Генетическое разнообразие планктонных и ассоциированных с губками динофлагеллят озера Байкал

Анненкова, Наталия Вадимовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Генетическое разнообразие планктонных и ассоциированных с губками динофлагеллят озера Байкал
ВАК РФ 03.01.07, Молекулярная генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическое разнообразие планктонных и ассоциированных с губками динофлагеллят озера Байкал"

00461-У? ^

Анненкова Наталия Вадимовна

Генетическое разнообразие планктонных и ассоциированных с губками динофлагеллят озера Байкал

03.01.07 - молекулярная генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

2 5 НОЯ 2010

Новосибирск 2010

004613911

Работа выполнена в лаборатории аналитической биоорганической химии Учреждения Российской Академии Наук Лимнологический институт Сибирского Отделения РАН, г. Иркутск.

Научный руководитель:

доктор биологических наук

профессор Беликов Сергей Иванович

Лимнологический институт СО РАН,

г. Иркутск

ведущий научный сотрудник Колесников Николай Николаевич

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук ведущий научный сотрудник Гончаров Андрей Анатольевич Биолого-почвенный институт ДВО РАН, г. Владивосток

государственный университет

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук

Ведущая организация

Санкт-Петербургский

Защита состоится: 3 декабря 2010 г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.045.02 при Институте химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН в конференц-зале института по адресу: 630090, Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 8. Тел: +7 (383) 33-33-912

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН

Автореферат разослан

2010г.

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Е. Б. Кокоза

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Развитие методов микроскопии и генно-молекулярной идентификации позволило на качественно новом уровне исследовать одноклеточных эукариот (простейших), которые, как выяснилось, играют огромную роль в биосфере и гораздо разнообразнее по своему происхождению и строению, чем считалось ранее. Новые знания о них породили новые вопросы, в том числе дискуссию о том, существует ли небольшое число видов, встречающихся повсеместно, или же их разнообразие велико, а местообитание может быть специфичным (Taylor et al. Philos. T. R. Sos. B: Biol. 2006. 361: 1947). В пользу второго предположения свидетельствует наличие скрытого разнообразия: морфологически идентичные одноклеточные отличаются генетически, в ряде случаев выявлены отличия на уровне физиологии (Boenigk et al. Appl. Environ. Microb. 2006. 72: 5159). Не все простейшие одинаково культивируемы и поэтому могут быть пропущены при анализе (Epstein, Lôpez-Garcia. Biodivers. Conserv. 2008. 17: 261). Основная часть генетических исследований выполнена для простейших, обитающих в океанах; настоятельно требуются данные по пресным водоемам (Lopez-Garcia, Moreira. Res. Microbiol. 2008. 159: 67). Это позволило бы определить, насколько эволюционно отличаются от морских виды, перешедшие в другие условия существования. Кроме того, озера достаточно изолированы друг от друга и часто имеют свои особенности, таким образом, являясь вероятным местом для новых, адаптированных к конкретным условиям, видов.

Dinoflagellata - большая группа простейших, образующая вместе с Apicomplexa и Ciliophora супергруппу альвеолят. Эти жгутиковые одноклеточные могут питаться за счет фотосинтеза или гетеротрофно. Целый ряд морских динофлагеллят синтезирует сильные токсины (Wang. Mar. Drugs. 2008. 6: 349). Динофлагелляты-симбионты необходимы для развития коралловых рифов (Douglas. Mar. Pollut Bui. 2003. 46: 385). В настоящей работе изучены представители класса Dinophyceae из пресноводного озера Байкал. Это древнейшее и самое глубокое озеро на планете - известный центр интенсивного видообразования, многие обитатели которого эндемичны. Простейшие в нем практически не изучены, особенно молекулярными методами. Динофлагелляты составляют важную часть планктона озера, но известно о них мало и лишь на основе данных оптической микроскопии (Kozhova, Izmest'eva. Leiden. Backhuys Publ. 1998). Высказано предположение о наличии специфичных динофлагеллят в байкальских губках (Müller et al. FEBS J. 2007. 274: 23), но их систематическое положение не изучено. Цель исследования: В связи с вышеизложенным молекулярно-генетическая характеристика и определение видового состава динофлагелят представляется важным шагом. Поэтому целью работы являлась сравнительная характеристика и анализ генетического разнообразия свободноплавающих и ассоциированных с губками динофлагеллят озера Байкал.

Задачи исследования: 1. Найти подходы к идентификации ДНК некультивируемых динофлагеллят, позволяющие охватить их наибольшее число. 2. Выяснить родственные связи эндемичного Gymnodinium baicalerise, имеющего наибольшую численность

среди динофлагеллят озера Байкал. 3. Определить генетическое разнообразие планктонных динофлагеллят в период их массового развития и уточнить фено-типические характеристики известных беспанцирных динофлагеллят. 4. Выявить специфичные нуклеотидные последовательности динофлагеллят в различных видах байкальских губок сем. 1-иЬот1г5кПс1ае. 5. Определить филогенетическое положение байкальских динофлагеллят среди известных морских и пресноводных видов. Научная новизна. Впервые с помощью молекулярно-генетических методов изучено разнообразие динофлагеллят в о. Байкал и исследованы динофлагелляты в пресноводных губках. В ходе работы впервые в пресноводных беспозвоночных обнаружены представители порядка БиеззЫеБ, ранее члены этой группы были известны как симбионты лишь морских беспозвоночных. Выявлен относительно большой спектр последовательностей ДНК динофлагеллят и определено их филогенетическое положение по отношению к известным видам. Впервые получены изображения эндемичного СутпосНпшт baicalen.se при помощи сканирующей электронной микроскопии, установлено его недавнее морское происхождение.

Для оценки разнообразия организмов использован наиболее современный подход - анализ метагеномной ДНК из окружающей среды, что помогает учесть редкие или же сложно культивируемые виды. При этом проанализированы не все эукариоты из проб, а одна группа (динофлагелляты), для чего были сконструированы специфичные праймеры. Это минимизировало недоучет части искомых фрагментов ДНК, что случается при анализе всего спектра простейших. Также для более полного анализа разнообразия динофлагеллят использована природная способность губки аккумулировать в себе простейших, фильтруя воду через себя. Благодаря этому были исследованы и вероятные симбионты, и свободноживущие представители группы, скапливающиеся в губках в течение некоторого времени.

Положения, выносимые на защиту: 1. В о. Байкал обитают, помимо известных двух родов вутпосИпшт и РегШтшт, представители ряда других родов и семейств. 2. Вид СутпосИпшт Ьа/са/елве занимает филогенетическое положение среди истинных представителей рода вутпосИпшт и наиболее близок к динофлагелляту из арктического льда. 3. В эндемичных байкальских губках сем. 1_иЬогш5кнс)ае присутствуют нуклеотидные фрагменты неизвестных для планктона динофлагеллят. Из них две группы, относящиеся к порядку ЗиеББ^еБ, - потенциальные симбионты губок. 4. Большая часть динофлагеллят Байкала, по-видимому, имеет недавнее морское происхождение, меньшая - перешла к жизни в пресных водах давно. Научно-практическое значение работы. Подходы, применявшиеся в работе, могут использоваться для комплексного определения различных групп одноклеточных, особенно, не имеющих прочной клеточной стенки. Разработанные генные маркеры подходят для быстрой идентификации динофлагеллят. Полученные результаты расширяют наши знания о взаимодействии динофлагеллят с беспозвоночными, важны для понимания как особенностей динофлагеллят Байкала, так и общих закономерностей эволюции и расселения простейших. Обнаружение новых динофлагеллят позволяет проводить поиск новых полезных метаболитов, которые в том

числе могут накапливаться в байкальских губках Показано присутствие в Байкале Peridinium aciculiferum (вида, известного как токсичный). Полученные данные могут использоваться при чтении лекций в учебных заведениях. В базу данных GenBank депонировано 96 отличающихся друг от друга нуклеотидных последовательностей (номера доступа: FJ024297 - FJ024304, FJ823462 - FJ823502, GQ423575 - GQ423596, GU723481 - GU723491, HQ259032 - HQ259047). Филогенетические деревья, описывающее генетическое разнообразие динофлагеллят в губках, депонированы в базу данных TreeBase (URL: http://purl.Org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S10600). Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на конференциях: 2010 Joint meeting of the International Society of Protistologists and the British Society for Protist Biology (Университет Кента, Кентербери, Великобритания, 18-23 июля 2010); II всероссийская конференция «Водоросли: проблемы таксономии, экологии и использование в мониторинге» (Сыктывкар, 5-9 октября 2009 г.); X Съезд Гидробиологического общества при РАН (Владивосток, 28 сентября - 2 октября 2009 г.); международная конференция "Nanotechnology and Applications" of The International Association of Science and Technology for Development (Крит, Греция, 29 сентября - 1 октября 2008); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11- 15 мая 2008 г.); IV международная конференция «Биоразнообразие и роль животных в экосистемах» (Днепропетровск, 9-12 октября 2007 г). Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 статьи - в журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ.

Вклад автора. Основные результаты диссертации получены и проанализированы автором самостоятельно. Работа по подсчёту численности и промерам клеток планктонных динофлагеллят сделана совместно с к.б.н. О И. Белых. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, литературного обзора, материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов, списка литературы (168 источников, из них 148 на английском языке) и приложения, изложена на 136 страницах, содержит 22 рисунка и 6 таблиц.

Благодарности. Выражаю искреннюю признательность профессору Лаврову Д.В. (Государственный университет Айовы, США) и к.б.н. Белых О.И. (ЛИН СО РАН) за обсуждение результатов и ценные замечания, а также сотрудникам лаборатории аналитической биоорганической химии ЛИН СО РАН за помощь в организации работы, предоставление реактивов и консультации. Благодарю директора ЛИН СО РАН академика Грачева М.А. за помощь и участие. Особую благодарность выражаю моим родителям за постоянную и всестороннюю поддержку. Работа поддержана проектами: программы РАН (базовое финансирование) № 6.1.1.10 и № VI.42.1.3, программа Президиума РАН № 23.12, Лаврентьевский молодёжный проект СО РАН № 6.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Сбор образцов. Пробы планктона отбирали еженедельно с марта по май 2008 и 2009 гг. в поверхностном слое воды из трещин во льду у пос. Листвянка (Южный Байкал, литораль) сетью Апштейна и батометром. Губки собрали в 2005 г. вблизи о. Ольхон

(зап побережье Байкала) на глубине 5-15 метров. Видовую принадлежность определили на основе морфологии спикул. Образцы хранили в 70% этаноле при +4°С. Оптическая, электронная микроскопия. Пробы изучали при помощи инвертированного микроскопа Axiovert 200. Виды определяли по (Пелагобионты Байкала: атлас и определитель. Н: 1995: 146). Наличие фотосинтезирующих пигментов выявляли, используя голубой (470 нм) и зеленый (545 нм) фильтры. Измерение клеток проводили с помощью программы Image-Pro Plus 4.0. Кроме того, пробы планктона фиксировали в 1% растворе 0s04, дегидратировали клетки в градиентном растворе этанола (от 30% до 100%), затем удаляли его добавлением гексаметилдисилазана или в вакуумной установке Hitachi HCP-2/Critical Point Dryer (Япония), напыленные золотом образцы исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа Philips SEM 525М. Выделение ДНК, конструирование праймеров, амплификация ДНК. Суммарную ДНК выделяли из проб с помощью набора ДНК-sorb В (InterLab Service, Москва) или СТАБ-методом. Дизайн специфичных для динофлагеллят праймеров проводили на основе ДНК динофлагеллят из GenBank и программы Primer Blast. Основные продукты амплификации получены с помощью праймеров L1 (5'-TTGGCCTACCGTGGCAATGAC) и R1 (5'- GACACAGGGAGGTAGTGACAAG) (Тпл=61), ограничивающих фрагмент 18S рДНК от V1 до V5 домена. Участок, содержащий второй нетранслируемый спейсер (ITS2) и фрагменты 5.8S и 28S рДНК амплифицировали с помощью праймеров 5L (5'-GTGAATTGCAGAACTCCGTGAAC) и RR (5-ATCCCTGTTCATTCGCCATTACT) (Т„л=52); участок 18S рДНК - с помощью L1 и 5R (5'-GTTCACGGAGTTCTGCAATTCAC) (Тпл=60>, фрагмент митохондриального гена сох1 - с помощью mF (5'-GAAAACCAGAACTTCTA-TAATG) и mR (5'-CGGTAAGGATATCAAGATTG) (Т„л=51). Продукты амплификации очищали электрофорезом в 1% легкоплавкой агарозе.

