Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Глюкоамилаза Aspergillus awamori 466

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Глюкоамилаза Aspergillus awamori 466"

Па правах рукописи 1/

СЛК1 ЮКУРОНЛ Юлия Ивановна

РГБ ОД

17 дпр т

ГЛЮКОЛМИЛЛЗЛ \SPHRGIIJ.(/.VАИ'АХ!ОШ 466: ВЫДИШПИН, ИММОБИЛИЗАЦИЯ И СВОЙСТВА

Специальность 03.00.04 - Ьиохимия, 03.00.23 - Биотехнология

АВГОРНФНРЛТ диссертации на соискание ученом степени кандидата биологических наук

Воронеж 2000

Работ выполнена на кафедре микробиологии и биохимии Воронежской lt дарственной чсмюлогичсской академии

Доктор биологических наук, профессор Жеребцов I I.A.

Каидида! технических иаук. доцегп Руадче И.Д.

Докгор биологических наук, профессор lipnuma Л.II.

Каидалат биологических иаук. доценг Тертмчная Т.П.

Московский юсу даре пнлшыи универси-I сг пищевых прои чводещ

Защша еоетошея «.Ii/» 2000 года в_часов на wee;

min специализированною совет Д 063.4S.11 Воронежского юсударегиеш ю университет (394693. Воронеж. Унинсрсшенжая площади. 1) С диееергапиеи можно ошакомигъся в бийлио1еке ИГУ

Автореферат разослан « Л? » 2000 г.

Ученый секретарь спеииллишрокаппшо cobci а.

Д 063.48.11 докгор биологических наук, профессор с^— 1 Л . Ковале

11аучный руководитель

1(аучпый консулы анг

Официальные ошюпешы:

Ведущая организация

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Ферменты играют большую роль в обмспе веществ живой клетки биологически активных веществ. В основе производства любого продукта лежат либо биохимические, либо физико-химические процессы, либо эти процессы тесно взаимосвязаны. Режимы хранения сырья, его качество и выход продукта определяются действием ферментов.

В этимологии особо актуальны вопросы, активности и специфичности действия ферментов, исследования биосинтеза, физико-химических свойств, механизма действия ферментов. Особый интерес представляет иммобилизация ферментов, сущность которой заключается в присоединении к инертной, нерастворимой полимерной матрице.

Теоретический и практический интерес представляют исследования по отысканию рационального режима иммобилизации гцдролаз, в частности глюкоамипазы (а-1,4:1,6 гшокан-4,6-глюкогвдролаза, КФ 3.2.1.3). Это экзо-ферменг, который осуществляет расщепление в крахмале и олйгосахарвдах а-1,4- и а-1,6- глюкозидпых связей. Использование ферментных препаратов глюкоамилазы в биотехпологии связано с подбором эффективных продуцентов фермента. В решении данного вопроса перспективными являются микро-мицеты рода АзрегфПж, которые обладают высокой биосшггетической активностью и продуцируют экзогенную глюкоамилазу.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры биохимии и микробиологии Воронежской государственной технологической академии но проблеме "Изыскание оптимальных условий микробного биосинтеза ферментов и исследование их физико - химических свойств". Данная проблема включена в координационный план РАН по программе "Микробиологический синтез и научные основы микробиологического получения практически ценных веществ".

Цель и задачи исследования. Целью работы явилось выделение высокоспецифичного продуцента глюкоамилазы, получение активного препарата глюкоамилазы, иммобилизация фермента, исследование физико-химических свойств свободной и иммобилизованной глюкоамилаз.

Для достижения поставленной цели предусматривалось решение следующих основных задач:

• отбор активного продуцента глюкоамипазы среди микромицегов;

• исследование условий биосинтеза глюкоамилазы и рационального режима культивирования продуцента;

• разработка эффективного метода выделения и очистаи глюкоамипазы из экстракта при поверхностном культивировании продуцента;

• подбор оптимального метода и рациональных носителей для получения иммобилизованного фермента глюкоамипазы;

• определение онгамальпых условий для иммобилизации глюкоамипазы;

• выявление характера взаимодействия глюкоамилазы с функциональными группами носителей;

• исследование некоторых физико-химических свойств свободной и иммобилизованной глюкоамилаз: рН - и температурного оптимума действия, рН - и термостабшшюсти фермента;

• идентификация функциональных групп активного центра глюкоашша-

зы;

• практическое использование препаратов штатной и иммобилизованной глюкоамилазы.

Научная новизна. Отобран микромицет Азрег%11ия <татоп 466 осуществляющий эффективный биосинтез глюкоамилазы. Подобраны рациональные условия биосинтеза дня поверхностного культивирования микромицета. Разработан способ получения препарата глюкоамилазы ы предложена схема его очистка Исследована сорбциошгая иммобилизация глюкоамилазы на носителях различного тина. Выявлена возможность многократного но пользования иммобилизованной глюкоамилазы. Показано использование ИК - спектроскопии для гаучених нроцгсса иммобилизации Найдены оптимальные рН и температура действия натившго и иммобилизованного ферментов. Исследован процесс термической и кислотной инактивации для натившго и иммобилизованного ферментного препаратов глюкоамилазы. Показана целесообразность применения ферментного препарата как в свободной так и в иммобилизованной форме в производстве некоторых хлебобулочных изделий.

Практическая значимость работы. Получен иммобилизованный ферментный препарат глкжоамилазы. Разработан комплексный улучшигсль на основе ферменгаого препарата глюкоамилазы и прошел апробацию при производстве хлебобулочных изделий в АООТ «Хлебозавод № 2» г. Воронежа. Предложена технологическая схема, но использованию иммобилизованной глюкоамилазы.

Апробация работы. Основные результаты по теме диссертации докладывались и обсуждались на внутривузовских, межрегиональных и международных конференциях. Они были представлены на Международной конференции «Проблемы шпцевой технология и техники» (Могилев, 1997), на Межрегионально й конференции «Продовольственная безопасность России: качество продуктов питания - 99» ВГАУ, на Международных и внутривузовских конференциях ВГТА за 1997 -1999 г.

Публикации. Основные результаты диссертационной работы юложепы в 9 публикациях.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 158 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов и их обсуждений, заключения, выводов, списка литературы из 197 наименований и приложений. Иллюстрационный материал включает 40 рисунков, 20 таблиц.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объекты исследований. При выборе продуцента глюкоамилазы использовали культуры микромицстов рода Aspergillus, Rhizopus, получеппые го Всероссийской коллекции микроорганизмов.

Культивирование продуцента проводили твердо фазный методом в колбах 750 см3, содержащих 20 г среды ш воздутыо-сухой массе. Выращивание осуществляло! при температуре 32 °С в течение 72 ч, влажность питательной среды - 65 % и крахмалистостъ отрубей -19 %.

Определение активности фермента. Метод основан па специфическом определении глюкозы, образующейся при гидролизе растворимого крахмала под действием фермента. За единицу ппокоамилазной активности принимали такое количество фермента, которое катализирует гвдролиз крахмала при 30 °С и рН 4,7 в течение 1 мин с образованием 1 мкмоля глюкозы.

Математическое планирование эксперимента. При подборе рациональных условий культивирования продудеть для достижения максимального биосинтеза глюкоамилазы использовали полный факторный эксперимент (ПФЭ 24) с применением центрального композиционного ротатабельного униформпланирования (Грачев, 1979).

Выделение и очистка ферментов. Для выделения технических препаратов ферментов жпользовали ультрафипьтрацию, осаждение органическими растворителями:

В ходе выделения препарата, полученного осаждением этанолом, проводили фракционирование белков сульфатом аммония. От ншкомолекулярных соединений глюкоамдаазу отделяли гель-фипьтрапией на сефадекее G-25. Далее использовали геяь-хроматографию на сефадекее G-100. Аналитический электрофорез проводили в иолиакриламвдгюм геле ш методу Дэвиса (Davis, 1964).

Статистическая обработка результатов. Опыты проводились в 3 -4 - кратпом повторении Обсуждаются только те результаты, которые были воспроизведены в каждом опыте.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выбор активного продуцента глюкоамилазы. Из микромицстов рода Aspergillus и Rhizopus, находящихся в музее кафедры биохимии и микробиологии ВГТА, подобран микромицет, обладающий способностью к активному биосинтезу глюкоамилазы. Микромицеты выращивали твердофазным способом в течении 72 ч ври 30 Т, используя в качестве среды пшеничные отруби Наибольшей способностью к биосинтезу глюкоамилазы обладал микромицет A. awamori 466.

Подбор оптимальных условий для твердофазного культивирования продуцента. Главным достоинством этого способа культивирования является высокий выход целевого продукта. В качестве основных факторов,

влияющих; та биосинтез глюкоамияазы, были выбраны температура, влажность питательной среды, продолжительность выращивания, крахмалистость отрубей. Критерием оценки влияния каждого фактора на цроцссс биосинтеза служила акгавность гаюкоамилазы.

Методом множественной корреляции было получено уравнение, адекватно описывающее иронрсс биосинтеза глюкоамияазы. Поиск условий максимального биосинтеза глюкоамияазы осуществляли но полученному уравнению градиентным методом. В результате были получены следующие оптимальные соотношения параметров: температура культивирования 32 °С, продолжительность выращивания 72 % влажность питательной среды 65 %, крахмалистость отрубей 19 %. При таких значениях параметров акгавность шюкоамилазы равнялась 480 ед\г воздушно-сухой массы поверхностной культуры

Получение препарата тюкоамилаш из микцуомицета А. ан>атоп 466. Ферментный препарат глюкоамилазы получали из экстракта поверхностной культуры микромицета, используя ультрафиягьтрацшо, осаждспш органическими растворителями (этанолом, изонронанолом, ацетоном) и сульфатом аммония, гель-фильтрацию на сефадексе С-25 и гель-хроматографию на се-фадексе С-100. Эти операции позволили получил, препарат со степенью очистки 93,5 и уделыюй активностью 690 ед/мг белка. Предложенная схема очистки обеспечивает достаточно высокий выход активного препарата шюкоамилазы (табл. 1). Определение молекулярной массы глюкоамияазы на сефадексе О-100 дало величину 48 кДа.

ИММОБИЛИЗАЦИЯ ГЛЮКОАМИЯАЗЫ

Принципиально новые перспективы для широкого применения ферментов открываются в результате их иммобилизации.

Иммобилизованные ферменты — это препараты ферментов, молекулы которых связаны с нерастворимым носителем (матрицей) и сохраняют при этом полностью или частично свои каталитические функции.

Сорбция глюкоамияазы сорбентами различного типа. Были исследованы ионообмешшки АЕЖБ-2, АНКБ-35, АН-251, КБ-4, АВ- 17-2П и неио-ногенный сорбент Сшросорб МХДЭ-100. Некоторые характеристики исследуемых ионообметшиков нредставлеЕШ в табл. 2.

Предварительная модификация носителей была направлена на повышение прочности адсорбции иммобилизованной глюкоамияазы. Помимо этого модификация носителя нередко обеспечивает улучшение каталитических свойств иммобилизованного фермента благодаря созданию для его молекул благоприятного микроокружения.

