда сортов Хусайне и Кишмиш черный. Установлено, что в соцветиях и побегах винограда содержатся три гиббереллина А4, А11 и А19. При переходе от фазы бутонизации к фазе завязывания соотношение различных гиббереллинов меняется, причем наиболее заметно изменяется уровень А4 (таблица 11).

Эти данные объясняют необычно высокую отзывчивость бессемянных сортов винограда на обработку ГК. В бессемянных сортах винограда (кишмиш) вероятно из-за отсутствия семяпочки в момент цветения не продуцируется физиологически-активный гиббереллин А4. В тоже время, рецепторы, адаптированные на этот гиббереллин в бессемянных сортах винограда имеются. Поэтому обработка бессемянных сортов именно в фазе цветения препаратами содержащими А4 и дает максимальный эффект.

Таблица 11.

_Динамика А4 в винограде сортов Хусайне и Кишмиш._

Содержание А4 в смеси ГК, %

Бутонизация | Цветение | Завязывание

Сорт винограда

Кишмиш соцветие 28 следы следы черный побеги 91 41 86 Хусайне соцветие__следы_71_23

ЗАЛ. Гормональный баланс и экзогенная регуляция прорастания клубней стахиса при хранении.

Клубни стахиса ценятся как диетический продукт питания. Они содержат много биологически-активных веществ, обладающих, фармоколо-гической активностью (Кононков 1993).

При промышленном возделывании стахиса возникает проблема с хранением клубней. При уборке стахиса в традиционные сроки (конец сентября - начало ~ октября) клубни закладывают на хранение. Однако, они имеют небольшой период покоя, быстро прорастают и легко поражаются болезнями при хранении. В настоящее время убранные клубни стахиса хранят пересыпанные песком в ящиках или полиэтиленовых пакетах при температуре от нуля до + 3 С, однако и в этих условиях велики потери и больше половины клубней обычно не сохраняется до весны. Представляло интерес на основании изучения гормонального баланса выявить фиторегуляторы, увеличивающие период покоя клубней стахиса.

Исследования со стахисом проводились в полевом опыте на базе ВНИИССОК. Посадка культуры - первая декада мая. Уборка урожая и закладка на хранение - первая декада октября.

В опытах исследованы крезацин - триэтаноламмониевая соль о-крезоксиуксусной кислоты и 2-хлорэтилфосфониевая кислота (2-ХЭФК).

В течение периода длительного хранения клубней стахиса в холодной камере (7 месяцев) проводили измерение длины ростков и потери клубней в процессе хранения. В опытах количественно методом газовой хроматографии контролировалось выделения этилена клубнями в нача-

ле и конце хранения и остаточные количества 2-ХЭФК.

В начале хранения обработка фиторегуляторами уменьшала длину ростков, тормозила прорастание клубней. Оказалось, что обработка 2-ХЭФК, перед закладкой на хранение была наиболее действенной (табл.12).

Уже в конце января контрольные клубнями были сильно поражены болезнями. В конце февраля - марте месяце были поражены также клубнями, обработанные 2-ХЭФК, что, вероятно, связано с фитотоксич-ностью препарата в данных концентрациях. Наибольшей устойчивостью к фитопатогенам обладали клубни, обработанные крезацином перед закладкой на хранение и полученные с растений, обработанных этим препаратом в период вегетации. Визуальные наблюдения в процессе хранения показали, что обработка вегетирующих растений крезацином приводила к обильному образованию воздушных корней на клубнях стэ-хиса при хранении.

Таблица 12.

Влияние фиторегуляторов на устойчивость клубней стахиса при дли-

тельном хранении.

Вариант опыта I Процент потерь при хранении, %

Контроль, 0,8 1,7 10,9 58,3 85,1 94,5

обр. водой

Крезацин, обработка растений

10 мг/л 0,5 0,8 2,0 7.2 9,2 10,2

50 мг/л 1,5 2,0 2,7 8,6 9,5 11,1

100 мг/л 0,9 1.4 1,5 9,5 10,9 11.5

Крезацин, обработка клубней

50 мг/л 0.8 1.8 2,4 9,8 11,2 13,3

100 мг/л 1,1 2,3 2,5 8,8 11.1 13,3

2-ХЭФК обработка растений перед уборкой

0,05 % 1.0 1.5 1,9 7,4 8.1 8,3

Таблица 13.

