Гистофизиология слизистой оболочки тонкой и толстой кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 при стрессорном холодовом воздействии

Абдулаева, Сабина Олеговна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Гистофизиология слизистой оболочки тонкой и толстой кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 при стрессорном холодовом воздействии
ВАК РФ 03.03.04, Клеточная биология, цитология, гистология

Автореферат диссертации по теме "Гистофизиология слизистой оболочки тонкой и толстой кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 при стрессорном холодовом воздействии"

На правах рукописи

005054022

Абдулаева Сабина Олеговна

ГИСТОФИЗИОЛОГИЯ СЛИЗИСТОЙ ОБОЛОЧКИ тонкой и ТОЛСТОЙ КИШКИ МЫШЕЙ ВАЬВ/С И С57В176 ПРИ СТРЕССОРНОМ ХОЛОДОВОМ ВОЗДЕЙСТВИИ

03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 ОКТ 2012

Москва-2012

005054022

Работа выполнена на Биологическом факультете ФГБОУВПО «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» и в ФГБУ «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Макарова Ольга Васильевна

Официальные оппоненты:

Главный научный сотрудник лаборатории развития эндокринной системы ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН

доктор медицинских наук, профессор Яглов Валентин Васильевич

Ведущий научный сотрудник лаборатории структуры и функции митохондрий НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им. М.В. Ломоносова

доктор биологических наук Плотников Егор Юрьевич

Ведущая организация: Российский университет дружбы народов

Защита диссертации состоится «29» ноября 2012г. в 12.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.004.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт морфологии человека» РАМН по адресу: 117418, Москва, ул. Цюрупы д.З

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН

Автореферат разослан « '7» октября 2012 года

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук

Михайлова Лилия Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В последние годы отмечается рост заболеваемости синдромом раздраженной кишки, воспалительными заболеваниями тонкой и толстой кишки, такими как болезнь Крона и хронический неспецифический язвенный колит (Shi X.Z. et al., 2011; Shokrani M. et al., 2012). Выраженность морфофункциональных изменений тонкой и толстой кишки при стрессорных воздействиях и воспалительных заболеваниях определяется состоянием эпителиальной выстилки, мукозальной иммунной системы и составом просветной микрофлоры.

По данным литературы, в инициальных механизмах развития синдрома раздраженной кишки и воспалительных заболеваний кишечника важную роль играют стрессорные воздействия (Kim J.J. et al., 2012). Влияние физиологического стресса на состояние нервной, эндокринной и иммунной системы в литературе освещено достаточно широко (Захарова JI.A. и др., 2010; Трунова Г.В. и др., 2011). Однако гистофизиологические изменения тонкой и толстой кишки при стрессорных воздействиях недостаточно изучены. Выраженность реакции организма на стрессорные воздействия зависит от генотипа и влияния различных факторов внешней среды (Matrison J., 2010; Gersemann М. et al., 2012). Для понимания генотипически обусловленных внутривидовых различий адаптивных и дизадаптивных реакций, воспалительных процессов, развивающихся в тонкой и толстой кишке, необходимо их изучение на линейных животных. Механизмы внутривидовой устойчивости к стрессу и, в частности, к холодовому, изучаются на линейных животных, и наибольшее число работ выполнено на мышах Balb/c и C57BI/6, у которых при стрессорных воздействиях развивается, соответственно, толерантная или резистентная адаптивная реакция (Кондашевская М.В. и соавт., 2004; Трунова Г.В. и др., 2011; Guo Y. et al., 2012; Weber E. et al., 2012).

Для изучения механизмов развития воспалительного процесса в толстой кишке используется модель острого язвенного колита, разработанная Okayasy et al. (1990). По данным экспериментальных исследований, выраженность морфологических проявлении язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия, зависит от генотипа: у мышей С57В1/6 с преобладанием Тх1 типа иммунного ответа его выраженность выше, чем у мышей Balb/c с преобладанием Тх2 типа иммунного ответа (Melgar S. et al., 2005; Nakanishi M. et al., 2007).

Следует отметить, что гистофизиологические изменения тонкой и толстой кишки при стрессорных воздействиях и воспалительных процессах в зависимости от преобладания клеточного или гуморального типа иммунного ответа у человека недостаточно изучены, что диктует необходимость проведения экспериментальных исследований на линейных животных.

Поэтому целью работы было изучение гистофизиологических изменений слизистой оболочки тонкой и толстой кишки у мышей Balb/c и С57В1/6 при стрессорном холодовом воздействии.

Задачи исследования:

1. Провести сравнительное исследование гистофизиологических особенностей тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови самцов-мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 в норме.

2. Изучить морфофункциональные изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры толстой кишки, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови, а также цитокинового профиля у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 на 9-е и 21-е сутки ежедневного однократного холодового воздействия.

3. Провести оценку морфофункциональных изменений слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры толстой кишки, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови и цитокинового профиля у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 на 9-е и 21-е сутки ежедневного двукратного холодового воздействия.

4. Провести сравнительную оценку изменений структурных компонентов тонкой и толстой кишки, просветной микрофлоры, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови и цитокинового профиля в разные сроки при однократном и двукратном холодовом воздействии.

5. На модели острого язвенного колита, вызванного декстрансульфатом натрия, изучить у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 патоморфологические изменения толстой кишки, оценить состояние ее просветной микрофлоры и цитокинового профиля.

6. Оценить выраженность патоморфологических проявлений острого язвенного колита, состава просветной микрофлоры толстой кишки и цитокинового профиля у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6, которых подвергали предварительному стрессорному холодовому воздействию.

Научная новизна. Впервые охарактеризованы гистофизиологические различия тонкой и толстой кишки у мышей-самцов Ва1Ь/с и С57В1/6. В условиях физиологического функционирования, по сравнению с мышами С57В1/6, у мышей линии Ва1Ь/с в тощей и ободочной кишке более выражен слизистый барьер. Мукозальная иммунная система у мышей Ва1Ь/с характеризуется высокими показателями числа межэпителиальных лимфоцитов, а у С57В1/6 — числа лимфоцитов и нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки тонкой и толстой кишки. В составе просветной микрофлоры у мышей Ва1Ь/с выше уровень условно-патогенных энтерококков Е./ес'шт.

однонаправленно изменяется состояние мукозальной иммунной системы, увеличивается показатель числа межэпителиальных лимфоцитов и лимфоцитов в составе клеточных элементов собственной пластинки слизистой оболочки.

Однократное и двукратное курсовое холодовое воздействие у мышей обеих линий оказывает положительный эффект на состав просветной микрофлоры, увеличивая количество лактозоферментирующих Е. coli и лактобактерий.

Стрессорное холодовое воздействие оказывает протективный эффект при индуцированном декстрансульфатом натрия остром язвенном колите у мышей Balb/c и С57В1/6, за счет противовоспалительного действия кортикостерона, уровень которого в сыворотке крови повышается при холодовом воздействии. Морфологические проявления острого язвенного колита при предварительном курсовом ежедневном холодовом воздействиии менее выражены у мышей обеих линий.

Практическая значимость. Данные по внутривидовым морфофункциональным реакциям тонкой и толстой кишки на стрессорное воздействие при преобладании Т-хелпер1 или Т-хелпер2 типа иммунного ответа позволят разработать методологические подходы к выделению индивидуальных критериев и групп риска развития дисбиотических состояний и воспалительных заболеваний толстой кишки у человека.

Внедрение в практику. Материалы диссертационного исследования используются в лекционном курсе на кафедре гистологии, цитологии и клеточной биологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Апробация работы

Результаты исследования и основные положения работы доложены и обсуждены на IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (Архангельск, 2011); XIV Всероссийском форуме «Дни иммунологии» (Санкт-Петербург, 2011); IV Всероссийской научно-практической конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2011); XVIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2011); научной конференции «Актуальные вопросы морфогенеза в норме и при патологии» (Москва, 2012); IV ежегодном всероссийском конгрессе по инфекционным болезням (Москва, 2012); совместном заседании кафедры клеточной биологии и гистологии Биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова и научных лабораторий ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (сентябрь, 2012)

Публикации материалов исследования

По материалам диссертации опубликовано 13 научных работ, из них 3 статьи представлены в изданиях, включенных в «Перечень периодических изданий», рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения и четырех глав: обзора литературы, материалов и методов исследования, результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов и практических рекомендаций; выводов и списка литературы. Работа изложена на 182 страницах машинописного текста и проиллюстрирована 29 рисунками и 28 таблицами. Библиографический указатель включает 186 источников (27 отечественных и 159 иностранных).

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

В работе использовали половозрелых самцов мышей Ва1Ь/с (п=70) и С57В1/6 (п=70), полученных из питомника «Столбовая». Возраст мышей составил 9-10 нед, масса тела 23-25г. При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (протокол №7 от 20.12.2009 г.).

Для изучения влияния физиологического стресса на морфофункциональное состояние тонкой и толстой кишки моделировали однократное (первая группа) и двукратное (вторая группа) холодовое воздействие. Животных первой группы (п=32) ежедневно в утренние часы (8.00 — 10.00) подвергали холодовому воздействию - плаванию в воде со льдом (1° +4°С) в течение 2-х минут однократно, второй группы (п=32) - двукратно. Степень охлаждения, согласно классификации Т.В. Козыревой (2002), была глубокой, так как ректальная температура снижалась в среднем на 2°С у мышей Ва1Ь/с и 2,5°С - у С57В1/6. После холодового воздействия у мышей обеих линий в течение 10-15 мин отмечался мышечный тремор и пилоэрекция. Исследование проводили на 9-е и 21-е сут холодового воздействия. Мышей опытных и контрольных групп (п=16) выводили из эксперимента передозировкой диэтилового эфира через 1,5 часа после последнего сеанса холодового воздействия.

Для решения вопроса о протективном или дизадаптивном характере реакций, вызываемых Холодовым воздействием, у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 после 9-ти сут однократного холодового воздействия воспроизводили по Окауаэи е1 а1. (1990) модель колита, индуцированного декстрансульфатом натрия. Исследование проводили на трех группах мышей обеих линий: с острым язвенным колитом (п=20); с острым язвенным колитом на фоне предварительного холодового воздействия (п=20); контрольная группа (п=20). Мыши первой группы с питьевой водой получали декстрансульфат натрия (молекулярная масса 100000; Р1ика): 5% раствор в течение 4-х сут и 7% раствор в течение последующих 3-х сут. Вторая группа мышей получала раствор декстрансульфата натрия в указанных концентрациях и режиме после 9-ти сут ежедневного однократного холодового воздействия.

Методы исследования

Гистологические. Проводили забор фрагментов тощей, подвздошной и среднего отдела ободочной кишки у животных опытных и контрольных групп. Фрагменты органов фиксировали в растворе Буэна и жидкости Копш-Рего с целью лучшей визуализации клеток Панета. Фрагменты органов заливали в парафин и окрашивали гематоксилином и эозином.

Гистохимические. Для выявления в составе секрета бокаловидных клеток тонкой и толстой кишки кислых гликопротеинов использовали окраску альциановым синим, нейтральных гликопротеинов - PAS-реакцию. С целью выявления гранул декстрансульфата фрагменты подвздошной кишки, брыжеечных лимфатических узлов и печени фиксировали в жидкости Карнуа и гистологические срезы окрашивали толуидиновым синим (pH 2,0).

Иммуногистохимические. Для выявление энтероэндокринных клеток использовали антитела к хромогранину A (Rabbit polyclonal to Chromogranin A, Abeam), в рекомендованном производителем титре 1:100, при инкубации 18 ч в холодильнике (12°С). Вторые антитела (HRP-Goat Anti-Rabbit IgG, Invitrogen) использовали в титре 1:100, срезы инкубировали 18 ч (12°С). Для визуализации реакции применяли набор Dako En Vision-HRP (DAB).

Морфометрические. При морфометрическом исследовании, с помощью сетки Г.Г. Автандилова (1973), определяли соотношение объемной доли энтероцитов и бокаловидных клеток, объемной доли стромы и клеточных элементов в собственной пластинке слизистой оболочки (СПСО) ободочной кишки. Проводили дифференцированный подсчет клеточных элементов (на 1000 клеток) в СПСО тощей, подвздошной и ободочной кишки, с определением относительного количества нейтрофилов и лимфоцитов; подсчет числа межэпителиальных лимфоцитов (МЭЛ) на 1000 эпителиоцитов в СПСО тощей и подвздошной кишки. Определяли количество митозов (на 1000 клеток крипт) в тощей, подвздошной и ободочной кишке. Подсчитывали число визуализируемых бокаловидных клеток на ворсинку в тощей и подвздошной кишке и на крипту в ободочной кишке; визуализируемых клеток Панета на крипту тощей и подвздошной кишки; энтероэндокринных клеток на ворсинку и крипту тощей и подвздошной кишки, на крипту ободочной кишки.

В гистологических срезах ободочной кишки животных с острым язвенным колитом, индуцированным декстрансульфатом натрия, полуколичественно (в баллах) оценивали выраженность патоморфологических изменений с помощью модифицированной нами шкалы S. Kitajima (2000) по ряду критериев. Распространенность язв: 0 - отсутствует; 1 - площадь язв занимает 10-20%; 2 - 21-50%; 3 - 51-80% поля зрения; 4 - площадь язвы занимает все поле зрения. Глубина некроза: 0 - отсутствует; 1 - некроз 1/3; 2 -2/3 высоты крипт; 3 - тотальный некроз слизистой оболочки. Выраженность отека подслизистого слоя: 0 - отсутствует; 1 - подслизистый слой, шириной не более, чем в два раза больше; 2 -шириной не более, чем в три раза больше; 3 -шириной более, чем в три раза больше, по сравнению с нормой, и наличие в

нем воспалительной инфильтрации нейтрофилами; 4 - сочетание указанных выше изменений с резко выраженным отеком, выраженной диффузной и очаговой инфильтрацией нейтрофилами.

