Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая вариабельность чувствительности лимфоцитов человека к антипролиферативному действию глюкокортикоидных гормонов

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая вариабельность чувствительности лимфоцитов человека к антипролиферативному действию глюкокортикоидных гормонов"

' г, у;.

академия шшпижких наук ссср вскхжвпыя научный шщи- гвнет и'жския центр иготитут генетики человека

На правах 'рутописи УДК б7б: р77. 25: 61?. 017

КАЛАЗВШКОВА Елена Александровна

ГЙГГКЧЕСКАЯ ПАРЙАБЕЛЬВХТЬ ЧУНТГБИТЕЛЬНСЮТИ ЛШЮПИТОВ ЧЕЛОРЯЯА Я АНГИПРОЛРЯЕРАТИИК«У ДШГГШ)

глгкокортикоцгшых горшнов

оасю. 16- уонетнка 11.00. йб - ' аллерголога и иммуголопп

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание утиной степени кандидата медицинских наук

Иэс|спа - 1991

Работа выполнена в лаборатории юшунсгенвтики Института генетики человека Всесоюуаого научного иедико-генетического центра АМН СССР.

Научные руководители: доктор иедш(инских наук профессор Л. А. Цевницкий; кандидат шдицинских наук А. Л. Цухальский.

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук профессор Алекл'гев Леонид Петрович;

кандидат ««дицински* наук,, доцент Г дан Ыдлия Вольфовна.

Ведунья организация: №*>чно-исследовательский институт клинической и экспериментальной иммунологии № PtttCP Директор - член-к^рр. АМН СССР ппофелеор ШвСалин R H

Ващита диссертации состоится и__и________ 1902г.

в час.__jîhh. lia йаседании Специализированного ученого со

вета Д. CCI. 16. 01. внигц АМН СССР (11Б47Й, IfcCKBa, ул. Шскво рвчьэ, д. 1).

С диссертацией можно ознакомиться в йиолш.гзкв Цэнтра. Автореферат разослан " " ....... _ . 1091 г.

Уиеный секретарь Специалиьи^ьанного ученого повета доктор медицинских наук

А Ф. Куршы.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАШГЫ

Актуальность теьгы. В настоя^е время вопрос о мехадизтя индивидуальной чувствительности больных к терапии глюкокорти-коиднши гормонами является залньм направлением исследований современной иммунофармакологии. Лечение горыональпыш препаратам! в клинике распространено очень зироко. Эффект от их прн-цзиення чрезвьпайно вариабелен: от высокой чувствительности до полкой резистентности Термин горюнорезистентяости или гор:гэ-ночувствнтельнссти относится в основном к з^кту от лечения гормонами болезней с аутотадганой патологией, в трансплантологии иди онкологии. В тех случаям, тогда в ходе лечения г"псо-корткко идами (ГК) быстро проявляется их противовоспалительный и шлзунодепресс'гзнкй з№га со значительна уьйньизннеи сня1-тоыов основного заболевании, говорят о горжночувствителькости. При отсутствии клинического эффекта от приеиа большое доз препаратов или длительного лечения гормонами, и часто неудачными попытками отменить поддерживающие дозы ГК, говорят о гор-монорезистентности (Данидяк, 1975; Чучаяки с созвт., 1934). Зяать заранее яли' хотя бы предполагать, какой будет чувствительность больного к 'этим препаратам, озяа'галс бы избегать кногочислешгах' нобочпьпе сф*-еетоз от приема ГК па оргаакзм, а такзэ сйздрома'оттш горвднов. Режиме этой весь;® актуальной, ' ао-чрезвычайно. сложной задачи, зависит от понимания тонких мехая5!змов шггуиодэирес-сизкого действия ГК. Хотя ГК азаи-1яэ действуют со зсеьи'сютгьгш сргадагзиа, (ЗаЛэг, Коизсэаи, 1979), глазиьи' з тэроппл аутояидунных болезней является т противовоспалительное и 2с*луяодепрессивно<э действие (Гаио 1, 1979; Насонова, Слгздкн, 1835). 3 свои очередь, подаздяюЕэе действие на игг^уиннй ответ зо многом определяется их способностью угнетать процессы пролиферации лим^оидкых меток.

В то яз вреия в современной научной литературе практически отсутствует ясслздозалия, лссвяпзняю зэучз:ппа гзяетзтесяой вариабельности чувствительности ляггфокдггых клеток по отяозэн>по к иичуношдулярук59«у действию гггкокоргяиояднкс гор?зоков, хота гдгаго'кслп:!;:^ крсезиенэ дедяъз заставлять иродиолагатл наличие такпй гетерогенности.

Цель и задачи исследования. '¿альт исследования явилось изучение механизмов индивидуальной чувствительности лиыфоидньа

клеток крови к антипроллфератианоцу действии ГК у здоровых ли: к Сольных аутоиммунной патологией, a Taicse модулирующего влшг иия стероидов на экспрессию генов, определяющих продукцию ин терлейкина-2 (ИЛ-2).

