Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический контроль биосинтеза канамицина культурой Streptomyces kanamyceticus

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический контроль биосинтеза канамицина культурой Streptomyces kanamyceticus"

.л > #

Мшштерство охорони здоров'я Украши Украшський науковий ппешчний центр

На правах'рукопису

Голець Леся Михаил 1вна

Генетичний контроль бюсинтезу канамщину культурою Б^ер^тусеБ капатусеИст

03.00.15 - Генетика

Автореферат

дисертацп на здобуття вченого ступеня кандидата бюлопчних наук

КиТв 1997

ДисереаЩев е рукопис

Роботу зикрчано в дабораторП генетики, селекцЛ та генетич-но! 1нхенер11 продуцент^ антиб1отик1в Льв1вського державного ун1верситету 1м.I.«ранка

Наукотхй кер1шм( - кандидат 01олог1чних наук, доцент Федоренко В.О.

041д1йя1 оасиева - доктор б1олог1чнях наук, професор Стародуб Ы.Ф.

Праз1диа орган!зац1я - Нац1ональний ун1верситет 1мен1

Захист в1дбудеться 25 кв1тня 1997 року о _ год на

зас1данн1 Спец1ал18оаано1 вчено! ради Д 01.37.03 при Укра-1нськоыу науковоиу г1г1ен1чноиу центр!.(254660, Ки1в-94, вул. Попудренка.бО)

3 дисертац1ею мохна ознайоиитись в науков1й ¿1бл1отец1 Укра1нського наукового г1г1ен1чного центру за адресою: м.Ки!в, вул. Попудренка.бО.

Автореферат роз 1 слано 11 О'Ь__ 1997 року

кандидат 01олог1чвих наук, доцент Шинкаренко Л.М,

Т.Г.Шэвченка

Вчений секретар Спец1ал1зовано1 вчено1 ради, кандидат б1огог1чких наук

9лгдхшд яаглюе'жпвяа п2ш1.

Аятушвнкггь socalase®. Канаы1цин А -аы1вогл1козидний ан-т2й1отак ыеднчного призвачешш 8 пироким спектром антиы1кробно1 Д11. ахтквний як проти граа-негативних, так 1 проти грам-пози-тивних Сактер1й - з0удпкк1з 1нфекц!йних аачворозань. КанаШцин викоркстовуеться тал» 1 як вих!днкй продукт для х1ы1чного синтезу ам1кацину - одного з найб1дьп ефгктизких в даний час анти-б1опк1в. Продуцентом кая аы1щшу А 1 бшш до га ого за структуре» канам1цкн!в В та С в актином1цегаа культура Streptomyces kanaraycetlcus. Str. kanarr/cet leus слабо значений в генетичнему в1дновенн1. S toio даяих про генетячний контроль б!осинтезу ка-наи1цину та геаетачн1 иехаа1зии високо! гнтиб1отично1 зктивност1 стаи!в-продуцент1в. Розробкз гезеткчккх та генно-!яженернкх п1д-ход1в у ксЕструязаяи1 прсиисловнх продуцент! в немсилива без роз-робга саеШально! генетик:! Str. kana-nyeet leus. Канаы!цкн А е представниизы 2-дезокскстрептаи!нозих анткб1откк1в i Str. kaiœycet icos uczэ розглядатися як моделыгай об'сет для вив-чення генетичнего контроля С1сс:шгезу гат1:51огак!з.

12з?з i ss^asri ¿pzsî^ssâ. Ыетс-а рсботи е.вивчення гене-гичного контроля б!осинтезу гсалаЛихну 1сультурса Str.kana-mycetlcus. Для досягецза ыети буля поставлен! тач! завдання: -отркыати колекцЛ генеткчно цардазашк пгггм!в з р!зккни влас-тивостяыи: ауксотрсфних, з nöpysemai б!оскнтезом канам1цину (Кап"), 1з зм1нексо р9зкстентн!стз до аЛноглИссзиднкх актко'о-tükIb, 1з зы!ненсп ката5ол1тнсэ penpecíra б!осинтезу каяамьцину дхерелачи вуглецв: -1денткф!кувати гепегичн1 локуси, со коктродиоть р1зн1 етапи б1осинтезу. кангм1цияу; локал1зуватн иаркерн ауксотрофност!, кап-мутац!1 та мутацИ ст1йкост1 до аатаб1отик!в на генетичн1й карт1 Str.kanamycetlcus.

-вивчити вшив даерел ьугледа на б1осинтез канаШцину у • мутая-

- г -

т1в Str.kanamycetlcus 8 piзною аяткб1отичнаю активн1стю;

Еаукога швгзвз. Створено кодекцН гекеткчно наркованих му-тант1в Str.kanamycetlcus.1денткф1ковано 6 генетичних локус1в, цо контролшп» р1зн1 етапи б1осингезу канач1цину. Виявлено хромо-comhI перебудови у нестабШного ыутанта kanl2. Визначено розм1-ри хромосоми Str.kanamycetlcus. Побудоваяо генетичну карту Str.kanamycetlcus, на як1й локад18овано 11 генеткчиих маркер1в.

КгутеЕО-щггяткчна ц1ин1сзъ робсии. Шдходи до вивчення гене-тичного контроля б1осинтезу канам1цину ыояуть бути застоссван! до проыислових штаы1в-яродуцент1в 2-дезоксистрептам1нових анти-б1отик1в. Мутанта з порусенкм б1ссиЕтевом канамЩнну искуть бути вюсористая! в експеркментах по ыутасинтезу, як рецнп1внти для кдонувазня ген1в б!ос;штезу. Му^антй, ст1йк! до 2-дезокси-1)-гло-кози. е перспективнкшг для отрицания високопродуктнвних вта-и1в-продуцект1в канам1цину.

Аяробад1я робогя. Матер1ади дисертацП представляйся на VII Нац1ональн1й'кок$орекц11 з виробництва 1 застосуваняя анткб1оти-к1в, Разград (Болгар1я), 1990; VI з'Тзд! Укра1нського товарнства генетик1в 1 селекц1опер!в Jm.M.I.Вавилова, Полтава, 1992; I з'-1зд1 Укра1нського к1кроб1ояог1чкого товариства, Одеса, 1993; VII Шжнароднсму сшюз1ум1 э генетики проьшслових и1кроорган!зм1в, Монреаль (Канада), 1994; IX Шязародноыу сиьшоз1уи1 'з 61олог11 зктином1цет1в > Москва. (Рос1я), 1994; XI конферекцП Шкецького товарнства вагаоно! Шкроб1оЕог11 '[Б1олог1я активом1цет1в", Шшсте? (Н1ыеташа). 1995; наукоанх конференц1ях Льв1вського держун1верснтету.