Вариант опыта Сроки отбора проб

ноябрь | маот

Контроль, обработка водой 0,004 0,001

Крезацин, обработка раст, 10 мг/л 0,011 0,02

Крезацин, обработка раст, 50 мг/л 0,005 0,12

Крезацин, обработка раст, 100 мг/л 0,005 0,03

Крезацин. обработка клубней, 50 мг/л 0,55 0,01

Крезацин, обработка клубней, 100 мг/л 0,32 0,08

2-ХЭФК обработха растений перед уборкой, 0,05 % 0,30 0,25

Роль этилена в процессах индукции и поддержания покоя хорошо известна. В наших опытах мы проконтролировали интенсивность выделения этилена в процессе хранения клубней стахиса. Обнаружено, что наиболее интенсивно этилен выделяют клубни обработанные перед

закладкой на хранение или полученные с растений опрыснутых в период вегетации фиторегуляторами (табл. 13 ).

Определение остаточных количеств 2-ХЭФК показало, что к концу хранения содержание этого препарата в тканях клубней обоих вариантов была ниже, чем предельно допустимый уровень (ПДК) равный 0,5 мг/кг. При хранении в клубнях стахиса меняется содержание таких фитогормонов как АБК и ГК (рис. 18). В клубнях контрольных растений содержится гораздо больше ГК, чем в обработанных крезацином.

Рис. 18. Динамика АБК и ГК в клубнях стахиса при хранении

гЬ

/ :

- 18

• 16

• 14

• 12 ш

• 10 и

■ 8 X

■ 6 ьО

• 4

• 2

• 0

Контроль, ГК

3 Клубни обработанные крезацином. ГК Контроль. АБК

-Клубни обработанные крезацином, АБК

Ноябрь Декабрь Январь с^враль Апрель

Обработка крезацином приводит к росту уровня АБК, по сравнению с контролем. Особенно этот эффект заметен в конце хранения.

Проведенные исследования выявили высокую эффективность препарата крезацин на стахисе. Обработка крезацином повышала урожай клубней и их устойчивость к болезням при длительном хранении, обработка 2-ХЭФК за две недели до уборки, хотя и показала неплохие результаты, но была менее эффективной.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Содержание гормонов в растениях меняется очень быстро, иногда эти изменения удается зафиксировать даже в течение одного часа. Для изучения поведения фитогормонов в динамике мы разработали комплексную, высокопроизводительную и высокочувствительную методику. Эта методика, основанная на сочетании физико-химических (ГЖХ, ГЖХ-МС, ВЭЖХ), иммуноферментных методов и биотестсв, позволяет анализировать пять основных групп фитогормонов (гиббереллины, абсцизовая и индолилуксус-ная кислоты, цитокинины, этилен). Предложенная нами аналитическая процедура дает возможность определять все перечисленные выше фито-гормоны в одной пробе растительного материала, что позволяет исключить ошибки, связанные со случайными, неконтролируемыми факторами. Высокая производительность и чувствительность методики позволяет анализи-

ровать качественный и количественный состав фитогормонов по фазам развития растения или срокам хранения сельскохозяйственной продукции, а также исследовать различные органы растения.

Экспериментальные данные полученные с помощью этой универсальной методики и всесторонний анализ литературы позволили нам сформулировать основные принципы формирования гормонального баланса растений. Система гормонального баланса растений находится в динамическом равновесии, которое постоянно поддерживается путем изменения концентрации фитогормонов. Соотношение фитогормонов меняется в ответ на внешнее воздействие, причем, увеличивая или сокращая (саморегулируя) биосинтез отдельных фитогормонов, варьируя соотношением их свободных и связанных форм, характером их транспорта растение, насколько это позволяет норма реакции данного генотипа, стремится компенсировать (или хотя бы ослабить) это внешнее воздействие. При этом, принципы смещения гормонального равновесия (баланса) соответствуют общим положениям химической кинетики.