Клонирование, определение нуклеотидных последовательностей. Клонирование продуктов амплификации проводили с использованием InsT/Aclone PCR Product Cloning Kit (Fermentas) и химически компетентных клеток. Определение нуклеотидных последовательностей продуктов амплификации с клонов проводили на секвенаторе CEQ 8800 (Beckman Coulter Inc.) согласно методике фирмы-производителя. Рестрикционный анализ (ПДРФ). Определяли последовательности ряда клонов, содержащих фрагмент 18S рДНК между праймерами L1 и R1,n с помощью программы DNAMAN 5.2.9 (Lynnon. Biosoft, Canada) подбирали рестриктазы для получения различающихся картин рестрикции. Выбрали рестриктазы АШЛ и DdeI. В дальнейшем данные клоны обрабатывали отдельно ферментом А1и 1 и ферментом Ddel согласно протоколу. Продукты рестрикции изучали при помощи электрофореза в 2.5% агарозе. Филогенетический анализ. По расшифрованным фрагментам ДНК проводили поиск родственных им последовательностей в GenBank с помощью программы BLAST. Нуклеотидные фрагменты выравнивали, используя программу BioEdit 7.0.5.2. На основе матриц выравниваний конструировали филогенетические деревья методом ближайших соседей с помощью программы Mega 4.0 и сравнивали эти деревья с анализом 238 последовательностей 18S рДНК динофлагеллят из работы (Logares et al. Mol. Phylogenet. Evol. 2007. 45: 887) для проверки того, учтены ли все виды,

близкие к байкальским. На основе выбранных последовательностей строили филогенетические деревья методом максимального правдоподобия (ML) с помощью on-line программы Phyml (устойчивость кластеризации оценивали в 1000 циклах бутстреп анализа) и методом Байеса (BI), используя программу MrBayes 3.1.2. При BI анализе запускали в двух повторностях 6 «горячих» и 1 «холодную» марковские цепи в течение N-106 циклов (N - в зависимости от маркера 2 - 7) с отбором каждого сотого дерева. На основе деревьев со стабильными оценками параметров моделей нуклеотидных замен и правдоподобия получали консенсусные деревья и апостериорные вероятности ветвления. Использовали следующие модели: для 18S рДНК -GTR+G+I, для ITS2 - HKY85+G+I, для фрагмента гена сох 1 - F81+G. Эти модели оптимальны для наших матриц данных согласно критерию Akaike (AIC), реализованного в программе Modeltest v3.8. Дополнительно для 18S рДНК при BI анализе применяли COV модель. Также использовали программы Mesquite 2.72 и FigTree v1.2.2. На приведенных в работе рисунках представлены байесовские деревья, укоренённые по середине. При помощи программы Mega 4.0 рассчитывали р-расстояния.

РЕЗУЛЬТАТЫ

Для более полного анализа разнообразия динофлагеллят Байкала,- во-первых, исследовали весенний подледный планктон, так как к этому сезону приурочено наибольшее число видов и их максимальная биомасса (Kozhova, Izmest'eva, 1998). Gymnodinium baícalense выделяется самой большой численностью, и он был изучен особенно тщательно. Во-вторых, анализировали ДНК динофлагеллят из эндемичных губок, процветающих в Байкале, в том числе из-за их ассоциации с симбионтами. Ими, как мы полагаем, могут быть динофлагелляты. Такой симбиоз известен для морских губок (Granados et al. Mol. Phyl. Evol. 2008. 49: 554). Кроме симбиотических, надеялись выявить и свободноживущих динофлагеллят, благодаря способности губок быть «натуральными фильтрами» и концентрировать в себе одноклеточных. Динофлагелляты из весеннего подледного сообщества озера Байкал. Начало цветения и в 2008, и в 2009 гг. отмечали в середине февраля с появлением вида Gymnodinium baícalense. Динофлагелляты других видов выявляли в пробах с конца марта и не так массово, как G. baícalense. Все они были способны к фотосинтезу, кроме Gymnodinium coeruieum: у него отсутствовали соответствующие пигменты. Наибольшее количество динофлагеллят наблюдали в апреле 2008 г.: G. baícalense -до 1743.2 тыс кл/л, Peridinium baícalense - до 19.0 тыс кп/л, Peridíníum sp. - до 3.5 тыс кл/л и единичные особи G. coeruieum. Для беспанцирных динофлагеллят важной характеристикой является размер клеток. Средние размеры G. coeruieum (данные оптической микроскопии) составили 47.5±3.1 мкм х 27.1 ±2.3 мкм. Это соответствует размерам вида Gyrodinium helveticum (47.2±3.2 мкм х 26.3±2.5 мкм (Takano et al. Phycol. Res. 2004. 52: 107)), наиболее похожего на G. coeruieum (Антипова. ДАН. 1955. 103: 325). Размеры клеток G. baícalense, по данным оптической микроскопии, составили 48.6±4.8 мкм ж 37.6±7.1 мкм в марте 2008 г., когда вид был в подавляющем большинстве, и 37.3±4.5 мкм X 29.5±2.6 мкм в апреле 2008 г., когда он доминировал на

фоне увеличения числа других организмов. С помощью сканирующей электронной микроскопии (рис. 1а) в апреле 2009 г. определили его размеры как 38.2±5.0 мкм х 27.1±3.4 мкм, ширину поперечной борозды - 2.9±0.8 мкм, продольной - 0.6±0.1 мкм.

Используя ДНК из пробы от 10.03.2008 с множеством клеток G. baicalense и единичными клетками G. coeruleum (данные оптической микроскопии), амплифициро-вали фрагменты 5.8S-ITS2-28S рДНК, 18S рДНК и гена сох1. На основе этих генетических маркеров создали библиотеки клонов, провели частичное определение последовательностей и филогенетический анализ вида G. baicalense (например, рис. 16)

Рис. 1. а) Электронно-микроскопические изображения Gymnodinium baicalense, масштаб 10 мкм; б) филогенетический анализ фрагментов 18S рДНК динофлагел-лят (1429 позиций). G. baicalense выделен стрелкой. На сером фоне представлены морские виды. Значения над линиями - апостериорные вероятности (метод BI), под линиями - значения бут-стреп анализа (метод ML) (<50 не показаны, также на последующих рисунках).

Согласно всем трём маркерам, байкальский вид достоверно кластеризуется с морскими представителями рода Gymnodinium и с несколькими мор-

|_DQ146406_Amoebophrya

77 sp. AF069516CKHMH видами, близко--Parvilucifera

o.i infectans родственными этому роду

AJ968729

Лучше всего разнообразие динофлагеллят изучено по 18S рДНК, поэтому этот маркер дает более полную информацию о родстве G. baicalense. Помимо морских гимноди-ниумов, в общую кладу с ним вошли пресноводные Gymnodinium sp. из озера Тувель и Gymnodinium fuscum, но они не являются наиболее близкими к байкальскому виду. Ближайший к G. baicalense организм (рис.1б) - эукариот из пробы льда с о. Шпицберген (генетическое расстояние - 0.003). Второй по сходству с G. baicalense является последовательность вида Gymnodinium aureoium (генетическое расстояние - 0.006).

Для изучения разнообразия динофлагеллят в планктоне амплифицировали фрагменты 18S рДНК из суммарной ДНК пробы от 13.04.2008 с 4 чётко различающимися морфовидами динофлагеллят (данные оптической микроскопии).

0.99 j-clone 7 1 . 98\Jclone 44 J

1-Uncultured eukaryote EU371356 Gvmnodinium aureoium AY999082 Gymnodinium aureoium FN392226 Gymnodinium sp. AF022196 л ,Uncultured Gymnodinium

—- AY840208

1Gymnodinium sp. AY829527 Pheopolykrikos hartmanii AY421789

gymnodinium fuscum AF022194 Wamowia sp. FJ947040 Nematodinium sp. FJ947039 Dinophyceae sp. FM180528 Xf Gymnodinium dorsalisulcum DQ837534

-Gvmnodinium imDudicum DQ785884

Gymnodinium catenatum AF022193 Lepidodinium viride DQ499645 100^Gymnodinium chlorophorum AM 184122 10(T -yjScrippsiella hanqoei EF417316 iS^Peridinium aciculiferum EF417315

Peridinium wierzejskii AY443018 1iPeridinium umbonatum AF274271 QOPeridinium inconsoicuum EF058247

Gyrodinium helveticum FJ024299 Gyrodinium rubrum AB120003 1 rGymnodinium impatiens EF058239 100 '—Glenodiniopsis steinii AF274257 -Gloeodinium viscum L13716

■Karenia brevis EF492501 1 Gymnodinium mikimotoi AF022195 Karlodinium micrum AJ415516

1 I-Symbiodinium goreaui EF036539

3J100 *— Gymnodinium béii U37406

-Woloszynskia pascheri EF058253

n «о ,_Syndinium sp.

Клонировав их, получили 57 клонов. Рестрикционный анализ разделил их на 4 группы. Чтобы соотнести эти группы с известными таксонами, определили первичную структуру 34 фрагментов. Исключив идентичные, оставили 28 фрагментов и на их

2Л2. -- . - ................Рис.2 Филогенетический анализ

фрагментов 18S рДНК (L1/R1 праймеры) (677 позиций). Консен-сусное дерево по принципу большинства. Морские виды представлены на сером фоне. * - отмечен фрагмент G. baicalense, расшифрованный нами ранее. Клада N3 соответствует кладе на рис. 4.