Еуйз1кацИ.За результатами дксертацП опубл1ковано 11 роб 1т.

Структура та обсяг робота. Дксертац1я складаетьса з 6 розд!-л1в:"Вступ","0гляд лИератури", "Матер1али та методи","Результата та 1х обговорення", "Висновки" та "Список л1тератури". Роботу ьккладенс на 1СС стр1нках машшописного тексту, в т.ч.27 таблиць

та 28 рнсунк1в. Список л1тератури вкоочав 185 найменувань. :

ИАТЕР1АЛИ ТА МЕГГОДИ.

Бактер1адьн1 ггташ. У робот 1 викоркстая1 птами Str.kana-nycetlcus 1375 ira 1 1з ыуаеэ куатур ИЩА (м.Носкза), а такса Ix «утазгн, отркман1 з дза1й робот1. Як тест-культуру при визвачен-н1 антЕб1отнчно1 гктивност1 Str.kansnycetlcus викоркстовуваги Bacillus sycoldes 537.

Серадовкгд та уыови кудьтавувачяя. Для вирощуваяня птгм1в агстиксы1цет1в викорнстовуваги повноц1нн1 середов;ща СР-6 ГЛо-иовсказ Н.Д. и др.,19711 та alвсяко (Гаузе, 1883]. В1дб1р рекои-б1нант1в у схрещуваннях, визначення генетичнкх ыаркер1в та р1вня с71йкост1 до аяткб1откк1в проводили на ы1в!мальному середовщ1 (MC) tHopxood et al. ,19851. Шцая1й для отркмаяня протопласт!в, а тгхол для вид1лення сумгрно! ДНК, вкрссуваги в р1дких середо--ве^зх YELîE, S. TS3. Регенерзц1в прототаст1в проводил! ка сере-дозк^зх R2, R2YE, R2T CHoprood et al. 1935]. Для зкзначення гнти-б1отично! активпЬст! Str.kananr/cetlcus вигаркстовувзля середсви-Ba:Sn, MgYE. CFY Otóchlko et al. 19333.

Визначошш акткб1отично! активное?! птаЛз Str. kansmyce-tlcus проводили Clc.-cri4Hi2.i методом дн^уз11 з агар з ' тест-культуре® B.mycoldes S37.

Отриыандя та 1денп:Мкап1» кутаат1в Str. kaiarycetlcus проводи! га иетодикезэ IKcptfood et al .19851.

Зл5тн!сть коп-мутзнт1в го косгатезу визначаги за методом [Delle et al..19701.

Уткд1гац1а глркозк з середовквд дтамами Str. kananyeet leus визначади ферментативюш негоден sa допсыогоо д1агностичного набору "Д1аглюк".

Тонкшарову хроматограф1ю иетаОол!т1в, як1 утвороэть втами Str.kananyceticus проводили на стШкагелевих шастинах в -систем!

розчянник1в п-пропадал : БХ водннй ам1ах (3:2). Хроматограми проявляли ва дошэыогсю 32 розчину н1нг1дрину в буталол!.

Визначення концентрацП каяамЩину А 1 2-дезексистреггтаы1ну проводили методом скануючо! спектрофотометр!1 тонкокарових хроыа-гограм иа спектрофотокетр1 КМ-3 "ОрЬоп" при довхин1 хвил! 475 им.

Отрицания, элиття протопласт1в та анал!з гапло!дних рекоыб!-яант!в проводили зг1дно методики СНормоос! еЬ а1. ,18853.

Проведения пульс-електорофорезу сумарно! ДНК ртам!в Str.kanamycet.lcus вд1йсшовали 8а методикою 1Резс1тке,1995]. Ден-симетричний анал1а електрофореграы . проводили як описано [ЬеЫогк1,1993].

Статистичну обробку результата проводили еа допомогою комп"ютерно1 програыи "51аЬегарМс5". Кореляц1й1.ий ааал1 а проводили як описано СЛакин,1980].

ре&хьтш та 1х оеговоршя

1. Внд1леш1я 1 Еязченля ауксотро^ннг \сгггт1ъ га иугах-т!в, ст1йкнх до антаб1отня1в у БЬг.ка.ча.'зусеИси^

Вид1лення ауксотрофних ыутант1в БЬг.капатусеисиэ проводили п1сля обробки спор. культури И-метнл-К-н1трозосечовинсю' (НМС). Мутаген ефективний в досить вузькому д!апазон1 доз, як1 обуыов-люють вихивашш в1д 0,1 до 17. спор. В р1еюи вар!ангах експери-иент1в ии проанал1зували 4308 незалегшгх клон1в Str.kananycet.icus 1, оброблених ШС. Вид 1 лею 29 ыутант1в, як1 несуть по одному маркеру ауксотрофкост!, цо складаз 0,67% в1д эагально! к1лькост1 досл1даених клон1ь. У трьох ауксотрофнкх му-тант1в на наступяому етап! були такт; отр1ман1 споитанн1 мутацп резистен?ност1 до анткб1отик1в гентач1щшу, р1фамп!цину та ерит-ром!щшу. Отриыана нами колекц1я гекетично ыаркованих итам1в 31г.капа'1> сеисиз. нарачовуе 43 мутзнти, з яких 14 маять по дьа геветкчиих ичркерн (табл.1). 11 наявнЮТь дозволила розпоча-

та систематичнкй генетичний анал1з Str.kanamycetlcus.

2. I ES34S3E1 ЗЛИЯЗЗССЗаЙ «ЭТЛЛПЗ Str.fcana-

sycstlci3 3 ЮТТЭЕЗЕЯ BICCSIEKS1 кшшцшс.

2.1.Вид1ленвя мутан?1в Str.kananycetlcus з поручении 01о-статеэоы капам!цину (Kai"). Дая внд1двння Кап~-кутант1в Str.kanamycetlcus т аннэрзсгаги тек! п1дходн: 1) виродуваяня OTsala 1375 та 1 в прису7ност1 брсм1ду етид1п (БЕ) та акркфлав1-ну (АФ); 2) проведения цикх1в - отркнання протопласт1в - регене-рац!я протопласт!в rosalв 1375 та 1; 3) обробка НИЗ спор птану 1. Цроанал1эозано 19555 незалетшк клон1в Str.kanamycetlcus, цр пройми plsal мутагенн! обробкк 1 вид!леко 44 мутанта з поруие-ним бЮсинтезоы канзЛцину. 0тркман1 мутанти за стаб1льн1стю КагГ-фэнотипу бута розд1лен1 на три групи:1-нестаб1льн1 мутанта (65% в1д вагагьно! к1лькост1 отрккашк), ею в друт1й 1 наступних генерац1ях роацепшоться, утяоршчи як Кап", так 1 Кап+-клояи; 2 -мутанти, ак1 почиягегъ скатеаувага неаначн1 кШкост! канаы1ци-ну на 8-12 добу, на в1ды1ну в1д внх1дноГ культури, яка починав сянтезуваги Éoro на 3-4 добу (10%); 3- стаб1льн! Кап"-ыутанти, як1 не дасть роз:зеплення прннайыз! в 5-ти генерац!ях (25%).

