Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Генетическая нестабильность в локусе lozenge у Drosophila melanogaster

ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Генетическая нестабильность в локусе lozenge у Drosophila melanogaster"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК СИБИРСКОЕ ОТДЕЛЕНИЕ ИНСТИТУТ ЦИТОЛОГИИ И ГЕНЕТИКИ

ОД

На правах рукописи 1 ' '' — УДК 575.24:595.773.4

ВОЛОШИНА Марина Александровна

ГЕНЕТИЧЕСКАЯ НЕСТАБИЛЬНОСТЬ В ЛОКУСЕ lozenge У DROSOPHILA MELANOGASTER

Генетика — 03.00.15

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Новосибирск - 1995

Работа выполнена в Институте цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Научные руководители: доктор биологических наук,

с.н.с. М.Д. Голубовский; • кандидат биологических наук, с.н.с. И.К. Захаров, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Л.А. Васильева, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск; доктор биологических наук, с.н.с. Л.В. Высоцкая, Новосибирский государственный университет, г. Новосибирск

Ведущее учреждение: Санкт-Петербургский Государственный

университет, г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится " ■3/ ■■ _ 1995 г.

на ЧТ^ймлн заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-002.11.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск, проспект акад. Лаврентьева, 10.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан "_ 2/

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

Осп^ог^Л 1995 г.

Хр^--

А.Д. Груздев

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Проблема генетической нестабильности отдельных мутантных генов и всего генома была поставлена еще в 30-е годы [Demerec, 1941; Дусеева, 1948; Тиняков, 1939]. Однако, только с развитием молекулярно-генетических методов была открыта инсерционная природа нестабильных мутаций. Проблема регистрируемой на фенотипическом уровне нестабильности генов оказалась частью более фундаментальной и сложной проблемы мобильных генетических элементов (МГЭ) — их свойств, , механизмов взаимодействия с геномом и места в эволюции.

Оказалось, что инсерции МГЭ являются основной причиной спонтанных мутаций у дрозофилы. Как правило, в норме частота транспозиций невелика и большинство инсерционных мутаций стабильны. Можно считать установленным, что дестабилизация генома является следствием активации перемещений одного или нескольких семейств МГЭ, однако причины, по которым это происходит, ясны не всегда. Наиболее изучена дестабилизация, вызываемая некоторыми межлинейными скрещиваниями, в том числе три известных системы гибридного дисгенезиса — Р-М, I-R, и hobo. Тем не менее, проблема регуляции транспозиции МГЭ остается актуальной и требует дальнейших экспериментальных исследований. В идеале такие исследования должны быть комплексными и включать как молекулярно-генетический аспект, так и классический генетический анализ феномена нестабильности и влияющих на него факторов.

В последние десятилетия проявляется большой интерес к этой проблеме, описано и изучено много случаев генетической нестабильности. Как правило, материалом таких исследований служат мутации, полученные при гибридном дисгенезисе или в результате других дестабилизирующих скрещиваний. Из спонтанно возникших нестабильных мутаций наиболее полно генетические свойства были описаны для ряда аллелей- генов singed и yellow, выделенных из природных популяций СССР. Ген lozenge остается практически неисследованным в этом отношении, несмотря на то, что мутации по нему регистрируются во многих нестабильных системах. Обнаружение нестабильного аллеля этого гена в

потомстве самца из природной популяции и послужило толчком и материалом для настоящей работы.

Цель и задачи исследования. Основной целью работы было исследование мутационных свойств и регуляции мутабильности спонтанно возникшего нестабильного аллеля локуса lozenge. В процессе исследования решались следующие конкретные задачи:

1) Изучить спектр и частоту мутирования нестабильного аллеля Zz75V и его мутантных производных, проследить динамику мутабильности за долговременный период.

2) Изучить регуляцию нестабильного состояния гена lozenge, влияние на мутабильность факторов внешней и внутренней среды: температуры, генетического состава Х-хромосомы, присутствия в ней другого нестабильного гена, а также цитотипа.