ÍL9]

Ш' 50

1 -^fPfiesteria- like dinoflagellate АМ050344 Pfíesteria piscicida AF330609 Paulsenella vonstoschii AJ968729 'Dinophyceae sp. AY590479 -ll—("Uncultured Gymnodinium AY840208 100 lGvmnodinium sp. AY829527

_L 100

0.9S

^Cvmr irclon® LA20 "Lclone LA31

Peridinium acicutiferum EF417315 Dinophyceae sp. AY251288 -Uncultured eukaryote EU371356 ■Gymnodinium baicalense * FJ024297

-Gymnodinium fuscum AF022194

- Gymnodinium aureolum AY999082 -clone LA46 -clone LA4 clone LA2S -clone LA34 -clone LA13 -clone LA12 -clone LA7 clone LA41 •clone LA40 clone LAI -clone LA9 clone LA101 clone LA17 -clone LA111 clone LA6 -clone LA 14 clone LA25 clone LA30 -clone LA42 -clone LA44 -clone LA103 -clone LA110 clone LA106 ■clone LAI 07

-Gymnodinium dorsaiisulcum DQ837534

Gymnodinium impudicum DQ785884

Symbiodinium sp. AB294594 Symbiodinium sp. AB055911 lymbiodinium sp. AB016578 Woloszynskia halophila EF058252 Polarella glacialis EF417317

SEF058235

основе провели филогенетический анализ, включив в него также 53 последовательности из GenBank. Полученное филогенетическое дерево (рис. 2) имело низкую степень достоверности в своей основе, что характерно для рДИК деревьев динофлагеллят (Saldarriaga et al. Eur. J. Protistol. 2004. 40: 85). В то же время и среди внутренних клад лишь некоторые были достоверны. Основная часть байкальских последовательностей и в ML, и в BI анализах вошла в кладу X с низкой статистической поддержкой (рис. 2). Кроме них в кладе X оказались последовательности ДНК морских представителей рода Gymnodinium, три

Parvilucifera infectans AJ968729 ^ОСЛв ДО В ЭТв Л ЬНОСТИ ПРеСноводных гимнодиниумов и отдельной группой - представители сем. Pfiesteriaceae. Два байкальских клона из этой клады идентичны рДНК вида Peridinium acicuiiferum, три имели единичные замены в сравнении с расшифрованной нами рДНК вида Gymnodinium baicalense. Остальные

..AiGlenodinium sp. AY829528

•olíñoe—Cystodinium phaseolus E.______

3jL—Uncultured freshwater eukaryote AY919716 d—Woloszynskia pascheri EF058253 "^jfci clone LA3 '¿SS^Gyrodinium helveticum &BLGyrodinium rubrum AB120003 90- Gyrodinium spirale AB120001 MGyrodinium fusiforme AB120002

1 i-Glenodiniopsis steinii AF274257

100 '-Gymnodinium /mo a fens EF058239 Takayama cf. pulchellum AY80013Q Gyrodinium sp. AB001438

ÎLâû-Tovelia ieopoliensis AY443025

50 1-Uncultured Peridinium AY827955

-The

'horacosphaera heimii AF274278 —Peridinium polonicum AY443017 -Peridinium wierzeiskii AY443018

-Dinophysis acuminata EU130569

Scrippsiella sweeneyae AF274276 -Peridinium centenniale EF058236 —Perídiniopsis borgei EF058241 -Peridinium umbonatum AF274271 Prorocentrvm minimum AY421791 —Heterocapsa sp. FJ549370

Gloeodinium montanum EF058238

Peridinium quinquecome AB246744

-Jadwigia appianata EF058240 -Gyrodinium instriatum AY721981

Karena brevis AF274259 —Gymnodinium catenatum AF022193

aleidiniium rugatum AB195668

-Syndinium sp. DQ146406

-Amoebophrya sp. AF069516

0.1

байкальские клоны клады X отличаются и от G. baicalense, и от P. aciculiferum, но недостаточно сильно, чтобы образовать отдельные достоверные кластеры. Генетические расстояния между последовательностями ДНК байкальских динофлагеллят из клады X (рис. 2) составляют 0.001 - 0.018. Кроме того, выявлен нуклеотидный фрагмент, идентичный участку 18S рДНК вида Gyrodiníum helveticum (клада N3, рис. 2). Достоверно близок к нему другой представитель рода Gyrodinium: морской G. rubrum. Клон LA11 не образовал общей клады с изученными динофлагеллятами. Динофлагелляты, ассоциированные с байкальскими эндемичными губками. Анализировали три вида губок: Baikalospongia intermedia, Baikalospongia recta и Lubomirskia incrustans. Используя суммарную ДНК из каждой губки и специфичные для динофлагеллят праймеры, амплифицировали фрагменты 18S рДНК, клонировали их и получили 170 клонов: 60 из L. incrustans, 60 из В. intermedia, 50 из В. recta. По результатам рестрикционного анализа все клоны разделились на 11 групп, различающихся по картине рестрикции и найденных во всех трёх губках (рис. 3). У 70 фрагментов из ' " ■ ь а ь ' " м Рис. 3. Пример рестрикционного анализа клонированных фрагментов 18ЭрДНК из губки В. recta. tes Каждая пара дорожек соответствует одному клону, — — ан> м> —— ^рестрицированному а) Aiu~\ и b) Dcfe1; M - маркер,

разных групп рестрикции определили первичную структуру. Идентичные последовательности из одной и той же губки не учитывались в анализе, 10 фрагментов не имели существенного сходства с последовательностями из GenBank, их также исключили. В итоге, филогенетический анализ провели на основе 45 выявленных фрагментов ДНК и 54 последовательностей ДНК, взятых из GenBank. ML и BI деревья имели сходную топологию и идентичные внутренние кластеры. Фрагменты динофлагеллят из байкальских губок не сформировали монофилетической группы и кластеризовались с фрагментами ДНК, принадлежащими ряду разных семейств динофлагеллят (рис. 4).

Два варианта последовательностей выявлены нами ранее также в планктоне. Во-первых, это клон M5-24BI, схожий с фрагментами Gymnodinium baicalense и Gymnodinium aureolum. Клон M5-33LI близок к данной группе, но с низкой степенью достоверности (клада N4, рис. 4). Во-вторых, около 15% фрагментов из каждой губки, согласно ПДРФ и нуклеотидной последовательности, образовало общую группу с родом Gyrodinium (клада N3, рис. 4). Генетическое расстояние между байкальскими клонами и G. helveticum составило 0.008 - 0.027. Кроме того, более половины определенных фрагментов сгруппировано с представителями родов Pfiesteria, Peridinium, Paulsenella и двумя Dinophyceae sp. (клада N2, рис. 4; BI 97, ML 51). Генетическое расстояние между байкальскими клонами в этой кладе доходило до 0.02. Другой вариант фрагмента рДНК динофлагеллят представлен клоном M5-32LI, достоверно кластеризующимся с пресноводным динофлагеллятом из олиготрофного озера Георга (США) и видами из европейских озер (клада N1, рис. 4). Согласно ПДРФ анализу

фрагменты последнего типа редки в изученных губках. В большинстве, взаимоотношения среди клад N1 - N4 на рисунке 4 не имеют сильной статистической поддержки.

(О

ю Z

со Z

Прочие расшифрованные фрагменты ДНК вместе с морскими видами порядка Suessiales и пресноводным паразитом Piscinoodinium sp. объединились в группу "suessioids" с высокой степенью достоверности (BI 1; ML 90%). Она состоит из трёх чётко выраженных клад (рис. 4). Клада N5 включает байкальских представителей и Piscinoodinium sp., клада N6 - симбиодиниумов, живущих в симбиозе с разными морскими хозяевами (включая морскую губку Haliciona koremella\ Symbiodinium sp. AB016578), клада N7 - байкальских клонов и холодолюбивую свободноживущую Woloszynskia haiophila. Симбионт фораминифер Gymnodinium beii близок к кладам N6 и N7, но с низкой достоверностью. Свободноживущая Polarella glacialis является сестринской по отношению к другим членам группы "suessioids", как было показано ранее (Shaked, Vargas. MEPS. 2006. 325: 59). Взаиморасположение клад N 5, 6, и 7 (рис. 4) нестабильно: когда Р. glacialis включена, клада симбиодиниумов группируется с кладой N7, в противном случае она группируется с кладой N5.

£ g ■s со

tglR

я? ® -Э eo lëî»

Ю to

o« ¿Тем

I" 8

oo __ « <r> lo SP <0

8=ä£St

> agillië

3?il! I

Рис. 4. Филогенетический анализ фрагментов 18S рДНК (L1/R1 праймеры) динофлагеллят (710 позиций), полученных из губок. Виды из морских или солоноватых вод представлены на сером фоне. Последовательности из байкальских губок выделены жирным шрифтом : красный - L. incrustans, зеленый - В. recta, синий - В. intermedia. * - виды из байкальского планктона, расшифрованные нами ранее.

Для подтверждения присутствия членов порядка Зиезэ^еэ в губках и уточнения их родственных связей, сконструировали специфичные к этому порядку праймеры, ограничивающие участок 5.85-1Т32-285 рДНК. Этот фрагмент выделили из губок и расшифровали по 15 клонов из каждой библиотеки. Идентичные

последовательности из одной губки не учитывали. Большинство расшифрованных фрагментов ДНК имели единичные замены в сравнении друг с другом, и лишь один клон (M5-6BR) существен-но отличался. В итоговый анализ (рис. 5) вошло 15 фрагментов ДНК, а также последо-вательности из базы данных GenBank: 8 от представителей Suessiales и 5 от свобо-дноживущих динофлагеллят. Сравнение данных ITS2 участков показало различие в их длине: от 258 до 326 нуклеотидов у динофлагеллят порядка Suessiales и от 322 до 374 нуклеотидов у остальных динофлагеллят. Длина ITS2 байкальских динофлагел-лят из клады N7 (рис. 5) и двух Symbiodinium sp. практически одинакова (292-296 нук-пеотидов). Последовательность байкальского динофлагеллята из клады N5 (рис. 5) состояла всего из 258 нуклеотидов. Все обсуждаемые байкальские клоны вошли в порядок Suessiales (BI, 1; ML, 98%) (рис. 5), топология кластеров внутри него соответствовала расположению

Рис. 5. Филогенетический анализ участка 5.8S-ITS2-28S ДНК динофлагеллят (428 позиций, учитывая пропуски). Морские виды представлены на сером фоне. Последовательности из байкальских губок выделены jjj жирным цветом: красный - L incrustaras, зеленый - В. recta, синий - В. Intermedia. Под пунктирной чертой располагаются известные планктонные виды.

[Clone M5-27BI GQ423581 (clone M5-41LI GQ423589 jrclone M5-2LI GQ423587 jlclone N15-11BR GQ423593 lrclone M5-20BI GQ423583 (.clone M5-2BR GQ423594 Vclone M5-24BI GQ423534 'clone M5-46LI GQ423590

Íclone M5-20LI GQ423588 clone M5-90U GQ423591 clone M5-1BRGQ423592 _ clone M5-3BR GQ423595 clone M5-88BI GQ423586 -clone M5-21BI GQ423582

Symbiodinium sp. AB294594 Symbiodinium sp. EU074875 Symbiodinium sp. AB294667

Symbiodinium sp. AF195148 Symbiodinium sp. AB207207

-Gymnodinium bóii DQ195342

-Gymnodinium coró AF318226

.........i..