На основании вышеизложенных общих принципов мы разработали некоторые приемы и, подходы к управлению гормональным балансом. Способы управления гормональным балансом основываются на контроле над биосинтезом не только самих фитогормонов, но и их предшественников. Для увеличения продуктивности необходим длительный (пролонгированный) эффект, воздействие (обработка) приводящие к кратковременному (пиковому) изменению гормонального баланса, как правило, не приводят к росту продуктивности растения. Изучение гормонального баланса позволяет также выявить критические "ключевые" фазы онтогенеза, когда применение фиторегуляторов наиболее эффективно. Иными словами, анализ гормонального баланса позволяет точно указать когда, т.е. на какой фазе развития растения следует проводить обработку, как и каким фиторегулятором (или приемом) следует воспользоваться, чтобы получить оптимальные результаты.

Метод изучения гормонального баланса был с успехом апробирован для решения,конкретных прикладных задач по повышению продуктивности, устойчивости растений к неблагоприятным факторам внешней среды, снижению потерь при хранении сельскохозяйственной продукции, а также при создании гормональных тестов для селекционного отбора высокопродуктивных и устойчивых форм и сортов растений.

ВЫВОДЫ.

1. Разработана универсальная высокопроизводительная методика анализа гормонального баланса растений, основанная на сочетании физико-химических (Г>КХ, ГЖХ-МС, ВЭЖХ), иммуноферментных методов и био-тестоа, благодаря которой стало возможным осуществить определение качественного и количественного состава пяти основных групп фитогормонов (ГК, АБК, ИУК, цитокинины, этилен) о одной, сравнительно небольшой (до

50 г сыр.м.) пробе. Разработанная нами методика универсальна и апробирована для серийный анализ большого количества образцов таких различных видов растений как ячмень, пшеница, картофель, виноград, яблоня, стахис, наперстянка, мята, свекла, дайкон.

2. Изучена динамика формирования гормонального баланса (АБК, ГК, ИУК, цитокинины, этилен) широкого спектра растений (яровой ячмень, озимая пшеница, картофель, кормовая свекла, дайкон, стахис, мята, наперстянка, яблоня, виноград). Показано, что гормональный баланс в процессах жизнедеятельности растений варьируется в широких пределах и зависит от генетических особенностей растения, фазы его развития и внешних факторов.

3. На основании многолетнего изучения динамики концентраций фи-тогормонов растений in vivo и анализа литературных данных выявлены основные принципы формирования фитогормонального баланса:

а) в процессе вегетации соотношение фитогормонов в растении постоянно меняется, сохраняя при этом динамическое равновесие (баланс), которое поддерживается за счет изменения концентрации отдельных фитогормонов;

б) скорость изменения соотношения фитогормонов в растении достаточно высока, и, как показали опыты на растениях ячменя, под влиянием суточных изменений температуры и влажности уровень фитогормонов может существенно (в несколько раз) меняться уже в течение часа;

в) направление и величина смещения гормонального баланса определяются характером внешнего воздействия и генетическими особенностями растения, но эти изменения ограничены нормой реакции данного генотипа.

3. Сформулированы принципы экзогенного управления гормональным балансом растений. Суть их сводится к следующему:

а) изучение динамики гормонального баланса позволяет точно установить критические "ключевые" фазы онтогенеза и указать сроки и характер наиболее эффективного применения фиторегуляторов. Этот подход был апробирован для подавления "цветушности" дайкона и стимуляции продуктивности бессемянных сортов винограда;

б) экзогенная регуляция гормонального баланса может быть основана не только на контроле над биосинтезом самих фитогормонов, но также и их предшественников. Так, экзогенная обработка растений ячменя, пшеницы и картофеля мевалоновой кислотой, предшественника цитокининов, абсци-зовой кислоты и гиббереллинов в биосинтезе, увеличивала содержание этих эндогенных фитогормонов и, особенно, гиббереллинов;

в) опыты на наперстянке и яблоне показали, что экзогенное изменение тем или иным способом концентрации одного из фитогормонов вызывает ответное смещение гормонального баланса в целом в направлении компенсации влияния этого изменения, что сказываются и на ростовых

процессах;

г) в опытах на зерновых (ячмень, пшеница) и картофеле показано, что для увеличения продуктивности следует добиваться длительного (пролонгированного) эффекта действия экзогенных фиторегуляторов на гормональный баланс, кратковременные (пиковые) изменения гормонального баланса, как правило, не оказывают заметного влияния на продуктивность растений;

5. В опытах на лекарственных растениях (мята, наперстянка) показана тесная взаимосвязь гормональной регуляции и формированием и увеличением выхода вторичных метаболитов. Установлена прямая связь между содержанием ментола , ГК и АБК в листьях мяты. Так, обработка растений препаратами подавляющими биосинтез гиббереллинов (ретарданты или экзогенный гиббереллин) стимулирует образование ментола и (или) повышает уровень АБК. Характер смещения направления биосинтеза в сторону ментола или АБК определяется сортовыми особенностями растения.