2.2. Аяал1з Кап~-ыу?аят1в Str.kanamycetlcus ва допоыогоа тест!в на косинтез та в!дновленяя б!осинтезу канзм!цину при до-даванн! його попередник!в. Одкнадцятъ стаб1дьши Кал-- ыутант1в булн попарно перев1рен1 в тест1 на косинтез. Три мутанта kan581, кап520 1 кап385 не утворвють каяам1цияу в даяоиу lecrl в парах ы1х собою 1 з ходнкм з досл1джених мутгнт1в. За результатами тесту на косинтез (табл.2) Кап~-мутанти розпод1лен1 на 4 групи, позначен! нами як kanA (I трупа), kanB (II група). kanC (III група), kanD (IV група). У вс1х досл1джэних парах мутант!в птаыи kanD131 1 kanD132 (група IV) s секретораш, тобто шлях бЮсинте-зу канаы1цину у них пошкодхевий на п1зн1юи еталах, н!л у 1х партнер1в. Метабол!ти, як1 нагромадхувть в середовшце цГ мутая-

Таблица 1

Характеристика отриманих генетично карковаиих итам1в S.kanaoyceticus.

Генетичн! маркери

Число незалеж-ких мутаит1в з даним фенотипом

Частота утворення ревертант1в з внх!д-ним фенотипом *

met

met ciis

ilv

his

his tyr

tiir

leu

ade

rib

pdx

rif

ilv gen ade ery

8 4 3 2 1 1 1 1 2 2 9

3,0 10"5 - 3,6-10"7

3.6-10-5 _ 5,o 10"3

2.7-10"5 - 1.0-10"7 4.0-10"6 - 7.0-10"7

<10'4 „ 3,1-Ю"6 0.510-6 5,6-10"7 (1.0-3.0)-10"® (3,0-6.0) 10"6 <10"é (2.4-7.9) 10"® (3.0-8.5) Ю'6

Всього:

43

Прим1тка: met-потреба в нет1он!н1, cys-в цисте1н1. ilv -в 1зо-леицин1 i вал!н1. his- в г!стидин1. tyr-в тирозин!, thr-в трео-híhí, leu-B лейцинi. ade- в аден!н1. pdx- в п1ридоксин1. rib- в рибофлав!н1, rif - ст1йк!сть до р1фамп1цину. gen - ст1йк!сть до гентаи1цину: er у' - ст!йк1сть до еритром1цину.

" «" - вказуеться частота утворення ревертант!в по кожному паркеру

Таблиця 2

Групи комплементацП Кап'-мутант1в S.Kananyceticus, визначен1 за допоногою тесту на косинтез

Мутант

Виступае як конвертор у napi з ищпхт-тат

Биступае як сек-репюр у napi з

афодняшо!

Група комплемемацИ

131,132

783.782 781, 47 472.106

131.132

131.132 782.783

131.132. 781.782 783. 47

783.782 781. 47. 472.106

781. 47. 472.106

472.106

IV (JcanD)

III (kanC)

II (Jcanß)

I (Jean/)

та, мояугь бути перетворен1 у к1вцевий продукт 1нлшми мутантами (конверторами), у яких поскоджен1 б1льш ранн! етапи б!осинтезу канаы1цину. Мутантн групп III (kanC783, kanC782) е секреторами для б!осинтезу кааам1цину мутантами II II труп; штами II групи (kanB781, капВ47) - для б1осинтезу антиб1отика мутантами I групи. Мутантн I групн (kanM72, капАЮб) виступаать як конвертори по в1дноаеш® до ес1х 1ншх Кап"-штам1в. Очевидно, що в них по-руаен! б1льп ранн1 етапи б1осинтезу канам1цину, н1я у 1нших, досл!джених нами Кап" штам1в.

Уи вивчили здатн!сть мутант1в до в1дновлення б1осинтезу ка-наШцину при додавани1 у поживне в1всяне середовкце речовин-по-передник1в канам1цину - D-глюкозам1ну 1 2-дезоксистрептам!ну (2-ДОС). У иутавт1в kanB781, квпС7В2, kanRi? б1осинтез каяам!ци-ну А в1дновлюеться при додаванн1 в середовище 2-ДОС, а у мутан-г1в kanA472 1 капАЮб - 1>глзокозам1ну. Отяе, у вказаних штам!в порупене нагроиадження дкх речовин. У рейта птаы1в б1осинтез ка-намЩину А не ,в1дновлветься при дсдаванн! обох попередпик!в. Илях б1осинтеэу антиб!о"гака у цих мутант!в поскодяений на стадП п1сля утворення 2-ДОС.

2.3.Тонкошарова хроматограф!я (7ШХ) Мета0ол!т1в,як! утворюють иутанги Str.kanaxycetlcus а пооупент б!осингезом ка.чгм!цину. Для п1дтвердження даних, отркманих в роздШ 2.2., ми провели анал1э метабол1т1в, як1 нагромаджують КагГ-мутанти Str.kanaciycetlcus за допомогою ТШХ. На рис. 1 представлен! результата хроматограф1чного розд1лення метабол!?1в. що утЕоркюгь мутаяти Str.kanamyceticus 8 порупёним б1осинтезом канам1цину у систем1 розчинник1в п-пропанол:5Х водний ам1ак (3:2). Хроматогра-Ф1чний анал1з показав, що стаб1льн!-мутанти kanD131, kanB782, капС47, капАЮб, kan38 1 кап581, для яких характеры! псжкодяекня р1зних етап1в б1осинтезу анткб!отика, д1йсно не утворюють каяа-м!цину А. Ц1 результата Шдтвердхен! при к!льк1сному визначенн!