3) Проанализировать данные популяционных исследований по концентрации и частоте возникновения мутаций lozenge в природных популяциях и изучить мутабильность /¿г-ал лелей, выделенных из природы в период работы.

Научная новизна. Впервые детально охарактеризован случай спонтанной нестабильности в локусе lozenge у Drosophila melanogaster. Показано длительное (почти 20 лет) сохранение свойства нестабильности при поддержании в лабораторных условиях. Пока /¿75v — единственный из аллелей, выделенных из природных популяций СССР, для которого выявлена зависимость частоты мутирования of генетического состава Х-хромосомы. Показано, что появление нестабильного аллеля этого локуса является редким случаем и не связано с повышением концентрации мутаций lzв популяциях.

Впервые выделены и описаны нестабильные аллели локусов, названных той и fbr, спонтанно возникшие в той же Х-хромосоме, что и аллель Iz?^.

Практическая ценность. Изучение мутационных свойств и регуляции спонтанно возникших нестабильных мутаций имеет большое теоретическое значение для понимания закономерностей естественного мутационного процесса, места и роли в нем мобильных генетических элементов и механизмов регуляции индуцируемой ими генетической нестабильности. Полученная коллекция линий с широким спектром мутаций по гену lozenge может быть использована в исследовании функционирования и тонкой структуры данного локуса.

Апробация результатов. Материалы диссертации были доложены, представлены тезисами докладов или стендовых сообщений на 6-м Всесоюзном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов" (Москва, 1987), на 5 и 6 Всесогоных совещаниях по проблемам биологии и генетики дрозофилы (Львов, 1987 и Одесса, 1989), на отчетных сессиях Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск,' 1988, 1991 и 1994), на 1 съезде ВОГИС им. Н.И. Вавилова (Саратов, 1994).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ и находится в печати 2.

Структура диссертации. Рукопись диссертации включает введение, обзор литературы, описание материала и методов, изложение собственных экспериментальных данных, обсуждение результатов, выводы и список литературы. Работа изложена на 147 страницах, включая 26 таблиц, 5 рисунков и список литературы, который содержит 157 наименований, из них 56 на русском языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

В первой главе — обзоре литературы, дана характеристика места инсерционного мутагенеза в спонтанном мутационном процессе у дрозофилы, анализируются данные о молекулярной структуре инсерционных мутаций. Явление генетической нестабильности рассматривается как проявление нарушений в механизмах регуляции подвижности МГЭ.

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ

Исследуемый в работе аллель гена lozenge (/г; 1—27,7) — /г7^', возник в 1975 г. при скрещивании самца из природной популяции Синий Гай (Дальний Восток) с самками лабораторной линии со сцепленными Х-хромосомами С( 1)DX,y\vf/ У. Фенотипически мутации этого гена проявляются в недоразвитии ряда эктодермальных структур: уменьшенные,"блестящие" глаза, желтый цвет тарзальных коготков, стерильность самок. Линия Zz^5V была основана путем скрещивания самца /¿75V с самками C(i)DX,ywf/ Y и последующим размножением полученного потомства "в себе". Таким же образом закладывались линии от самцов-носителей новых аллелей Iz, возникавших в результате

мутирования исходного аллеля. Особенностью такого ведения линий является то, что природная Х-хромосома, в которой возник аллель /i75V (X'5ч'-хромосома), наследуется самцами патроклинно, без рекомбинационных изменений, то есть "клонируется". Аутосомы линий lz в результате ряда возвратных скрещиваний с самками линии C(l)DX,ywf практически замещены аутосомами этой лабораторной линии.

Частота мутирования во всех экспериментах определялась в однотипных индивидуальных скрещиваниях самцов /г* (где lz* — любой мутантный аллель) с самками C(l)DX,ywf/ Y или C(l)RMfyf/Y как отношение числа мутантных самцов к общему числу самцов-потомков.

Для получения рекомбинантных Х-хромосом, несущих нестабильные аллели, использовались маркерные линии у ct v t'/Base и w si?.