Морфометрическую оценку -площади кровоизлияний и язв в макропрепаратах продольно рассеченной ободочной кишки у мышей с язвенным колитом проводили на фотографиях с помощью морфометрической программы Image-Pro.

Культуральные. С целью изучения цитокинового профиля из селезенки мышей контрольных и опытных групп выделяли клетки с помощью стеклянного гомогенизатора Поттера. Для индукции продукции цитокинов суспензию клеток селезенки культивировали 24 часа в 1мл полной ростовой среды с добавлением конканавалина А (5 мкг/мл) в 24-х луночных культуральных панелях при 37°С в атмосфере 5% С02. По окончании инкубации отбирали надосадки, которые хранили при -20°С не более трех месяцев. Среда для культивирования состояла из RPMI 1640 с добавлением 5% фетальной сыворотки и антибиотиков.

Иммуноферментный. Для определения уровня кортикостерона использовали набор Corticosterone ELISA IBL International GMBH. Определение уровня эндотоксина в сыворотке крови проводили с использованием набора Hycult Biotech LAL.

Проточная цитофлюориметрия. В культуральной жидкости спленоцитов, активированных конканавалином А, определяли уровень цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-17, ИФН-у, ФНО-а, ГМ-КСФ методом проточной цитофлюориметрии с использованием набора mouse Thl/Th2 lOplex BMS820FF BenderMedSystems на приборе CytomicsFC500 «BeckmanCoulter»

Бактериологические. Оценку состояния микрофлоры толстой кишки проводили путем высева на соответствующие питательные среды (HiMedia, Индия) десятичных разведений гомогената фекалий, взятых из прямой кишки. Определяли уровень лактозоположительных и лактозоотрицательных энтеробактерий, энтерококков (Е. faecalis et fecium), лакгобактерий. Результаты посевов представляли в виде количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 грамм фекалий.

Статистические. Статистическую обработку показателей проводили с учетом характера распределения параметрическими (t-критерий Стьюдента) и непараметрическими (U-критерий Манн-Уитни) методами. Различия считали достоверными при р<0,05.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Сравнительная гистофизиологическая характеристика слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры толстой кишки и уровня кортикостерона у мышей Balb/c и С57В1/6

В условиях физиологического функционирования, у мышей-самцов Balb/c, в отличие от мышей С57В1/6, более высокий уровень кортикостерона

(соответственно, 95,8 и 20,0 nmol/L; р<0,05). Повышенное содержание кортикостерона в сыворотке крови мышей Balb/c, по сравнению с мышами других линий, и, в том числе C57BI/6, также выявлено V. Brinks et al. (2009) и M.L. Palumbo et al. (2010). По нашим данным, высокий уровень кортикостерона в сыворотке крови мышей Balb/c сочетался с низким показателем митотической активности эпителия тонкой кишки, а у мышей С57В1/6 низкий уровень кортикостерона - с высокой митотической активностью. Полученные результаты соответствуют данным литературы об обратной корреляционной связи между уровнем кортикостерона и митотической активностью эпителия (Алов И.А., 1964; Alahmed S. et al., 2008). В подвздошной кишке у мышей C57BI/6, по сравнению с Balb/c, выявлена большая численность популяции секретирующих дефенсины клеток Панета (рис.1), что в сочетании с высокой митотической активностью эпителия и локализацией клеток Панета в дне крипт предопределяет эффективную защиту стволовых и малодифференцированных эпителиальных клеток от повреждающего воздействия (Roth S. et al., 2012). По сравнению с С57В1/6 в тощей кишке у мышей Balb/c было большее количество МЭЛ (рис.1), являющихся частью эфферентного звена иммунной системы слизистых оболочек (Cheroutre Н. et al., 2011).

В ободочной кишке у мышей Balb/c увеличена объемная доля бокаловидных клеток, что отражает повышение накопления гликопротеинов, которые формируют на поверхности слизистой оболочки покровный вязко-эластический слой слизи (рис.1). Слизистый барьер препятствует повреждению эпителия и является основой биопленки для пристеночной микрофлоры (Prakash S. et al., 2011). По-видимому, даже в физиологических условиях, у мышей с Тх1-типом иммунного ответа (С57В1/6) взаимодействие паттерн-распознающих рецепторов энтероцитов и иммуноцитов с пептидогликанами микроорганизмов вызывает более выраженные иммунологические реакции и темпы обновления эпителия. Увеличение числа клеточных элементов в собственной пластинке слизистой оболочки у мышей-самцов С57В1/6 сочеталось с повышением содержания нейтрофилов и лимфоцитов. Повышение содержания нейтрофилов может быть обусловлено особенностями функционального состояния системы перекисное окисление липидов -антиоксидантная защита. В норме у мышей C57BL/6, по сравнению с Balb/c, более низкая активность антиоксидантных ферментов - супероксидцисмутазы и каталазы (Трунова Г.В., 2004).

В отличие от мышей С57В1/6, у мышей Balb/c в толстой кишке выявлено более высокое количество Е. faecium (соответственно, 1350 и 6900 КОЕ/г; р<0,05), что сочетается с увеличением численности популяции бокаловидных клеток и, соответственно, с формированием более выраженного слоя слизи, препятствующего взаимодействию микрофлоры и эпителия толстой кишки (Sansonetti P.J. et al., 2011). Показатели уровня эндотоксина в сыворотке крови у мышей сравниваемых линий были низкими и достоверно не различались, что соответствует литературным данным и отражает отсутствие нарушения

слизистого барьера и проницаемости эпителиального слоя толстой кишки (Рябиченко Е.В. и др., 2007).

Бокаловидные клетки (тощая кишка)

Межэпителиальные лимфоциты (тощая кишка)

г! 100-

ВаІЬ/с

C57BI/6

Balb/c

C57BI/6

Нейтрофилы в собственной пластинке слизистой оболочки (тощая кишка)

с MndBKl □ 25%-75ЧЬ I Non-Oallior Ranea

Лимфоциты в собственной пластинке слизистой оболочки (тощая кишка)

a Medían Q 2544-75% X Non-Outlier Ranea

Balb/C C57BI/6

Клетки Панета (подвздошная кишка)

Batb/c C57BI/6

Бокаловидные клетки (ободочная кишка)

Ва1Ь/с

C57BI/6

70605040302010-

h П * —

=П1_ ■

I----І-^---

CU Balb/c MC57BI/6

Объемная доля

Рис.1. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки тонкой и толстой кишки мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 в физиологических условиях, М±8Е

Сравнительная гистофизиологическая характеристика слизистой оболочки тонкой и толстой кишки и состава просветной микрофлоры мышей Ва1Ь/с и С57ВІ/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии

С целью моделирования стресс-реакций мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 подвергали курсовому ежедневному однократному холодовому воздействию.

Холодовое воздействие вызывало у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 повышение в сыворотке крови уровня кортикостерона, что отражает стрессорный характер воздействия (рис.2).

Ва'Ь/С С 57 В1/6

контроль 21-е сут " контроль „ 21-е сут

uy I CI р г\гт

Рис.2. Изменение содержания кортикостерона (nmol/L) в сыворотке крови мышей Balb/c и С57В1/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии

При качественном морфологическом исследовании в тонкой и толстой кишке у мышей Balb/c и С57В1/6, подвергавшихся курсовому однократному холодовому воздействию в течение 9 и 21 сут, альтеративных изменений не было выявлено.

В ответ на курсовое ежедневное однократное холодовое воздействие в слизистой оболочке тощей и подвздошной кишки у мышей Balb/c и С57В1/6 снижалось число клеток Панета, кроме того, у мышей С57В1/6 увеличивалось число энтероэндокринных клеток; в тощей кишке у мышей обеих линий снижалось число бокаловидных клеток; в подвздошной кишке у мышей Balb/c уменьшалось число бокаловидных клеток (рис.3,4).

В ободочной кишке мышей Balb/c и С57В1/6 динамика изменений числа энтероэндокринных клеток была разнонаправленной: у мышей Balb/c их число снижалось, а у мышей С57В1/6 увеличивалось. В ободочной кишке мышей Balb/c также снижалось число бокаловидных клеток, но увеличивалась их объемная доля (рис.5).

Число визуализируемых бокаловидных клеток у мышей Balb/c в тонкой и толстой кишке уменьшалось, но в сочетании с выраженным окрашиванием их цитоплазмы альциановым синим и при проведении PAS-реакции, что отражает присутствие в секрете и кислых, и нейтральных гликопротеинов. Важная роль слизи в функционировании кишечного барьера убедительно показана в ряде работ, в которых у мышей, нокаутных по гену MUC2, слой слизи, покрывающий эпителий, был тонким и бактерии контактировали с эпителиальными клетками, что приводило к развитию воспалительного процесса (Van der Sluis М. et al., 2006; Johansson M. E. et al., 2008; Salim S Y et al., 2011).

Бокаловидные клетки

Клетки Панета

3 контроль 3 9 сут 121 сут

С57ВІ/6-

ВаІЬ/с-

I I контроль ' 19 сут ШШ21 сут

И"1*

число на ворсинку

Энтероэндокринные клетки

С57ВІ/6-

I_I контроль

I 1С сут ^■21 сут

0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 число на крипту

Энтероэндокринные клетки

н 1

ІН

I I контроль

]н* 1=19 сут

■ 21 сут

число на ворсинку

число на крипту

Рис.З. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки тощей кишки мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии

Бокаловидные клетки

Клетки Панета

С57ВІ/6

3 контроль 39 сут 121 сут

2 3 4 число на ворсинку

Энтероэндокринные клетки

—и

число на крипту

э *

-1 I_і контроль

СЗ 9 сут Ні 21 сут

]контроль 3 9 сут 121 сут

число на крипту Энтероэндокринные клетки

С57ВІ/6-

0.00 0.05 0.10 0.15 0.20 0.25 0.30 0.35 0.40 0.45 число на ворсинку

Рис.4. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки подвздошной кишки мышей ВаІЬ/с и С57ВІ/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии

Бокаловидные клетки

C57BI/6-

Ва1Ь/с

10 20 30 40 50 число на крипту

J контроль 3 9 сут 121 сут

C57BI/6-

Balb/c-

I—I контроль С3 9 сут &Ш 21 сут

JH*

О 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60 65 объемная доля

Энтероэндокринные клетки У

C57BI/6-

Balb/c

и контроль 3 9 сут 121 сут

Рис.5. Морфометрическая характеристика слизистой оболочки ободочной кишки мышей Ва1Ь/с и С57ВІ/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии

0.0 0.1 0.2

число на крипту

Муцин, продуцируемый бокаловидными клетками, играет роль не только механического барьера, но и способен адгезировать бактерии. Возможность связывания бактерий со специфическим эпитопом муцина облегчает колонизацию комменсальной флоры. Поэтому муцины во-многом определяют состав пристеночной микрофлоры (Young С. et al., 2009). Буферный слой слизи можно условно разделить на две фракции. Во внешнем слое защитной слизи находится большинство микроорганизмов. Внутренний слой остается относительно стерильным, чему способствует высокая концентрация антимикробных белков, продуцируемых клетками Панета. В кишечнике млекопитающих клетки Панета секретируют эндогенный лизоцим, секреторные иммуноглобулины, кислую фосфатазу, дегидрогеназу, фосфолипазу А2 и дефенсины (Vaishnava S. et al., 2008; Nieuwenhuis E. E. et al., 2009). В клетках Панета выявляются IgA, IgG и IgE, и они характеризуются высокой экспрессией CD95, «домена смерти» необходимого для трансдукции цитотоксического сигнала. Все это указывает на участие клеток Панета в поддержании нормальной структуры и барьерной функции слизистой оболочки кишки (Shi J. et al., 2007), регулировании роста бактериальной флоры тонкой кишки (Brugman S. et al., 2010), модулировании цитокинового ответа моноцитов и лимфоцитов, выработке аттрактантов для им мунекомпетентных клеток при инфекционном воспалении (Grigat J., 2007). В то же время, дефенсины являются мощными активаторами врожденного иммунитета. В

очаге воспаления они индуцируют хемотаксис наивных Т-лимфоцитов, моноцитов и незрелых дендритных клеток, усиливают синтез цитокинов и хемокинов (Yang D. et al., 2009). Выявленное нами при холодовом воздействии снижение числа визуализируемых клеток Панета (рис.3,4), может быть обусловлено опустошением их цитоплазмы в результате повышенной секреции гранул, либо снижением экспрессии генов Wnt-сигнального пути, который определяет дифференцировку стволовых клеток в секреторные (Medema J.P. et al., 2011).

Динамика изменения популяции энтероэндокринных клеток (рис.5), выявленных с помощью антитела к хромогранину А, при холодовом воздействии у мышей сравниваемых линий отличается. По данным W.I.Khan (2010) хромогранин может осуществлять одновременно провоспалительную и противовоспалительную функции, а также регулировать проницаемость эндотелия при воспалительном процессе, предотвращая ФНО-а индуцированный отек. В то же время, концентрация хромогранина прямо коррелирует с уровнем маркеров воспаления, такими как прокальцитонин и С-реактивный белок (Zhang D. et al., 2009; Khan W. I. et al., 2010). Принимая во внимание, что патогенетические механизмы синдрома раздраженной кишки связаны с увеличением количества и функциональной активности общей популяции энтероэндокринных клеток (Spiller R. et al., 2008; Sidhu R. et al.,

2010), увеличение количества последних в слизистой оболочке тонкой и толстой кишки мышей С57В1/6 может косвенно указывать на изменение моторики, процессов секреции и всасывания.