- о -

канам1цнну А методе« спектрофотоыетрвчного сканування тонкошаро-вих хроматограы у вндиШй облает! (табл.З). Сканування хрсыатог-рам показало, со мутант кглВ782 не синтезу? 2-ДОС, тод! як. капВ47 1 капАЮб, утворггэтъ його в сл1дов!х к1 ль косках (табл.З). В тест1 на косинтез игам 1<апВ131 е секретороы по в!дношэнно до капАЮб: капС782 1 кап347. Ц1 результата вказують на те, вр б1о-синтез канаы1цкну у цього птака пошкодаений п1сля утворення 2-ДОС. Однак, иетабоа!т!в, щр волод1ють антиб1отичнш активиста, в1н не продукуе. Мутанта кт0581 1 кап038 утворкгть в!дпо-в1дно в 1,7 1 2,4 рази б!льш 2-ДОС, н1в игтам 1375. Очевидно, вказан1 штамп, пагроиздяуючи 2-ДОС, не эдатн! до його подагьсо! трансформацП а утворецшш метайолШв, ко ыгать аатк51отичну аетивн1сть. Шдтвердхено вксновох про те, со Кап~-Фенотип мутанта капАЮб моха визначаткся порупенкныи утворення 0-глюкозам1ну.

Наш будо вквчено два ыутаати (ka.il 1 1 капб), для яккх ха-рактерний п1вн1С початок б!осинтезу канзм1цину 1 п'ять нестабильна ыутант1в (кап7, капЮ, кап12, кш16, кап17). 3 даних, иазедених ез рис.1 1 в ■гаЗл.З видео, ир неста01дьн1 цутанти кап7 1 кап16 не.синтезуать канааНщн А. Са1дов1 к!лькос?1 цього антн-б1отака (0,2-2,3 1КГ/Щ) синтезують неста31£ьн1 мутанти капЮ, кап12, кал17. Вс1 досл1дген1 нестаб1дьн1 мутанта, кр1м кап10, синтезують а 1,3-0,5 раз1в 61льсо 2-асс, ы1г 2их1дний птам 1375. Це ьиже св!дчятн про цо Кап'-клояи цих птам1в, як 1 капО-ыу-■гаати, це адатн! до подагьао! традсфор1ац11 2-ДОС. На в1ды1ну Б1д ус1х досд1дяйнн:; ГлгГ-стаШв Е1г.капзг,усеЬ!сиз, Езутапт кап7 не иагро^эдхуе е ¡г/ль?урадьн1й р1дии1 :<анозал1в. Ууганти . БЬг.капааусеИсиз в поручении ¡Иссштезоу кааозам1ну рглШе пе Сули 1денткф1ковал1 серед КагГ-ь7?аат1в. Цек клал ¡.,утац1й позначен^ наш! як капа. Стрк«ан1 дан1 показуг^ь, со козкодхення 01о-синтезу !анам1цнну у иес?а01гьЕих ьГгТакПв ьйять р1зш$ характер, 1 неста51льа1сть ке е в-саотиМста еовеого 1СЕаау кгп-иутгщЯ;

о о о о о

О ■ 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 о 0

с • 0 0 0 0 0 0 0 . 0 0 0 0 0 0 0 0

о о о

в • 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0

о с? о о

А 0 0 0 0 0 0 0 0

I = < "£5 с 9 -3 -3 ^ 1 111 ■з л 1 1 1 1

Рпс.1 Результата хроматографхчзогорозЛчеяня метаболЫз, утворенпх мугалтама З.калапуссЦсиз з порушенял б1осинтезом кага^цпзу. А-кан1М1ц:ш А; В-2ДОС; С-В-гликозам1я; С-казозазоя

Таблнця 3

Результат« кЬзыасного визначеняя каяам1дпну А I 2-дезоксистрептам1яу, утзореяих кап-мутантами З.капатусеНси:

Група кап- Штам Концентрация в

мутагтв культурадьн1л риит (мкг/мл)

каяа.м1ц;:ыуА 2-дезокси-стлептажну

Дикий тип 1375 189.0=0.37 73.8*1.11

Стабьтьн! капАЮб 0 39.0^1.21

калВ782 0 0

капС47 0 0.4*0.05

калШ31 0 154.0*1.93

капОЗЗ 0 ' 176.7*1.71

капГ)381 0 122.6*1.34

кап7 0.2±0.01 213.5*2.26

калЮ 0 215.3il.88

к ал 12 3.3±0.12 40.7*1.13

кап16 0 482.0±3.46

кап17 2.5*0.37 96.1*0.94

Починають капб 24.7*0.09 2.8*0.06

синтез кап 11 9.96*0.34 365.4*4.68

канахщину з

зашзненням *

Str.kanaaiycetleus. Дан1, отриман1 при аналШ втам1в капб 1 kanll, со в1дносятъся до групи мутаят1в 8 8ал1зненням б1осиктеэу aetkôlotf^îa, показують, ер вони суттево в1др1вняитьса wis собой за 8датн<стю до б1осинтеау канам1цину А 1 2-ДОС.

Шд1Срана вами система ТШХ шее бути yen 1 оно аастооовааа для анал1ву каяаы!цин1в та Ix попередник1в. ШХ араак1в культу-раяьно! р1дини в согднанн1 в к1льк1сюш визначеннаи sa допсшогсш опектрсфотшетрнчного сканування хроыатограм моое бути викорие-тана як екепрес-кетод для вяэвачення антиб!отично1 активност1 втаы1 б-продуцент 1 в канш1шшу.

Досл1джено ознаки ст1йкост1 до алтнб1отгог1в у Кап--мутант 1 в Str. kananyeet leus; капАЮб, kanS47 , kanl2, kanll. Bel кап-ку-танти, кр1ы kanl2, чутлнвШ. Hl» птаи 1375 до.каааи1цкну. гев-таа1циву 1 тоСраы1цкну. Иутант kanAlOô найчугашИзкй до д'1 ем1-вогл1козвд1в. Нестаб1льнкй мутант kml2 майда не в1др1вкяеться в1д вюс1дного sa чутливЮти до канаы1щшу. Цеп иутант виавився реанстентн1шм до тобрам1цкну та гентаи1ццну, ais 1376. Спосте-р1гаються певн1 В1дм1ни у ст1йкост1 Кап-ыутант1в до 1ншх анти-61отик1в. Bel мутанта чутлив1а1, н1я вих1дн1 втами до хлора»4>е-н1колу, kanB47, kanll та кап12 - до р1фаш1цнну, a kanB47 - raras до л1нкоц]цину.

2.4. Анал1в перебудоа хроыосоыи у мутант!в Str. kananyeetleus в поруденим б1осинтезоы ка.<ам1цину.

EljtbDlcTb отриманих вами Кап"-иутант1в Str. капашу cet leus е нестаб1яьннми. Проведено анал1з хромосомно! ДНК Кап~-иутант1в Str.kanamycetlcus 1, kanCTBS та kanl2 sa допоыогою методу пульс-електрофореэу. На в1дм1ну в1д ран1ше опубл1кованих методик при-готуьааня препарат1в актином1цетно! ДНК для пульс-електрофореэу, ми використали не м1цел1й. а протопласти вказаних штам1в для 1юбШрадП в агарозний гель. В »одному г цих шам1в не вдалося ввд1хкти автокомних шсазм1д аа допокогею пуль^електрофорезу. .