В задачи работы входило:

1) разработка метода оценки индивидуальной чувствительное ти здоровых доноров к антипролиферативноиу дэйствк дексаиетаэона (Dm);

2) изучение эффективности связывания ГК специфическими ци топлазмзтичвекиыи рецепторами в зависимости от припадлекност донора к той или иной грунпо чувствительности;

3) изучение распределения частот встречаемости антигано HLA среди доноров, относящихся к различный группа« чувства тельности;

4) определение уровня продукции ШЬ2 лимфоците, т с разны типом чувствительности к Дм;

Б) исследование изменения нрдзпеции Ий-2 при воздействи широкого диапазона доз Да;

5) изучение распределения типов чувствительности сред больных ревматоидным артритом и больных с нефротичзеккм сиид рошм;

7) оценка влияния горьяэнотерапш на измзнение "увствктель кости лимфоцитов больных с ревматоидный артритом и нефротичас гаш синдромом к антипролифератшшому действию ГК;

8) изучение связи игхду типом чувствительности и результа тами гормонотерапии в указанных группах Сольных.

Научная новизна и практическая значимость. Разработан иа ■год оценки in vitro чувствительности лиьафоидкых щшток к ое типролиферативному действию глшокортикоидных горыэнов, позве лаиций разделить популяцию здоровых лиц на группы с раз не чувствительность!}. Показало, что такое разделение не являете случайным, так как огтозитные по чувствительности группы ри< личаются по ряду параметров: эффектирность рецепции ГК, интвг сивность продукции ИЛ-2, наличие разных ассоциаций с антигене ми HLA. В ходе работы впервые установлено наличие aacoiriaip резистентности доноров с антигенами HLA DR2, В7, В12, а чувс твительности - с антигеном HLA-B18. Впервыа обнаружен феноме стимуляции продушен ИЛ-2 низкими дозами ГК . Пои исследован! Сольных аутоиммунными заболявачнчии показ am, что чувствител]

ность Лин} цитов Сольных ревматоидным артритом к ГК сущаствен-но ниже, чем у здоровых лиц.

Ассоциации групп чувствительности с HLA-антигенами , а также различия между группами па генетически детерминированным параштрам, указывают на генетическую природу вариабельности чувствительности лимфоцитов человека к антипролиферативнону действии глюкокортикоидов. ГЬлученнш даннда могут быть использованы в иммунофармакологических и клинико-иммунологических исследованиях.

Изложения, выносимые на защиту.

1. Штод разделения здоровых доноров на группы чувствительности к антипролттферативному действию глюкокортикоидных гормонов in vitro.

2. Оппозитные по чувствительности группы различаются шЖ-ду собой по ряду генетически детеминированных иммунологических и физиологических параметров.

3. Наличие ассоциаций меаду типами чувствительности и антигенами HLA как I, так и II классов.

4. Феномен стимуляции продукции интерлейкина-2 низкими дозами глпсокортикоидов.

Б. Более высокая резистентность лии}оцитов к антипролифе-ративному действию глюкокортикоидов у больных ревматоидным ар-гритом, чем в популяции здоровых доноров; возможность снижения этой резистентности в процессе гормонотерапии.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит иэ »ведения, обзора литературы (глава 1), описания материала и «тодов исследовании (глава 2), экспериментальных данных и об-:уждения (глава 3), заключения, выводов и списка литературы, 'абота излояена на страницах машинописного текста, содержит 11 рисунков и 10 таблиц. Список литературы включает >аботы, из них - отечественных и - зарубежных авторов.

Апробация работы, Штериады диссертации представлены на аонференциях молодых ученых Института иедицинской генетики АМН ¡ССР (Шсква, 1986г., 1989г.), IV Всесоюзной конференции по •енетике соматических клеток (Звенигород, 1989г.). Всесоюзном :импозиуые " Проблемы изучения наследственности человека на ровне белковых продуктов генной экспрессии" (Иэсква, 1989г.), Всесоюзном съезде иммунологов (Москва, 1989г.), симпозиуме .

1йэждународнай ассоциации биологической стандартизации (Аннеси Франция, 1691г.). Официальная апрбация работы состоялась н семинаре Института генетики человека ВШГЦ Alfil СССР 16 октяОр 1891г.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали лм4юцити периферической крови адо ровшс доноров и больных ревматоидным артритом (РА) и с нефра тическим синдромом (Ш). Лщфэцкты выделяли иа венозной гепа риниэированной крови (25 ЕД гепарина на 1 мл крови) путем гра диентного центрифугировании в смеси фиколла и верографин (Boyum, 1968).

Реакции бласттрансформации люфоцтов проводили в ере; RPMI 1640 с ЮХ лошадиной сывороткой в пластиковых Зб-луночкь планшетах с пошщьп стимуляшш фитогемаггшоти, .ном (ФГА) концентрации 5 мкг/ыл. Для тормаианил пролиферативного отвез использовала дексаштазон (Дхг) в б различных концентрациях диапазоне доз от 10 U до 2х10е11 В контрольные лунки даксамЕ тагов не добавляли (они содержали культуральную среду с SU или без него). Клетки инкубировали в тбчзшф 72 ч при 37*С i влажной атмосфере, содержащей 61 СО;. За 4 ч до окончат культивирования вносили 3Н-тимидин в дозе 40 кЕк н~ лунку. Пос да остановки культивирования клетки переносили на фильтры поизщьо автоматического cGopnjt-ca клеток. Радиоактивность фил тров оценивали в жидкостном сциктилляцконком счетчике . Инте! сценость пролиферации выражали в импульсах в 1 мин (за вгчат( фона), и интенсивность антипролиферативного действия - в bhj срединной активной дозы (КДБО). Какого донора повторно обе« довали от 2 до Б раз. Всего проведено 100 обследований 41 д< вора.