Опыты ш сорбции глюкоамияазы проводили при температуре 20 °С и рН 5,0. Результаты сорбции глюжоамилазы на сорбентах: Стиросорб МХДЭ-100, КБ-4, АНКБ-2, АНКБ-35, АН-251, АВ-17-2П в зависимости от времени взаимодействия фаз представлены на рис. 1.

Максимальное связывание фермента было установлено для неионоген-ного сорбента Стиросорб МХДЭ - 100 и иопообмешшка КБ - 4 и составляло соответствеппо: 112,5 мг/г и 107,5 мг/г поситсля.

Таблица 1

Очистка глгокоамилазыА ста топ 466

Стадия очветки Актив- Количе- Удельная Степень Выход

ность ство бел- актив- очистки препара-

глюкоа- ка, ность, та,

милазы, мг ед/мг бел- %

ед ка

Экстракт поверх- 5080,3 + 1020,30 ± 4,98 ±0,22 1,00 100,0

ностной культуры 43,1 34,61

Ультрафильтрация на мембране 0,005 4673,9 + 44,8 496,50 ± 17,32 9,41 ±0,42 1,89 92,0

мкм

Осаждение этано- 3739,1 ± 169,30 ± 22,08 + 4,44 73,6

лом в соотноше- 35,9 5,91 0,99

нии 1 :3

Фракционирование сульфатом 2865,3 ± 27,2 62,40 + 2,17 45,91 ± 2,06 9,21 56,4

аммония при на-

сыщении 70 -

90%

Гель-фильтрация на еефадеисе (!-25 868,7 ± 7,8 10,10 ± 0,45 85,95 ± 3,87 17,26 17,1

Гель-хроматогра- 345,5 ± 0,90 ± 397,21 + 78,23 6,8

фия на сефадексе в-ЮО 6,7 0,03 10,88

Наиболее актив- 157,5 ± 0,30 ± 690,00 ± 93,51 3,1

ная фракция 2,3 0,01 18,33

Для выявления эффекта сорбционной иммобилшации па каталитическую активность гшо ко амилазы в опытах использовался препарат с максимальным содержанием белка. Препарат тщательно отмывали дистиллированной водой. Эксперименты показали, что глюкоамнпаза, иммобилизованная на Стиросорб МХДЭ-100 и ионообменных смолах КБ-4, АНКБ-2, АНКБ-35, АН-251 и АВ-17-2П имеет значительную удельную активность. Наибольший эффект сорбции показали Стиросорб МХДЭ-100 - 2947,5 ед/г и КБ-4 - 2945,5 ед/г сорбента (табл. 3). Выявлена возможность многократного использования иммобилгоовандаго фермента. Было установлено, что глюкоамилаза иммо-

билизованная сорбционно на носителе Старосорб МХДЭ-100 к 20-ой замене субстрата обладала 50 % активностью от исходной (рис. 2.).

Использование метода ИК-снектросшшш позволило предположить, что в связывании фермента с носителем участвуют карбоксильные группы, мстил ьные, метиленовые группы и аминогруппа.

Таблица 2

Объекты исследования

Марка Ионига Характеристика ионига Функциональная группа

АНКБ-2 Окисленный сополимер 2-ыстил-5-винилпиридниа и дивинил бензола. Макропористый амфолит нолиме-ризационного типа, содержащий наряду с кислотными ионогенными группами основные — третичный пиридиновый азот.

А1ЖБ-35 Карбоксимсгилированный н ами-нированный ХМС стирола и днвн-нилбетаола. Полимеризациоиный ам-фолиг, содержащий наряду с кислотными ионогенными группами основные - иыинодиацетатные. ,,сигооон 4CTjCOOH

КБ-4 Омыленный сополимер метакриловой кислоты и дквиннлбешола. Катеонит полимеризационного типа, содержит один вид иоиогешшх групп - карбоксильную - СООН. aij 1 -сн,-с~ 1 соон

АВ-17-2П Аминированный триметиламином ХМС стирола и дишшлбензола. Макропористый анионит полимеризационного типа, содержит только один вид ио1 га-генных групп - бензиядиметилэтаио-ламмониевую. Содержание дивинил-бензола 12%. ¿Нг Hç-i^^-ciij-Ntai,).

АН-251 Сополимер 2-метнл-5-вщшлт1нрндина и дивинил бе! пола. Макропористый анио-нит, имеет в качестве ионогенных групп - азот пиридинового кольца. Содержит 15 % дивинил бензола. -сн^н^

Стиросорб МХДЭ-100 Сверхсщитый полистирол моно-хпордиэтиловым эфиром. Неионо-генный сорбент, обладающий высокой сорбциошюй активностью по отношению к большим биомолекулам. и H Ï"' СНз сн, ^н, ai,

Таблица 3

Иммобилизация глюко амилазы сорбциоппым методом _па носителях различного типа__

Носитель Кол-во связанного белка, мг/г носителя Общая активность в исходном растворе, ед Остаточная активность, % от исходной Удельная активность биокатализатора, ед/мг белка Активность иммобилизованной плокоамилазы, сд/г сорбента

Стиросорб 112,5 3000 44,20 26,2 2947,5

КБ-4 107,5 3200 44,15 27,4 2945,5

АНКБ-35 100,0 3600 41,24 27,5 2750,0

АНКБ-2 95,0 3900 41,24 28,9 . 2745,5

АН-251 87,5 4300 35,29 26,9 2353,8

В-17-2П 65,0 4937 37,91 38,9 2528,5

Рис. 1. Кривые динамики сорбции белка фсрмспла носителями различного типа: 1- Стиросорб; 2 - КБ-4; 3 -АНКБ-35;4-АНЮ5-2; 5 - АН-251; б - АВ-17-2П. Исходное содержание белка в растворе 262,5 мг. Б - количество сорбированного белка, мг/г носителя; т - продолжительность сорбции, ч.

Рис. 2. Ишенснис активности иммобилизованной глюкоамилазы при многократном использовании; А — активность глюкоамилазы, % от исходной; КИ — кратность использования иммобилизованной глюкоамилазы.

НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙС1БА СВОБОДНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ГЛЮКОАМИЛАЗ Л. ЛЮШОШ 466

При гидролизе крахмала основными факторами, влияющими та активность и стабильность глюкоамилазы, являются температура и величина рН.

Установлены рН- оптимум — 5,0 и оптимальная температура - 65 °С для свободной глюкоамилазы. Оптимальный температурный интервал действия иммобилизованной глюкоамилазы 65 - 72 °С, а рН- оптимум 4,0 - 5,0. Полученные результаты свидетельствуют о расширении диапазона действия иммобилизованной формы фермента (рис. 3 и рис. 4).

А, % 100 80 60 40 20 0

\ \

\ \

\ л

\

\

20 30 40 50 60 65 70 % °С

Рис. 3. Влияние темпс-ратуры на активность глюкоамилазы А. сгяатоп 466.1 -свободная глююоамнлаза; 2 — иммобилизованная глюкоамилаза. А - активность. % от максимальной; I - температура, "С.

100

60 40 20 0

2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 рН >

Рис. 4. Влияние рН на активность глюкоамилазы А. татоп 466: 1 - свободная; 2 — иммобилизованная; А — активность, % от максимальной.

Опыты ю кислотной и термической инактивации глюкоамилазы показали наибольшую стабильность фермента в интервале рН 4,5 - 5,0 и температуре 30 - 60 X.. При рН 5,0 и темшратуре 30 °С за 120 ч активность глюкоамилазы снижалась на 2,8 %, а при 40 °С па 9,5 %. Через 12 ч инактивации при 60 °С остаточная активность фермента составила 83,2 %. Повышение температуры до 70 °С приводило к еще большей инактивации фермента: за 30 мин - активность его составила - 13,5 %.

Несмотря на сложность перехода нативного фермента в инакгивирован-ное состояние, этот процесс для большинства ферментов является реакцией первого порядка, которая описывается уравнением:

х А

и

где Ао — исходная активность фермента;

А - активность фермента в момент времепи г. К - константа скорости инактивации, я"1.

В табл. 4 приведены данные кинетики инактивации глюкоамилазы А. ац'атоп 466.

Таблица 4.

Константы скорости термической инактивации

глю ко амилазы А. ауатоп 466

Темпера- К-10" ч"' ври рН

тура,^ 3,0 4,0 4,5 5,0 6,0 7,0

30 5,86 3,61 2,31 1,41 9,86 13,91

40 27,26 14,93 9,76 7,12 95,45 120,28

50 189,08 70,33 51,64 37,48 568,43 962,65

60 953,05 310,55 254,53 154,9 7071,63 10628,94

65 8065,00 3045,00 2283,00 1466,66 30800,00 61005

70 120996,7 57138 46843 40785,00 214050,0 398990

Из табл. 4 ввдно, что температура и рН являются тесно взаимосвязанными факторами интенсивного процесса инактивации.

Воспользовавшись теорией переходдаго комплекса, мы дали термодинамическую характеристику процесса инактивации ппокоамилазы, определив энтропию АХ^ этого комплекса (табл. 5).

Из табл. 5 вадно, что инактивация ппокоамилазы/! сматоп 466 пост сложный характер; в формировании белковой глобулы фермента участвуют, видимо, два типа связей и гидрофобные взаимодействия. Можно предположить существование двух параллельных процессов с различными температурными коэффициентами. В зове рН 3,0 - 6,0 и температурах 30 - 60 °С происходит разрушение слабых электростатических связей, по всей видимости, водородных. Об этом свидетельствуют небольшие изменения энтропии ДУ^- При увеличении температуры от 60 до 70 °С скорость инактивации возрастает. Тепловая энергия вызывает интенсивное разрушение гидрофобных взаимодействий. В результате происходит более глубокое разрушение поли-пепщдной цепи, случайное расположение ее участков относительно друг

друга, чего подтверждается высоким приростом энтропии При низких температурах (30-60 °С) решающую роль в инактивации выполняют ионы Н\ при высоких температурах — тепловая энергия.

Таблица 5

Влияние температуры и р11 на изменение энтропии переходного комплекса глюкоамилазы А. епуатоп 466

Температура, °С рН Дж-град"1 -моль1

30-60 3,0 203,24

60-70 3,0 1008,84

30-60 4,0 128,96

60-70 4,0 952,54

30-60 4,5 82,48

60-70 4,5 986,21

30-60 5,0 127,86

60-70 5,0 1049,62

30-60 6,0 307,79

60-70 6,0 720,74

Кислотную инактивацию иммобилизованного фермента проводили при температуре 65 °С в интервале рН 3,0 - 7,0. Наименьшая потеря активности для всех сорбентов находится в интервале рН 4,0 - 5,0. Для фермента, иммобилизованного па носителе Стиросорб МХДЭ-100 гфи температуре 65 "С и рН 4,0; 5,0; 6,0 после 3 ч инкубации остаточная активность составила 75,4; 76,8 и 54,3 % соответственно.