Эпителиальная выстилка кишечника — это зона взаимодействия между иммунной системой слизистых оболочек и бактериями пристеночной и просветной микрофлоры (Wang F. et al., 2011). По результатам нашего исследования, реакция мукозальной иммунной системы тонкой и толстой кишки мышей сравниваемых линий при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии, характеризовалась увеличением числа МЭЛ и лимфоцитов в составе клеточных элементов СПСО тощей и подвздошной кишки (рис.6).

Повышение числа МЭЛ и лимфоцитов в СПСО соотносится с литературными данными об уменьшении количества лимфоцитов, циркулирующих в крови, при увеличении концентрации кортикостерона в ответ на стрессорное воздействие, что носит адаптивный характер и отражает перераспределение клеток, в первую очередь, в барьерные в органы и ткани (Stefanski V. et al., 2003).

Большинство лимфоцитов в СПСО - это В-клетки (15-40%), Т-клетки (4090%) и небольшое количество естественных киллеров (Тертычный А. С. и др.,

2011). В-клетки дифференцируются в плазмоциты, которые секретируют IgA, IgM, IgG в пропорции 90:6:4. Большинство Т-клеток в СПСО имеют фенотип хелперов (CD3+, CD4+). Синтезируемый лимфоцитами СПСО IgA, отличается от IgA, циркулирующего в сыворотке крови тем, что не активирует комплемент

и не влияет на продукцию провоспалительных цитокинов, что обеспечивает идеальную защиту поверхности слизистой оболочки (ТгивЫпа Е. N. е1 а1., 2004).

Межэпителиальные лимфоциты Лимфоциты в СПСО

C578I/6

подвздошая кишка

тощей кишки

□ Median Q 25%-75% X Non-Outlier Range

Balb/c

6 Q 0

C57BI/6

Лимфоциты в СПСО подвздошной кишки

a Median Q25%-75% X Non-OuWer Range

Лимфоциты в СПСО ободочной кишки

о Median О 25%-75% J Non-Oullief Range

* А

J Balb/c У □

C57BI/6

й 1

Balb/c

C57BI/6

Рис.6. Характеристика мукозальной иммунной системы слизистой оболочки тонкой и толстой кишки мышей Ва1Ь/с и С57ВІ/6 при курсовом ежедневном однократном холодовом воздействии

МЭЛ - это Т-лимфоциты, локализованные в эпителиальной выстилке слизистой оболочки. Большинство МЭЛ представлено С08+лимфоцитами, осуществляющими «киллинг» инфицированных эпителиальных клеток. Меньшая часть популяции МЭЛ - СП4+СЭ8+лимфоциты, которые способны подавлять Тх1-опосредованное воспаление в стенке кишечника ИЛ10-зависимым путем (Atarashi К. et al., 2011). МЭЛ находятся в постоянном контакте с антигенами просвета кишечника и являются первой структурой иммунной системы, которая взаимодействует с антигенами (Cheroutre Н. et al., 2011). МЭЛ секретируют ряд хемокинов, что ограничивает возможность бактериальной транслокации через слизистые оболочки (Ismail A. S. et al., 2009). Наряду с этим, МЭЛ обеспечивают восстановление эпителия после повреждения, что связано с их способностью регулировать продукцию KGF (keratinocyte growth factor - фактор роста кератиноцитов) и стимулировать пролиферацию прогениторных клеток в кишечных криптах (Ismail A. S. et al., 2009).

Сравнительная гистофизиологнческая характеристика слизистой оболочки тонкой и толстой кишки мышей Balb/c и C57BI/6 при курсовом ежедневном двукратном холодовом воздействии

Применение курсового ежедневного двукратного холодового воздействия у мышей Balb/c и С57В1/6 не привело к развитию дизадаптивных, альтеративных и воспалительных реакций в слизистой оболочке тощей, подвздошной и ободочной кишки. Реакция тонкой и толстой кишки, как при однократном, так и при двукратном ежедневном холодовом воздействии, была однонаправленной и сходной по характеру вызванных изменений. По морфологическим данным, выраженность и направленность структурных изменений тонкой и толстой кишки при использовании сравниваемых режимов холодового воздействия у мышей Balb/c и С57В1/6 не отличались. Однако, по сравнению с однократным, при двукратном холодовом воздействии активация мукозальной иммунной системы была более выражена: в тонкой кишке содержание лимфоцитов в СПСО было более, чем в 2, а в толстой - более, чем в 5 раз больше у мышей обеих линий.

Изменения состава просветной микрофлоры толстой кишки, уровня эндотоксина и цитокинового профиля у мышей Balb/c и С57В1/6 при курсовом ежедневном однократном и двукратном холодовом воздействии

По результатам микробиологического исследования, при ежедневном однократном и двукратном холодовом воздействии у мышей Balb/c и С57В1/6 количественный состав микрофлоры толстой кишки изменялся: увеличивалось количество лактозопозитивных, лактозонегативных энтеробактерий и лактобактерий (табл.1). Кроме того, нами было выявленно повышение уровня условнопатогенных энтерококков Е. faecalis и Е. fecium, которое при увеличении сроков холодового воздействия сменялось нормализацией их количества (табл.1). Увеличение количества лактозоферментирующих Е. coli и лактобактерий свидетельствует о положительном влиянии использованного режима холодового воздействия на микробиоту кишечника. Так как, по данным литературы, лактобактерии, как представители сахаролитической микрофлоры, помимо молочной кислоты способны продуцировать целый ряд низкомолекулярных метаболитов, обладающих выраженным

бактериостатическим эффектом: органические кислоты, перекись водорода, диацетил, реутерин и т.д. Помимо этого, низкомолекулярные метаболиты, блокируя рецепторы эпителиоцитов, препятствуют адгезии патогенной микрофлоры к эпителию и обладают способностью индуцировать хемотаксис бактерий (Stoianova L. G. et al., 2012).

По нашим данным, при однократном холодовом воздействии у мышей Balb/c повышается продукция клетками селезенки уровня ФНОа и ГМ-КСФ, а у мышей С57В1/6 - уровня ИФНу (рис.7). Различия в изменении продукции и секреции цитокинов при холодовом воздействии, по-видимому, связаны с тем, что у мышей Balb/c и С57В1/6 исходно разный тип иммунологической

реактивности: преобладание гуморального типа иммунных реакций у мышей Balb/c и клеточного - у мышей C57BI/6 (Palumbo M. L. et al., 2010). В литературе показано, что повышение продукции цитокинов, таких как ФНО-а и ИФН-у, может быть обусловлено разнообразными факторами (Palumbo M. L. et al., 2010), в том числе, эндотоксином. В частности, в нашем исследовании, повышение продукции и секреции цитокинов сопряжено с увеличением уровня эндотоксина в сыворотке крови, также наблюдаемым нами при однократном холодовом воздействии у мышей С57В1/6 (табл.1). Так, уровень эндотоксина в сыворотке крови у мышей С57В1/6 повышался на 9-е сут и снижался относительно контроля на 21-е сут исследования, а у мышей Balb/c достоверно не изменялся. По данным В. Spellberg et al. (2000), увеличение содержания кортикостерона в сыворотке крови при стрессорных воздействиях приводит к увеличению проницаемости кишечного эпителия, в том числе для эндотоксина. Это согласуется с нашими данными, по которым повышение уровня эндотоксина коррелирует с максимальным уровнем кортикостерона, также наблюдаемым на 9-е сут однократного холодового воздействия у мышей С57В1/6 (уровень этого гормона более, чем в 7 раз превысил контрольные значения).

При двукратном холодовом воздействии уровень цитокинов, с увеличением сроков эксперимента, прогрессирующе снижался (рис.7), что также отмечалось в ряде исследований, посвященных изучению изменений цитокинового профиля при физиологическом стрессе (Cohen S. et al., 2012; Karp С. L. et al., 2012). Иммуносупрессия, развивающаяся при острых стрессорных воздействиях, является одним из механизмов адаптационного процесса, ограничивающего негативное влияние стрессорных агентов на иммунную систему (Scott С. L. et al., 2011). В тоже время, длительное снижение иммунологических функций может приводить к формированию вторичного иммунодефицита и на его фоне — развитию воспалительных заболеваний (Shah N. et al., 2012).

Снижение уровня продукции цитокинов, очевидно, также связано с противовоспалительным эффектом повышенного уровня кортикостерона (рис.2), так как, по данным литературы, известно прямое ингибирующее действие глюкокортикоидов на синтез цитокинов (Bauer M. Е. et al., 2001). Под влиянием холодового воздействия наблюдаемое нами повышение уровня кортикостерона у мышей обеих линий, очевидно, блокирует активацию NF-kB, что в свою очередь ингибирует гены воспалительного и иммуного ответа и приводит к снижению уровня иммунорегуляторных Тх1 (ИФН-у, ИЛ-2), Тх2 (ИЛ-1, ИЛ-4, ИЛ-5, ИЛ-6), ТхЗ (ИЛ-17) и провоспалительных (ФНОа) цитокинов. Помимо этого, глюкокортикоиды ингибируют экспрессию молекул адгезии и рецепторов к цитокинам на поверхности иммунокомпетентных и других клеток, что приводит к снижению чувствительности к цитокинам (Bauer M. Е. et al., 2001).

Изменения просветной микрофлоры (КОЕ/г) толстой кишки и уровня эндотоксина (EU/ml) при курсовом ежедневном однократном и двукратном холодовом воздействии, Ме (25L;75U)

Однократное возденет Balb/c C57B1/6 Порог доверительной вероятности

контроль 9-е сут XB 21-е сут XB контроль 9-е сут XB 21-е сут XB

1 2 3 4 5 6

Энтеробактерии Lac+/Е. coli 3,5 (1;40) 100 (90;690) 80(10;150) 2,2 (0;9,1) 200 (48.5:465) 18(1,3:90) p 1-2=0.00 pl-3=0.04 p4-5=0.00 D4-6=0.21

(*105) Lac- 5,4(1,1;14,5) 505 (0;2400) 41 (5;300) 2,5(1,1;8,2) 96 (0,1;160) 20 (5;13000) p 1-2=0,12 pl-3=0,03 D4-5=0.26 D4-6=0.02

Энтерококки (*10!) E.faecalis 0 (0;0) 0(0:100) о(0;0) 0 (0;0) 500 (500:1500) о(0:0) pl-2=0,l 1 pl-3=l,00 o4-5=0.00 D4-6=1.00

E.fecium 6900 (5025:7500} 1050 (210:3500) 4500 (2000:70001 1350 (715:1850) 1000 (370:4300) 1200 (700:2850) pl-2=0.01 pl-3=0,14 04-5=0.64 n4-6=0.83

Лактобактерии (*10!) 55,5 (4,1;336) 150 (73.3:700) 1000 (160:2500) 96(1;1260) 550 (363:4800) 172(35;1000) p 1-2=0,18 p 1-3=0.01 ü4-5=0.04 D4-6=0.58

Эндотоксин 0,01 (0.00:5.13) 0,24 (0.04:5.20) 56,0 (27,0;59,0) 0,04 (0.02:0.06) 0,24 (0.07:0.40) 0,0 (0,0;0,02) p 1-2=0,82 p 1-3=1,00 p4-5=0,03 D4-6=0.04

Двукратное холодовое воздействие Balb/c CS7BI/6 Порог доверительной вероятности

контроль 9-е сут XB 21-е сутХВ контроль 9-е сут XB 21-е сут XB

1 2 3 4 5 6

Энтеробактерии (*ю!) Lac+/E. coli 3,5 (1;40) 2(1; 9) 1 (1;100) 2,2 (0;9,1) 73(i6;i30) 0,3 (0,3;0,5) pl-2=0,58 pl-3=l,00 p4-5=0.00 D4-6=0.21

Lac- 5,4(1,1;14,5) 80(17:177,5) 75 (25;950) 2,5(1,1;8,2) 49(25:100) 3900 (2300:9400) p 1-2=0.01 pl-3=0.04 p4-5=0,01 d4-6=0.00

Энтерококки(*105) E.faecalis 0(0:0) 0 (0;0) 0 (0;0) 0 (0;0) 0 (0; 0) 0(0; 0) pl-2=l,00 pl-3=l,00 p4-5=1.00 o4-6= 1.00

E.fecium 6900 (5025:7500) 4500 (1700:14500) 1700 (1100:2000) 1350 (715:1850) 6650 (1650:29000) 1200 (1100:1200) p 1-2=0,83 pl-3=0.01 p4-5=0.02 p4-6=0.63

Лактобактерии (* 10!) 55,5 (4,1;336) 400 (200;4250) 80 (67:350) 96(1:1260) 1450 (500:8600) 150 (20;325) p 1-2=0.02 j) 1-3=0,39 p4-5=0.03 ü4-6=0.91

Эндотоксин 0,01 (0.00:5.13) 0,01 (0,01:0,12) 0,00 (0.00:0.01) 0,04 (0.02:0.06) 0,58 (0.06:1.05) 0,05 (0,00:0,11) pl-2=0,65 p 1-3=0,30 p4-5=0,13 p4-6=0.66

Показатели уровня эндотоксина в сыворотке крови мышей исследуемых линий при двукратном холодовом воздействии варьировали, но статистически значимо не изменялись (табл.1).

Ва1Ь/с

зян

300250200, 150100500-50-100-

ЕП31/9 сут В1/21 сут ЕЭ 2/9 сут ЕЯ 2/21 сут

Ва!Ь/с

ИФН-у

ФНО-а ГМ-КСФ

(ЕЭ 1/9 сут а 1/21 сут ЕЗ 2/9 сут Б532/21 сут

С57В1/6

11/9 сут 3 1/21 сут 32/9 сут 3 2/21 сут

1/9 сут 1/21 сут 2/9 сут 2/21 сут

7000-, I

еооо-5000- щ

1000- Н

3= 3000- §§Щя

2000-

1000- ■ !