Определение HLA-антигенов проводили с помоядьи сталдартш мккролимфоцитотоксичэского теста (Terasaki, Maclelland, 106-s модификации ШциональЕого института здоровья (США) , испох вуя специфические HLA-антисыворотки к 2В антигенам I класса 8 антигенам II класса. В-лимфоциты для определения HLA-"R ai титанов (II класс) получали с помощью удаления Е-роаеткиоОр. вувщих клеток из общего пула лимфоцитов .

Излучение ИЛ-2 в супврнатангах культур 1ЛТй проводили ыэтоду Bonnard с соавт, (1980). Сугпенаиы М1Ш чаловока в ко:

- б -

центрации 1Г,{ кл/ыл в объвш 1,5 ил культуральнсй среды пошщз-ли в лунки 24-луночной плоскодонной плашки, добавляли Кон Л (конечная концентрация - 20 ют/ил) и инкубировали 3,6 часа при 37'С во влажной атмосфере, содердащэй 57. C0t. Затем панель центрифугировали при 400s 10 мин, надосадок удаляли, а в лунки валивали сведую среду с и инкубировали при тех же услозиях. Шсле этого надосадок собирали и хранили при температуре -20*С. Для оценки содержания ИЛ-2 в супернатантах использовали ЯЛ-2-зависимуи мшмнув линии цитотоксических Т-лиифоцито» (CTLL-2). Клетки поддерживали в пластиковых флаконах в среде с с добавлением 25Z- супернатанта клеток селезенки (КС) мыигай DBA/2, стимулированных митогеном в гачестве источника ИЛ-2. Пересевали линию через 3 суток; периодически часть клеток замораживали и хранили в яидком азоте.

Количество ИЛ-2 в отобранных надссадках определяли по их способности поддерживать рост CTLL. Супернатаяты в разведениях от 1:2 до 1:16 (1:32 в некоторых случаях) в культуралыюй с роде в объеме 100 мкл помещали в лунки 96-луночной плоскодонной панели (каждый образец - в 3 лунки), содержащие 100 нкл суспензии CTLL (4 тыс.клеток на лунку). В качестве стандарта использовали рекомбинакткьй ИЛ-2 (Amersham, Великобритания) я ЯЛ-2-содорлаитЛ мышиный супернагант КС DBA/2. После 20-часовой шгкубации оценивали пролифэративнуп активность клеток по вклю-чэнлю3Н-тимидика. Тнтровочпые кривые исследуемых и стандартных образцов анализировали с пожщью метода пробитая. Содержанке ШЬ2 в супернатантах выра-тали в ьйгцдународных единицах (lffl).

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Разработка метода определения типов чувствительности ДЕмфоцитсв к антипродифератквному действия глгкокортккоядов in vitro.

Известно, что степень подавления пролиферация лимфоцитов глвкокортикоидами различных ладей различна (Valker St. al., 1037). Проблема состоит в том, чтобы достаточно точно установить тип чувствительности конкретного донора, исключив, по возможности, влкянкэ средавых факторов.

Для оценки степени угнетения пролиферзтивного ответа стимулированных лимфоцитов в присутствии Дм, необходимо использовать серию доз горчона, что позволяет построить титровочнув

кривую и вычислить величину ЕДБО (дозу, обеспечивающую БО-процентное подавление пролиферации в данной опыте).

При повторных обследованиях одних и тех же доноров вьсотс пролиферативного ответа в условиях использования постоянно! дозы <ЕГА существенно колеблется. Уровень подавления пролиферации дексамэтазоном также супрственно изменяется от опыта > опыгу . Тем не менее сопоставление данных о высоте пролиферативного ответа с данными об интенсивности подавления пролиферации даксаметаэоном в том яе опыте позволило обнаружить наличие мзжду этими показателями прямой положительной корреляцш (г - 0,61 при df - 98; Р < 0,01). На рис. 1 показана свив] между чувствительностью лимфоцитов периферической крове к ан-типролифератнвноцу действию Дм (Y) и высотой ответа на STA (К

з, о

2,0

1,0

О. о

- i ,0

Рис. 1 Оценка связи между чувствительностью лимфоцитов антипролифаративвому действию дексаштанона и внсото ответа на STA (теоретическая линия регрессии). № оси абсцисс - натуральный логарифм высоты пролиферативнэг ответа в импульсах в 1 мин после вычитана фона (спонтанной пролиферации без «ГА); по.оси ординат - показатель антипролиферативнпго действия гор иона - логарифм срединной активной концентра ции дексаметааона (ЕД50).