В табл. 6 приведены данные кинетики инактивации свободной и иммобилизованной глюкоамилаз А. тнлпоп 466.

При кислотной инактивации максимальную стабильность наблюдали для глюкоамилазы, иммобилизованной на носителе Стиросорб МХДЭ-100,

При иммобилизации фермента изменяется его рН стабильность за счет следующих факторов: 1) изменение микроокружсиим фермента при его иммобилизации; 2) изменение конформации фермента при иммобилизации, вызванное взаимодействием с носителем; 3) увеличенне жесткости белковой глобулы, препятствующее ее денатурации, разворачиванию и тем самым ипактивации, в результате многоточечного взаимодействия белка с поверхностью носителя.

Таблица 6

Копстапты инактивации (К- К)2, ч1) свободной и иммобилизованной _________ пдокоамилзз при температуре 65 °С_

Глюкоамилаза

рН Время, Сво- Иммобилтованная на сорбентах

ч бодная Стиро- СОрб АНКБ-35 КБ-4 АН-251 АБ-17 А1ПСБ-2

1 36,10 15,19 23,17 13,60 26,23 37,59 24,57

4,0 2 30,90 12,33 19,69 14,75 31,18 30,50 19,37

3 24,20 9,40 17,11 15,15 26,35 24,07 16,53

1 14,60 13,87 16,76 17,93 62,97 30,09 19,51

5,0 2 15,40 11,00 15,64 16,14 40,87 24,53 15,84

3 16,30 8,78 14,11 15,74 30,66 21,71 14,10

1 299,00 30,30 48,96 29,82 77,91 61,48 39,18

6,0 2 - 24,57 43,53 3231 56,98 56,36 28,02

3 - 20,37 37,74 33,53 46,00 51,68 21,97

Исследование кислотной и термической инактивации свободной и иммобилизованной глюкоамилаз А. смсстоп 466 показало высокую кислотную и термическую стабильность иммобилизованной формы.

ИДЕНТИФИКАЦИЯ ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ГРУПП АКТИВНОГО ЦЕНТРА ГШОКОАМИЛАЗЫ А. АШАМОШ 466

Идентификация функциональных трупп является важным подходом в исследовании механизма действия фсрмсптов. Чтобы идентифицировать функциональные труппы, входящие в активный цешр фермента, мы истоль-зовали несколько независимых экспериментальных критериев. Это дало возможность сделать достаточно убедительное заключение о химической природе трупп, участвующих в акте катализа.

С этой целью были определены величины рК трупп, рассчитаны их теплоты ионизации, а также фермент был подвергнут фотоокисленгао.

Величины рК определили но кинетической зависимости активности фермента от рН (рис. 5). Профиль кривой характерен для кривой диссоциации ионных групп аминокислот и свидетельствует об участии в элементном акте разрыва а - 1,4 а - 1,6 - гликозидиых связей в молекуле крахмала двух

(11У1ШШПИЯТП.ТШУ ГПУПП

Были определены рК} и рК2; для восходящей и нисходящей ветвей кривой; они оказались равными рКт = 2,5, рК2 = 6,2. Эти величины свидетельствуют о том, что в формировании активного цешра фермента участвуют карбоксильная группа либо гаутаминовой, либо асоарапшовой, либо какой-то другой С- концевой аминокислспы и имидазольиая группа гистидина.

Наличие в активном центре глюкоамилазы карбоксильной и имидазоль-ной групп подтверждают найденные нами величины теплоты ионизации этих групп Рассчитанная го уравнению Ванг-Гоффа теплота ионизации функциональных групп оказалась равна для восходящей ветви кривой - 7,6 кДж/моль и для нисходящей - 26,7 кДж/моль, что соответствует теплотам ионизации карбоксильной и имвдазолыгой групп.

Типичной реакцией иа имцдазольную груш1у гистидина является фотоокисление в присутствии метилеювого синего, играющего роль фотосенсибилизатора. Глюкоамилаза подвергалась интенсивной фотоинактивации, которая описывается уравнением реакции первого порядка. На рис. 6 представлена зависимость константа скорости инактивации от рН [К = 1'(рН)].

V пшх 100 80 60 40 20 0

У та

2

Г \

/ N \

г \ Ч 1

14, 2

рК, рК2 р1

2,3 2,5 3 4 4,5 5 6 6,5

Рис. 5. Зависимость V ^ /(/>//) при температуре, "С: 1 — 5; 2 —60; скорость реакции, % от максимальной.

К,ч 2 1,5 1

0,5 О

4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 рН<

Рно. <>. Зависимость К = '(рН) при фото-окислепни глюкоамилазы А. акатоп 466 при температуре: 20 °С - 1, 40 °С -

2.

Кривая этой зависимости имеет 5-образную форму. Прямая, проведенная параллельно оси абсцисс на расстоянии от нее, равном Ко/2, дает точку пересечения с кривой, соответствующую рК2 = 5,7 для температуры 20 °С и рК'г = 5,9 для температуры 40 °С. Данные значения величин соответствуют рК имидазолыюй группы гистидина.

ПРИМЕНЕНИЕ ФЕРМЕНТНОГО ПРЕПАРАТА СВОБОДНОЙ И ИММОБИЛИЗОВАННОЙ ГШОКОАМИЛАЗ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЫХ ИЗДЕЛИЙ

Разработан улучшигель комплексный хлебопекарный (УКХ), в качестве активной части которого использовали высокоактивный препарат глюкоамилазы, проявляющий максимальную активность при рН 5,0 и температуре 65 "С.

Выбор комшненшого состава УКХ помимо ферментного препарата и наполнителя в ввде марковш-паточшго порошкообразного полуфабриката основывался на принципах: доступности, положительному влиянию (на структуру теста и качество хлеба), безвредности. Таким образом, проведенная серия экспериментов позволила определить активную часть комплексного улучшигеля: ферментный препарат глюкоамилазы - 4,5 %, фосфорнокислый аммоний - 5 %, аскорбиновая кислота - 0,5 %, морковпо-паточпый порошкообразный полуфабрикат - 90 %.

Анализ экспериментальных данных показал интесификациго основных биохимических процессов ери внесении в тесто (3 % по массе муки) разработанного УКХ Помимо активации жизнедеятельности микрофлоры в процессе брожения теста, обусловливающее повышение пористости и кислотности, внесение комплексного улучшигеля способствует улучшению структуры пористости. В свою очередь глюкоамилаза, не только создает благоприятные условия для дрожжевых клеток, но и способствует накоплению глюкозы, вступающей в реакцию мелановдинообразования и улучшающей цвет корки.

Были проведены исследования по применению иммобилизованной глюкоамилазы с использованием заварки. Процесс пиролиза крахмала с помощью иммобилизованной глюкоамилазы шучался в непрерывных условиях -на колонке.

В отличии от традиционных (92 ±3°С) были изменены температурные режимы процесса (60 ± 5 °С), что снимает необходимость дня охлаждения заварки и позволяет осуществлять осахаривапие в непрерывном режиме.

При осахаривапии предложенным способом дозировка заварки составляет 35 % к массе среды, а редуцирующие вещества — 4,93 — 5,50 %, что выше традиционного (3,6 - 4,8 %).

Таким образом, применение иммобилизованной глюкоамилазы может быть рекомендовано на стадии приготовления заварки в производстве хлеба из ржаной муки и ее смеси с пшеничной.

выводы

1. Из микромииртов рода Аярег&Иш иШаориз наиболее активным продуцентом глюкоамилазы является АврегфИш т/стоп 4662. С использованием математического метода планирования эксперимента, разработаны рациональные условия эффективного биосинтеза глю-коамилазы при твердофазном культивировании мшромицега: температура культивирования - 32 °С; продолжительность биосинтеза - 72 ч; влажность питательной среды - 65 %; крахмалистость отрубей - 19 %.

3. Получен высокоактивный препарат глгокоамилазы. Максимальная глюко амилаз ная активность проявляется при рН 5,0 и температуре 65 °С. С помощью методов ультрафильтрации, осаждения, фракционирования, гель-фильтрации получен высокоочищенный препарат глюкоамилазы с удельной активностью 690 сд/мг белка и степенью очистки 93,5. Молекулярная масса фермента 48 кДа.

4. Сорбет Стиросорб МХДЭ-100 обладает высокой сорбциогшой спо-еобиостыо иммобилизации глюкоамилазы. При этом практически полностью сохраняет ся гаюкоамшазная активность и она составляет 2817 ед/г сорбента.

5. Практически полная иммобилизация осуществляется в течение 6 ч, при значении рН 5,0, температуре 20 °С.

6. Температурный оптимум действия иммобилизованной глюкоамилазы лежит в пределах 65 - 72 °С, рН-оптимум в интервале 4,0 - 5,0, что позволяет расширить диапазон действия иммобилизованной формы по сравнению со свободной.

7. Выявлена возможность многократного использования иммобилизованной глюкоамилазы: 20 оборотов замены субстрата привело к потере 50 % активности иммобилизованного фермента егг исходной.

8. Профиль К}>ивой активность глюкоамилазы - рН, величины рК ионо-генпых групп, фоговтакгавацвя фермента в присутствии метилепового синего, зависимость ковланш скорости фотоинактивации от рН дают основание считать, что в активный цеягр фермента входит система карбоксилат - ими-дазолий.

9. Установлено, что инактивация фермента описывается уравнением реакции первого порядка. Расчет термодинамических параметров активированного комплекса позволил предположить, что в формировании белковой глобулы фермента важную роль играют гидрофобные взаимодействия. Гшоко амилаза А. сматоп 466 имеет достаточно высокую кжлотную и термическую стабильность. Стабильность иммобилизованного фермента на порядок выше, чем нативного.

10. Проведенные исследования глюкоамилазы как в свободной, так и б иммобилизованной формах показали целесообразность применения ферментного препарата цри гидролизе крахмала.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Яковлев Л.Н., Руадзе И.Д., Григоров B.C., Слепокурова ЮН. Биосинтез амилаз термотолерашиым микро минетом Asp. awamori ВУД Т-2 на средах с различными источниками азотного и углеродного пигапия.- Хранение и переработка ссльхозсырья, 1999.- № 3,- С. 52 - 53.

2. Григоров B.C., Руадзе И.Д., Слепокурова Ю.И., Яковлев Л.IL Глюкоа-милаза Aspergillus awamori 466. Препаративное получение.- Биотехнология, 1999,-№4.- С. 45 - 48.

3. Жеребцов ILA., Руадзе И.Д, Слепокурова Ю.И. О фотоокислении фермента глюкоамилазы Aspergillus awamori 466 / Тезисы докладов XXXVII отчетной научной конференции за 1998 г.- Воронеж.- часть I,- 1999.- С. 21 - 22.

4. Жеребцов H.A., Руадзе И.Д., Слеткурова Ю.И. Иммобилизация глю-коамилаз (Тезисы докладов XXXVII отчетной тучной конференции за 1998 г.-Воронеж,- часть I.- 1999.- С. 22 - 23.