Изучение влияния на мутабильность аллелей /г^-семейства регуляторных факторов гибридного дисгенезиса проводилось в скрещиваниях с сильной линией Р-цитотипа 712 (линия получена от У. Энгельса), в результате которых получены самцы /г*, сочетающие Р- или М-цитотип с разной долей хромосом этой линии в геноме.

Оценка достоверности отличия выборок проводилась по критерию Стьюдента. Всего за время работы было просмотрено около 200 тысяч мух.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ Мутационные свойства аллеля Zz75^ и его производных.

Сразу после возникновения аллель Z^5V мутировал к фенотипически нормальному и нескольким новым мутантным состояниям с суммарной частотой 3-Ю 2. Все возникающие аллели /г75У-семейства были отнесены к 7 фенотипическим классам: /г+, /г8, /г"1, Zz6* и Iz> (перечислены в порядке усиления мутантного фенотипа, /г"1 —фенотип исходного аллеля У

части аллелей lzь сохранялось такое проявление /z-мутаций, как стерильность гомозиготных самок, т.е. они были псевдонормальны.

Таблица 1. Частота и спектр мутирования аллеля ¡¿ЬУ и его мутантных производных за период наблюдения.*

Год тес- Направление и частота мутирования, %

Аллель тирования 1г+ /2й /г"1 N

¡¿Ы 1975 2,64 0,15 0 - 0,03 5919

1976 0,86 0 0 - 0,10 1054

1986 0,08 0 0 - 0,03 3832

1987 0,02 0,02 0 - 0 5163

1989 0 0 0 - 0 1772

1993 0 0 0 - 0 2697

/2? 1979 0,24 0,05 - 0 0 2127

1983 0,51 0,07 - 0 0 2942

1986 0,18 0 - 0 0 7071

.1989 0,09 0,04 - 0,04 0,01 7684

1993 0,19 0 - 0 0,05 2046

1988 1,3 0 1.9 0 0 317

/*»« 1990 0 0 0,12 0 0 1690

/г*13 1987 0,20 - 0 0,10 0,10 935

/г6119 1980 1,0 ■ - 0,14 0 0 1387

1983 2,0 - 0,06 0 0,06 8282

1987 0 - 0 0 0 1074

/гсх 1975 2,7 0 0 0 - 258

/2ех И 1989 0 0 0 1,1 - 353

* Данные, относящиеся к 1975-1980 гг., были получены М.Д.Голубовским и М.Б.Павловой.

Свойство нестабильности оказалось присуще и многим мутантным производным и не связанным жестко с фенотипом: стабильные и нестабильные аллели были во всех фенотип ических классах. Исключение составил класс полных рсвертантов /г+, все возникавшие в разные годы и разными путями аллели которого были стабильны. Единичные случаи мутирования некоторых

аллелей наблюдались в экспериментах с использованием рекомбинации или гибридного дисгенезиса. Очень близкие по фенотипу к аллелям ¡¿¥ и отличающиеся от них только желтым цветом коготков, /¿"-аллели, напротив, часто были высокомутабильны (табл. 1). Спектр возможных мутантных переходов у нестабильных аллелей одного фенотипического класса был, как правило, сходным. Мутирование в разных направлениях происходило с неодинаковыми частотами, обычно выделялось одно наиболее предпочтительное направление, для большинства аллелей это были переходы к № (табл. 1).

Первоначально присущая аллелю высокая частота

мутирования наследовалась без изменений потомками; с учетом того, что аутосомы линий /г* постепенно замещались на аутосомы лабораторной линии С(1)ОХ,у\у^ это указывало на относительную независимость нестабильного состояния локуса 1г от остального генома. Длительные наблюдения показали, что некоторые аллели сохраняют нестабильное состояние в течение всего времени поддержания в линиях в лаборатории — более десяти лет (например, аллель /г8 в табл.1). В то же время,, в некоторых линиях происходило постепенное снижение частоты мутирования (аллели и /2®1 19 в табл.1). Обратного явления — спонтанного повышения темпа мутирования, не наблюдалось.