Gymnodinium aureoium AY999082

jymnodimum baicaiense

FJ024304

Stoeckeria aigicida EU978468 ■Pfmsteria pisoicida AF330609 ■Prorocentrum micans EU780638

соответствующих кластеров при анализе18Э рДНК (рис. 4): клада N5 с клоном М5-6BR из губки В. recta и Pis-cinoodinium sp., клада N6 с видами рода Symbiodinium и родственными им Gymnodinium beii и Gymnodinium corrí, клада N7 с группой клонов из байкальских губок (рис. 5).

Исследуемые в работе губки собраны в одно и тоже время и в одном месте. Они принадлежали двум родам сем. Lubomirskiidae: Baikaiospongia (два вида) и Lubomirskia (один вид). Байкальские динофлагелляты из клады N7 (порядок Suessiales) найдены во всех трёх губках (рис. 4 и 5). В то же время динофлагелляты из клады N5 (рис 4 и 5) этого же порядка не выявлены в L. incrustans (согласно ПДРФ анализу и структуре последовательностей ДНК). Другие клонированные последовательности динофлагеллят представлены во всех губках примерно в равной пропорции. Среди них наиболее распространены члены клады N2 (рис. 4). Хотя Gymnodinium baicalense - самый массовый вид среди динофлагеллят планктона, сходные с ним последовательности ДНК в губках встречались редко. Это может быть

связано со временем сбора губок (летом, в то время как G. baicalense цветет подо льдом весной) или с колебанием численности динофлагеллят.

ОБСУЖДЕНИЕ

К настоящему времени сообщалось о следующих динофлагеллятах в планктоне озера Байкал: Gymnodinium baicalense, Gymnodinlum coeruleum, Glenodinium sp., Peridinium baicalense, Peridinium aciculiferum, Peridinium sp. (Kozhova, Izmest'eva, 1998). По мнению (Rengefors, Meyer. Phycologia. 1999. 37: 284) в Байкале обитает также Peridinium euryceps. В целом, динофлагелляты озера не изучены современными методами, поэтому невозможно судить о степени их разнообразия и уникальности. Чтобы изучить этот вопрос, мы провели описанные выше исследования, что позволило разделить динофлагеллят Байкала на следующие группы. Байкальские динофлагелляты порядка Suessiales. Ряд расшифрованных последовательностей динофлагеллят из изученных губок группировался вместе с представителями порядка Suessiales (рис. 4, 5). В этот порядок входит небольшое число свободноживущих видов (6 морских, включая Woloszynskia halophila и Biecheleriopsis adriatica, известный как Gymnodinium corii, и 4 пресноводных вида) и большинство описанных динофлагеллят симбионтов (множество видов) морских беспозвоночных, включая губок (Siano et al. Protist. 2010. 161: 385). Обнаружение в байкальских губках фрагментов ДНК, принадлежащих Suessiales, означает, что байкальские динофлагелляты могут быть вовлечены в симбиоз с этими губками. Динофлагеллят из этого порядка ранее не выявляли в Байкале, также и среди расшифрованных нами планктонных нукпеотидных фрагментов не было найдено принадлежащих этой группе. Губки исследованного сем. Lubomirskiidae не близкородственны морским видам губок (Itskovich et al. J. Mol. Evol. 2008. 67: 608), в будущем необходимо изучить, как они оказались ассоциированы с динофлагеллятами из Suessiales, и насколько такие динофлагелляты распространены в пресных водах. Следует отметить, что о присутствии Suessiales в пресноводных, а не в морских беспозвоночных ранее не сообщалось. Внутри группы Suessiales часть байкальских фрагментов ДНК кластеризовалась с Woloszynskia halophila (клада N7, рис. 4), образуя сестринскую группу по отношению к видам рода Symbiodinium (плюс Gymnodinium béii и G. corii при анализе ITS2, рис. 5). Остальные фрагменты сформировали достоверную кладу (N5, рис. 4 и 5) вместе с пресноводным паразитом рыб Piscinoodinium sp., филогенетически близким к морским динофлагеллятам из порядка Suessiales (Levy et al. J. Parasitol. 2007. 93: 1006). В дальнейшем степень ассоциации динофлагеллят и губок, как и её направленность, следует изучить дополнительными методами.

Анализ участка 5.8S-ITS2-28S рДНК показал меньшую дивергенцию фрагментов клады N7 (рис. 5), чем анализ на основе фрагментов 18S рДНК (рис. 4). Возможно, это связано с тем, что данный участок менее различен у этих динофлагеллят. В то же время то, что последовательности из клады N7 (рис. 5) практически идентичны, может быть связано с артефактами амплификации, как это описано для рода Symbiodinium (Thornhill et al. Mol. Ecol. 2007.16: 5326).

Байкальские динофлагелляты, филогенетически близкие сем. Pfiesteriaceae.

Считалось, что Pfiesteriaceae обитают в морях, могут заходить в дельту рек (Miller, Belas. Res. Microbiol. 2003. 154: 85). Недавно было показано, что пресноводный Tyrannodinium berolinense относится к этому семейству (Calado et al. J. Phycol. 2009. 45: 1195), а пресноводный Peridinium aciculiferum филогенетически близок к нему (Logares et al. Environ. Microbiol. 2008. 10: 1231). Выявление байкальских организмов, близких к членам данного семейства (рис. 4 клада N2; рис. 2, клада X), ещё более расширяет географию распространения динофлагеллят родственных роду Pfiesteria.

Во-первых, как и в европейских озерах, в Байкале, по всей вероятности, обитает холодолюбивый P. aciculiferum: мы выявили в планктоне фрагменты рДНК этого вида и, кроме того, P. aciculiferum упомянут в списках водорослей Байкала, хотя его морфологические исследования не велись. Согласно (Logares et al., 2008) этот вид недавно перешел к пресноводному образу жизни, что отличает его от большинства пресноводных динофлагеллят. Во-вторых, фрагменты ДНК, близкие к типовому для семейства роду Pfiesteria, хотя и с невысокой степенью достоверности, обнаружены в байкальских губках. При этом клада N2 (рис. 4) включает в себя ряд генетических вариантов таких последовательностей, что свидетельствует о довольно длительной эволюции данных динофлагеллят в Байкале. Возможно, мы имеем дело с ранее невыявленными планктонными организмами, накопленными за счёт фильтрации в губке, однако в изученной пробе планктона они отсутствовали. Учитывая, что многие виды сем. Pfiesteriaceae гетеротрофны, a Paulsenella vonstoschii, расположенная на рис. 4 в одной кладе (N2) с клонами из губки, ведет паразитический образ жизни (Kühn, Mediin. Protist. 2005. 156: 393), оправдано предположение о существовании гетеротрофной, возможно, связанной с губками группы динофлагеллят в Байкале.

Ряд представителей сем. Pfiesteriaceae токсичны для рыб и даже людей (Burkholder, Glasgow. Limnol. Oceanogr. 1997. 42: 1052), а значит и обнаруживаемые пресноводные члены семейства могут оказаться способными производить токсичные вещества. Уже показано, что Р. aciculiferum - один из трёх пресноводных динофлагеллят, оказывающих токсичное воздействие (Rengefors, Legrand. Limnol. Oceanogr. 2001. 46: 1990). Токсичность некоторых морских динофлагеллят зависит от места обитания (Taylor et al. Biodivers. Conserv. 2008 17:407). В свете этого, обнаружение P. aciculiferum в таком обособленном водоеме, как Байкал, полезно для изучения данного феномена в пресных водах.

Байкальские динофлагелляты вида Gymnodinium baicalense. Этот вид отнесен к роду Gymnodinium согласно данным оптической микроскопии (Антипова, 1955). Мы показали, что это фотосинтетик, массово цветущий подо льдом, мигрирующий к свету, и провели промеры его клеток, аналогичные проведенным Антиповой. Наши данные по апрельским популяциям 2008 и 2009 гг. сопоставимы с её данными по G. baicalense var. minor, хотя по очертанию это типичные G. baicalense. Упомянутые Антиповой особи длиною в 90 мкм нами не обнаружены. Сегодня считается, что Gymnodiniales -полифилетический порядок, и многие организмы отнесены к нему ошибочно. В недавней работе авторы (Daugbjerg et al. Phycologia. 2000 39: 302) существенно ограничили

род Gymnodinium, отнеся к нему лишь пресноводных G. fuscum (типовой вид для рода) и G. palustre, морских G. aureolum, G. catenatum, G. impudicum, G. nolleri, G. cf. placidum и G. chlorophorum (переименован в Lepidodinium chlorophorum из-за особенностей морфологии (Hansen et al. Phycol. Res. 2007. 55: 25)). Как следует из анализов трех генных маркеров, G. baicalense кластеризуется именно с этими видами, то есть филогенетически относится к истинным гимнодиниумам.

Самым близким к G. baicalense является неизвестный динофлагеллят, живущий в арктическом льду в районе Шпицбергена. Оба этих вида также сближает их приуроченность к ледовому покрову. Второй вид, близкий к байкальскому - это морской эвригалинный G. aureolum, вызывающий "цветение" воды. Пресноводный G. fuscum оказался в меньшей степени схож с байкальским видом (рис. 1). Мы полагаем, что G. baicalense относительно недавно проник в озеро из океана, возможно, являясь реликтом, сохранившимся на Байкале после того, как ушел ледник, с конца плиоцена покрывавший континент. Рисунок 2 показывает, что в планктоне присутствуют различные последовательности, близкие к G. baicalense, поэтому в будущем понадобится уточнение, обитает ли в Байкале один вид рода Gymnodinium или несколько близких. Крайне интересно также сравнить арктических и байкальских гимнодиниумов: вероятно, что байкальский вид приобрел некие локальные адаптации. Байкальские динофлагелляты рода Gyrodinium. При анализе библиотек клонов на основе ДНК из планктона выявили фрагмент 18S рДНК (рис. 2, клада N3), идентичный ДНК гетеротрофного вида Gyrodinium helveticum из японского пресноводного озера Шикотсу. Из байкальских губок также выделили фрагменты, практически идентичные этому виду (клоны M5-3BI и M5-14BR из клады N3, рис. 4). Учитывая, что при микроскопическом исследовании планктонных проб найден гетеротрофный динофлагеллят, чьи очертания и размеры соответствовали виду G. helveticum, мы соотнесли расшифрованные последовательности именно с ним. Таких динофлагеллят Антипова описала как Gymnodinium coeruieum, упомянув об их схожести с G. helveticum. По её мнению, различием между ними является более короткая продольная борозда, остроконическая без выростов верхушка и голубая окраска G. coeruieum (Антипова, 1955). Однако, накопленные на сегодня наблюдения свидетельствуют, что окраска не может являться важным отличием: часть байкальских особей, также как и ряд представителей японского варианта G. helveticum, бесцветны. Описаны варианты клеток G. helveticum, включающие характерные для байкальских особей «шапочки» (Takano, Horiguchi, 2004). Всё это, в совокупности со 100% генетическим сходством по рассмотренному нами маркеру, позволяет отнести представителя гетеротрофных байкальских динофлагеллят к роду Gyrodinium. Вероятнее всего, мы имеем дело с байкальским вариантом вида G. helveticum, космополитного для пресных вод умеренного климата и активного в течение всего теплого сезона. Размеры клеток промеренного нами G. coeruieum и японского G. helveticum совпадают. Байкальские динофлагелляты без определенной аффилиации. Часть последовательностей и из планктона, и из тканей губок кластеризовалась с низкой достоверностью с последовательностями известных динофлагеллят. Это относится к несколь-

ким последовательностям из губок, группирующимся с кладой гиродиниумов (N3, рис. 4,) и гимнодиниумов (N4, рис. 4), но отличных от байкальских планктонных Gyrodinium helveticum и Gymnodinium baicalense. Такие нуклеотидные фрагменты могут принадлежать еще неизученным байкальским динофлагеллятам, в том числе бентосным видам. Пресноводные бентосные динофлагелляты практически не известны: описан лишь один вид (Taylor et al. 2008). При анализе пробы планктона кроме последовательностей, идентичных известным планктонным динофлагеллятам (G. baicalense, Peridinium aciculiferum), мы выявили спектр нуклеотидных фрагментов, близких к первым, но имеющих некоторые замены (клада X, рис. 2). Они могут принадлежать двум выше названным видам: отражать либо их внутривидовые вариации, либо полиморфизм рДНК у отдельных особей этих двух видов. Но наиболее вероятным можно считать то, что эти фрагменты принадлежат видам, которые нельзя различить с помощью выбранного маркера (18S рДНК). Это подтверждается тем, что с помощью оптической микроскопии в данной пробе был замечен Peridinium baicalense, то есть часть найденных фрагментов должна принадлежать этому виду. Замечания по эволюции байкальских динофлагеллят. Проведенный анализ выявил присутствие в Байкале нескольких филогенетически далеких друг от друга групп динофлагеллят. Некоторые из них более близки к известным морским видам (см. N2, N3, N4, N7, рис. 4). Также в озере обитают Gyrodinium helveticum и Peridinium aciculiferum (рис. 2), относимые к динофлагеллятам, поздно освоившим пресные воды (Logares et al., 2007). Это указывает на сравнительно недавнюю колонизацию Байкала данными группами. Другие выявленные последовательности не имеют выраженного сходства с известными линиями (например, часть клонов из клады N3 и клон M5-33LI из клады N4, рис. 4). Лишь один генетический вариант динофлагеллят Байкала, несомненно, группировался с другими пресноводными видами (клада N1, рис. 4). Обнаружение в Байкале линий, родственных морским динофлагеллятам, не было ожидаемым, так как ранее анализируемые морские и пресноводные виды в целом не были достаточно близкими (Logares et al., 2007). Выявлено несколько гетерогенных кластеров байкальских клонов (например, N2 и N5, рис. 4), что позволяет предположить активно продолжающуюся эволюцию таких динофлагеллят в озере. Таким образом, по-видимому, виды динофлагеллят имеют различное время появления и происхождение в Байкале. Возможно, некоторые из них эндемичны для озера, в частности динофлагелляты из губок. Схожие заключения сделаны при изучении байкальских многоклеточных (Sherbakov. Trends Ecol. Evol. 1999. 14: 92).

Исследованные губки содержали примерно одинаковый набор динофлагеллят, включая потенциально симбиотических. Это согласуется с данными об отсутствии высокой специфичности динофлагеллят в морских губках (см. Granados et al., 2008). Единственным исключением стали последовательности ДНК, близкие паразиту Pisci-noodinîum sp. и отсутствующие в Lubomirskia incrustans. Наши данные указывают на одновременное присутствие двух групп из порядка Suessiales в одной губке. Ситуации, когда один хозяин содержит разные виды симбиотических динофлагеллят, известны в том числе и для морских губок (Granados et al., 2008).

выводы

1) На основе анализа специфичных последовательностей ДНК из метагеномов установлено, что динофлагелляты представлены в Байкале большим количеством видов, чем считалось ранее. Помимо известных для озера двух родов Gymnodinium и Peridinium, выявлены представители других родов и семейств: Gyrodinium helveticurrr, группа, родственная семейству Pfiesteriaceae; две группы порядка Suessiales; динофлагеллят, кластеризующийся с известными пресноводными видами (Woloszynskia pascheri, Cystodinium phaseolus) и ряд последовательностей динофлагеллят без определенной родовой принадлежности.

2) На основании анализа трёх молекулярных маркере^ (фрагменты генов 18S РНК и сох1, участок 5.8S-ITS2-28S рДНК) установлено, что вид Gymnodinium baicalense, ведущий подледный образ жизни, занимает филогенетическое положение среди истинных представителей рода Gymnodinium. Наибольшее родство он проявляет к динофлагелляту из арктических льдов Шпицбергена (99 BI и 98 ML), что, вероятно, указывает на его морское происхождение. Возможно, G. baicalense попал в Байкал во время последнего ледникового периода из Северного Ледовитого океана.

3) При генетическом исследовании пробы весеннего планктона Байкала, содержащей не менее 4 различных морфовидов динофлагеллят, выявлен спектр нуклеотидных фрагментов, слабо отличающийся от ДНК видов Gymnodinium baicalense и Peridinium aciculiferum и кластеризующийся с низкой достоверностью со свободноживущими, преимущественно морскими динофлагеллятами.

4) В планктоне Байкала выявлен фрагмент 18S рДНК космополитного вида Gyrodinium helveticum. Высказано предположение, что этот вид в Байкале ранее был описан как эндемик Gymnodinium coeruleum, для которого в ходе работы определили некоторые фенотипические признаки.

5) В пресноводных губках сем. Lubomirsküdae обнаружены последовательности ДНК динофлагеллят, неизвестных для байкальского планктона. Это две группы из порядка Suessiales; гетерогенная группа, близкая сем. Pfiesteriaceae; а также последовательности, кластеризующиеся с низкой достоверностью с родом Gyrodinium, и последовательность динофлагеллята, родственного типичным пресноводным видам ( Woloszynskia pascheri, Cystodinium phaseolus).

6) Две группы динофлагеллят из байкальских губок могут рассматриваться как потенциальные симбионты данных животных, так как филогенетически они относятся к порядку Suessiales, содержащему большинство симбиотических динофлагеллят беспозвоночных, в том числе морских губок.

7) Во всех трех исследованных губках (Baikalospongia intermedia, Baikalospongia recta и Lubomirskia incrustans) выявлено сходное разнообразие динофлагеллят. Возможным исключением является одна из групп порядка Suessiales, близкая к пресноводному паразиту Piscinoodinium sp.: она не обнаружена в L. incrustans.

8) Современные динофлагелляты Байкала относятся, по меньшей мере, к двум эволюционным и историческим линиям. Большинство групп филогенетически ближе к морским, а не к известным на данный момент пресноводным видам, что свидетельствует об их относительно недавнем появлении в Байкале. По-видимому, лишь некоторые виды представляют динофлагеллят, давно перешедших к пресноводному образу жизни.

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

(* - публикации в изданиях, рекомендуемых ВАК)

1) *Annenkova N.V., Lavrov D.V., Belikov S.I. Dinoflagellates associated with freshwater sponges from the ancient Lake Baikal // Protist. 2010. Published online on 3 September 2010. doi: 10.1016/j.protis.2010.07.002.

2) 'Анненкова H.B., Беликов С.И. Обнаружение в озерэ Байкал динофлагеллят, филогенетически близких к семейству Pfiesteriaceae // Вода: химия и экология. 2010. № 11. С. 8- 17.

3) 'Анненкова Н.В., Белых О.И., Деникина Н.Н., Беликов С.И. Идентификация представителей динофлагеллят озера Байкал на основе молекулярно-генетических данных // Доклады Академии Наук. 2009. Т. 426. № 4. С. 559 - 562.

4) Annenkova N.V., Belikov S.I. Freshwater dinoflagellates from Lake Baikal: free-living and sponge-associated diversity // Joint meeting of the I International Society of Protistologists and the British Society for Protist Biology: abstracts. Canterbury, UK: University of Kent, 2010. P. 17-18.

5) Annenkova N.V., Belykh O.I., Belikov S.I. Dinoflagellate genetic diversity during spring ice-covered period in Lake Baikal // Пятая Верещагинская Байкальская конф.: тез. докл. Иркутск: Аспринт, 2010. С. 60-62.

6) Анненкова Н.В., Беликов С.И., Белых О.И. Молекулярно-генетический и микроскопический анализ байкальского динофлагеллята Gymnodinium baicalense, вегетирующего в подледный период // Проблемы экологии. Чтения памяти профессора Кожова М.М.: тез. докл. межд. науч. конф. и межд. школы для молод, ученых. Иркутск: Иркутский гос. ун-т, 2010. С.195.

7) Анненкова Н.В., Беликов С.И., Белых О.И. Обнаружение динофлагеллят рода Gyrodinium в фитопланктоне и губках озера Байкал путём анализа нуклеотидных последовательностей // Водоросли: проблемы таксономии, экологии и использование в мониторинге: тез. докл. II всерос. конф. Сыктывкар: Институт биологии Коми НЦ УрО РАН, 2009. С. 219-222.

8) Анненкова Н.В., Беликов С.И. Динофлагелляты в глубоководной байкальской губке // X Съезд Гидробиологического общества при РАН: тез. докл. Владивосток: Дальнаука, 2009. С. 495.

9) Annenkova N.V., Danilovtseva E.N., Belikov S.I., Annenkov V.V. Nanorelief coatings with increased surface area of functional groups for DNA immobilization // Nanotechnology and Applications: proceedings of the IASTED intern, confer. Crete, Greece: ACTA Press. 2008. P. 41-46.

10) Анненкова H.B., Деникина H.H., Беликов С.И. Исследование симбиотических динофлагеллят байкальских губок // IV съезд Росс, общества биохимиков и молекулярных биологов: тез. докл. Новосибирск: Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, 2008. С. 262.

11) Беликов С.И., Анненкова Н.В. Симбиотические динофлагелляты некоторых пресноводных байкальских губок. Биоразнообразие и роль животных в экосистемах // IV межд. науч. конф.: тез. докл. Днепропетровск: ДНУ, 2007. С. 533.

Подписано в печать 20.10.2010 Печать Riso Усл.п.л. -1,0 Тираж: 130 экз.

Оперативная типография «Грань» ИНН 3812088580 664007, г. Иркутск, ул. Декабрьских Событий, д. 85 Тел.: (3952)294594

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Анненкова, Наталия Вадимовна

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Генетическое разнообразие простейших.

1.1.1 Позиция простейших с классификационной точки зрения.

1.1.2 Виды простейших, их количество и распространение.

1.2. Методы исследования генетического разнообразия простейших.

1.3. Общая характеристика динофлагеллят.

1.3.1 Морфология и генетические особенности.

1.3.2 Экология динофлагеллят.

1.3.3 Специфические адаптации.

1.3.4 Эволюция, биоразнообразие и биогеография динофлагеллят.

1.4 История изучения и роль динофлагеллят в экосистеме озера Байкал.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1 Сбор образцов.

