Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетический анализ тканеспецифической функции слюнных желез DROSOPHILA VIRILIS

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетический анализ тканеспецифической функции слюнных желез DROSOPHILA VIRILIS"

АКАДЕМИЯ НАУК СССР

ОРДЕНА ЛЕНИНА СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ Институт цитологии и генетики

На правах рукописи

А Й М А Н О В А Каряыгаш Газизсвна

УДК 575 . 16 : 577.21

ОТЕТИЧЕСШ АНАЛИЗ ТКАНЕС1П2ЦИФИЧЕСК0.1 ФУНКЦИИ СЛШНИХ ЖЕЛЕЗ БНОБОРНИЛ УППЫЭ

Генетика - 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1990 ^

№ )

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО АН СССР

г. Новосибирск

кандидат биологических наук,старший научный сотрудник Н.Н.Колесников, Институт цитологии и генетики СО ЛИ СССР, г.Новосибирск

доктор биологических наук,профессор В.Н.Стегний, НИИ биологии и биофизики при Томском государственном универ -ситете, г.Томск

кандидат биологических наук, Н.М.Матвеева, Институт цитологии и генетики СО ЛИ СССР, г.Новосибирск

Институт биологии развития им.Н.К. Кольцова ЛИ СССР, г.Москва

Защита состоится " 1$ " C^j^ail,Я : 1990 г. на чЛг24СШио заседании специализированного совета по защите диссертации на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.П.01) при Институте цитологии и генетики СО ЛИ СССР в конференц-зале Института по адресу : 630090 г.Новосибирск - 90, проспект академика Лаврентьева, 10

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО ЛН СССР.

Лвтореферет разослан "ffi » tftcBUils, худ) г.

Ученый секретарь специализированного совета доктор биологических наук

Научный руководитель -

Официальные оппоненты:

Ведущее учреждение:

/

6 ц. Б.Христолюбова

Актуальность проблемы. Одной из актуальных проблем современной биологии является проблема клеточной дифференцировки.Процесс цитодифференцировки связан со становлением морфологических,структурных и биохимических особенностей различных типов клеток, что обусловлено дифференциальной экспрессией генов и сопровождается, как правило.синтезом белков,специфических для этого типа клеток (Конюхов,1973; Корочкин,1977).Значительный, интерес для выяснения основ клеточной дифференцировки представляют конкретные данные об организации и экспрессии генов,связанных с синтезом таких ткане-специфических белков.Удобной моделью для изучения биохимических, генетических и цитогенетических аспектов дифференцировки являются слюнные железы Díptera (дрозофилид,хирономид),так как на определенных стадиях развития они обладают четко выраженной тканеспе-цифической функцией,проявляющейся в образовании специфического белкового продукта - секрета.В настоящее время показано,что у Díptera генетические системы,контролирующие синтез тканеспецифичес-кого продукта слюнных желез,относятся к сложным информационным мультигенным семействам.

Наиболее полно охарактеризовано мультигенное семейство секреторных белков слюнных желез D.melanogaster .Описан полиморфизм по основным белковым компонентам секрета,проведен анализ их физико-химических свойств.установлена цитогенетическая локализация некоторых генов.изучается молекулярная организация и экспрессия структурных генов секреторных белков ( Korge,1977;1981; Beckendorf .Kafatos, 1976; Кокоза и др. ,1982; Muskavltch,Hognes3, 1982 s Meyerowltz s.a. ,1965; Shore,Guild,1986; Hofmann s.a.,1987)«

Ha D.viriiis изучена метаболическая активность отдельных ферментов .участвующих в гликозшшровашш секреторных белков,процесс секреции в слюнных железах {Cress,1980; Enghofer,Kre3s,1980). Б то же время практически отсутствуют данные,касающиеся организации генетической системы,контролирующей синтез секреторных бел -ков слюнных желез D.virllia.

Цель и задачи исследования. Настоящая работа посвящена генетическому анализу тканеспецифической функции слюнных желез D.vi-rilis ( а также представителей Drosqphila группы virilis . В ходе данной работы ставились следующие конкретные задачи:

- Биохимическое изучение изолированного секрета слюнных желез личинок конца III возраста D.virllia .которое включало электрофо-ретический анализ секреторных белков,определение мол.масс основных

компонентов секрета, выявление углеводсодержащих секреторных белков.

- Выявление тканеспецифических и онтогенетических особенностей формирования секрета в ходе III личиночного возраста.

- Анализ полиморфизма и выявление электрофоретических вариантов по секреторным белкам среди 35 лабораторных линий D.virilis и 12 видов группы virilia ; изучение характера наследования основных секреторных белков.

- Проведение генетического картирования структурных генов, кодирующих синтез отдельных секреторных белков слюнных желез,методом рекомбинационного анализа.

Научная новизна. В данной работе впервые проведено изучение генетической системы.контролирующей синтез тканеспецифических белков слюнных желез личинок Drosophila группы virilis .При злектро-форетическом анализе секрета в кислой буферной системе определены оптимальные условия его разделениям результате чего были выявлены не описанные ранее секреторные белки.Установлены онтогенетические характеристики формирования секрета в ходе III личиночного возраста и тканеспецифичность анализируемых основных секреторных белков слюнных желез.

Впервые описан полиморфизм по основным компонентам секрета у 12 видов группы virilis и 35 лабораторных линий D.virilis .в составе секрета выявлены "О" вариант по секреторному белку, "консервативные" и "полиморфные" компоненты. Показано,что представи -тели фчг.тгадн montana обладают более разнообразными по подвижности и количеству секреторных белков спектрами по сравнению с представителями филады virilis.

В результате анализа генетического контроля синтеза секреторных белков показан аутосомный кодоминантный характер наследова -ния для секреторных белков группы lg и сцепленный с полом для белков spl - sp5 . Определена генетическая локализация в Х-хро-мосоме трех генов,кодирующих мажорные секреторные белки,два из которых оказались тесно сцеплены.

Обнаружено явление активации структурных генов секреторных белков у межвидовых гибридов D.virilis х D.texana . Показана кластерно-дисперсная организация семейства генов секреторных белков D.virilis.

Научно-практическая ценность. Полученные данные можно исполь-

зовать в генетическом анализе процессов индивидуального развитая и цитодифферендировки.Описанные характеристики генетической системы тканеспецифнческой функции слюнных желез D.virilis имеют зна -чение для сравнительного генетико-биохимического анализа сложных мультигенных семейств тканеспецифической функции у разных представителей Díptera . Кроме того.материалы данного исследования были использоезны при написании коллективной монографии Кикнадзе И.И., Колесников H.H., Карают Е.И.,Кокоза В.А. "Организация и экспрессия генов тканеспецифической функции у Díptera

Апробация работы. Материалы диссертационной работы были представлены и обсуждались на У1 Всесоюзном совещании эмбриологов (Москва, 1981); на Международном симпозиуме "Организация и экспрессия канеспецифических генов" (Новосибирск,1982); на Всесоюзном совещании по биологии и генетике дрозофилы (Минск,1985); на 3 Всесоюзной школе-семинаре по генетике и селекции животных(Новосибирск,1989)

Публикации. Основные результаты данного исследования опубликованы в 7 работах отечественной и зарубежной печати.

Структура и объём работы. Диссертация состоит из введения .четырех глав,выводов,списка цитированной литературы ( 191 ссылка ). Работа изложена на 135 страницах машинописного текста,иллюстрирована 25 рисунками и 3 таблица?.":.

Автор глубоко благодарен И.И.Кикнадзе за постоянное внимание к работе. Перелкгиной 1.Ы.,.Кодозе В.А. за помощь при проведении экспериментальной работы и обсуждении результатов.

МАТПБШШ И ^ТОДД.

В работе использованы 12 -видев группы virilis .входящие в

две __- D.YiriJis, D. texa&a» D. sxaoricana ,

D. novenexicaaa, ,D. lurmei H. ( D.iittoralls S» ) ; montana - D.kanekoi, D. ezoana, D. borealis, D. flavonontana , D.aontana, D. Xaoicola, D. inoretensis S. (она seD«littoralia M). Проанализировано такие 35 лабораторных лший D«virilis 2 D. texana - 423,419; 2 линии D.lunmei - 201,205; 3 линии D.ime-retensis - 302,387,1081.

Автор признателен Л.И.Корочкину, В.Г.Митрофанову (Москва,Институт биологии развития ш,т.H.H.Кольцова) за предоставление коллекции видов и линий группы virilis.

Синхронизацию культуры D.virilis проводили по откладке яиц

и моменту второй линьки по Полуэктовой (1975). Секрет выделяли из слюнных желез личинок конца III возраста по методу Kodani (1948) и осаждали 96$ этанолом. Секрет хранили на холоду.Экстрагирование белков секрета проводили в течение 20-24 час. >.

Електрофоретический анализ секреторных белков проводили в 7,5% ПААГ.содержащем Ш мочевины,по методу Panyim, Chalkley (1969) в в градиентном 5-20$ ПААГ,содержащем додецилсульфат натрия (ДСН) ПО методу Laemmli (1970).

Белковые фракции секрета выявляли окрашиванием Кумасси G- 250 и В- 250. Углеводсодержащие секреторные белки определяли при помощи ШИК - реакции по методу Caldwell, Pigman (1965).

ЕЕЗУЛЕШ И ОБСУЖДЕНИЕ Биохимический анализ белков секрета слюнных желез DroBophila группы virills

Для анализа генетической системы,контролирующей синтез сек -реторных белков слюнных желез,на первом этапе был изучен полиморфизм по основным секреторным белкам в 35 лабораторных линиях D.virills и у" 12 видов группы virilis.

Электрофорез белков секрета в 7,5$ ПААГ в кислой буферной системе .содержащей ал мочевины,дает наиболее полную картину разделения основных (мажорных) секреторных белков.Для выявления полиморфизма по белкам секрета исследовали 5 видов филады virilis и 7 ви -дов филады montana.

Сравнительный анализ спектров секрета проводили с учетом филогенетических связей внутри группы и филад .установленных на основе цитогенетических данных ( Throckmorton, 1982).

_Фшгада virilis _ ДЗпектр секрета D.virilis ,как наиболее примитивного вида группы ( Patterson,Stone,1952 ) принимался за исходный тип, с которым сравнивали спектры секреторных белков других видов группы.В результате анализа в секрете слюнных желез выявлены мажорные компоненты,которые обозначены как группа 16 (медленно мигрирующая и состоящая из 2-4 фракций) и группа белкоБ SP1 -sp5 (secretion protein ).в данной работе детально исследовали белки spi-sp5 со средней подвижностью в 7,5$ ПЛАТ (Рис.1).

У D.virilis~ceKpeTopiffle белки sp1 - sp5 по электрофоретичес-кой подвижности можно объединить в две группы.первая из которых состоит из двух белков sp1 , sp2 , а вторая содержит три -spj , sp4, sp5 или два белка - sp¿ ,sp5 • Обнаружен полиморфизм по трем секреторным белкам: sp2, sp4 и sp5 . Для белка зр2 описано пять ва-

риантов (2a,b,c,d,e ); белка sp4 - четыре варианта ( ^а ,ъ, с, d ); белкаsp5- два - ( 5а,ъ ). у 12 линий D.virilis белок sp4 представлен "О" вариантом. Не обнаружено полиморфизма по подвижности белков spl и sp3 среди 35 лабораторных линий D.virilis .Кроме того, выявлены линии с различным содержанием белка зр5 (Рис.1).

При анализе спектра секрета у других представителей филады virilis обнаружен полиморфизм по числу секреторных белков и их подвижности.Количество секреторных белков 1-ой группы у всех представителей одинаковое - два белка ( sp1,sp2). yD.americana ,D.ta-xana fD.lumiaei произошло увеличение подвижности белкаspl по сравнению с D.virilis . Для белка sp2 выявлены варианта (2а,ъ ) у D.texana (линии 423,419).

При анализе второй группы белков у видов этой филады также обнаружены различия по количеству и подвижности секреторных белков относительно D.virilis . Так, у D.americana в спектре один белок spj в ЭТОЙ группе, у остальных ВИДОВ ( D.novamexicana .D.texana , D.luismei ) - 2-3 белка. В отличие от D.virilis у остальных видов филады в спектре секрета имеется один белок,содержащий основное количество секреторного материала.

Таким образом,в филаде virilis наиболее детально охарактеризована D.virilis . У всех представителей этой филады обнаружен полиморфизм по числу секреторных белков и их подвижности.В первой группе белков у всех видов.два белка (spl ,зр2 ),причем белок зр2 наиболее полиморфен. Для белков второй группы характерно уменьшение их количества ПО сравнению С D.virilis : D.novaaexicana , D. texana 419 _ три белка; D.texana 423, D.lummei - два белка; D. americana _ один белок (Рис.1).

Сопоставление полученных данных с результатами патогенетического анализа видов филады virilis ( Patterson, Stone,1952; Throo-morton ,1982 ) не выявило простых закономерностей зависимости изменения спектров секрета от степени эволюционного родства этих видов. Однако,МОЖНО отметить,что виды ( D.novamexicana , D.lummei )» отличающиеся от D.virilis наименьшим числом перестроек,в составе секрета,также как D.virilis ,имеют 4-5 белков. В то время как е. americana .наиболее далекая от D.virilis за счет числа и раз -личных типов перестроек ( Throckmorton,1982 ).обладает тремя секреторными белками. В целом для филады virilis характерна вариация в количестве мажорных секреторных белков от 3 до 5.

sp-a-1 sp-a-2

sp-a-3

Dn Da

Dt

i

î

-fv2—'

^ ТЭТГ ' —

D1

5b

IP2

ФЗ

lp4 IP5

Dv Dv Dv Dv Dv Dv

ЦЛЭ 423 201 112 160 109 101 41 103 205

I

FV

"Dk

De bi

Di

sp-b-1 sp-b-2 sp-b-6

ep-b-3 sp-b-4 sp-b-5|n

Dt

1081 302 387

m

ÏJf

sp-lc-1

ap-lc-6

ap-lc-5

01c

m

WJ

m-

РисЛ.Схематическое изображение спектров белков секрета 12 видов группы virils . Филогенетические взаимоотношения видов приведены по Трокмортон ( ТгосЪшогЬоа, 1982 )

Филава_montana. _. При сравнительная анализе спектров секрета слюнных желез 7 видов показано,что наиболее примитивный вид фшгады D.kanekoi ( Throckmorton, 1982 ) характеризуется наличием 5 секреторных белков,которые как и у D.vlrills можно объединить в две группы. Первая содержит два белка ( вр1,ар2 ),вторая - три ( sp3,sp4,sp5 ).причем подвижность их сопоставима с таковыми D. virilis (Рис Л). '

При электрофоретическом анализе в первой группе белков у D. его ana , D.imeretensls S (линии 302,387) обнаружено, так же как H у D.kanekoi ,два белка,но с отличной электрофоретической подвижностью. У двух видов -D.borealis » D.laclcola в этой группе выявлено три белка (spl,sp2, арб ). У D.laclcola белоквр1 имеет наименьшую,а белок sp2 наибольшую подвижность относительно соответствующих белков остальных II видов группы virllls . Кроме того, в спектре секрета D.borealis и D.laclcola выявлен мажорный белок арб с. редкой подвижностью между первой и второй группами белков. У D.montana И D.flavomontana в первой группе белков выявлен только один белок spi (Рис.1).

В (^иладе montana наблюдается значительная вариация (от 4 до I) в количестве секреторных белков второй группы. В спектре секрета D.montana , D.flavomontana выявлено 4 белка; D.imeretensls S. 1081, D.kanekoi , D.borealis - три белка; D.ezoana ,D.imeretea-sis S. (302,387) - два белка; D.laclcola - один белок (Рис.1).

Таким образом,для филады montana характерно уменьшение количества секреторных белков от 3 до I в первой, от 4 до I во второй группах белков; выявлены белки с редкой подвижностью: у D.laclcola (sp1,sp2, sp6 ), у D.flavomontana , D.mont ana ( sp2 ), y D.borealis ( sp6 ).Характерен также полиморфизм по подвижности и относительному содержанию фракций в составе спектра секрета.

Следует отметить,что такие виды филады как D. kanekoi .D.ezoana .D.imeretensls s. .имеющие спектры секрета сходные о D. virilis до числу секреторных белков,их подвижности и наличию одного белка с основным количеством секреторного материала,относятся, к Евроазиатскому комплексу . Спектр! секрета D. borealis , D.flavomontana ,D. lacicola .D. montana .характеризующиеся отличитель — ными особенностями (наличием белков с редкой подвижностью,двумя бел ками с основным количеством материала) входят в Американский комплекс видов ( stone е.а. ,1960 ),т.е.разобщены географически.

Таким образом,электрофоретический анализ изолированного секрета слюнных желез 12 видов Drosophila группы virilis .входящих в две филады virilis , montana выявил видоспецифические особенности полиморфизма по числу секреторных белков ( 3-6), их подвижности и относительному содержанию секреторного материала.

Сходные результаты получены для белков слюнных желез дрозофил, относящихся К подгруппе D.nasuta группы ВИДОВ D.immigrans Для 8 видов этой подгруппы число мажорных фракций составило пять. Отмечено,что электрофоретическая структура секреторных белков ви-доспецифична, а также обнаружены межлинейные различия в пределах каждого вида ( Ramesh, Kaiisch, 1989 ).Различия по подвижности и относительному содержанию секреторных фракций в спектре секрета выявлены также для различных линий D.melanogaster ( Korge,1975i 1977,1921! Vellisariou.Ashburner,1980,1981; Kokoza е.а.,1982).

_ф£аж^они£ование секреторных белков_в_основной темеЛ1осле электрофореза секрета в ДСН-содержащем градиентном 5 -20$ ПААГ выявлено 4 мажорных секреторных компонента.Первый компонент с мол.массой 220 кД,второй у разных линий D.virilis и видов (D.texana, D.virilis) с мол.массой от 160 кД до 180 кД и две низкомолекулярные фракции - 14 кД и 16 кД. Таким образом, анализируемые секреторные белки слюнных желез D.virilis представляют собой смесь белков, мол.масса которых варьирует в широком диапо -зоне от 14 кД до 220 кД и выше. Вариации от 10 кД до 360 кД в мол. ыассе секреторных белков отмечены для D.melanogaster (Becken -dorf,Kafat os,1976; Korge,1977 5 Кокоза и др.,1980).

_Выякление_углеводе0£е£жаищх_сек£ето£ных_белков. Для идентифи-кации гликозилированных секреторных белков применяли 1IIIK - реакцию после разделения белков в 7,5% ПААГ в кислой буферной системе. Для этого после электрофореза гели окрашивали на белки Кумас-си и для выявления углеводных компонентов использовали Шифф - йодную кислоту. Сопоставляя спектры секреторных белков идентифицп -ровали углеводсодержащие компоненты секрета. Оказалось,что все анализируемые основные секреторные белки spl - sp5 проявляют Неположительную реакцию, то есть являются гликопротеинами. Интенсивность окрашивания на белок и углеводный компонент не всегда совпадает, что может свидетельствовать о разной степени гллкозили-рования белков.

Тканеспецифичность основных секреторных белков.

Сравнительный анализ белковых спектров различных органов личинок D.virilis в конце III возраста ( слюнных желез,изолированного секрета,жирового тела.малышгиевых сосудов,имагинальных дисков ) показал, что в слюнных железах и в секрете содержатся белки идентичные по подвижности белковым фракциям других личиночных тканей. Однако, ШИК - реакция выявила углеводные компоненты только в основных анализируемых секреторных белках слюнных желез. Не обнаружено сходных по подвижности ШИК-положительных фракций в других личиночных органах. Следовательно, выявляемые секреторные гликопротеины оказались специфическими для слюнных желез и могут быть отнесены к тканеспецифическим компонентам секрета D.virilis.

Онтогенетические характеристики формирования спектра секрета слюнных желез D.virilis в III личиночном возрасте

Для анализа становления белковых спектров слюнных желез в ходе III личиночного возраста использовали синхронно развивающихся личинок. Момент второй линьки принимали за "О" часов III воз -раста.Идентификацию секреторных белков проводили сравнением спектров слюнных желез на разных стадиях развития со спектром изоли -рованного секрета конца III возраста. Установлено, что секреторные белки появляются на разных стадиях развития, так белки зрз, sp4,sp5 обнаружены у личинок 32 час. развития, что совпадает с появлением первых ШИК-пшгажительных гранул в клетках железы (Они-щенко и др.,1976). На стадии 54 час. в спектре секрета выявляются белки spl,sp2, а также белки группы 1g . Интенсивность окрашивают основных секреторных белков spl - sp5 возрастает по мере приближешш к моменту образования пупариума и резко ослабевает на стадии предкукодки 2 час., что обусловлено секрецией гликопро-теинов из слюнной железы. Таким образом, анализ формирования спектра секрета слюнных желез показал, что активация структурных генов секреторных белков происходит на разных стадиях III личиноч -ного возраста. ■

Анализ генетического контроля синтеза секреторных белков слюнных желез Drosophlla virilis

Выявленный полиморфизм по электрофоретической подвижности основных секреторных белков зр1 - зр5 у разных линий и видов группы virilis позволил провести анализ генетического контроля синтеза этих белков. v

При проведении экспериментов по генетическому картированию секреторных белков анализировали секрет индивидуальных личинок.

Определение гр^пш_С2еш1ения^ Для определения характера наследования секреторных белков проврдили анализ секрета у потомства первого и второго поколений от рецидрокных скрещиваний между линиями.различающимися электрофоретическими вариантами белков: 9-8L х 160; 9-8L х 142; 156 х 142; 101 х 160; 41 х 101; 41 х 142. Во всех случаях самки первого и второго поколения независимо от направления скрещивания имели гибридный спектр по белкам sp- группы. а самцы обладали материнским типом спектра секрета (Рис.2.). Результаты анализа продемонстрировали аутосомный кодоминантный характер наследования для медленно мигрирующих белков группы 1g и сцепленный с полом для полипеитидов sp2, sp4, sp5.

Так как сравнительный анализ секрета слюнных желез 35 лабораторных линий D.virilis не выявил различий в подвижности белков api, sp3 , для определения характера наследования этих белков использовали межвидовую гибридизацию. Анализировали потомство от скрещиваний D.virilis (160,101) х D.texana ,у которых белки api - ар5 хорошо различаются по электрофоретической подвижности. Анализ гибридных самок первого поколения от скрещиваний в обоих направлениях выявил в спектре секрета все белки,характерные для спектров секрета родителей,то есть самки имели гибридный спектр секрета. В обоих направлениях скрещивания самцы имели материнский тип секреторных белков (Рис.2). Эти данные указывают на кодоми -нантное сцепленное с Х-хромосомой наследование белков sp1, арЗ-

Интересный феномен обнаружен при межвидовой гибридизации D.virilis (160,101) xD. texana , У гибридных самок появляются дополнительные фракции в зоне подвижности белков api - sp2 , отсутствующие в спектрах секрета родителей. Подвижность одной из них лежит между вр1 - ар2 D.virilis .другой - меаду sp-t-1 и ep-t-2 D. texana (Рис.2). По-видимому .дополнительные фракции не являются белками-предшественниками.так как ШИК-положителыш, то есть подверглись гликовизированию. Далее были исследованы гибриды второго поколения от скрещивания гибридов первого поколения между собой.Анализировали 21 самца и 20 самок второго поколения индивидуально. У всех гибридных самок,несущих одну Х-хромосо-му от D.virilis .другую от D.texana выявлен гибридный спектр секрета и обнаружены также две дополнительные фракции сек-

рета, не выявлено влияния аутосом.Можно заключить,что явление активации структурных генов при межвидовой гибридизации обусловлено взаимодействием двух Х-хромосом разных видов.

Р

sp1 sp2e|_

эрЗ

sp5a sp4dL

? с/. ? с/

101

101 41

ф1 ip2d

ФЗ ip4a

Ф5Ъ

</ ?

Р

ioi Dt 101 лгл ТОТ" ТЭТ 101

(DtxIOI) (101 xDt)

ip-t-1 sp-t-2

ap-t-3 sp-t-4

Dt

(101x4-1) (41x101)

Рис.2.Схематическое изображете спектров секреторных белков слюнных железв.у1г111з (101,41), D.texana (Dt) и реципрокных гибридов (F,, ) между ними.

Таким образом,в результате реципрокных скрещиваний между линиями D.virilis и видами группы virilia установлено, что гены секреторных белков api - зр5 локализованы в Х-хромосоме.Поскольку для белков sp2, sp4, sp5 были выявлены аллельные варианты по але-ктрофоретической подвижности,провели генетическое картирование генов этих белков с целью выяснения особенностей организации трех генов: собраны ли они в кластер или расположены в разных участ -ках хромосомы.

Локализация гена VSP-2 .Для этой цели из имеющихся линий первоначально была синтезирована тестерная. линия I27N с маркерами (cv - 25,0; v - 25,5; Вх - 94,5; w - 105 ) со спектром секрета исходной линии 109. В первой серии опытов для локализации гена VSP-2 на генетической карте Х-хромосомы использовали тестер-ную линию I27N и-линию 41,огличапдиеея между собой вариантами 2е и 2с.Принципиальная схема генетической локализации дана на Рис.3. В первом поколении получали гибридных самок и скрещивали их на самцов линии 41.Во втором поколении отбирали самцов по фенотипу. Так как активность гена проявляется на личиночной стадии,а испо- > льзуются видимые маркеры имаго,для определения аллеля гена VSP-2 анализируемого самца,их скрещивали индивидуально с 4-5 самками линии 41 с известным вариантом 2е.В потомстве анализировали только секрет самок.

127Н су у Вх т» 2с су V Вх «г 2с су у Вх у 2с + + + + 2е су у Вх ту (?)

-р,

СУ у Вх + (?) -7

СУ V + + (?) -

су у + у ( 7) -?»

су у Вх 4- (?)

+ + . + + 2е

2,9 25_

у су

+ + + + 2е ---

+ + + + 2е

V

+ + + +(?) + + + (?)

+ + Вх и (?) + + Вх + (?)

+ + у; (?) + + + + 2е

9»,5 105

Вх иг

+ + + + 2е

+ + + + 2е

136 144.5 ар УБР—2,4

У

1

Р

2

г

3

Рис. 3 Схема генетической локализации гена

Результаты генетической локализации гена убр-2 представлены в табл.1. Всего исследовано 138 самцов. Расстояние между генами {&%): су - убр-2-56 ; Вх - убр-2 -49,7 ; v/ - убр-2 - 33,4. Отсюда следует,что ген убр-2 расположен правее гена « .Генетическое расстояние между ними,определенное по формуле Косамби (Захаров,1979) равно 39,5 . Эта формула применяется при высоких частотах рекомбинации для более точного определения зависимости гене -тического расстояния от наблвдаемой частоты рекомбинации.Данные генетического картирования показали,что ген убр-2может быть локализован в положении 144,5 ед.на генетической карте Х-хромосош.

Во второй серии опытов для локализации гена уэр-2 использовали линии 139 (у - 2,9: ар - 136; 2в) и 41 ( + + 2е). В табл.2 представлены данные анализа 77 самцов • Определение частоты рекомбинации мевду генами у,ар и УвР-г показало,что ген УБР-г расположен правее гена ар на расстоянии 8,4 ед.карты (по формуле Косамби). Таким образом, ген увр-2 локализован в положении 144,4 ед. на генетической карте Х-хромосош, что совпадает с предыдущими данными.

Табл.1. Генетическая локализация гена vsp-2

Генотип

число особей

всего

Генотип

V

число особей

всего

+ + + 2е 7 13 9,4 + Вх + 2е 5 10 7,2

стт Вх W 2с 6 CW + W 2с 5

+ Вх W 2с 16 35 25,4 + + W 2е 10 19 13,8

CW + + 2е 19 CW Вх + 2с 9

+ + W 2с 19 34 24,6 + Вх W 2е 9 16 11,6

CW Вх + 2е 15 CW + + 2с 7

+ + + 2с 5 8 5,8 + Вх + 2с 1 3 2,2

CW Вх W 2е 3 GV7 + W 2е 2

Локализация генов vsp-4,vsp-5 Для генетической локализации генов vsp-4,vsp-5 на генетической карте Х-хромосомы определяли частоту рекомбинации между этими генами и геном vsp-2 .используя линии 101 (2Ъ,4а,5Ъ ) и 41 (2е,ад,5а ). В результате реципрокных скрещиваний получали гибридных самок с суммарным спектром секрета и самцов со спектром материнского типа,которых вновь скрещивали между собой. Во втором поколении изучали секрет индивидуально у самок и самцов. Результаты анализа представлены в Табл.3. Не обнаружено ни одного случая рекомбинации между генами vsp-4 и vsp-2 . Всегда встречаются варианты 2Ъ,4а или 2e,4d .характерные для родителей. Это указывает на то, что,по-видимому,гены vsp-2 и vsp-4 тесно сцеплены. Всего проанализировано 108 особей второго поколения.

Табл.2. Генетическая локализация гена vsp-2

Генотип F2

число всего особей

Генотип

число всего особей

%

+ + 2о 28 35 45 + + 2Ь 5 5 6,5

У ар 2Ъ 7 У ар 2е -

+ ар 2Ъ 25 35 45 + ар 2е 2 2 2,6

У + 10 У + 2Ъ -

С другой стороны, в этих экспериментах наблюдали рекомбинацию между генами у£р-2 и увр-5 . Из 108 особей 26 имели варианты 2в,5а и 2е,5в; из 36 исследованных самцов 12 были рекомби -нантными по фенотипу (Табл.3).При определении генетического расстояния по функции Косамби ген УБР-г может быть удален от гена уер-5 на 26,1 ед.карты. На основании полученных данных пока нельзя сделать вывод в какую сторону от гена убр-2 расположен ген убр-5.

Табл.3. Генетическая локализация генов УБР-4. УЭР-д

Генотип потомст- о 41 /10Г £ 101 х 41 ва во втором по- ~ _!_

колении

число особей

всего

число особей

всего

? ? 2Ъ2е,4а4<1,5а5Ъ 26 12

? ¥ 2е2в,4<Мй,5а5а 16 42 4 16

? ? 2Ъ2е,4а4<1,5Ъ5Ъ 3 7

? ? 2Ъ2Ъ,4а4а,5а5Ъ 3 4 11

^^ 2Ъ, 4а, 5Ъ 3 9

^^ 2е, ад, 5а 6 9 6 15

^^ 2Ъ, 4а, 5а 4 ■ 1 У У

° 0 2е, ад, 5Ъ 5 9 2 3

Результаты генетической локализации показывают,что у и.у!-г1На пять генов, кодирующих синтез секреторных белков расположены в X—хромосоме, два гена (УЭР-2, УБР-4), по-видимому,тесно сцештены к локализованы в положении 144,5 ед.генетической карты Х-хромосош, ген У5Р-5 удален от них на расстояние 26,1 ед.карты. В отличие от В.уХгШа у В.те1апс^авЪег только один ген Ббз-4 локализован в хромосоме X (Когее,1977; Кокоза,1983), а три гена (Беб-з, 833-7, Б£а-8 ) образуют кластер в районе 68С хромосомы 3 (Мрувгоу1Ъа,Ноепвзз,1982).

Таким образом,организация генов тканеспецифической функции слюнных желез ю^иШа несколько отличается от в.те1аповазЪег но есть общие черты - тканеспецифический характер экспрессии,последовательное включение генов в онтогенезе,кластерно-дисперсное распределение в геноме.

выводы

1. Проведен генетический анализ тканеспецифической функции слюнных желез D. virilis , заключающейся в синтезе секреторных гликопротеинов в ходе III личиночного возраста.

1.1. В составе секрета разных линий D.virilis после электрофореза в кислой буферной системе выявлено две группы мажорных компонентов: а) группа ig , состоящая из 2-4 фракций; б) группа белков spl - sp5 . Основные компоненты секрета ШИК-положительные, то есть относятся к классу гликопротеинов.

1.2. Секреторные белки обладают тканеспецифичностью, не выявлено аналогов по злектрофоретической подвижности в спектре белков жирового тела и гемолимфы. Активации генов секреторных белков происходит на разных стадиях III личиночного возраста: на стадии 32 час. в спектре секрета выявляются белки зрЗ, sp4, sp5; на стадии 54 час. - белки spl, sp2, а также белки группы ig.

2. Впервые описан полиморфизм по основным компонентам секрета у 35 линий D.virilis и 12 видов группы virilis.

2.1. Из 8 описанных спектров секрета два оказались характерными для 21 линии D.virilis . в составе секрета выявлены "консервативные" ( по элетрофоретической подвижности ) и полиморфные компоненты. Обнаружено 12 линий с "О" вариантом по белку зр4.

2.2. Среди 12 видов группы virilis выявлены межвидовые различия по белкам эр- группы. В филаде virilis количество фрак -ций колеблется от 3 до 5, в филаде montana от 4 до 6. Представители филады montana ( D. borealis, D. lacicola ) обладают более разнообразными по подвижности белками по сравнению с самым "примитивным" видом группы D.Virilis.

3. Генетический анализ продемонстрировал аутосомный кодо-минантный характер наследования для медленно мигрирующих белков группы ig и сцепленный с палом для полипептидов spl - sp5>

3.1. Ген ■ vsp-2, кодирующий синтез белка зр2 локализован в положении 144,5 ед. генетической карты Х-хрсмосомы; ген vsp-5 удален от гена vsp-2 на 26,1 ед. генетической карты.

3.2. В ходе гибридологического анализа не выявлено реком-бинантов меаду генами vsp-2 и vsp-4 , что указывает на их тесное сцепление.-

4. У межвидовых гибридов D. virilis на D.texana в спектре

секрета обнаружены две дополнительные фракции, отсутствующие в спектре секрета родителей. Показано, что появление этих фрак -ций определяется взаимодействием только двух Х-хромосом от разных видов, не выявлено влияния аутосом. Высказано предположение, что в данном случае происходит активация структурных генов при взаимодействии геномов разных видов.

Результаты исследования опубликованы в следующих основных сообщениях:

1. Колесников Н.Н., Айманова К.Г..Макарова Е.Н. Экспрессия тканеспецифических генов,контролирующих синтез секреторных гли-копротеинов в слюнных железах Drosophila virilis в ходе развития// Тезисы У1 Всесоюзного совещания эмбриологов.-Москва.-1981.- С.86.

2. Kolesnikov N.N..Aimanova K.G. Genetic and biochemical analysis of secretory proteins of the salivary glands of Drosophila virilis // Abstracts of European Dros.Res.ConfFinland.- 1981.- P.65.

J. Kolesnikov N.N.,Aimanova K.G., Pereligina L.M. Genetic and biochemical analysis of Drosophila virilis salivary glands // Abstracts of International Sym."Organization and expression of tissue-specific genes".- Novosibirsk.- 1982.-P.33.

4. Колесников Н.Н..Айманова К.Г. Характеристика секреторных гликодротеинов слюнных желез и их генетический контроль у Drosophila virilis // В кн.: Организация и экспрессия генов тканеспецифической функции у Diptera .- Новосибирск: Наука.-1985.- С.80-96.

5. Aimanova K.G..Pereligina L.M..Kolesnikov N.N. A biochemical analysis of the salivary gland secretory glycoproteins of Drosophila virilis // Dros.Infoim.Serv.- 1987.-V.66.- P.1-3.

6. Aimanova K.G..Pereligina L.M., Kolesnikov N.N. A genetic analysis of the tissue-specific salivary gland secretory proteins of Drosophila virilis// Dros.Inform.Serv.-1987.-V.66.-

P. 3-5.

7. Айманова К.Г..Колесников Н.Н. Межвидовые отличия в спектре белков слюнных желез Drosophilaч группы virilis // Тези -сы докл. 3 шкслы-семинара по генетике и селекции животных.- Известия СО АН СССР.- 1989.-вып.2,- С.45. „ „

JZiuJ'