Таблица 2. Нестабильные видимые мутации других генов, возникшие в _Х75У-хромосоме.___

Локус (локализация) Фенотип ' Год возникновения • Частота мутирования

singed (21,0) опаленные щетинки 1975 ОТ к 5Л+ и 5Лт ~1х10"3

гои (6-8 ед.карты)* грубые глаза 1986 ОТ гои к гои+ -2x10-3

fbr (0,2 ед.карты левее гои) * тонкие щетинки 1992 от /Ъг к /Ъг+ -5x10"3 §

* Мутации картированы приблизительно, аллелизм с какими-либо известными генами не установлен.

§ Мутирование гена й>г в хромосоме {Ьг гои происходит всегда совместно с геном гои, от /Ьг го и к /Ъг+ гои+.

Одной из характерных черт мутагенеза в изучаемых линиях была его локу(¡специфичность: частота возникновения видимых мутаций' других генов не превышала порядка 10"5 и практически все они были стабильны. Тем не менее, в Х75У-хромосоме было зарегистрировано несколько новых мутаций, проявлявших, как и /г7547, свойство нестабильности (табл. 2).

Роль /'-элемента в нестабильности аллеля

Гибридизация in situ на препаратах политенных хромосом с ДНК .Р-элемента показала, что X75V-xpoMocoMa, несущая аллель /z75v, содержит 14 копий этого элемента, в том числе и в цитогенетическом сайте гена lozenge — 8D (рис. 1, А).

2С

Y-.7, Т

Ysde

IT? ^

7EF 8D

ут.т.

X

тг, ,т, т

Т

19

ti5V ,

у .т. t ,1т

13

I

15

5С

Ysde j 7E'F :8D — 6А 7А У V

Y У Т, I

далее данных нет

Т

—Г 11

I

13

1

15

19

9Е ЮС I1F 13А

16С 17F 19В

j , ут, у , , Т.т, у у: ,,7,1 J4

1А 2F 3D 5АВ

ТУТ т^

7

7А

4-

9Е ЮС

XL

13 13А

ж

16С 17F 19В

Т Т Т^1

fe+I<

д

гои t lz+2 1

L

; за

2F Y'3D lik

I

15

17

19

9E 10CD 11F

T, T, T 13AyTy

далее данных нет

17

—Г"

19

15

Рис. 1. Локализация Р-элементов в Х-хромосомах, несущих нестабильный аллель /¿75У и его мутантные производные (данные получены совместно с Е.Сп. Беляевой). А — исходный аллель /г75У Б — аллель /2?х3 , возникший в линии /г754'. В, Г и Д — /г+-производные от аллеля /г15 .

Чтобы проверить, действительно ли с этим элементом связана нестабильность аллеля было изучено расположение

Р-элементов в Х-хромосомах, несущих его мутантные производные. Р-элемент присутствовал в сайте 8Б в линиях с мутантными производными экстремального фенотипа

/^ехЗ

(рис. 1, Б) и

субнормального фенотипа /г" (на рис. 1 линия не приведена), но в тех линиях, где произошла реверсия к норме — /г+1°, /г+11 и той /г+2, Р-элемент из этого сайта исчезал (рис. 1, В, Г и Д). Отсюда следует два вывода: что мутирование в направлении /гг+ происходит в результате эксцизии Р-элемента (точной или неточной), а мутирование в других изученных направлениях происходит с сохранением Р-элемента в локусе. Связь /г+-фенотипа с эксцизиями может быть объяснением отмеченной выше стабильности всех мутантов этого класса.

Влияние генетического состава Х-хромосомы на частоту мутирования аллелей и /г8

Нестабильность аллелей /г73У-семейства могла быть обусловлена свойствами самих аллелей и (или) генетическими факторами, содержащимися в природной Х75У-хромосоме (поскольку практически все аутосомы были заменены на аутосомы стабильной лабораторной линии). Для исследования влияния хромосомных факторов были проведены рекомбинационные замены различных участков Х75У-хромосомы на гомологичные участки маркерной Х-хромосомы лабораторной линии у сЬ V (/Ваэс . Для эксперимента были взяты исходный аллель и производный от него аллель опыт с аллелем /г8 ставился дважды, с интервалом в шесть лет.