6. Продемонстрирована высокая эффективность применения метода изучения гормонального баланса при разработке технологии хранения корнеклубнеплодов стахиса. Показано, что обработка оастений стахиса креза-цином уменьшает прорастание клубней и повышает их устойчивость к фи-тспатогенам при хранении. Действие крезацина связано с изменением баланса фитогормснов в тканях клубней. При обработке этим препаратом содержание АБК, цитокининов и интенсивность выделения этилена клубнями возрастает, а уровень ИУК и ГК снижается.

7. Установлено, что такие показатели, как состав и характер изменение соотношение фитогормонов уже на ранних этапах онтогенеза могут использоваться в качестве экспресс-тестов при селекционном отборе высокопродуктивных и устойчивых форм и сортов растений.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Курапов П.Б.,Скоробогатсва И.В..Бумажный Б.Е., Блиновский И.К. Идентификация гиббереллинов в побегах яблони методом хромато-масс-слектрометрии. Регуляторы роста растений, М. Агропрсмиздат, 1990. С. 110-114

2. Курапов П.Б.,Скоробогатоза И.В., Блиновский И.К., Бумажный Б.Е. Изменение содержания эндогенных гиббереллинов в побегах яблони под действием ретардантов. 2- е Всесоюзное совещание по пестицидам, Черноголовка 1990 г., тез.докл.

3. Скоробогатоэа И.В., Блиновский И.К., Бумажный Б.Е., Курапов П.Б. Изменение содержания эндогенных гиббереллинов в побегах яблони под действием ретардантов Тез. докл. международного совещания СЭВ "Эффективность регуляторов роста в различных почвенно-клима-тических зонах" Краснодар, 24-29 сент. 1990

Л. Скоробогатова И.В., Курапоэ П.Б., Бумажный Б.Е. Изучение действия брассиносте-роидов на содержание гиббереллинов в растениях ячменя. 2-е совещание по брасси-носте рейдам,Минск, 1991 г.

5. Kurapov Р.В., Blinovsky I.K.GC-MS identification of endogenous gibberellins in apple shoot tissue Plant metabolism regulation, Sofia, 1991, p.216-219.

6. Курзпов П.Б., Блиновский И.К., Бумажный Б.Е. Методика определения остаточных количеств мивала в растениях. Материалы рабочего совещания по программе "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 16-18 июля 1991 г.), С.123

7. Курапов П.Б..Блиновский И.К., Бумажный Б.Е. Методика определения остаточных количеств креэацина в растениях. Материалы рабочего совещания по программе "Регуляторы роста и развития растений" (Москва. 16-18 июля 1991 г.), С.124.

8. Блиновский И.К.. Курапов П.Б.. Бумажный Б.Е., Скоробогатова И.В.. КозикТ.А., Сле-пичев С.И. Влияние брассиностероидов на продуктивность и содержание АБК, цитоки-нинов и гиббереллинов в яровом ячмене. Материалы рабочего совещания по программе "Регуляторы роста и развития растений" (Москва, 16-18 июля 1991 г.). С. 4.

9. Курапов П.Б., Блиновский И.К., Сальникова Е.И. Идентификация гиббереллинов в препарате "Гиббереллин кристаллический" и их активность в биотестах Извест. ТСХА. 1991, № 1

10. Колектив авторов, (Курапов П.Б.) Регуляторы роста растений Киев, 1992. 178с.

11. Курапов П.Б.. Козик T.A., Бумажный Б.Е.. Скоробогатова И.В.. Кислин E.H. Влияние брассиностероидов на содержание АБК. цитокининов и гиббереллинов в яровом ячмене Регуляторы роста растений, Киев, 1992. С. 144-155

12. Курапов П.Б. Брассинолиды - новый перспективный класс регуляторов роста растений Сб. матер, конф. Перспективы создания экологически безопасных регуляторов роста растений, средств защиты и технологии их применения в производстве с.-х. продукции (Киев, март. 1992) С.42

13. Скоробогатова И.В., Галактионова О.Ю., Курапов П.Б. Влияние брассиностероидов на содержание этилена в растениях ячменя. Доклад на научной конференции ТСХА (Москва, 8-10 декабря 1992 г.).