2.2 Оптическая и сканирующая электронная микроскопия.

2.3 Выделение ДНК.

2.4 Конструирование специфических праймеров, полимеразная цепная реакция (ПЦР).

2.5 Клонирование фрагментов, определение нуклеотидных последовательностей, рестрикционный анализ (ПДРФ).

2.6 Филогенетический анализ.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ.

3.1 Динофлагелляты из весеннего подледного сообщества озера Байкал.

3.1.1 Общее описание динофлагеллят, развивающихся в весенний сезон.

3.1.2 Определение размерных характеристик беспанцирных планктонных динофлагеллят.

3.1.3 Изучение доминирующего в весеннем планктоне СутпосЛпшт Ьа1са1еже с помощью молекулярно-генетических маркеров.

3.1.4 Анализ динофлагеллятных нуклеотидных фрагментов 188рДНК из весеннего планктона Байкала.

3.2 Динофлагелляты, ассоциированные с байкальскими эндемичными губками

3.2.1 Аналнз динофлагеллятных последовательностей 18БрДНК.

3.2.2 Анализ фрагментов ДНК, содержащих участок 5.88-1Т82-288, динофлагеллят, ассоциированных с губками.

3.2.3 Распределение динофлагеллят между изученными байкальскими губками.

4. ОБСУЖДЕНИЕ.

4.1. Байкальские динофлагелляты порядка 8ие881а1ез.

4.2 Байкальские динофлагелляты, филогенетически близкие семейству Рйез1епасеае.

4.3. Байкальские динофлагелляты вида СутпосИтит Ъа1са1епБе.

4.4. Байкальские динофлагелляты рода Сугойтшт.

4.5. Байкальские динофлагелляты без определенного положения.

4.6. Замечания по эволюции байкальских динофлагеллят.

ВЫВОДЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Генетическое разнообразие планктонных и ассоциированных с губками динофлагеллят озера Байкал"

Актуальность работы. В последние десятилетия активное развитие методов микроскопии и генно-молекулярной идентификации позволило на качественно новом уровне исследовать одноклеточных эукариот (простейших). Выяснилось, что эти организмы играют огромную роль в биосфере и гораздо разнообразнее по своему происхождению и строению, чем считалось ранее [Baldauf, 2008]. Новые знания о простейших породили новые вопросы, в том числе связанные с их, часто весьма причудливой, генетикой и экологией. Один из таких вопросов, вызывающий острые дискуссии, - это проблема разнообразия видов простейших: существует ли относительно небольшое число видов, встречающихся повсеместно, или же разнообразие простейших велико, и ряд экосистем содержит специфических простейших [Taylor et al, 2006]. В пользу последнего свидетельствует наличие скрытого разнообразия: морфологически идентичные одноклеточные отличаются генетически, выявлены некоторые отличия на уровне физиологии (например, [Boenigk et al., 2006]). Также далеко не все простейшие одинаково культивируемы, и поэтому могут быть пропущены при анализе. Так, по-видимому, не выявлены многие паразитические и симбиотические микроорганизмы [Epstein, Lopez-Garcia, 2008]. На сегодня основное генетическое разнообразие простейших изучено для океанов, настоятельно требуются данные по пресным водоемам [Lopez-Garcia, Moreira, 2008]. Это позволило бы определить, насколько эволюционно отличаются от морских виды, перешедшие в другие условия существования. Кроме того, озера достаточно изолированы друг от друга и часто имеют свои особенности, таким образом, являясь вероятным местом для новых, адаптированных к конкретным условиям, видов.

Dinoflagellata - большая группа простейших, образующая вместе с Apicomplexa и Ciliophora супергруппу альвеолят. Эти жгутиковые одноклеточные могут питаться за счет фотосинтеза или гетеротрофно. Целый ряд морских динофлагеллят синтезирует сильные токсины [Wang, 2008]. Симбиотические динофлагелляты необходимы для развития коралловых рифов [Douglas, 2003]. В настоящей работе изучены представители класса Dinophyceae из пресноводного озера Байкал. Это древнейшее и самое глубокое озеро на планете — известный центр интенсивного видообразования, многие обитатели которого эндемичны. Простейшие в нем практически не изучены, особенно молекулярными методами. Динофлагелляты составляют важную часть планктона озера, являясь, особенно весною, важным источником пищи для зоопланктона, но об их разнообразии известно немного и только на основе данных оптической микроскопии [Kozhova, Izmest'eva, 1998]. Высказано предположение о наличии специфичных динофлагеллят в байкальских губках [Müller et al., 2007], но их систематическое положение не изучено. Цель и задачи исследования: В связи с вышеизложенным молекулярно-генетическая характеристика и определение видового состава динофлагеллят представляется важным шагом как для лучшего понимания организации экосистемы Байкала, так и для решения общих вопросов экологии и генетики простейших. Поэтому целью работы являлась сравнительная характеристика и анализ генетического разнообразия свободноплавающих и ассоциированных с губками динофлагеллят озера Байкал. Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1. Найти подходы к идентификации ДНК некультивируемых динофлагеллят, позволяющие охватить их наибольшее число.

2. Выяснить родственные связи эндемичного Gymnodinium baicalense, имеющего наибольшую численность среди динофлагеллят озера Байкал.

3. Определить генетическое разнообразие планктонных динофлагеллят в период их массового развития и уточнить фенотипические характеристики известных беспанцирных динофлагеллят.

4. Выявить специфичные нуклеотидные последовательности динофлагеллят в различных видах байкальских губок сем. Lubomirskiidae.

5. Определить филогенетическое положение байкальских динофлагеллят среди известных морских и пресноводных видов.

Научная новизна. Впервые с помощью молекулярно-генетических методов изучено разнообразие динофлагеллят в о. Байкал и исследованы динофлагелляты в пресноводных губках. В ходе работы впервые в пресноводных беспозвоночных обнаружены представители порядка 8иез81а1ез, ранее члены этой группы были известны как симбионты лишь морских беспозвоночных. Выявлен относительно большой спектр последовательностей ДНК динофлагеллят и определено их филогенетическое положение по отношению к известным видам. Впервые получены изображения эндемичного ОутпосИпшт Ьтса1ете при помощи сканирующей электронной микроскопии, установлено его недавнее морское происхождение.

1. В о. Байкал обитают, помимо известных двух родов ОутпосИпшт и РепсНтит, представители ряда других родов и семейств.

2. Вид ОутпосИтит Ьтса1ете занимает филогенетическое положение среди истинных представителей рода ОутпосИпшт и наиболее близок к динофлагелляту из арктического льда.

3. В эндемичных байкальских губках сем. Lubomirskiidae присутствуют нуклеотидные фрагменты неизвестных для планктона динофлагеллят. Из них две группы, относящиеся к порядку Suessiales, - потенциальные симбионты губок.

4. Большая часть динофлагеллят Байкала, по-видимому, имеет недавнее морское происхождение, меньшая — перешла к жизни в пресных водах давно. Научно-практическое значение работы. Подходы, применявшиеся в работе, могут использоваться для комплексного определения различных групп одноклеточных, особенно, не имеющих прочной клеточной стенки. Разработанные генные маркеры подходят для быстрой идентификации динофлагеллят. Полученные результаты расширяют наши знания о взаимодействии динофлагеллят с беспозвоночными, важны для понимания как особенностей динофлагеллят Байкала, так и общих закономерностей эволюции и расселения простейших. Обнаружение новых динофлагеллят позволяет проводить поиск новых полезных метаболитов, которые в том числе могут накапливаться в байкальских губках. Показано присутствие в Байкале Peridinium aciculifenim (вида, известного как токсичный). Полученные данные могут использоваться при чтении лекций в учебных заведениях. В базу данных GenBank депонировано 96 отличающихся друг от друга нуклеотидных последовательностей (номера доступа: FJ024297 -FJ024304, FJ823462 - FJ823502, GQ423575 - GQ423596, GU723481 - GU723491, I-IQ259032 - HQ259047). Филогенетические деревья, описывающее генетическое разнообразие динофлагеллят в губках, депонированы в базу данных TreeBase (URL: http://purl.Org/phylo/treebase/phylows/study/TB2:S 10600).

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на следующих конференциях: 2010 Joint meeting of the International Society of Protistologists and the British Society for Protist Biology (University of Kent, Canterbury, UK, 18-23 July 2010); Проблемы экологии: чтения памяти проф. М.М. Кожова (20-25 сентября 2010, Иркутск); II всероссийская конференция «Водоросли: проблемы таксономии, экологии и использование в мониторинге» (Сыктывкар, 5-9 октября 2009 г.); X Съезд ГБО при РАН (Владивосток, 28 сентября - 2 октября

2009 г.); международная конференция "Nanotechnology and Applications" of The International Association of Science and Technology for Development (Crete, Greece, 29 сентября - 1 октября 2008); IV съезд Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 11- 15 мая 2008 г.); IV международная конференция «Биоразнообразие и роль животных в экосистемах» (Днепропетровск, 9-12 октября 2007 г).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ, из них 3 работы - в журналах из списка, рекомендованного ВАК РФ. Вклад автора. Основные результаты диссертации получены и проанализированы автором самостоятельно. Работа по подсчёту численности и промерам клеток планктонных динофлагеллят сделана совместно с к.б.н. О. И. Белых. Структура и объем диссертации. Работа включает следующие разделы: введение, литературный обзор, материалы и методы, результаты, обсуждение, заключение, выводы, список использованной литературы (168 источников, из них 148 на английском языке) и приложение. Диссертация изложена на 136 страницах, содержит 22 рисунок и 5 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная генетика", Анненкова, Наталия Вадимовна

ВЫВОДЫ

1) На основе анализа специфичных последовательностей ДНК из метагеномов установлено, что динофлагелляты представлены в Байкале большим количеством видов, чем считалось ранее. Помимо известных для озера двух родов Gymnodinium и Peridinium, выявлены представители других родов и семейств: Gyrodinium helveticum', группа, родственная семейству Pfiesteriaceae; две группы порядка Suessiales; динофлагеллят, кластеризующийся с известными пресноводными видами (Woloszyriskia pascheri, Cystodinium phaseolus) и ряд последовательностей динофлагеллят без определенной родовой принадлежности.

2) На основании анализа трёх молекулярных маркерах (фрагменты генов 18S РНК и coxl, участок 5.8S-ITS2-28S рДНК) установлено, что вид Gymnodinium baicalense, ведущий подледный образ жизни, занимает филогенетическое положение среди истинных представителей рода Gymnodinium. Наибольшее родство он проявляет к динофлагелляту из арктических льдов Шпицбергена (99 BI и 98 ML), что, вероятно, указывает на его морское происхождение. Возможно, G. baicalense попал в Байкал во время последнего ледникового периода из Северного Ледовитого океана.

4) В планктоне Байкала выявлен фрагмент 18S рДНК космополитного вида Gyrodinium helveticum. Высказано предположение, что этот вид в Байкале ранее был описан как эндемик Gymnodinium coerideum, для которого в ходе работы определили некоторые фенотипические признаки.