мо

оха

-1.10

Ряс. 2 йзполъеорание лниии рэгрестин для распределения доноров но типам чувствительности к антипролифвратизпоиу дейс-тлют дексслгэтазона, по оси абсцисс - . цифры - ноьаэра доноров. По осп ординат - величина д(¥-У') - разность *^злду зкеперга^ентальнш и (гпдаэглм значениям величины ЕД50.

Е1 7 а оЬс и □ ср 1, а т * 113 ,1: 1 1 1 1 <

1 * 1 1 1 I 1 ! ' < •

12 3 4 3 6 7 3 9 101112131<1!1»171в19гм12йЖ2!гат2га»яггз5з»ямз7гзг««>41.

О- резистентный тип, а - про1Ялуто'шый тип, о - чувствительный тип.

для 41 здорового донора, описшаеизя уравнением: V - 0.417Х -4,399. Шлучанный коэффициент корреляции, хотя и свидетельствует о наличии достоверной связи мэжду изучаемыми параизтраш, существенно меньше единицы, что отражает заметное рассеяние точек вокруг линии регрессии (см. рис. 1). Такое рассеяние свидетельствует о вариабельности индивидуальной чувствительности доноров к антипролифератииному действию Дм. Чам меньше Судет эта вариабельность, теп блилэ к линии регрессии расположатся экспериментальные точки и соответственно увеличится значение г.

Основываясь на этих данных, можно сгруппировать доноров пс степени чувствительности их лимфоцитов к антипролиферативному действию Дм. Для этого необходимо, использул линию регрессии в качестве линии отсчета, расположить все точки определенных значений ЕД50 в условных единицах расстояния от линии регрессии (рис. 2, все точки значения ЕД50, относящихся к одному донору, расположены на одной вертикальной линии). Таким образом, с помощью описанного метода все оСследованныо доноры были разбиты на 3 группы: группа резистентных доноров (результаты все! определений ложатся выше линии регрессии), группа чувствительных доноров (все точки - ниже линии регрессии) и группа лиц с промежуточной чувствительностью, клэт»си которых а _дних опыта: обнаружили умеренную чувствительность, а в других - умеренна резистентность (точки колеблются вокруг линии регрессии).

2 Индивидуальная чувствительность к антштрадиферативн^ -гу действию Дм и антигены главного комплекса гч .'тосовместимости.

В свете су^ствутацкх представ .та кий о роли антигенов главного комплекса гистосовместимости в иммунных процессах и нысо ком полиморфизме этой системы, обеспечивающему вариаОьльност: молекулярно-генетичаских механизмов иммунного ответа, Сш проведено изучение возможной связи фенотипа Ю с индивидуаль вой чувствительностью лимфоцитов здоровых доноров к антипроли феративному действию Дм.

В ходе работы было проведено определение фенотипа Н1_А 266 здоровых доноров крови русской национальности г. Мэсквы Среди доноров, обследованных на чувствительность к антипроли феративному действию Дм обнаружено, что в группе рчзютеятвы доноров частота антигенов 0Я2 и В7 достоверно по вью» на как пр

сравнении с донорами чувствительного типа, так и с контрольной вьйоркой. Шчисления проводили с поправкой на число исследованных антигенов (Thomson, 1981) (табл. 1). Частота антигена В18 у чувствительных при таком мэтоде сравнения оказывается повышенной недостоверно.

Следует отмэтить, что обследованные лица (41 чел.) входят п число контрольной популяции (266 чел.). При сравнетш частот антигенов HLA у обследованных и необследованных лиц различий в распределении частот антигенов HLA у этих групп не обнарудш-лось. Шэтому модно считать нашу выборку (41 чел.) по чзстотам антигенов HLA поответствушэй контрольной. В связи с этим ш считали правомерным провести сравнение распределения антигенов

Таблица 1

*йлтота встречаемости некоторых антигенов HLA у лиц с различным типом чувствительности к антнпролифератявно-му действию дексаметазона.

Группы HLA-DR2 4LA-B7 HLA-B18

Контрольная (1) (2) (3)

23, К ?4,4Z 13,2Х

Резистентные (4) (Б) (6)

доноры 84,6Х 76,9Z ОХ

^ствителънна (7) (8) (9)

доноры 27,8Х 5,6% 33,ЗХ

Р 1,4 - 0,000013 (Ркорр. - 0,00093) Р 3,9 - 0,031 Р 4,7 - 0,0024 Р 6,9 - 0,0253

Р 3,6 - 0,192

Р 2,5 - 0,00016 (Ркорр. - 0,012) Р 5,8 - 0,000062 Р 2,8 - 0,047

ILLA па группам внутри обследованной выборка. В результата установлено, что у резистентных лиц т сраянесиэ со zeeisz остальными достоверно повшьэна частота алтигсиос ше, Б7 и B1Z, Б у ЧуЕСТЕКТОДЬКЫГ - аетигска Ble (tzQjl 2).

ТсЛледг 2

Частоте Естречаемостн некоторыг актигекос HLA ородк обслэдо-ЕСЕШХ допоров С РйБКЫМ Т1ЖСЫ ЧуЕСТБКТОЛЬЕОСТИ К ШЛКЩЮ.Ш£Э-рмпвноцу доСствив двксалютазона.