14. Galaktionova О, Skorobogatova I, Bumazhny В., Kurapov P. The influence of brassinosteroids on content ethylene in barley's plants. Конф. Этилен: Физиология, биохимия и практическое применение. Москва-Пущино-С.-Пт., 16-21 июля 1992 г.

15. Kurapov Р.В.. Boumazhnij В.Е., V.Yu.Andreev. В.F. Ivanov.B.B.Vartapetian. Etanol metabolisation in apple-tree fruits under anoxia. Physiologia Plantarum 1992, v. 85 (3). part 2. A 97

16. Kurapov Р.В., Boumazhnij B.E., V.Yu.Andreev, В.F. Ivanov.B.B.Vartapetian, Etanol metabolisation in apple-tree fruits under anoxia. 8th Congress of the Federation of European Societies of Plant Physiology, Antwerpen, August 23-28, 1992

17. Канева И.M., Курапов П.Б., Васюкова Н.И., Озерецковская О.J1. Стерины в процессе ранеаой репарации клубней картофеля. Прикладная биохимия и микробиология 1993, Т. 2

18. Курапов П.Б., Скоробогатова И.В.,Сиушева А.Г., Козик Т.А., Галактионова О.Ю. Брассиностероиды - новый класс природных регуляторов роста растений Конф. Совершенствование научно-теоретического и методического уровня преподавания физиологии растений, Смоленск 29 сент,- 1 октября 1993 г.

19. Курапов П.Б., Скоробогатова И.В.;Сиушева А.Г., Козик Т.А., Ковалев В.М. Некоторые аспекты действия брассиностероидоа на растения ячменя и картофеля Тез. докл. симпоз. "Брассиностероиды - биорациональные, экологически беоласные регуляторы роста и продуктивности растений" (Минск, 1-3 июля 1993 г.) - Мн., 1993. С.6-7

20. Курапов П.Б., Скоробогатова И.В.,Сиушева А.Г., Козик T.A., Ковалев В.М.. Слепи-чев С.И., Денискин С.В.Влияние физических полей на интенсивность физиологических процессов, гормональный статус и продуктивность картофеля, ячменя и гриба вешен-ка. Тез. докл. второй конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 29 июня- 1 июля1993 г.) ТСХА, М. 1993. С.37

21. Куралое Л.Б., Скоробогатова И.В., Сиушева А.Г., Козик Т.А.. Ковалев В.М. Применение методов изучения гормонального баланса растений в растениеводстве и селек-

ции Тез. докл. второй коиф. "Регуляторы роста растений" (Мосхва 29 июня-1 июля1993 г.) ТСХА, М. 1993. С.39

22. Ванчиков А.Н., Курапов П.Б. Состав жирных кислот растительного масла семян различных сортов амаранта Тез.докл. Российской научно-практической конф. "Фундаментальная и методическая подготовка будущего специалиста по экологии и охране природы" Орел, 22-24 ноября 1994, С. 173

23..Курапов П.Б., И.В.Скоробогатова А.Г.Сиушева, ТАКозик, Ковалев В.М., Кононков П.Ф., Шестакова Е.В. Изучение гормонального баланса дайкона в зависимости от продолжительности светового дня. Тез.докл. Российской научно-практической конф. "Фундаментальная и методическая подготовка будущего специалиста по экологии и охране природы" Орел. 22-24 ноября 1994, С. 174.

24. Шевелуха B.C., Ковалев В.М., Курапов П.Б. Оценка продуктивности и устойчивости растений на ранних этапах онтогенеза по их гормональному статусу Тез. докл. "Методы комплексной оценки продуктивности и устойчивости с.-х. растений". (Москва 14-16 ноября 1994 г.) РАСХН. - М„ 1994, С.23.