-и -

m

.Т.П.H.

5 4

Ы^Нп-^ fe/r I

Щ р • à

""-л » -! t* ss v

tíá ш - -

3 2

436,5 388 0

291.0 242.5 1940 1450

970 48.5

'í3ebi

Т.П.H.

1S4C

^f

f . ' .-"'i

fe» S53

В

1500 •

—— г,")*: ——— с-В £3=23 753x2 E2T2S3 0-?

5ГГЙ5Я «0x2 r.STS3 М-5

43)'

237-

2«-

-J

шт. 12 8217.т.п.м.

22¡J*2 вжсгэ H-l

1зг.

•G

123x2 E-F

шт.1, kanC782 7788.т.п.н.

Рнс. 2, Pmjtutата п>тп,с-гель-електрофоргзу Asel ra БМ-фрлгмг1гпв cyMaptraï ДНК птамш S Jana rr.yc oticus при pbirax умовхх фракшонувокня (та5л. 4.13.) А - змша часу пугасу 5-50 с. 190 V. 18 гол. Б - зм1ка часу пупсу 20-90 с, 170 V, 22 гад. В - схгмдлгшд штерпргташя А та Б.

I А - цоюсзтомсрп фдга X 1 Б - хромосоии Sacchaiomyccs csrevisiae

2.5 - штам 1

3.6 - kanC7S2

4.7 - kan 12

2-4 - Asel фрагмента s- 7 - BfrI фрагмента

Ми провели аяал1з Asel та Dral - фрагмент!в ДНК досл1джува-ннх штам!в. 1дентиф1ковано 16 А5е1-фрагмент1в ДНК штам1в 1 та кгпС782, рози!ри яких варИаэть в1д 40 до 1500 т.п.н. У геном1 нестаб1льного мутанта kanl2 в!дбулися певн1 перебудови: у нього в1дсутн1 фрагменти роам1ром 98 т.п.н. (D), один з двох фрагмента розм1ром 220 т.п.н. (I), а такс® виявляються додатков1 фрагменти з рози1раыи 297 (J') 1 450 (К') т.п.н. (рис.2). Шсля об-робки ДНК штам1в 1. та kanC782 ендонуклеазою Dral отримано 12 фрагмент1в а розм!рами в1д 40 до 1800 т.п.н. При розщепленн1 ДНК втаму kanl2, виявлено додатковий фрагмент В', розм1ром 150 т.п.н. 0трнман1 дан1 дозволишь аробити висновок, щр перебудови нуклеотидннх посл!довностей в1дбувааться саме в хромосом! неста-б1льного мутанта kanl2, хоча ц1 дан! не достатн! для виявлення механ1зму таких перебудов. Результати, отримаа! при електрофоре-тичному анал1з1, дозволяють визначити розм1рк хроыосоии досл1д-«уваних штам1в Str.karmycetlcus як суму розы1р1в виявлених мак-рофрагмент1в ДНК. Суш розм1р1в АБе1-фрагмент1в ДНК штам1в 1 та kanC782 становить 7888 т.п.н.,а 0га1-фрагмент1в-7715 т.п.н. (рис.2). У той es час, сума Asel-фрагмент1в нестаб1льного мутанта kanl2 становить 8217 т.п.н, а 0га1-фрагмент1в -7865 т.п.н. Q1 дан! дозволишь еробяти вксновок про наявнЮть в хро-uocoMl цього отаму ямпл1ф!кац!й нуклеогидних посл1доввостей. От-риыан1 вами результата в вих1днаа! для подажьшого ф1аичного кар-тування хромосома Str. kananycet leus 1 вивчення механ1зм1в неста-б1льност1 гевому ц1е1 культура. '

One, ва OCHOB1 вивчення вхастивостей Кап--мутант1в Str. ka. namycetlcus аа допошгею тест1в на косинтез, в1дновленяя синтезу канам1цину при додавашй Coro пооередник1в до середовиид, в яко-иу вирооувалн КагГ-ыуранти, лршатограф1чного анал1зу метабол1-51в, sp вони нагрсыадаують, 1дентаф1козано б клас1в мутац1й, як1 е. очевидно, пошдаеняяыи окреыих ген1в, ер конгродзють б1осин-

тез антиб1о7ика. ыутантн капА не нагрсыаджувть D-глюкозам1я. а кгпВ та капС - 2-дезоксистрептаы1н. НутацП kanD обуыоалноть неспроыодн1сть arraalB Str.kanamyceticus перетворювати 2-дезок-систрептам1н з кетзбол1тя, як1 ыаоть аити01от!гчяу активШсть, найЬчов!palee, парсиам1и, a kanQ - сшгтезувати кано8ам1н(рис.З).

D-

глюкоза

кап А

ЬшВ ЬаС

Ьлп G

D-rAJOKoaaaÍB«--- 2-дезоксястрептамш

4S /

4 ч /

V '

ч /

^ ' / \za D

• Калеаашя

> /

ПарокаиЬ к 'KaainigEa С'

i

i .

ч ✓

Неашн--------1---- Кшмш'бш! В /

Кшпв'

Канамшнн А

Рис. 3. Схема бшеинтезу канамщину io вказанням щентифжо-ваних клаейв Кап-мутащй: kan A, kan В, han С, kan D, kan G.