-1000- ' 1/9 сут

С57В1/6

ИФН-у

И31/9 сут И1/21 сут £232/9 сут 5332/21 сут

1/9 сут 1/21 сут 2/9 сут 2/21 сут

Рис.7. Изменение уровня продукции цитокинов клетками селезенки мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 при курсовом ежедневном однократном н двукратном холодовом воздействии. Данные представлены в процентах по отношению к контрольной группе, которая приравнена нулю.

1/9 - 9-е сут однократного ХВ 2/9 - 9-е сут двукратного ХВ

1/21 — 21-е сут однократного ХВ 2/21 — 21-е сут двукратного ХВ

Таким образом, выявленные при курсовом однократном и двукратном холодовом воздействии, гистофизиологические изменения тонкой и толстой кишки свидетельствуют о широком функциональном резерве по отношению неблагоприятным факторам внешней среды, вследствие чего дизадаптивные реакции не развиваются. Однако, в связи с отсутствием четких критериев перехода адаптивных изменений в дизадаптивные, вопрос о положительном или отрицательном влиянии холодового воздействия на гистофизиологическое состояние тонкой и толстой кишки мышей сравниваемых линий остается открытым.

Поэтому для решения вопроса о протекторном или дизадаптивном эффекте холодового воздействия у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 моделировали острый язвенный колит на фоне холодового воздействия.

Сравнительная характеристика морфологических проявлений экспериментального острого язвенного колита у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6

В работе использовали разработанную Окауаэи ^ а1. (1990) модель острого язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия.

На 3-й и 5-ые сут у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6, получавших вместо питьевой воды раствор декстрансульфата натрия, был жидкий стул 4-5 типа по Бристольской классификации. В кашицеобразном кале темно-коричневого цвета выявлялась примесь крови. При вскрытии брюшной полости толстая кишка была с участками сужения и расширения, нечетко очерченными зонами темно-красного цвета.

С целью выявления путей распространения и оценки механизмов действия декстрансульфата, проводили исследование тонкой кишки, мезентериальных лимфатических узлов и печени. При гистологическом исследовании микропрепаратов, окрашенных толуидиновым синим, в просвете тонкой кишки, строме ее ворсинок, в звездчатых макрофагах печени (клетках Купфера), лимфатических сосудах, краевых, промежуточных и мозговых синусах лимфатических узлов выявлялись метахроматически окрашенные массы и гранулы декстрана.

При макроскопическом исследовании ободочной кишки у всех 10-ти мышей Ва1Ь/с с острым язвенным колитом выявлены мелкие эрозии и очаги гиперемии. На поверхности слизистой оболочки ободочной кишки у 9-ти из 10-ти мышей С57В1/6 определялись обширные очаги гиперемии и язвы со сгустками крови. У 6-ти из 10-ти мышей С57В1/6 практически вся внутренняя поверхность ободочной кишки была изъязвлена и дно язв было заполнено сгустками крови.

При количественной оценке макроскопических изменений в слизистой оболочке ободочной кишки у мышей сравниваемых линий оказалось, что процесс более выражен у мышей С57В1/6 (рис.8, табл.2). Показатель относительной площади макроскопически визуализируемых

патоморфологических изменений у мышей Ва1Ь/с составлял 0,087 мм2 (р=0,001), а у С5 7В1/6 - 0,218 мм2 (р=0,03).

При микроскопическом исследовании, в слизистой оболочке ободочной кишки у мышей обеих линий наблюдали изменения различной тяжести: очаговые некрозы и эрозии слизистой оболочки, дистрофические и десквамативные изменения колоноцитов, а в участках с сохраненной слизистой оболочкой - увеличение размеров бокаловидных клеток и количества слизи на ее поверхности. В подслизистом слое выявлено расширение просвета лимфатических сосудов, отек и различной степени выраженности диффузная воспалительная инфильтрация лимфоцитами, гистиоцитами и нейтрофилами.

По данным полуколичественной оценки с помощью модифицированной нами шкалы Б. К^а^та (2000), выраженность некротических, экссудативных и воспалительных изменений, тяжесть процесса и его распространенность были выше у мышей С57В1/6 (табл.2).

Таким образом, по данным морфологического исследования у мышей С57В1/6, с преобладанием Тх1 типа иммунного ответа, по сравнению с мышами Balb/c с преобладанием Тх2 типа, патоморфологические проявления острого язвенного колита более выражены.

Механизмы развития декстран-индуцированного колита по данным L.A. Dieleman et al. (1994) связаны с реакциями врожденного иммунитета, так как в развитии воспаления при его воздействии, очевидно, ключевую роль играет повреждение эпителия и активация макрофагов, которые фагоцитируют частицы декстрансульфата. По сравнению с мышами Balb/c, большая выраженность морфологических проявлений колита у мышей С57В1/6 генотипически обусловлена преобладанием Тх1 типа иммунного ответа. Наши данные о большей выраженности воспалительных изменений в толстой кишке у мышей С57В1/6, по сравнению с Balb/c, согласуются с литературными (Melgar S. et al., 2005).

В нашем исследовании, в контрольной группе у мышей Balb/c, по сравнению с С57В1/6, было выявлено достоверно более высокое содержание кортикостерона, который блокирует активацию транскрипционного фактора NF-kB и, тем самым, ингибирует гены воспалительного и иммуного ответа. Кроме того, нами показано, что у мышей Balb/c в толстой кишке более выражен слизистый барьер, который оказывает протективный эффект, препятствуя цитотоксическому действию декстрансульфата, вызывающего повреждение эпителия (Bauer М.Е. et al., 2001).

Сравнительная характеристика морфологические проявлений экспериментального острого язвенного колита на фоне предварительного курсового холодового воздействия у мышей Balb/c и С57В1/6

При моделировании острого язвенного колита на 9-ые сут после ежедневного однократного холодового воздействия, патологический процесс у мышей Balb/c и С57В1/6 был менее выраженным. Показатели относительной площади макроскопических изменений в ободочной кишке при остром язвенном колите на фоне предварительного холодового воздействия были статистически значимо ниже, по сравнению с группой мышей, не подвергавшихся холодовому воздействию (табл.2). Относительная площадь очагов гиперемии и эрозий у мышей С57В1/6 с колитом после холодового воздействия была в 7,7, а у мышей Balb/c - в 3,2 раза ниже, чем у мышей с колитом (рис.8). При сравнении показателей выраженности воспалительного процесса при остром язвенном колите на фоне холодового воздействия у мышей линий Balb/c и С57В1/6 не было выявлено статистически значимых различий по распространенности язв и глубине некрозов (рис.8). В связи с этим можно утверждать, что предшествовавшее развитию колита холодовое воздействие нивелировало различия в реакции слизистой оболочки мышей сравниваемых линий и оказало протективный эффект.

0,35

т *

г1

Т а 0

КВа1Ь/с КС57В1/6

ХВ+К Ва1Ь/с ХВ+КС57В1/6

Рис.8. Относительная площадь (на 1мм2) макроскопически визуализируемых изменений слизистой оболочки ободочной кишки у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 при остром язвенном колите без и после предварительного холодового воздействия. Условные обозначения: К - язвенный колит; ХВ - холодовое воздействие

При полуколичественной оценке выраженности морфологических изменений в ободочной кишке, по сравнению с группой животных без холодового воздействия, у мышей Ва1Ь/с, при остром язвенном колите с предварительным Холодовым воздействием, не выявлено статистически значимых различий по распространенности язв и глубине некрозов, но выраженность отека подслизистого слоя была статистически значимо выше (табл.2). По сравнению с мышами с острым язвенным колитом, в слизистой оболочке мышей С57В1/6 с колитом, моделированным после предварительного холодового воздействия, были статистически значимо ниже показатели распространенности язв, глубины некрозов и отека подслизистого слоя.

При сравнении показателей выраженности воспалительного процесса при остром язвенном колите после предварительного холодового воздействия у мышей линий Ва1Ь/с и С57В1/6 не было выявлено статистически значимых различий по распространенности язв, глубине некрозов. Показатель выраженности отека подслизистого слоя был достоверно выше в ободочной кишке у мышей С57В1/6 (табл.2).

0,30 0.25 0,20 0.15 0,10 0,05 0.00

Таблица 2

Полуколичественная оценка выраженности морфологических проявлений

острого язвенного колита без и с предварительным Холодовым _воздействием у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6, М±5Е_

Группа наблюдений, линии мышей Относительная площадь макроскопически визуализируемых изменений (на 1мм2) Показатели микроскопической полуколичественной оценки изменений (баллы)

Распространенность язв Глубина некрозов Отек и инфильтрация подслизистого слоя

Колит Ва1Ь/с 1 0,087±0,01 0,8±0,1 1,1±0,1 1,6±0,1

С57В1/6 2 0,218±0,03 1,8±0,2 1,8±0,1 3,5±0,1

ХВ+колит Ва1Ь/с 3 0,027±0,01 0,5±0,1 0,8±0,1 2,4±0,1

С57В1/6 4 0,028±0,00 0,6±0,1 0,9±0,1 3,0±0,1

Порог доверительной вероятности р 1,7=0,00 рз^=0,09 р 1.^=0.02 Р2-4=0,00 р 1.7=0.00 РЗ_4=0,53 р 1-з=0,29 Р2-4=0.00 р 1,7=0.00 РЗ-4=0,10 р 1-3=0,06 Р2_4=0,00 р,-7=0.00 р^=0.00 р 1-з=0,00 07-4=0,00

Изменения состава просветной микрофлоры толстой кишки и цитокинового профиля у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 при остром язвенном колите и колите после предварительного холодового воздействия

По результатам микробиологического исследования, количественные показатели просветной микрофлоры у мышей обеих линий при остром язвенном колите снижались, за исключением потенциально патогенного Е. /есшт, уровень которого повышался у мышей С57В1/6. Показатели количественного состава микрофлоры в группе с острым язвенным колитом после предварительного холодового воздействия у мышей обеих линий были выше, чем в группе мышей с острым язвенным колитом без предварительного холодового воздействия, но не достигали контрольных значений.

В цитокиновом профиле у мышей Ва1Ь/с с острым язвенным колитом наблюдалось снижение уровня продукции и секреции клетками селезенки ИФН-у и ИЛ-4, а у мышей С57В1/6 статистически значимых изменений уровня цитокинов не наблюдалось. При остром язвенном колите на фоне холодового воздействия, по сравнению с колитом без предварительного холодового воздействия, у мышей Ва1Ь/с не выявлено изменений в уровне продукции цитокинов клетками селезенки, а у С57В1/6 был достоверно ниже уровень ИЛ-2 и ИФН-у.

Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что холодовое воздействие повышает функциональный резерв толстой кишки, снижает чувствительность к бактериальному антигенному воздействию, уменьшает выраженность воспалительного процесса.

Меньшая выраженность морфологических проявлений декстрансульфат-индуцированного колита после предварительного холодового воздействия может быть обусловлена повышением при холодовом воздействии уровня кортикостерона в сыворотке крови у мышей обеих линий. Кортикостерон, как уже рассматривалось выше, оказывает иммуносупрессорное действие, подавляет продукцию и секрецию провоспалительных цитокинов и ингибирует экспрессию молекул адгезии и рецепторов к цитокинам (Bauer М. Е. et al., 2001). На местном уровне протективный эффект холодового воздействия обусловлен гистофизиологическими адаптивными изменениями слизистой оболочки кишечника, характеризующимися повышением количества МЭЛ и лимфоцитов в составе клеточных элементов СПСО у мышей обеих линий. Активация мукозальной иммунной системы, с одной стороны, обеспечивает восстановление эпителиальной выстилки после повреждения, а с другой стороны, снижает выраженность ответа на бактериальные антигены.

ВЫВОДЫ

1. В норме у мышей-самцов линии Balb/c и С57В1/6 выявлены внутривидовые гистофизиологические различия слизистой оболочки тонкой и толстой кишки. В эпителиальной выстилке тощей и ободочной кишки у мышей Balb\c выше число бокаловидных клеток, а в подвздошной — меньше клеток Панета. Мукозальная иммунная система у мышей Balb\c характеризуется более высокими показателями числа межэпителиальных лимфоцитов, а у C57BI/6 -числа лимфоцитов и нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки.

Уровень кортикостерона в сыворотке крови у мышей Balb/c в 4,8 раза выше, чем у С57В1/6, что соотносится с более низкими показателями числа митозов в криптах тощей кишки у мышей Balb/c.

В составе просветной микрофлоры толстой кишки у мышей Balb/c, по сравнению с С57В1/6, содержится большее число энтерококков E.fecium.

2. Курсовое ежедневное однократное и двукратное холодовое воздействие является для мышей Balb/c и C57BI/6 стрессорным и сопровождается повышением содержания кортикостерона и изменением баланса уровня цитокинов.

3. Курсовое ежедневное однократное холодовое воздействие вызывает у мышей Balb/c и C57BI/6 адаптивные гистофизиологические изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки. В эпителиальной выстилке тощей кишки у мышей Balb/c и С57В1/6 снижается число бокаловидных клеток и клеток Панета, а у мышей С57В1/6 в подвздошной и ободочной кишке увеличивается число энтероэндокринных клеток. Изменения мукозальной иммунной системы у мышей обеих линий характеризуются увеличением числа межэпителиальных лимфоцитов и содержания лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки.