г

jila актегены

ТЕПН ЧуЕСТЕИТеЛЬНОСТЕ

рзэкстеитньгп

прошкуточкый + 4yUCa'CirrG£2Stíi

I

Ш2

в/

BIS

84,6Z 7G.QX

за.бх

21,41 1

3,6%

С,0002

0,00017

0,0034

El 8

чувствительный

33,32

проыэдуточный + рбвютентиый

4,ЗХ

0,020

Р

3. Группи чтггствителйнаоти и связы^тая гикоргитаг.лог, сЕбцкфкческгпз! рацапт-орааа.

Известии генетически деторцнифовашагг различия в чуа-огвЕтельностЕ к ГЕ у и челзсека (Лкшко с cosa?., 1С20

Лассо, Сунн, 1987) В связи с зтйи предстазлялось вероятпш что ккдкЕпдуальныа различи в чуЕетЕктельиости ддафаздаы.. ко ток адоровш доноров к антлпро-Е^ратшшоцу дэйстбиэ горюсз югут бить связаны с генетически до тир ы.ш ни i и аяьог. намэячя еостью роцэпц1ш i'k KMlTtuUÜL

Дел оцршэ! Езамдсвйзи иэвду тшч;»ы ч-увст нитсль ноет и ¿шф)-

ицных клеток донора к антипролиферативноцу действии декпамета-зона и особенностями этих клеток в отношении рецепции ГК совестно сЕН. Ляпко были обследованы 9 здоровых доноров. Параметры связывания ГК с лимфоцитами были определены по описанному ранее изтоду (Ляехо, Сухих, 1987), при этом вычисляли измсималаноз количество мест связывания (Вт), равновесную константу диссоциации (Кй), а такие показатель эффективности рецепции (Вт/К(1).

Таблица 3

Парегэтры связывания дексамэтаэона с лимфоцитами доноров

N Тип (Вт/К<1)х

доноров чувствительности Вт (пИ) Кс1 (нМ) х 10

рег -ответный

(О

31,66 20,21 17,72

6,9 6,4 4,1

4,95 Ь,7Б 4,32

1а прошяуточный 16, 10 2,5 6,08

14 (П) 40, 61 4,9 8,27

24 10, 62 3,1 0,33

26 чувствительный 63, 29 6,6 11,27

26 (Ш) 22, 78 3,0 7,69

29 34, 81 6,0 6,96

Вш - количество глакокортнкоидных рецепторов (максимальное количество цэет связывания в пересчете на 1 л клеточной

в

суспензии в кош;ентрацин 10 кл/ил); ко - равновесная константа диссоциации; Вт/КД - показатель эффективности рецепции. НЬиэра доноров те яа, что и на рис. 2.

Определение типов чувствительности лимфоцитов 9 обследованных доноров показало, чхо 4 донора могут С>»гь отнесены к типу чувствительных, 3 донора - к типу резистентных и 2 донора - к /1роь»дутоыыоиу типу (табл. 3). Сопоставление типа чувствительности лимфоцитов к аытипролиферати. ному действию Дм как с

количеством рецепторов к ГК (Вт), так и с константой диссоциации (Kd), нэ позволяет обнаружить какой бы то ни было коррелятивной связи (табл. 3). Однако при введении в систему анализа такого интегрального показателя, как эффективность рецепции (Bm/Kd), видно, что в группе чувствительных доноров величина этого показателя значимо выше, чем в группе резистентных доноров (Р I, III < О,ОБ).

4. Чувствительность к антипролиферативноцу действии gw и интенсивность продукции интбрлейкина-2.

Одним из механизмов ант ипро лифе ративюго действия ГК на лимфоциты человека является подавление синтеза одного из главных медиаторов пролиферации - ШЬ2 , которое происходит за счет снижения накопления соответствующей MPHR в клетках . При добавлении КЛ-2 в среду угнетенная • эрмонами пролиферация может практически полностыз восстановиться. Ичюю предположить, ■по различия в чувствительности к тормозящему действию ГК на пролиферацию связаны с различной способностью к продукции ЯЛ-2. В связи с этим мы исследовали в системе in vitro связь между способностью лимфоцитов определенных лиц синтезировать ИЛ-2 и их чувствительностью к антипролиферативноцу действию Дм.

В ходе работы обследовано 27 здоровых доноров. Интенсивность продукции Ш-2 повторно определена у Б человек. Результаты повторных исследований, а такде соответствующие данные литературы (Bonnard et al., 1980), свидетельствуй: и том, что уровень продукции КЛ-2 представляет собой достаточно стабильный признак. В табл. 4 представлении даннш по лрод}| дии КЛ-2 лимфоцитами лиц с различным типом чувствительности к антипро-лиферативному действию Дм. Очевидно, что в группе резистентных доноров продукция ИЛ-2 была относительно высокой, в группе доноров с промелуточньм типом чувствительности этот показатель был несколько нгаи. В группе чувствительных доноров средние показатели продукции Ш-2 были самыми низкими (согласно критерию Стьвдента t 1,111-2,48; Р - 0,022).

Таблица 4

Интенсивность продукции ИЛ-2 лимфоцитами доноров с различными типами чувствительности к антипролиферативному действию глюко-гаэртккоидов.