- 14 -

3. Озрзшшш sa bsbssbss ъвзстзасяей мутшг1г Str.ksnäsyocrticus, crl&na gp г-евиаксв-и-глвюга <2-£¡3D. Ыосвятеэ Kaaaíflщшу культурою Str.kansnycetlcus п1длягас глзкозя1й ponpeciî IDeaaln, 1030J. Проведен1 експердмевп; по от-риыангаг ыутант1в Str. kananvcet 1сиз 1375, сПйхкх до 2-ЛСГ. (чаэ-тота вкнмкяешш (1.2-3.4)'10~5). Вквчево впдкв гдзкоав, иавьто-- be. сахароза 1 гл1церкну ва р1езкь ОЮскктезу канга1цзку втздаии Str. капзлусе tiens 1375, 1 1 С£г1. досл1д*ево проаес у?кл1эац11 Hsara глвкозн та дкнам1ку кагрскадхення б1оизсн. Визьдено, сз досл!дгея1 епекя 1375, 1 I tígrl суттево в1др1внетться als собсо за регухяц1еэ 01оскнтезу калам! шшу дгерелаый вуглецз. Штаи 1, СО пpoises селекц1ю на п1двиз;ену аяткбЮгичну актнзн1стъ та еггау dgrl, ст16кий до 2-ЛРР, виюркстоэувтъ г.шсозу з полезного сере-дошс» лоз!льк1вз, alx. нязькоакгквнкй еггаа 1375 (ркс.4). Б1оснн-тез канш1цину у птаыу Î иена о я1длягаа гдакозл1й peopecll, н1х у втаму 1375. TfiKi я властквсст!. в б1льа1й irtpi, характера! для стаау d^rî, ст1йхого до 2-ДОТ,' ягай проявляв впеоку антибЮ-тичну гктквн1сть (рно.Б). Нор1вЕякнЕ властивостей ДОСЛ!ДХЙЯКХ стам1в дозволяэть прнпуститк, со ахЛнн в регуляцП глскозоо б1о-скатезу канаьйшиу иогуть бути оди1сэ в принн г.1двкзено1 акти-б!откчяо1 ак?шшост1 Str.kananrycetlcus. Досл!&&ено р1вн1 ст1й-KocTl ыу?азт1в tígrl, dgrß 1 ¿gr3 до какшЩнну, гентам1цкну 1 тобраи1цину, Ц1 кутают в ц!лоыу чутлкв1с1 до вказанж анга51о-TivKlB, His вшйдний втам 1375.0грк*£2л1 каия дач1 св1дчать про перспективв1сть вакоргжташш ыутант1в в порусеаов катаЗсл!?!;сю penpecle» в салекцН ErraalB Str.kanssycetleus в п1двиаеноо азти-

6107ИЧВСЮ ÛKTHBHlCTO.

Ba¡rsysa¡s¡s reala Str.fcsas^rootlcts га дастдшгоэ suestes ц?огозшг1д.

4.1. Отрниалня ta злиття протопласт!в Str.kanariycetleus.

У культура Str.kanaciycetlcus не 1денгкф1коваяо природних

Pac.4 УтшЦжЦл гхюхоз! 1 •irpe>it£Vmui M«uc« * nujdsJ

porry rnuii 9.iariâjByc»ticue По od «веаак- аде мтещуижхя гуль тур. re». По od ojuxmt: I - юамптши мюжош. шпак/» П • ютом МП. >г

Р«с.5 Itou Oloc«ni«y ышаЫияау »питали RlumemycoUciui • млгакютт! >U Kmi»nt]*uil г lutoin lio ослх Y . pi win аогмтгау (%)

систем генетичного оОДну. Рекомб1нанти ц1е1 культури ми отриыу-ьали за допоыогоо алиггя протопласт1в. Проведен! експериыенти по шдбору умов отрицания 1 регенерецП протопласт1в птам!в Str.kanamycetlcus 1 та вести його маркованих мутан?1в. Виявлено, во для отрицания та регенерац11 протопласт1в досл!джених мутаа-т1в найоптииалъи1шш с вкросуважя Ix ы1цел!ю на протяз1 60 год в середовшЦ ST aöo S7U з концентрац1сю гл1цину 0.1-1Z, викорис-тания л1зоцнму в концентрац11 21, регенерац1я протопласт!в до м1цел1альних кл1тин на середовид! R2YE. Злиття протопласт1в проводили у присутност1 Б02 ПЕГ а молекулярной массе 2000 протягоц 1 хв.

4.2. Генетична рекомб!нац!я при алитт! протопласт!в Str. karoriycetleus. Нами було проведено 1 проанал1эовано 5 неза-лехнкх схрецувапь ва допоыогою влиття протопласт1в. Частота ут-ворення гаш!01дпих реком51нант1в коливаэться в межах в!д О.ч-Ю"4 до 6,7'10"3.

Анал1з злиття протопласт1в Етам1в 781metl0cys2kanB781 та 92 ade! eryRl проводили еа такта селектившаш маркерами: cys+ade+ та met+ade+. Результата схрецування наведен! в тайп.4;5 1 на рис.6.В цьому схрецуваня1 вид1лено 232 рекоыб!цанти 10 генотипо-вих клаз1в. Пр0аяаа180вана рекс«51нац1я Mis парами локус1в, встановлено характер ачеплення ы!д ники. Як видно s результат!в, наведеннх в табл.5 , вайвиц1 частота реком01вац!1 е Mix маркерами metlO-adel (43Х) та cys2-adel (501). Процент реком51нац11 ы1а локусамн metl0-cys2 стааовить 14Х, а ми капЗ-eryRl - 42. Це ю-хе св1дчига про те. W вказан! гевя е вчепленими, Було досл1дхе-но характер сегрегацП неселективних иаркер1в. is давкх табл. 6 видно, що сегрегац1я ал елей raetlO-eryRl та kan3-cys2 незалежна. Сегрегац1я алалей kan+/kan~ валежить в1д сегрегацП егу"/егу+ (коефЩ1снти кореляц11 0,76 та 0,82). Де п1дтверджуе дан1 про зчеплення м!д локусаш ery-kan, отркиан! при визначенн! частот

__Тг&пзя 4

лнад1э аятга шчшшаспз

7531 ГЭ(.10 суз2 ккгЭ781 з 53 егуй!

п/ /п ГЕНОТИПИ РЕКШВ1-НАНТ!В СЕЛЕКТИВШ ПАРКЕРА

гпеЬ суз аЗе егу кап СУА айе 1нтервал в яких в1дбув. крсс1нг. аде* 1а?ервал в яких в1дбув. кр0С1НГ. Серед-на частота

1 + + + + 4 а, с 2 а, с 3

2 + + + + - 28 3,(1 34 а,с1 31

3 + + - ♦ 56 а.Ь 64 а.Ь 60

1 + + - - 3 с,<1 4 а,Ь.с,<1 4

5 - + + - + 8 Ь,е 8

б - + + - - 3 Ь,с 3

7 + - + + + 3 а.Ь.с.с! 3

8 - ' + + + + 4 С,(1 4

9 - + + + - 12 ы 12

10 + - + - 7 а,Ь,с,с1 6

БСЬСГО: 232 118 114

Тгбсзг» б

РШ&ЗШИЦЯ ша ЛДРА121 ЛЗУС1В 7 СХРгДГВАЕН!

731 эз110 суз2 !спл3731 z 02 «Ы егуЕ!