5) В пресноводных губках сем. Lubomirskiidae обнаружены последовательности ДНК динофлагеллят, неизвестных для байкальского планктона. Это две группы из порядка Suessiales; гетерогенная группа, близкая сем. Pfíesteriaceae; а также последовательности, кластеризующиеся с низкой достоверностью с родом Gyrodinium, и последовательность динофлагеллята, родственного типичным пресноводным видам (Woloszynskia pascheri, Cystodinium phaseolus).

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Анненкова, Наталия Вадимовна, Новосибирск

1. Антипова H.JI. Новые виды рода Gymnodinium Stein (Gymnodiniaceae) из озера Байкал // Доклады Академии Наук СССР. 1955. Т. 103. С. 325-328.

2. Антипова H.JI. Межгодовые изменения в фитопланктоне Байкала в районе Больших котов за период 1960-1970 гг. // Продуктивность Байкала и антропогенные изменения его природы / под ред О.М. Кожовой. Иркутск: Иркутский гос. ун-т, 1974. С. 75-94.

3. Воронцов H.H. Синтетическая теория эволюции: ее источники, основные постулаты и нерешенные проблемы // Журнал Всесоюзного химического общества им Д. И. Менделеева. 1980. Т. 25. № 3. С. 295-314.

4. Вотинцев К.К., Мещерякова А.И., Поповская Г.И. Круговорот органического вещества в озере Байкал. Новосибирск: Наука, 1975. 188 с.

5. Глик Б., Пастернак Дж. Молекулярная биотехнология. Принципы и применение / пер с англ. М.: Мир, 2002. 589 с.

6. Грачев М.А. О современном состоянии экологической системы озера Байкал. Н.: Изд-во СО РАН, 2002.156 с.

7. Грин Н., Стаут У., Тейлор Д. Биология / пер. с англ. под ред. Р. Conepa. М.: Мир, 1990. Т. 3. 376 с.

8. Ефремова С.М. Губки (Porifera) // Озеро Байкал: аннотированный список фауны озера Байкал и его водосборного бассейна. Н.: Наука, 2001. Т. 1. Кн. 1. с. 179-192.

9. Киселев И.А. Панцирные жгутиконосцы (Dinoflagellata) морей и пресных вод // определитель по фауне СССР. 33. М.; Л.: Изд-во АН СССР, 1950. - 280 с.

10. Кобанова Г.И. О морфологии и жизненном цикле Gymnodinium baicalense Ant. (Dinophyta) из озера Байкал // Сибирский экологический журнал. 2009. № 6. С. 899-905.

11. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М.: Мир, 1984. 480 с.

12. Мейер К.И. Введение во флору водорослей озера Байкал // Бюллетень Московского общества испытателей природы. Отдел биологический. 1930. Т. 39. С.179-400.

13. Оболкина JI.A., Бондаренко H.A., Дорощенко Л.Ф., Горбунова Л.А., Моложавая O.A. О находке криофильного сообщества в озере Байкал // Доклады Академии Наук. 2000. Т. 371. № 6. С. 815-817.

14. Основы теоретической систематики: Учеб. Пособ / Глущенко В.И., Акулов А.Ю., Леонтьев Д.В., Утевский С.Ю. Харьков: ХНУ, 2004. 110 с.

15. Зоология беспозвоночных в двух томах. От простейших до моллюсков и артропод / под ред. В. Вестхайде и Р. Ригера. М.: Т-во научных изданий КМК, 2008. Т. 1. 512 с.

16. Происхождение Байкала // Байкал: атлас / под ред. Г.И. Галазия. М., 1993. 7 С.

17. Ребриков Д.В., Саматов Г.А., Трофимов Д.Ю., Семёнов П.А., Савилова A.M., Кофиади И.А., Абрамов Д.Д. ПЦР в реальном времени. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2009. 215 с.

18. Сулимова Г.Е. ДНК-маркеры в генетических исследованиях: типы маркеров, их свойства и области применения. 2004. Электронный ресурс. URL: http://lab-cga.ru/articles/JornalO 1/Statial .htm (дата обращения: 6.09.2010).

19. Таничев А.И., Бондаренко H.A. Свободноживущие жгутиковые // Пелагобионты Байкала: атлас и определитель / под ред. O.A. Тимошкина. Новосибирск: Наука, 1995. С. 146-181.

20. Aligizaki К., Katikou P., Nikolaidis G., Panou A. First episode of shellfish contamination by palytoxin-like compounds from Ostreopsis species (Aegean Sea, Greece) // Toxicon. 2008. V. 51. № 3. P. 418-427.

21. Algal toxins: nature, occurrence, effect and detection / ed. Evangelista E., Barsanti L., Frassanito A. M., Passarelli V., Gualtieri P. Springer: Science, 2008. 399 p.

22. Anderson D.M., Lobel P.S. The continuing enigma of ciguatera // Biological Bulletin. 1987. V. 172. P. 89-107.

23. Andrsen R.A. What to do with protists? // Australian Systematic Botany. 1998. V. 11. P. 185-201.

24. Baillie B.K., Belda-Baillie C.A., Maruyama T. Conspecificity and Indo-Pacific distribution of Symbiodinium genotypes (Dinophyceae) from giant clams // Journal of Phycology. 2000. V. 36. P. 1153-1161.

25. Baker A.C. Flexibility and specificity in coral-algal symbiosis: diversity, ecology, and biogeography of Symbiodinium II Annual Review of Ecology, Evolution, and Systematics. 2003. V. 34. P. 661-689.

26. Baldauf S.L. An overview of the phylogeny and diversity of eukaryotes // Journal of Systematics and Evolution. 2008. V. 46. № 3. P. 263-273.

27. Belda-Baillie C.A., Baillie B.K., Maruyama T. Specificity of a model cnidarian-dinoflagellate symbiosis // Biological Bulletin. 2002. V. 202. P. 74-85.

28. Berney C., Fahrni J., Pawlowski J. How many novel eukaryotic 'kingdoms'? Pitfalls and limitations of environmental DNA surveys // BMC Biology. 2004. V. 2. P. 1-13.

29. Boenigk J., Pfandl K., Garstecki T., Novarino G., Chatzinotas A. Evidence for geographic isolation and signs of endemism within a protistan morphospecies // Applied and Environmental Microbiology. 2006. V. 72. P. 5159-5164.

30. Burkholder M.J., Glasgow H.B. Pjiesteria piscicida and other Pfesteria-like dinoflagellates: behavior, impacts, and environmental controls // Limnology and Oceanography. 1997. V. 42. №. 5. P. 1052-1075.

31. Calado A.J., Craveiro S.C., Daugbjerg N., Moestrup 0. Description of Tyrannodinium gen. nov., a freshwater dinoflagellate closely related to the marine Pfiesteria-like species II Journal of Phycology. 2009. V. 45. P. 1195-1205.

32. Calliari D., Corradini F., Flaim G. Dinofagellate diversity in Lake Tovel // Studi

33. Trentini di Scienze Naturali Acta Biologica. 2004. V. 81. P. 351-357.f

34. Chen M:, Chen F., Yu Y., Ji J., Kong F. Genetic; diversity of eukaryotic microorganisms in Lake Taihu, a large shallow subtropical lake in China // Microbial Ecology. 2008. V. 56. P. 572-583.

35. Coats D.W.,. Kim S., Bachvaroff T.R., Handy S., Delwiche C.F. Dinophycean parasites of tintinnids // Joint meeting of the International Society of Protistologists and the British Society for Protist Biology. Canterbury: University of Kent, 2010. P. 24.

36. Coffroth M.A., Santos S.R. Genetic diversity of symbiotic dinoflagellates in the genus Symbiodinium II Protist. 2005. V. 156. P. 19-34.

37. Dodge D.J. The fine structure of chloroplasts and pyrenoids in some marine dinoflagellates // Journal of Cell Science. 1968. V. 3. P. 41-48.

38. Douglas A.E. Coral bleaching-how and why? // Marine Pollution Bulletin. 2003. V. 46. P. 385-392.

39. Epstein S., Löpez-Garcia P. "Missing" protists: a molecular prospective // Biodiversity and Conservation. 2008. V. 17. P. 261-276.

40. Farmer M.A., Fitt W.K., Trench R.K. Morphology of the symbiosis between Cörculum cardissa (Mollusca: Bivalvia) and Symbiodinium corculorum (Dinophyceae) // Biological Bulletin. 2001. V. 200. P. 336-343.

41. Fenchel T., Finlay B.J. The diversity of microbes: resurgence of the phenotype // Philosophical Transactions of the Royal Society B: Biological. 2006. V. 361. P. 1965-1973:

42. Fensome R.A., Saldarriaga J.A., Taylor F.J.R. Dinoflagellate phylogeny revisited: reconciling-morphological and molecular based phylogenies // Grana. 1999. V. 38. P. 66-80.

43. Finlay B.J. Global dispersal of free-living microbial eukaryote species // Science. 2002. V. 296. P. 1061-1063.

44. Finlay B.J. Protist taxonomy: an ecological perspective // Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences B. 2004. V. 359. P. 599-610.

45. Fryxell G.A. Survival Strategies of the Algae. New York: Cambridge University Press, 1983. 144 p.

46. Gajewskaja N.S. Zur oekologie, morphologie und systematik der Infusorien des Baikalsees. Stuttgart: Bibliotheca Zoologica, 1933. Bd. 32. 298 s.

47. Gonzalez J.M., Zimmermann J., Saiz-Jimenez C. Evaluating putative chimeric sequences from PCR-amplified products // Bioinformatics. 2005. V. 21. № 3. P. 333-337

48. Gray M.W., Lang B.F., Burger G. Mitochondria of protists // Annual Review of Genetics. 2004. V. 38. P. 477-524.

49. Guindon S., Gascuel O. A simple, fast and accurate algorithm to estimate largephylogenies by maximum likelihood // Systematic Biology. 2003. V. 52. P. 696704.

50. Hackett J.D., Anderson D.M., Erdner D., Bhattacharya D. Dinoflagellates: a remarkable evolutionary experiment//American Journal of Botany. 2004. V. 91. P. 1523-1534.

51. Hamkalo B.A., Rattner J.B. The structure of a mesokaryote chromosome //

52. Harrison P.L., Wallace C.C. Reproduction, dispersal and recruitment of Scleractinian corals // Coral reef ecosystems / Ed. Z. Dubinsky Amsterdam: Elsevier; 1990. P. 133-207.

53. Hill M., Wilcox T. Unusual mode of symbiont repopulation after bleaching in Anthosigmella varians: acquisition of different zooxanthellae strains // Symbiosis. 1998. V. 25. P. 279-289.

54. Hofmann G.E., Todgham A.E. Living in the now: physiological mechanisms to tolerate a rapidly changing environment // Annual Review of Physiology. 2010. V. 72. P. 22.1-22.19.

55. Hoppenrath M., Leander B.S. Character evolution in polykrikoid dinoflagellates // Journal of Phycology. 2007. V. 43. P. 366-377.

56. Hoppenrath M., Saldarriaga J.F. Dinoflagellates. 2008. Version 16 September 2008. Электронный ресурс. URL: http://tolweb.Org/Dinoflagellates/2445/2008.09.l 6 in The Tree of Life Web Project, http://tolweb.org/ (дата обращения: 20.05.2010).

