Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические дефекты и полиморфизм гена каппа-казеина у племенного молочного скота

ВАК РФ 03.02.07, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические дефекты и полиморфизм гена каппа-казеина у племенного молочного скота"

На правах рукописи/

НИКИФОРОВА ЕКАТЕРИНА ГЕННАДЬЕВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕФЕКТЫ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА У ПЛЕМЕННОГО МОЛОЧНОГО СКОТА

Специальность: 03.02.07 - генетика

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

0050&»1*-

1 6 ПАЙ 2013

Санкт-Петербург-2013

005059129

Работа выполнена в Государственном ночном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской Академии

сельскохозяйственных нау к

Н^чный руководитель:

доктор биологических наук, ГНУ ВНИИГРЖРосселкозакадемии Терлецкий Валерий Павлович

Официал ьные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, ГНУ ВНИИГРЖ Ро ссел ьхозакад емии Кузьмина Татьяна Ивановна

кандидат биологических нау к, ФГБОУ ВПО ОТбГАУ Митютько Валентина Ивановна

Ведущая организация: ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины»

Защита состоится » zUCiJ 2013 года в « » часов

на заседании диссертационного совета Д 006 01201 по защите докторских и кандидатских диссертаций в Государственном ночном учреждении Всероссийский н^чно-исследоватетьский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской А гад емии

сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИГРЖ РАСХН) по адресу: Московское ш., д. 55 а, г. Пушкин, Санкт-Петербург, 196601. E-mail: spbvniigen(fi.;mail xu. факс 8 (812)465 99 89.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВНИИГРЖРАСХН. Автореферат разослан 2013 года.

Ученый секретарьдиссертационного совета, *

доктор биологических н^к,профессор г—ГН. Сердюк

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Летальные рецессивные мутации могут наносить большой экономический ущерб отрасли животноводства во многих странах мира, в том числе вРоссии. В племенных хозяйствах Ленинградской области их распространение практически не изучаю. Аюуалшость проведенных исследований определяется необходимостью выявить вредные рецессивные мутации в популяциях племенных животных Ленинградской области, особенно у быков-производителей с целью ограничения их распространения в процессе разведения. Своевременный мониторинг позволит снизить частот}' встречаемости этих дефектов и, таким образом, повысить воспроизводительные качества племенных животных, повысить резистентность к бактериальным инфекциям. Генотипирование по гену каппа-казеина даст возможность определить структуру стад по типам этою гена и идалифицировать животных -носителей определенных аллелей. Связь аллелей гена каппа-казеина с удоями, содержанием жира и белка в молоке исследовали многие авторы, однако выводы из этих работ носят протнюречивый характер. Поэтому изучить этот вопрос на примере высокопродуктивных племенных животных Ленинградской области является актуальной задачей для современного молочного скотоводства. Целью является п р еймущественное использование носителей благоприятных аллелей в селекционном процессе.

Цель и задачи исследования. Цель представленной работы заключается в выявлении распространенности вредных рецессивных мутаций и типов каппа-казеина в племенных стадах чфно-пестрой голштинизированной и айрширсюй пород в Ленинградсгайобласти.

Длядостиженияу казанной цеди б ыли поставлены следующие задачи:

- модифицировать способ выделения геномной ДНК, пригодной для генотипирования методомПЦР;

- оптимизировать процедуру проведения ПЦР на предмет выявления мутаций BLAD CVM и DUMS, а также типов капп а-казенно в;

- провести генотипирование на предмет носительсгва вредных рецессивных мутаций и выявления аллельных вариантов гена каппа-казеина у животных 6-ти хозяйств Ленинградской области, а также быков племпредприятия ОАО «Невское» по племенной работе;

- обеспечить быстрый ответ специалистам хозяйств касательно результатов генотипирования;

- выявить связь между алледьными вариантами гена каппа-казеина и рядом продуктивных признаю в у коров (удой, содержание жира и бедка), а также у нэров-дочфей быков в сравнении со сверстницами (удой, содержание жир а и бедка).

Научная иопизна. Оптимизированы методы выделения ДНК и проведения полимеразной цепной реакции для выявления летальных рецессивных мутаций и аллелей гена каппа-казеина. Выяснена частота летальных рецессивных мутаций BLAD, CVM, DUMPS среди быков

-производителей и ремонтных бычюв. С целью снижения частоты этих мутаций и распространения их в потомстве впервые проведен скрининг и выделены быюпроизводящие коровы - носители генетических дефектов. Определенычастоты аллелей гена каппа-казеина среди племенных животных и состояние генетического равновесия в популяции молочного скота. Установлен повышенны"! удой у коров-носителей ачлели «В» гена каппагказеина и повышенное содержание белка в молоке дочерей быков-носителей аллели «В».

Научно-практическая значимость. Проведенный ПЦР-ПДРФ анализ на предмет выявления мутаций ВЬАБ, СУМ и БиМЗ позволяет понять степень распространенности этих мутаций у племенных животных. Эта знания позволяют проводить эффективный контроль частоты встречаемости мутаций в процессе селекционной работы с целыо недопущения фенотипического проявления этих мутаций, наносящих существенный эыэномический ущерб хозяйствам. Выявленная связь аллели «В» с молочной продуктивностью позволит проюдить селекцию сучетом этого показателя.

Основные положения, выносимые на защиту:

оптимизация процедуры быстрого выделения ДНК и проведенияПЦР;

- профили аллелей мутаций ВЬАБ, СУМ и БиМЗ у племенных животных;

- необходимость проведения генотипирования в современных условиях индустриального животноводства;

- анализируемые популяции молочного сшта находятся в равновесии по частотам аллелей (равновесие по Харди-Вайнбергу);

- существует связь генотипов по гену каппа-казеина с продуктивными признаками у коров.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсужцены на международной ночной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.М. Лебедева «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных (Санкг-Петфбург, 2009), на Международной конференции «Вопросы образования и науки: теоретические и методические аспекты», 2012 г., Тамбов, на отчетных сессиях Ученого ответа Государственного ночного учревдения Всероссийский н^чно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных 2007-2012 гг.

Публикации. По теме диссертации опублиювано 5 научных статей.

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, предложения производству, список использованной литературы. Работа содержит 111 страниц машинописного текста, 18 таблиц, 7 рисунгов. Библиография включает 169 наименований, в томчисле 114 наиностранных языках.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Исследования проводили в период 2007-2009 годы в лаборатории молекулярной цитогенетики ГНУ ВНИИГРЖ. Объектом исследований была ДНК, выделенная из крови быков-производителей племпредприятия ОАО «Невское» по племенной работе (далее - «Невское»), ремонтных бычков и коров 6-ти племенных хозяйств Ленинградской области. Генотипировали 275 быков и 359 коров, таким образом, общее число животных в анализе составило 634 головы.

Использовали два метода выделения геномной ДНК, пригодной для генотипирования методом ПЦР:

- классический фенольный метод;

- метод, основанный на использовании наборов ДНК-сорб-В ФБУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора.

Нами был найден оптимальный вариант генотипирования. Оказалось, что в некоторых случаях предпочтительно использовать определенные ферменты, буфера и праймеры. Удалось найти оптимальные сочетания всех компонентов, что позволило разработать надежную систему генотипирования с применением коммерчески доступных реактивов.

Выявление мутации BLAD.

Выявление мутации BLAD проводили с использованием различных праймеров. Оказалось, что праймеры, предложенные в работе Schifferli (Schifferli С. et al, 2000), давали более четкий сигнал, чем методика по Shuster (Shuster et al., 1992).

Использование праймеров, предложенных в работе Medrano (Medrano et al., 1990) приводило к амплификации ПЦР-продукта, который нужно было для выявления типов гена каппа-казеина расщеплять рестриктазой Hinft. Для подтверждения результатов мы использовали другую комбинацию праймеров, предложенных в работе словацких ученых (Vasícek et al., 1995). Были использованы праймеры:

прямой 5 '-AGGCAGTTGCGTTCAACGTGA-3',

обратный 5'-CCGACTCGGTGATGCCATTGA-3';

ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 1 ед. Taq - полимеразы, по 0,25 шМ каждого dNTP, 67 mM трис -НС1 рН 8,6, 2,5 mM MgCl2, 16,6 mM NH4OH, по 0,5 мкм каждого праймера и 100-150 нг ДНК. использовали буфер из набора фирмы Интерлабсервис «5х ПЦР-буфер blue».

Программа включала в себя первоначальную денатурацию (95° С, 1 мин), 40 циклов, состоящих из следующих повторяющихся друг за другом этапов - денатурация - 95° С, 1 мин, отжиг праймеров - 62° С, 1 мин, синтез -72° С, 1 мин; финальный синтез - 72° С, 5 мин.

Полученный амплификат резали при помощи 3-4 ед. рестриктазы Taql (Fermentas) при температуре 56°С в течении 2 часов. Обе цепи ДНК здоровых животных режутся с помощью указанного фермента. В итоге на электрофорезе мы видим два фрагмента -100 п.н и 58 п.н. Так как мутация

ведет к исчезновению сайта рестрикции для Та} I, то ДНК животного, гетерозиготного по этой мутации будет представлена в видетрех фрагментов 158 пл., 100 пл.,58 пл.

Выявление мутации СУМ.

Использовался метод ПДРФ аншшза ПЦР продуктов. В связи с тем, что выявляемый фрагмент ДНК длиной в233 п.о.(101 по. 4-го экзонаи 132 по. 4-го интрона) в месте нахождения точенной мутации не имеет сайтов рестрикции, необходимо искусственно ввести сайты путем использования специфических праймеров .ЗаменаG (дикий тип аллели) на Т (CVМ-аллель) приводит при использовании праймеров к исчезновению сайта для рестриктазыРвИ

прямой Pst5'- САС AATTTG TAG GTC ТСА CTG CA, обратный 5'- CGA TGA AAA AGG AAC CA A AAG GG. При использовании праймеро в по является сайтрестрикции дляЕооТ22, выявляющий мутантную аллель:

прямой ЕсоТ22 5'- САС AATTTG TAG GTC ТСА A TG CA, обратный 5'- CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG. Оба праймера комплементарны последовательности наминая с нуклеотида № 537 до 554 гена 5ЬС35АЗ,однаиэ 2 нуклеотида в 4-й и 5-й позиции с З'-гонца праймеров являются различными. Три нуклеотида на З'-юнце обоих праймеров являются комплементарными нуклеотидам 556-558 как кдиюй,таки кСУМмутантной аллели.

Начальнаяденатурация94°С- 1 минута, денатурация 94°С-30 се^нд, отжиг 56°С - 30 секунд, удлинение 72°С - 30 сиунд, конечная ин1убация 72°С - 2 минуты. Всего проводится 30 циклов. Для ускорения анализа на большом поголовье животных, нами были использованы аллель-специфичные праймеры для выяапенияточечной мутации СУМ: прямой №1 5'- CA С AATTTG TAG GTC ТСА CTG GAT, прямой №2 5'- САС AATTTG TAG GTC ТСА CTG GAG, обратный 5'- CGA TGA AAA AGG AAC CAA AAG GG. ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 1 ед. Taq -полимеразы, по 0,25 тпМ каждого dNTP, 67 mM трис -HQ pH 8,6, 2,5 mM MgCl2, 16,6 mMNH^OH, по 0,5 мкм кавдого праймфа и 100-150 нг ДНК. В последнее время и спол ьзу ем бу фф из н абор а фир мы И нтфл аб сф ви с «5х ПЦР-буфф blue». При использовании аллель-специфических праймфов ставится две реакции ПЦР:прямой №1 + обратный и прямой №2 + обратный. В случае если амплификация произойдет в комбинации прямой №1 + обратный,можно говоритьо наличии мутации(заменаС наТ).

Ген PTPN18, мутация в котором ответственна за развитие симптомов DUMPS, локализован в первой хромосоме. Точковая мутация в гене привела к замене в 405 положении цитозина на тимин. Для проведения полимеразной цепной реакции были использованы праймеры:

прямой 5'- GAACATTCTGAATTTGTGATTGGT - 3', обратный 5'- GCTTCTAACTGAACTCCTCGAGT - 3'. ПЦР проводили в общем объеме 25 мкл, содержащем 1-2 ед. Taq -полимеразы (Биолаб, Санкт-Петербург), по 0,25 тМ каждого dNTP, 67 тМ трис -НС1 рН 8,6, 2,5 mM MgCl2, 16,6 тМ NH4OH . по 0,5 мкм каждого праймера и 100-150 нг ДНК. В последнее время используем буфер из набора фирмы Интерлабсервис«5х ПЦР-буфер blue».

Программа ПЦР включала в себя первоначальную денатурацию (94°С, 1 мин), 30 циклов, состоящих из следующих повторяющихся друг за другом этапов - денатурация - 94° С, 1 мин, отжиг праймеров - 60°С, 1 мин, синтез - 72°С, 1 мин; финальный синтез - 72°С, 5 мин. Полученный амплификат резали при помощи 3-4 ед. рестриктазы Aval (Fermentas) при температуре 37°С в течении 2 часов. Обе цепи ДНК здоровых животных режутся с помощью указанного фермента в двух местах. В итоге на электрофорезе мы видим три фрагмента - 40, 36 и 19 п.н. Так как мутация ведет к исчезновению одного сайта рестрикции для Aval, то гетерозигота по этой мутации будет представлена в виде четырех фрагментов 76, 40,36 и ! 9 п.н.

Проведение полимеразной цепной реакции для выявления генотипов по гену каппа-казеина

При типирования гена каппа-казеина использовали праймеры: прямой 5'-GCT GAG CAG GTA ТСС TAG TTA T-3' обратный 5'-CTT CTT TGA TGT CTC CTT AGA G-3\ Продукты амплификации подвергались расщеплению с помощью эндонуклеазы рестрикции ЯгЫШ (Vasicek et al., 1995). Использовали 5 е.а. фермента, реакцию проводили 3 часа при 37°С. ПЦР-смесь содержала 200мкМ концентрацию праймеров и 1 е.а. Taq-полимеразы. Начальная денатурация проводилась при 95°С в течение 5 минут. Использовали 35 циклов: денатурация 94°С в течение 40 секунд, отжиг 53°С в течение 40 секунд, удлинение праймеров 72°С в течение 40 секунд.

Фрагменты ДНК, полученные в результате амплификации и расщепления ДНК эндонуклеазами рестрикции, разделяли в 2% агарозном геле. Гель заваривали в 0,5-кратном трис-боратном электрофорезном буфере в микроволновой печке. Сразу после приготовления в горячую агарозу вносили бромистый этидий в количестве 5 мкл (10 мг/мл) на 100 мл агарозы.

После остывания агарозы до примерно 50°С ее заливали на подложку в заливочном столике. Застывала агароза в течение 40 минут. После этого осторожно удаляли гребенки и гель с подложкой устанавливали в электрофорезный аппарат. Перед работой в электрофорезный аппарат

вносили буфф для электрофореза. Наиболее удобно пользоваться 0,5-кратным трис-боратным буффом.

Электрофорез проводили при напряжении электрического поля в 150 вольт втечениеЗО минут. В одну из лунок геля вносили маркф длин фрагментов ДНК. Использовали коммерчески доступные маркфы молекулярных массрВЮ22Ш<1 (908,659/656,521,403 ¿81,257,226,100,90 пф оснований) и pUCl9/Mspl (501,489,404,331,242,190,147,111Л 10,67, 34/34). Маркфы вносили влунки в юличестве2 мкл.

После завфшения электрофореза гель просматривали в трансиллюминагоре под ультрафиолетовым светом и, если, результат бьт положительным, гель фотографировали в системе гень-документации для дальнейшего анализа.

Статистическую обработку данных проводили по стандфтным методикам, рассчитывали частоту встречаемости генотипов, частоту аллелей в популяции, вычисляли до сто вф но ста разности между средними значениями количественного признака в выборках оюбей разного генотипа для выявления связей между генотипами и продуктавными признаками

Помимо использования традиционного расчета критфия досговфности, применяли t-тест, заложенный в пакет программ Excel 2007, позволяющий определить вфоятноегь того, что две выборки взяты из генфальных совокупностей, юторые и moot одно и то же феднее значение количественного признака.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Использование праймфов 5' - AGG CAGTTG GG ТТСА A OG TG А-3', обратный 5'-CCGACTCGGTGATGCCATTGA-3' и эндонуклеазы рестрикции Taql позволило провести анализ образцов ДНК, вьщеленных из крош племенньк горови бымэв Ленинфадской области на предмет носительства мутантной аллели в гене CD18. Данная комбинация праймфов и ффмента рестрикции дает четкую картину фрагментов ДНК (рисунок 4). Если животное является носителем мутации в гетфозиготном состоянии, то на картине видно три фрагмента ДНК - 50, 107 и 157 пар оснований, если животное гомозигота по мутации — один фрагмент 157 пф оснований, не носители имеют два фрагмента длиной 50 и 107 пф оснований. Объясняется такое распределение фрагментов тем, что при наличии мутации исчезает сайт для расщепления ффментом Taql и на картине виден амплифи кат длиной 157 пф оснований.

При наличии мутации в одной хромосоме (гегерозигота) половина амплификата расщепляется фф ментом на фрагменты 50 и 107 пф оснований, а другая половина не расщепляется - 157 пф оснований. В результате видны все три фрагмента. В случае гомозиготы по мутации амплифи кат не расщепляется и на картине проявляется фрагмент длиной в 157 пар оснований.

1 2 3 4 5 6 7 М 8 9 10 11 12 13

50 п.о. 107 п.о. 157 п.о.

Рисунок 1. Картина ПЦР-ПДРФ на носительство мутации ВЬАБ у 13 племенных животных. 1, 5, 6, 7 - носители мутации ВЬАБ; 2, 3, 4, 9-13 -норма (не носители); 8 - гомозиготный носитель мутации ВЬАБ; М - маркер молекулярных масс рБС19 БЫ А/Мер I

Типичная картина ПЦР-тестирования животных на СУМ представлена на рисунке 5. В связи с тем, что каждый образец представлен в двух реакциях амплификации (аллель-специфическая ПЦР-реакция) на картине видим пары дорожек.

М 1 2 3 4 5 б 7 8 9 10 М

Рисунок 2. Картина продуктов амплификации на носительство мутации СУМ (дорожки 7-10 - носители мутации, остальные пары дорожек - не носители)

Работа по тестированию быков началась в середине 2000-х годов. Ежегодно проверялись не только быки, стоящие на племпредприятии «Невское», но и ремонтные быки в ведущих племенных хозяйствах Ленинградской области. Кроме быков тестировали также племенных коров. Прежде всего, были проверены быки четырех линий племпредприятия «Невское». Было выявлено несколько носителей мутации ВЬАБ. В частности, в линии быка Вис Айдиал носителем оказался бык Хагги 601, в линии Рефлекшн Соверинга - Дедок 385 и Джерри 89335, в линии Монтвик Чифтейна - Издатель 52025 и Рис 2108575. Быки линии Пабст Говернор были свободны от мутации ВЬАБ.

В хозяйствах «Лесное», «Рабитицы», «Гражданский» носителей мутации ВЬАБ в 2008 году выявлено не было. В ЗАО ПЗ «Ленинский путь» был обнаружен один носитель - ремонтный бык № 522. дата рождения 16.01.2007 (мать - Гана 3604, отец Маркиз 3649). В этом же году проведено

тестирование56 быков наплемпридприятии «Невское» и один быкоказался носителем: Малевич № 239. Таким образом, по итогам года было протестировано 138 голов и выявлено 2 гетерозиготных носителя мутации BLAD.

Работа по генотипированию племенных животных продолжилась в 2009 году. К это!^ времени была отработан а методика выявления носителей мутации CVM. Установлены два носителя мутации CVM - бык №90 07Ю52008 гр. из ЗАО «Ленинский путь» (мать - Июнька 3452, отец

- Мэрт 3940) и бык №2794 27Ö72008 г.р. из ЗАО ПЗ «Петровский» (мать

- Линейка 3470, отец - Лиазон 4783). В этом году быков, положительных по мутации BLAD выявлено не было.

Помимо генотипирования быков в 2009 году были генотипированы коровы в племенных хозяйствах Ленинградской области.

Данные тестирования коров позволили установить ряд носителей вредных рецессивных мутаций. В частности, в ЗАО ПЗ «Гражданский» выявлено две носители мутации BLAD (юровы Анкета 3446 22.102004 гр. и Доля 3312 08Ö92004 гр. и одна корова была положительной по мутации CVM - Зазубринка 32545 2008 2004 гр.). Мутация CVM оказалась распространенной вОАО ПЗ «Лесное», где часто та ветрея аемости превысила 10 % (79 голов, 8 носителей). Носителями мутации были 8 коров (№№515, 429, 450, 704, 499, 221, 427 и 351). В осношом, мутационный аллель наследовался от отца- б ыка-производител я Момент 5747 (6 носителей из 8). Помимо этого, в хозяйстве выявлено два носителя мутации BLAD - коровы №420 и №361.

Несмотря на довольно большое число обследованных иэров в хозяйствах ЗАО ПЗ «Рабитицы» (50 голов) и «Петровский» (19 голов), носителей вредных рецессивных мутаций в 2009 году не выявлено. Тестирование на мутации в племзаводе «Но гол ацо же кий» не проводилось (анализ только натапы к-казенно в).

Частота встречаемости мутации BLAD находится в пределах 1-2%. Сравнивая с данными за прошлые годы, которые были получены в лаборатории, частота встречаемости мутации существенно сократилась. что связано в первую очередь с проверкой и выбраковкой бынов-носителей мутации BLAD. Аналогичная ситу ация наблюдается в ряде развитых стран, где в программы селекции включаю обязательное тестирование племенных животных (Schutz et al., 2008).

Частота встречаемости мутации CVM в некоторых хозяйствах еще высока (10%), поэтому имеется необходимость тестирования молодняка и племядра для выявления носителей мутации. Высокая частота встречаемости CVM-мутации связана с широким использованием быков -носителей с высокой племенной ценностью. Это такие быки как Базилик 8297 и Момент5747.

Определение носителей мутаций очень важно для племенных хозяйств. Продажи племенных бычюв невозможны без тестирования на летальные мутации. Тестирование юрови телоктакже необходимо для снижения затрат

на осеменение и выращивание молодняка. Например, для осеменения коров -носителей мутаций можно использовать менее дорогую сперму, а их потомство может быть использовано для товарного производства молока. Постепенно при использовании «чистых» от мутаций быков и отбору в племядро «чистых» животных, можно за одно-два поколения полностью очистить стадо. Аналогичное тестирование по выявлению животных -носителей вредных рецессивных мутаций и их удаление из племенной работы во многих странах привели к существенному снижению частоты этих мутаций (МикЬорасйуауа е! а!., 2000; Ра1е1 е1 а1., 2007; Яопш^еп, 1973; Сгаггик е1 а1., 2007Ь). В товарных хозяйствах проверять поголовье не выгодно, необходимо использовать семя только проверенных на мутации производителей.

Данные, за 2008-2009 гг. были суммированы с данными генотипирования племенных животных, полученными в лаборатории за предыдущие годы и рассчитаны частоты встречаемости рецессивных мутаций (таблица 1).

Таблица 1. Частота генотипов носителей ВЬАО, СУМ в различных _хозяйствах Ленинградской области _

хозяйство всего исследовано голов носители мутации BLAD, % носители мутации CVM, %

ЗАО ПЗ «Рабитицы» (коровы) 50 0 0

ОАО ПЗ «Лесное» (коровы) 80 2,5 10

ЗАО ПЗ «Петровский» (коровы) 19 0 1,6

ЗАО ПЗ «Гражданский» (коровы) 125 1,6 0,8

ЗАО ПЗ «Рабитицы» (ремонтные бычки) 4 0 0

ЗАО ПЗ «Ленинский путь» (ремонтные бычки) 14 0 7,1

ЗАО ПЗ «Петровский» (ремонтные бычки) 17 0 5,9

Итого 309 1,0 3,1

В целом, частота встречаемости мутации BLAD в настоящее время находится на приемлемом низком уровне (1,0%), мутация CVM имеет более высокую частоту встречаемости, но это объясняется очень высокой частотой в хозяйстве «Лесное». Мутация DUMPS у племенных животных Ленинградской области за период 2007-2009 годы выявлена не была.

Параллельно на протяжении ряда лет проводили ПЦР-тестирование на типы гена каппа-казеина. В соответствии с нуклеотидной

последовательностью гена каппа-казенна в аллелшом варианте «А» сайт рестрикции для фермента НтйШ отсутст^ет, а в вфианте «В» - присутствует. Таким образом, нуклеотидная последовательность варианта «В» расщепляется на два фрагмента длиной 400 и 130 пар оснований. Амплификат варианта «А» имеет размер 530 пар оснований. Были получены данные по встречаемости генотипов по каппагказеину у быков-производителей племпредприятия «Невское» за три периода (таблица 2). Данные показывают, что в черно-пестрой породе за период с 1995 по 2007 год произошло существенное снижение «АВ» генотипов при одновременном увеличении частоты «АА» генотипов. В айрширсгай породе тестирование проводилось дважды - в 2005 и 2007 годах, гомозиготных животных по аллели «В» выявлено не было, более того в 2007 году отсу тетю вали и гетерозиготы«АВ».

Таблица2.Частота генотипов(%) по капп а-казеину у быков-производителей

Порода АА АВ ВВ

1995 2005 2007 1995 2005 2007 1995 2005 2007

Черно-пестрая 28,8 85,7 93,3 67,3 9,5 6,7 3,84 4,8 0,0

Голшгинская 13,3 66,7 31,6 86,6 28,6 63,2 0,0 4,7 5,3

Айр широкая - 83,3 100,0 - 16,7 0,0 - 0,0 0,0

Тестирование на типы гена каппа-казеина проводится в лаборатории молекулярной цитогенетики ГНУ ВНИИГРЖ Россельхозакадемии с 1995 года. Наша работа дополнила эти исследования новыми данными не талы® по быкам-производителям, но и коровам черно-пестрой, айрширеюй и голштинсгой пород.

Результаты тестирования бычюв по гену каппа-казеина за 2009 год по ЗАО ПЗ «Ленинский путь»,ЗАО ПЗ «Петровский»,ЗАО ПЗ «Рабитицы», тестирование по ЗАО ПЗ Гражданский», ОАО ПЗ «Лесное», ЗАО ПЗ «Петровский», ЗАО ПЗ «Рабитицы» и ПЗ «Новоладожский», представлены в таблицеЗ.

В исследованиях, проведенных в 1995 году (Усенбеков, 1995) бьпо показано, что более 67% черно-пестрых быков-производителей имели гетерозиготный генотип АВ, до 2007 года их число резко снижалось и соьратилось до 9$%. Наглядно динамика изменения частот генотипов по гену каппа-казеинапредсгавленанарисункеЗ.

ТаблицаЗ. Частота генотипов по гену каппа-казеинау телок, высокопродуктивных коров,ремонтных бьнковвразных племенных хозяйствах Ленин град его й области

хозяйство всего исследо-вано голов генотип по канпа-казеину, %

АА АВ ВВ

ЗАО ПЗ «Рабигицы» (коровы) 50 82,00 18,00 0,00

ОАО ПЗ «Лесное» (коровы) 80 81,25 18,75 0,00

ЗАО ПЗ «Петровский» (коровы) 19 63,16 31,58 5,26

ЗАО ПЗ «Гражданский» (коровы) 125 76,80 23,20 0,00

ОАО ПЗ «Новоладожский» (коровы ) 85 66,44 32,56 0,00

ЗАО ПЗ «Петровский» (бычки) 17 64,71 29,41 5,88

ЗАО ПЗ «Ленинский путь» (бы чки) 14 85,71 7,14 7,14

Итого 390 74,93 23,78 0,77

90 80 7060 504030 2010 о-

АА АВ ВВ АА АВ ВВ

Рису но к 3. Дин ами ка и змен ения ч асто т встр еч аемо сти геноти по в ген а каппа-казеина в 1995 и 2007 годах

По результатам 2008 годаотмечен рост доли гетерозиготных генотипов среди быков-производителей до 0,4. Увеличение доли генотипа «АВ» обусловлен завозом животных гетерозиготных по каппа казеину из других стран. Доля ценных с точки зрения сыроделия носителей генотипа «ВВ» ср еди б ыго в-лроизводител ей составл яет 2-5%.

□ 1995 ■ 2007

Доля гомозиготных особей «АА» в ведущих племенных хозяйствах очень высока (таблица 3). В ЗАО ПЗ «Петровский» отмечена высокая доля гетерозигот (около 0,3)- Были найдены также носители генотипа «ВВ» как среди коров, так и среди ремонтных бычков. У коров айрширской породы (ОАО ПЗ «Новоладожский») доля гетерозиготных особей около 1/3, что выше, чем по голштинской породе. Гомозигот с аллелями «ВВ» в выборке айршнрских коров не обнаружено. Зная частоты встречаемости генотипов, были рассчитаны частоты отдельных аллелей. Так, частота аллели «А» в голштинской породе по всем хозяйствам составила 0,88. Частота аллели «В» - 0,12. В айрширской породе частота встречаемости аллели «А» была несколько ниже и составила 0,84.

Высокая частота гетерозиготного генотипа «АВ» в айрширской породе (не обеспечила повышенной частоты аллели «А» в сравнении с голштинскими животными. Объяснить это можно наличием некоторого числа гомозигот «ВВ» у голштинов. Известно, что именно гомозиготы дают больший вклад при расчете частоты аллели. Низкое содержание гомозигот по аллелю «В» в наших исследованиях совпадает с данными других авторов (Калашникова с соавт., 2007; Михайлова с соавт., 2007). В зарубежных исследованиях также отмечается невысокая частота встречаемости «В» аллели, например, у красных шведских и шведских голштинов частота «В» аллели составляла 0,17 (Hallen et al., 2008). В связи с тем, что «В» аллель связан с выходом и качеством сыра, можно предполагать, что в странах с высокоразвитым сыроделием (Италия, Франция, Германия) частота «В» аллели в популяциях коров в результате длительной селекции будет выше. Такое предположение подтверждено экспериментально (Jann et al., 2004).

Далее была поставлена задача определить, имеется ли отклонение частот аллелей гена каппа-казеина от теоретически ожидаемых частот согласно закона Харди-Вайнберга. Для этого использовали критерий х2 по Пирсону. Чтобы рассчитать этот параметр необходимо знать наблюдаемые и ожидаемые частоты встречаемости особей с данными генотипами - «АА», «АВ» и «ВВ» (таблица 4).

Расчет критерия х2 показал, что его значение для айрширского скота составило 3,24, а для голштинского - 0,27. В данном случае число степеней свободы равно числу генотипов минус число аллелей, т.е. 3-2=1. Если критерий х2 превышает значение 3,84, то нулевая гипотеза о равновесии популяции отвергается.

Наши данные указывают на возможность принятия нулевой гипотезы, т.е. на уровне 95% вероятности можно утверждать, что и голштинская и айрширская популяции находятся в состоянии равновесия. Недостаток гомозигот по аллели «В» в эксперименте не нарушает это равновесие в силу низкой частоты этой аллели. Например, в айрширской породе гомозигот «ВВ» не выявлено вовсе.

Таблица4.Наблюдаемое в эксперименте и теоретически ожидаемое число животных с генотипами «АА»,«АВ» и «ВВ» по гену кап па-казеин а

Порода число голов всего число голов генотипаАА число голов генотипа АВ число голов генотипа ВВ

Айрширская (ОАО ПЗ «Но юл адо же кий») 85 набл.57 ожид.60 набл.28 ожид.23 набл.О ожид.2

Голштинская (5 племенных заводо в) 305 набл.237 ожид.236 набл.65 ожид.64 набл.З ожид.4

Низюе содержание гомозигот «ВВ» отметается многими авторами для рада пород: голштинская, симментальская, швицкая, сычевская, холмогорская (Калашникова с со авт., 2007). Например, Михайлова с соавторами выявили всего одну гомозиготу «ВВ» на Витебсмэм племпред приятии, ачастота аллели «В» среди всех исследованных животных составило всего 0,12 (Михайлова с со авт., 2007). Эти данные точно совпали с нашими данными по частоте аллели «В» у голштинских животных. Наш вывод о генетическом равновесии по частотам ачлелей гена каппа-казеина соответствует заключению других авторов, изучавших этот вопросу черно-пестрой породы(Грашин,2011).

Следующий этап работы был изучить вопрос о возможной связи генотипов по гену каппа-казеина с продуктивными качествами животных. Вначале была сделана попытка найти связь между продуктивными качествами дочерей быюв-производителей и вариантами гена каппа-казеина быюв(таблица5).

Данные по племенной ценности быков позволили сгруппировать улучшателей и ухудшателей по удою, процентному содержанию жира в молоке в зависимости от генотипа по гену каппа-казеина и представить данные в графическом формате (рисунок 7). Видно, что улучшатели по удою ассоциируются с генотипом «А В», самое большое число быков нейтральных по племенной ценности обнаруживаются в генотипе «АА».

Таблица 5. Племенные качества и генотип по гену каппа-казеина быков-

производителей

№ п/п кличка № быка продуктивность дочерей +/- к сверстницам плем. категория генотип

п удой кг % жира жир кг % белка N Удой кг % жира жир кг % белка

1 Гусар 1226 128 6025 3,99 240 3,28 1558 + 179 -0,02 +6 -0,01 А2 AB

2 Амур 24 60 6735 3,71 250 3,07 1120 -438 +0,01 -15 +0,01 Нейтр. АА

3 Монарх 140 64 7499 3,72 279 3,05 1697 +206 -0,01 +7 -0,06 А2 АА

4 Чаплин 184 106 7781 3,63 283 3,14 1652 -260 +0,04 -6 +0,01 Нейтр. АА

5 Зодиак 638 55 7716 3,56 275 3,05 747 +369 -0,05 +9 -0,03 Al АА

6 Марко 969 105 8341 3,75 313 3,12 2168 +14 +0,02 +2 0 Нейтр. AB

7 Одиссей 974 110 8289 3,75 311 3,16 1788 -223 +0,02 -7 +0,05 Нейтр. AB

8 Титул 1087 247 8540 3,74 319 3,09 3048 +59 -0,03 -1 -0,03 Нейтр. ВВ

9 Ноготок 2818 74 6954 3,66 255 3,10 2011 -446 -0,02 -17 -0,01 Нейтр. AB

10 Орлан 3376 56 7551 3,72 281 3,15 1207 +257 +0,06 + 14 +0,01 А2БЗ AB

11 Оникс 5417 98 7967 3,73 297 3,15 1490 + 100 +0,06 +8 +0,02 АЗБЗ AB

12 Титаник 7571 223 7791 3,64 284 3,13 4122 -82 -0,01 -3 +0,01 Нейтр. AB

13 Вектор 1030 70 5923 3,94 233 3,23 805 +369 -0,08 + 10 -0,03 Al АА

14 Жасмин 17 116 7824 3,68 288 3,11 1920 +35 +0,01 +2 0 Нейтр. АА

15 Лихой 55 71 8334 3,68 307 3,13 1113 -87 +0,01 -2 +0,02 Нейтр. АА

16 Ким 208 73 8413 3,74 315 3,08 1329 -60 +0,04 -2 -0,01 Нейтр. АА

17 Истом 423 74 7622 3,67 280 3,13 1486 -236 -0,02 -10 0 Нейтр. АА

18 Алтай 511 124 7675 3,64 279 3,10 1929 +96 -0,01 -2 -0,03 A3 АА

19 Плутон 619 134 7466 3,70 276 3,12 2333 -59 -0,02 -4 -0,01 Нейтр. АА

20 Добрый 716 94 6732 3,81 256 3,11 1544 -252 +0,04 -7 -0,01 Нейтр. АА

21 Ниагар 869 60 7193 3,82 275 3,16 1237 -62 +0,12 +7 +0,03 Б2 AB

22 Майор 4462 86 8222 3,62 298 3,16 1373 +501 -0,02 + 16 +0,01 Al AB

23 Бисер 4544 127 7874 3,67 289 3,15 1453 +256 -0,06 +5 0 Al AB

26 Опал 5376 50 7513 3,75 280 3,13 955 + 185 +0,01 +8 +0,01 А2 AB

27 Форд 7386 74 8242 3,69 304 3,12 1745 -349 -0,03 -16 -0,03 Нейтр. АА

28 Шуберт 98 58 7182 3,69 265 3,06 1383 -275 +0,01 -9 -0,02 Нейтр. АА

29 Герман 0381 200 7904 3,69 292 3,09 2710 -30 -0,02 -2 +0,02 Нейтр. АА

30 Делегат 475 69 8054 3,75 302 2,99 1176 -199 +0,03 -5 -0,03 Нейтр. АА

31 Престиж 80 7456 3,82 285 3,07 1320 179 +0,03 -4 0 Нейтр. АА

0731

32 Валет 805 56 7483 3,69 276 3,15 1162 -407 0 -15 +0,03 Нейтр. АА

33 Харрисон 0984 303 8396 3,64 306 3,00 4306 +308 -0,04 +8 -0,04 Нейтр. АА

34 Цимбал 2244 82 7908 3,56 282 2,97 2033 +78 -0,01 -4 -0,04 Ух. жира АА

35 Комфорт 2306 119 6974 3,6 251 3,01 2503 -210 -0,03 -10 0 Нейтр. АА

36 Султан 5241 143 8887 3,71 330 3,08 1763 -5 -0,01 -1 +0,01 I IcM'ip. АА

37 Момент 5747 189 8754 3,68 322 3,03 4434 +534 -0,06 + 15 -0,03 Al АА

3S Пик 1150 173 6197 4,02 249 3,2 2280 +92 -0,01 +3 0 A3 АВ

39 Воин 1839 57 5883 4,05 238 3,25 1190 -409 -0,03 -19 -0,01 Нейтр. АА

40 Вымпел 16 58 7825 3,64 285 2,98 1291 +143 +0,07 + 10 +0,02 A3 АА

41 Тюльпан 33 64 8131 3,58 291 3,03 1321 +305 -0,09 +4 -0,01 А2 АВ

42 Идеен 51 95 7409 3,55 263 3,04 2522 -244 -0,08 -15 -0,03 Нейтр. АА

43 Подарок 541 114 6771 3,59 243 3,04 1657 -145 -0,02 -7 +0,01 Нейтр. АА

44 Батлер 1316 83 7804 3,68 287 3,07 1927 -422 +0,05 -12 +0,04 Нейтр. АА

45 Адажио 1876 75 7127 3,65 260 3,02 1596 + 182 0 +7 +0,01 А2 АА

46 Ледорез 1884 141 7691 3,59 276 3,06 2458 +86 -0,05 -1 -0,02 Нейтр. АА

47 Договор 2080 142 7980 3,63 290 2,96 2532 -36 -0,01 -2 -0,03 Нейтр. АА

48 Лабиринт 4906 121 7757 3,57 277 3,01 2346 +398 -0,03 + 12 -0,05 Al АА

49 Джимми 6573 43 8470 3,76 319 3,03 996 +481 -0,01 + 18 -0,01 Al АА

50 Горизонт 6678 42 8013 3,70 297 3,10 1157 +187 +0,07 + 13 +0,04 АЗБЗ АВ

51 Бард 7054 79 8109 3,65 296 3,05 1603 + 104 -0,01 +3 0 A3 АВ

52 Чемпион 7220 188 7627 3,66 279 3,07 3017 + 15 0 0 +0,01 Нейтр. АА

53 Омар 154 82 5665 4,04 229 3.24 1243 -158 +0,01 -6 +0,06 Нейтр. АА

54 Омен 158 62 6150 3,98 245 3,17 896 +260 -0,04 +8 -0,02 Al АА

55 Легион 538 166 7452 3,71 276 3,04 2537 +216 +0,02 +9 -0,01 А2 ВВ

56 Мзпл 1541 65 7533 3,61 271 3,01 1378 -278 -0,02 -12 +0,03 Нейтр. АА

57 Мольер 5218 58 7686 3,62 278 3,00 863 +281 -0,01 +9 0 Al ВВ

58 Веер 8220 129 7380 3,62 267 3,01 2046 +8 0 0 +0,03 Нейтр. АА

59 Катер 9602 47 7981 3,63 290 3,05 1242 +38 -0,05 -2 -0,1 Нейтр. АВ

60 Китеж 9726 139 7664 3,66 280 3,12 3065 +68 +0,02 +4 +0,05 Нейтр. АВ

61 Кипрей 9730 140 7593 3,60 273 3,08 1931 +251 +0,03 +11 +0,03 Al АВ

□ АА BAB

Рисунок 7. Распределение быков улучшателей и ухудшателей по удою и процентному содержанию жира в молоке в зависимости от генотипа по

гену каппа-казеина

Данный график не позволяет оценить статистическую значимость связи генотипа и продуктивных признаков. Поэтому был проведен статистический анализ. Расчет достоверности разности средних производили по формуле и по t-тесту программы Excell 2007. В связи с тем, что число носителей генотипа «ВВ» недостаточно, они были объединены с особями-носителями генотипа АВ. Таким образом, учитывали связь аллели «В» (либо в гомозиготном, либо в гетерозиготноми состоянии) с продуктивными признаками.

Вначале была проведена работа на 50-ти головах племенного ядра ЗАО ПЗ «Рабитицы». Целью было выявить связь между генотипами гена каппа -казеина и продуктивными качествами коров - носителей генотипов «АА» и «АВ». Аналогичные расчеты были выполнены на оцененных по потомству быках. Данные по коровам и быкам суммированы.

Коровы в количестве 50 голов из ЗАО ПЗ «Рабитицы» с генотипом «АВ» превосходили коров с генотипом «АА» ( Млв = 11951, МАА= 10402). Разница была высокодостоверной по второму порогу достоверности (р<0,01), так как значение td, равное 2,72 превысило табличное значение в 2,70 при числе степеней свободы 50-2=48. Расчет t-теста с использованием пакета статистических программ Excel 2007 подтвердил этот вывод, хотя здесь точнее значение вероятности того, что две выборки взяты из генеральных совокупностей, имеющих одно и то же среднее значение количественного признака составило 0,014, что незначительно превышает вероятность «р» традиционного анализа. Содержание жира и белка в молоке коров статистически не связано с генотипами по гену каппа-казеина.

Выяснилось, что генотип быков-производителей связан с содержанием белка у их дочерей (3,120% > 3,075%). Преимущество имели генотипы, содержащие аллель «В» («АВ»+»ВВ»). Разность была достоверной по первому порогу (р<0,05) при использовании критерия достоверности, что соответствует выводу и по t-тесту (вероятность, что средние продуктивные показатели одинаковые в обеих выборках равна 0,026). Содержание жира и удой у дочерей не был связан с генотипом отца.

В то же время, имеется тенденция превышения удоя дочерей быков с генотипами, содцэжащими аллель «В» («АВ»+»ВВ») над продуктавностью дочерей быков генотипа «АА» при сравнении со сверстницами. Сравнение со сверстницами более адекватно отражает связь генотипа быков и их дочерей, так как позволяет компенсировать влияние других факторов на конечную продуктивность (стадо, сезон, кормление и тд.).

Таблицаб. Связь между продуктивными признаками и генотипами по гену капп а-казеин ау быков-производителей и крров(критерии и Ьтест)

генотип коров, п=50

продуктивные качества коров генотип АА генотип АВ+ВВ td t-тест

удой, М±ш 10402+330 11951±464 2,72* 0,014*

% жира, М±ш 3,75+0,016 3,78±0,039 0,75 0,516

% белка, М±т 3,06±0,015 3,07±0,032 0,29 0,960

генотип быков, п=61

продуктивные качества дочерей генотип АА генотип АВ+ВВ td t-тест

удой, М±ш 7727+123 7670±141 0,77 0,446

% жира, М±ш 3,70±0,020 3,71±0,025 0,31 0,660

% белка, М±т 3,08+0,012 3,12+0,014 2,64* 0,026*

продуктивные качества дочерей в сравнении со сверстницами генотип АА генотип АВ+ВВ

удой, М±ш -21 109

% жира, М±ш 0,0087 0,0048

% белка, М±т 0,0087 0,0043

Таким образом, наши исследования показали связь наличия аллели «В» в генотипе как быков-производителей, так и коров и повышенной продуктавности по удою. Такие выводы совпадают с данными некоторых авторов о связи аллели «В» (Павлова с соавт., 2011; Грашин, 2011) с продуктавными качествами. В наших исследованиях на примере племенных мэров ЗАО ПЗ «Рабишцы» показано, что коровы с аллелем «В» имеют более высокую молочную продуктивность по удою. Повышенный удой у дочерей быков-носителей аллели «В» можно объяснить, тем, что эта аллель передается потомкам по законам Менделя и дочери таких быков имеютповышенную частоту аллели «В».

4. ВЫВОДЫ

1. Оптимизирована методика выделения ДНК из периферической крови и спермы, разработаны оптимальные схемы постановки полимеразной цепной реакции на предмет выявления рецессивных генетических дефектов у крупного рогатого скота.

2. ПЦР-диагностика носительства мутации ВЬАБ у быков-производителей, содержащихся на племпредприятии «Невское» позволили выявить гетерозиготных носителей в трех линиях быков - Вис Айдиала, Рефлешн Соверинга и Монтвик Чифтейна. Быки линии Пабст Говернор были свободны от мутации.

3. Ремонтные бычки племенных заводов «Лесное», «Рабитицы», «Гражданский» и «Петровский» по данным П1ДР-тестирования в 2008 и 2009 годах были свободны от мутации ВЬАБ. В племзаводе «Ленинский путь» выявлен только один носитель - бык №522.

4. Выявлено 2 носителя мутации СУМ среди ремонтных бычков в племзаводе «Ленинский путь» и 1 носитель в племзаводе «Петровский» по данным тестирования в 2009 году.

5. У племенных коров установлен ряд носителей вредных рецессивных мутаций ВЬАБ и СУМ по данным тестирования в 2009 году. В частности, в племзаводе «Гражданский» обнаружено 2 носители мутации ВЬАБ и одна - мутации СУМ. В племзаводе «Лесное» выявлена высокая частота встречаемости вредных рецессивных мутаций: 8 носителей мутации СУМ и 2 носителя мутации ВЬАО. У 6 животных из 8 носителей мутации СУМ отцом был бык-производитель Момент 5747, который одновременно оказался гетерозиготным по мутации СУМ.

6. Установлено снижение частоты встречаемости гетерозиготного генотипа «АВ» гена каппа-казеина у быков черно-пестрой породы племпредприятия «Невское» с 67,3% в 1995 году до 6,7% в 2007 году. Параллельно идет нарастание частоты генотипа «АА».

7. Генотип «АВ» у коров 6-ти племенных хозяйств Ленинградской области встречается чаще, чем у быков плепредприятия «Невское» и его частота составляет почти 24%. Высокая частота гетерозигот «АВ» отмечается у айрширских животных ОАО ПЗ «Новоладожский» - почти 33%.

8. Несмотря на более низкую частоту встречаемости гомозиготных генотипов «ВВ» по гену каппа-казеина как в голштинской, так и в айрширской породе, в изученных популяциях равновесие частот аллелей по критерию %2 не нарушено.

9. Выявлена связь (р = 0,014) между гетерозиготным генотипом «АВ» по гену каппа-казеина и удоем коров на примере племзавода «Рабитицы».

10. Доказана статистически достоверное превышение отдельных продуктивных признаков дочерей, таких как содержание белка в молоке (р=0,026), разность в удое со сверстницами (р=0,040) с наличием в генотипе отца аллели «В» гена каппа-казеина.

5. ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ

Результаты прея ставленной к защите работы рекомендуется использовать при планировании селекционной работы с племенными животными Ленинградской области, прежде всего, в плане ограничения использования быков-носителей вредных рецессивных мутаций. Рекомендуется при подборе быюв для воспроизводства учитывать аллепьный состав гена каппа-казеина в генотипе этих быюв как дополнительный благоприятный фактор. Материалы диссертации могут бьггь использованы в учебном процессе для студентов сельскохозяйственного и ветеринарного профилей.

6. СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ РАБОТ

1. Косякова ГЛ., Уровень молочной продуктивности и показатели дестабилизации генома коров /' Косякова ГЛ., Яковлев А.Ф., Никифорова ЕР. // Сборник научных трудов ГНУ ВНИИГРЖ «Актуальные проблемы генетики и селекции сельскохозяйственных животных».- 2011 .-С- 117-121.

2. Никифорова ЕР., Мониторинг генетических дефектов и аллелей каппагказеина крупного рогатого скота / Никифорова Е.Г., ДементьеваН.В., ЯковлевА.Ф. //Достижениян^ки и техники АПК.- 2010.- №5,- С.- 65-67.

3. Дементьева Н.В., Генотипирование крупного рогатого сшта в целях выявления генетических дефектов и аллелей каппа-казеина / Дементьева Н.В., Никифорова ЕГ., Митрофанова ОБ., Терлецкий В.П., Яковлев А.Ф. // Материалы международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.М. Лебедева «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных.-9-11 июня 2009, часть 2.- 2009 .-С.-39-42.

4. ЯковлевА.Ф.,Генотипированиеплеменного молочного скота/ЯковлевА.Ф., Н.В. Дементьева,НикифороваЕГ. //Практика,.- 20Ю.-№3,- С.-42-45.

5. Яковлев А.Ф., Биотехнологические подходы к совершенствованию и сохранению генетических ресурсов сельскохозяйственных животных / Яковлев А.Ф., Никифорова ЕР. // Вопросы образования и науки: теоретические и методические аспекты.- Часть 2.-2012.-Тамбов-С.-161-162.

Подписано в печать 22.04.2013г. Формат 60x84 1/16 Бумага офсетная Тираж 100 экз. Заказ №68 Отпечатано на ризографе ГНУ СЗНИИ МЭСХ Россельхозакадемии 196625, Санкт-Петербург, Павловск, Фильтровское шоссе, 3

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Никифорова, Екатерина Геннадьевна, Санкт-Петербург

Государственное научное учреждение Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных Российской Академии сельскохозяйственных наук

На правах ру^писи

04201356857

НИКИФОРОВА ЕКАТЕРИНА ГЕННАДЬЕВНА

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ДЕФЕКТЫ И ПОЛИМОРФИЗМ ГЕНА КАППА-КАЗЕИНА У ПЛЕМЕННОГО МОЛОЧНОГО СКОТА

03.02.07 - генетика

ДИССЕРТАЦИЯ на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, Терлецкий В.П.

Санкт-Петербург -2013

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика основных продуктивных показателей молочного скота Ленинградской области

1.2. Обзор молекулярно-генетических маркеров, используемых в селекции 10

1.3. Преимущества полимеразной цепной реакции в сравнении

с другими методами анализа 16

1.4. История выявления вредных рецессивных мутаций у крупного рогатого скота 18

1.5. Использование полимеразной цепной реакции в выявлении

мутаций ВЬАР, СУМ и ОЦМ8 у крупного рогатого скот 26

1.6. Использование полимеразной цепной реакции в выявлении аллельных вариантов гена каппа-казеина 33

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

2.1. Выделение и определение качества ДНК из проб крови

36

2.2. Оптимизация процедуры полимеразной цепной реакции для выявления рецессивных мутаций и аллелей гена каппа-казеина

39

2.3. Проведение полимеразной цепной реакции для выявления рецессивных мутаций BLAD, СУМ и DUMPS

41

2.4. Проведение полимеразной цепной реакции для выявления генотипов по гену каппа-казеина

44

2.5. Анализ фрагментов ДНК в агарозном геле

44

2.6. Статистическая обработка данных 45

3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

3.1. Встречаемость мутации ВЬАБ и СУМ в различных хозяйствах Ленинградской области 47

3.2. Типы гена каппа-казеина и их частота встречаемости у коров Ленинградской области 70

3.3. Связь генотипов гена каппа-казеина и продуктивных качеств коров 79 ВЫВОДЫ 88 ПРЕДЛОЖЕНИЯ ПРОИЗВОДСТВУ 90 СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 91

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ, ТЕРМИНОВ И УСЛОВНЫХ

ОБОЗНАЧЕНИЙ

ДНК - дезоксирибонуклеиновая кислота

ПЦР - полимеразная цепная реакция

ПДРФ - полиморфизм длин рестрикционных фрагментов ДНК SflS - додецилсульфат натрия ЭДТА - этилендиаминтетраацетат SNP - однонуклеотидный полиморфизм

RAPD - полиморфизм ДНК, выявляемый случайными праймерами

BLAD - дефицит адгезивности лейкоцитов

CVM - комплексное уродство позвоночника

DUMPS - дефицит фермента уридинмонофосфатсинтетазы

л

X - критерий Пирсона соответствия наблюдаемой частоте встречаемости генотипа в популяции теоретически ожидаемой частоте

мМ, цМ - миллимолярная и микромолярная концентрация, соответственно

Праймер - олигонуклеотид, служащий затравкой в ПЦР

Олигонуклеотид - короткая последовательность дезоксинуклеотидов одноцепочечной ДНК

Полимеразная цепная реакция - молекулярно-генетический метод, позволяющий многократно амплифицировать изучаемый участок ДНК

Генотипирование - молекулярно-генетические методы, позволяющие выявит различия между индивидами на уровне генов или ДНК

Ферменты рестрикции - ферменты, расщепляющие ДНК в строго определенных участках, позволяющие выявить однонуклеотидные полиморфизмы в этих участках.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность работы. Летальные рецессивные мутации могут наносить большой экономический ущерб отрасли животноводства во многих странах мира, в том числе в России. В племенных хозяйствах Ленинградской области их распространение практически не изучено. Актуальность проведенных исследований определяется необходимостью выявить вредные рецессивные мутации в популяциях племенных животных Ленинградской области, особенно у быков-производителей с целью ограничения их распространения в процессе разведения. Своевременный мониторинг позволит снизить частоту встречаемости этих дефектов и, таким образом, повысить воспроизводительные качества племенных животных, повысить резистентность к бактериальным инфекциям. Генотипирование по гену каппа-казеина даст возможность определить структуру стад по типам этого гена и идентифицировать животных-носителей определенных аллелей. Связь аллелей гена каппа-казеина с удоями, содержанием жира и белка в молоке исследовали многие авторы, однако выводы из этих работ носят противоречивый характер. Поэтому изучить этот вопрос на примере высокопродуктивных племенных животных Ленинградской области является актуальной задачей для современного молочного скотоводства. Целью является преимущественное использование носителей благоприятных аллелей в селекционном процессе.

Цель и задачи исследования. Цель представленной работы заключается в выявлении распространенности вредных рецессивных мутаций и типов каппа-казеина в племенных стадах черно-пестрой голштинизированной и айрширской пород в Ленинградской области.

Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачи:

- модифицировать способ выделения геномной ДНК, пригодной для генотипирования методом ПЦР;

- оптимизировать процедуру проведения ПЦР на предмет выявления мутаций ВЬАЭ СУМ и БЦМ8, а также типов каппа-казеинов;

- провести генотипирование на предмет носительства вредных рецессивных мутаций и выявления аллельных вариантов гена каппа-казеина у животных 6-ти хозяйств Ленинградской области, а также быков племпредприятия ОАО «Невское» по племенной работе;

- обеспечить быстрый ответ специалистам хозяйств касательно результатов генотипирования;

- выявить связь между аллельными вариантами гена каппа-казеина и рядом продуктивных признаков у коров (удой, содержание жира и белка), а также у коров-дочерей быков в сравнении со сверстницами (удой, содержание жира и белка).

Объект исследования. Объектом исследования служили образцы ДНК, выделенные из крови либо спермы племенных животных из племпредприятия ОАО «Невское по племенной работе» или 6-ти племенных хозяйств Ленинградской области - ЗАО ПЗ «Рабитицы», ЗАО ПЗ «Петровский», ОАО ПЗ «Лесное», ЗАО ПЗ Ленинский путь», ЗАО ПЗ «Гражданиский», ОАО ПЗ «Новол адожский».

Методы исследования. Основным методом исследования была полимеразная цепная реакция со специфическими праймерами с последующим расщеплением продуктов амплификации ферментами рестрикции (ПЦР-ПДРФ). Результаты генотипирования обрабатывали общепринятым статистическим анализом по традиционному критерию достоверности и с использованием пакетного анализа программы MS Excel 2007 (t-тест, гетероскедастический анализ).

Основные положения, выносимые на защиту:

- оптимизация процедуры быстрого выделения ДНК и проведения ПНР;

- профили аллелей мутаций BLAD, CVM и DUMS у племенных животных;

- необходимость проведения генотипирования в современных условиях индустриального животноводства;

- анализируемые популяции молочного скота находятся в равновесии по частотам аллелей (равновесие по Харди-Вайнбергу);

- существует связь генотипов по гену каппа-казеина с продуктивными признаками у коров.

Научно-практическая значимость. Проведенный ПЦР-ПДРФ анализ на предмет выявления мутаций BLAD, СУМ и DUMS позволяет понять степень распространенности этих мутаций у племенных животных. Эти знания позволяют проводить эффективный контроль частоты встречаемости мутаций в процессе селекционной работы с целью недопущения фенотипического проявления этих мутаций, наносящих существенный экономический ущерб хозяйствам. Выявленная связь аллели «В» с молочной продуктивностью позволит проводить селекцию с учетом этого показателя.

Научная новизна. Оптимизированы методы выделения ДНК" и проведения полимеразной цепной реакции для выявления летальных рецессивных мутаций и аллелей гена каппа-казеина. Выяснена частота летальных рецессивных мутаций BLAD, СУМ, DUMPS среди быков -производителей и ремонтных бычков. С целью снижения частоты этих мутаций и распространения их в потомстве впервые проведен скрининг и выделены быкопроизводящие коровы - носители генетических дефектов. Определены частоты аллелей гена каппа-казеина среди племенных животных и состояние генетического равновесия в популяции молочного скота. Установлен повышенный удой у коров-носителей аллели «В» гена каппа-казеина и повышенное содержание белка в молоке дочерей быков-носителей аллели «В».

Достоверность научных результатов. Достоверность полученных результатов подтверждена общепринятым статистическим анализом по традиционному критерию достоверности и по пакетному анализу программы MS Excel 2007. Данные достоверны либо по первому (р<0,05), либо по второму порогу (р<0,01) достоверности.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены и обсуждены на международной научной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения М.М. Лебедева «Достижения в генетике, селекции и воспроизводстве сельскохозяйственных животных

(Санкт-Петербург, 2009), на Международной конференции «Вопросы образования и науки: теоретические и методические аспекты», 2012 г., Тамбов, на отчетных сессиях Ученого совета Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт генетики и разведения сельскохозяйственных животных 2007-2012 гг.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 научных статей

Структура и объем работы. Диссертационная работа включает главы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследований, результаты и обсуждение, выводы, предложения производству, список использованной литературы. Работа содержит 111 страниц машинописного текста, 18 таблиц, 7 рисунков. Библиография включает 169 наименований, в том числе 114 на иностранных языка.

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1.1. Характеристика основных продуктивных показателей молочного скота Ленинградской области

Ленинградская область занимает лидирующие позиции в Российской Федерации по молочной продуктивности черно-пестрого голштинизированного скота. Голштинская порода оказала большое влияние на черно-пестрый скот страны, в частности, в Ленинградской области. Интенсивное использование генофонда голштинской породы началось с 70-х годов прошлого века и продолжается по настоящее время. В результате в стране были созданы высокопродуктивные зональные и заводские типы: Ленинградский, Московский, Уральский и т.д. Ленинградский тип создан методом поглотительного скрещивания и индивидуального подбора быков-производителей голштинской породы к маточному поголовью черно-пестрого скота (Прохоренко, 2012).

Коровы Ленинградского типа за 2010 год имели продуктивность 9993 кг молока за лактацию. Наивысшая продуктивность была достигнута в следующих племзаводах области: «Рабитицы» (10775 кг, п=1330), «Гражданский» (9980 кг, п=1200) и «Гомонтово» (9485 кг, п=1200). В целом, по Ленинградской области средний годовой удой приблизился к 7000 кг молока за лактацию. Данный показатель превышает средний удой в племенных заводах в целом по России -6450 кг (Амерханов, 2012). Рекордистка среди коров Ленинградского типа стала корова «Пазуха» №284 из племзавода «Рабитицы», которая дала 19012 кг молока за 305 дней лактации (Прохоренко, 2012). Несмотря на высокие показатели молочной продуктивности коров в отдельных племзаводах Ленинградская область все еще отстает по этому показателю от передовых стран. В частности, средняя продуктивность молочного скота в Израиле достигла в 2011 г. 11775 кг (таблица 1).

Таблица 1. Продуктивные качества коров в трех странах-лидерах (Прохоренко, 2012)

Страна Средний удой Содержание жира % Содержание белка %

Израиль 11775 3,66 3,24

США 10607 3,66 3,07

Канада 9975 3,79 3,19

Несмотря на широкое использование импортных генетических ресурсов, существуют планы по наращиванию реализации отечественного племенного молодняка до 80% от потребности. Сейчас в России работают 1478 племенных хозяйств, число племенных коров достигает 965,5 тыс. (Амерханов, 2012). По молочному скоту в стране действует 378 племенных заводов и 944 племенных репродукторов (Дунин, 2010).

В племенных хозяйствах Ленинградской области в результате использования голштинских быков-производителей сложилась определенная генеалогическая структура, основанная на трех линиях голштинской породы -В. Айдиал 933122, Р. Соверинг 198998 и М. Чифтейн 95679. В линии Монтвик Чифтейн большое влияние на черно-пеструю породу в области оказал бык-производитель K.M. А. Белл 1667366, который был улучшателем по содержанию жира и белка. К сожалению, этот бык оказался носителем летальных рецессивных мутаций, которые были переданы потомкам и получили широкое распространение во многих странах мира (Барсукова, 2012).

1.2. Обзор молекулярно-генетических маркеров, используемых в селекции

Молекулярно-генетические маркеры получили в настоящее время широкое распространение не только при решении фундаментальных задач биологии, но и в повседневной практической работе в животноводстве (Глазко, 2010; Зубец, 2001; Долматова с соавт., 2004; Ковалюк с соавт., 2007; Исламова

с соавт., 2007; Сулимова, 2004). Различают монолокусные и мультилокусные ДНК-маркеры. К мультилокусным относятся методы ПЦР сл случайными праймерами (RAPD-PCR), полиморфизм амплифицированной ДНК (AFLP) и ДНК-фингерпринтинг.

В основе RAPD-PCR лежит использование коротких праймеров со случайной последовательностью нуклеотидов (Welsh & MacClelland, 1990; Williams et al., 1990; Vignal, 2002). Методом проб и ошибок подбираются такие праймеры, которые дают четко различимые амплификаты и которые позволяют выявить различия в числе и распределении фрагментов ДНК между животными (Харченко, 2006). Несмотря на широкое использование данного метода в генетическом анализе сельскохозяйственных животных (Сулимова, 2006; Долматова с соавт., 2000), он имеет серьезные недостатки - плохая воспроизводимость внутри и между лабораториями, чувствительность к малейшим изменениям условий проведения реакции. Это объясняется наличием в геноме участков, частично комплементарных случайным праймерам. В этом случае результат реакции определяется степенью комплементарности и в большом геноме животного имеется множество таких участков. Небольшие изменения, например, в температуре могут приводить к амплификации различных участков генома (Atienzar 2000; Dodgson 1997).

Полиморфизм амплифицированной ДНК (AFLP) проводится с целью генотипирования животных, когда нужно добиться высокой разрешающей способности метода. Метод позволяет одновременно получить несколько десятков фрагментов, некоторые из которых будут полиморфными, т.е. отличаться у разных животных. Впервые данный подход был разработан в 1995 году (Vos et.al., 1995). Считают, что AFLP является доминантным биаллельным маркером. Он является «золотым стандартом» при генотипировании ряда микроорганизмов (Teneva, 2009). Метод широко используется при выяснении родственности между породами, при построении генетических карт и идентификации генов у сельскохозяйственных животных, таких как крупный рогатый скот, овцы, свиньи ( De Marchi, 2006; Marsan, 2007; Luikart, 2003).

Некоторые авторы подвергают сомнению воспроизводимость метода и призывают исследователей уделять больше внимания этому вопросу (Crawford et al., 2012). AFLP основан на расщеплении геномной ДНК двумя ферментами рестрикции, лигировании двух адаптеров и постановки реакции амплификации с двумя праймерами, комплементарными адаптерам. Продукты амплификации анализируют в полиактиламидном геле либо в капиллярном электрофорезе. Метод можно частично автоматизировать, что увеличивает производительность и позволяет анализировать большое число образцов одновременно.

ДНК-фингерпринтинг также позволяет анализировать достаточно большое число локусов одновременно. Метод хорошо зарекомендовал себя при выяснении генетической структуры популяций животных и при решении ряда других вопросов (Потапов, 1997; Рысков 1988). ДНК-фингерпринтинг основан на расщеплении геномной ДНК ферментом рестрикции, электрофорезе фрагментов ДНК в агарозном геле, переносе разделенных фрагментов на нейлоновый фильтр и молекулярной гибридизации ДНК-ДНК. Используются как радиоактивные метки, так и другие способы мечения ДНК (дезоксигени, биотин, флуоресцентные красители).

Микросателлитная ДНК относится к однолокусным генетическим маркерам и представляет собой короткие (2-4 нуклеотида) повторяющиеся элементы, разбросанные по всему геному. Такие элементы в геномах впервые были выявлены в 1989 году Таутцем (Tautz, 1989). Размер каждого повторяющегося элемента обычно составляет до 200 пар оснований. Установлено, что повторы в три нулеотида длиной встречаются каждые 300500 тысяч пар оснований в геноме и их частота в 10 раз ниже, чем у динуклеотидных повторов типа GT (Глазко с соавт., 2001). Микросателлиты имеют ряд преимуществ в сравнении с другими маркерами. Прежде всего, они легко выявляются в полимеразной цепной реакции и идентифицируются. Весь процесс можно легко автоматизировать. Они покрывают практически весь геном. Это позволяет устанавливать их генетическое сцепление со многими

генами, формирующ