"¿9 суз газ пхэЬ СУ5 1Ш1 егу суз егу а<3е ■ егу кап СУ5 кеп ас!е кап кап егу

3 3 8 3 3 60 4 31 3 '4

31 31 3 31 31 4 8 4 60

60 60 3 8 4 а 4 3 8 4

4 л 4 3 5 3 3 3

3 в 12 3 12 0 12 4

6 3 В 6 6

12

107 лп** 125 50% £3 14Х 48 19% 5Б 22% 81 322 47 19% 59 23.52 84 3« 11 42

Тв&ящя S

Ccrpai имя мсшюкяашвг ажлвЛ у czpcqyseasl стая lu

78Í aallQ cys2 кяяБ?81 XJS «fei eryW Ki СедектхвШ каркери: cys ede

Hecejexnoal маркери: met /ml'-, егу*/вгу~\ кагГ/кт~ п-118

кan" кап* ввГ ret4

егу* 40 8 18 32

егу~ 6 64 11 59

Г-0.7В; х2-6б.31 Р<0.001 Г-0.20 *z-4.72 ГЧ0.1

В: Седектшш1 маркери: ade*ret*

Неселект*вн1 маркера: cys/cys ; кап/кагГ; егу /егу~ п-114

cys* cys" егу' егу*

кап* ее 10 71 б

кап' 33 0 4 34

Р-0.22 rz-5.4S Ж0.С6 Г-0.Б2; хг-77.34 Р<0.001

А Б

сс.\с*тх»ш ааракрм селсхпит sириерм

cyt'tJt* mrtSd.»

Рис.6. ЛокалЬдцй локуаа на кйргл S.lunamyceticu» >а длнммы cipeiayiaw« 781ro«llOty»2luinB7M * 92»deleryR1

рекоыб1нац11. На рис.6 вказаа1 1нтерваги хроыоссми, в яких може в1дбуватиса крос1нговер для вкникнення рекоаб1нант1в. Б1льи1сть рекомб1пант1в е результатом подв1йкого крос1нговеру. В результа-т1 инсжннних крос1нговер1в утворсеться 122 гаакЯдюа рекоыб1-наят!в (табл.4).Тахим чинш, враховувчп так! критерП, як ади-тивн1сть в1дстаней на карт1 та сегрегац!я неселективних алелей, ыаркери на генетичн1й карт1 в1д схреоування 781гаеЬ10су52капВ781 х 92 асЫ егуШ мазута бути розтаэоваа! так, як показано на рис. 6.

АналоПчно Суло проведено генетичний анал1э рекомб1ваит1в, отрнманкх в результат 1 1ненх схреоувань. Шсля злиття протопласта 781лю110су52капЕГ781 та 131Ь1з1Ьуг1капЛ131 в!дб!р проводили за 4 парами селектавних алелей: 1)суз+1уг+; 2)суз+Мз+: 3)теЬ+1уг+; 4) теЬ+Мз+.Вуло проанал1зовано 395 гадлоТдних ре-комб1нант1в, в1днесених до 12 генотипових кдас1в. Розтапувалня генетичних маркер1в, встановдене при анал1з1 реаультат1в цього схрещування, показане на рис.7.

При злитр! протопласт 1 в 781гаеЫ0су52капВ781 та 2111у1еепМ. анал1з гапло1дних рекскб1нант1в проводили за такими селективниыи маркерами: 11у+суз+, теЬ*11у+. Бую проанал1зовано 241 гапло1д-ний рекомб1нант 1 виявлено 11 генотипових клас1в. За результатами цього схрещувания ми розм1стили проанал1зован1 маркери на ге-нетичн1й карт1 ЗЬг.кападусеЫсиз так як показано на рис.8.

Провели такох селективний анал18 злиття протопласПв 52Мз1ЬНг1 та 92а(1е1егу1?1. Вид1лено 174 а(1в+ЬЬг+, Мз+а<1е+ гап-лоТдних рексмб1нант1в. Розм1цеяня проанал1зованих в цьому схре-цувшш! ыарквр1в показано на рис.9.

Проведений анал1з Цуг^Ьуг*. Г11з+ЬЬг+- рекомб1нант1в, як! утворилися при здитт1 протопласт1в 131hlsltyгlkanD131 та 4ЬЬг1г1Г1?1. У даному схрешуванн1 було проанал1аовано 176 гапло-1дних рекоаб1нант1в, цо належать до 10 генотипових клас1в. За

IV ■ ' AuUMMgii тсуг» m Mfffi S k*wnyc*t*w н и^ш^цмм 7aWlWcjv2baB7¿I * МОмЬтгОмШ

Рис. 8. Aoe^vMyie «a 5 iuiureycrtjcus м дли

Рас Э. ,WâAÏ**tit* доя>са iu lu^n S.LaaiAyccticu* i

. Рвс.10. АоииЫул локтем к» мрт) S-kiftAmycrticuv ы д» схрсщумния Ulhnltyrl * 4ùv4niRt

Ряс. H. Лс*4Л13*фж гтятгчнк* uupwep® tu Mçrri S.Lnamyceiicut

- Bí -

результата!« схрещування генепгш1 ыаркери ноаша розы1стнти на карт1 таккы чином, як на рис. 10.

Отгю, а результат! проведених схрегзуваяь иетодои злиття протопласт^ псбудсваяо пояередн» генетачну карту Str.kanéaycetlcus, на як1й локал1зовано 11 геветячних иаркер1в (рис.11). Показано, цо мутацЛ реакстептксст1 до генташцнну, р1фаып1вдгау та ерятрсм1цину зчеплен1 з геном капВ, ер контролое один з eraalB б1осинтезу 2-дезокснстреатам1ну.

ESSDSS3

1. 0трлыан1 коаекцП спонтанних та 1ндукованих ыугант1в Str.kanasnycetleus -ауксотрофних.з порупениы б1осинтезоы канаы1-цину, резистентних до аяткб1отик1в та ст1йких до 2-ДОГ.

2. 1дентиф1ковано п'ять кдас!з кап-ыутац1й, цо контролхаэть р1зн1 етапа б!оаштезу канаы1цкну культурою Str.kananyeetleus: kan А- нагроыадхення [)-глвкозаы1ну; kanß, капС - . у творения 2-ДОС: kanD- транс$ормац!о 2-ДОС в метабаз1тл, ер игять аятиб!о-тичну активы 1сть; kanG - утЕорення канозаы1ну.

3. Визначен! рози1ри хрсиосоин crraulB Str.kanámycetlcus 1, kanC782 та кап12'за допс«огсэ цетоду пулъс-електорофорезу. Показано, ер розы1ри хрсмосеми nrraulB 1 та 782 становлять 7788 (Asel) та 7715 (Dral) т.п.н. В геном1 нестаб1льного мутанта kanl2 вкявлено хрсыосомн1 перебудови.

4. Вкявлено, щр б1осинтез канам1цину у кутант1в, ст1йких до 2-ДОГ, uewe п1дляras penpecll глюкозео, н1д у птаиу дикого типу. Показано перспективн1сть вкгористання иуталт!в з порусенога катабол1тнся penpecleo в селекцП птач1в Str.kananycetlcus з п1двиц9Ксо антибЮтичнсп активн1сто.