Тип К N Уровень И ± ш

чувстви- группы доноров продукции и доверительные

тельности ИЛ-2 (ЦЕ/цл) интервалы

1 14,83

2 14,11

Рааистент- 4 10,16 10,86 ± 1,76

ггыЯ Г Б 16,99 (17,01)*

б 7,32 (6,67 1 15,12)

7 8,36

12 4,17

14 4,17

1Б 6,40

Прошлу- II 16 8,00 (8,14)* 9,54 ± 3/7

точный 19 13,11 (7,61)*

22 3,70 (1,40 т 17,68)

23 24,64

24 16,34

25 10,93

27 8,67

26 4,10 (2,24; 2,90)*

28 3,17 (1,28)*

29 13,43

30 2,60 6,22 + 1,34

32 1,62

33 0,62 (2,32 т 8.12)

Чувстви- 34 4,64

тельный III ЗТ 2,96

38 2,60

39 2,7Б

40 0,74

Р 1,111 - 0,022; Р 11,111; 11,1 > 0,06.

* - Результаты повторных исследований (при расчете всех показателей использовали средние значении интенсивности продукции ЯЛ-2 для каждого донора). Номера доноров те л», что и на рис. а.

6j_ Изменение продукции ИЛ-2 лимфоцитами периферической крови при оОработке низкими дооаьм дексамэтааоиа.

Известно, что клинические и лабораторные результаты роя действия глжокортикоидов на иммунную систему дояозавипимы, поэтому в работе мы попытались научить модулируйте влкянж стероидов на экспрессию генов продукции интерлейкина-2. На втс нас натолкнуло наблюдение о влиянии низких доз Дм на пролиферацию лимфоцитов. Ubi эамэтилн, что не все дозы Дм приводят и снижению пролиферативного ответа. При уменьшении дозы торыюззэ-ние пролиферативного ответа исчезало и наблюдалась, наоборот, стимуляция пролиферации, несмотря на оптимальную стимулирувчуя доэу ФГА .

Ш предположили, что наблвдаемый эффект, возможно, обусловлен усилением продукции или высвобождения ИЛ-2.

Чтобы исключить возможное влияние сывороточных факторов и дополнительного количества ГК гэ сыворотки в дальнейшем использовали в экспериментах бессывороточную среду.

Всего было обследовано 9 доноров. Выраженный эффект стимуляции высвобождения ИЛ- - в культур-■льную среду наблюдался у 6 из них, менее отчетливый - у 2 (доноры - 3. С. и С. Г., ркс. 3). В одном случае стимуляции не наблюдалось (С. С., рис. 3). Как правило, переход от стимуляции к угнетению продукции ШЬЕ происходил в диапазоне доз 10 - 10 UL Сеномен стимуляции продукции ЙЛ2 низкими дозами Дм у здоровых доноров in vitro подтверждается статистическими расчетами с помоп?>в точного метода вишера, даже если принять 3 последних случая как негативные в отношении эффекта стимуляции (Р«0,004Б).

В результате, глюкокортикоидные гормоны играют роль истинных имыуномодуляторов, способных как подавлять, т-'К и усиливать иммунные реакции. Данный феномен выявлен надо впервые и требует дальнейшего изучения. Мэжно лишь предположить, что ГК, по-видимому, угнетают не только продукцию ИЛ-2, но воздействуют и на супрессорные по отношению к ИЛ-2 фактора

Подобные вопросы важны для исследования проблем контроля экспрессии генов и изменения типа эффегсгорных иммунных реакций, зависящих от широкого спектра димфокинов.

Таким образом, нами изучены некоторые генэтичэска дстор-ыинированные шханиамы, определяющие различия в чувствительности лимфоцитов здоровых доноров к антипролифэративно^ действию ГК ' ■

«о*

14-

з.с. з.е.

р.а.

С.С.

р

Л-У?,-*, ?,•»,•«, .-У«,-',-»,•»,•'«,-'!, .-5.-*.-Т;1.);>» <<

логарифм доз дексгметаэона

Рис, 3 Эффект изменения высвобождения ИЛ-2 в культуралънуг среду при воздействии разных доз См у 9 здоровых доноров (обозначены инициалами). 1Ь оси ординат - процентное содержание ИЛ-2 в надосадках по отношению к контролю (стимуляция лимфоцитов без 13м).

О

о

б. Чувствительность к дексамэтааону к интенсивность

продукции ИЛ-2 лимфоцитами больных . В работе начато изучение зависимости между типом чувствительности к ГК и результатами гормонотерапии у больных ревматоидным артритом (FA). Эта нозология выЗрана не случайно. В отличие, например, от другого заболевания с поражением соединительной ткани - системной красной волчанки, где в большинстве случаев удается получить выраженный клинический эффект от лечения ГК, при РА до 40Z процентов больных являются резистентными к этим препаратам. Одни больные резистентны изначально, другие утрачивает чувствительность в процессе развития болезни. UU изучали распределение типов чувствительности среди больных РА, высоту пролиферативного ответа на ФГА, уровни продукции Kit-Z, влияние терапии на чувствительность к ГК и свявь типа чувствительности с результата и гормонотерапии.

Было обследовано 25 взрослых больных с клиническим диагнозом РА, из них повторно тип чувствительности определялся у 4 больных. Распределение тишь чувствите; "зности больных к анти-пролиферативному действию Дм показано на рис. 4. Фчти все больные оказались по нашим оценкам резистентными. Отличия от вдоровых обследованных доноров статистически достоверны (различия определяли по показателю д( Y-Y") с помощью метода Вил-коксона-ианна-Уитни, Р < 0,01).

В обследованной группе наблзэдали два случая гиперрезистентности, когда ни одна из примененных нами доз Дм не вызвала подавления пролиферации. Следует отметить, что у больных средни* уровень пролиферативного ответа (11,79 + 0,09) был достоверно выше, чем у здоровых (11,39 + 0,06; Р < 0,001) При повторных исследованиях больных обнарутдано, что чувствительност) к ГК in vitro возрастает. У больных с пшеррезнстентностью , обследованных через Б и 8 месяцев , находившихся в клиническое ремиссии, появилась реакция на антилролиферативное дейтвие Дм но их лимфоциты были все же очень резистентными. Двух другя больных обследовали через неделю после начала лечения стерои дами . ^ствительность их лимфоцитов к Дм такте сильно уведи чилзсь, но и они остались в резистентной группе.

При исследовании продукции интерлейкина-2 лимфоцитам больных (в среднем: 5,14 ± 1,04 IE/мл) и здоровых (7,67 + 1,1

- 17 -

НЕ/мл) достоверных отличий не обнаружив (Р > 0,1).

Итак, на основании клинического материала южно .говорить, о том, что чувствительность лимфоцитов больных с аутоиммунной патологией (в данном случав РА ) к антипролиферативному действию ГК ншю, чем у ад_>ровых и что ата чувствительность мен ется в процессе лечения.

ítv ИМЛ/WíH

Рис.41 Чувствительность лимфоцитов больных ревматоидным артритом к антипролиферативному действию дексамэтааона (lg ED50) и высота пролиферативного ответа (1п имп/мин) на б miov ма 41'А. Лшия регрессии проведена для здоровых доноров (см. рис.1). Стрелками указаны повторные исследования.

- 18 -

Представленные материалы показывают, что такой параметр как чувствительность лимфоцитов периферической крови человека к антипролиферативноч/ действию глхкокортикоидных гормонов поддается количественному учету. Это позволяет отнести каждого донора к тому или иному типу чувствительности. Клетки лиц, относящихся к оппоэитным по чувствительности группам (чувствительная и резистентная) отличаются друг от друга по таким свойствам как эффективность рецепции глюкокортикоидов и интенсивность продукции интерлейкина-2. Эти свойства не только помогают объяснить механизмы различий между группами чувствительности (эффективность рецепции выда у лиц с высокой чувствительностью, а высокая продукция интерлейкина-2, наоборот, характерна для резистентных доноров), но и свидетельствуют в пользу их генетической детерминированности, так как и количество глю-кокортикоидных рецепторов, и интенсивность продукции интерлейкина-2 контролируется генетически. Еще одним доказательством генетической обусловленности различий между группами является обнаружэнние наш ассоциаци" с антигенами HLA (низкая чувствительность - с антигенми DR2, В7 и В12, а высокая - с В18). Следует заметить, что по данным литературы антигены В7 и В18 ассоциированы, соответственно, с высоким и низким уровнями кортиаола в плазме. Такая однонаправленность ассоциаций, полученная в совершенно различных физиологических системах, также может свидетельствовать в пользу генетической детерминированности механизмов гормональной регуляции иммунного статуса. Прямое отношение к вопросам гормональной регуляции функции иммунной системы имеют эксперименты по влиянию широкого спектра доз дексаметазона на продукцию интерлейкина-2 лимфош-.сами периферической крови человека. Результаты этих опытов показывают, что г лшо кортика иды могут выступать в качестве истинных иммуномодуляторов, когда направленность эффекта (торможение или стимуляция) зависит от использованной дозы.

Исследования, проведенные на больных с аутоиммунной патологией, показали, что резистентность больных ревматоидным артритом (а в ряде случаев и больных с нефротическим синдромом) достоверно выше, чем в популяции здоровых лиц. В процессе лечения чувствительность лимфоцитов больных может увеличиваться. Отсутствие прямой коррелящш между типом чувствительности, который определяется у больного до начала лечения, и результата-

vüi терапии, по-видимоцу, с точки зрешш ¡¿еханиз.чов антипроли-форативного действия глюкокортикоидов, вполне закономерно. Дэйствительно, низкая чувствительность к действию Дм на фоне гьзсокого пролифэративного ответа на иитоген может объясняться наличием у данного больного значительного количества активированных диифоцитоз. Уровень экспрессии высокоаффшпшх рецепторов для ПЛ-2 у таких клеток шжэт бить достаточно высок. В этой случае подавление продукции ИЛ-2 с помощью глшокортикгч-дов о кагат минимальней антипролифоративный зффэг", особенно, ясли мРНК для ИЛ-2 ytre образовалась. В то хв время, большие дозы ГК за счет своих противовоспалительных свойств могут и при таких обстоятельствах оказать благоприятный клинический эффект. Исследования в этой направлении могли бы дать ценный liaTepnaa для более глубокого понимания механизмов терапевти-чэского действия глюкокортик.. идных горыонов.

ВЫВОДЫ

1. Предложен ьзетод оценки гадивидуальной чувствительности шшфок. ,ных клеток здоровых доноров к антипролифэративному действию декса«0тазона. ГЬказано наличие прямой положительной корреляции между высотой пролиферативного ответа и степенью подавления этого ответа дексаметазоном, при этом удалось выявить 3 типа чувствительности: чувствительный, промежуточный и резистентна

2. Епервые обнаружено, что резистентность к сятипролифера-тивноыу действию дексаметазона ассоциирована с антигенами HLA-DÍÍ2, В7 и В12, а чувствительность - с антигеном HLA-B18.

а Эф1»ктив110сгъ рецепции глюкокортикоидов у лимфоцитов чувствительных доноров выше, чем у лимфоцитов резистентных, а продукция ИЛ-2 клетками регистентных доноров достоверно выше, чем клетками чувствительных .

4. Ассоциация типа чувствительности к антипролиферативному действию ГК с антигенами системы HLA, а тшсла зависимость типа чувствительности от таких генетически детерминированных признаков как эффективность рецепции ГК и интенсиг )сть продукции ИЛ-2, свидетельствуют в пользу генетичесютй природы различий мчжду группами чувствительности.

-zo-

Б. Впервые обнаружен феномен стимуляции прдукции ИЛ-2 малыми дозами глюкокоргккоидов. Высокие дозы гормона подавляет продукцию ИЛ-2, а низкие (10 - 10 М) ее стимулируют. Как правило, переход от стимуляции к угнетению продукции ИЛ-2 происходит в диапазоне доз 10 - 10 U.

& Резистентность лимфоцитов Сольных ревматоидным артритом л антипролиферативному действию глюкокортикоидов достоверно выше, чем в популяции здоровых доноров. У больных ревматоидным артритом высота пролиферативного ответа такяе была достоверно выше, чем у здоровых, а уровни продукции интерлейкина-2 лтфэ-идными клетками больных не отличались от таковых у здоровых.

7. В процессе иммунодепрессивной терапии чувствительность лимфоцитов больных к антипролиферативному действию дексамэта-зона молат изменяться. Как правило, такие изменения происходят в сторону увеличения чувствительности клеток.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКС ДАННЫХ ГО ТПСЕ ДИССЕРТАЦИИ.

1. Калашникова Е. А., Цухальский А. Л., Пэвницкий Л. А. Вариабельность чувствительности лимфоцитов здоровых доноррв к антипролиферативному действию дексаметаэона и антигены сиетеш HLA. - Билл. акснер. биол., 1988, N 9, с. 334-336.

2. Калашникова Е. А., Цухальский А. Л., Ляшко Е Е Чувствительность лимфоцитов человека к антипролиферативному действии глшокортикоидов и эффективность рецегщии. - Бшл. экспер. биол , 1989, Т. 108, N 11, С. 683-584.

3. Пухацьский А. Л., Калашникова Е. А., Ляшко R Е Швниц-кий Л. А. Шханизмы индивидуальных различий чувствительности лимфоидных клеток человека к антипролиферативному действию глюкокортикоидсв. - Всесоюзн. конф. по генетика соматических клеток в культуре (Звенигород, 12-16 акт. 1989г.). Тезисы докладов. - U., 1989г. , с. 74.

4. Цухальский А. Л , Калашникова Е. А., Ллшко R R Антипро-лиферэтивное действие глшокортикоидов на лимфоциты человека, механизмы индивидуальной чувствительности. - Тезисы I Всесоюз-

- 21 -

пого съезда иммунологов. - U., 1989г., с. ЗБ9.

Б. Цухальский А. Л., Топтыгина А. П., Калашникова С. А. , Швницкий Л. А. Интенсивность продукции интерлейкина-2 как показатель экспрессии гечов, участвующих в контроле иымунореактивности. Всесоганый симпозиум "Проблемы изучения наследственности человека на уровне белковых продуктов генной экспрессии". Тезисы докладов. - И., 1989г, с. 61.

6. Pukiialsky A. L , Elena A. Kalashnikova, V.H. Lyas ко 4 L. A. Pevnitsky. inhibition оГ phytohemag_lutinin-induced lympfccyte proliferation by dexamethasone: meohanisms of individual susceptibility. - Int. J. Imiunopharmao., 199Q, Vol. 12, No 6, p. 6Б7-В63.

7. Elena A. Kalashnikova» A.L. Pukhalsky. Interleukin 2 rele.-ка by human peripheral blood lynptocytes treated with low doaas of dexamethasone. - In.: Standartization of the iniiiinnpharmannloery of natural and synthetic inmt^omodulators. Symposium t the international Association of biological standartization. - Anreoy - France, 15-17 May, 1991, p. 148.

учло i ok множительной техники в011ц амн ccc* поди к печати 5 '¿f/ л- jakaij af,^ тира *jqq 3ki.