5. Жеребцов НА, Руадзе И.Д., Слепокурова Ю.И., Яковлев АЛ Фотоокисление глюкоамилазы ю микромицгта Aspergillus awamori 466 ( Тезисы докладов междупародпой научной конференции «Продовольственная безопасность России. Качество продуктов питания - 99», Воронеж 1999 (ВГАУ).-С. 129.

6. Жеребцов H.A., Яковлев А.Н, Руадзе И.Д., Слепокурова Ю.И. Получение ферментного препарата амилаз из микромицетов рода Aspergillus / Тезисы докладов международной научной конференции «Продовольственная безопасность России. Качество продуктов питания - 99», Воронеж 1999 (ВГАУ).- С. 130.

7. Руадзе И. Д., Яковлев А.Н., Слепокурова Ю.И. Перспективы получения комплексного препарата амилаз из Asp. awamori ВУД Т-2 для использования в переработке крахмал »содержащего сырья / Тезисы докладов международной научно-технической конференции «Техника и технология пищевых производств», Могилев, Республика Беларусь, 25 - 27 марта 1998.- С. 70.

8. Слепокурова Ю.И., Руадзе И.Д. Выбор оптимальных параметров для биосинтеза глюкоамилазы минромицетом A. awamori 466 / Тезисы докладов XXXVI отчетной научной конференции за 1997 г. Воронеж.- часть 2,- 1998,-С. 60.

9. Руадзе И.Д., Жеребцов НА., Стоянова О.Ф., Шкугина И.В., Селеменев В.Ф., Слепокурова Ю.И. Иммобилизация ферментного цретарата глюкоамилазы из Aspergillus awamori 466 и некоторые свойства.- {Принята к печати в «Прикладную биохимию и микробиологию»].

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Слепокурова, Юлия Ивановна

Введение

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Илочники глкжоамишзы

1.2. Влияние некоторых факторов на биосинтез глкжоамишзы

1.3. Вьщелшие и очистка препаратов глкжоамишзы

1.4. Иммобилизация ферментов 15 1.4.1. Оюсобы и носители для иммобилизации ферментов 15 1.4.2 Иммобшжзованнью глкжоамишзы

1.5. Физико-химические свойства свободной и иммобилизованной глкжоамилсаз

1.5.1. Свойства нативной глкжоамишзы 20 1.5.2 Влияние иммобилизации на физико-химические свойства глкжоамишзы

1.6. ^пользование свободной и иммобилизованной глкжоамишз

Введение Диссертация по биологии, на тему "Глюкоамилаза Aspergillus awamori 466"

Актуальность работы Ферменты играют большую роль в технологии пищевых продуктов. В основе производства любого продукта лзжат либо биохимические, либо физико-химические процессы, либо эти процессы тесно взаимосвязаны Режимы хранения сырья, его качество и выход продукта определяются действием ферментов.

В энзимооюгии открытыми остаются вопросы, касающиеся необычайно высокой активности и специфичности действия ферментов, актуальными являются исследования биосинтеза, физико-химических свойств, механизма действия ферментов.

В настоящее время в связи с развитием биотехнологии представляет значительный интерес иммобилизация ферментов, сущность которой заключается в присоединении к инертной, нерастворимой полимерной матрице.

С этой точки зрения особый интерес представляет гидролитический фермент, глкжоамилаза (а-1,4:1,61шкжан-4,б-глкжогидролаза, КФ 3.2.1.3) - эк-зофермент, который осуществляет гидролиз в крахмале и олигосахаридах а-1,4- и а-1,6- глкжозидных связей. Использование ферментных препаратов глкжоамилазы в биотехнологии связано с подбором эффективных продуцентов фермента В решении данного вопроса перспективными являются микро-мицеты рода АБрег^Ит, которые обладают высокой биосинтешческой активностью и продуцируют экзогенную глкжоамилазу.

Настоящая работа выполнялась в соответствии с тематикой научных исследований кафедры микробиологии и биохимии Воронежской гскударствен-ной технологической академии по проблеме "Изыскание оптимальных условий микробного биосинтеза ферментов и исследование их фнзико - химических свойств". Данная проблема включена в координационный план РАН по программе "Микробиогогический синтез и научные основы микробиолэгического получения практически ценных веществ".

Шль и задачи исследования ль работы - выделение вькхжоспецифинного продуцента глкжоамилазы, получение активного ферментного препарата, иммобилизация и исследование физико-химических свойств свободной и иммобилизованной пжжоами-лаз.

Изсодя из цели были поставлены следующие задачи:

• отбор активного продуцента глкжоамишзы среди микромицегов;

• исследование условий биосинтеза глкжоамилазы и рационального режима культивирования продуцента;

• разработка эффективного метода выделения и очистки пжжоамшшы из экстракта при поверхностном культивировании продуцента;

• подбор оптимального метода и рациональных носителей для получения иммобилизованного фермента глюкоамилвзы;

• определение оптимальных условий для иммобилизации глкжоамишзы;

• выявление характера взаимодействия глкжоамилазы с функциональными группами носитежй,

• исследование некоторых физико-химических свойств свободной и иммобилизованной глкжоамилзз: рН- и температурного оптимума действия, рН - и термостабильносш фермента;

• идентификация функциональных групп активного центра глкжоамилазы;

• практическое использование препаратов нашвной и иммобилизованной глкжоамилазы

Научная новизна

Отобран микромицет Аярег&Ыз сматоп. 466 осущесгвлякхций эффективный биосинтез глкжоамилазы ГЪдобраны рациональные условия биосинтеза для поверхностного культивирования микромицета 7

Разработан способ получения препарата глкжоамилазы и предложена схема его очистки.

Наследована сорбционная иммобилизация глкжоамилазы на носителях различного типа Выявжиа возможность многократного использования иммобилизованной глкжоамилазы Показано использование ИЬС- спектроскопии для изучения процесса иммобилизации

Найдеяь1 оптамалшью рН и температура действия нативного и иммобилизованного ферментов. Ихждован процесс термической и кислотной инактивации для нативного и иммобилизованного ферментного препаратов глю-коамилазы

Показана целесообразность применения ферментного препарата как в свободной, так и в иммобилизованной форме в производстве некоторых хлебобулочных изделий.

Практическая значимость работы

Получен иммобилизованный ферментный препарат глкжоамилазы из Азрег^йш ашгтоп 466. Разработан комплексный улучшитесь для хлебобулочных изделий на основе ферментного препарата глкжоамилвзы, который прошел апробацию в АООТ «Хлебозавод № 2» г. Воронежа Предложена технологическая схема, по использованию иммобилизованной глкжоамилазы

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Слепокурова, Юлия Ивановна

выводы

1. Из микромгщетов рода Азрег&Иш и Шторгиз наиболее активным продуцентом глюкоамилззы является ^рег^гНш атзтоп 466.

2. С использованием математического шинирования эксперимента, разработаны рациональные условия эффекшвного биосинтеза глюкоамилззы при твердофазном культивировании микромицета: температура культивирования — 32 °С; продолжительность биосинтеза -72 ч; влажность питательной среды — 65 %: крахмалистость отрубей - 19 %.

3. Получен высокоактивный техническг-ш препарат глюкоамилззы Максимальная глюкоаштлазная активность проявляется при рН 5,0 и температуре 65 °С. С помощью методов ультрафильтрашш, осаждения, фракционирования, гельфильтрации получен вьюокоочищенный препарат глюкоамилазы с удельной активностью 690 едмг белка и степенью очистки 93,5. Молекулярная масса фермента 48 кДа

4. Сорбент Сшросорб МХДЭ-100 обладает высокой сорбционной способностью иммобилизации глюкоамилззы. При этом практически полностью сохраняется глюкоамнтазная активность и она составляет 2817 ед/'г сорбента

5. Практически полная иммобилизация осуществляется в течение 6 ч, при значении рН5,0, температуре 20 °С.

6. Температурный оптимум действия иммобилизованной глюкоамилазы лежит в пределах 65 - 72 °С, рНютимум в интервале 4,0 - 5,0, что позволяет расширить диапазон действия иммобилизованной формы по сравнению со свободной.

7. Выявлена возможность многократного использования иммобилизованной глюкоамилазы 20 оборотов замены субстрата привело к потере 50 % активности иммобилизованного фермента от исходной.

8. Профиль кривой активность глкжоамшвзы - рН, величина рК ионо-генных групп, фотоинакшвация фермента в присутствии мешленового синего, зависимость константы скорости фотоинактивации от рН дают основание счи

137 тать, что в акшвный центр фермента входит система кнрбоксилат - имидазо-жш.

9. Установлено, что инактивация фермента описывается уравнением реакции первого порядка. Расчет термодинамических параметров активированного комплекса позволил предположить, что в формировании белковой глобулы фермента важную роль играют гидрофобные взаимодействия. Глюкоа-милаза А амншоп 466 имеет достаточно высокую кислотную и термическую стабильность. Стабильность иммобилизованного фермента на порядок выше.

10. Проведенные исследования глкжоамилазы как в свободной, так и в иммобилизованной формах показали целесообразность применения ферментного препарата в производстве хлебобулочных изделий.

138

6.4. Заключение

Исследование кислотной и термической инактивации нативной и иммобилизованной глюкоамилазы А. ашгтоп 466 показало высокую кислотную и термическую стабильность иммобилизованной глюкоамилазы.

Полученные данные расчетов термодинамических характеристик процесса инактивации фермента дали представление о протекании этого процесса, позволили предположить, что в формировании белковой глобулы глюкоамилазы важную роль играют гидрофобные взаимодействия

Профиль кривой активности глюкоамилазы - рЦ величины рК расчет теплоты ионизации, фотоинактивация позволили предположить, что в активный центр глюкоамилазы входят карбоксильная и имидазольная группы

Установлено, что иммобилизация глюкоамилазы сорбционным способом приводит к повышению стабильности Глкжоамилаза иммобилизованная на сорбентах Стиросорб МХДЗ-100, КБ-4 и АМКБ-35 показала более высокую стабильность к концентрации ионов РГ при кислотной инактивации.

118

Рис. 6. 10. Зависимость К = ЯрН) при фотоокислении глкжоамишзы А а\штоп 466 при температуре: 20 °С - 1, 40 °С - 2.

ГЛАВА 7. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ СВОЮДНЭЙ И

ИММОБИЛШОВАННЭЙ ГЛЮКОАМИЛАЗ В ПРОИЗВОДСТВЕ ХЛЕБОБУЛОЧНЬГХ ИЗДЕЛИЙ

Существенную роль в технологии хлеба играют ферменты, пивным образом амилазы и протеазы, влияющие на протекание биохимических и микробиологических процессов, при брожении теста Введение амилаз в количестве 0,02-0,04 % к массе муки способствует накоплению в тесте сбраживаемых углеводов вследствие гидролиза крахмала, что в конечном итоге обусловливает получение изделий с более ярко окрашенной коркой и более ароматных. Под действием амилаз накапливаются декстрины, что положительно сказывается на сохранении свежести изделий, повышается скорость брожения и увеличивается количество сахара в выпекаемом хлебе [3, 60].

7.1. Е^лбор компонентного состава комплексного улучшителя

В качестве активной части комплексного хлебопекарного улучшителя был использован высокоактивный технический препарат глюкоамилазы Его максимальная глкжоамишзная акшвность проявляется при рН 5,0 и температуре 65 °С Была выполнена предварительная серия опытов по определению эффективности действия препарата на ржаное, пшеничное тесто и заварку из ржаной муки. В тесто вводили ферментный препарат из расчета 8 единиц фермента на 1 г крахмащ, гидролиз крахмала осуществляли при 30-32 °С; отбор проб для определения редуцирующих Сахаров проводили через каждые 60 мин. Заварку готовили при соотношении муки ржаной обдирной и воды в массовых долях 1:2,5. Затем ее охлаждали до температуры 40-50 °С; вводили ферментный препарат из расчета 8 единиц фермента на 1 г крахмала Отбор проб проводили через каждые 60 мин

Результаты исследований в виде зависимостей накопления редуцирующих веществ от продолжительности процесса представлены на рис. 7.1. Максимальное накопление ред\адрукшшх веществ наблюдается в заварке из ржа

Рис. 7.1. Динамика накопления редуцирующих веществ под действием глкжоамишзы в: 1 — тесте из пшеничной муки; 2 — тесте из ржаной обдирной муки; 3 - завфке из ржаной обдирной муки 4 - контроль для ржаной муки, 5 - контроль дня пшеничной муки. С - содержание редуцирующих веществ, мг/г муки; х - продолжительность воздействия глюкоамилазы, мин ной обдирной муки - это результат предварительной обработки водой с температурой 94 ± 2 °С. Ь&именыдее накопление продуктов гидролиза крахмала, свидетельствует о целесообразности разработки комплексного улучшителя для изделия из пшеничной муки. йппа дальнейшая работа была основана на методических подходах к формированию состава комплексного улучшителя, принятых на фирме Ей. группы Кэрри-Великобритания [91].

Е^юранное направление использования комплексного улучшителя в производстве изделий из пшеничной муки обусловило состав комплексного улучшителя. Анализ источников научно-технической литературы по этому вопросу [89] показывает, что чаще всего помимо ферментных препаратов, это минеральные добавки, поверхностно-активные вещества, утучшители окислительного и восстановительного действия. Особенностью таких улучшителей является применение определенных сочетаний микроингредиентов различного принципа действия в оптимальных количествах, стабилизаторов и наполнителей.

ЕЬюор компонентного состава комплексного улучшителя (помимо ферментного препарата и наполнителя в виде морковно-паточного порошкообразного полуфабриката) основывался на принципах: доступности (как по стоимости, так и по существованию отечественного производства этого компонента), положительному влиянию ( или на структуру теста и качество хлеба, или на жизнедеятельность микрофлоры), безвредности (с точки зрения влияния на организм человека). Кроме того, были учтены известные исследования в этом направлении, а также рекомендации представителей французской фирма «Б. 1.Ьеза1&е».

В исследованиях были приняты следующие соли: фосфат кальция в дозировке 0,15 % к массе муки; фосфорнокислый аммоний - 0,15 %; сернокислый аммоний - 0,3 %; сернокислый магний - 0,55 %; хлористый калий - 0,55 %; сернокислое железо- 0,01 °/о. При выборе дозировок 'солей помимо рекомендаций [89], учитывали их оптимальное содержание для активной жизнедеятельносш дрожжевых клеток [3]. Однако в этой серии интересовало влияние выбранных минеральных солей на активность фермента

Замешивали тесто из муки, воды, раствора минеральной соли и ферментного препарата Термосташровали при 28-30 С. Через каждые 60 мин отбирали пробы теста, в которых определяли содержание глюкозы Параллельно анализировали контроль (без минеральных солей).

Результаты исследований представлены на рис. 7.2.

Анаше полученных - зависимостей показывает, что максимально положительное влияние на активность глкжоамилазы оказывает фосфорнокислый аммоний. Следует учесть миш^мальную (по сравнению с другими солями за исключением сернокислого железа) дозировку этой минеральной добавки 0,15 % к массе муки.

Фосфорнокислый аммоний известен как минеральная добавка в питательную среду при выращивании дрожжей Батагоптусез сегеуша [60], поэтому в случае ее введения в состав комплексного улучшителя можно ожидать его положительное влияние на жизнедеятельность дрожжей

В литературе встречаются сведения об отрицательном влиянии фосфорнокислого аммония на активность глкжоамилазы (снижение до-30-33 %) [90]. Однако в приведенном источнике нет достаточно полного описания самого ферментного препарата (продуцента, степени и способа очистки) и условий проведения эксперимента В связи с чем, сопоставить полученные результаты не представляется возможным.

Во внимание были приняты результаты наших исследований -фосфорнокислый аммоний введен в состав комплексного улучшителя.

Следукжцими компонентами комплексного улучшителя были выбраны окислители. К ним относятся аскорбиновая кислота, азодикарбонамид, перекись бромбеязоида, пероксид кальция, а в отдельных странах иодаты калия и кальция. Природы таких окислителей разная, неодинаковы их реакции взаимодействия с компонентами муки [90]. Однако, их объединяет конечный результат - улучшение структуры теста (белкового каркаса), особенно, если испольо

60

120

180

Рис. 7.2. Влияние различных солей на образование редуцирующих веществ: 1 - фосфат калия; 2 - фосфорнокислый аммоний; 3 -сернокислый аммоний; 4 - сульфат магния; 5 - хлорид калия; 6 - сернокислое железо; 7 - контроль. С - содержание редуцирующих веществ в тесте из пшеничной муки первого сорта, мг/г муки. зуется мука второй и третьей группы (слабая) по качеству клейковины Анализ разрешенных к применению в производстве хлебобулочных изделий окислителей показал, что наиболее доступным из них является аскорбиновая кислота Предпочтение этому компоненту отдано и с точки зрения возрастающего внимания к безвредным пищевым добавкам.

В серии экспериментов замеливали тесто из муки и воды с внесением предварительно растворенных фермента, фосфорнокислого аммония, минимального и максимального из рекомендуемых количеств аскорбиновой кислоты (0,01 и 0,005 % к массе муки). Контрольный образец готовили без окислителя. Тесто термосташровали при 28-30 °С. Каждые 60 мин отбирали пробы для определения содержания -в них, глюкозы Результаты эксперимента представлены на рис. 7.3. Графическая интерпретация полученных результатов позволяет выбрать в качестве компонента комплексного улучшителя аскорбиновую кислоту в дозировке 0,01 % к массе муки.

К сожалению, в работе не проведены исследования, по влиянию поверхностно-активных веществ на основную функциональную составляющую комплексного улучшителя, что связано с недоступностью компонентов этой направленности.

Таким образом, проведенная серия экспериментов позволила определить активную часть комплексного улучшителя: ферментный препарат глю-коамилаз, фосфорнокислый аммоний, аскорбиновая кислота В качестве наполнителя выбран морковно-паточный порошкообразный полуфабрикат. При этом доля активной части составляет 10% от массы комплексного улучпдггеля. Окончательный состав комплексного улучшителя в массовых долях: фермент глюкоамилазы- 4,5 %; фосфорнокислый аммоний - 5 %; аскорбиновая кислота - 0,5 %;

Морковно-паточный порошкообразный полуфабрикат - 90 %. С мг/r 108,7

78,7

48,7

0 60 120 ' 180

Рис. 7.3. Влияние различной дозировки аскорбиновой кислоты на образование редуцирующих веществ: 1 - аскорбиновая кислота (дозировка 0,01); 2 - аскорбиновая кислота (дозировка 0,0075) + фосфорнокислый аммоний; 3 - аскорбиновая кислота (дозировка. 0,005); 4 - контроль. С - содержание редуцирующих веществ в тесте го муки пшеничной первого сорта, мг/г муки.

7.2. Апробация комплексного у^чшигеля в лабораторных условиях

Для определения эффекптности действия разработанного улучшителя были исследованы процессы газообразования и кислотонакопления в тесте, а также определены качественные показатели готовых изделий. В серии экспериментов за основу была принята рецептура хлеба белого из пшеничной муки первого сорта Для сравнения параллельно готовили образца текста с внесением УКХ Амилокс-1 (Россия) и Волюмикс (Чехия). й>юор именно этих улуч-шителей основан на близких к нашим рекомендациям по использованию общих сведений о составе и- реальных с точки зрения практического использования ценах.

ГЬ сведению фирм производителей в состав АмилоксаЛ входят, аскорбиновая кислота, ферментные препараты амилолитического действия, соли аммония и натрия или кальция фосфорнокислые, наполнитель -пшеничная, соевая мука и крахмал В состав Волюмикса - пшеничная мука, солодовая мука, сухая сыворотка, аскорбиновая кислота, эмульгатор Е471. Рецептура образцов теста и параметры их приготовления приведены в табл. 7.1.

Результаты по газообразованиям и кислотонакоплению в образцах теста с различными УКХ представлены на рис. 7.4. и 7.5.

Анаше экспериментальных данных показывает интенсифбжацию основных биохимических процессов при внесении в тесто разработанного УКХ (Глюкоамилокс). Это можно связать как с накоплением продуктов гидролиза крахмала непосредственно: усвояемых дрожжевой и кислотообразующей микрофлорой, в отличие от известных УКХ, в состав которых входят амилаза Так и с активизацией жизнедеятельности микрофлоры при внесении азота и фосфора в виде фосфорнокислого аммония.

Рецептура и параметры приготовления теста

Сырье и технологические параметры приготовления Мука,кг Расход сырья и параметры приготовления теста с кошьйжсным улучшителем

Амилокс-1 0,7 Волюмикс 0,7 Глюкоамилокс 0,7

Дрожжи, кг 0,014 0,014 0,014

Соль пищевая, кг 0,0091 0,0091 0,0091

Кислотность теста конечная, не более, град 3,2 3,2 3 ">

Продолжительность брожения, мин 120-150

Температура начальная,^ 30-32

Результаты анализа полуфабрикатов полностью коррелировали с качественными характеристиками готовых изделий, полученных в лабораторных условиях (табл 7.2.).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Слепокурова, Юлия Ивановна, Воронеж

1. Адамсон А Физическая химия поверхностей.- М: Мир,- 1979,- 566 с.

2. Алешин АЕ, Голубев AM, Фирсов JIM Кристаллическая структура глюкоамилазы из A awamon X 100 //Молекулярная биология.- 1993.-Вып. 267,- №2,- С. 8-12.

3. Ауэрман ЛЯ. Технология хлебопекарного производства- Vi: Легкая и пищ. пром-сть.-1984,- 414 с.

4. Бекер ME Биотехнология микробного синтеза- Рига: Зинатне.- 1980.287 с.

5. Беккер З.Э. Физиология грибов и их практическое использование.- М: МГУ,- 1963,- 269 с.

6. Белозерский АП, Проскуряков МИ Практическое руководство по биохимии растений,- М: Советская наука-1951.- С. 37- 108.

7. Бенедицкий КМ, Яровенко В.Л Кинетика ферментативного гидролиза крахмала//Ферментная и спиртовая промышленность.- 1975.- № б.- С 39 -42.

8. Березин ИВ. Исследования в области ферментативного катализа и инженерной энзимологии.- М: Наука- 1990,- 384 с.

9. Березин ИВ., Мартинек К Основы физической химии ферментативного катализа-М: 1977.-280 с.

10. Биотехнология/Под ред. НС. Егорова, В. Д. Самушюва Инженерная эн-зимолошя. Т. 8.- М: Высшая школа-1987,- 144 с.

11. П.Бояринов А И, Кафаров В. В. Методы оптимизации в химической техно-логин.- М: Химия.- 1975.- 576 с.

12. Брухман Э.Э. Прикладная биохимия.- М: Легкая и пищ пром-сть.- 1981,-С. 113-121.

13. Буник В. И, Гамазкова B.C. О функциональной роле гистидиновых остатков а-кетоглутаратдегащрогеназы //Биохимия,- 1987.- Т. 52.- № 8.- С. 1235.

14. Введение в прикладную энзимолошю /Под рея. И В. Березина и К . Мар-тинека- М: Изд-во MГУ.- 1982- 384 с.

15. Вирник АД, Кильдеева HP., Красовская С.Б. Иммобилизация ферментов в структуре волокон и пленок в процессе их формирования //Биотехнология.- 1987,- Т. 3.- №5,- С. 602-610.

16. Войно ЛИ Образование амилолитических и протеолитических ферментов при поверхностном и глубинном культивировании.: Автореф. канд. дисс,- М- 1970,- 29 с.

17. Галич ИП Амилазымикроорганизмов.- Киев: Наука думка- 1987,- С. 160 -162

18. Галич ИП Хроматографическое исследование высокоочищенных препаратоь микробных а-амилаз и некоторых других глобулярных белков: Автореф. канд. диссер.- Киев.: Укр НИИНГИ- 1968,- 29с.

19. Грачев Ю.П Математические методы планирования экспериментов.- М: Пищевая пром-сгь- 1979.- 192 с.

20. Грачева ИМ Технология ферментных препаратов,- М: Пищевая пром-сгь,- 1975,- 392 с.

21. Грачева ИМ, Гернет MB. Пути синтеза и регуляции образования глюкоами."взы выделение и очистка ее,- В сб.: Микробиология.- М: Итоги науки и техники ВИНИТИ АН СССР.- 1978,- Т. 9.- С. 148 156.

22. Григорьев А И, Пруткова НМ, Митрофанова H Д. Исследование средних иминодиапетатов некоторых металлов методом инфракрасной спектроскопии //Докл АНСССР,- 1973,- Т. 161.- № 4.- С. 839 842.

23. Двадцатова Е.А Селекция и физиология питания Asp. oiyzae 3-9-15: Автореф. канд. дисс,- М: Ин-т микробиологии АН СССР.- 1961,- 32 с.

24. Двадцатова Е.А, Комарова Г. И, Воронцова H H Штамм Aspeigillus awamori Т-1-464 продуцент глкжоамилазы, используемой для осахарива-ния крахмалистого сырья: Ас. 753897 СССР//Б.И 1980.- №29.- с. 123.

25. Деникина Е.К. №кпюдов АД, Логинова Т.А Изучение и свойства иммобилизованного ферментного препарата с пептид азной активностью //Прикд биохимия и микробиология,- 1985,- Выл 2,- С. 177- 183.

26. Детерман Г. Гель-хроматография. М: Мир.- 1970,- 352 с.

27. Джиловян Л. Р., Лосякова Л С., Москвичева Э.П Подбор питательной среды для получения глюкоамилазы //Ферментная и спиртовая пром-сть.-1985.- Вып. 5.-С. 26-29.

28. Диксон М, Уэбб Э. Ферменты В 3 т.- М: Мир,- 1982,-1118 с.

29. Дикчювене А А, ГЪслякас ИИ, Дагене М.Н, Пауожжонас А Б. Определение количества белка, иммобилизованного на нерастворимом носителе //Методы биохимии /Матер. По II биохим. Съезду Лит. ССР,- Вильнюс: Главмикробиопром. 1976.- С. 5 - 9.

30. Добролинская Г.М Глюкоамилаза плесневого гриба A. awamori: Дис. канд. биолог, наук- М- 1961.

31. Дурмиппшзе СВ., Квеситадзе Г.И, КЪконашвили Г.Н Глюкоамилаза A awamori //Доклады АН СССР.- 1974.- Т. 217.- № 2,- С. 470.

32. Дятлова ИМ, Темкина В. Я., Попов К И Комплексы и комплексонаты металлов,- М: Хямия,- 1988,- 544 с.

33. Жакоб Ф., Моно Ж. Регуляция активности генов //Регуляторные механиз-мыклетки- М.: Наука, 1964.- С. 278- 286.

34. Жбанков Р.Г. Инфракрасные спектры и структура углеводов,- Минск: Наука и техника- 1972,- С. 27-43.

35. Жеребцов НА Амилолитические ферменты в пищевой промышленности.- М: Лекая и пищевая прм-стъ.- 1984,- 160 с.

36. Жеребцов НА Фракционирование и очистка ß-амилэзы солода //Приют биохимия и микробиологи,- 1965,- Т. 1.- Вып. 3,- С. 274 277.

37. Жеребцов НА, Корнеева О.С., Фараджева Е.Д. Ферменты Их роль в технологии пищевых продуктов,- Воронеж: Изд-во ВГУ.- 1999,- 120 с.

38. Жеребцов НА, Краюшкина Э.А, Авдеева З.К Исследование кинетики и механизма кислотной инактивации а-амилазы /Лэиохимия,- 1969.- Т. 34.-Вып.4.-С. 752-762.

39. Жеребцов НА, Пащенко Л.П, Житенева Т.Д Выделение и изучение свойств кислотоустойчивой а-амилазы АБр. а\уатоп //Приют биохимия и микробиология,- 1974,- Т. 10.- Вып. 2,- С. 236 241.

40. Жеребцов НА, Руадзе ИД, Яковлев АН О механизме кислотного и ферментативного гидролиза крахмала //Приют биохимия и микробиология,- 1995,- Т. 31,- №6,- С. 599 603.

41. Жеребцов НА. Забелина Л. Ф., Эктова АИ О механизме действия амилаз на глюкозидные связи грахмала //Биохимия.- 1976,- Т. 41.- Вып. 12,- С. 2119-2125.

42. Землянухин А А Малый практикум по биохимии:.- Воронеж Изд-во ВГУ,- 1985,- 128 с.

43. Зиновьева МЕ, Калачева НВ., Гамаюрова В. С. Методы иммобилизации глюкозоизомеразы//Биотехнология,- 1997,- №6,- С. 47-50.

44. Ивановская МГ., Копылов АМ, Останкина В.А Экспериментальные методы исследования белков и нуклеиновых кислэт.- М: Изд-во МГУ,-1985.-С. 46 47.

45. Иммобилизованные ферменты /Под ред. Березина ИВ., Клячко НЛ., Левашова А В.- М: Высшая школа- 1987.- Т. 7.- 159 с.

46. Иммобилизованные ферменты Современное состояние и перспективы /Подред. ИВ. Березина, В.К Антонова, К Мартинека- М: Изд-во МГУ.-1976,-Т. 1.2,-296 е., 358 с.

47. Кадушявичюс В.А, Суцжювене О.Ф., ГЪслякас ИИ Модифицирование неорганических носителей для синтеза биоспецифических сорбентов /УБиоорган. химия.- 1983.- Т. 9,- №8.- С. 1128- 1135.

48. Казанская А, Синявская Н, Кузнецова Л. Применение в хлебопечении новых функциональных добавок и нетрадиционного сырья //Хлебопродукты- 1993,- №3,- С 42-48.

49. Калинченко ЕА, ЛюбишжийГ.В. ¡Измерение глкжоамилазной активности с помощью рН-стата //Приют биохимия и микробиология.- 1992- Т. 28,-№2- С. 304-308.

50. Кафаров В.В., Перов В.Л., Мешалкин В.П Принципы математического моделирования химико-технологических систем,- М: Химия.- 1974,- 344 с.

51. Квеситадзе Г. И Селекция продуцентов и характеристика амилолитиче-ских ферментов грибов рода Азре^Ших. Автореф. докт. Дне,- М: Ин-т биохимии АН СССР,- 1980,- 35 с.

52. Квеситадзе Г.И., Воронцова НН, Гончарова О.Н, КЬридзе В.В., Двадца-това Е. А, Квачадзе Л.Л Экзогенные глюкоамилазы плесневых грибов рода АзкЪ^Шш //Прикладная биохимия и микробиология.- 1981,- Т. 17.-Вьш.4.- С. 569-574.

53. Келети Т. Основы ферментативной кинетики,- М: Мир,- 1990.- 350 с.

54. Кестнер А И ^мобилизованные ферменты //Успехи химии.- 1974.- Т. ХЫИ,- Вып. 8.- С. 1480- 1511.

55. Клочкова Т. А, Чикин Г. А. Смирнов В.Б. Ижиты носители биокатализатора в глюкозном производстве. Применение ионитов в промышленности и аналишческой химии //Тезисы докладов V всесоюзной конференции. -Воронеж.- 1981,- С. 134- 135.

56. Ковалева С. В., Дорожко А И, Коган З.С. Фотоокисление и модификация дютшпшрокарбонатом «биосинтетической» ¿-треониндегадрогеназы из пивных дрожжей Засскаготусес сагЬЬег^етя //Биохимия.- 1984,- Т. 49,-№8,-С. 1253-1261.

57. Ковалева Т. А, Селеменев В.Ф., Плохих АМ и др. Изучение некоторых свойств глюкоамилазы сорбционными и спектральными методами //Теория и практика сорбционных процессов.- Воронеж: ВГУ.- 1985.- № 17.-С. 58-61.

58. Коваленко Г,А, Ванина МП Иммобилизация ферментов на упкродми-неральных носителях. Некоторые закономерности адсорбционной иммобилизации ферментов //Биотехнология,- 1997,- № 4,- С. 3 12.

59. Коваленко Г.А, Соколовский В.Д. Двойная иммобилизация ферментов в неорганических матрицах //Биохимия.- 1987,- Т. 3,- №5,- С. 612 617.

60. КЬзьмина НП Биохимия хлебопечения.- М: Пищ. пром-сть,- 1978,- 278 с.

61. Коконагттили Г.Н Способы очистки и изучения свойств глюкоамилазы и а-амилазы плесневых грибов А. ашгпюп и А. отучает. Дис. Тбилиси Институт биохимии растений АН ГССР,- 1977.

62. Коновалов С.А Биосинтез ферментов микроорганизмами. М: Пищ пром-сть,- 1972,- 270 с.