5. За допсмогся злиття протопласт1в побудовано попередню генетичну карту, цо нарахозуе 11 генетичкнх маркер1в хрсмссоми Str.kanamycetlcuStr. Заявлено, со ыутац!я kan В (контролое Öio-

сизтеэ 2-дос) вчешена э маркерайи резистентное*! до гентаы1ци-

ву. р1фамп1цину, еритроыЩину.

сашик

poSlr, аоубх1козжза sa ussoplasau» й^свртаЦ!

1.Голец Л.М., Василия Л.И., Мазепа А.И.. Федорекко В.А. Получение и изучение свойств мутантов Streptcmyces kananycetlcus с нарушениями биосинтеза каааьащкна. // Антибиот. и хшшо-Tep.-10S5.-T.4O,- N1.-C.3-7.

2.Голец Л.14., Деккдчук Ю.А., Федоренко В. А. Биосинтез канадацина и резистентность к ашшоглнкоэвдаы у мутантов Streptocr/ces каяэст/cetlcus, устойчкгых к 2-дезоксиглзкозе. //Акти5ют. и хиюютер.-1983.-Т.41.- К'5.- С.10-14.

3.Деикдчук Ю.А.. Голец Д.М.. Седоренко В.А. Характеристика мутантов Streptooyces kanasiycetlcus, устойчивых к аинногликоэвд-ньш антибиотикам. //Антибиот. и хнмиотер.- 1933.- Т. 41.- НБ.-С. 15-20.

4.Голец Л.Ы., Есипов С.Е., Федоренко В.А. Тонкослойная хроиатог-рафкя ыетгболитоз, образуемо: мутантаиг Streptocr/ces kananyceUcus с нарусенкьы биосинтезов кана^кцика.// Антибиот. и хкуиогер.- 1937.- Т.42.- N.3- С.8-12.

5.Гслец Л.Ы., Кириченко Н.В., Седорекко В.А. Получение г: изучение свойств мутантов Streptccyces kanarr/cetlcLS с измененной резистентность*) к ^¡ашоглззтевдаьа! антибиотика. /л вационал-ка конференция по производство а придогэкке на анткбиоти-це.-Paarрад. 19S0.- с.187.

6. Гол ешь Л.М., Седоренко В. О. Вазченнз ыутгат1в Streptccryces kanasiyceticus,- ctIhkhkx до аи1вог£1коэидккх антК51отик1в.// Иатер1ади YI в'Чзду УТГС.Полтава. 1992.Т.1.- С.96.

7.Голець Z.U., Деыщчук D.O. Одержаны 1 вивчення властивостей мутант!в Str.kanaraycötlcus 18 гы1невсе> регуляц1ех> дхерелаыи вуглецю б1осинтеву канш1цину. // Шкро01ол. «урн.,1094, 55.

Nl.-C.46.

в.Деыидчук D.O., Годець Л.У. ,Бзс1л1я ЛЛ. .Оедоренко В.О. Вивчен-ня генетнчкого контроля б1осинтезу канан1цину культурою Streptcoryces kaianycotlcus. //Ы1кроб1ол. журн., 1994, И. HI.- С.52-54.

Q.Golec L., Desydchuk J., Basiliya L., Pernlakova N.. Fedoreako V. Repression by the carbon stxirces of karismycln biosynthesis In mutants Str.ksnsnycetlcus aith altered antibiotic activity and resistance.//Abstr. 7 Int.Syrcp. Genet.Industr.Hlcroor?. Montreal, Canada 1994.P. 164.

10.GolecL., BasillyaL..Deoydchuk J.» Fedorenko V. Genetic analysis of kansmycln producing Str.ksnsnycetlcus. // Theses the 8-th Int.Syzp.Biol.Actyn., 1994, Moscot, Russia. P.104.

11.Golec L,.Baslllya L., Mazepa A..Klrlchenko N.. Eslpov S.E. Fedorenko V. Identification of genes controlling the kanamycln biosynthesis in Str.kanaTjyceticus.-YAAli-V.'orkshop. Biologie der Actlncrcyceten. .yunster. 1995.-P. SO.

Гагац 2.11.

ГеюузжсеккЯ кегкрзг* бгаспжгзза геаспяэдаза кузатуроЗ Strepfccryccs ¿anssyesiicas. Диссертация на соискаякэ ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.15 - генетика. Украинский научный центр гигиены, Ккев. 1997.

Получены коллекций спонтанных я яндуциронаяных мутантов Str.kansnycotlcus с различньагы свойствами:- ауксотрофкые, устой-чивие к антибиотикам, к 2-дезоксн-0-глвкозе, с нарушенным биосинтезом каяаыициза. ЛдентифгпЕфовано пять генетических локусов, контролирующих различные этапы биосинтеза канадщина - образовав ние 2-дезоксистрептамина и превращение его в метаболиты с ан биотической активностью, образование D-глокозашна а канозами

- Zi -

Определены размеры хромосомы Str.kanamycetlcus с поыоцыэ метода пульс-электрофореза. В геноме нестабильного мутанта kanl2 обнаружены перестройки ДНК.

Обнаружено, что мутанты, устойчивые к 2-ДОГ, менее подвержены глюкоаной катаболитной репрессии, чем исходный птаыы.

Построена предворительная генетическая карта Str.kana-myceticus, на которой локализованы И генетических маркеров. Показано, что маркеры устойчивости к гентамицину, рифамлицину и эритромицину сцеплены с мутацией биосинтеза канамицина.

Кпзчов! слова: актиномЩетн, антибЮткки, 61осиитез када-м1ц>шу, Streptomyces, елиття протопласт1в.

Galots L.

Ecnotic control of k22is=i*cln biosynthesis by Strcplospcss tezsgyvclicus.

The Candidate Thesis for a Pbylosophy Degree, a Speciality 03.00.15 - Genetics, Ukrainian Research Hygienic Centre,1997.

The collections cpontoneous and induced mutants Str.ka-naKycctlcus with different properties иеге received. Identified 5 loci controlling different stages of капгягус1п biosynthesis -creation of 2-deoxystrepta^lne. D-glucosamine, kanosaalne. The size Str. kanasiycetlcus chronosccne were investigated by means puls-flld-frel-electroforesls. In penсою of unstable cutant kail2 additional fragments were found.

Mutants resistent to 2-deoxy-D-elucose are less subjuct to flucose katabollte repression ksnssiycin biosynthesis then Initial strain wild type.

Eleven markers localised on preliminary linkage изр of Str.kananyceticus. Markers of gentamycln-, erythranycln- and rlfffiiplcin-reslstance are linked with imitation of kanamycln biosynthesis.