57. Howe C.J., Nisbet R.E.R., Barbrook A.C. The remarkable chloroplast genome of dinoflagellates // Journal of Experimental Botany. 2008. V. 59. № 5. P. 10351045.

58. Jackson C.J., Norman J.E., Schnare M.N., Gray M.W., Keeling P.J. and Waller R.F. Broad genomic and transcriptional analysis reveals a highly derived genome in dinoflagellate mitochondria // BMC Biol. 2007. V. 5. P. 1-41.

59. Karlsson J., Bystrom P., Ask J., Ask P., Persson L., Jansson M. Light limitation of nutrient-poor lake ecosystems //Nature. 2009. V. 460. P. 506-510.

60. Keeling P.J., Burger G., Durnford D.G., Lang B.F., Lee R.W., Pearlman R.E., Roger A.J., Gray M.W. The tree of eukaiyotes // Trends in Ecology and Evolution. 2005. V. 20. № 12. P. 670-676.

61. Keeling P.J. Functional and ecological impacts of horizontal gene transfer in eukaryotes // Current Opinion in Genetics and Development. 2009. V. 19. P. 613-619.

62. Kibbe W.A. OligoCalc: an online oligonucleotide properties calculator // Nucleic Acids Research. 2007. V. 35. № 2. P. W43-W46.

63. Jeunesse T.C. Investigating the biodiversity, ecology, and phylogeny ofendosymbiotic dinoflagellates in the genus Symbiodinium using the ITS region: in search of a "species" level marker // Journal of Phycology. 2001. V. 37. P. 866-880.

64. Maddison W.P., Maddison D.R. Mesquite: a modular system for evolutionary analysis. Version 2.72. 2009. Электронный ресурс. URL: http://mcsquiteproiect.org (дата обращения: 04.06.2010).

65. Mariani S., Piscitelli M.P., Uriz M.J. Temporal and spatial co-occurrence in spawning and larval release of Cliona viridis (Porifera : Hadromerida) // Journal of the Marine Biological Association UK. 2001. V. 81. P. 565-567.

66. Marlow H.Q., Martindale M.Q. Embryonic development in two species of scleractinian coral embryos: Symbiodinium localization and mode of gastrulation //Evolution and Development. 2007. V. 9. P. 355-67.

67. Marshall A. Calcification in hermatypic and ahermatypic corals // Science. 1996: V. 271. P. 1788-1792.

68. Masuda Y. Electron Microscopic study on the Zoochlorellae of some freshwater sponges // New Perspectives in Sponge Biology / ed Rützler К. Washington D.

69. Moestrup 0., Lindberg K., Daugbjerg N. Studies on woloszynskioid dinoflagellates V. Ultrastructure of Biecheleriopsis gen. nov., with description of Biecheleriopsis adriatica sp. nov. // Phycological Research. 2009b. V. 57. P. 221-237.

70. Montresor M., Procaccini G., Stoecker D.K. Polarella glacialis, gen. nov., sp. nov. (Dinophyceae): Suessiaceae are still alive! // Journal of Phycology. 1999. V. 35. № l.P. 186-197.

71. Nisbet R.E.R., Hiller R.G., Barry E.R., Skene P., Barbrook A.C., Howe C.J. Transcript analysis of dinoflagellate plastid gene minicircles // Protist. 2008. V. 159. P. 31-39.

72. Noguchi T., Arakawa O. Tetrodotoxin distribution and accumulation in aquatic organisms, and cases of human intoxication // Marine Drugs. 2008. V. 6. P. 220242.

73. Okolodkov Y.B. An ice-bound planktonic dinoflagellate Peridiniella catenata (Levander) Balech: morphology, ecology and distribution // Botanica Marina. 1999. V. 42. P. 333-341.

74. Ordas M.C., Fraga S., Franco J.M., Ordas A., Figueras A. Toxin and molecular analysis of Gymnodinium catenation (Dinophyceae) strains from Galicia (NW Spain) and Andalucia (S Spain) // Journal of Plankton Research. 2004. V. 26 №. 3. P. 341-349.

75. Oren A. Prokaryote diversity and taxonomy: current status and future challenges // Philosophical Transactions of the Royal Society of London Series B-Biological Sciences. 2004. V. 359. P. 623-638.

76. Pochon X., Pawlowski J. Evolution of the soritids-Symbiodinium symbiosis // Symbiosis. 2006. V. 42. P. 77-88.

77. Porto I., Granados C., Restrepo J.C., Sanchez J.A. Macroalgal-associated dinoflagellates belonging to the genus Symbiodinium in Caribbean Reefs // PLoS ONE. 2008. V. 3 № 5. P. e2160.

78. Posada D. ModelTest Server: a web-based tool for the statistical selection of models of nucleotide substitution online // Nucleic Acids Research. 2006. V. 34. P. W700-W703.

79. Potter D., Lajeunesse T.C., Saunders G.W., Anderson R.A. Convergent evolution masks extensive biodiversity among marine coccoid picoplankton // Biodiversity Conservation. 1997. V. 6. P. 99-107.

80. Rengefors K., Karlsson I., Hansson L.-A. Algal cyst dormancy a temporal escape from herbivory // Proceedings of the Royal Society of London B' Biological Sciences. 1998. V. 265. P. 1353-1358.

81. Rengefors K., Legrand C. Toxicity in Peridinium aciculiferum—an adaptive strategy to outcompete other winter phytoplankton? // Limnology and Oceanography. 2001. V. 46. P. 1990-1997.

82. Rengefors EC, Meyer B. Peridinium euryceps sp. nov. (Peridiniales, Dinophyceae), a cryophilic dinoflagellate from Lake Erken, Sweden // Phycologia. 1999. V. 37. P. 284-291.

83. Rengefors K. Freshwater dinoflagellates life history and HAB potential // Life histories of microalgal species causing harmful blooms: report of a Europ workshop. 2001, p. 64-66.

84. Rogers S.O., Bendich A.J. Extration of DNA from milligram amounts of fresh, herbarium and mummified plant tissues // Plant Molecular Biology. 1985. V. 5. P. 69-76.

85. Ronquist F., Huelsenbeck J.P. MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models // Bioinformatics. 2003. V. 19. № 12. P. 1572-1574.

86. Rosell D. Effects of reproduction in Cliona viridis (Hadromerida) on zooxanthellae // Scientia Marina. 1993. V. 57. P. 405-413.

87. Schultz M., Kiorboe T. Active prey selection in two pelagic copepods feeding on potentially toxic and non-toxic dinoflagellates // Journal of Plankton Research.2009. V. 31. № 5. P. 553-561.

88. Schwarz J.A., Krupp D.A., Weis V.M. Late larval development and onset of symbiosis in the scleractinian coral Fungia scutaria II Biological Bulletin. 1999. V. 196. P. 70-79.i a

89. Schwarz J.A., Weis V.M., Potts D.C. Feeding behavior and acquisition of zooxanthellae by planula larvae of the sea anemone Anthopleura elegantissima II Marine Biology. 2002. V. 140. P. 471-478.

90. Shaked Y., de Vargas C. Pelagic photosymbiosis: rDNA assessment of diversity and evolution of dinoflagellate symbionts and planktonic foraminiferal hosts // Marine Ecology Progress Series. 2006. V. 325. P. 59-71.

91. Shears N.T., Ross Ph.M. Blooms of benthic dinoflagellates of the genus Ostreopsis; an increasing and ecologically important phenomenon on temperate reefs in New Zealand and worldwide // Harmful Algae. 2009. V. 8. № 6. P. 916-925.

92. Sheng J., Edwin M., Katz J., Adolf J.E., Place A.R. A dinoflagellate exploits toxins to immobilize prey prior to ingestion // Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 2010. V. 107. № 5. P. 2082-2087.

93. Sherbakov D.Y. Molecular phylogenetic studies on the origin of biodiversity in Lake Baikal II Trends in Ecology and Evolution. 1999. V. 14. P. 92-94.

94. Shipunov A.B. Systema Naturae or the outline of living world classification // Protistology. 2009. V. 6. № 1. P. 3-13.

95. Siano R., Montresor M., Probert I., Not F., deVargas C. Pelagodinium gen. nov. and P. beii comb, nov., a dinoflagellate symbiont of planktonic foraminifera // Protist. 2010. V. 161. P. 385-399.

96. Siu G.K.Y., Young M.L.C., Chan D.K.O. Environmental and nutritional factors which regulate population dynamics and toxin production in the dinoflagellate Alexandriwn catenella // Hydrobiologia. 1997. V. 352. P. 117-140.

97. Skovgaard A., Massana R., Balague' V., Saiz E. Phylogenetic position of the copepod-Infecting parasite Syndinium turbo (Dinoflagellata, Syndinea) // Protist. 2005. V. 156. P. 413-423.

98. Skovgaard A., Daugbjerg N. Identity and systematic position of Paradinium poucheti and Other Paradinium-like parasites of marine copepods based on morphology and nuclear-encoded SSU rDNA // Protist. 2008. V. 159. P. 401-413.

99. Takano Y., Horiguchi T. Surface ultrastructure and molecular phylogenetics of four unarmored heterotrophic dinoflagellates, including the type species of the genus

100. Gyrodinium (Dinophyceae) I I Phycological Reserch. 2004. V. 52. P. 107-116.

101. Talarmin H., Droguet M., Pennec J.P., Schroder H.S., Muller W.E.G., Gioux M., Dorange G. Effects of a phycotoxin, okadaic acid, on oyster heart cell survival // Toxicological and Environmental Chemistry. 2008. V. 90. № 1. P. 153-168.

102. Tamura K., Dudley J., Nei M., Kumar S. MEGA4: molecular evolutionary genetics analysis (MEGA) software version 4.0 // Molecular Biology and Evolution: 2007. V. 24. P. 1596-159.

103. Taylor F.J.R., Hoppenrath M., Saldarriaga J.F. Dinoflagellate diversity and distribution //Biodiversity and Conservation. 2008. V. 17. P. 407-418.

104. Thornhill D.J., Lajeunesse T.C., Santos S.R. Measuring rDNA diversity in eukaryotic microbial systems: how intragenomic variation, pseudogenes, and PCR artifacts confound biodiversity estimates // Molecular Ecology. 2007. V. 16. P. 53265340.

105. Thornhill D.J., Xiang Y., Fitt W.K., Santos S.R. Reef endemism, host specificity and temporal stability in populations of symbiotic dinoflagellates from two ecologically dominant Caribbean corals // PLoS ONE. 2009. V. 7. P. e6262.

106. Timoshkin O.A. Biology of Lake Baikal: "White spots" and progress in research // Berliner Geowissenschaftliche Abhandlungen E. 1999. V. 30. P. 333-348.

107. Toller W.W., Rowan R., Knowlton N. Zooxanthellae of the Montastraea annularis species complex: patterns of distribution of four taxa of Symbiodinium on different reefs and across depths // Biological'Bulletin. 2001. V. 201. P. 348359.

Информация о работе

Анненкова, Наталия Вадимовна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2010
ВАК 03.01.07

Диссертация

Генетическое разнообразие планктонных и ассоциированных с губками динофлагеллят озера Байкал - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы