Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетические аспекты хронической фтористой интоксикации (флюороза)

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетические аспекты хронической фтористой интоксикации (флюороза)"

| российская академия медицинских наук

МЕДИКО-ГЕНЕТИЧЕСКИЙ НАУЧНЫЙ ЦЕНТР

- - 0 Д на правах рукописи

и УДК 616-056.7:577.1:575

2 9 ЯНП 1593

МАКАРОВ Сергей Вячеславович

ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ ХРОНИЧЕСКОЙ ФТОРИСТОЙ ИНТОКСИКАЦИИ (ФЛЮОРОЗА)

(03.00.15. - ГЕНЕТИКА)

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Москва 1998

Работа выполнена в лаборатории экологической генетики Медико-генетического научного центра РАМН

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор В.А. Спицын

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор B.C. Журков

кандидат биологических наук Л.П. Кузьмина

Ведущее научное учреждение:

Институт молекулярной генетики РАН

Защита диссертации состоится "2-1~" JliObJo 199^ г. в )/ на заседании Диссертационного Совета Д.001.16.01 при Мсдико-геметнческом научном центре РАМН (МГНЦ РАМН) (Москва, Москворечье, 1).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медико-генетического научного центра РАМН

Автореферат разослан " " 1998 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета,

доктор биологических наук, профессор Л.Ф.Курило

Научная новизна.

Впервые на репрезентативных выборках группы больных флюорозом II стадин, незаболевших рабочих с большим стажем работы на производстве алюминия и популяционного контроля тестировались на различия по 11 генетическим признакам (ABO, Cerumen, HP, TF, PI, GC, C3, GLOl, ESD, ACPI, PGM1). По большинству исследованных генетических систем дифференциация групп больных и "здоровых" была разнонаправленной. В результате проведенного исследования выявлена статистически значимая ассоциация флюороза II стадии с определенными аллелями локусов ACPI, PGM1 и фенотипом Cerumen. Полученные факты служат аргументом в пользу существования профессионального отбора по факторам, предрасполагающим к развитию флюороза.

Научно-практическая значимость работы.

Обнаруженные ассоциации полиморфных ферментов могут быть полезными в решении фундаментальной проблемы: выяснения механизма воздействия фтористых соединений на организм и сориентировать исследования по патогенезу флюороза.

Результаты могут послужить основой для разработки критериев профессионального отбора и практических рекомендаций для профилактики хронической фтористой интоксикации.

Положения, выносимые на защиту.

1. В исследованных группах определены фенотипические и генные частоты по 11 генетическим системам.

2. Выявлено разнонаправленное изменение частот аллелей (поляризация) в изученных выборках, где контрольная группа занимает срединное положение. Когорта больных флюорозом статистически значимо дифференцируется от сравниваемых групп по ряду аллелей локусов Cerumen, ACPI и PGM1.

3. Показана роль изученных локусов в предрасположенности к развитию флюороза. Наибольший риск заболеть флюорозом имеют индивиды с фенотипом Cerumen d (RR=6,57), носители аллелей PGM1*1- (RR=4,03) и ACPI* А.

4. Средний уровень содержания: 1) гаптоглобина фенотипов 2-1 и 2-2 повышается среди лиц контактировавших с фторидами, 2) ингибитора протеиназ понижен среди больных с фенотипом Р1 1-2, 3) трансферрина существенно ниже среди больных.

Апробация работы. Результаты исследований были представлены на межлабораторном семинаре Института клинической генетики МГНЦ РАМН (1998).

Публикации. По теме диссертации имеется 4 работы.

Структура и объем работы. Работа изложена на 138 листах машинописного текста; состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы из 170 источника. В тексте диссертации 22 рисунка и 28 таблиц.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ: В качестве объектов исследования были выбраны: 1) группа больных флюорозом в количестве 172 человек (средний стаж 23г. работы на Новокузнецком алюминиевом заводе (НКАЗ) г. Новокузнецк Кемеровской области;) 2) группа незаболевших флюорозом рабочих, имевших контакт с фторсоединениями на производстве - 54 человека (стаж более 11 лет, средний стаж -20 л, работники того же завода); 3) контрольная выборка адекватная по возрасту из 71 жителя г. Новокузнецка не соприкасавшихся с фтором в профессиональной деятельности.

В последствии из когорты больных была выделена группа из 64 наиболее тяжелых больных с диагнозом профессиональный флюороз II стадии, которая и участвовала в большинстве тестов сравнения.

Диагноз профессионального флюороза ставился специалистами по профпатологии в условиях стационара клиники Института комплексных проблем гигиены и профессиональных заболеваний СО РАМН.

Исследуемые контингенты были обследованы по комплексной медико-генетической программе: 1) проводилось визуальное тестирование наружного слухового канала с целью определения типа консистенции ушной серы, 2) генетическое анкетирование включало в себя данные о

s

половой принадлежности, стаже контакта с вредностью на производстве, возрасте, национальности, месте рождения обследуемого, 3) собранные образцы крови анализировались по 11 полиморфным системам с целью определения генетической структуры изученных групп.

Группы крови АВО определялись методами гемагглютинации с помощью антисывороток.

Фенотипы гаптоглобина (Hp), третьего компонента комплемента (СЗ), группоспецифического компонента (Gc) и эритроцитарного фермента глиоксалазы GL01 разделяли электрофоретически [Altland et al., 1980; Smithies 1959] Выявление типов гаптоглобина проводили при помощи бензидиновой реакции. При идентификации фенотипов СЗ и Gc использовали окраску раствором кумасси. Для определения фенотипов G LOI гель смачивали субстратной смесью (глутатион, метилглиоксаль), инкубировали 40 мин. при 37 °С, а затем гель обрабатывался р-ром иодина.

Фенотипы трансферрина (ТО определяли изоэлектрофокусированием (ИЭФ) в полиакриламидном геле (ПААГ) с иммобилизованным градиентом рН ( от рН 5,9 до рН 5,0 ) [Gorg et al., 1983J.

Ингибитор протеиназ (PI) исследовали ИЭФ в 0,5 мм агарозном геле [Frants et al., 1978].

Кислую эритроцитарную фосфатазу (ACPI) исследовали ИЭФ в 0,5 мм агарозном геле [Miller et al., 1987] с амфолином рН 4-6,5 (LKB). Ферментативную активность выявляли при помощи раствора 4-метилумбеллиферилфосфата облучая гель светом ультрафиолетового диапазона.

Субтипы фермента фосфоглкжомутазы-1 (PGM1) идентифицировались методом изоэлектрофокусирования в полиакриламидном геле с использованием амфолинов в градиенте рН 6,0 - 8,0 фирмы "Pharmacia -ЬКВ"{Швеция) (Goedde et al., 1981]. Активность PGM1 выявляли при помощи фармазановой реакции методом агаровой аппликации [Прокоп О., Гелер В.,1991].

Полиморфизм эстеразы D (ESD) выявляли методом неравновесного изоэлектрического фокусирования в полиакриламидном геле с

последующим окрашиванием в растворе метилумбеллиферил ацетата (1 мг/л).

Количественное содержание сывороточных белков - гаптоглобина, трансферрина и альфа-1-антитрипсина исследовалось посредством техники радиальной иммунодифузии с применением преципитирующих антисывороток фирмы "Behring".

Статистический анализ.

Частоты генов кодоминантных полиморфных систем рассчитывали стандартным методом [Животовский J1.A. 1991]. Частоты аллелей групп крови ABO вычислялись по методу Бернштейна [Фогель Ф., Мотульски А. 1990]. Для проверки соответствия наблюдаемых частот фенотипов распределению Харди-Вайнберга использовали критерий Хи-квадрат. Для тестирования гетерогенности выборок по частотам фенотипов и генов использовали критерий Хи-квадрат [Животовский Л.А., 1983]. Для оценки направления и степени ассоциаций изученных маркеров с устойчивостью или предрасположенностью к развитию заболевания расчитывался показатель относительного риска RR ;ю Вульфу, достоверность которого проверяли критерием Хи-квадрат. Статистическая обработка данных по количественной изменчивости сывороточных белков производилась с помощью программы STATGRAFICS v.3.0 .

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Как показал последующий сравнительный анализ, в когорте больных с симптоматикой характерной для хронической фтористой интоксикации основной девиантной подгруппой оказались наиболее тяжело больные с диагнозом - флюороз II (костной) стадии. Поэтому имеет определенный резон в дальнейшем акцентированное внимание уделить именно группе больных с диагнозом рентгенологически верифицированным специфической для профессиональной хронической фтористой интоксикации - остеопатией. Сравнительная характеристика дискретного генетического полиморфизма.

В таблицах 1, 2 и 3 представлена информация о распределении фенотипических частот в изученных выборках.

В таблицах 4 и 5 представлена информация о распределении генных частот в изученных выборках.

В таблице 6 представлены данные по количественному содержанию гаптоглобина, ингибитора протеиназ и трансферрина в крови в зависимости от фенотипической принадлежности в исследованных когортах.

Полученные величины с свидетельствуют, что эмпирическое распределение фенотипов по всем изученным локусам соответствует теоретически ожидаемому, согласно равновесию Харди-Вайнберга во всех группах.

Система группы крови ABO.

Проведенный анализ частот фенотипов в обследованных контингентах не выявил достоверных различий в их распределении. Контрольная выборка характеризовалась тенденцией к повышению частоты первой группы крови, а незаболевшие рабочие - второй. Группа больных флюорозом таких особенностей не имела. Изучение распределения групп крови на уровне сравнения генных частот свидетельствует об отсутствии различий между всеми выборками взятыми для анализа.

В ряду "Больные-Контроль-Рабочие" имеется некоторая динамика повышения частоты аллеля АВ0*А и снижения - АВ0*0 и АВО*В.

В целом же можно утверждать, что данное исследование не выявило статистически достоверных различий в распределении частот фенотипов и генов системы групп крови ABO.

Система типов консистенции ушной серы Cerumen.

В силу некоторых обстоятельств ограничивающих возможности сбора данных, в популяционном контроле тестирование по этому маркеру - типа консистенции ушной серы - не представилось возможным. Поэтому группой сравнения для когорты больных служили только незаболевшие работники.

Таблица 1. Распределение фенотипов сывроточных белков и групп крови в исследованных группах.

Локус Флюороз 11 Флюор. симптом. Популяц. Незабол. рабоч!

стадии контроль

Фенотип N0 N. Част. Ыс Част. ^ N. Част. Час

Всего 64 172 70 54

АВО 0 25 23.42 .39 65 63.76 .37 28 23.68 .40 17 18.19 .31

А 14 15.31 .21 46 47.04 .26 16 19.59 .22 17 16.02 .31

В 19 20.36 .29 47 48.04 .27 17 20.61 .24 16 15.03 .25

АВ 6 4.92 .09 14 13.16 .08 9 6.12 .12 4 4.75 .о;