4. Курсовое ежедневное двукратное холодовое воздействие по выраженности и направленности структурных изменений эпителиальной выстилки тонкой и толстой кишки не отличается от однократного и не вызывает развития дизадаптивных, альтеративных и воспалительных изменений. Степень активации мукозальной иммунной системы при двукратном холодовом воздействии более выражена, по сравнению с однократным. Содержание лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки возрастает более чем в два, а толстой кишки - более чем в пять раз у мышей обеих линий.

5. Курсовое ежедневное однократное и двукратное холодовое воздействие у мышей Balb/c и С57В1/6 оказывает положительный эффект на состав микрофлоры толстой кишки, увеличивая количество энтеробактерий и лактобактерий.

6. По сравнению с мышами Balb/c, у мышей С57В1/6 морфологические проявления острого язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия, более выражены. При остром язвенном колите количественные показатели просветной микрофлоры у мышей обеих линий снижаются. Уровень продукции и секреции цитокинов у мышей С57В1/6 не изменяется, а у мышей Balb/c снижается уровень ИФН-у и ИЛ-4.

7. При остром язвенном колите после предварительного холодового воздействия по сравнению с колитом без холодового воздействия, в ободочной кишке у мышей Balb/c и С57В1/6 снижается выраженность эрозивно-язвенного и воспалительного процесса; повышаются показатели количественного состава микрофлоры. У мышей Balb/c цитокиновый профиль не изменяется, а у мышей С57В1/6 снижается уровень продукции ИЛ-2 и ИФН-у.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи, опубликованные в журналах, входящих в список ВАК РФ:

1 .Абдулаева С.О. Морфологическая характеристика слизистой оболочки толстой кишки и микробиоты у мышей Balb\c при адаптации к холодовому воздействию // Морфологические Ведомости. — 2011. — №2 - с. 9-13.

2.Трунова Г.В., Макарова О.В., Диатроптов М.Е., Богданова И.М., Михайлова Л.П., Абдулаева С.О. Морфофункциональная характеристика иммунной системы мышей линии Balb/c и С57В1/6 // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины.-2011. — №1 -с. 112-115.

3.Абдулаева С.О., Хомякова Т.И., Макарова О.В. Гистофизиология тонкой и толстой кишки и уровень стероидных гормонов у мышей-самцов Balb/c и С57В1/6 // Морфологические ведомости. -2012. -№1- с.6-11.

Тезисы и материалы докладов на конференциях:

4.Абдулаева С.О. Характеристика морфологических изменений слизистой оболочки толстой кишки и микробиома мышей Balb/c при холодовом воздействии // Бюллетень Северного государственного медицинского университета. —2011. —№1, вып. XXVI. - с. 190-191.

5.Абдулаева С.О. Морфологические изменения слизистой оболочки толстой кишки и микробиоценоза мышей Ва1Ь/с при холодовой нагрузке // Материалы конференции «Ломоносов». - М., 2011. - С. 278.

6.Абдулаева С.О. Морфологические изменения слизистой оболочки толстой кишки мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 при холодовом воздействии // Материалы конференции «Цитоморфометрия в медицине и биологии: фундаментальные и прикладные аспекты». - М., 2011. - с. 2-4.

7.Абдулаева С.О., Хомякова Т.И. Морфофункционапьная характеристика толстой кишки и изменение микробиома у мышей Ва1Ь/с при холодовом стрессе // Материалы конференции «Актуальные проблемы спортивной морфологии и клинической анатомии». - М., 2010. - с. 36-38.

8.Абдулаева С.О., Краснова В.В., Трунова Г.В., Макарова О.В. Межлинейные различия реакции иммунной системы мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 при холодовом воздействии // Морфология. -2010. - №4, т. 137. - С. 12.

9.Абдулаева С.О., Макарова О.В., Добрынина М.Т., Хомякова Т.И. Структурные изменения толстой кишки и уровень продукции цитокинов при холодовом воздействии у мышей Ва1Ь/с // Медицинская иммунология. - 2011. -№4-5, т. 13. - с. 303-304.

Ю.Макарова О.В., Хомякова Т.И., Абдулаева С.О., Данилевская М.М., Магомедова А.Д., Хомякова Ю.Н. Эффект холодового воздействия на состояние микробиома мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 в модели острого экспериментального колита // Материалы IV ежегодного всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - М., 2012. - С. 233.

П.Хомякова Т.И., Абдулаева С.О., Магомедова А.Д., Чертович Н.Ф., Хомякова Ю.Н., Макарова О.В. Изменение некоторых параметров микрофлоры мышей С57В1/6 при развитии острого и хронического экспериментального колита // Материалы IV ежегодного всероссийского конгресса по инфекционным болезням. - М., 2012. - с. 412-413.

12.Абдулаева С.О., Макарова О.В., Хомякова Т.И., Мхитаров В.А., Кирюхин С.О., Добрынина М.Т. Сравнительное исследование морфологических, иммунологических и микробиологических проявлений экспериментального острого язвенного колита у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 // Актуальные вопросы морфогенеза в норме и патологии. - М., 2012.-е 3-6.

13. Абдулаева С.О., Кирюхин С.О., Белоусова Т.А., Хомякова Т.И., Черников В.П., Макарова О.В. Морфологическая характеристика острого язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия, у мышей Ва1Ь/с // Клиническая и экспериментальная морфология. - 2012. - №3 - с. 40-51.

Соискатель

С.О. Абдулаева

Подписано в печать 17.10.2012 Формат 60x88 1/16. Объем 1.0 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 1254 Отпечатано в ООО «Соцветие красок» 119991 г.Москва, Ленинские горы, д.1 Главное здание МГУ, к. А-102

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Абдулаева, Сабина Олеговна

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1. Гистофизиология тонкой и толстой кишки как барьерных органов.

2. Современные представления о роли микрофлоры в физиологическом функционировании толстой кишки.

3. Механизмы стресса. Роль стресса в развитии синдрома раздраженной кишки.

4. Сравнительная характеристика мышей линии Ва1Ь/с и С57В1/6.

5. Экспериментальная модель острого язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Гистофизиология слизистой оболочки тонкой и толстой кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 при стрессорном холодовом воздействии"

По данным литературы, в инициальных механизмах развития синдрома раздраженной кишки и воспалительных заболеваний кишечника важную роль играют стрессорные воздействия (Kim J.J. et al., 2012). Влияние физиологического стресса на состояние нервной, эндокринной и иммунной системы в литературе освещено достаточно широко (Захарова Л.А. и др., 2010; Трунова Г.В. и др., 2011). Однако гистофизиологические изменения тонкой и толстой кишки при стрессорных воздействиях недостаточно изучены. Выраженность реакции организма на стрессорные воздействия зависит от генотипа и влияния различных факторов внешней среды (Matrison J., 2010; Gersemann М. et al., 2012). Для понимания генотипически обусловленных внутривидовых различий адаптивных и дизадаптивных реакций, воспалительных процессов, развивающихся в тонкой и толстой кишке, необходимо их изучение на линейных животных. Механизмы внутривидовой устойчивости к стрессу и, в частности, к холодовому, изучаются на линейных животных, и наибольшее число работ выполнено на мышах Balb/c и С57В1/6, у которых при стрессорных воздействиях развивается, соответственно, толерантная или резистентная адаптивная реакция (Кондашевская М.В. и соавт., 2004; Трунова Г.В. и др., 2011; Guo Y. et al., 2012; Weber E. et al., 2012).

Для изучения механизмов развития воспалительного процесса в толстой кишке используется модель острого язвенного колита, разработанная Okayasy et al. (1990). По данным экспериментальных исследований, выраженность морфологических проявлений язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия, зависит от генотипа: у мышей С57В1/6 с преобладанием Тх1 типа иммунного ответа его выраженность выше, чем у мышей Balb/c с преобладанием Тх2 типа иммунного ответа (Melgar S. et al., 2005; Nakanishi M. et al., 2007).

Следует отметить, что гистофизиологические изменения тонкой и толстой кишки при стрессорных воздействиях и воспалительных процессах в зависимости от преобладания клеточного или гуморального типа иммунного ответа у - человека недостаточно изучены, что диктует необходимость проведения экспериментальных исследований на линейных животных.

Поэтому целью исследования было изучение гистофизиологических изменений слизистой оболочки тонкой и толстой кишки у мышей Balb\c и С57В1\6 при стрессорном холодовом воздействии.

Задачи исследования:

Провести сравнительное исследование гистофизиологических особенностей тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови самцов-мышей Balb/c и С57В1/6 в норме.

Изучить морфофункциональные изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры толстой кишки, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови, а также цитокинового профиля у мышей Balb/c и С57В1/6 на 9-е и 21-е сутки ежедневного однократного холодового воздействия.

Провести оценку морфофункциональных изменений слизистой оболочки тонкой и толстой кишки, состава просветной микрофлоры толстой б кишки, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови и цитокинового профиля у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 на 9-е и 21-е сутки ежедневного двукратного холодового воздействия.

Провести сравнительную оценку изменений структурных компонентов тонкой и толстой кишки, просветной микрофлоры, уровня кортикостерона и эндотоксина в сыворотке крови и цитокинового профиля в разные сроки при однократном и двукратном холодовом воздействии.

На модели острого язвенного колита, вызванного декстрансульфатом натрия, изучить у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 патоморфологические изменения толстой кишки, оценить состояние ее просветной микрофлоры и цитокинового профиля.

Оценить выраженность патоморфологических проявлений острого язвенного колита, состава просветной микрофлоры толстой кишки и цитокинового профиля у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6, которых подвергали предварительному стрессорному холодовому воздействию.

Научная новизна. Впервые охарактеризованы гистофизиологические различия тонкой и толстой кишки у мышей-самцов Ва1Ь/с и С57В1У6. В условиях физиологического функционирования, по сравнению с мышами С57В1/6, у мышей линии Ва1Ь/с в тощей и ободочной кишке более выражен слизистый барьер. Мукозальная иммунная система у мышей Ва1Ь/с характеризуется высокими показателями числа межэпителиальных лимфоцитов, а у С57В1/6 - числа лимфоцитов и нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки тонкой и толстой кишки. В составе просветной микрофлоры у мышей Ва1Ь/с выше уровень условно-патогенных энтерококков Е./есшт.

Курсовое ежедневное однократное и двукратное стрессорное холодовое воздействие вызывает у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 адаптивные гистофизиологические изменения слизистой оболочки тонкой и толстой 7 кишки, характеризующиеся снижением числа визуализируемых бокаловидных клеток и клеток Панета. В подвздошной и ободочной кишке у мышей С57В1/6 увеличивается число энтероэндокринных клеток. У мышей обеих линий однонаправленно изменяется состояние мукозальной иммунной системы, увеличивается показатель числа межэпителиальных лимфоцитов и лимфоцитов в составе клеточных элементов собственной пластинки слизистой оболочки.

Стрессорное холодовое воздействие оказывает протективный эффект при индуцированном декстрансульфатом натрия остром язвенном колите у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6, за счет противовоспалительного действия кортикостерона, уровень которого в сыворотке крови повышается при холодовом воздействии. Морфологические проявления острого язвенного колита при предварительном курсовом ежедневном холодовом воздействиии менее выражены у мышей обеих линий.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Клеточная биология, цитология, гистология", Абдулаева, Сабина Олеговна

выводы

1. В норме у мышей-самцов линии Ва1Ь/с и С57В1/6 выявлены внутривидовые гистофизиологические различия слизистой оболочки тонкой и толстой кишки. В эпителиальной выстилке тощей и ободочной кишки у мышей Ва1Ыс выше число бокаловидных клеток, а в подвздошной - меньше клеток Панета. Мукозальная иммунная система у мышей Ва1Ь\с характеризуется более высокими показателями числа межэпителиальных лимфоцитов, а у С57В1/6 - числа лимфоцитов и нейтрофилов в собственной пластинке слизистой оболочки.

Уровень кортикостерона в сыворотке крови у мышей Ва1Ь/с в 4,8 раза выше, чем у С57В1/6, что соотносится с более низкими показателями числа митозов в криптах тощей кишки у мышей Ва1Ь/с.

В составе просветной микрофлоры толстой кишки у мышей Ва1Ь/с, по сравнению с С57В1/6, содержится большее число энтерококков Е./есшт.

2. Курсовое ежедневное однократное и двукратное холодовое воздействие является для мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 стрессорным и сопровождается повышением содержания кортикостерона и изменением баланса уровня цитокинов.

3. Курсовое ежедневное однократное холодовое воздействие вызывает у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 адаптивные гистофизиологические изменения слизистой оболочки тонкой и толстой кишки. В эпителиальной выстилке тощей кишки у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 снижается число бокаловидных клеток и клеток Панета, а у мышей С 57В1/6 в подвздошной и ободочной кишке увеличивается число энтероэндокринных клеток. Изменения мукозальной иммунной системы у мышей обеих линий характеризуются увеличением числа межэпителиальных лимфоцитов и содержания лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки.

4. Курсовое ежедневное двукратное холодовое воздействие по выраженности и направленности структурных изменений эпителиальной

159 выстилки тонкой и толстой кишки не отличается от однократного и не вызывает развития дизадаптивных, альтеративных и воспалительных изменений. Степень активации мукозальной иммунной системы при двукратном холодовом воздействии более выражена, по сравнению с однократным. Содержание лимфоцитов в собственной пластинке слизистой оболочки тонкой кишки возрастает более чем в два, а толстой кишки - более чем в пять раз у мышей обеих линий.

5. Курсовое ежедневное однократное и двукратное холодовое воздействие у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 оказывает положительный эффект на состав микрофлоры толстой кишки, увеличивая количество энтеробактерий и лактобактерий.