Изучение частоты мутирования аллеля /г® в потомстве самцов-рекомбинантов (рис. 2, верхняя диаграмма) показало, что как дистальный, так и проксимальный участки Х75У-хромосомы содержат факторы, влияющие на мутабильность этого аллеля. Замена проксимального участка — от района между локусами к (1-27,7) и V (1-33,0) до центромеры (1-70,0) (рекомбинанты /г8 /и /г8 к/) приводила к подавлению нестабильности аллеля /г8. При замене дистального участка — от теломеры (1-0,0) до района между локусами с£ (1-20,0) и 1г (1-27,7) (рекомбинанты у Уг8

Жтыс.) 11 8 8 14 2 12 6 19 6 10

уа /г* V /г* /г* /г* / /г* к/

СП ) "лп ) ГН—) г~пз г~го

'---'

га I- к

о X

1- га

о ш

п о

т а

2

0.00

Ы(тыс.) 8

и™

0.00

10

0.10

Б

С? №4 // 5У „ (

1.73

0.04

0.00.

0.00

4 5

11

14 2

Рис.2. Влияние генетического состава Х-хромосомы на частоту мутирования нестабильных аллелей /г« и

В средней части рисунка схематически изображены разные типы рекомбинантных хромосом: белым цветом окрашены участки природной Х7-^-хромосомы, черным - маркерной Х-хромосомы у V /! На верхней диаграмме приведена частота мутирования аллеля /г8 в соответствующих хромосомах, 1,2- данные двух экспериментов, проведенных с интервалом 6 лет. На нижней диаграмме - данные по аллелю А, Б - два контроля: А -

самцы из линии /г754', Б - некроссоверные самцы, полученные в тех же скрещиваниях, что и кроссовериые. Все отличия частот мутирования от контроля достоверны с уровнем значимости 0,01 .(/г8) и 0,05 Ш^У

и у сС /г11), наоборот, наблюдалось существенное превышение частоты мутирования над контрольной, присущей аллелю /г8 в интактной Х75У-хромосоме.

Другой аллель - /г75У, к началу опыта имел устойчивую частоту мутирования равную 1 * Ю-3. Оказалось, что даже этот, относительно невысокий, уровень мутабильности аллеля /г75У снижался до нуля при любых рекомбинационных заменах (рис. 2, нижняя диаграмма). Снижение мутабильности не было связано с влиянием аутосом линии у V так как у некроссоверных

самцов, полученных от скрещивания с той же линией частота мутирования составила 4-10~4, т.е. почти не изменилась.

Необходимо отметить и наличие среди рекомбинантов /г75У исключительного самца № 4 у резко отличающегося по мутабильности от других самцов этого класса (рис. 2, нижняя диаграмма). Если среди 14 тыс. потомков девяти других самцов /г75У V { не было найдено ни одного мутанта, то в потомстве самца № 4 частота мутирования /г75У достигла величины 1,7%, что на порядок выше контрольной. Такое изменение состояния аллеля, несомненно, связано с рекомбинационным событием, которое в данном случае произошло в непосредственной близости от локуса 1г и могло затронуть какие-то его регуляторные зоны.

Чтобы исключить объяснение обнаруженных изменений мутабильности у рекомбинантов какими-то особенностями маркерной линии у сЬ V ^Ваэс, эксперимент с аллелем /г8 был повторен с другой маркерной линией — IV и получены аналогичные предыдущим результаты.

Сравнение данных, полученных для аллелей /г75У и /г®, позволяет сделать следующие выводы: 1) проксимальный участок Х-хромосом обеих линий содержит факторы, необходимые для поддержания нестабильного состояния изученных аллелей; 2) в дистальном участке Х-хромосомы, несущей аллель /г75У, содержатся факторы аналогичного действия, тогда как факторы дистального участка Х-хромосомы линии /г® действуют, наоборот, как репрессоры мутабильности. Противоположность действия факторов дистального участка на два изученных аллеля объясняется, скорее всего, не аллелеспецифичностью выявленных факторов, а генетическими различиями в этом участке Х75^хромосомы, накопившимися в результате мутационного

процесса: линии /г0 и /z75V велись раздельно в течение 12 лет, с момента возникновения аллеля /г® в исходной линии /i75V.

Было изучено также взаимовлияние на мутабильность нестабильных аллелей разных локусов объединенных в одну Х-хромосому. Оказалось, что все исследованные аллели: возникшие в той же Х75У-хромосоме аллели гои и rey, а также аллель независимого от /г75У происхождения — 5ЛВ9, сохранили присущий им темп мутирования неизменным.

Влияние па мутабильность /z-аллелей регуляторных факторов Р-М-гибридного" дисгеиезиса

Приведенные выше данные по гибридизации in situ указывали на связь аллелей /г73У-семейства с инсерцией Р-элемента. Как правило, регулирующие транспозицию Р-элементов хромосомные (/"-элементы) и цитоплазматические (Р- и М-цитотип) факторы существенно изменяют мутабильность индуцированных в лаборатории Р-инсерционных аллелей. Представляло интерес изучить зависимость от них темпа мутирования инсерционных аллелей спонтанного происхождения, какими являются аллели /г73У-семсйства.

Для опыта, были взяты аллель в рекомбинантной

хромосоме у ct и аллель /г8 в интактной Х75У-хромосоме, и в скрещиваниях с сильной Р-линией щ получены разные сочетания хромосом и цитотипов Р- и М-линий. Линии lz*, несмотря на присутствие Р-элементов в Х-хромосоме, имели М-цитотип.

Рассмотрим сначала влияние цитотипа. Из рис. 3 видно достоверное снижение обоих показателей: частоты мутирования и доли семей с мутированием в Р-цитотипе по сравнению с контролем (вариант М(0)). То, что это влияние именно Р-цитотипа, показывает сравнение вариантов М(1/2) и Р(1/2), в которых потомки имели одинаковый состав хромосом, но разные цитотипы. Влияние Р-хромосом (хромосом линии %2> несущих Р-факторы) на мутабильность можно проследить, сравнивая варианты М(0) -контроль, М(!/4) и М(1/2) на рис. 3. У самцов двух последних генотипов мутирование /г-аллелей происходило в ситуации классического гибридного дисгенезиса: Р-хромосомы оказывались в М-цитотипе. На этом фоне частота мутирования аллеля /г8

повышалась от 0,8% в контроле до 2-3%. Аллель У/', имевший более высокую контрольную частоту 2,1%, сохранял ее в ситуации гибридного дисгенезиса почти на том же уровне. Создается впечатление, что величина 2-3% — верхний предел мутабильности аллелей Уг^-семейства.

Таким образом, для двух изученных аллелей наблюдалось снижение темпа мутирования в Р-цитотипе и повышение его до максимальной, присущей данным аллелям величины, при гибридном дисгенезисе, индуцированном скрещиванием с линией щ. Эти изменения соответствуют тем, которые наблюдались для других /Чшсерционных аллелей; хотя амплитуда изменений в случае, например, аллеля $[?■', была намного больше.

Цитотип (в скобках М(0) доля ^-хромосом)

М(1/4) М(1/2) Р(1/2)

Рис. 3. Влияние цитоплазматических и хромосомных факторов гибридного дисгенезиса на частоту мутирования нестабильных аллелей /г8 и У/1. Все отличия от контроля (вариант М(0)) достоверны с уровнем значимости 0,01.

ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение нестабильного аллеля ¡¿^ продолжило цикл работ но генетической нестабильности разных генов, найденных в природных популяциях СССР. Накопленный материал дает возможность сравнить свойства аллеля ¡¿^ и изученных ранее нестабильных аллелей генов singed и yellow. Основными чертами мутагенеза у всех изученных аллелей были следующие: (1) высокая частота мутирования: от 1(И до 10~4; (2) ярко выраженная локусспецифичность мутагенеза; (3) возникновение как стабильных, так и нестабильных мутантных производных; (4) наличие характерного спектра мутирования у каждого аллеля; (5) длительное сохранение свойства нестабильности. Взятые в совокупности, эти свойства однозначно указывали на инсерционную природу изучаемых мутаций. Исследование 11 аллелей гена sn показало, что 5 имели сайт гибридизации с /'-элементом, 2-е мдг 3 [Голубовский, Беляева, 1985]. /Чшсерционным оказался и /г75У-аллель. Таким образом нестабильность аллелей, выделенных из природных популяций, связана с активностью разных классов МГЭ. Этот же вывод подтверждают активно ведущиеся в последнее время исследования разных нестабильных систем, полученных в лабораторных условиях: дестабилизацию могут вызывать мобильные элементы, относящиеся к разным структурным типам и имеющие разные механизмы транспозиции.

Независимо выделенные из природных популяций аллели имели и индивидуальные различия: (1) но частоте мутирования — от 10'3-10"4 до десятков процентов, (2) по спектру, (3) по соотношению мутабильности в половых и соматических клетках и (4) по стабильности мутантных производных. Характерной отличительной чертой аллеля /г75У оказалась стабильность всех полученных фенотипически нормальных ревертантов. Еще одной особенностью была зависимость темпа мутирования от генетических факторов, локализованных в той же, что и сам аллель, X-хромосоме. что не было выявлено для других "природных" нестабильных аллелей.

X7 5 v -х р о м ос ом а интересна и тем, что в ней возникли несколько нестабильных мутаций других локусов, хотя в целом мутагенез носил, как и в линиях с нестабильными sn- и у аллелями, локусспецифичсский характер. Локусспецифичност

указывает на то, что преимущественно транспозиции МГЭ происходят на небольшие расстояния, в пределах локуса (для Р-элемента это подтверждено литературными данными). Происходящие реже инсерции в новые районы, как правило, не проявляются на фенотиническом уровне, малая их часть приводит к возникновению видимых мутаций, и еще меньшая - новых нестабильных мутаций.

Изучение влияния разных факторов на темп мутирования аллелей Уг75У-семейства показало, что наибольший эффект вызывала замена участков Х75х/-хромосомы, меньшие по амплитуде изменения наблюдались под действием регуляторных факторов гибридного дисгенезиса. Это не противоречит сложившимся представлениям о регуляции /Чшсерционных мутаций, но еще раз подтверждает, что ее характер в конкретных линиях может иметь свои особенности, зависящие как от генотипа линий, так и от природы присутствующих в них Р-элементов.

ВЫВОДЫ

Изучены мутационные свойства спонтанно возникшего нестабильного /Чшсерционного аллеля гена lozenge — /¿75v. Для анализа регуляции нестабильности исследовано влияние на частоту мутирования факторов внутренней и внешней среды.

1. а) Аллель /z75V спонтанно мутировал с высокой, порядка 10"2, частотой к фенотипически нормальному и различным мутантным состояниям. Характерной чертой алеля Zz75v является появление исключительно стабильных фенотипически нормальных ревертантов, тогда как производные мутантных фенотипов часто были нестабильны. Нестабильное состояние некоторых мутантных производных сохраняется почти 20 лет.

б) Мутагенез в Х75чг-хромосоме имеет локусспецифический характер. Частота возникновения видимых мутаций других локусов не превышает порядка 105. В двух случаях вновь возникшие видимые мутации генов, названных гои и fbr, оказались нестабильны.

в) Подтверждено сделанное ранее предположение, что аллель /г75У связан с инсерцией Р-элемента: у нескольких полных ревертантов показано исчезновение этого элемента из цитогенетического сайта локуса lozenge — 8D. Высокая

мутабильность аллелей lozenge в X' v - х р о м о с о м с является индикатором активности Р-элементов.

2. а) Обнаружена зависимость темпа мутирования аллелей /¿^-семейства от генетического состава Х-хромосомы: факторы, проксимального участка природной Х75У-хромосомы необходимы для поддержания высокой мутабильности аллелей /г8 и /г754'. Факторы, локализованные в дистальном участке, также необходимы для нестабильности аллеля lz*~)V, но уменьшают темп мутирования аллеля /г8.

б) Анализ взаимовлияния на мутабильность нестабильных аллелей разных генов Х-хромосомы в цис-положении показал, что в сочетаниях /z8 s/?89, rey /г8, rey гои и rou fbr исходный темп мутирования каждого аллеля сохраняется неизменным.

3. Изучено влияние на мутабильность аллелей lz хромосомных и цитоплазматических - факторов гибридного дисгенезиса. В Р-цитотипе происходит снижение мутабильности аллелей /г8 и 1гв 2-4 раза до величины 0,5%. В ситуации гибридного дисгенезиса частота их мутирования достигает максимального уровня — 3%.

4. Установлено, что как пониженная (16-18°С), так и повышенная (29°С) температура развития приводит к снижению частоты мутирования аллеля /г® в 2-4 раза.

5. В изученный период (1972-1994 годы) концентрация и частота возникновения мутаций локуса lozenge в природных популяциях СССР не превышали фоновых значений 0,03% и 0,01%, соответственно.

6. Сравнительный анализ изученных аллелей гена lozenge с описанными ранее нестабильными мутациями singed и yellow показывает, что механизмы поддержания и регуляции нестабильного состояния инсерционных аллелей могут быть различны.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Волошина М.А., Голубовский М.Д. Генетический анализ влияния хромосом и цитоплазмы Р-М-системы гибридного дисгенеза на нестабильность мутаций, вызванных внедрением разных мобильных элементов у дрозофилы. // Генетика. 1986. Т. 22, №4, С. 624-632.

2. Голубовский M.Д., Волошина M.А., Захаров И.К., Юрченко H.H. Взаимоотношение мобильных элементов Р и мдгЗ у Drosophila melanogaster: генетический аспект. // Генетика. 1986. Т. 22, №10. С. 2452-2458.

3. Волошина М.А., Голубовский М.Д. Генетическая нестабильность в локусе lozenge у дрозофилы. // Тезисы докладов б Всесоюзного совещания по проблемам биологии и генетики дрозифилы. Одесса. 7-12 сентября 1989г. С. 19.

4. Голубовский М.Д., Волошина М.А. Генетический аспект взаимодействия мобильных элементов у дрозофилы. // В кн.: Молекулярные механизмы генетических процессов. / "Наука": М. 1990 С. 36-46.

5. Прохорова A.B., Волошина М.А., Шостак Н.Г., Барский

B.Е., Голубовский М.Д. Получение и первичный генетический анализ трансформантов Drosophila melanogaster линии w lzB/ XX ywf, содержащих ген mini-white, интегрированный в геном при Р-элемент-зависимой трансформации. // Генетика. 1994. Т. 30, №7,

C. 874-878.

6. Voloshina М.А., Golubovsky M.D. Instability of lozenge allele from the Far East natural population. // Drosophila Inform. Serv., 1994 V. 75. P. 111-112.

7. Захаров И.К., Иванников A.B., Скибицкий Е.Э., Чурашов К.В., Юрченко H.H., Волошина М.А., Голубовский М.Д. Генетические свойства аллелей генов Х-хромосомы, выделенных из природных популяций Drosophila melanogaster в период вспышки мутаций. // Доклады Академии наук. 1995. Т. 341. №1. С. 126129.

8. Волошина М.А., Голубовский М.Д. Генетическая нестабильность в локусе lozenge у Drosophila melanogaster: характеристика аллеля /г75У. // Генетика. 1995. (в печати).

9. Волошина М.А., Голубовский М.Д., Павлова М.Б., Беляева Е.Сп. Влияние генетического фона на частоту мутирования инсерционных аллелей гена lozenge у Drosophila melanogaster. / / Генетика. 1995. (в печати).