X* = 0.55 0.12 3.43 0.32

Всего 61 165 71 54

НР 1-1 8 8.67 .131 22 24.44 .133 10 11.04 .141 8 8.56 .14

2-1 30 28.66 .492 83 78.12 .503 36 33.92 .507 27 25.88 .50

2-2 23 23.67 .377 60 62.44 .364 25 26.04 .352 19 19.56 .35

х2 = 0.13 0.64 0.27 0.10

сего 61 163 70 54

Тр 1-1 41 42.64 .672 99 102.88 .607 43 42.61 .592 32 31.72 .59

1-2 12 10.03 .197 37 32.57 .227 19 16.27 .268 15 14.70 .27

1-3 8 6.69 .131 23 19.86 .141 6 6.69 .085 3 3.87 .05

1-Э - - - 1 0.79 .006 1 0.15 .014 - . -

2-2 - .59 - 1 2.58 .006 0 1.55 - I 1.70 .01

2-3 - .79 - 2 3.14 .012 2 1.48 .028 2 0.90 .03

3-3 - .26 - - 0.13 - 1 0.35 .014 0 0.12 -

X" = 2.34 3.84 3.35 1.27

Всего 61 165 71 54

Р1 1-1 37 36.21 .607 102 100.85 .618 53 51.55 .746 37 36.67 .68

1-2 14 15.41 .230 43 46.13 .261 13 16.19 .183 12 13.19 .22

1-3 4 4.62 .066 8 7.82 .048 2 1.70 .028 3 2.47 .05

1-Б 2 1.54 .033 3 2.35 .018 - - - - — -

2-2 2 1.64 .033 7 .54 .042 3 1.27 .042 2 1.19 .03

2-3 2 0.98 .033 2 .15 .012 0 0.27 - 0 0.44 -

3-3 0 0.15 - .09 - 0 0.01 - 0 0.04 -

X" = 2.09 1.79 3.35 1.27

Всего 61 165 71 54

ее 1-1 29 25.58 .48 74 70.04 .45 41 39.56 .58 24 22.69 АА

1-2 21 27.84 .34 67 74.92 .41 24 26.87 .34 22 24.63 .41

2-2 11 7.58 .18 24 20.04 .14 6 4.56 .08 8 6.69 .1«

X" = 3.68 1.85 0.82 0.62

Всего 35 83 71 54

СЗ Б-Б 30 29.26 .857 72 70.51 .867 65 65.13 .915 46 46.30 .85:

Р-в 4 5.49 .114 9 11.98 .108 6 5.75 .085 8 7.41 .14:

р.р 1 0.26 .029 2 .51 .024 0 0.013 - 0 0.30 -

*2 = 2.56 5.14 * 0.14 0.34

Таблица 2. Распределение фенотипов эритроцитарных белков в исследованных группах.

Локус Больные Больные Популяциои. Незаболевшие

флюороз II ст. флюороз. контроль работники

симптом.

Фенотип No N, Част N Част. Nr Част N„ Nc Част

Всего 64 165 71 54

АСР1 А-А 11 10.97 .172 18 24.56 .105 4 5.36 .056 7 4.74 .130

А-В 29 28.57 .453 87 74.83 .506 31 26.09 .437 17 20.74 .315

А-С 2 2.48 .031 7 6.05 .041 0 2.20 - 1 1.78 .019

В-В 18 18.60 .281 51 56.98 .297 28 31.78 .394 24 22.69 .444

В-С 4 3.23 .063 9 9.21 .052 8 5.35 .113 5 3.89 .093

С-С 0 0.14 - 0 0.37 - 0 0.23 - 0 0.17 -

х2 - 0.44 4.89 5.44 1 2.65

Всего 64 172 71 154

PGM 1 + 1 + 15 18.06 .234 56 62.88 .326 33 31.78 .465 24 22.69 .44

1 + 1- 15 14.34 .234 33 30.84 .192 11 8.70 .155 6 4.54 .11

1+2+ 18 13.81 .281 44 36.88 .256 14 16.73 .197 11 16.20 .204

1+2- 5 3.72 .078 19 14.51 .110 4 6.02 .056 5 3.89 .093

1-1- 3 2.85 .047 3 3.78 .017 0 0.6 - 0 0.23 -

1-2+ 5 5.48 .078 10 9.04 .058 1 2.29 .019 1 1.62 .019

¡ 1-2- 1 1.48 .016 2 3.56 .012 1 0.82 - 0 0.39 -

2+2+ 1 2.64 .016 2 5.41 .012 4 2.20 .111 6 2.89 .111

2+2- 1 1.42 .016 3 4.26 .017 2 1.58 .019 1 1.39 .019

2-2- 0 0.19 - 0 0.84 - 1 0.29 - 0 0.17 -

х2 = 3.80 2.35 6.51 7.00

Всего 64 172 71 54

GLO 1-1 8 9.77 .125 22 24.19 .128 8 8.11 .113 9 7.04 .167

2-1 34 30.47 .531 85 80.63 .494 32 31.77 .451 21 24.92 .389

2-2 22 23.77 .344 65 67.19 .378 31 31.11 .437 24 22.04 .444

г2 = 0.86 .506 0.004 1.33

Всего 64 172 71 54

ESD I-I 47 45.56 .734 128 126.4 .744 59 58.60 .831 42 42.67 .778

1-2 13 16.03 .203 38 41.16 .221 11 11.81 .155 11 9.78 .204

1-5 1 0.84 .016 1 0.86 .029 - - - 1 0.89 .019

2-2 3 1.41 .047 5 3.35 .006 1 0.60 .014 0 0.56 -

*2 = 2.59 1.24 0.33 0.84

Таблица 3. Распределение фенотипов Cerumen в изученных группах.

енотип Флюороз II стадии Флюороз, симптом. Незаболевшие работники

набл.числ. | Част набл.числ | Частота набл. чнсл. | Частота

Всего: 24 54 53

W 12 .50 35 .64 46 .86

d 12 .50 19 .35 7 .13

Таблица 4. Распределение частот генов в исследованных группах.

Больные Больные флюор. Популяцион. Незаболевшие

флюороз Пет. симпт. контроль работники

Аллель Част. Ст.ош. Част. Ст.ош. Част. Ст.ош. Част. Ст.ош.

+/- +/- +/- +/-

АВО*0 .605 .042 .6089 .0263 .582 .042 .580 .047

АВ0*А .173 .034 .1938 .0213 .205 .034 .216 .039

А ВО* В .222 .034 .1974 .0215 .213 .034 .204 .038

НР*1 .377 .044 .3934 .6152 .395 .041 .398 .047

НР*2 .623 .044 .6406 .0268 .605 .041 .602 .047

TFM .836 .034 .7945 .0224 .775 .035 .774 .041

TF*2 .098 .027 .1258 .0184 .148 .030 .179 .037

TF*3 .066 .022 .0767 .0147 .070 .022 .047 .021

TF*D - - .0031 .0031 .007 .007 - -

PIM .771 .038 .7818 .0227 .852 .029 .824 .037

PI*2 .164 .034 .1788 .0211 .134 .029 .148 .034

PI*3 .049 .019 .0303 .0094 .014 .001 .028 .016

PI*S .016 .012 .0091 .0052 - - - -

GC*1 .648 .043 .6515 .0262 .747 .037 .648 .046

GC*2 .352 .043 .3485 .0262 .253 .037 .352 .046

C3»S .914 .034 .9217 .0209 .958 .017 .926 .025

C3*F .086 .034 .0783 .0209 .042 .017 .074 .025

GLOI* 1 .391 .043 .3750 .0261 .338 .034 .361 .046

GLOl'2 .609 .043 .6250 .0261 .662 .034 .639 .046

ESD M .843 .032 .8576 .0188 .909 .024 .889 .030

ESD *2 .148 .031 .1395 .0187 .091 .024 .102 .029

ESD *5 .008 .008 .0029 .0029 - - .001 .001

ACPl'A .414 .062 .3779 .0261 .275 .038 .296 .044

ACPl'B .539 .044 .5756 .0266 .669 .040 .648 .046

ACPl'C .047 .019 .0465 .0114 .056 .019 .056 .022

PGM1M + .531 .044 .6047 .6047 .669 .040 .648 .046

PGM1*1- .211 .036 .1483 .1483 .092 .024 .065 .024

PGM1*2+ .203 .036 .1773 .1773 .176 .032 .232 .041

PGM1*2- .055 .020 .0698 .0698 .063 .020 .055 .022

Таблица 5. Частота аллелей Cerumen в исследованных группах.

Аллель Больные флюороз 11 стадии Больные флюороз, симптом. Незаболевшие работники

CeruineiVW .290 .408 .640

Cerumen*d .710 .592 .360

Характер распределения частот фенотипов и генов обнаруживает резковыраженную динамику снижения частоты встречаемости влажного (W) типа консистенции ушной серы и соответствующего повышения частоты сухого типа с возрастанием тяжести заболевания профессиональным флюорозом. В когорте больных флюорозом II стадии частота гена Cerumen*d (0.71) повышена почти вдвое, в сравнении с частотой в когорте незаболевших высокостажированных рабочих (0.36). Тестирование на гетерогенность выборок по критерию Хи-квадрат показало, что эти различия оказались статистически высокозначимыми (х2 = 15.98 при а<0.001).

Таким образом можно предположить, что по системе Cerumen в отношении заболевания профессиональным флюорозом фенотип сухой консистенции ушной серы оказывается неблагоприятным фактором.

Гаптоглобин (HP).

В ряду "Больные-Контроль-Рабочие" наблюдается тенденция повышения частоты варианта гаптоглобина 1-1 (от 0.13 до 0.15), частоты соответствующего аллеля НР*1 (0.377 -> 0.4) и обратная динамика для варианта гаптоглобина 2-2 и соответствующего аллеля НР*2 : максимальное значение - среди больных профессиональным флюорозом (HP 2-2=0.377) и минимальное среди незаболевший рабочих (HP 2-2 = 0.352) при относительной индифферрентности частоты гетерозигот 2-1.

Средний уровень гаптоглобина между всеми изученными группами колеблется несущественно - от 2,35 до 2,72 г/л и не обнаруживает сколь либо выраженных различий между анализируемыми группами. В соответствии с многочисленными литературными данными [Parker and Beam, 1963], у носителей фенотипа HP 1-1 в сыворотке крови содержится в среднем белка гаптоглобина больше, чем у гетерозигот HP 2-1, концентрация которого, в свою очередь, выше, чем у гомозигот HP 2-2. Этой закономерности полностью соответствует тенденция в контрольной группе, в отличие от групп контактировавших с фторсодержащими соединениями, где наличествует, видимо компенсаторное, повышение содержания этого белка. Это особенно выражено в группе больных,

различие которой с группой рабочих в случае фенотипов НР 2-1

оказывается статистически значимой 05(=2.12 при а < 0.05).

Таблица 6. Количественное содержание белков в крови в зависимости от групповой и генотипической принадлежности.

Локус (генотип) Флюороз I Популяц. | Незаболевш. II стадии 1 контроль 1 работники

Гаптоглобин

НР число обслед. 55 65 54 .........2.35+0.16

Среднее кол-во (г/л) 2.73 + 0.16 2.38+0.11

дисперсия а2 1.43 0.90 1.45

Н-Р 1-1 число обслед. 7 9 8

Среднее кол-во (г/л) 3.16 + 0.54 2.66 ± 0.45 3.15 ±0.60

дисперсия о* 2.11 1.81 2.87

^Р 2-1 число обслед. 26 33 27

Среднее кол-во (г/л) 2.66 ± 0.22 2.48 ±0.17 2.05 ±0.19

дисперсия а2 1.31 0.95 0.95

НР 2-2 число обслед. 22 23 19

Среднее кол-во (г/л) 2.66 ± 0.25 2.14 ± 0.14 2.46 ± 0.27

дисперсия с2 1.44 0.48 1.35

Ингибитор протеиназ

Р1 число обслед. 22 60 49

Среднее кол-во (г/л) 2.10 ± 0.12 2.36 ±0.07 2.25 ±0.13

дисперсия а2 0.31 0.29 0.80

Р1 1-1 число обслед. 17 47 37

Среднее кол-во (г/л) 2.13 ±0.14 2.31 ±0.08 2.10 ±0.12

дисперсия а* 0.34 0.31 0.56

Р1 1-2 число обслед. 5 13 12

Среднее кол-во (г/л) 1.99 + 0.23 2.54 ±0.12 2.71 ±0.33

дисперсия а2 0.27 0.20 1.34

Трансферрин

ТР число обслед. 48 57 47

Среднее кол-во (г/л) 3.29 ±0.11 3.78 ±0.13 3.62 ±0.10

дисперсия а2 0.69 0.91 0.44

ТТ7 Ы число обслед. 39 38 32

Среднее кол-во (г/л) 3.30 ±0.14 3.68 ±0.16 3.56 + 0.10

дисперсия о2 0.73 1.00 0.53

ТР 1-2 число обслед. 9 19 15

Среднее кол-во (г/л) 3.24 ± 0.24 3.98 ±0.20 3.76 ± 0.23

дисперсия а* 0.55 0.73 0.78

Этот феномен согласуется с литературными данными [Opinya and Imalingat, 1991; Botha et al., 1993] предполагающими наличие

субклинической воспалительной реакции у больных скелетной формой флюороза и повышение содержания гаптоглобина, церулоплазмина и скорости оседания эритроцитов.

Трансферрин (ТО-

Анализ распределения частот фенотипов и генов этой системы в исследованных когортах показывает, что наибольшее разнообразие фенотипических вариантов трансферрина встречается в контрольной популяционной группе. В ряду "Больные-Контроль-Рабочие" отмечается относительное понижение частоты встречаемости варианта ТР 1-3 и повышение - варианта ТР 1-2, сходные тенденции имели и частоты соответствующих аллелей. Оппозитное распределение в частотах аллелей ТР*С1 и ТР*С2 в группах больных и "здоровых" может указывать на существование профессионального отбора по данному генетическому фактору. Однако статистической достоверности эти различия не достигли.

Средняя концентрация данного белка в крови больных оказалась достоверно снижена в сравнении с популяционным контролем (151=2.76 при а < 0.01) и группой рабочих (151=2.15 при а < 0.05). При учете фенотипической принадлежности, носители аллеля ТР*2 в группе больных имели статистически значимое снижение содержания трансферрина относительно популяционого контроля (15|=2.22 при а < 0.05). Указанный аллель оказывался неблагоприятным фактором в отношении предрасположения к многим патологиям и в данном случае аналогия при флюорозе нами не исключается.

Ингибитор протеиназ (Р1).

Наибольшая вариабельность изоморф ингибитора протеиназ Р1 присутствует в когорте больных флюорозом II стадии и обусловлен относительным повышением доли редких вариантов РП-Б и Р12-3. Доля более частых вариантов этого белка (РП-2 и Р11-3) и частоты генов 1'1*2 и Р1*3 также выше среди больных флюорозом, так что частота преобладающего во всех когортах аллеля Р1*1 оказывается относительно снижена. Стоит отметить, что, хотя вышеуказанные тенденции можно наблюдать в исследованных когортах, статистическое оценивание на их

гетерогенность не достигает существенных величин по критерию Хи-квадрат. Однако обращает на себя внимание тот факт, что именно в группе больных дважды встретились гетерозиготы по аномальному гену Р1*5, считающимся неблагприятным фактором в отношении многих заболеваний.

Средняя концентрация белка Р1 колеблется в весьма узких пределах и, подобно, трансферрину, средний уровень Р1 несколько выше в контроле -2,36 г/л и понижается среди контактирующих с фтором рабочих и больных флюорозом (до 2,10 г/л). Подобно динамике дисперсии в уровне НР, амплитуда колебаний концентрации Р1 оказыавется низкой в контроле и наиболее высокой среди рабочих с длительным стажем работы с профвредностыо. В выборке больных флюорозом отмечается существенное падение уровня Р1 при сравнении с популяционным контролем в случае фенотипической принадлежности к гетерозиготе Р1 1-2 (151=2.25 при а < 0.05). Тенденция снижения концентрации Р1 в раду 1-1 > 1-2 у больных флюорозом 11 стадии противоположна наблюдаемой в группе незаболевших рабочих и контроле.

Витамин-О-связывающий белок (ОС).

Анализ на гетерогенность исследованных выборок по критерию Хи-квадрат показал отсутствие дифференциации в распределении частот фенотипов и генов по системе ОС.

Система третьего компонента комплемента СЗ.

Характер распределения частот фенотипов и генов системы СЗ не позволяет утверждать о статистической существенности в гетерогенности исследованных когорт, хотя можно, как и в случае системы Р1 обратить внимание на то, что среди больных флюорозом выше частота редкого варианта СЗ БР и соответственно редкого аллеля СЗ*Р.

Фермент глиоксалаза ОШ1 (КФ:4.4.1.5).

Статистически достоверных различий в характере распределений частот фенотипов и генов системы ОЬ01 в изученных группах не выявлено.

Эстераза Б ЕББ (КФ:3.1.1.1.).

Сравнивая исследуемые выборки при тестировании на гетерогенность статистически достоверных различий обнаружить не удалось. Наибольшая

вариабельность фенотипов представлена, как и в случае систем PI и СЗ благодаря редким вариантам: ESD2-2 и ESD1-5, в когорте больных флюорозом. Не без оснований считается, что обладатели редких генетических вариантов имеют, как правило, повышенный риск в предрасположенности к различным (в том числе и профессиональным) заболеваниям.

Система кислой фосфатазы ACPI (КФ:3.1.3.2).

Приведенные в таблицах данные свидетельствуют, что во всех выборках преобладающими по встречаемости являются варианты кислой фосфатазы ACPI АВ и ACPI ВВ, а наиболее редкими - продукты экспрессии аллеля АСР1*С и соответственно частоты аллелей убывают в ряду АСР1*В > АСР1*А > АСР1*С, что характерно для многих популяций средней полосы. Несмотря на сходный профиль распределения частот аллелей в сравниваемых группах, динамика распределения фенотипов оказалась оппозитной, с поляризацией когорт больных флюорозом II стадии и незаболевших рабочих относительно контроля. Так в группе больных доминирующим оказался вариант ACPI АВ (45,3 %), тогда как среди незаболевших флюорозом высокостажированных рабочих - ACPI ВВ (44,4%), а популяционная выборка заняла срединное положение. Доля изоморф содержащих продукт экспрессии аллеля АСР1*А (АА, АВ, АС) оказалась максимальной среди больных. Тестирование на гетерогенность по методу Хи-квадрат показало, что более чем троекратное повышение частоты ACPI АА среди больных против популяционного контроля статистически достоверно (%2 =5.83 при а<0.05 d.f.= l). Соответвствующая дифференциация была установлена и по частотам аллелей. Сравнение по АСР1*А выявило статистически значимое 1,5-кратное повышение относительно популяционного контроля частоты этого аллеля при заболевании флюорозом II стадии. Примечательно, что повышение частоты АСР АА у больных было отмечено и при изучении другого профессионального заболевания - асбестоза [Смицын 1992J. Такое положение может характеризовать носительство аллеля кислой фосфатазы АСР1*А как предрасполагающий фактор к развитию тяжелой степени

заболевания при хронической фтористой интоксикации, а вариант ВВ наоборот, как вероятный фактор резистентности к профессиональному флюорозу.

Системы фосфоглюкомутазы PGM1 (КФ: 5.4.2.2).

Наименее вариабельной по спектру представленных фенотипов оказалась когорта незаболевших рабочих, так как в популяционном контроле присутствует дополнительно фенотип PGM1 2-2-, а среди больных флюорозом - PGM1 1-1-. При сохранении сходного профиля в распределении частот фенотипов, по данной полиморфной генетической системе, также как и в случае кислой фосфатазы, может быть прослежена отчетливая поляризация больных и незаболевших. При сравнении больных флюорозом II стадии и незаболевших высокостажированных рабочих по частоте фенотипа PGM1 2+2+ было выявлено статистически значимое повышение ее у последних (х2 = 4,79 при а<0,05 d.f.= l). Показательно также высокозначимое снижение частоты фенотипа PGM1 1+1+ среди больных при сравнении как против популяционного контроля (х2 — 7.79 при сс<0.01 d.f.= l), так и против когорты незаболевших рабочих ( у} = 5,84 при а<0,025 d.f.= l). Тестирование на гетерогенность по методу Хи-квадрат по частотам генов также выявило статистически значимую достоверность обособленности когорты больных. Частота аллеля PGM1*1- оказалась существенно выше среди страдающих флюорозом II стадии как по отношению к группе незаболевших рабочих (х2 =5,84 при а<0,025 d.f.= l), так и по отношению к популяционному контролю (х2 = 7,79 при а<0,01 d.f.= l). Таким образом можно предположить, что в системе фермента фосфоглюкомутазы PGM1 предрасполагающим фактором к развитию флюороза является наличие у пробанда аллеля PGM1M-, а варианты PGM1 1 + 1+ и PGM1 2+2+ играют превентивную роль.

Оценка степени ассоциации изученных генетических маркеров с профессиональным флюорозом.

Для выяснения степени ассоциаций проанализированных генетических систем с профессиональным флюорозом нами была рассчитана величина

так называемого относительного риска - RR (relative risk) для каждого изученного фенотипа.

Таблица 7. Данные сравнения групп по изученным маркерам

X2 попарного сравнения групп при d.f.= l

Аллель Больные(Пст)-Контроль Больные (Ист)- Рабочие

АСР1*А 5.83 * 3.53

АСР1*В 4.77 * 2.27

PG М1 * 1 - 7.61 ** 10.14 **

Cerumen*d Í 5.98 *** 1

Фенотип

ACPI АА 4.60 * !

PGM1 1 + 1 + 7.79 ** 5.84 ** |

PGM1 2+2+ 4.79 * 1

Уровень значимости: * - а < 0.05, ** - а <0.01, *** - а <0.001

Таблица 8. Величины показателя относительна риска RR развития флюороза

Фенотип(ы) Больные(Пст)-Контроль j Больные (Ист) - Рабочие |

RR х2 1 RR X2 I

ACPI АА 3.48 4.14'

ACPI АХ 2.21 4.40'

PGM1 1 + 1 + 0.35 7.57 '* 0.38 5.69 *

PGM1 1-ХХ 2.95 7.01" 4.03 8.41 **

Cerumen d - I 6.57 10.70 ** J

Уровень значимости: * - а <0.05, ** - а < 0.01, *** - а< 0.001 X - любой аллель данного локуса.

В данном разделе работы представлены материалы только по тем генетическим системам для которых были получены статистически значимые величины связи между заболеванием и генетическим фактором.

Результаты поиска вероятных связей этих систем с флюорозом представлены в таблицах 7 и 8.

Система типов ушной серы Cerumen.

Как видно из приведенных данных по этой генетической системе больные флюорозом II стадии имеют наибольшую статистически значимую (а< 0,001) девиацию от когорты незаболевших рабочих. Биологическое

значение диморфизма ушной серы изучено еще не достаточно полно для понимания роли Cerumen в функционировании организма. Так обнаружено, что во влажной по консистенции ушной сере содержится больше, чем в сухой, таких компонентов, как лизоцим и секреторные иммуноглобулины класса G и A [Petrakis et al., 197lj. Что, в свою очередь, может быть сопряжено с более эффективной системой противоинфекционной защиты и общим иммунным статусом организма. Но исходя только из этого, трудно будет объяснить механизм, по крайней мере, непосредственного влияния различных фенотипов Cerumen на чувствительность к хронической фтористой интоксикации. Известно, что действие фторидов (и особенно фторида алюминия) выражается, в частности, в нарушении внутриклеточного транспорта (дезорганизации везикулярного транспорта между аппаратом Гольджи и эндоплазмагическим ретикулумом)|Ма15ио et al., 1996; Жаворонков и др., 1997]. Можно предположить, так как Cerumen является продуктом секреции, что разные типы консистенции имеют свои особенности в реализации этого сложного процесса межорганельного взаимодействия, которые паралельно происходят в других клетках организма, синтезирующих и секретирующих иные субстанции существенные для метаболизма.

Система кислой фосфатазы ACPI.

Полученные данные об относительном риске развития флюороза II стадии свидетельствуют, что по локусу кислой фосфатазы ACPI положение когорты больных явно обособлено как от когорты незаболевших рабочих, так и от популяционного контроля. Предрасположенностью к заболеванию можно считать носительство гена АСР1*А, по частоте которого больные флюорозом статистически достоверно отличались от популяционного контроля. При сравнении когорты больных с незаболевшими работниками НКАЗ относительный риск развития флюороза составил 2,21 для обладателей фенотипов ACPI АХ (то есть несущих аллель АСР1*А: ACPI АА, ACPI АВ и ACPI АС). Показатель относительного риска RR при сравнении больных с популяционным контролем также оказался

статистически значимо (сх<0,05) высоким (3,48) для гомозиготного фенотипа ACPI АА.

Процессы фосфорилирования и дефосфорилирования имеют в организме исключительное по своей важности значение. Регуляция многих, если не большинства, биохимических реакций контролируется этими противоположно направленными процессами. Более того, зачастую активность самих ферментов катализирующих эти реакции зависит от состояния их фосфорилированности [Страйер Л.,1985|, которое в норме, в свою очередь, определяется физиологической потребностью в том или ином направлении реакции. Для кислой фосфатазы (ACPI) показано [Bottini et al., 1995] наличие двух различных функций в организме: 1) дефосфорилирование флавинмононуклеотида (одного из ключевых участников дыхательной цепи переноса электронов в митохондриях) и 2) фосфотирозил фосфатазы. Фториды могут усложнить работу кислой фосфатазы по выполнению первой функции: известно [Marquis, 1995], что фторид алюминия (A1F4-) образуя комплекс с протон-переносящими белками и повышая проницаемость мембран для Н+-ионов препятствуют их нормальному функционированию, что угнетает процессы в дыхательной цепи переноса электронов и снижая таким образом выработку высокоэргических молекул (АТФ) в клетке. Прежде, чем перейти к рассмотрению вопроса о возможности влияния фторидов на вторую функцию ACPI, следует заметить, что нормальный метаболизм и регуляция биохимических реакций в организме во многом зависит от баланса между активностью киназных и фосфатазных ферментов. Так, когда киназа находится в состоянии высокой активности, противонаправленная по биохимическому эффекту фосфатаза - практически не активна [Страйер Л.,1985]. Фторид алюминия является одним из наиболее эффективных ингибиторов протеин-фосфатаз, поэтому возможно его прямое действие на активность кислой фосфатазы [Olczak et al., 1997]. Кроме того, касаясь второй функции ACPI по дефосфорилированию фосфотирозил-протеинов: Thomas с соавт. установили [Thomas et al., 1996], что обработка фторидом в митогенной концентрации ведет к повышению стационарного уровня

тирозил фосфорилирования по крайней мере 13-ти специфических клеточных белков как в нормальных клетках из костной ткани человека, так и в клетках ТЕ85 остеосаркомы человека. Как показали дальнейшие исследования, эффект не был следствием прямой активации тирозил киназ эпидермальным фактором роста, который индуцирует лишь острофазную активацию и быстро обратимую в течении 1 часа. Такая же доза фторида не оказывала никакого действия на фибробласты кожи человека. В заключении авторы утверждают, что эти данные подтверждают гипотезу о том, что " остеогенное действие фторида, по крайней мере частично, опосредуется путем ингибирования активности одного или более фторид-чувствительных фосфотирозил-протеин фосфатаз в клетках кости человека".

В нашем же исследовании по поиску ассоциации генетических маркеров с хронической фтористой интоксикацией высокий, статистически достоверный показатель относительного риска RR по системе кислой фосфатазы оказался для фенотипа ACPI АА - наиболее частого в когорте больных. В своей работе Голден с соавт. [Golden and Sensabaugh, 1986] продемонстрировали, что данный вариант кислой фосфатазы проявляет меньшую активность относительно других изоформ данного локуса. Было бы естественно предположить, что в жестких условиях фтористой интоксикации, именно этот фенотип ACPI, в следствии минимального резерва активности, окажется критически слабым звеном в функционировании организма. В то же время фенотип ACPI ВВ, в силу повышенной активности, может оказаться защитным фактором против развития тяжелой формы профессионального флюороза.

Система фосфоглюкомутазы (PGM1).

Группа больных флюорозом II стадии статистически значимо отличается более высокой частотой аллеля фосфоглюкомутазы PGM1*1- и соответстенно фенотипами имеющими в своем составе этот аллель - PGM1 1-1-, PGM1 1+1-, PGM1 1-2+ и PGM1 1-2-. Относительный риск для данной совокупности фенотипов оказался статистистически существенным (при а<0,01) как при сравнении с когортой незаболевших высокостажированных рабочих, так и при сравнении с популяционным

контролем и составил 4,03 и 2,95 соответственно. Напротив, среди больных наблюдалась пониженная частота фенотипов PGM1 1 + 1+ и PGM1 2+2+ и в результате - низкие величины относительного риска RR как при сравнении с популяционным контролем - соответственно 0,35 (значимая при а<0,01) и 0,27 (незначима при а<0,05), так и при сравнении с контингентом незаболевших рабочих - соответственно - 0,38 (значимая при а<0,01) и 0,13 (незначима при а<0,05). Меньшая встречаемость варианта PGM1 2+2+, относительно PGM1 1+1+, вероятно, обусловила отсутствие статистической достоверности при сравнении с немногочисленной группой больных флюорозом II стадии. Однако косвенным подтверждением того, что фенотип PGM1 2+2+ может, наравне с PGM1 1+1+, быть отнесен к превентивным факторам в развитии флюороза, является результат расчета показателя RR при сравнении совокупной группы больных флюорозом различных стадий с группой незаболевших высокостажированных рабочих -0,09 (х2 = 8,05 при а<0,01).

Обнаруженные ассоциации изученных фенотипов PGM1 могут указывать на тонкие биохимические связи между влиянием фтора на организм и функциональным действием этой генетической системы. Косвенным свидетельством вовлеченности PGM1 в процессы остеопатии является обнаружение ассоциации ферментов этого локуса с оссификацией задней продольной связки (ligamentuin longitudinale posterius) позвоночника [Tanikawa et al., 3986] -часто встречающимся симптомом при профессиональном флюорозе. Работами Зырянова и др. [Зырянов и др., 19911 установлено повышение в ранние сроки ХФИ напряженности функционирования инсулярного аппарата и снижение резерва регуляции важнейшего метаболического показателя - уровня глюкозы в крови. Фермент фосфоглкжомутаза (PGM1) катализирует реакцию трансформации глюкозо-1-фосфата, полученный при диссоциации гликогена, в глкжозо-6-фосфат - исходный субстрат для гликолиза. Полученные данные о неравноценнности носителей отдельных вариантов PGM1 к действию вредного производственного фактора фтора находят свое подтверждение и в результатах по изучению относительной активности и термостабильности

различных аллелей фермента. Так было показано [Scacchi et al., 1983], что активность PGM1 ранжируется в следующем порядке: 1-<2-<1+<2+. Возможно, низкая активность аллеля 1- оказывается менее выгодной в случае контакта с рассматриваемым антропогенным фактором по сравнению с аллелем 2+, который определяет изоферменты максимальной активности. Действительно, как показано во многих работах [Marquis, 1995; Belli et al., 1995; Guha Chowdliury et al., 1997] фториды ингибируя гликолитический фермент - енолазу - и, как слабокислые соединения, создавая низкий рН среды, угнетают гликолитический процесс, тем самым усиливая ацидоз. Кроме того, установлено [Whitford and Anginar Mansson, 1995; Whitford, 1997; Zhao and Guenard, 1997], что тканевый ацидоз понижает клиренс фтора через почки и повышает его внутриклеточное содержание. Для противодействия этому эффекту фтористой интоксикации ферменты должны обладать большим запасом активности, а изоморф PGM1 1-1-очевидно этому критерию соответствует в наименьшей степени. Носительство же вариантов 1+ и 2+ может быть более благоприятным для индивидов, контактирующих с фтором, что позволяет считать систему PGM1 весьма перспективной в экогенетическом отношении.Таким образом, полученная информация по величинам относительного риска дает представление о возможном вкладе изученных локусов в развитии флюороза. Тестирование по этим системам может помочь врачам-профпатологам для решения проблем профессионального отбора.

ВЫВОДЫ.

1. В исследованных группах определены фенотипические и генные частоты по 11 системам (группы крови - ABO; типа ушной серы Cerumen; сывороточных белков - гаптоглобина (HP), трансферрина (TF), витамин-D-транспортирующего белка (GC), ингибитора протеиназ (PI), 3-го компонента комплемента (СЗ); эритроцитарных ферментов - кислой фосфатазы (ACPI), фосфоглюкомутазы (PGMI), глиоксалазы (GL01), эстеразы D (ESD)).

2 Выявлено разнонаправленное изменение частот аллелей по большинству систем (поляризация) в изученных выборках, где контрольная группа

занимает срединное положение. Когорта больных флюорозом статистически значимо дифференцируется от сравниваемых групп по ряду аллелей локусов Cerumen, ACPI и PGM1.

3. Определена роль каждого изученного локуса в развитии флюороза на основании величин относительного риска. В качестве группы повышенного риска в отношении развития флюороза определены субъекты носители следующих аллелей: Ceruinen*d, АСР1*А, PGM1*!-. Наибольший риск заболеть флюорозом имеют индивиды с фенотипом Cerumen d (RR=6,57), носители аллелей PGMI*1- (RR=4,03) и АСР1*А. Напротив, резистентными к воздействию являются носители следующих разновидностей: Cerumen W, ACPI ВВ, аллеля PGM1*1+.

4. Сопоставление количественных характеристик с фенотипической принадлежностью соответствующих белков показало, что средний уровень содержания: 1) гаптоглобина фенотипов 2-1 и 2-2 повышается среди лиц контактировавших с фторидами, 2) ингибитора протеиназ понижен среди больных с фенотипом PI 1-2, 3) трансферрина существенно ниже среди больных.

СПИСОК РАБОТ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Спицын В.А., Макаров C.B., Кравчук О.И., Данилов И.П. Определение роли генетических факторов в развитии флюороза на Новокузнецком алюминиевом заводе. Сб. "Проблемы общей и промышленной экологии" , Новокузнецк. 1996. с.20.

2. Макаров C.B., Спицын В.А., Кравчук О.И. Роль некоторых генетических факторов в развитии профессионального флюороза. Медицина труда и промышленная экология, (в печати)

3. Макаров, В.А. Спицын, О.И. Кравчук, JI.C. Бычковская. Соотношение дискретной генетической и непрерывно варьирующей физиологической изменчивости в концентрации ряда сывороточных белков при флюорозе. Генетика, (в печати)

4. Spitsyn V.A., Titenko N.V., Gokhman 1.1., Bogdanova V.l., Cliistov Yu.K., Makarov S.V. Serum Protein Polymorphisms in the Population of South Yemen. Human Heredity! 93f.41, p. 43-46.