6. По сравнению с мышами Ва1Ь/с, у мышей С57В1/6 морфологические проявления острого язвенного колита, индуцированного декстрансульфатом натрия, более выражены. При остром язвенном колите количественные показатели просветной микрофлоры у мышей обеих линий снижаются. Уровень продукции и секреции цитокинов у мышей С57В1/6 не изменяется, а у мышей Ва1Ь/с снижается уровень ИФН-у и ИЛ-4.

7. При остром язвенном колите после предварительного холодового воздействия по сравнению с колитом без холодового воздействия, в ободочной кишке у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 снижается выраженность эрозивно-язвенного и воспалительного процесса; повышаются показатели количественного состава микрофлоры. У мышей Ва1Ь/с цитокиновый профиль не изменяется, а у мышей С 57В1/6 снижается уровень продукции ИЛ-2 и ИФН-у.

Заключение

По данным литературы в развитии ряда заболеваний желудочно-кишечного тракта - СРК, болезнь Крона и хронический неспецифический язвенный колит, важную роль играет стрессорное воздействие. Влияние стресса на состояние нервной, эндокринной и иммунной системы интенсивно изучается, но данные о гистофизиологических особенностях тонкой и толстой кишки при стрессорных нагрузках в литературе отсутствуют. Важным аспектом изучения влияния стресса на интегративные системы, различные органы и ткани, являются внутривидовые различия, так как они определяют выраженность реакции. Изучение внутривидовых структурно-функциональных различий реакции на стрессорное воздействие проводится, главным образом, на экспериментальных моделях. Для оценки внутривидовых различий стрессорных реакций, воспалительных и иммунологических процессов широко используются линейные мыши Ва1Ь/с (стрессустойчивые) и С57В1/6 (стресснеустойчивые), с преобладанием, соответственно, Тх2 и Тх1 типа иммунного ответа.

В связи с изложеным, нами была сформулирована цель исследования -изучение морфофункциональных изменений слизистой оболочки тонкой и толстой кишки у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 в условиях физиологического функционирования, при стрессорном холодовом воздействии и остром язвенном колите. Анализ современной литературы показывает, что барьерная функция тонкой и толстой кишки определяется, главным образом, состоянием следующих компартментов: микробиоценозом, эпителиальной выстилкой и мукозальной иммунной системой. Поэтому при планировании работы нами использованы методологические подходы и методы, позволяющие адекватно оценить состояние указаных компартментов слизистой оболочки тонкой и толстой кишки.

Общая характеристика материала

В работе использовали половозрелых самцов мышей Ва1Ь\с (п=70) и С57В1\6 (п=70), полученных из питомника «Столбовая». Возраст мышей составил 9-10 нед, масса тела 23-25г.

При работе с экспериментальными животными руководствовались приказом Минздрава СССР №755 от 12.08.1977г. На проведение эксперимента получено разрешение биоэтической комиссии ФГБУ «НИИ морфологии человека» РАМН (протокол №7 от 20.12.2009 г.).

Для решения вопроса о протективном или дизадаптивном характере реакций, вызываемых Холодовым воздействием, у мышей Ва1Ь\с и С57В1\6 после 9-ти сут однократного холодового воздействия воспроизводили по I.

Окауаэи е1 а1. (1990) модель колита, индуцированного декстрансульфатом натрия. Исследование проводили на трех группах мышей обеих линий - с острым язвенным колитом; с острым язвенным колитом на фоне предварительного холодового воздействия; контрольная группа. Мыши первой группы с питьевой водой получали декстрансульфат натрия молекулярная масса 10000; Р1ика): 5% раствор в течение 4-х сут и 7% раствор в течение последующих 3-х сут. Вторая группа мышей получала

43 раствор декстрансульфата натрия в указанных концентрациях и режиме после 9 сут однократного холодового воздействия (табл.1). Методы исследования

1. Гистологические методы

Для гистологического исследования проводили забор фрагментов тощей, подвздошной и среднего отдела ободочной кишки у животных опытных и контрольных групп. Фрагменты органов фиксировали в растворе Буэна и жидкости Копш-Рего с целью лучшей визуализации клеток Панета. Образцы тканей проводили по спиртовым растворам возрастающих концентраций, заливали в парафин, изготовляли срезы и окрашивали их гематоксилином и эозином.

2. Гистохимические методы

Для выявления в составе секрета бокаловидных клеток тонкой и толстой кишки кислых гликопротеинов использовали окраску алъциановым синим, нейтральных гликопротеинов - PAS-реакцию.

С целью выявления гранул декстрансульфата в просвете кишки, брыжеечных лимфатических узлах и печени материал фиксировали в жидкости Карнуа и гистологические срезы окрашивали толуидиновым синим (рН 2,0).

3. Иммуногистохимические методы

Для выявления энтероэндокринных клеток использовали антитела к хромогранину A (Rabbit polyclonal to Chromogranin A, Abeam), которые применяли в рекомендованном производителем титре 1:100, при инкубации 18 ч (при температуре 12°С). Вторые антитела (HRP-Goat Anti-Rabbit IgG, Invitrogen) использовали в титре 1:100, срезы инкубировали 18 ч (12°С). Для визуализации реакции применяли набор Dako EnVision-HRP (DAB).

4. Морфометрические методы

При морфометрическом исследовании с помощью сетки Г.Г. Автандилова (1973) определяли соотношение объемной доли энтероцитов и

44 бокаловидных клеток, объемной доли стромы и клеточных элементов в СПСО ободочной кишки. Проводили дифференцированный подсчет клеточных элементов (на 1000 клеток) в СПСО тощей, подвздошной и ободочной кишки, с определением относительного количества нейтрофилов и лимфоцитов; подсчет числа МЭЛ на 1000 эпителиоцитов в СПСО тощей и подвздошной кишки. Определяли количество митозов (на 1000 клеток крипт) в тощей, подвздошной и ободочной кишке. Подсчитывали число бокаловидных клеток на ворсинку в тощей и подвздошной кишке и на крипту в ободочной кишке; визуализируемых клеток Панета на крипту тощей и подвздошной кишки; энтероэндокринных клеток на ворсинку и крипту тощей и подвздошной кишки, на крипту ободочной кишки.

В гистологических срезах ободочной кишки животных с острым язвенным колитом, индуцированным декстрансульфатом натрия, полуколичественно (в баллах) оценивали выраженность морфологических изменений слизистой оболочки по ряду критериев. Распространенность язв: 0 - отсутствует; 1 - площадь язвы занимает 10-20% поля зрения; 2 - площадь язвы занимает 21-50% поля зрения; 3 - площадь язвы занимает 51-80% поля зрения; 4 - площадь язвы занимает все поле зрения. Глубина некроза: 0 -отсутствует; 1 - некроз 1/3 высоты крипты; 2 - некроз 2/3 высоты крипты; 3 -тотальный некроз слизистой оболочки. Выраженность отека подслизистого слоя: 0 - отсутствует; 1 - подслизистый слой, шириной не более, чем в два раза больше, по сравнению с нормой; 2 - подслизистый слой, шириной не более, чем в три раза больше, по сравнению с нормой; 3 - подслизистый слой, шириной более, чем в три раза и наличие в нем воспалительной инфильтрации нейтрофилами; 4 - сочетание указанных выше изменений с резко выраженным отеком и выраженной диффузно-очаговой инфильтрации нейтрофилами.

Для морфометрической оценки площади кровоизлияний и язв в макро препаратах продольно рассеченной ободочной кишки мышей с

45 декстрансульфатиндуцированным колитом проводили фотографирование препаратов и подсчет с помощью морфометрической программы Image-Pro.

5. Культуральные методы

С целью изучения цитокинового профиля из селезенки мышей контрольных и опытных групп выделяли клетки с помощью стеклянного гомогенизатора Поттера. Выделенные клетки центрифугировали два раза в среде для отмывки (среда 199) 5 мин при 200G. Количество живых клеток определяли при подсчете в камере Горяева.

Для индукции продукции цитокинов суспензию клеток селезенки культивировали 24 часа в 1мл полной ростовой среды с добавлением конканавалина А (5 мкг/мл) в 24луночных культуральных панелях при 37°С в атмосфере 5% СО?. По окончании инкубации отбирали надосадки, которые хранили при -20°С не более трех месяцев. Среда для культивирования состояла из RPMI 1640 с добавлением 5% фетальной сыворотки и антибиотиков.

6. Иммуноферментный анализ

Для определения уровня кортикостерона использовали набор Corticosterone ELISA IBL International GMBH. Определение уровня эндотоксина в сыворотке крови проводили с использованием набора Hycult Biotech LAL.

7. Метод проточной цитофлюориметрии

В культуральной жидкости спленоцитов, активированных конканавалином А, определяли уровень цитокинов - ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-5, ИЛ-6, ИЛ-10, ИЛ-4, ИЛ-17, ИФН-у, ФНО-а, ГМ-КСФ методом проточной цитофлюориметрии с использованием набора mouse Thl/Th2 lOplex BMS820FF BenderMedSystems на приборе CytomicsFC500 «BeckmanCoulter» США.

8. Бактериологические методы

Оценку состояния микрофлоры толстой кишки проводили путем высева на соответствующие питательные среды (ШМесИа, Индия) десятичных разведений гомогената фекалий, взятых из прямой кишки, в физиологическом растворе, после инкубирования и периодического встряхивания в течение 40 мин по следующим параметрам: уровень лактозоположительных и лактозоотрицательных энтеробактерий, уровень энтерококков (Е. /аесаШ /есшт), уровень лактобактерий. Результаты посевов пересчитывали и представляли в виде количества колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 грамм фекалий. Определение видовой принадлежности микрофлоры на основании данных, полученных с использованием идентификационных наборов «Микро-Ла-Тест» (совместно со ст.н.сотр. лаборатории молекулярной микроэкологии к.м.н. Т.И. Хомяковой).

9. Статистические методы

Статистическую обработку показателей проводили с учетом характера распределения параметрическими (^критерий Стьюдента) и непараметрическими методами (11-критерий Манн-Уитни). Различия считали достоверными при р<0,05.

Схема эксперимента

I Однократное холодовое воздействие

9-е сут 21-е сут

Двукратное холодовое воздействие i 1 1

Опытные Контрольные Опытные группы группы группы

Контрольные группы V

9-е сут

21-е сут

Острый язвенный колит

Опытные группы

Контрольные группы

Ва1Ь/с п=10

IV Однократное холодовое воздействие (9 сут) +

Острый язвенный колит

Опытные группы

Контрольные группы

Ва1Ь/с п=10

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Абдулаева, Сабина Олеговна, Москва

1. Автандилов Г. Г. Морфометрия в патологии // М.: Медицина, 1973. 247с.

2. Алов И. А. Очерки физиологии митотического деления клеток// М.: Медицина, 1964. 302 с.

3. Ашмарин И. П., Ляпина Л. А., Пасторова В. Е. Модуляция гемостатических реакций in vitro и in vivo представителями семейства регуляторных пептидов // Вестн. РАМН. 1996. № 6, с. 50-58.

4. Билимова С. И. Характеристика факторов персистенции энтерококка // Журн. микробиол. 2000. №4, с. 104-105.

5. Бондаренко В. М., Мацулевич Т. В. Дисбактериоз кишечника как клинико-лабораторный синдром ¡современное состояние проблемы//М: ГЭОТАР-Медиа, 2007. 304 с.

6. Горизонтов П. Д., Белоусова О. И., Федотова М. И. Стресс и система крови// М: Медицина, 1983. 224 с.

7. Ермоленко Е.И., Черныш А.Ю., Колобов A.A., Суворов А.Н. Влияние синтетических индукторов пептидов на антибактериальную активность энтерококков // Benef Microbes. 2011. т. 2, №1 с. 9-13.

8. Захарова Л. А. Взаиморегуляция развития нейроэндокринной и иммунной систем // Онтогенез. 2010. т.41, №6 с. 414-424.

9. Ивашкин В. Т., Рапопорт С. И., Шептулин А. А. Достижения и перспективы развития клинической гастроэнтерологии // Клиническая мед.-2010. №4, с. 17-22.

10. П.Козырева Т. В., Елисеева Л. С. Иммунный ответ и состав кортикостеронов при различных режимах холодового воздействия // Бюл. экспер. биол. и мед. 2002. т. 133, №4 с. 384-387.

11. Костюкевич С. В. Эндокринные клетки эпителия слизистой оболочки каудальной части кишечника сизого голубя // Морфология. 2003. -т. 123, №3 с. 74-78.

12. Рябиченко Е. В., Бондаренко В. М. Роль кишечной бактериальной аутофлоры и ее эндотоксина в патологии человека // Журн. микробиол. -2007. №3 с. 103-111.

13. Сергеева С. П., Ерофеева Л. М., Сапин М. Р., Коплик Е. В. Морфологические характеристики тимуса крыс вистар в условиях экспериментального внутримозгового кровоизлияния // Морфология. -2010. т. 137, №2 с. 35-38.

14. Середенин С. Б., Лапицкая А. С., Надоров С. А., Кудрин В. С.Бадиштов Б. А. Многомерная оценка межлинейных различий в обмене моноаминов в мозге мышей С57В1/6 и Ва1Ь/с // Бюл. экспер. биол. и мед. 2000. - т. 129, №5 с. 487-490.

15. Серов В. В. Воспаление// М: Медицина, 1995. С.

16. Стоянова Л. Г., Устюгова Е. А., Нетрусов А. И. Антибактериальные метаболиты молочнокислых бактерий: их разнообразие и свойства // Прикл. Биохим. и Микробиол. 2012. - т.48, №3 с. 259-275.

17. Тертычный А. С., Андреев А. И., Карэл Г. Современные подходы к морфологической диагностике воспалительных заболеваний кишечника на материале эндоскопических биопсий // Архив патологии. 2011. №1, с. 40-47.