25. Курапоа П.Б., И.В.Скоробогатова Н.П.Карсункина А.Г.Сиушева, Шевелуха B.C., Соркина Г.Л. Экзогенная регуляция биопродуктивности и гормональный баланс дайкона. Научная конференция ТСХА, (Москва 6-8 декабрь, 1994)

26. Курапов П.Б., Н.П.Карсункина, Ковалев 8.М., Кононков П.Ф. Применение регуляторов роста для оптимизации хранения стахиса. Научная конференция ТСХА, (Москва 68 декабрь, 1994).

27.Курапоа П.Б., И.В.Скоробогатова, Н.П.Карсункина, А.Г.Сиушева. Т.А.Козик Возможные пути регуляции цветения дайкона. Первый международный симпозиум "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического испопьзования. Тезисы докладов. Пущино-1995 г. с.161-163.

28. Карсункина Н.П., Соркина Г.Л., Курапов П.Б. Влияние регуляторов роста на покой и устойчивость к болезням клубеньков стахиса при хранении. Первый международный симпозиум "Новые и нетрадиционные растения и перспективы их практического использования. Тезисы докладов, Пущино-1995 г., с.614-616.

29. Курапоа П.Б., Болотин Б.М., Ванчикоз А.Н., Савенкова Е.Б. Полимерная композиция для пленок сельскохозяйственного назначения. // Патент РФ по заявке № 94009874/04 от 23.03.94.

30. Скоробогатова И.О., Сиушева А.Г.. Бойценюк Л.И, Ковалев В.М., Курапов П.Б. Влияние электромагнитных излучений на гормональный баланс, ростовые процессы и продуктивность растений и грибов. Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 июня1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.74-75

31. Бойценюк Л.И., Калашников Д.В., Курапов П.Б., Хорхе Рикельме Диас. Гормональная регуляция процессов оплодотворения. Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 мюня1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.9-10.

32. Курапов П.Б. Метод гормонального балзнса для целей растениеводства и селекции. Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 июня1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.11-12.

33. Курапов П.Б., Скоробогатова И.В..Сиушева А.Г.,Сальниковз Е.И., Ковалев 8.М., Соркина Г.Л. Гормональный статус различных ро засухоустойчивости сортов ячменя. Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 июня 1995 г.) ТСХА, М. 1695, С.26-27.

34. Куралоз П.Б., Сальникова Е.И., Казахмедоэ Р.Э. Изучение гормонального баланса генеративных органов винограда различных зколого-географичесшх групп. Тез. докл.третьей гонф. "Регуляторы роста растений" (Москоа 27-29 июня 1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.28-29.

35. Куралоз П.Б., Шаин С.С., Головкина Г.И., Гейер Н.И., Скоробогатова И.В..

Сиушева А.Г., Соркина Г.Л.. Бумажный Б.Е., Ковалев В.М. Управление биопродуктивностью по сбору гликозидов и гормональный баланс в онтогенезе наперстянки Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 июня1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.45-46

36. Шаин С.С., Курапов П.Б., Скоробогатова И.В., Дмитриев Л.Б., Дмитриева В.Л., Сиушева А.Г., Сальникова Е.И. Влияние стимулирующих и ингибирующих рост фиторегу-ляторов на гормональный баланс и состав эфирных масел различных сортов мяты. Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 июня1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.53-54.

37. Карсункина Н.П., Соркина Г.Л., Курапов П.Б. Регуляция покоя и устойчивости к болезням клубеньков стахиса в процессе хранения при обработке регуляторами роста Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 июня 1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.158-159.

38. Ванчиков А.Н., Соркина Г.Л., Курапов П.Б., Сиушева А.Г. Снижение уровня остаточных количеств пестицидов и регуляторов роста в пищевых продуктах растительного происхождения. Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 июня 1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.197-198.

39. Курапов П.Б., Сиушева А.Г., Скоробогатова И.В., Быков В.А., Савина Т.А., Ванды-шев В.В., Шаин С.С. Гормональный статус склероциев и инфекционного материала спорыньи (Clavceps purpurea (Fr.) Tul.) Тез. докл.третьей конф. "Регуляторы роста растений" (Москва 27-29 июня1995 г.) ТСХА, М. 1995. С.199

40. Курапов П.Б., Сиушева А.Г., Скоробогатова И.В. Влияние зпибрассинолида на транспорт ассимилятов в растениях картофеля, ячменя и пшеницы Тез. докл. IV конф. Брассиностероиды - биорациональные, экологически безопасные регуляторы роста и продуктивности растений (Мн., 3-6 июля 1995 г.) С. 7-8.

41. Курапов П.Б., Скоробогатова И.В., Сиушева А.Г., Шевелуха B.C., Ковалев В.М. Гормональный статус различных по засухоустойчивости сортов ячменя Тез. докл. на втором съезде Белорусского общества физиологов растений (18-20 октября 1995 г. Минск) ИЭБ АНБ. -Мн. 1995, С.18-19.

42. Колектив авторов (Курапов П.Б.)// под ред. В.С.Шевелухи и Г.В.Удовенко. Физиологические основы селекции. Т.2.: Теоретические основы селекции. ВИР. - С.-Пб., 1995. 320 с.

43. Курапов П.Б., Шаин С.С., Головкина Г.И., Гейер Н.И., Шевелуха B.C. Экзогенная регуляция продуктивности в онтогенезе наперстянки Физиология растений, 1995 г., т.42, № 5, с.780-786.

44. Курапов П.Б., Карсункина Н.П., Скоробогатова И.В., Сиушева А.Г., Соркина Г.Л., Ковалев В.М., Шевелуха B.C., Кононков П.Ф.,Шестакова Е.В. Гормональный баланс и экзогенная регуляция цветения дайкона. Сельскохозяйственная биология, 1996 г. (в печати).

45. Курапов П.Б., Скоробогатова И.В., Сиушева А.Г. Роль мевалоновой кислоты в формировании гормонального баланса растений. Сельскохозяйственная биология, 1996 г., №1, с 56-59.

46. Курапов П.Б., Скоробогатова И.В., Сиушева А.Г., КозикТА Гормональные аспекты действия зпибрассинолида в яровом ячмене, озимой пшенице и картофеле. Сельскохозяйственная биология, 1996 г. № 3, с. 36-42.

47. Курапов П.Б., Скоробогатова И.В., Сиушева А.Г., Соркина Г.Л., Ковалев В.М., Сальникова Е.И. Гормональный баланс различных по засухоустойчивости сортов ячменя Вестник РАСХН, 1996 № 1, с.17-19.

48. Курапов П.Б., Шаин С.С., Шевелуха B.C., Скоробогатова И.В., Сиушева А.Г., Соркина Г.Л., Ковалев В.М., Бумажный Б.Е. Экзогенная регуляция биопродуктивности и гормональный баланс наперстянки в онтогенезе Вестник РАСХН, 1996, № 4, с. 52-54.

49. Карсункина Н.П., Курапов П.Б., Ковалев В.М., Соркина Г.Л. Средсиво для повышения устойчивости клубней стахиса к болезням. II Патент РФ по заявке № 9510236/13. Решение о выдаче патента от 02.07.96.

50. Kurapov Р.В. The Plant hormone balance method in plantbreedlng and selection. Второй симпозиум "Физико-химические основы физиологии растений", Пенза, 5-8 февраля 1996 г.

51. Бойценюк Л.И., Калашников Д.В., Куралов П.Б. Влияние фитогормонов на формирование плодов у перекрестноолыляемых растений. Тез. 2-й конф. "Влияние физических и химических факторов на рост и развитие с.х. культур", Орехово-Зуеео, 1996, с. 7.

52. Сальникова Е.И., Казахмедов Р.Э., Курапов П.Б., Смирнов К.В. Гормональная регуляция бессменных ягод винограда. Тез. 2-й конф. "Влияние физических и химических факторов на рост и развитие с.х. культур", Орехово-Зуево, 1996, с. 8.

53. Сальникова Е.И., Каэахметов Р.Э., Курапов П.Б., Смирнов К.В., Сиушеоз А.Г. Гормональный баланс и его изменение при применениии регуляторов роста на ранних этапах эмбриогенеза винограда сорта Хусайне (Vitis Vinifera). // Международный сельскохозяйственный журнал, 1996, № 6, с. 44-49.

54. Карсункина Н.П., Соркина Г.Л., Курапов П.Б. Использование регуляторов роста для повышения урожайности и сокращения потерь клубней стахиса при хранении. II Международный сельскохозяйственный журнал, 1996, № 6, с. 38-41.

Информация о работе

Курапов, Павел Борисович
доктора биологических наук
Москва, 1996
ВАК 03.00.12

Автореферат

Похожие работы