63. Коршак В.В., Шгильман МИ Полимеры в процессах иммобилизации и модификация природных соединений,- М: Наука- 1984,- 260 с.

64. Котов В.Б., Гошев В.С. Производство и применение ферментных препаратов за рубежом.- М- 1973.- ОНТИТЭИмикробиопром.- 40 с.

65. Кочетов Г. А Практическое руководство по этимологии.- М: Наука -1980,- С 233 246.

66. Кочетов Г.А Тиминовые ферменты- М: Наука- 1978,- 74 с.

67. Крахмал и крахматюпродукты /Под ред. №хапетяна Л.А- М: Агропром-издат,- 1985.- 240 с.

68. Куликова А К. Чичуа В.Г., Церетели А К, Квеситадзе Г. И Очистка внутриклеточной инвертазы ЗассЬагогпусез 1гаш11Б //Приют биохимия и микробиология- 1986,- Т. 22.- №5,- С. 648 651.

69. Кулис Ю.Ю. Аналитические системы на основе иммобилизованных ферментов." Вильнюс: Мокслас.- 1981.- 200 с.

70. Лейднер К Кинетика органических реакций.- М: Мир,- 1966.- 187 с.

71. Ленинджер А Основы биохимии.- М: Мир,- 1985,- Т. 1.- С, 226- 269.

72. Ленинджер А Биохимия- М: Изд-во иностр. лит.- 1979,- 1048 с.

73. Лосева Л.П, Бендианишвили МВ., Шатилов В.Р., Шубин В.В., Крегович В. Л. Роль остатков гистидина к конститутивной НАД(Р>глутаматдегидрогеназе Chlorella pirenoiäosa 82 TЖюхимия.- 1986.- Т. 51.- № 5.-С. 840 849.

74. Макамиси К Инфракрасная спектроскопия и строение органических соединений,- М: Мир.- 1965.- 216 с.

75. Макаров МК, Ласкорин Б.Н, Годцобина В. А Синтез амфотерных ионов на основе поликонденсационных и полимеризационньк анионитов //ИЬнитыиионный обмен,- Л: Наука- 1970,- С. 27-32.

76. Мальцев ПН Технология бродильных производств.- М: Пищ. рпом-сть,-1980.- 560 с.

77. Маршнек К, Березин ИВ. Стабилизация ферментов ключевой фактор при внедрении биокатализа в практику //"Успехи химии.- 1980,- Т. 49.- С. 737 - 770.

78. Матвеева ИВ., Белявская ИГ. Пищевые добавки и хлебопекарные улуч-шители в производстве мучных из дели- М: МГЧПП- 1998,- 250 с.

79. Методы биохимического исследования растений /Под ред. Ермакова А ИЛ: Агропромиздат.- 1987,- 430 с.

80. Можаев В. В. Иммобилизация ферментов как новый подход к решению фундаментальных проблем энзимологии //Успехи биологической химии.-1983,-Т. 24,-С. 99-134.

81. Муронец В. И, Наградова НН Иммобилизованные олигоферменты- М: Hawa- 1984.- 208 с.

82. Неустроева КН, Голубев AM, Фирсов Л.М Влияние ферментативного и химического дегликозилирования на физико-химические свойства глюкоамилазы из Aspergillus awamori //Биохимия,- 1992,- № 4,- С. 12.

83. Неустроева КН, Фирсов ДМ Кислая протеиназа и множественность форм глюкоамилззы из Aspergillus awamori varX- 100 //Биохимия.- 1990.-№5,- С. 9-13.

84. Нечаев А П Пищевые добавки //'Пищевая промышленность. 1996. - № 6. -С. 12-14.

85. Орос Г.КХ Сеяеменев В.Ф., Хохлов В.Ю., Стукалов О.И, Сапожкова АН Механизм сорбции тРНК неионогенным сорбентом //Физическая химия, -1998,- Том 72,- № 5,- С. 926 932.

86. Панкратов АЯ., Антипова Л.В., Щуваева Г.П., Сванидзе СК Биосинтез ферментов грибами рода Ррсопус.- Воронеж: Изд-во ВГУ,-1993,- 184 с.

87. Пащенко Л.П, Зубченко А В., Жеребцов НА Влияние высокоосахарен-ных ферментативных гидролизатов на газообразовании при тестоведении //Изв-я вузов СССР. Пищевая технология,- 1976,- №6,- С. 45 46.

88. Пащенко Л.П, Зубченко А В., Жеребцов НА Применение ферментного препарата из Кг с1е1етаг для приготовления высокоосахаренных гидроли-загов ;/ХШ- 1974,- №2,- С. 16- 18.

89. Плевако ЕА Технология дрожжей.- М: Пищ. пром-стъ.- 1970,- 299 с.

90. Поландова Р. Д. Применение пищевых добавок в хлебопечении //Хлебопечение России- 1996.- № 1,- С. 10 11.

91. Поландова Р.Д., Турчанитова Т.П, Увайтхэст Б. Проблемы промышленного производства комплексных хлебопекарных улучпштелей //Хлебопечение России.- 1998,- №3,- С. 25 27.

92. Полторак О.М, Чухрай ЕС. Физико-химические основы ферментативного катализа- М: Высшая школа 1971,- С. 247 - 251.

93. Поляновский О.А Роль функциональных групп белка в ферментах.- М: Наука- 1964,- С. 101 121.

94. Путнам Ф. Денатурация белков.- В кн.: Белки.- М: Мир.- 1984,- 24 с.

95. Роуз Э. Химическая микробиология,- М: Мир,- 1971,- 294 с.

96. Рузинов Л.П Статистические метода оптимизации химико-технологических процессов,- М: Химия,- 1972.- 199 с.

97. Рухлядева АП, Полыгалина Г. В. Методы определения активности гидролитических ферментов. М: Легкая и пищевая пром-стъ.- 1981 — 288 с.

98. Рухлядова А П., Филатова Г. Г., Мереднегленко В. С. Справочник для работников лабораторш спиртовых заводов,-М: Пищевая пром-сть.- 1979.-С. 160-164.

99. Рыжжова В, Г., Фениксова Р. В. Получение высокоочищенной глюкоамилазы Aspergillus awamori //'Биохимия,- 1972,- Т. 37,- № 5,- С. 1019-1022.

100. Савельев АН, Сергеев В.Р., Фирсов JI.M Изучение активного центра глкжоамишзы из A awamori Х- 100 //Биохимия,- 1982.- Т. 47,- Ekm. 3,-С. 390 396.

101. Савельев АН, Сергеев В.Р., Фирсов JIM Изучение дополнительного субстратсвязьзвающего центра глюкоамилазы //Биохимия,- 1989,- Т. 54,-№10.-С. 1725-1731.

102. Савельев АН, Яковлева МФ., Фирсов Л.М Углеводный состав и некоторые свойства глюкоамилазы из A awamori //Биохимия,- 1984,- Т. 49.-вып. 11.-С. 1754-1760.

103. Сборник технологических инструюдий для производства хлеба и хлебобулочных гвделий.- М: Прейсьурашиздат. 1989,- 493 с.

104. Свишцов А А, Барсукова Т. К, Игтатов И А Новые возможности ультрафильтрации в биотехнологии: Обз. инф,- М: ЦБНТИ Минмедбиотехни-ка, 1987,- Вып. 5,- 32 с.

105. Семушин AM, Яковлев В.А, Иванова Е.В. ИК-спектры поглощения ионообменных материалов.- Л.: Химия,- 1989,- 96 с.

106. Синицин АН, Клибанов AM, Клесов А А, Мартинек К Зависимость стабильности глюкоамилазы от способа иммобилизации //Приют биохимия и микробиология.- 1978.- Т. XIV.- Вып. 2,- С. 236-242.

107. Смирнов ИН, Волжинский А И, Константинов В. А Рассчет и моделирование ионообменных реакторов,- Л: Химия,- 1984,- 224 с.

108. Сярейкайте И А, Герасимене Г. Б, Денис Г. И Выделение и характеристика внеклеточных а-глкжозидазы, инвертазы и глкжоамишзы из Aspergillus awamori //Прикл биохимия и микробиология.- 1989,- Том XXV-Вьш. 4.-С. 458-465.

109. Таджиев MX, Ибрагимов Ф, Рахимов ММ Иммобгшизация и стабилизация ферментов полимерами с функвдгональлными эпоксигруппами //Прикл. биохимия и микробиология.- 1978.- Т. 14.- № 5.- С. 703 708.

110. Ташмухомецова III С., Хасанов XT., Рахимов ММ Влияние удаления протеолишческих ферментов на очистку амилазы //Приклад, биохимия и микробиология.- 1995,- Т. 31,- № 3,- С. 272 274.

111. Тоддра Ф., Джонсон Н Иммобшшзация глюкоамилазы на пористых стеклянных волокнах //Технология и биотехнология,- 1987 Т. 40,- № 4,- С. 275 284.

112. Тохаязе З.В., Квачадзе JLJI, Квееитадзе Г.И. Влияние состава питательной среды на биосинтез кислотоустойчивой а-амилазы различными видами Aspergillus //Прикл биохимия и микробиология.- 1975,- Т. 11,- № 4,-С. 515.

113. Тривен М Иммобилизованные ферменты- М: Мир,- 1983,- 213 с.

114. Тройнина Т.И, Лифшиц Д.Б., Калашников ЕЯ. Влияние качества пшеничных отрубей на амилолитическую активность ферментных препаратов //Микробиология.- 1961.- Т. XXX- Вып. 3,- С. 540 544.

115. Уильяме В., Уилиамс X Физическая химия для биологов,- М: Мир,-1979,-600 с.

116. Уонг Д., Кеоней И, Демайн А Ферментация и технология ферментов.-М: Легкая и пищ. пром-тсь,- 1983,- 335 с.

117. Успехи биоорганического катализа /Под ред. ИВ. Березина, К Марти-нека- М: Изд-во МГУ,- 1979,- 285 с.

118. Феникаова Р. В., Кинзбурская Ф.М, Шилова А А Влияние состава питательной среды и способов выращивания на образование амилолитиче-ских ферментов из А. огшое //Науч. тр. ВНИИФС.- 1954.- Вып. 3,- С. 110 -127.

119. Фешжсова Р. В., Рыжакова В.Г. Влияние кислотности среды на образование амилолитических ферментов //Микробиология- 1970.- Вып. в.- С. 974-978.

120. Ферменты и иммобилшованные ферменты /'Под ред. АК Аренса- Рига: Авотс.- 1987,- С. 74-108.

121. Фертман Г.И, Шойхет МИ Химико-технологачесюЕЙ контроль спиртового и ликеро-водочного производства- М: Пищевая прм-стъ.- 1975.440 с.

122. Филатова Л.Н, ЦЬлякина МА, Егоров ЕВ. Кондиционирование и регенерация фосфорсодержащих сорбентов, используемых для получения особо чистых веществ .//Реактивы и особо чистые вещества- 1974.- Вып. 36.-С. 81-86.

123. Хиао К, Чен 3. Активность и термостабильностъ глюкоамилазы иммобилизованной диазотацией //Технология и биотехнология.- 1994.- № 5,- С. 681-684.

124. Хорлин А Я. Структура и функции активных центров ферментов,- М: Наука- 1974,- 36 с.

125. Шилова А А Амилолитические ферменты Л awamori и применение их в спиртовой промышленности: Автореф. дис. . канд. техн. наук- Воронеж- 1967,- 23 с.

126. Шмырева Ж.В., Клочкова АС., Крышка АЮ. Кятионит КБ-2П-05 как носитель глюкоамилазы //Теория и практика сорбционных процессов.-1983.-№16,-С, 55-57.

127. Зидус Л.Х Физико-химические исследования механизма инактивации ферментов //Биофизика- 1966,- Т. 2- Вып. 4,- С. 601 618.

128. Atkinson A The purification of microbial enzymes. Process Hodiern-1973.- № 8 P. 9.

129. Barton L.L., Georgi C.E., Lineback D.R. //Journal of Bacteriology.- 1972-V. 111.-P. 771.

130. Bendetskii KM, Yarovenko V.L., Sanatorova T.P. //Biokhimia- 1977,- V. 39.- P. 802

131. Bode HE. Uiited States Patent 3.- 1966.- V. 249,- p. 514.

132. Gorman J., Langlikke AF. Action of mold Enzyme in Starch Scarification //Cereal Chem.- 1948,- V. 125.- P. 190- 194.

133. Gorman, J. Uiited States Patent 3,- 1968,- P. 380, 891.

134. Davis B.J. Eies electrophoresis. 11. Method and application to human serum proteins //Ann. №4. Asad. Sei.- 1974,- Vol. 121,- P. 404-427.

135. Day D.F. Current Mcrobiology.- 1978,- № 1.- p. 181.

136. Dixon MM, Fogarty w.M Proceedings of the Society for General Microbiology.- 1975,-№2,-p. 80.

137. Dröper NR. "Ridge analysis" of Responce urfaces /Technometrics.- 1963.-№4- P. 3-18.

138. Durratriu V., Bulacovshi V., Constantinescu D. //Cellulose Chemistry and Technology.- 1969.- V. 13.-p. 391.

139. Edsall J. Protein. V. 1. ed. H Neurath, K Walley. Acad. Press.- 1958,- № 4.-P. 990.

140. Eggermont E. // J. Biochem- 1964,- Vol. 12,- №> 14,- P. 483.

141. Finch P., Leonard P.A Comparative studies on giucoamylases isolated from a strain of aspergillus Starke, 1978,- V. 30,- № 10.- P. 341.

142. Fleming I.D., Stone B.A //Hochem J., 1965,- V. 97.- P. 13.

143. Freedberg I.M, Levin Y., Kay CM //Biochemica et Biophysica Acta-1975,- V. 391,- P. 361.

144. Gillifand R B. //J. Inst. Brew.-1966,- Vol. 72- № 3,- P. 271.

145. Graesbeck C., Rase HF. Immobilized ghicoamvlase enzym sistem for continuous of dextrose//Ind. Eng. Chem. Prod. Res. Deveiop.- 1972.- № 11.- P. 74.

146. Hamauzu Z, Hromi K, Qno S. //Journal of Hochemistry, Tokyo.- 1965,-V. 57,- P. 39.

147. Hayashibara Co. British Patent 1,- 1969,- P. 268, 96.

148. Hayashida S., Kurasaki S., Nakao O. //Agric. Hoi. Chem- 1982.- V. 48,- № 1,-P. 83-89.

149. Hayashida S., Nomura T., Yoshino E., Hondo M //Agricultura and Biological Chemistry- 1976.- V. 40.- P. 141.

150. Hopkins RH, Kulka D. Archives of Biochemistry and Application.- 1957.-V. 69,- P. 45.

151. Jablonski E, Deluca M Properties and uses of immobilized light emitting ename systems from Beneckea harvegi //Qin. Chem- 1979,- V. 25,- № 9,- P. 1622-1627.

152. Karicka L.J., Green K Immobilized biolumminesceiit enzymes //Trends Analit. Chem- 1983.- V. 2.- № 1.- P. 244-247.

153. Kindle KL. Characteristics and production of thermostable a-amylase //'Appl. fiochem Biotechnol.- 1983,- V. 8,- P. 153-170.

154. King N.J. //Biochemical Journal.- 1967,- V. 105,- P. 577.

155. Kond Wei, 2 hou Hoi. // J. Chem Technol. and Biotechnol.- 1994.- V. 15.-№ 5.- P. 681 684.

156. Knruchima M, Sato J., Kitahara K //Journal of the Agricultural Chemical Society of Japan.- 1974,- V. 48,- P. 665.

157. Lilly M.D., Sharp AK The Kinetics of enzymes attached to -water insoluble polymers. The Chemical Engineer.- 1972,- N° 215,- P. 12-18.

158. Lineback D.R, Bauman W.E. Properties of glucoamylase from Aspergillus phoemcis.- Carbohyd. Res.- 1970,- V. 14,- P. 341.

159. Lowiy O.H, Rosebrough N.H, Forr A.L. Protein estimation with. Fo.in phenol reagent //J. Biol. Chem- 1951,- Vol. 193,- № 2,- P. 265 275.

160. Marmera D.J., Rowe KZ //Carbohyd. Res.- 1969,- Vol. 9,- № 14,- P. 444.

161. Marsh D.R, Lee Y.Y. Immobilized glucoamylase on prous glass. //Biotechnol. Biotng.- 1973,- № 15. P. 483 492.

162. Marshall J.J. In: Mechanisms of Saccharide Polymerization and Depolym-erization (J.J. Marshall, ed). //Academic Press, New York- 1980,- P. 119.

163. Mcdeary B. V., Anderson MA //Carbohydrate Research.- 1980.- V. 86,- P. 77.

164. Menchum ZD, Colvin MJ., Braymer HD. Chemical and phisicai studies of Neurospora crassa invortase. Molecular weight, amino acid and carbohydratecomposition and qiiatemary structure //Biochemistry'.- 1971,- V. 10.- № 2.- P. 326 332.

165. Mchelena V. V., Castillo F.J. Production of amylase by Aspergillus foetidus on rise flour medium and characteriation of the enzyme //J. Appl. Bacteriol.-1984.-V. 56,- P. 395-407.

166. Mtsue T., Saha B.C., Ueda S. //Journal of Applied Biochemistry.- 1979- V. 1,- P. 410.

167. Monta Y., Shimizu K, Ohga M //Agricultural and Biological Chemistry.-1966,- V. 30,- P. 114.

168. Moriyama S., Matsuno R, Nakanishi K. //Agricultural and Hological Chemistry.-1980,- V. 44.- P. 2763.

169. Murayama T., Ishilcawa T. //Journal of Bacteriology'.- 1973,- № 115,- P. 796.

170. Qno, S., Hromi, K. And Pfemauzu, Z I. //Jumal of Hodiemistryr. Tokyo1965.- V. 57,- P. 34.

171. Oteng Gvang K, Moulin G., Galzy P. Zeitschrift fur Allgemeine Mikrobiologie.- 1981,- V. 21,- P. 537.

172. Pazur J.H, Ando T. //Journal of Biological Chemistn.- 1959.- V. 234.- P.1966.

173. Pazur J.H, Knüll HR., Cepure A //Carbohydrate Research.- 1971.- V. 20.-P. 83.

174. Pazur J.H, Tommaga Y., Forsberg L.S. //Carbohydr. Res.- 1980.- V. 84,- P. 103-114.

175. Pestana F., Castillo F.J. Giucoamylase production by Aspergillus awamori on rise fluor nidium and partial characterization of the enzyme //Mircen J. App. microbiol. Hotechnol.- 1985,- V. 1,- № 3,- P. 225 237.

176. Phillips L.L., Caldwell ML. A study of the purification and properties of glucose forming amylase from Rh. delemar. Giucoamylase ill. Am Chem Soc.-1951,- V. 73,- P. 3559-3563.

177. Quader MA, Kausar T. //Pakistan Journal of Scientific and Industrial Research.- 1971,- V. 14,- p. 247

178. Rosevear A Immobilized biocatalysts-acritical review //J. Chem. Technol. Biotechnol.- 1984,- V. 34,- P. 127-150

179. Spenser Martins I., van Uden N. European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology.- 1979,- V. 6.- P. 241.

180. Sukhumavasi J., Kato K //'Ferment. Technol.- 1978,- V. 56,- P. 279 288.

181. Svensson B., Larsen K, Svendsen I. //Carlsberg Res. Communs.- 1983,- V. 48,- P. 529-544.

182. Svensson B., Sierks MR //Biochem.- 1992. V. 5.- № 7. - P. 29 - 44.

183. Takahashi T., Inokuchi N. Irie M //Journal of Biochemistry, Tokyo.- 1981.-V. 89,- P. 125.

184. Taylor P.M, Napier E.J. Fleming I.D. //Carbohydrate Research.- 1978.- V. 61,- P. 301.

185. Ueda S. In: Mechanisms of Saccharide Polymerization and Dspolymeriza-tion (J. J. Marshall, ed.) //Academic Press, New York- 1980.- P. 55.

186. Underkofler, L.A, Denault, L.J., Hou, E.F. //Die Starke.- 1965.- V. 17,- P. 179.

187. Voitkova Lepshikova A, Kotskova - Kratokhilova A //Mcrobiologiya-1966,- V. 35,- P. 773.

188. Watanade K, Fukirnbara T. //Agricultural and Biological Chemistry.- 1973.-V. 37,- P. 2755.

189. Watanade K, Fukirnbara T. //Journal of Fermentation Technology.- 1965.-V. 43,- P. 690.

190. Weetal H. Immobilized Hochemicals and Affinity Chromatography //Ed. RB. Dunlap.- Plenum Press.- 1974,- V. 42,- P. 191 212.

191. Weetai H. Immobilized Hochenicals and Affinity Chromatography //Ed. RB. Dunlap.- Plenum Press.- 1974,- V. 42.- P. 191 212.

192. Winkler K., Ruttloff H, Zi elder F. //Zeitschnft fur Allgemeine Mkrobiolo-gie- 1919.- V. 19.- P. 517 577.153

193. Xiao Cha, Hi Zhou, Weili. //J. Chem Techno! and Biotechnol.- 1990.- V. 47,- № 2- P. 161 169.

194. Yamasaki Y., Suzuki Y. //Agricultural and Biological Chemistry.- 1978.- V. 42- P. 971.

195. Yamasaki Y., Suzuki Y., Oawa J. //Agricultural and Hological Chemistry.-1977,-V. 41,-P. 2149.

196. Yamasaki, Suzuki Y, Ozawa J. Three from of a-glycoidase and glucoamy-lase from Aspergillus awamori //Agric. Biol. Chem.- 1977,- V. 41.- № 11,-P.2149- 2161.

197. Yuen S. United States Patent 3.- 1974.- P. 793, 461.154