18. Трунова Г. В. Морфофункциональная характеристика популяций тучных клеток у мышей Ва1Ь/с и С57В1/6 при холодовом воздействии // Бюл. экспер. биол. и мед. 2004. т. 138, №2 с. 182-184.

19. Трунова Г. В., Макарова О. В., Диатроптов М. Е., Богданова И. М., Михайлова Л. П.Абдулаева С. О. Морфофункциональная характеристика иммунной системы мышей линий Ва1Ь/с и С57В1/6 // Бюл. экспер. биол. и мед. 2011. т.151,№1 с. 99-102.

20. Трушина Е. Н., Мустафина О. К.Никитюк Д. Б. Лимфоидная система кишечника и иммуномодулирующее действие пребиотиков // Вопр. питан. 2004. т. 73, №6 с. 49-53.

21. Учакин П. Н., Учакин О. Н., Тобин Б. В.Ершов Ф. И. Нейроэндокринная иммуномодуляция // Вестн. Рос. Акад. Мед. Наук. 2007. № 9 с. 26-32.

22. Хаитов Р. М., Лесков В. П. Иммунитет и стресс // Рос. Физиол. Ж Им. И. М. Сеченова. 2001. т.87, №8 с. 60-72.

23. Яглов В. В., Яглова Н.В. Нерешенные проблемы нормальной и патологической морфологии диффузной эндокринной системы // Архив патологии. 2011. № 5, с. 58-62.

24. Adnyane I. K., Zuki A. B., Noordin M. M.Agungpriyono S. Immunohistochemical study of endocrine cells in the gastrointestinal tract of the barking deer, Muntiacus muntjak // Anat Histol Embryol. 2011. - Vol. 40, № 5, p. 365-374.

25. Alahmed S.Herbert J. Strain differences in proliferation of progenitor cells in the dentate gyrus of the adult rat and the response to fluoxetine are dependent on corticosterone // Neuroscience. 2008. - Vol. 157, № 3, p. 677-682.

26. Atarashi K., Umesaki Y.Honda K. Microbiotal influence on T cell subset development // Semin Immunol. 2011. - Vol. 23, № 2, p. 146-153.

27. Bartolomucci A. Social stress, immune functions and disease in rodents // Front Neuroendocrinol. 2007. - Vol. 28, № 1, p. 28-49.

28. Bauer M. E., Perks P., Lightman S. L.Shanks N. Are adhesion molecules involved in stress-induced changes in lymphocyte distribution? // Life Sci. -2001. Vol. 69, № 10, p. 1167-1179.

29. Belkaid Y.Oldenhove G. Tuning microenvironments: induction of regulatory T cells by dendritic cells // Immunity. 2008. - Vol. 29, № 3, p. 362-371.

30. Belzung C.Griebel G. Measuring normal and pathological anxiety-like behaviour in mice: a review // Behav Brain Res. 2001. - Vol. 125, № 1-2, p. 141-149.

31. Bian Z., Guo Y., Ha B., Zen K.Liu Y. Regulation of the inflammatory response: enhancing neutrophil infiltration under chronic inflammatory conditions //J Immunol. 2012. - Vol. 188, № 2, p. 844-853.

32. Bjerknes M., Khandanpour C., Moroy T., Fujiyama T., Hoshino M., Klisch T. J., Ding Q., Gan L., Wang J., Martin M. G.Cheng H. Origin of the brush cell lineage in the mouse intestinal epithelium // Dev Biol. 2012. - Vol. 362, № 2, p. 194-218.

33. Blaut M. Relationship of prebiotics and food to intestinal microflora // Eur J Nutr. 2002. - Vol. 41 Suppl 1, p. 111-16.

34. Boirivant M., Fuss I. J., Chu A.Strober W. Oxazolone colitis: A murine model of T helper cell type 2 colitis treatable with antibodies to interleukin 4 // J Exp Med. 1998. - Vol. 188, № 10, p. 1929-1939.

35. Brandtzaeg P. The gut as communicator between environment and host: immunological consequences // Eur J Pharmacol. 2011. - Vol. 668 Suppl 1, p. S16-32.

36. Brinks V., de Kloet E. R.Oitzl M. S. Corticosterone facilitates extinction of fear memory in BALB/c mice but strengthens cue related fear in C57BL/6 mice // Exp Neurol. 2009. - Vol. 216, № 2, p. 375-382.

37. Brugman S.Nieuwenhuis E. E. Mucosal control of the intestinal microbial community // J Mol Med (Berl). 2010. - Vol. 88, № 9, p. 881-888.

38. Buller N. V., Rosekrans S. L., Westerlund J.van den Brink G. R. Hedgehog signaling and maintenance of homeostasis in the intestinal epithelium // Physiology (Bethesda). 2012. - Vol. 27, № 3, p. 148-155.

39. Callihan P., Mumaw J., Machacek D. W., Stice S. L.Hooks S. B. Regulation of stem cell pluripotency and differentiation by G protein coupled receptors // Pharmacol Ther. 2011. - Vol. 129, № 3, p. 290-306.

40. Campbell J. H., Foster C. M., Vishnivetskaya T., Campbell A. G., Yang Z. K., Wymore A., Palumbo A. V., Chesler E. J.Podar M. Host genetic and environmental effects on mouse intestinal microbiota // ISME J. 2012. - Vol. № p.

41. Chang F., Mahadeva U.Deere H. Pathological and clinical significance of increased intraepithelial lymphocytes (IELs) in small bowel mucosa // APMIS.- 2005. Vol. 113, № 6, p. 385-399.

42. Cheroutre H., Lambolez F.Mucida D. The light and dark sides of intestinal intraepithelial lymphocytes // Nat Rev Immunol. 2011. - Vol. 11, № 7, p. 445-456.

43. Choy S. W.Cheng S. H. Hedgehog signaling // Vitam Horm. 2012. - Vol. 88, p. 1-23.

44. Cieza R. J., Cao A. T., Cong Y.Torres A. G. Immunomodulation for gastrointestinal infections // Expert Rev Anti Infect Ther. 2012. - Vol. 10, № 3, p. 391-400.

45. Clevers H.Nusse R. Wnt/beta-catenin signaling and disease // Cell. 2012. -Vol. 149, №6, p. 1192-1205.

46. Cohen S., Janicki-Deverts D., Doyle W. J., Miller G. E., Frank E., Rabin B. S.Turner R. B. Chronic stress, glucocorticoid receptor resistance, inflammation, and disease risk // Proc Natl Acad Sci U S A. 2012. - Vol. 109, № 16, p. 5995-5999.

47. Corr S. C., Gahan C. C.Hill C. M-cells: origin, morphology and role in mucosal immunity and microbial pathogenesis // FEMS Immunol Med Microbiol. 2008. - Vol. 52, № 1, p. 2-12.

48. Crosnier C., Stamataki D.Lewis J. Organizing cell renewal in the intestine: stem cells, signals and combinatorial control // Nat Rev Genet. 2006. - Vol. 7, № 5, p. 349-359.

49. Depaolo R. W., Kamdar K., Khakpour S., Sugiura Y., Wang W.Jabri B. A specific role for TLR1 in protective TH17 immunity during mucosal infection // The Journal of experimental medicine. 2012. - Vol. 209, № 8, p. 14371444.

50. Dulawa S. C., Holick K. A., Gundersen B.Hen R. Effects of chronic fluoxetine in animal models of anxiety and depression // Neuropsychopharmacology. -2004. Vol. 29, № 7, p. 1321-1330.

51. El Hage W., Peronny S., Griebel G.Belzung C. Impaired memory following predatory stress in mice is improved by fluoxetine // Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 2004. - Vol. 28, № 1, p. 123-128.

52. Elphick D. A.Mahida Y. R. Paneth cells: their role in innate immunity and inflammatory disease // Gut. 2005. - Vol. 54, № 12, p. 1802-1809.

53. Escher J. C., ten K. F., Lichtenbelt K., Schornagel I., Buller H., Derkx B.Taminiau J. Value of rectosigmoidoscopy with biopsies for diagnosis of inflammatory bowel disease in children // Inflamm Bowel Dis. 2002. - Vol. 8, № 1, p. 16-22.

54. Fevr T., Robine S., Louvard D.Huelsken J. Wnt/beta-catenin is essential for intestinal homeostasis and maintenance of intestinal stem cells // Mol Cell Biol. 2007. - Vol. 27, № 21, p. 7551-7559.

55. Fre S., Bardin A., Robine S.Louvard D. Notch signaling in intestinal homeostasis across species: the cases of Drosophila, Zebrafish and the mouse // Exp Cell Res. 2011. - Vol. 317, № 19, p. 2740-2747.

56. Friswell M., Campbell B.Rhodes J. The role of bacteria in the pathogenesis of inflammatory bowel disease // Gut Liver. 2010. - Vol. 4, № 3, p. 295-306.

57. Gersemann M., Wehkamp J.Stange E. F. Innate immune dysfunction in inflammatory bowel disease // J Intern Med. 2012. - Vol. 271, № 5, p. 421428.

58. Gill B. M., Knapp C. M.Kornetsky C. The effects of cocaine on the rate independent brain stimulation reward threshold in the mouse // Pharmacol Biochem Behav. 2004. - Vol. 79, №l,p. 165-170.

59. Grigat J., Soruri A., Forssmann U., Riggert J.Zwirner J. Chemoattraction of macrophages, T lymphocytes, and mast cells is evolutionarily conserved within the human alpha-defensin family // J Immunol. 2007. - Vol. 179, № 6, p. 3958-3965.

60. Henderson B.Wilson M. Cytokine induction by bacteria: beyond lipopolysaccharide // Cytokine. 1996. - Vol. 8, № 4, p. 269-282.

61. Inagaki-Ohara K., Sawaguchi A., Suganuma T., Matsuzaki G.Nawa Y. Intraepithelial lymphocytes express junctional molecules in murine small intestine // Biochem Biophys Res Commun. 2005. - Vol. 331, № 4, p. 977983.

62. Ismail A. S., Behrendt C. L.Hooper L. V. Reciprocal interactions between commensal bacteria and gamma delta intraepithelial lymphocytes during mucosal injury // J Immunol. 2009. - Vol. 182, № 5, p. 3047-3054.

63. Johansson M. E., Phillipson M., Petersson J., Velcich A., Holm L.Hansson G. C. The inner of the two Muc2 mucin-dependent mucus layers in colon is devoid of bacteria // Proc Natl Acad Sci USA.- 2008. Vol. 105, № 39, p. 15064-15069.

64. Karp C. L. Unstressing intemperate models: how cold stress undermines mouse modeling // J Exp Med. 2012. - Vol. 209, № 6, p. 1069-1074.

65. Kawada M., Arihiro A.Mizoguchi E. Insights from advances in research of chemically induced experimental models of human inflammatory bowel disease // World J Gastroenterol. 2007. - Vol. 13, № 42, p. 5581-5593.

66. Kelly P., Feakins R., Domizio P., Murphy J., Bevins C., Wilson J., McPhail G., Poulsom R.Dhaliwal W. Paneth cell granule depletion in the human small intestine under infective and nutritional stress // Clin Exp Immunol. 2004. -Vol. 135, №2, p. 303-309.

67. Keshav S. Paneth cells: leukocyte-like mediators of innate immunity in the intestine // J Leukoc Biol. 2006. - Vol. 80, № 3, p. 500-508.

68. Khan W. I.Ghia J. E. Gut hormones: emerging role in immune activation and inflammation // Clin Exp Immunol. 2010. - Vol. 161, № 1, p. 19-27.

69. Kim J. J., Shajib M. S., Manocha M. M.Khan W. I. Investigating intestinal inflammation in DSS-induced model of IBD // J Vis Exp. 2012. - Vol. № 60, P

70. Kitajima S., Takuma S.Morimoto M. Histological analysis of murine colitis induced by dextran sulfate sodium of different molecular weights // Exp Anim. -2000.-Vol. 49, № 1, p. 9-15.

71. Kraehenbuhl J. P.Neutra M. R. Epithelial M cells: differentiation and function // Annu Rev Cell Dev Biol. 2000. - Vol. 16, p. 301-332.

72. Kwon K. H., Ohigashi H.Murakami A. Dextran sulfate sodium enhances interleukin-1 beta release via activation of p38 MAPK and ERK1/2 pathways in murine peritoneal macrophages // Life Sci. 2007. - Vol. 81, № 5, p. 362371.

73. Lan R. Y., Mackay I. R.Gershwin M. E. Regulatory T cells in the prevention of mucosal inflammatory diseases: patrolling the border // J Autoimmun. 2007. -Vol. 29, № 4, p. 272-280.

74. Li J., Wang Q., Chai W., Chen M. H., Liu Z.Shi W. Hyperglycemia in apolipoprotein E-deficient mouse strains with different atherosclerosis susceptibility // Cardiovasc Diabetol. 2011. - Vol. 10, № p. 117.

75. Liu W., Li J., Tian W., Xu T.Zhang Z. Chronic alcohol consumption induces cardiac remodeling in mice from Thl or Th2 background // Exp Mol Pathol. -2011,-Vol. 91, №3, p. 761-767.

76. Louvel D., Delvaux M., Staumont G., Camman F., Fioramonti J., Bueno L.Frexinos J. Intracolonic injection of glycerol: a model for abdominal pain in irritable bowel syndrome? // Gastroenterology. 1996. - Vol. 110, № 2, p. 351361.

77. Lugering A.Kucharzik T. Induction of intestinal lymphoid tissue: the role of cryptopatches // Ann N Y Acad Sci. 2006. - Vol. 1072, p. 210-217.

78. Macdonald T. T.Monteleone G. Immunity, inflammation, and allergy in the gut // Science. 2005. - Vol. 307, № 5717, p. 1920-1925.

79. Mahler M., Bristol I. J., Leiter E. H., Workman A. E., Birkenmeier E. H., Elson C. O.Sundberg J. P. Differential susceptibility of inbred mouse strains to dextran sulfate sodium-induced colitis // Am J Physiol. 1998. - Vol. 274, № 3 Pt 1, p. G544-551.

80. Manichanh C., Borruel N., Casellas F.Guarner F. The gut microbiota in IBD // Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 2012. - Vol. № p.

81. Matricon J., Barnich N.Ardid D. Immunopathogenesis of inflammatory bowel disease // SelfNonself. 2010. - Vol. 1, № 4, p. 299-309.

82. Medema J. P.Vermeulen L. Microenvironmental regulation of stem cells in intestinal homeostasis and cancer // Nature. 2011. - Vol. 474, № 7351, p. 318-326.

83. Meerson F. Z., Miniailenko T. D.Pozharov V. P. Super-resistance to hypoxic hypoxia in adaptation to stress exposures: its possible mechanisms. // Aviakosm Ekolog Med. 1993. - Vol. 27, № 2, p. 44-53.

84. Morris G. P., Beck P. L., Herridge M. S., Depew W. T., Szewczuk M. R.Wallace J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon // Gastroenterology. 1989. - Vol. 96, № 3, p. 795803.

85. Myles M. H., Dieckgraefe B. K., Criley J. M.Franklin C. L. Characterization of cecal gene expression in a differentially susceptible mouse model of bacterial-induced inflammatory bowel disease // Inflamm Bowel Dis. 2007. -Vol. 13, №7, p. 822-836.

86. Neal M. D., Richardson W. M., Sodhi C. P., Russo A.Hackam D. J. Intestinal stem cells and their roles during mucosal injury and repair // J Surg Res. -2011. Vol. 167, № l,p. 1-8.

87. Noah T. K., Donahue B.Shroyer N. F. Intestinal development and differentiation // Exp Cell Res. 2011. - Vol. 317, № 19, p. 2702-2710.

88. Okayasu I., Hatakeyama S., Yamada M., Ohkusa T., Inagaki Y.Nakaya R. A novel method in the induction of reliable experimental acute and chronic ulcerative colitis in mice // Gastroenterology. 1990. - Vol. 98, № 3, p. 694702.

89. Packey C. D.Sartor R. B. Commensal bacteria, traditional and opportunistic pathogens, dysbiosis and bacterial killing in inflammatory bowel diseases // Curr Opin Infect Dis. 2009. - Vol. 22, № 3, p. 292-301.

90. Papanicolaou D. A.Chrousos G. P. Interactions of the endocrine and immune systems in children and young adults // Curr Opin Pediatr. 1995. - Vol. 7, № 4, p. 440-444.

91. Peaudecerf L.Rocha B. Role of the gut as a primary lymphoid organ // Immunol Lett. 2011. - Vol. 140, № 1-2, p. 1-6.

92. Prakash S., Rodes L., Coussa-Charley M.Tomaro-Duchesneau C. Gut microbiota: next frontier in understanding human health and development of biotherapeutics // Biologies. 2011. - Vol. 5, № p. 71-86.

93. Reading N. C.Kasper D. L. The starting lineup: key microbial players in intestinal immunity and homeostasis // Front Microbiol. 2011. - Vol. 2, № p. 148.

94. Reber S. O. Stress and animal models of inflammatory bowel disease—an update on the role of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis // Psychoneuroendocrinology. 2012. - Vol. 37, № 1, p. 1-19.

95. Rescigno M. The intestinal epithelial barrier in the control of homeostasis and immunity // Trends Immunol. 2011. - Vol. 32, № 6, p. 256-264.

96. Richmond C. A.Breault D. T. Regulation of gene expression in the intestinal epithelium // Prog Mol Biol Transl Sci. 2010. - Vol. 96, № p. 207-229.

97. Roth S., Franken P., Sacchetti A., Kremer A., Anderson K., Sansom O.Fodde R. Paneth cells in intestinal homeostasis and tissue injury // PLoS One. -2012.-Vol. 7, №6, p. e38965.

98. Salim S. Y.Soderholm J. D. Importance of disrupted intestinal barrier in inflammatory bowel diseases // Inflamm Bowel Dis. 2011. - Vol. 17, № 1, p. 362-381.

99. Sansonetti P. J. To be or not to be a pathogen: that is the mucosally relevant question // Mucosal Immunol. 2011. - Vol. 4, № 1, p. 8-14.

100. Saunders D. R., Sillery J.Rachmilewitz D. Effect of dioctyl sodium sulfosuccinate on structure and function of rodent and human intestine // Gastroenterology. 1975. - Vol. 69, № 2, p. 380-386.

101. Sava I. G., Heikens E.Huebner J. Pathogenesis and immunity in enterococcal infections // Clin Microbiol Infect. 2010. - Vol. 16, № 6, p. 533-540.

102. Schwetz I., Bradesi S.Mayer E. A. The pathophysiology of irritable bowel syndrome // Minerva Med. 2004. - Vol. 95, № 5, p. 419-426.

103. Scott C. L., Aumeunier A. M.Mowat A. M. Intestinal CD 103+ dendritic cells: master regulators of tolerance? // Trends Immunol. 2011. - Vol. 32, № 9, p. 412-419.

104. Selye H. Stress, hormones, and cardiovascular disease // Recent Adv Stud Cardiac Struct Metab. 1972. - Vol. 1, № p. 701-706.

105. Shah N., Kammermeier J., Elawad M.Glocker E. O. Interleukin-10 and interleukin-10-receptor defects in inflammatory bowel disease // Curr Allergy Asthma Rep. 2012. - Vol. 12, № 5, p. 373-379.

106. Shaker A.Rubin D. C. Intestinal stem cells and epithelial-mesenchymal interactions in the crypt and stem cell niche // Transl Res. 2010. - Vol. 156, № 3, p. 180-187.

107. Shehadeh N., Wies R., Eishach O., Berant M., Etzioni A.Shamir R. Influence of oral insulin supplementation on carbohydrate, lipid and protein metabolism in weaned Balb/c mice // J Pediatr Endocrinol Metab. 2003. - Vol. 16, № 3, p. 431-437.

108. Shi J. Defensins and Paneth cells in inflammatory bowel disease // Inflamm Bowel Dis. 2007. - Vol. 13, № 10, p. 1284-1292.

109. Shi X. Z., Winston J. H.Sarna S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn's colitis and ulcerative colitis // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2011. - Vol. 300, № 1, p. G41-51.

110. Shibahara T., Miyazaki K., Sato D., Matsui H., Yanaka A., Nakahara A.Tanaka N. Alteration of intestinal epithelial function by intraepithelial lymphocyte homing // J Gastroenterol. 2005. - Vol. 40, № 9, p. 878-886.

111. Shih D. Q., Targan S. R.McGovern D. Recent advances in IBD pathogenesis: genetics and immunobiology // Curr Gastroenterol Rep. 2008. - Vol. 10, № 6, p. 568-575.

112. Shokrani M. Inflammatory bowel disease: diagnosis and research trends: the clinical lab is playing an increasingly important role // MLO Med Lab Obs. -2012. Vol. 44, № 8, p. 8, 10, 12; quiz 14.

113. Sidhu R., Drew K., McAlindon M. E., Lobo A. J.Sanders D. S. Elevated serum chromogranin A in irritable bowel syndrome (IBS) and inflammatory bowel disease (IBD): a shared model for pathogenesis? // Inflamm Bowel Dis. -2010.-Vol. 16, №3, p. 361.

114. Siegl S.Uhlig S. Using the One-Lung Method to Link p38 to Pro-Inflammatory Gene Expression during Overventilation in C57BL/6 and BALB/c Mice // PLoS One. 2012. - Vol. 7, № 7, p. e41464.

115. Simons B. D.Clevers H. Stem cell self-renewal in intestinal crypt // Exp Cell Res. 2011. - Vol. 317, № 19, p. 2719-2724.

116. Spellberg B.Edwards J. E., Jr. Type 1/Type 2 immunity in infectious diseases // Clin Infect Dis. 2001. - Vol. 32, № 1, p. 76-102.

117. Spiller R. Serotonergic agents and the irritable bowel syndrome: what goes wrong? // Curr Opin Pharmacol. 2008. - Vol. 8, № 6, p. 709-714.

118. Stefanski V., Peschel A.Reber S. Social stress affects migration of blood T cells into lymphoid organs // J Neuroimmunol. 2003. - Vol. 138, № 1-2, p. 17-24.

119. Strober W. Why study animal models of IBD? // Inflamm Bowel Dis. 2008. -Vol. 14 Suppl 2, p. S129-131.

120. Swidsinski A., Loening-Baucke V., Lochs H.Hale L. P. Spatial organization of bacterial flora in normal and inflamed intestine: a fluorescence in situ hybridization study in mice // World J Gastroenterol. 2005. - Vol. 11, № 8, p. 1131-1140.

121. Takahashi N., Vanlaere I., de Rycke R., Cauwels A., Joosten L. A., Lubberts E., van den Berg W. B.Libert C. IL-17 produced by Paneth cells drives TNF-induced shock//J Exp Med. 2008. - Vol. 205, № 8, p. 1755-1761.

122. Toft P., Svendsen P., Tonnesen E., Rasmussen J. W.Christensen N. J. Redistribution of lymphocytes after major surgical stress // Acta Anaesthesiol Scand. 1993. - Vol. 37, № 3, p. 245-249.

123. Trautvetter U., Ditscheid B., Kiehntopf M.Jahreis G. A combination of calcium phosphate and probiotics beneficially influences intestinal lactobacilli and cholesterol metabolism in humans // Clin Nutr. 2012. - Vol. 31, № 2, p. 230-237.

124. Treuting P. M., Dintzis S. M., Frevert C. W., Liggitt H. D.Montine K. S. Comparative anatomy and histology : a mouse and human atlas: / Treuting P. M., Dintzis S. M., Frevert C. W., Liggitt H. D.Montine K. S.; Place: Elsevier/Academic Press, 2012.

125. Tsaprouni L. G., Ito K., Powell J. J., Adcock I. M.Punchard N. Differential patterns of histone acetylation in inflammatory bowel diseases // J Inflamm (Lond). 2011. - Vol. 8, № 1, p. 1.

126. Umar S. Intestinal stem cells // Curr Gastroenterol Rep. 2010. - Vol. 12, № 5, p. 340-348,

127. Vries R. G., Huch M.Clevers H. Stem cells and cancer of the stomach and intestine // Mol Oncol. 2010. - Vol. 4, № 5, p. 373-384.

128. Wang F., Zou Z., Liu D., Wang J.Su Y. Active deformation of apoptotic intestinal epithelial cells with adhesion-restricted polarity contributes to apoptotic clearance // Lab Invest. 2011. - Vol. 91, № 3, p. 462-471.

129. Weber E., Algers B., Wurbel H., Hultgren J.Olsson I. Influence of Strain and Parity on the Risk of Litter Loss in Laboratory Mice // Reprod Domest Anim. -2012. p. 1-5.

130. Weisser S. B., van Rooijen N.Sly L. M. Depletion and reconstitution of macrophages in mice // J Vis Exp. 2012. - № 66, p. 4105.

131. Wend P., Holland J. D., Ziebold U.Birchmeier W. Wnt signaling in stem and cancer stem cells // Semin Cell Dev Biol. 2010. - Vol. 21, № 8, p. 855-863.

132. Wolczuk K., Wilczynska B., Jaroszewska M.Kobak J. Morphometric characteristics of the small and large intestines of Mus musculus during postnatal development // Folia Morphol (Warsz). 2011. - Vol. 70, № 4, p. 252-259.1. St,

133. Wong E. Y.Herbert J. Roles of mineralocorticoid and glucocorticoid receptors in the regulation of progenitor proliferation in the adult hippocampus // Eur J Neurosci. 2005. - Vol. 22, № 4, p. 785-792.

134. Yan Y., Kolachala V., Dalmasso G., Nguyen H., Laroui H., Sitaraman S. V.Merlin D. Temporal and spatial analysis of clinical and molecular parameters in dextran sodium sulfate induced colitis // PLoS One. 2009. -Vol. 4, № 6, p. e6073.

135. Yang D., de la Rosa G., Tewary P.Oppenheim J. J. Alarmins link neutrophils and dendritic cells // Trends Immunol. 2009. - Vol. 30, № 11, p. 531-537.

136. Young C., Sharma R., Handfield M., Mai V.Neu J. Biomarkers for infants at risk for necrotizing enterocolitis: clues to prevention? // Pediatr Res. 2009. Vol. 65, № 5 pt 2, p. 91R-97R.

137. Zhang L., Lander A. D.Nie Q. A reaction-diffusion mechanism influences cell lineage progression as a basis for formation, regeneration, and stability of intestinal crypts // BMC Syst Biol. 2012. - Vol. 6, № 1, p. 93.

138. Zhang X., Beaulieu J. M., Sotnikova T. D., Gainetdinov R. R.Caron M. G. Tryptophan hydroxylase-2 controls brain serotonin synthesis // Science. -2004. Vol. 305, № 5681, p. 217.

139. Zhao F., Edwards R., Dizon D., Afrasiabi K., Mastroianni J. R., Geyfman M., Ouellette A. J., Andersen B.Lipkin S. M. Disruption of Paneth and goblet cell

Информация о работе

Абдулаева, Сабина Олеговна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.03.04

Диссертация

Гистофизиология слизистой оболочки тонкой и толстой кишки мышей Balb/c и C57Bl/6 при стрессорном холодовом воздействии - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы