Функциональное состояние гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем самок-крыс при влиянии йод-индуцированной блокады щитовидной железы

Басалаева, Надежда Львовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональное состояние гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем самок-крыс при влиянии йод-индуцированной блокады щитовидной железы
ВАК РФ 03.03.01, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Функциональное состояние гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем самок-крыс при влиянии йод-индуцированной блокады щитовидной железы"

На правах рукописи

Басалаева Надежда Львовна

ФУНКЦИОНАЛЬНОЕ СОСТОЯНИЕ ГШЮФИЗАРНО-ТИРЕОИДНОЙ И ГИПОФИЗАРНО-ГОНАДНОЙ СИСТЕМ САМОК-КРЫС ПРИ ВЛИЯНИИ ЙОД-ИНДУЦИРОВАННОЙ БЛОКАДЫ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

03.03.01 - физиология"

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук . - -

2 ОКТ 2014'

Курган - 2014

005552850

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «ЮжноУральский государственный университет» (Национальный исследовательский университет) Министерства образования и науки Российской Федерации.

Научный консультант:

Исаев Александр Петрович, доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ, директор научно-исследовательского центра спортивной науки института спорта туризма и сервиса Южно-Уральского государственного университета

Официальные оппоненты:

Жаворонков Леонид Петрович, доктор медицинских наук, профессор, заместитель директора по научной работе ФГБУ «Медицинский радиологический научный центр» РАМН (г. Обнинск)

Нотова Светлана Викторовна, доктор медицинских наук, профессор кафедры биохимии и молекулярной биологии ФГБОУ ВПО «Оренбургский государственный университет»

Смелышева Лада Николаевна, доктор медицинских наук, профессор кафедры анатомии и физиологии человека ФГБОУ ВПО «Курганский государственный университет»

Ведущее учреждение:

Федеральное государственное учреждение науки Институт иммунологии и физиологии Уральского отделения Российской академии наук (ИИФ УрО РАН)

Защита диссертации состоится «15» октября 2014 г. в 900 часов на заседании диссертационного совета ДМ 208.079.01. при Федеральном государственном бюджетном учреждении «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» имени академика Г.А. Илизарова» Минздрава РФ, 640014, г. Курган, ул. М. Ульяновой, д. 6.

С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке ФГБУ «Российский научный центр «Восстановительная травматология и ортопедия» им. академика Г.А. Илизарова» Минздрава России и на сайте ilizarov.ru..

Автореферат разослан « » 2014 г.

Ученый секретарь диссертационного """""

совета д. м.н., профессор

Ю.П. Солдатов

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность исследования. В связи с аварией на атомной станции в г. Фукусима (Япония) в 2011 году вновь возник интерес к изучению физиологических механизмов влияния на человека и животных основного средства блокировки щитовидной железы (БЩЖ) при угрозе радиационного заражения - калия йодида (КИ) (Hänscheid H, 2011). Основную опасность для биологических организмов при авариях на атомных электростанциях или после ядерных взрывов представляют радиоизотопы (в основном 1311). Даже минимальное количество радиоактивного йода при попадании в щитовидную железу может обеспечить дозу облучения, приводящую к малигнизации органа (Meck RA, 1985).

Эффективность КЙ в качестве средства профилактики поражения щитовидной железы обусловлена эффектом Вольфа-Чайкова - физиологическим торможением функции щитовидной железы при воздействии высоких концентраций йодидов. По общепринятой версии, КЙ насыщает тиреоциты стабильным нерадиоактивным йодом, и радиоактивные изотопы не поглощаются щитовидной железой.Шаует М, 2006).

Исследования прошлых лет не выявили серьезных побочных эффектов КЙ. По заключениям многочисленных комитетов и организаций, исследующих данный вопрос, основное осложнение при назначении КЙ - гипертиреоз (йод - Базедов), который наблюдается у людей с гиперчувствительностью к йоду (International basic safety standards for protection against ionizing radiation and for the safety of radiation sources., 1996).

Но при появлении клинических и экспериментальных данных о роли избытка йода в возникновении и прогрессировании рака щитовидной железы (Kanno J,

1992), применение БЩЖ было ограничено (Recommendation of the German Commission on Radiological Protection (Use of Iodine Tablets for Thyroid Blocking in the Event of a Nuclear Accident), 2011).

Не теряет актуальности и изучение возможных побочных эффектов БЩЖ в экстратиреоидных органах. По заключению FDA (2001) (Управление по контролю за продуктами и лекарствами (США)) использование КЙ в Польше после аварии на Чернобыльской АЭС дало полезную информацию о его безопасности (Nauman J,

1993). Однако по мнению некоторых экспертов, возможные побочные эффекты КЙ до сих пор систематически не исследованы (L. Spallek, 2011), а оценка неблагоприятных последствий БЩЖ опирается на косвенные данные из смежных областей (Bacher К, 2002, Meck RA, 1985 ).

Например, общепризнано, что гипотиреоз связан с нарушениями менструального цикла (Poppe К. 2007). Однако результаты исследования влияния антитиреоидных препаратов на репродуктивную функцию разноречивы - имеются данные как о наличии негативного воздействия (Hapon MB.2010), так и о безопасности антитиреоидной терапии (Armada-Dias L. 2001). Аналогичные вопросы вызывает и влияние йод-индуцированной БЩЖ (ЙИ БЩЖ) на^епродуктивную функцию.

Все вышеизложенные проблемы применения КИ тесно связаны с нерешенными до сих пор вопросами физиологических механизмов влияния ЙИ БЩЖ.

Wolff J. в 1969 году, в обзорной статье, посвященной двадцатилетию исследований эффекта Вольфа-Чайкова, отмечал, что достоверность гипотезам о

физиологических механизмах влияния йода на щитовидную железу может дать только непосредственное определение йода в щитовидной железе. При йод -индуцированной БЩЖ активно исследовались изменения содержания йода в щитовидной железе (Hänscheid H, 2011), однако эти данные опирались, в основном, на косвенные показатели — исследования проводились чаще всего с помощью радиоизотопных методов, с ориентировкой на скорость накопления элемента. Трудности при аналитическом определении йода были связаны с его малой концентрацией в биологических объектах.

В связи с тем, что йод не органифицируется в экстратиреоидных органах, не уделялось особого внимания изменениям содержания йода в экстратиреоидных органах при БЩЖ. Хотя в литературе имелись сведения о накоплении йода в гипофизе и половых железах при йодной нагрузке (Trunnell J.B., 1950 ).

Взаимосвязь йода и селена определяется ролью селена в синтезе, метаболизме и активации тиреоидных гормонов - как компонента дейодиназ и глутатионпероксидаз (Ko.hrle J.,2005). Однако сложности в определении содержания селена, как и йода, обусловлены их малыми концентрациями в биологических тканях.

Количественный рентгеноспектральный микроанализ (РМА) является одним из наиболее чувствительных современных методов микроанализа, однако требует дегидратации образцов. Традиционно для дегидратации использовалась длительное термальное подсушивание, несмотря на возможные потери йода при пробоподготовке (20-60%) (Покровский A.A., 1981). Оптимизация пробоподготовки биологических препаратов для РМА могла бы позволить применить этот метод для исследования содержания йода и селена как в щитовидной железе, так и в экстратиреоидных органах.

Сопоставление функциональных изменений эндокринных органов при ЙИ БЩЖ с количественным микроанализом внутриорганного содержания йода и селена возможно, позволило бы уточнить некоторые физиологические механизмы влияния йодидов. .

В литературе1 имеются данные о том, что йодиды стимулируют процессы апоптоза в щитовидной железе (Lenvann Р., 2006). Однако физиологические механизмы действия йодидов на апоптоз в щитовидной железе остаются дискутабельными. Разнятся данные и по путям йодиндуцированного апоптоза (Mutaku J F, 2002).

Особую актуальность этому аспекту физиологического механизма действия йодидов дали исследования, посвященные влиянию йода на апоптоз в экстратиреоидных малигнизированных тканях, например, в тканях молочной железы (Shrivastava, А., 2006.) и легких (Zhang L., 2003). Однако внимание исследователей было посвящено исследованию культур раковых клеток. Данные о воздействии йодидов на апоптоз в физиологических тканях, особенно экстратиреоидной локализации и in vivo, очень скудны.

Указанные предпосылки послужили основанием для целенаправленного исследования физиологических механизмов влияния ЙИ БЩЖ на функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем с изучением внутриорганных йода, селена и маркеров апоптоза.

Целью исследования явилось изучение в эксперименте функционального состояния гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем при влиянии йод-индуцированной БЩЖ с определением интраорганного содержания йода, селена и маркеров апоптоза.

Задачи исследования:

1. Разработать методику пробоподготовки биологических тканей, позволяющую применить для исследования микроэлементов рентгенспектральный микроанализ.

2. Определить с помощью РМА содержание йода и селена в эндокринных органах у крыс (щитовидная железа, гипофиз, яичники, семенники, гипоталамус, поджелудочная железа).

3. Определить с помощью РМА содержание йода в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у женщин и сравнить их с показателями у самок — крыс.

4. Выявить особенности функционального состояния гипофизарно-тиреоидной (ТТГ, Тз и Т4 в крови) и гипофизарно-репродуктивной систем (ФСГ, ЛГ, эстрадиол, прогестерон в крови) и экспрессию тканевого натрий - йодного симпортера (НИС) в щитовидной железе, гипофизе и яичниках самок - крыс при влиянии однократного применения КЙ в дозировке 4 мкг/100 г веса животного.

5. Исследовать возможность воздействия КЙ в дозировке 4 мкг/100 г веса животного на проапоптические факторы (каспаза 3, 8 и Bel) в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у самок — крыс.

6. Изучить особенности влияния однократного применения КЙ при различных дозировках (1, 4, 8 и 25 мкг/100 г веса животного) на изучаемые функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-репродуктивной систем самок - крыс (с исследованием экспрессии ТТГ, ФСГ и ЛГ в гипофизе), уровни экспрессии каспаз и НИС в щитовидной железе, гипофизе и яичниках.

7. Определить с помощью РМА уровень интраорганного йода в щитовидной железе, гипофизе и яичниках; выяснить значимость дозозависимости для физиологических механизмов действия однократных доз КЙ .

8. Изучить динамические особенности влияния ЙИ БЩЖ при дозе КЙ 8 мкг/100 г веса животного на функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-репродуктивной систем самок-крыс (с исследованием изменений экспрессии ТТГ в гипофизе), уровни экспрессии каспазы 3 и НИС в щитовидной железе, гипофизе и яичниках.

9. Определить с помощью РМА уровень интраорганного йода и селена (щитовидная железа, гипофиз); выяснить роль интраорганного йода и селена в физиологических механизмах ЙИ БЩЖ-

Научная новизна исследования.

Впервые проведено с помощью РМА определение уровня йода и селена в щитовидной железе и большинстве эндокринных органов крыс; в щитовидной железе, гипофизах и яичниках женщин. Сформулировано понятие «базисного уровня» йода - уровня йода в йод-позитивных точках (ЙПТ) большинства экстратиреоидных эндокринных органов крыс. Выявлено, что видовое различие в содержании йода характерно не только для щитовидных желез, но и для гипофизов и яичников.

Впервые проведена дифференциация влияния «малых фармакологических доз» йодидов в зависимости от соотношения их с «базисным уровнем» йода в щитовидной железе: при дозе, соответствующей «базисному уровню» щитовидная железа накапливает йод, при превышении - теряет.

Впервые выявлено, что в физиологических механизмах влияния КЙ активно участвует гипофиз: выявлено, что при дозах КЙ, превышающих уровень йода в щитовидной железе, происходит накопление йода в ЙПТ гипофиза. Этот процесс сопровождается изменением функциональной активности гипофиза как в отношении тиреоидной, так и гонадной систем: снижается уровень ТТГ (как в крови, так и экспрессии в гипофизе) и повышается уровень ФСГ и ЛГ (как в крови, так и экспрессии в гипофизе).

Впервые выявлено, что гипофиз играет значимую роль в физиологических механизмах воздействия ИИ БЩЖ: на фоне нормальных показателей тиреоидных гормонов происходит рост уровня йода в ЙПТ гипофиза, экспрессии НИС, экспрессии каспазы 3 и снижение экспрессии ТТГ. Эти изменения наблюдаются на день раньше уменьшения уровня йода, роста экспрессии НИС и экспрессии каспаз в щитовидной железе.

Впервые установлено, что «критический уровень снижения йода» в щитовидной железе, при достижении которого начинается ребаунд-эффект, соответствует «базисному уровню йода». Скачкообразный рост экспрессии ТТГ в гипофизе за день до ребаунд-эффекта синхронен с падением йода в щитовидной железе до «базисного уровня».

Впервые выявлена взаимосвязь уровня интраорганного йода и экспрессии каспаз, установлена органозависимость направления этой взаимосвязи - в щитовидной железе - обратная, в гипофизе — прямая. Впервые выявлена обратная взаимосвязь уровней селена и экспрессии каспаз в гипофизе.

Впервые выявлено, что ЙИ БЩЖ оказывает тормозящее влияние на гипофизарно-гонадную системы самок-крыс с участием активации каспазозависимого апоптоза в яичниках.

Впервые разработана методика пробоподготовки биологических субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволяющая минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях (патент № 2366952,2009).

Теоретическая и практическая значимость

В теоретическом аспекте нами была подтверждена гипотеза, что при БЩЖ интратиреоидальный йод снижается до критического уровня. Было установлено, что «критический уровень снижения интратиреоидального йода» соответствует «базисному уровню» йода в ЙПТ экстратиреоидных эндокринных органов самок-крыс.

По результатам исследования была выдвинута гипотеза о дозозависимости влияния малых фармакологических доз йодидов: накопление щитовидной железой йода происходит при дозировках, не превышающих «базисный уровень». При увеличении дозировок щитовидная железа йод не накапливает, однако йод аккумулируется в ЙПТ гипофиза: этот процесс сопровождается активацией местного каспазозависимого апоптоза и снижением функциональной активности гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной системам самок-крыс.

Были выявлены изменения содержания селена в гипофизе при ЙИ БЩЖ: было установлено, что снижению уровня селена в селен-позитивных точках (СеПТ) гипофиза за пределы чувствительности РМА соответствуют максимальные подъемы экспрессии гипофизарных каспаз самок-крыс.

Было установлено, что у женщин по сравнению с самками-крысами уровень йода выше как в щитовидной железе, так и в яичниках и гипофизах, видозависимо и соотношение уровней йода в вышеназванных органах. Полученные результаты необходимо учитывать при экстраполяции «крыса — человек» в исследованиях, посвященных воздействию йода на гипофизаро-тиреоидную и гипофизарно-гонадную системы.

В практическом аспекте полученные знания физиологических механизмов ЙИ БЩЖ обосновывают новые возможности оптимизации доз КЙ, применяемых при угрозе радиационного заражения и оценки возможных осложнений со стороны репродуктивной системы при проведении вышеназванных мер профилактики. Результаты исследований включены в национальный проект в сфере научной деятельности (РФФИ №1207-004430а) ИГК №2014-252. Работа выполнена при поддержке Министерства образования и науки РФ в рамках базовой части государственного задания (код проекта -1696).

Предложенный нами метод пробоподготовки биосубстратов для РМА дает новые возможности исследования микроэлементов с минимальными потерями в процессе аналитических процедур и повышения точности определения микроэлементов.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Уровень йода в йод-позитивных точках (РМА) большинства экстратиреоидных эндокринных органов одинаков («базисный уровень») и видоспецифичен. При блокаде щитовидной железы «критический уровень снижения йода» соответствует «базисному уровню»

2. Механизмы воздействия йодида калия на щитовидную железу, гипофиз и яичники органоспецифичны и дозозависимы.

При воздействии доз йодидов, аналогичных «базисному уровню», щитовидная железа накапливает йод, при увеличении дозы - теряет.

Гипофиз при повышении дозы свыше «базисного уровня» аккумулирует йод в ЙПТ. В яичниках накопления йода не выявлено.

3. Процесс аккумуляции йода в ЙПТ гипофиза сопровождается снижением функциональной активности как гипофизарно-тиреоидной, так и гипофизарно-гонадной систем.

4. Уровень интраорганного йода взаимосвязан с каспазо-зависимым апоптозом: в щитовидной железе эта зависимость обратная, в гипофизе — прямая. Максимальный рост каспаз в гипофизе сопровождается снижением уровня селена в СеПТ гипофиза.

Личный вклад соискателя

Постановка проблемы, цель и задачи исследований, разработка программы исследований и её методологии, экспериментальные работы, анализ и обобщение полученных результатов выполнены автором лично, в качестве соискателя Центра оперативной оценки состояния человека (руководитель центра, зав. кафедрой

технологии спорта и системного анализа, профессор докт. биол. наук Исаев А.П.). Отдельные разделы диссертации выполнены в сотрудничестве (доля участия автора не менее 75%) с сотрудниками кафедры фармакологии (зав. кафедрой проф. докт. биол. наук Самородова И.М.), кафедры анатомии и гистологии (зав. кафедрой проф. докт, вет. наук Стрижиков В.К.) ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины МСХР РФ», лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета (заведующий кафедрой -профессор докт. техн. наук Михайлов Г.Г.), научно-исследовательского центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.), иммунологической лаборатории НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО «РЖД» на ст. Челябинск» (заведующая отделением Малахова Е.Г.), областном патологоанатомическом бюро МЗ Челябинской области (начальник — канд. мед. наук Г.В. Сычугов).

Внедрение результатов исследования

Методика пробоподготовки биологических субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволяющая минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях внедрена в работу научно-исследовательского центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета (заведующий докт. хим. наук Авдин В.В.) и лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета (заведующий кафедрой профессор, докт. техн. наук Михайлов Г.Г.). Положительные результаты внедрения методов, соответственно, 63,1% и 95,0%.

Результаты диссертации используются в научной и педагогической практике: лекционном курсе и на практических занятиях кафедры анатомии и гистологии, кафедры физиологии и фармакологии животных и человека, кафедры акушерства, кафедры терапии и кафедры хирургии Уральской академии ветеринарной медицины МСХР РФ (Троицк).

Апробация работы

Основные положения диссертации представлены на:

XXII Российской конференции по электронной микроскопии, г.Черноголовка, 2-3 июня 2008 г.

Юбилейной научно-практической конференции к 50-летию факультета ветеринарной медицины АГАУ, 100-летию со дня рождения И.С. Ржанициной, г.Барнаул, 11 октября 2012.

Международной научно-практической интернет-конференции, посвященной 65-летию кафедры паразитологии Ставропольского ГАУ «Современные тенденции в ветеринарной медицине», Ставрополь, 21 ноября 2012 г.

5 интернациональном конгрессе федерации европейского общества микроэлементологов «Fifth International Congress of FESTEM», Авиньон, Франция, 22-24 мая 2013 г.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 22 печатные работы: их них - 4 в зарубежных рецензируемых :журналах («Endocrine Regulation»,V.44, 2010; «Endocrine Regulation», V. 45(1), 2011; «Endocrine Regulation», V. 45(3), 2011; «Biological Ttrace Element Research», V. 154(2), 2013); 11 статей в ведущих

рецензируемых журналах, определенных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций. Получено 2 патента Российской Федерации на метод исследования и способ лечения.

Структура и объем диссертации состоит из введения, 8 глав, заключения, выводов и списка литературы. Материалы диссертации изложены на 260 страницах, содержат 13 таблиц, иллюстрированы 45 рисунками. Библиография включает 271 источников, из них 232 зарубежных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

В период с 2008 по 2012 было выполнено 4 серии опытов.

1-я серия опытов состояла в разработке метода дегидратации образцов биологических тканей, позволяющего достигнуть постоянной массы образца при минимальной потере йода (комбинация вакуумного и термального подсушивания образцов). Использовались образцы человеческой щитовидной железы. Применялся метод рентгенфлюоресцентного анализа (РФА) (в низком вакууме).

2-я серия экспериментов состояла в определении содержания йода и селена в эндокринных органах крыс (щитовидных железах, гипофизах, яичниках, семенниках, надпочечниках, гипоталамусах, поджелудочных железах). Применялся метод РМА (в глубоком вакууме — «метод точек»).

3-я серия опытов состояла в определении содержания йода в тканях человека - в щитовидных железах, гипофизе и яичниках у женщин. Применялся метод РМА (в глубоком вакууме — «метод точек»).

4-я серия опытов проводилась в 3 этапа:

1-й этап — экспериментальное исследование воздействия однократного применения КИ в дозировке, соответствующей содержанию йода в щитовидной железе — 4 мкг/100 гр веса животного

П-й этап экспериментальное исследование воздействия однократного применения КЙ в различных дозировках (от 1 мкг до 25 мкг/100 гр веса животного) на гипофизарно -тиреоидную и гипофизарно - гонадную системы самок - крыс

Ш-й этап - экспериментальное исследование воздействия ЙИ БЩЖ (8 мкг/100 гр веса животного в течение 5 дней) на гипофизарно - тиреоидную и гипофизарно -гонадную системы самок - крыс

В 2008 при разработке пробоподготовки биосубстратов, было использовано 6 человеческих щитовидных желез (3 мужчины и 3 женщины, средний возраст 57,6 лет). В 2011 году было проведено исследование тканей человека — щитовидных желез, гипофизов и яичников у 2-х женщин (средний возраст женщин составил 42,5 года). Фатальный исход во всех случаях не был связан с патологией щитовидной железы, гипофиза или яичников. Забор тканей производился при ранних патологоанатомических вскрытиях, выполненных в Челябинском областном патологоанатомическом бюро (начальник - канд. мед. наук Г.В. Сычугов) и патологоанатомическом отделении Дорожной клинической больницы на ст. Челябинск (заведующая отделением - Чубатова H.A.). Все исследования проводились в строгом соответствии и с соблюдением биоэтических норм.

В период с 2008 по 2012 год в условиях вивариев ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины МСХР РФ» (г. Троицк) и МУБК «Зоопарк»

г.Челябинска — согласно договору о научно — практическом сотрудничестве с ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины МСХР РФ» (г. Троицк) (от 18.04.2007) было проведено 3 серии опытов на 311 беспородных крысах (308 самки 6-месячного возраста массой 250 + 30 г и 3 самца 6-месячного возраста массой 320 + 40 г). Схема проведения опытов представлена в таблице 1.

Животные содержались в виварии со стандартным световым режимом (12 ч света: 12 ч темноты (дневная фаза - с 7:00 до 19:00 летнего времени)) и температурой (24±1°С); получали стандартный корм и воду. Эксперимент проводился в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 года № 775) и Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемых для экспериментов или в иных научных целях (Страсбург, 18 марта 1986 г. - European Community Directive 86/609/ЕС). Самки были взяты в опыт в фазы диэструса и метаэструса. Анализ цикличности функционирования гонад проводился на основании исследовании вагинальных мазков.

Таблица 1.

Схема проведения опытов

Группы животных Количество животных в группе

1-й этап - экспериментальное исследование воздействия однократного применения йодида калия в дозировке 4 мкг/100 гр веса животного 53

контроль 16

1-я — однократное применения йодида калия в дозировке 4 мкг/100 гр веса животного, эвтаназия через 48 часов 18

И-я — однократное применения йодида калия в дозировке 4 мкг/100 гр веса животного, эвтаназия через 120 часов 19

II -й этап - экспериментальное исследование воздействия однократного применения йодида калия в различных дозировках (от 1 мкг до 50 мкг/100 гр веса животного); эвтаназия через 48 часов 121

контроль 37

1-я— 1 мкг/100 гр веса животного 21

11-я — 4 мкг /100 гр веса животного 23

Ш-я - 8 мкг /100 гр веса животного 20

IV-*-25 мкг/100 гр веса животного 20

Ш-й этап — экспериментальное исследование йод - индуцированной блокады щитовидной железы (8 мкг/100 гр веса животного в течение 5 дней) 125

1-я — контроль 35

1-я - 2 день Б1ЦЖ (эвтаназия через 24 часа после однократного введения КЙ) 12

П-я - 3 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после однократного введения КЙ) 20

Ш-я - 4 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после двукратного введения КЙ) 15

IV-* - 5 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после трехкратного введения КЙ) 14

У-я - 6 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после четырехкратного введения КЙ) 15

У1-я - 7 день БЩЖ (эвтаназия через 48 часов после пятикратного введения КЙ) . 14

Исходя из целей и задачей исследования использовались следующие методы:

1. Взвешивание образцов проводилось на высокоточных аналитических

весах Sartorius MSA225S-100-DI (Германия) на базе научно-исследовательского

центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета.

2. Термометрия: ректальная термометрия у самок - крыс (1 и 2 этап 4 серии опытов) проводились электронным термометром OMRON Eco ТЕМ CMC - 203-Е (Япония). Региональная термометрия (3 этап 4 серии опытов) проводилась компьютерным многоточечным термометром с датчиками DS18B20 (USA) на базе кафедры «Теория и методика физической культуры и спорта» (Институт спорта туризма и сервиса ФГБОУ ВПО ЮУрГУ).

3. Иммуноферментный анализ гормонального статуса экспериментальных животных проводился методом твердофазного иммуноферментного анализа на иммуноферментном автоматическом анализаторе (фотометр «BIO - RAD model 680 MR 12726», США) на базе иммунологической лаборатории НУЗ «Дорожная клиническая больница ОАО « РЖД» на ст. Челябинск». В сыворотке крови животных определяли содержание тиреоидных гормонов - общего 3,5,3-трийодтиронина (оТ3), свободного тироксина (сТ4), тиреотропного гормона (ПТ), фолликулостимулирующего гормона (ФСГ), лютеинизирующего гормона (ЛГ) и прогестерона с использованием стандартных наборов тест-систем ОАО «Алкор-Био» (Санкт-Петербург, Россия), эстрадиола — с использованием тест-систем «GmbH» (Германия).

4.Морфологическое исследование тканевых образцов (световая микроскопия) и иммуногистохимическое исследование тканевых образцов проводилось на базах кафедры анатомии и гистологии ФГБОУ ВПО «Уральская академия ветеринарной медицины МСХР РФ» и Челябинского областного патологоанатомического бюро. Применяли моноклональные или поликлональные антитела, предназначенные для работы с парафиновыми срезами: ТТГ (клон QB2/6), ФСГ (клон INN-hFSH-60), ЛГ (клон С93), каспаза 3 (клон GHM62), каспаза 8 (клон 11В6) производства «Novocastra», Newcastle upon Tyne, Великобритания, НИС производства «Abbiotec», San Diego, США, Bcl-2 (клон bcl-2/100) производства «BioGenex», San Ramon, California, США. Препараты исследовались с помощью светового микроскопа Axiostar plus (Carl Zeiss Jena, Germany), оснащенного 35 мм фотоаппаратом (Cannon Power Shot A520). Подсчет числа клеток с позитивным (коричневым) иммуногистохимическим окрашиванием проводился при увеличении х 400 по проценту окрашенных клеток (positive area % (РА%). Результаты подвергались автоматизированному количественному анализу с использованием программного обеспечения BioVision Professional 3.0 (West Medica Handels GmbH, Vienna, Austria).

5. Количественный рентген-флюоресцентный микроанализ был проведен с помощью рентген-флюоресцентного спектрометра Supermini (Rigaku, Япония) базе научно-исследовательского центра «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета. Измерения проводились при полной мощности рентгеновской трубки (50 кВ и 4,0 мА), с использованием стандартных кристаллов LiF (200), PET, и RX25. Общее время анализа для всех пиков и

фоновых линий составляло около 4 мин на образец. Исследования проводились на воздухе и в вакууме (3 Ра). Результаты выражались как миллиграмм/грамм (мг/г).

6. Количественный рентгеноспектральный микроанализ был проведен в лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета с помощью растрового электронного микроскопа JEOL JSM — 6460LV (JEOL, Tokyo, Япония) оснащенного спектрометром волновой дисперсии (ВДС - WDS) Inca 500 (Oxford Instruments, High Wycombe, UK) и энергодисперсионным спектрометром (ЭДС - EDS) Inca 7574 (Oxford Instruments, High Wycombe, UK) при 20 kB, 2,5 нА, в высоком вакууме. Время исследования каждой анализируемой точки при ВДС составило 20 секунд. С помощью мультиспектральной аналитической Oxford Inca Energy Wave Crystal EWC453 (Oxford Instruments, High Wycombe, UK, 2003) определялось отношение пик/фон для изучаемого элемента в анализируемой точке. В каждом образце исследовалось не менее 5 точек на элемент.

7. Статистические методы: был использован комплексный статистический анализ. Сравнение уровня показателей, выражающихся непрерывными значениями, проводили после проверки нормальности распределения этих признаков по тесту Колмогорова-Смирнова. При нормальном типе распределения (отличия между средней арифметической (М) и медианой (Me) менее 10 %) применялись следующие методы вариационного анализа: определение средней арифметической (М), ее стандартной ошибки (/и), среднего квадратичного отклонения, отражающего центральную тенденцию и вариабельность значений выборки, оценка распределения величин (Платонов А.Е., 2000). С целью преодоления эффекта множественных сравнений при числе сравниваемых групп больше двух при нормальном распределении использовался дисперсионный анализ. Наиболее широко нами применялся многоранговый тест Дункана. Справедливость нулевой гипотезы в некоторых сериях опытов оценивали с помощью t-критерия Стьюдента (Гланц С.М., 1998). Пороговая величина вероятности ошибки традиционно устанавливалась на уровне равном 0,05.

Обработку данных выполняли в среде StatSoft. Inc. STATISTICA (data analysis software system), version 6.0 и Exel из пакета Micrisoft Office 2007.

3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Разработка метода дегидратации образцов биологических тканей с помощью комбинации вакуумного и термального подсушивания.

Разработка метода дегидратации образцов биологических тканей, позволяющего достигнуть постоянной массы образца при минимальной потере йода (комбинация вакуумного и термального подсушивания образцов) проводилась в научно-исследовательском центре «Нанотехнологии» ЮжноУральского государственного университета (заведующий докг. хим. наук Авдин В.В.). Использовались образцы человеческой щитовидной железы. Взвешивание образцов проводилось на высокоточных аналитических весах Sartorius MSA225S-

100-DI (Германия). Количественный РФА был произведен с помощью рентген -флюоресцентного спектрометра Supermini (Rigaku, Япония).

Ткани щитовидной железы были забраны путем стандартных процедур. 6 влажных фрагментов человеческой щитовидной железы (средний вес 18.5±2.0 мг) были исследованы с помощью рентген-флюоресцентного спектрометра на воздухе, затем в вакууме (3 Ра). Затем фрагменты были высушены при 100°С: 3 образца в течение 45 минут и 3 образца - в течение 90 минут. После подсушивания образцы были вновь исследованы в вакууме (3 Ра). На каждом этапе проводилось взвешивание образцов. Соотношение сухого и влажного веса было определено для каждого образца.

Потеря веса после вакуумного высушивания составила примерно 60%, дальнейшее подсушивание при 100°С в течение 45 минут привело к потере 70% веса, в течение 90 минут - 80% (достигнув постоянной массы, в соответствии с данными литературы (Frisch RE, 1977).

Динамика изменений уровня йода и веса щитовидной железы после вакуумного и термального высушивания представлена в рисунке 1. После вакуумного подсушивания уровень йода в образцах повысился на 22% (на фоне 60% снижения веса). При дальнейшем подсушивании образцов при 100°С в течение 45 минут уровень йода повысился на 44% от исходного (при 70% потере веса). При подсушивании образцов при 100°С в течение 90 минут уровень йода снизился до исходного (при потере веса более 80%).

Таким образом, пробоподготовка методом комбинации вакуумного (ЗРа) и термального подсушивания (100°С в течение 45 минут) дала оптимальное сохранение йода в образцах щитовидной железы при их обезвоживании. Разработанная пробоподготовка биологических образцов была оформлена в виде патента на метод исследования «Метод определения содержания йода в биосубстратах организмов», RU Patent 2366952 (Басалаева Н.Л., 2009).

Попытка аналогичного исследования эндокринных органов у крыс оказалась неудачной, вероятно, в связи с малыми уровнями йода в органах. Было решено для дальнейших исследований использовать более чувствительный метод микроанализа.

Определение содержания йода и селена в эндокринных органах крыс с помощью количественного рентгеноспектрального микроанализа.

Количественный рентгеноспектральный микроанализ (РМА) образцов тканей с помощью спектрометра волновой дисперсии был проведен в лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета. Взвешивание образцов проводилось в научно-исследовательском центре «Нанотехнологии» Южно-Уральского государственного университета.

Так как перед РМА на исследуемый образец проводится напыление платины в вакууме (ЗРа), то во избежание двойного вакуумного подсушивания, этапность пробоподготовки была изменена: образцы сначала подвергались термальному подсушиванию, а затем — вакуумному.

Для определения нормативов содержания йода и селена в эндокринных органах крыс с помощью РМА ВДС - «метод точек» использовались органы 6 интактных

беспородных крыс (3 самки и 3 самца) весом 250-300 грам. Фрагменты 2 щитовидных желез, 2 гипофизов, 2 яичников, 3 семенников, 2 поджелудочных желез и 2 гипоталамусов (с влажным весом от 10 до 18 мг) были высушены при

О 1.710.0

3.6±0.6*

влажная ткань

вакуумное подсушивание

подсушивание 45 минут подсушивание ВО минут

о вес фрагментов | мг) - -о- -содержание йода (мг/г)

Рис. 1.Изменения уровня йода в щитовидных железах и их веса после вакуумного и термального подсушивания. * р < 0,05 — различия с показателями влажной ткани щитовидной железы (тест Дункана).

100°С в течение 45 минут. Затем образцы были высушены при вакууме 3 Ра. На каждом этапе проводилось взвешивание образцов с определением соотношения сухого и влажного веса. Йод был определен в каждом образце (2 образца от различных органов), селен - в 2 щитовидных железах и 2 гипоталамусах, и в одном образце из остальных органов. Каждый образец был исследован в среднем 5.8 раз (для I) и 5.6 раз (для Бе).

Анализируемые точки, в которых определялся йод или селен, были идентифицированы как йод или селен положительные точки (ЙПТ или СеПТ). Анализировалось процентное соотношение ЙПТ ко всем исследуемым по йоду точкам (%ЙПТ). Аналогично определялись %СеПТ.

Постоянная масса фрагментов органов крыс весом в несколько микрограмм была достигнута при высушивании при 100°С в течение 45 минут. Вакуумное подсушивание не оказало влияние на соотношение сухого и влажного веса образцов. Все цитируемые в дальнейшем уровни микроэлементов относятся к сухому весу образцов (с.в.).

137 точек были изучены рандомизировано (79 — I, и 58 — 8е). Результаты РМА (анализ точек) для йода и селена в эндокринных органах крыс продемонстрированы в таблице 2. В большинстве эндокринных органов крыс уровень йода в ЙПТ был одинаков (исключая щитовидную железу и семенники). Этот показатель был идентифицирован как «базисный уровень». Уровень селена в позитивных точках был одинаков во всех эндокринных органах.

Процент ЙПТ был органозависим (от 100% в щитовидной железе до 37% в поджелудочной железе), как и процент СеПТ (от 80% в поджелудочной железе до 50% в яичниках).

Таким образом, в результате исследования был установлен «базисный уровень» йода в ЙПТ для большинства эндокринных экстратиреоидных органов. При проведении следующих этапов эксперимента этот показатель явился основанием для выбора доз КЙ (по аналогии с экспериментами Wolff J, Chaikoff IL (1948), использовавшими дозировку КЙ, 5 — кратно превышающую уровень йода в щитовидной железе крыс.

Определение содержания йода в некоторых эндокринных тканях женщин и самок-крыс с помощью количественного рентгеноспектрального микроанализа.

Большинство экспериментальных исследований, посвященных тиреоидной и репродуктивной системам было выполнено с использованием крыс (Pedraza Р, 2006). Однако экстраполяция научных данных отчасти затруднена - например, демонстрация эффекта Вольфа-Чайкова у человека остается предположительной (Wolff J., 1969).

В связи с вышеизложенным целью следующей серии опытов стало изучение и сравнение содержания йода в щитовидных "железах, гипофизах и яичниках у женщин и самок крыс с помощью РМА.

Были использованы 6 беспородных крыс - самок, у которых поле эвтаназии были изъяты щитовидные железы, гипофизы и яичники. У 2 умерших женщин (средний возраст 42,5 года) так же был произведен забор тканей щитовидной железы, гипофизов и яичников. Фатальный исход не был связан с патологией вышеназванных органов.

В лаборатории электронной микроскопии Южно-Уральского государственного университета был проведен количественный рентгеноспектральный микроанализ (134 определения содержания йода в образцах тканей). Результаты определения уровней йода в тканях человека и крыс приведены в таблице 3.

У женщин позднего репродуктивного возраста уровень йода в ЙПТ щитовидной железы и яичников превышал соответственный показатель полугодовалых самок — крыс в 2 раза (как по ЙПТ, так и по общему числу определений). В гипофизе у женщин уровень йода в ЙПТ по общему числу точек превышал показатели самок -крыс в 2,5 раза, по уровню йода в ЙПТ - в 3 раза.

Таким образом, видовая пропорция содержания йода 2:1 у женщин и самок-крыс характерна не только для щитовидной железы, но и для экстратиреоидных органов (гипофиз, яичники). Полученные данные, по нашему мнению, необходимо учитывать в экстраполяции экспериментальных данных на человека: доза КЙ в эксперименте Вольфа-Чайкова рассчитывалась из пропорции дозы КЙ к уровню йода в щитовидной железе крысы, а не человека.

Таблица 2. Количественный рентгеноспектральный микроанализ (анализ точек) для йода и селена в эндокринных органах крыс

Орган Йод Селен

ЙПТ (масс% х 10-2 с.в.) %ЙПТ СеПТ (масс% х Ю-2 с.в.) %СеГГГ

(М±т) Мишш. значение Максим, значение (М±т) Минпм. значение Максим, значение

Щитовидная железа 21.4±0.4" 0.9 59.0 100 2.8±1.5 0.4 6.3 62.5

Гипофиз 2.5±0.б 0.5 6.3 64.2 1.7±0.6 1.8 6.3 57.1

Гипоталамус 2.5±0.б 12 4.2 62.5 2.Ш.9 0.4 6.3 55.5

Япчник 2.5±0.6 0.9 4.9 46.1 1.9±0.9 0.4 5.6 50

Семенник 5.2±1.6* 3.0 8.4 46.2 ].б±0.4 0.4 2.4 80

Поджелудочная железа 1.8±1.2 0.6 4.2 37.5 3.9±0.4 2.5 5.2 83.3

♦ р< 0,05 - достоверные различия между органами (тест Дункана).

Таблица 3. Сравнительная характеристика уровня йода в щитовидных железах, гипофизах и яичниках у женщин и самок - крыс (М ± т)

Щитовидная железа 10 2 масс% Гипофиз (10 "2масс%) .Яичники (10 -2 масс%)

Самки-крысы (во всех точках) 16,7=ЬЗ,0 (18) 1,4±0,3 (32) 1,7± 0,4 (33)

Женщины ( во всех точках) 33,2*3,4* (16) 5,2±1,1*(20) 3,2± 1,2 (15)

Самки - крысы ( в йод - позитивных точках) ) 16,7*3,0(18) 2,2±0,3 (32) 3,1±0,8 (33)

Женщины ( в йод - позитивных точках) 33,2±3,4»(16) 6,5±0,1* (16) 6,1±1,7*(8)

* р < 0,05 - достоверные различия между органами (тест Дункана). В скобках- число исследований.

Экспериментальное исследования влияния йодида калия в малых фармакологических дозах на шпофизарно-тиреоидную и гипофнзарно-гонадную системы самок-крыс

Аналогом для данного исследования послужили эксперименты Wolff J, Chaikoff IL, 1948. Феномен Вольфа-Чайкова (повышение уровня неорганического йода в плазме крови блокирует образование органического йода в щитовидной железе) проявляется начиная с дозы КЙ 25 мкг/100 г в.ж., которая была приблизительно в 5 раз выше количества йода в щитовидной железе крыс (Wolff J, Chaikoff IL, 1948). Доза КЙ, соответствующая уровню йода в щитовидной железе крыс составила бы приблизительно 5 мкг/100 г в.ж.

Аналогично приведенной схеме, доза КЙ, соответствующая «базисному уровню» йода в йод - позитивных точках большинства эндокринных органов крыс была определена как 0,6 мкг/100 г в.ж.

Исходя из приведенных расчетов для экспериментального исследования были выбраны следующие дозы КЙ:

- 1 мкг KI/100 г в.ж. (как соответствующая «базисному уровню» йода в йод-позитивных точках большинства экстратиреоидных эндокринных органов крыс)

- 4 мкг К1/100 г в .ж. (доза примерно в 5 раз превышала «базисный уровень», приблизительно соответствующая уровню йода в щитовидной железе крысы)

- 8 мкг KI/100 г в.ж. (доза, в 2 раза превышающая уровень йода в щитовидной железе крысы и соответствующая уровню йода в человеческой щитовидной железе)

- 25 мкг KI/100 г в.ж. (доза, в 5 раз превышающая уровень йода в щитовидной железе крысы) - дозировка, при которой проявляется феномен Вольфа -Чайкова).

Исследование воздействия йодида калия на гипофизарно - тиреоидную и гипофизарно - гонадную системы самок - крыс при однократном введении в дозировке 4 мкг /100 г массы животного

В эксперименте были использованы 53 беспородных крысы - самки. 16 животных составили контрольную группу, 18 - первую и 19 - вторую. Крысам 1 и 2 групп однократно через желудочный зонд вводили КЙ из расчета 4 мкг /100 г массы животного. Крысы первой группы были подвержены эвтаназии через 48 часов после введения КЙ, крысы второй группы - через 120 часов. Нарушений терморегуляции у животных всех групп выявлено не было. Результаты исследования гормонов гипофизарно - тиреоидной системы в сыворотке крови приведены в таблице 4. В контрольной группе показатели соответствовали эутиреоидному состоянию животных, не отличаясь от литературных данных (Козлов, В.Н., 2008). Через 48 часов после введения КЙ наблюдался гипертиреоз легкой формы (Козлов, В.Н., 2008). Через 120 часов после введения КИ концентрация тиреоидных гормонов нормализовалась, уровень ТТГ оставался сниженным.

Гормоны репродуктивной системы (таблица 5) соответствовали персистирующему эструсу через 48 часов после введения КЙ (двукратное снижение уровня прогестерона на фоне низкого уровня эстрадиола, в сочетании с

повышенной, но недостаточной для овуляции, секрецией ЛГ и ФСГ). Через 120 часов уровень гипофизарных гонадотропинов нормализовался, концентрация прогестерона оставалась низкой.

Таблица 4

Сравнительная характеристика содержания гормонов гипофизарно - тиреоидной системы в сыворотке крови экспериментальных животных (М ± т)

ттг оТ3 сТ,

мкМЕ/мл нмоль/л пмоль/л

0,120±0,03 1,74±0,07 20,35±1,2

Контрольная группа (8) (8) (8)

1 труппа 0,06±0,02* 2,4±0,1* 15,4±1,4*

(через 48 часов) (10) (10) (Ю)

2 группа 0,06±0,02" l,£t0,08 18,5±1,8

(через 120 часов) (И) (11) (10)

* р < 0,05 различия между контрольной и 1 группами; ** р < 0,05 различия между контрольной и 2 группами (критерий Стъюдеига). В скобках - число исследований

Таблица 5

Сравнительная характеристика содержания гормонов репродуктивной системы в сыворотке крови экспериментальных животных (М ± т)

ФСГ ЛГ Прогестерон Эстрадиол

мМЕУыл мМЕ/мл нмоль/л пмоль/л

Контрольная 0,11±0,05 0,05±0,04 103±7,7 3,3±1,7

группа (7) (7) (7) (7)

1 группа 0,44i0,13* 0,35±0,14* 57,8±8,9* 4,9±3,0

(через 48 часов) (8) («) (8) (6)

2 группа 0,09±0,05 0,05«, 01 44,7±10,0** 7,2 ±3,3

(через 120 часов) (7) (7) (7) (7)

* р < 0,05 различия между котрольной и 1 группами; ** р < 0,05 различия между контрольной и 2 группами (критерий Стьюдента). В скобках - число исследований

При гистологическом исследовании фрагментов яичников животных всех групп каких - либо микроскопических признаков некроза (соответственных изменений ядер клеток, цитоплазмы, внеклеточного матрикса, демаркационного воспаления) выявлено не было.

При иммуногисгохимическом исследовании маркеров апоптоза определялись экспрессии эффекторной каспазы 3, инициаторной каспазы 8 и антиапопточеского белка Вс1-2. Контрольные показатели по тканям достоверно не отличались: экспрессия каспазы 3 в тканях щитовидной железы составила 2,9±0,6 РА(%), в гипофизе - 1,4±0.6 РА(%), в яичниках - 1,5±0,5 РА(%). Соответственно экспрессия каспазы 8 составила 3,5±0,5 РА(%), 1,9±0,9 РА(%) и 1,6±0,8 РА(%), экспрессия Вс1-2 - 9,9±1,1 РА(%), 9,5±1,0 РА(%) и 9,9±2,1 РА(%).

КЙ в дозировке 4 мкг /100 г индуцировал активность апоптоза через рост экспрессии эффекторной каспазы 3 в клетках гипофизов и яичников у животных через 48 часов (соответственно до 4,7±0,6 РА(%) и 3,9±1,2 РА(%))и 120 часов (соответственно до 5,5±2,0 РА(%) и 4,5±1,2 РА(%)).

Рост инициаторной каспазы 8 отмечался в яичниках крыс через 120 часов после инсталляции КЙ (до 4,9±1,1 РА(%)). В гипофизе достоверных изменений каспазы 8 не было зафиксировано.

В щитовидной железе было выявлено снижение активности апоптоза через снижение каспаз 3 и 8 через 120 часов после введения КЙ.

Вс1-2 изменился только в яичниках, снизившись через 120 часов после введения КЙ (до 4,2± 1,1 РА(%)).

Таким образом, однократное применение 4 мкгКШОО гр в.ж. у самок-крыс провоцировало краткосрочную (до 120 часов) легкую гиперфункцию гипофизарно-тиреоидной системы; причем реакция гипофиза на нагрузку йодом была более длительная, чем ^ щитовидной железы. На репродуктивную систему крыс вышеуказанная доза КЙ оказывала подавляющее влияние, которое было так же краткосрочно и не превышало длительность одного астрального цикла, однако уровень гипофизарных гонадотропинов восстанавливался быстрее, чем концентрация гормонов, продуцируемых яичниками. Изменений физиологических параметров (ректальной температуры) у исследуемых животных выявлено не было.

Длительное время на основании экспериментальных данных считалось, что фармакологические дозы йодидов вызывают в яичниках лабораторных животных дистрофические и деструктивные изменения фолликулярного аппарата с обратимым прекращением овариальной функции (Брауде И.Л., 1957). Однако при нашем эксперименте при гистологическом исследовании фрагментов яичников микроскопических признаков некроза обнаружено не было на всем протяжении последующего астрального цикла (через 48 часов и 120 часов после приема К1).

Пути программированной гибели клеток при воздействии йодидов до настоящего времени дискутабельны. ВоесЬа! Ь.Н.В е! а1. (2002) выявили, что йодид калия модулирует в клетках щитовидной железы оба пути апоптоза, как митохондриальный, так и через рецепторы апоптоза (каспазный). По мнению других авторов (8Ьпуа51ауа А., е1 а1, 2006), йод-индуцированный апоптоз каспазо-независим. Следует отметить, что 8Ьпуаз1ауа А., й а1 исследовали апоптоз на культуре человеческих клеток малигнизированной молочной железы.

По нашим данным реакция щитовидной железы, гипофиза и яичников на 4 мкгКШОО г в .ж. каспазозависима и органоспецифична. Щитовидная железа реагировала снижением активности процессов апоптоза через снижение каспаз, гипофиз и яичники - повышением активности апоптоза через рост каспаз, но у яичника, в отличие от гипофиза, реагировали оба пути апоптоза - и рецепторный, и митохондриальный.

Исследование воздействия йодида калия на гипофизарно-тиреоидную и гипофизарно-гонадную системы самок-крыс при однократном введении в различных дозировках

В эксперименте были использованы 121 беспородная крыса - самка. 37 животных составили контрольную группу, 21 - первую, 23 - вторую, 20 -третью и 20 - четвертую. Крысам 1,2,3 и 4 групп однократно через желудочный

зонд вводили КЙ из расчета соответственно 1 мкг /100 г массы животного, 4 мкг /100 г, 8 мкг /100 г и 25 мкг /100 г. Все животные были подвержены эвтаназии через 48 часов после введения препарата.

Нарушений терморегуляции у животных всех групп выявлено не было, аналогично первому этапу эксперимента.

Результаты исследования гормонов гипофизарно-тиреоидной системы в сыворотке крови приведены в таблице 6. В контрольной группе ТТГ, оТз и сТ* соответствовали эутиреоидному состоянию животных. После введения КИ у всех крыс наблюдался гипофизарный гипотиреоз (снижение уровней ТТГ и СТ4). Снижение ТТГ начиналось при воздействии 1 мкг/100 г. Величина введенной дозы не влияла на уровень ТТГ - достоверных различий между показателями ТТГ после воздействия дозировок от 1 мкг/100 г до 25 мкг на 100/г выявлено не было.

Т4 значимо снижался после введения 1 мкг/100 г. Уровень Т4при дозах 4 и 8 мкг/100 г достоверно не отличался от показателя при 1 мкг/100 г, дальнейшие снижение наблюдалось при максимальной дозе КИ - 25 мкг/100 г.

При всех дозах изменений 0Т3 зарегистрировано не было.

Таблица 6.

Гормоны гипофизарно- тиреоидной системы в сыворотке крови при различных дозах йодида калия (М ± ш)

ТТГ оТз сТ<

ыкМЕ/мл нм оль/л пм оль/л

Контрольная группа 0,13±0,03 1,71±0,07 20,3±1,4

(7) (7) (7)

1 группа 0,03±0,01» 1,5±0,2 14,2±0,8»

(1 мкг/100 г) (6) (б) (6)

2 группа 0,01±0,01" 1,9±0,4 16,4±1,5"

(4 мкг/100 г) (7) (7) (7)

Згруппа 0,01±0,004*** 1,4±0,2 15,1±1,5***

(8 мкг/100 г) (6) . (6) (7)

4 группа 0,02±0,01**'» 1,6±0,2 11,8±0,9"**

(25 мкг/100 г) (6) (6) (6)

* р < 0,05 различия между контрольной и 1 группами; ** р < 0,05 различия между контрольной и 2 группами,*" р < 0,05 различия между контрольной и 3 группами, ♦*** р < 0,05 различия между контрольной и 4 группами (критерий Стьюдеша). В скобках - число исследований

При анализе результатов исследования гормонов репродуктивной системы (таблица 7) было установлено, что воздействие различных доз КЙ специфично для каждого гормона. ФСГ повышался при воздействии 1 мкг/100 г, ЛГ - при 1 и 25 мкг/100 г, прогестерон снижался при 4 и 8 мкг/100 г, эстрадиол - при всех концентрациях КИ.

Реакция гипофизарно-гонадной системы была однотипной («персистирующий эструс») при дозах 4 и 8 мкг/100 г: снижение прогестерона и эстрадиола при тенденции к росту гипофизарных гонадотропинов. При дозах 1 и 25 мкг на фоне достоверного роста гипофизарных гонадотропинов снижался только эстрадиол; достоверных изменений прогестерона не наблюдалось.

Таким образом, изменения гормонов щитовидной железы и яичников были сложные - одни гормоны не реагировали введение йодида (оТз), другие -снижались при всех дозах йодида калия и глубина их снижения не зависела от дозы (эстрадиол), у третьих - наблюдалось «плато» снижения уровня при

нарастании дозы (сТ4 и прогестерон), однако при дозе 25мкг/100 г вышеназванные гормоны вели себя различно - сТ4 продолжил снижение, прогестерон - поднялся к показателям контрольной группы.

Таблица 7

Гормоны гипофюарно-гонадной системы в сыворотке крови при различных дозах йодида кали» (М ± т)

ФСГ мМЕ/мл ЛГ мМЕ/мл Прогестерон им оль/л Эстрадиол пм оль/л

Контрольная группа 0,11±0,05 (V) 0,05±0,04 (7) 103±7,7 (7) 3,3±1,7 (7)

1 группа (1 мкг/100 г) 0,33±0,08* (6) 0,32±0,07* «¡) 90,8±19,2 («) 0* (6)

2 группа (4 мкг/100 г) 0,38±0,15 (7) 0Д9±0,15 (7) 51,4±14,9** (7) 0** (7)

3 группа (8 мкг/100 г) 0,54±0,27 (6) 0,42±0,32 («) 45,9*10,6*** (6) 0*** (6)

4 группа (25 мкг/100 г) 0,Э5±0,23 (6) 0,20±0,07**** ■ (6) 70,916,9 (6) о»»«» (6)

* р < 0,05 различи» между контрольной и 1 группами; ** р < 0,05 различия между контрольной и 2 группами,*** р < 0,05 различия между кошрольной и 3 группами, **** р < 0,05 различия между кошрольной и 4 группами (критерий Стьюдента). В скобках - число исследований

Однозначно на введение различных дозировок йодида калия отвечали снижением функции гормоны гипофиза - ТТГ, ФСГ и ЛГ, причем реакция их не зависела от дозы К1. Однако изменения уровня гипофизарных гонадотропинов в крови были недостоверны. Это обстоятельство обусловило более углубленное исследование функции гормонов гипофиза.

Результаты определения экспрессии тиреотропного, фолликуло-стимулирующего и лютешшзирующего гормонов в гипофизах самок-крыс иллюстрированы рисунком 2.

Динамика изменений экспрессии ТТГ, ФСГ И ЛГ в гипофизе несколько отличалась от динамики изменений параметров гормонов в крови. Достоверное снижение уровня экспрессии ТТГ (более, чем в 2 раза) начиналось с дозы 4 мкг/100 г в .ж.. При нарастании дозы йодида калия выраженность снижения экспрессии ТТГ уменьшалась.

Экспрессия ФСГ и ЛГ в тканях гипофиза максимально (более, чем в 2 раза) возрастала так же при 4 мкг К1 /100 г. При увеличении дозы сохранялось повышение экспрессии ФСГ, а показатели ЛГ достоверно не отличались от уровня контрольной группы.

Таким образом, воздействие доз КЙ, соответствующих содержанию йода в щитовидной железе привело к снижению функции гипофиза не только на уровне гуморальных показателей, но и на уровне экспрессии гормонов в гипофизе.

По результатам исследования ФСГ и ЛГ реагировали на КЙ сочетано с изменениями ТТГ как на. уровне показателей в крови, так и на уровне морфологических структур. Однако, если изменения уровня гормонов в крови наблюдались при всех исследуемых дозах КЙ, начиная с дозы, соответствующей

ШТТГ ПФСГ илг

Рис. 2. Изменения экспрессии ТТГ, ФСГ и ЛГ в гипофизе через 48 часов после однократного введения йодида калия при различных дозировках * р < 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Стьюдента).

«базисному уровню» (1 мкг/100 г в.ж.), то одновременная вариабельность экспрессии гормонов в гипофизе - только при дозе КИ, соответствующей уровню йода в щитовидной железе (4мкг/100 г в.ж.). При дозе КЙ, превышающей это соотношение (8 мкг/100 г в.ж.) достоверно менялась только экспрессия ТТГ. При воздействии 25 мкг/100 г в.ж. наблюдался интересный феномен - изменилась экспрессия не только ТТГ, но и ФСГ, однако экспрессия ЛГ достоверно не отличалась от показателей контроля. Эти данные соответствовали полученным ранее результатам - при дозе 25 мкг/100 г в.ж. прогестерон, в отличие от эстрадиола, не отличался от уровня контрольной группы.

Таким образом, гипофизарные гонадотропины продемонстрировали индивидуальную чувствительность к различным дозам КИ.

Результаты определения экспрессии натрий-йодного симпортера в щитовидных железах и гипофизах самок-крыс иллюстрированы рисунком 3. В яичниках экспрессия НИС достоверно повысилась в 2 раза при сравнении с контролем (4.3±0.1% РА) после 8 мкг/100 г (9.9±2.4% РА) (р<0.05). После 1 мкг/100 г экспрессия НИС снизилась до 1.8±0.7 % РА (р>0.05), после 4 и 25 мкг/100 г повысилась до 4.9±1.0 % РА (р>0.05) и 5.8±1.5 % РА (р>0.05).

По результатам исследования выяснено, что в контроле не было достоверных различий между уровнями экспрессии НИС в органах, несмотря на то, что показатель в яичниках превышал уровни в щитовидной железе и гипофизе.

В щитовидных железах достоверный рост экспрессии НИС по сравнению с контролем был выявлен после дозировок 8 и 25 мкг/100 г в.ж., то есть при превышении дозировок, соответствующих уровню йода в щитовидной железе.

13.9+1.5* 11.9+2.81

25 мкг/100 г

■ щитовидная железа □ гипофиз

Рис. 3. Изменения экспрессии НИ С в щитовидной железе и гипофизе через 48 часов после однократного введения йодида калия при различных дозировках * р < 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)

В гипофизах достоверный рост экспрессии НИС по сравнению с контролем наблюдался после дозировок 4, 8 и 25 мкг/100 г в.ж., то есть при превышении дозировок «базисного уровня». В яичниках экспрессия НИС реагировала только на дозу, ориентировочно соотносимую с уровнем йода в щитовидной железе (4 мкг/100 г в.ж.).

Результаты определения экспрессии каспазы 3 и каспазы 8 в щитовидных железах и гипофизах иллюстрированы рисунками 4 и 5.

В щитовидных железах экспрессия каспазы 8 не изменялась при всех исследуемых дозировках. Экспрессия каспазы 3 по сравнению с контролем выросла после 8 мкг/100 г.

В гипофизах экспрессия эффекторной каспазы 3 достоверно выросла по сравнению у контролем при всех дозировках йодида калия. Экспрессия инициаторной каспазы 8 увеличилась достоверно после 1мкг/100 г, 8 мкг/100 г и 25 мкг/100 г. Таким образом, пик экспрессии обеих каспаз в гипофизе был выявлен после воздействия 8 мкг/100 г КЙ.

В яичниках уровень экспрессии каспазы 8 достоверно повышался с 1.7±0.8 %РА в контроле до 4.0±0.9 %РА после дозы КЙ 8 мкг/100 г (р<0.05) и до 4.2±0.3 %РА после 25 мкг/100 г (р<0.05). Повышение экспрессии каспазы 3 было недостоверным при всех дозах КЙ: от 1.5±0.5 %РА в контроле до 3.0±0.7 %РА (р>0.05), 3.9±1.2 % РА(р>0.05), 2.5±0.2 %РА (р>0.05), 3.4±0.6 % РА(р>0.05) после доз КЙ 1, 4, 8 и 25 мкг/100 г соответственно.

Таким образом, при воздействии различных доз КЙ активизируется каспазозовисимый апоптоз. Однако максимально выраженная стимуляция происходит не в щитовидной железе, а в экстратиреоидных органах - гипофизе и яичнике.

1в 14 12

— 10

? Н

4 2 0

1.8+0.7

9.1+2.0'

1 мкг/100 г 4 мкг/100 г

НИС

каспаза3

■ щитовидная железа □ гипофиз

ю -

9 ■

8 -

7 -

< !"

й- 4 -

6.6+0.6* 6.0+2.3 __

JI 3.9+0.1

___I

5.3+0.8

•8 В _ 4.7+0.9«

3.8+0.8 Щ ■ —

контроль 1 и кг/100 г 4 мкг/100 г 8 мкг/100 г 25 мкг/100 г

каспаза 8

I щитовидная железа

□ гипофиз

Рисунки 4 и 5. Изменения экспрессии каспазы 3 и 8 в щитовидной железе и гипофизе через 48 часов после однократного введения йодида калия при различных дозировках.* р<0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)

Рост активности апоптоза в гипофизе наблюдался уже при воздействии 1 мкг/100 г КЙ. Следует отметить, что при дозировке 1 мкг/100 г изменилась только активность апоптоза в гипофизе. Максимальный рост экспрессии обеих каспаз в гипофизе наблюдался при 8 мкг KI/100 г. При нарастании дозы КЙ активность апоптоза в тканях гипофиза была менее выраженной.

Результаты количественного рентгенспектрального анализа содержания йода в щитовидных железах и гипофизах представлены в рисунке 6.

При РМА щитовидных желез было выявлено, что уровень йода в ЙПТ достоверно повысился после дозы 1 мкг/100 г. После 8 и 25 мкг/100 г отмечалось снижение уровня йода в ЙПТ. Следует отметить, что только при дозе КЙ, провоцирующей эффект Вольфа-Чайкова (25 мкг/100 г), в щитовидной железе появились точки, в которых йод не определялся.

В гипофизе было выявлено повышение уровня йода в ЙПТ в сравнении с контролем- недостоверное после дозировок 1, 4 25 мкг/100 г, и достоверное -после 8 мкг/100 г. Более, чем 2-х кратное повышение уровня йода в ЙПТ гипофиза сопровождалось двукратным снижением числа ЙПТ (% ЙПТ снизился после 8 мкг/100 г с 65 % (в контроле) до 28%).

*еса 35

2 30

и 25

ъ 20

о? 15

<Я 10

го- 1б.7+з.о ■

н н н

I I У I Т ■ п ' ■ РГ

иод в нод-понпивиых точках

■ щитовидная железа □ гипофиз

Рисунок 6. Количественный рентгенспектральный микроанализ содержания йода в йод-позитивных точках щитовидной железы и гипофиза через 48 часов после однократного введения йодида калия при различных дозировках * р < 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)

В яичниках уровень йода в ЙПТ в контрольной группе (3.1±0.5 10"2масс%) достоверно не отличался от уровня йода в ЙПТ гипофиза (2.2±0.3 10"2масс%). При всех дозах КЙ этот показатель достоверно не менялся: 4.6±0.7 10"2масс% после 1 мкг/100 г (р>0.05), 4.0±0.5 (р>0.05) после 4 мкг/100 г, 3.9±1.1 (р>0.05) после 8 мкг/100 г (р>0.05) и 4.2±0.8 после 25 мкг /100 г (р>0.05).

Число ЙПТ в яичниках в контрольной группе (54 %) было несколько меньше, чем в гипофизе (65,6%). При воздействии КЙ количество ЙПТ в яичниках снизилось по сравнению с контролем до 28% после 4 мкг/100 г, и повысилось до 71% после 25 мкг/100 г.

Таким образом, по результатам проведенного нами исследования было определено, что экстратиреоидные органы (гипофиз и яичники), как и щитовидная железа, реагируют на введение КЙ. Было так же выявлено, что яичники обладают как общими с гипофизом особенностями реакции на йодную нагрузку, так и индивидуальными.

В щитовидной железе после 1 мкг/ 100 г в.ж. уровень йода поднялся в 2 раза, после 8 и 25 мкг\100 г в.ж. - снизился на 30%.

Гипофизы и яичники, в отличие от щитовидной железы, не реагировали на дозу КЙ, соответствующую их собственному внутриорганному содержанию йода (1 мкг/ 100 г в.ж.) и дозу, 5-кратно превышающую уровень йода в щитовидной железе (25 мкг/100 г в.ж.). Изменения исследуемых показателей у яичников и гипофизов наблюдались при дозе 4 мкг/100 г и 8 мкг/100 г в.ж..

В гипофизах уровень йода в ЙПТ вырос в 2 раза после 8 мкг/100 г в.ж. То есть, гипофиз, как и щитовидная железа, оказался способным накапливать йод, но при других воздействующих дозах КЙ.

Следует отметить, что рост уровня йода в ЙПТ гипофиза сопровождался снижением числа ЙПТ в гипофизе. Вероятно, этот механизм способствует

сохранению уровня йода в гипофизе постоянным. В отличие от гипофиза, в яичнике не менялся уровень йода в ЙПТ.

Таким образом, функциональная активность экстратиреоидных органов (гипофиза и яичников), как и функциональная активность щитовидной железы, дозозависимо изменялись при малых фармакологических дозах КЙ. Минимальное .влияние (без изменения экспрессии гипофизарных гормонов в гипофизе) наблюдалось при 1 мкгКМОО г. Выраженное влияние (с изменением экспрессии гипофизарных гормонов в тканях гипофизов) на гипофизарно-гонадную систему оказывала доза 4 мкг/100 г, на гипофизарно-тиреоидную - 8 и 25 мкг/100 г.

Сочетанное исследование содержания йода в органах с помощью РМА и иммуногистохимического определения экспрессии НИС позволило осветить новые нюансы воздействия КЙ на щитовидную железу, гипофиз и яичники.

Широко известно, что накопление йода в щитовидной железе происходит при малых фармакологических дозах йодидов, подавление накопления — при больших фармакологических дозах. Ориентация доз КИ на внутриорганную концентрацию йода, позволила обосновать и уточнить понятия «малых» и «больших» фармакологических доз, четкой классификации которой нет до сих пор. Диапазон «малых» доз иодидов простирается до 225 мкг/100 г (Markovic L.,2010).

Дозы, при которых в нашем эксперименте подавлялась аккумуляция йода в щитовидных железах, традиционно относились к «малым дозам» йодидов (Duntas LH., 2008). Однако при нашем исследовании было определено, что в диапазоне 1-25 мкг/100 г наблюдались принципиальные различия в реакции гипофизарно-тиреоидной системы:

- при дозе КЙ, соответствующей «базисному уровню», йод накапливался только в' щитовидной железе.

- при диапазоне 5-10 кратно превышающем «базисный уровень» наблюдалось снижение аккумуляции йода щитовидной железой и накопление йода в ЙПТ гипофиза. Таким образом, этот диапазон «малых фармакологических доз» КЙ обладал свойствами «больших фармакологических доз». Следует отметить, что дозировка КИ 4-8 мкг /100 г в несколько раз ниже дозировки КЙ, общепринятой для БЩЖ при угрозе радиоактивного заражения.

- при дальнейшем нарастании дозировки КИ в гипофизе не было выявлено аккумуляции йода, в щитовидной железе йод снижался.

Таким образом, эффект подавления аккумуляции йодидов щитовидной железой наблюдался при дозах, традиционно относимых к «малым».

Доза 4 мкг/100 г, с которой начиналось подавление накопления йода в щитовидной железе, была выбрана как аналогичная уровню йода в щитовидной железе. Следовательно, реакция гипофиза и щитовидной железы начиналась при достижении определенной пропорции между уровнем неорганического йода в крови и уровнем йода в ЙПТ гипофиза и щитовидной железы.

Дополнительным аргументом предложенной дифференцировки доз служил тот факт, что экспрессии гипофизарных гормонов реагировали на дозы КЙ, превышающие 1 мкг/100 г.

Изменения экспрессии НИС в щитовидной железе и гипофизе при воздействии различных доз КЙ так были дозозависимы. Интересно, что накопление йода щитовидной железой при 1 мкг/100 г не сопровождалось изменением экспрессии тиреоидного НИС. Этот показатель изменился при увеличении дозы КЙ свыше «базисного уровня», когда щитовидная железа йод не накапливала. В отличие от щитовидной железы, аккумуляция йода в ЙПТ гипофиза при 8 мкг К1/100 г сопровождалась ростом экспрессии НИС в гипофизе.

Увеличение экспрессии НИС в гипофизах самок - крыс начиналось с дозы 4 мкг/100 г, в то время как в щитовидной железе - с 8 мкг/100 г. Следовательно, гипофиз оказался более чувствительным к воздействию КЙ, чем щитовидная железа.

Следует подчеркнуть, что реакция гипофиза на КЙ отличалась от реакции другого экстратиреоидного органа - яичника. Исходя из того факта, что в контрольной группе крыс уровень экспрессии НИС в яичниках в 2 раза превышал показатель в гипофизах, хотя ЙПТ яичников содержали равное с гипофизами количество йода, мы ожидали более активную реакцию яичников на введение КИ. Однако в яичниках рост экспрессии НИС отмечался только при 8 мкг/100 г, без достоверного роста уровня йода в ЙПТ. Таким образом, если росту экспрессии НИС в гипофизе соответствовал рост уровня йода в ЙПТ гипофиза, то в яичниках такой взаимосвязи выявлено не было - достоверный рост экспрессии НИС в яичниках не сопровождался увеличением уровня йода в ЙПТ яичника.

В связи с вышеизложенным можно было заключить, что изменения гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем при воздействии КЙ в дозировках 1-25 мкг К1/100 г не только дозозависимы, но и органоспецифичны. Причем реакция экстратиреоидных органов (гипофиза и яичника) различна по активности.

Многочисленные исследования посвящены изучению процессов апоптоза в гипофизе, но апоптические процессы в гипофизе активно рассматривались с позиции патологии, а не физиологии. В последнее время роль йодида в экстратиреоидных тканях неоднократно и широко обсуждалась (Сапп 8. А., ег а1. 2006 года). Результаты нашего исследования дают возможность предположить, что функция экстратиреоидного йода может быть расширена в связи с его возможным влиянием на каспазозависимый апоптоз.

В гипофизе экспрессия каспаз увеличивалась в прямой зависимости от нарастания интраорганного йода. При 4 мкгКШОО г начиналось нарастание йода в ИПТ гипофиза и синхронный рост экспрессии гипофизарных каспаз; максимум йода в ЙПТ совпадал с максимумом экспрессии обеих каспаз в гипофизе при 8 мкг/100 г. Причем этот процесс был связан со снижением функциональной активности гипофиза (снижение экспрессии ТТГ и рост экспрессии ФСГ и ЛГ).

Так как функциональная активность гипофиза начинала изменяться при меньших дозах КЙ, чем функциональная активность щитовидной железы, гормоны которой не повышались при исследуемых дозировках КЙ, то можно было предположить, что процесс органификации йода в щитовидной железе

вторичен и находится под влиянием команд гипофиза. Активность каспазного механизма в гипофизе так же напрямую зависела от соотношения уровня йода в крови и внутриорганного йода.

Однако эта зависимость наблюдалась только при «физиологических» концентрациях вводимых доз КЙ. При дозе 25 мкг/100 г (доза эффекта Вольфа-Чайкова) показатели уровня йода в ИПТ гипофиза не отличались от контрольных показателей, а уровень экспрессии гипофизарных каспаз были на уровне 1 и 4 мкг КМ 00 г. Таким образом, БЩЖ при эффекте Вольфа-Чайкова, возможно, происходит без регулирующего участия гипофиза. Вероятно, что гипофиз реагировал на КЙ только в диапазоне от 1 до Ш мкг/100 г.

Одновременное изменение уровня йода в ЙПТ гипофиза и снижение процента ЙПТ в гипофизе предположительно явилось компенсационным механизмом для поддержания постоянного количества йода в гипофизе, в отличие от щитовидной железы, количество йода в которой может увеличиться.

Таким образом, синхронное и однонаправленное изменение экспрессий каспаз и НИС и уровня йода в ЙПТ гипофиза дали возможность предположить прямое влияние йода на функциональную активность гипофиза, опосредованное через ЙПТ гипофиза путем каспазозависимого апоптоза.

Критическая доза КЙ при воздействии на гипофиз была определена как 8 мкг/100 г: при этой дозировке уровень йода в ЙПТ гипофиза повышался в 3 раза, а уровень экспрессии каспаз — в 10 раз по сравнению с контрольными показателями. Именно эта дозировка была выбрана для исследования влияния йод-индуцированной БЩЖ на гипофизарно-тиреоидную и гипофизарно-гонадную системы самок - крыс.

Исследование воздействия йод-индуцированной блокады щитовидной железы на гипофизарно-тиреоидную и гипофшарно-гонадную системы самок-крыс

В эксперименте были использованы 125 беспородных крыс-самок. 35 животных составили контрольную группу, 12 — первую, 20- вторую, 15 — третью, 14 — четвертую, 15 — пятую и 14 — шестую.

Крысам 1 группы однократно через желудочный зонд вводили КЙ в дозировке 8 мкг /100 г массы животного на 0,5 мл физиологического раствора (забой был проведен через 24 часа после введения препарата). Животным из 2, 3, 4, 5 и 6 групп введение КЙ было проведено соответственно в течение 1, 2, 3, 4 и 5 дней. Забой был проведен через 48 часов после введения препарата.

В соответствии с различными временными периодами БЩЖ, экспериментальные животные были разделены на следующие группы: крысы, забитые через 24 часа после однократного введения К1, составили группу «второй день БЩЖ». Соответственно, крысы, забитые через 48 часов после однократного введения КЙ, составили группу «третий день БЩЖ». Животные, получавшие КЙ в течение двух дней и забитые через 48 часов после последнего введения, составили группу «четвертый день БЩЖ». Остальные крысы, получавшие КЙ в течение трех, четырех и пяти дней и забитые через 48 часов

после последнего введения КЙ, соответственно составили группы: пятый, шестой и седьмой день БЩЖ.

Результаты региональной точечной термометрии компьютерным многоточечным термометром с датчиками DS18B20 (USA) в 3 различных регионах: правое ухо, влагалище и верхняя треть хвоста иллюстрированы рисунками 8 и 9.

В контрольной группе был выявлен достоверный подъем влагалищной температуры на 5 и 6 дни исследования. Этот факт можно было объяснить вступлением самок-крыс в период эструса (согласно данным влагалищных мазков). Интересно, что аналогично с влагалищной температурой изменилась температура ушей, причем температура этого региона выросла на 2 дня раньше влагалищной температуры. По завершении стадии эструса температура обоих регионов снизилась до исходных данных. Изменений температуры хвостового региона за период наблюдений вьивлено не было.

При анализе результатов термометрии при ЙИ БЩЖ не было достоверных изменений региональной температуры на саму процедуру введения КЙ (при сравнении показателей до и после первого введения КЙ). Влагалищная температура достоверно возрастала на 2 и 3 дни БЩЖ, но затем, не достигнув показателей контрольной группы, снизилась. На 5 и 6 дни наблюдений мезор температур групп контроля и БЩЖ достигал 2 и 3°С соответственно. Аналогично изменялась и температура ушей. Термометрия хвостового региона соответствовала показателям контрольной группы.

Таким образом, при проведении региональной точечной термометрии была выявлено наличие региональной гипертермии (регионы влагалища и ушей) при эструсе в контрольной группе. У самок-крыс при БЩЖ вышеописанного эффекта не наблюдалось, вероятно, вследствие персистирующего эструса в течение БЩЖ (по результатам влагалищных мазков).

контрольная группа

1 день 2 день 3 день 4 день 5 день б день 7 день

—О- влагалище —□—правое ухо —Н - верхняя треть хвоста

Рисунок 8. Динамика изменений региональной температуры самок-крыс в контрольной группе. * р < 0,05-различия с исходными данными (критерий Дункана).

БЩЖ

31 • 29,6+0,7

29 ■

27,1+03

,—

27- С

26-

25 -

Уд+0,1

24 <

30Д+0.4 ' "К . 29.1±М

29,3+0,3

30,2+0,7

30Д+0.4

28,4+ОД

25,1+0,3

после введении

2 дерь

БЩЖ

Здевь БЩЖ

4 день

БЩЖ

5девь БЩЖ

бдевь БЩЖ

7девь БЩЖ

ЩЯ

—О- влагалище

- правое ухо

- верхняя треть хврста

Рисунок 9. Динамика изменений региональной температуры самок - крыс при блокаде щитовидной железы. * р < 0,05-различия с исходными данными, ** р < 0,05-различия с данными контрольной группы(критерий Дункана).

Результаты определения гормонов гипофизарно-тиреоидной и гнпофизарно-гонаднон систем в сыворотке крови самок-крыс представлены в таблице 8 и рисунках 10 и 11.

Таблица 8

Гормоны гипофизарно-тиреоидной системы в сыворотее крови при БЩЖ (М ± ш)

Группы животных ТТГ мкМЕ/мл оТ3 нм оль/л сТ4 пмоль/л

Контрольная группа 0,117±0,030 (8) 2,09±0,27 (9) 18,5±1,7 (9)

1 группа 0,014±0,007* 2,45±0,32 1б,6±1,6

(2 день БЩЖ) (4) (4) (4)

2 группа 0,014±0,007* 2,03±0,54 13,8±1,4*

( 3 день БЩЖ ) (8) (8) (8)

3 группа 0,038±0,015* 2,90±0,45 16,7±1,1

(4день БЩЖ) (7) (7) (7)

4группа 0,024±0,012* 2,94±0,57 17,5±1,9

(5 день БЩЖ) (6) (6) (6)

5 группа 0,026±0,015* 3,01±0,46» 17,51:1,7

(б день БЩЖ) (7) (7) (7)

6 группа 0,073±0,035 2,78±0,41 18,2±1,8

(7 день БЩЖ) (6) (6) (6)

Примечание. * р < 0,05 - достоверность различий с контрольной группой (критерий Дункана). В скобках -количество исследований.

При однократном введении КИ ТТГ снизился в 10 раз, причем снижение регистрировалось как через 24 часа, так и через 48 часов после введения. Снижение ТТГ сохранялось при двух, трех и четырех - кратных введениях КЙ. После пятикратных инсталляций КЙ ТТГ поднимался до уровня контроля.

Достоверный подъем 0Т3 наблюдался только при четырехкратном введении КЙ, перед нормализацией ТТГ. Достоверное снижение сТ4 было зарегистрировано через 48 часов после однократного введения КЙ.

Таким образом, при ЙИ БЩЖ наблюдалось снижение ТТГ в крови, длившееся в течение недели. Длительность реакции гипофизарно-тиреоидной системы соответствует литературным данным: еще в 1966 году был описан ребаунд-эффект при введении КЙ (кратковременный гипотиреоз, сменяющийся гипертиреозом, длящимся в течение недели) (Hall R., 1966). Однако при нашем исследовании было выявлено, что реакция щитовидной железы (гипертиреоз) присоединилась к гипофункции гипофиза только после четырехкратного введения КИ. Сочетанная реакция гипофиза и щитовидной железы предшествовала нормализации уровня ТТГ и тиреоидных гормонов при пятикратном введении КЙ

Изменения уровня ТТГ происходили на фоне монотонного уровня тиреоидных гормонов в течение первых трех суток, и следовательно вряд ли могли быть вторичными.

Таким образом, первично на введение КЙ отреагировал гипофиз, а реакция щитовидной железы наступила лишь на 4 - е сутки после начала введения препарата. Возможно, присоединение реакции щитовидной железы к реакции гипофиза на продолжающееся введение КЙ и явилось триггером для нормализации функции гипофизарно-тиреоидной системы.

Динамика изменений гормонов гипофизарно-гонадной системы показала, что при БЩЖ наблюдался персистирующий эструс (ПЭ): со второго дня БЩЖ в 3 раза снижался уровень прогестерона, с третьего дня БЩЖ отмечался рост ФСГ и ЛГ, с четвертого дня в 3 раза возрастал эстрадиол.

Особенностью ПЭ при ЙИ БЩЖ явились синхронное изменение ЛГ и прогестерона на 5 день БЩЖ - ЛГ снизился, а прогестерон - поднялся до уровня контрольных показателей. То есть, после 3-х кратного введения КЙ наблюдался! эффект «ускользания» гипофизарно-гонадной системы, однако последующее введение КИ вновь спровоцировало подъем ЛГ и снижение прогестерона. ФСГ и эстрадиол оставались монотонно высокими в течение 3-7 и 4-7 дней блокады соответственно.

При ребаунд-эффекте (7 день БЩЖ), в отличие от гипофизарно-тиреоидной системы, полноценной скачкообразной нормализации йод - индуцированного персистирующего эструса не наблюдалось: определялась нормализация только одного гормона - снизился уровень ЛГ. Вероятно, нормализация эстрального цикла после ИИ БЩЖ требует более длительного временного периода, чем восстановление функции тиреоидной системы.

0,8 0,7 0,6

1 °'4 1 0,3

од 0,1 о

0,65+0-25

13 олз+о.п

контроль 2 день БЩЖ ЗденьБЩЖ 4деаьБЩЖ 5 день ЕЩЖ бдеиьБЩЖ 7 день БЩЖ

—С—ФСГ -о- лг

Рис. 10. Динамика изменений ФСГ И ЛГ в крови самок-крыс при блокаде щитовидной железы.* р < 0,05-различия с контрольными данными (критерий Дункана).

94.5+10.7

\ \

- 62.4+14.1

\ 30.7+6.9* 48.0+11.9* 37.1+9J- . ^

4.9+2.2

. ^ • ^ 33.1+113« \ _ - " ~ " ____038J+12.9-

О 17.5+10.5» 16J+4.8*

.7+3.7 . - О......О- - . 9.4+4J _ . <> 16.6+3.6*

' ' -О-"" -

з.

о ..... -л -ЗЛ*!.». -О' *

контроль 2деиьБЩХ ЗденьБЩЖ 4дешБЩЖ 5 день БЩЖ 6 лень БЩЖ 7 день ЕЩЖ

- -О - эстрадиол нмоль/л —о — прогестерон пг/мл

Рис. 11. Динамика изменений эстрадиола и прогестерона в крови самок-крыс при блокаде

щитовидной железы.* р < 0,05 - различия с контрольными данными (критерий Дункана).

Результаты определения экспрессии тироидстимулирующего гормона в гипофизе иллюстрированы рисунком 12. Экспрессия ill в гипофизе постепенно снижалась со второго до пятого дня БЩЖ (достоверно - с третьего дня БЩЖ), затем скачкообразно выросла до уровня контроля на шестой день БЩЖ. Таким образом, БЩЖ сопровождалась постепенным снижением экспрессии ТТГ в гипофизе. Скачкообразный рост экспрессии ТТГ произошел за день до ребаунд-эффекта.

Результаты определения экспрессии натрий-йодного симпортера в щитовидной железе и гипофизе иллюстрированы рисунком 13.

Экспрессия НИС в щитовидной железе выросла достоверно в 2 раза по сравнению с контролем на 3 и 4 дни БЩЖ. Затем экспрессия НИС снизилась до

Рис.12 . Динамика изменений экспрессии ТТГ в гипофизе самок - крыс при блокаде щитовидной железы.* р < 0,05-рааличия с контрольными данными (критерий Дункана).

контроль гденьБЩЖ ЗдеиьБЩЖ 4 день БЩЖ 3 дань БЩЖ бданьБЩЖ 7дегьБЩЖ

нис

—О—щитовидная железа - -О - гипофиз

Рис 13.Изменения экспрессии НИС в щитовидной железе и гипофизе в различные дни блокады щитовидной железы * р < 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана) контрольного уровня на пятый день БЩЖ и достоверно ниже контрольных показателей - на шестой день. При ребаунд-эффекте на седьмой день БЩЖ экспрессия НИС поднялась до уровня контроля.

Экспрессия НИС в гипофизе достоверно скачкообразно выросла на второй день БЩЖ - более чем в 7 раз по сравнению с контролем. Снижение экспрессии НИС наблюдалось только на пятый день БЩЖ, однако более чем двукратное превышение уровня контроля сохранялось до ребаунд-эффекта.

В яичниках экспрессия НИС достоверно поднималась на 3 день БЩЖ (8,8±2,1), снижаясь до уровня контроля (4,3±0,9) на 4 и 5 дни (соответственно 4,4±1,2 и 3,5±0,9), имела тенденцию к росту на 6 день БЩЖ (7,6±2,2) и достоверно снижалась на седьмой, при ребаунд-эффекте (2,7±0,5).

Таким образом, при ИИ БЩЖ наблюдались изменения экспрессии НИС во всех органах, причем изменения экспрессии НИС в гипофизе начинались раньше, чем в щитовидной железе, и были более выраженными. Характер изменений

экспрессии НИС в яичниках отличался от вариабельности экспрессии НИС в гипофизе.

Результаты определения экспрессии каспазы 3 в щитовидных железах и гипофизах представлены в рисунке 14.

Экспрессия каспазы 3 в щитовидной железе постепенно выросла в течение первых пяти дней БЩЖ (достоверные различия с контролем были зарегистрированы на четвертый и пятый дни БЩЖ, затем снизилась до контрольного уровня при ребаунд-эффекте (7 день блокады).

В гипофизе экспрессия каспазы 3 на второй и пятый дни БЩЖ скачкообразно выросла в 14 и 13 раз по сравнению с контролем. На третий - четвертый и шестой - седьмой дни блокады наблюдалось некоторое снижение показателя.

В яичниках экспрессия каспазы 3 была достоверно выше контрольного показателя (1.5±0,5) почти на всем протяжении БЩЖ, поднимаясь со второго дня; однако на третий день БЩЖ наблюдалось кратковременное снижение до норматива (3.3±0,8).

Таким образом, при ЙИ БЩЖ наблюдались изменения экспрессии каспазы 3 во всех органах, причем изменения в гипофизе начинались раньше, чем в щитовидной железе, и были более выраженными (аналогично с изменениями экспрессии НИС). Характер изменений экспрессии каспазы 3 в яичниках отличался от вариабельности экспрессии каспазы 3 в гипофизе.

О,1»-0±5.5*

о 15.6+0.5*

контроль 2 день БЩЖ 3 день БЩЖ 4 день БЩЖ 5 день БЩЖ 6 день БЩЖ 7 день БЩЖ

каспаза 3

—^—щитовидная железа - О - гипофиз

Рис 14. Изменения экспрессии каспазы 3 в щитовидной железе и гипофизе в различные дни блокады щитовидной железы * р < 0,05 различия по сравнению с контролем (критерий Дункана)

Результаты количественного рентгеноспектрального микроанализа йода и селена в щитовидной железе и гипофизе самок-крыс при ЙИ БЩЖ приведены в таблицах 9 и 10.

Достоверные различия между уровнями йода в ЙПТ щитовидной железы и гипофиза были зарегистрированы в контрольной группе (уровень йода в ЙПТ щитовидной железы был в 8 раз выше, чем в гипофизе), в группе «6 день БЩЖ» (уровень йода в ЙПТ щитовидной железы был в 2 раза ниже, чем в гипофизе, снизившись до базального уровня йода в ЙПТ) и в группе «7 день БЩЖ»

(уровень йода в ЙПТ щитовидной железы был в 6 раз выше, чем в гипофизе; соотношение уровней йода в обоих органах вернулось к контрольным при ребаунд-эффекте).

Таким образом, при ЙИ БЩЖ изменения уровня йода в ЙПТ наблюдались в обоих органах: в щитовидной железе этот показатель снижался, а в гипофизе -повышался. Изменения уровня йода^ в гипофизе начинались раньше, чем в щитовидной железе: уровень йода в ЙПТ гипофиза достоверно повысился на 3 день БЩЖ, а в щитовидной железе достоверно снизился на 4 день БЩЖ. Важно отметить, что повышение уровня^ йода в ЙПТ гипофиза сопровождалось снижением процента гипофизарных ЙПТ.

Уровень селена в СеПТ и процент СеПТ в контрольной группе в щитовидной железе и гипофизе достоверно не различались. Эти данные соответствуют литературным данным о содержании селена в щитовидной железе и гипофизе крыс (Chanoine J, 1993, Thorlacius-Ussing О., 1988). При ЙИ БЩЖ изменения содержания селена наблюдались только в гипофизе - на 2 и 5 день блокады уровень селена в СеПТ гипофиза снижался ниже чувствительности метода определения.

„ Таблица 9. количественный ренгеноспектральный микроанализ (анализ точек) йода в щитовидной железе и гипофизе в различные дни блокады щитовидной железы._

Группы Щитовидная железа Гипофиз

ЙПТ (масс% х 102 с.в.) %ЙПТ ЙПТ (масс% х 10"2 с.в.) %ЙПТ

М±т Миним. Максим М±т Миним Максим.

Котпроль 16.7±3.0 2.6 59.0 100 2.2±0.3 0.2 6.3 65

2 день БЩЖ 11.6±2.9 2.7 32.9 100 4.7±0.6 3.2 6.3 83,3

3 день БЩЖ 9.3±1.9 0.5 40.2 100 7.2±1.2* 4.2 12.0 28

4 день БЩЖ 4.3±0.9» 0.9 11.5 100 5.6±0.9* 0.7 12.6 43.4

5 день БЩЖ 6.7±1.1* 1.6 12.6 83,3 6.2±1.7* 1.4 17.5 41.6

6 день БЩЖ 3.6±0.6 • 0.9 7.7 73,3 6.4±0.8« 0.4 11.9 42.8

7 день БЩЖ 23.7±5.9 0.1 57.2 91,6 3.6±0.7 2.1 9.8 62.5

* р < 0,05 - достоверные различия с контролем (тест Дункана).

Таблица 10.

Количественный ренгеноспектральный микроанализ (анализ точек) йода в щитовидной железе и гипофизе в различные дни блокады щитовидной железы.________

Группы Щитовидная железа Гипофиз

СеПТ (масс%х 10'2 с.в.) % СеПТ СеПТ (масс% х 10'2 с.в.) %СеПТ

М±т Миниы Максим. М±т Миним Максим.

Контроль 2.2±0.3 0.4 10.5 42.8 1.8±0.8 0.7 3.5 57.1

2 день БЩЖ 1.8±0.6 0.4 4.2 44.4 0« 0 0 0»

3 день БЩЖ 2.3±0.1 1.1 5.2 57.1 3.5±1.4 2.1 4.9 50.0

4 день БЩЖ 3.0±0.7 0.7 4.5 45.4 2.1±0.4 1.4 2.5 60.0

5 день БЩЖ 2.5±0.5 1.1 4.7 58.4 0» 0 0 0-

6 день БЩЖ 1.9±0.7 0.3 5.2 63.6 3.2±0.7 1.5 4.5 60.0

7 день БЩЖ 3.1±0.5 1.0 5.6 66.6 1.9±0.6 1.1 3.2 50.0

• р < 0,05 - достоверные различия с контролем (тест Дункана).

При анализе изменений йода и селена в щитовидной железе и гипофизе в комплексе с динамикой экспрессий ТТГ, НИС и каспазы 3 на протяжении ИИ БЩЖ были выделены следующие периоды (рисунок 15 и рисунок 16): Период 1. Старт БЩЖ — дестабилизация физиологических соотношений йода и селена в щитовидной железе и гипофизе (2 день БЩЖ). Снижение уровня йода в ЙПТ в щитовидной железе сопровождалось изменениями соотношения микроэлементов в гипофизе: повышением уровня йода в ЙПТ и первым снижением до нуля уровня селена в СеПТ. Так же в гипофизе повышались экспрессия НИС и экспрессия каспазы 3 и появляется тенденция к снижению экспрессии ТТГ.

Период 2. Период плато одинаковых уровней йода в ЙПТ щитовидной железы и гипофиза (3—4 дни БЩЖ). Плато одинаковых уровней йода в ЙПТ щитовидной железы и гипофиза сопровождалось плато повышения экспрессии НИС в обоих органах.

В гипофизе уровень селена в СеПТ на третий день блокады скачкообразно двукратно повысился по отношению к уровню контроля, а затем снизился до контрольного уровня. Изменения селена в гипофизе сопровождались двукратным снижением экспрессии каспазы 3 в гипофизе. Экспрессия каспазы 3 в щитовидной железе несколько повысилась, но эти изменения не отразились на уровне селена в щитовидной железе. Экспрессия ТТГ в гипофизе постепенно снижалась, и к четвертому дню блокады это снижение стало достоверным по отношению к контролю.

гастроль 2день БЩЖ Здеиь БЩЖ 4 день БЩЖ 5 день БЩЖ 6 день БЩЖ 7деш, БЩЖ

- О -ИПТЩ

-ИПТГ

—о - ттг

РисЛ5. Динамика изменений уровня йода в ЙПТ щитовидной железы (ЙПТЩ), ЙПТ гипофиза (ЙГПТ) ( масс% хЮ' с.в.) и экспрессии 111 в гипофизе ( РА<%)) на протяжении блокады щитовидной железы. * = р<0.05 по сравнению с кошролем, ••= р<0.05 по сравнению между ЙПТ щитовидной железы и гипофиза (критерий Дункана).

контрой. 2 день БЩЖ Здеш. БЩЖ 4 день БЩЖ 5 день БЩЖ 6 день БЩЖ 7 деть ЕЩЖ

—°— СеПТГ —•— каспаза 3

Рис. 16. Динамика изменений уровня селена в СеПТ гипофиза (СеПТГ) ( масс% хЮ"2 с.в.) и экспрессии каспазы 3 в гипофизе (РА%) на протяжении блокады щитовидной железы. * = р<0.05 по сравнению с контролем (критерий Дункана).

Период 3. Начало дестабилизации плато одинаковых уровней йода в ЙПТ щитовидной железы и гипофиза (5 день БЩЖ). Плато одинаковых уровней йода в ИПТ щитовидной железы и гипофиза сохранилось, однако в обоих органах снизилась экспрессия НИС.

В гипофизе наблюдалось второе снижение до нуля уровня селена в СеПТ, которое сопровождалось вторым скачкообразным ростом экспрессии каспазы 3 в гипофизе. В щитовидной железе экспрессия каспазы 3 выросла двукратно по сравнению с контролем, но уровень селена в СеПТ щитовидной железы не изменился. Однако процент СеПТ увеличился с 40% до 60 %. Это увеличение процента СеПТ в щитовидной железе сохранится на всем протяжении блокады, включая ребаунд-эффект. Экспрессия ТТГ в гипофизе снизилась двукратно по

сравнению с контролем, достигнув минимального значения на все^протяжении блокады щитовидной железы.

Период 4. Дестабилизация плато одинаковых уровней йода в ЙПТ щитовидной железы и гипофиза (6 день БЩЖ). Уровень йода в ЙПТ щитовидной железы снизился ниже уровня йода в ЙПТ гипофиза, достигнув «базисного уровня» йода в ЙПТ. Экспрессия НИС в щитовидной железе снизилась ниже контрольного уровня.

В гипофизе наблюдалось повторное сочетание двукратного роста уровня селена в СеПТ и снижения экспрессии каспазы 3. Экспрессия каспазы 3 снизилась и в щитовидной железе. Экспрессия ТТГ в гипофизе скачкообразно выросла до контрольного уровня.

Период 5. Ребаунд-эффект (7 день БЩЖ). Наблюдалась скачкообразная одновременная нормализация исследуемых показателей: уровень йода в ЙПТ и экспрессия НИС повысились в щитовидной железе и понизились в гипофизе до контрольных показателей.

Уровень селена в СеПТ гипофиза снизился до контроля. Экспрессия каспазы 3 в гипофизе осталась повышенной по сравнению с контролем. В щитовидной железе этот показатель от контроля не отличался. Экспрессия ТТГ в гипофизе так же соответствовала контрольному уровню.

Таким образом, при йод-индуцированной БЩЖ наблюдалась периодичность изменений уровня йода в ЙПТ как щитовидной железы, так и гипофиза. Однако эти изменения были разнонаправлены — в гипофизе этот показатель постепенно возрастал, затем скачкообразно снизился, в щитовидной железе постепенно снижался, затем скачкообразно вырос.

Интересно, что соответствие изменений экспрессии НИС изменениям уровня йода было различно для щитовидной железы и гипофиза и менялось в различные периоды блокады. В гипофизе изменения экспрессии НИС соответствовали изменениям уровня йода в ЙПТ в течение первых двух периодов (при начале блокады и при плато одинаковых уровней йода в ЙПТ щитовидной железы и гипофиза); в щитовидной железе - в течение четвертого периода (при дестабилизации плато одинаковых уровней йода в ИПТ щитовидной железы и гипофиза); и в обоих органах - при ребаунд-эффекте.

В отличие от экспрессии НИС щитовидной железы, изменения экспрессии ТТГ в гипофизе были синхронны и однонаправлены с изменениями уровня йода в ЙПТ щитовидной железы на протяжении периодов плато (первый - третий периоды).

Ключевым моментом в ребаунд-эффекте, по-видимому, явился четвертый период, когда на фоне синхронного снижения до минимума уровня йода и экспрессии НИС в щитовидной железе, наблюдался скачкообразный рост экспрессии ТТГ в гипофизе.

Изменения уровня селена при БЩЖ наблюдались только в гипофизе и сочетались с изменениями экспрессии каспазы 3: снижение уровня селена сочеталось с ростом экспрессии каспазы 3. Причем этот феномен наблюдался дважды - в первом и четвертом периодах блокады (при дестабилизация физиологических соотношений йода и селена в щитовидной железе и гипофизе и

при дестабилизации плато одинаковых уровней йода в 0ПТ щитовидной железы и гипофиза при блокаде).

В щитовидной железе этот эффект не наблюдался, однако одновременно с ростом экспрессии каспазы 3 в щитовидной железе процент СеПТ в щитовидной железе повышался на 50%.

Таким образом, ЙИ БЩЖ вызывала изменения уровня йода в ЙПТ как в щитовидной железе, так и в гипофизе, а уровня селена в СеПТ - только в гипофизе.

Изменения уровня йода в щитовидной железе более гармонировали с изменениями экспрессии ТТГ в гипофизе, чем с экспрессией НИС в щитовидной железе. Вариабельность экспрессии каспазы 3 наблюдалась в обоих органах, но была более выражена в гипофизе и ассоциировала с изменениями гипофизарного селена.

При анализе реакции гипофизарно-гонадной системы на БЩЖ можно сделать вывод о том, что наличие персистирующего эструса при йодной нагрузке, выявленное в первых двух этапах опытов с КЙ, было подтверждено и при моделировании БЩЖ. Однако при ребаунд-эффекте, в отличие от гипофизарно-тиреоидной системы, не наблюдалось полноценной скачкообразной нормализации йод - индуцированного персистирующего эструса: определялась нормализация только одного гормона - ЛГ (снижение). Показатели ФСГ, эстрадиола и прогестерона не отреагировали на ребаунд-эффект. Вероятно, нормализация эстрального цикла после БЩЖ требует более длительного временного периода, чем восстановление функции тиреоидной системы.

Первичная реакция яичника на ЙИ БЩЖ, вероятно, присутствовала - в виде активации местного апоптоза. Этот эффект имел как общие с щитовидной железой и гипофизом, так и индивидуальные особенности: в яичниках на начальных этапах развития БЩЖ активация апоптоза не была синхронна с изменениями маркера содержания йода в тканях - рост экспрессии каспазы 3 (2 день БЩЖ) предшествовал росту экспрессии НИС (3 день БЩЖ). В гипофизе и щитовидной железе активация апоптоза была синхронна с ростом НИС, но в гипофизе этот эффект наблюдался на 2 день БЩЖ, а в щитовидной железе - на третий.

Вариабельность вышеназванных показателей в яичниках на протяжении БЩЖ так же отличалась индивидуальностью. Основной индивидуальной особенностью реакции яичников на БЩЖ явилась длительная активация апоптоза, не прекратившаяся при ребаунд-эффекте при снижении экспрессии НИС. В гипофизе и щитовидной железе при ребаунд-эффекте экспрессия НИС и каспазы 3 нормализовались.

ВЫВОДЫ

1. Иод - индуцированная БЩЖ оказывает влияние не только на гипофизарно-тиреоидную, но и на гипофизарно-гонадную системы у самок-крыс.

2. КЙ как при однократном применении, так и при ЙИ БЩЖ (многократном введении КИ) вызывает персистирующий эструс у эутиреоидных самок-крыс

- при однократном применении длительность персистирующего эструса не превышает один астральный цикл;

- при многократном введении при ребаунд-эффекте полноценной нормализации персистирующего эструса не наблюдается. .

3. Определение с помощью РМА уровня йода в щитовидной железе и большинстве эндокринных органов крыс позволяет ввести понятие «базисного уровня» йода - уровня йода в ЙПТ большинства экстратиреоидных эндокринных органов крыс (исключая семенники).

4. Выраженность и характер изменений в щитовидной железе, гипофизе и яичниках при воздействии КЙ зависит не только от определенной пропорции между уровнем неорганического йода в крови и уровнем йода в щитовидной железе (феномен Вольфа - Чайкова), но и от определенной пропорции между дозой КЙ и «базальным уровнем» йода.

Понятие «базисного уровня» йода дает возможность провести дифференциацию внутри «малых доз» йодидов в зависимости от:

- направленности их воздействия на функцию щитовидной железы: при дозах КЙ, не превышающих «базисный уровень» щитовидная железа накапливает йод, при превышении этого показателя — теряет;

- выраженности воздействия на функциональную активность гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно- гонадной систем: при дозах КЙ, не превышающих «базисный уровень», реагируют гормоны крови, при превышении - экспрессия гипофизарных гормонов в гипофизе и экспрессия НИС щитовидной железы, гипофизов и яичников;

- дифференцированное™ воздействия на функциональную активность гипофизарно-тиреоидной и пшофизарно-гонадной систем: при дозировках КЙ не превышающих уровень йода в ИПТ щитовидной железы (4 мкг/100 г), активнее реагируют гипофизарные гонадотропины, при превышении указанного уровня — показатели гипофизарно-тиреоидной системы.

5. Изменения гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем при воздействии КЙ в малых фармацевтических дозах органоспецифичны, причем реакция экстратиреоидных органов (гипофиза и яичников) различна по активности. Гипофиз более чувствителен к воздействию КЙ, чем щитовидная железа и яичники, так как увеличение экспрессии НИС в гипофизе началось с дозы 4 mktKI/100 г, а в щитовидной железе и яичниках — с 8 мкг/100 г. При 25 мкгК1/100 г экспрессия НИС в яичниках не реагирует.

6. Воздействие КЙ в малых фармацевтических дозах связано с органоспецифической активацией каспазозависимого апоптоза:

- в щитовидной железе активация каспазозависимого апоптоза сочетается со снижением интратиреоидального йода;

- в гипофизе рост активности каспаз происходит на фоне увеличения уровня йода в ЙПТ (выявлена прямая зависимость между этими показателями) и снижения экспрессии тиреотропного гормона (выявлена обратная зависимость между этими показателями);

- в яичниках вышеописанная зависимость четко не просматривается; выявлена активация местного апоптоза при БЩЖ.

7. При ИИ БЩЖ при использовании дозы 8 мкгКШОО г первично на введение йодида калия реагирует гипофиз: уровень тиреотропного гормона в крови и его экспрессия в гипофизе снижаются после первого введения КЙ; изменения гормонов щитовидной железы проявляются только после четырехкратного введения КЙ.

8. Присоединение реакции гормонов щитовидной железы к реакции гипофиза на продолжающееся введение КЙ, возможно, является триггером для нормализации функции гипофизарно-тиреоидной системы, так как сочетанная реакция гормонов гипофиза и щитовидной железы предшествовала ребаунд-эффекту.

9. Нами подтверждена гипотеза о том, что при блокаде щитовидной железы интратиреоидальный йод снижается до критического уровня. Установлено, что «критический уровень интратиреоидального йода» - это «базисный уровень» йода: скачкообразный рост экспрессии ТТГ в гипофизе перед ребаунд-эффектом синхронен со снижением уровня йода в ЙПТ щитовидной железы до «базисного уровня». При настоящем исследовании не выявлено более низкого снижения уровня йода в ЙПТ щитовидной железы.

10. Выявлены изменения содержания селена в гипофизе при ЙИ БЩЖ: установлено, что при максимальных подъемах экспрессии каспаз (на второй и пятый дни БЩЖ) уровень селена в СеПТ гипофиза снижается за пределы чувствительности РМА.

11. Установлено, что содержание йода у женщин и самок - крыс видозависимо и органозависимо. Соотношение 2:1 соответственно характерно не только для щитовидной железы, но и для экстратиреоидных эндокринных органов (гипофиз, яичники). Уровень йода в ЙПТ в гипофизах у женщин 4-х кратно превышает соответственный показатель у самок-крыс.

12. Предложенная нами оптимизация пробоподготовки биологических субстратов для РМА (комбинация вакуумной и термальной сушки) позволила минимизировать потерю микроэлементов в исследуемых тканях при пробоподготовке.

Практическое использование полученных результатов 1. Полученные данные могут быть использованы для оптимизации доз КЙ, применяемых для профилактики поражения щитовидной железы при угрозе радиоактивного заражения.

2. Полученные данные могут быть использованы для профилактики нарушений репродуктивной системы у женщин при применении КЙ в качестве профилактики поражения щитовидной железы при угрозе радиоактивного заражения.

3. Полученные данные могут быть использованы при написании монографий, справочников по вопросам физиологических механизмов влияния КЙ.

4. Метод пробоподготовки биосубстратов для РМА (комбинация вакуумной (3 Ра) и термальной сушки (45 минут при 100°С) рекомендуется к применению в РМА.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Патенты

1. Басалаева H.JI. Способ лечения дисфункциональных маточных кровотечений при железисто-кистозной гиперплазии и полипах эндометрия./ Басалаева Н.Л.// RU Patent 2310459,2006.

2. Басалаева НЛ. Метод определения содержания йода в биосубстратах организмов./ Басалаева H Л., Михайлова Э.Н.. Казачков Е.Л, Сычугов Г.В.// RU Patent 2366952,2009.

Публикации в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК РФ

1. Басалаева Н.Л. Особенности влияния йодида калия на функциональные , параметры тиреоидной и репродуктивной системы самок — крысУ Басалаева

НЛ., Стрижиков В.К., Мифтахутдинов Н.Т., Сычугов Г.В.. Кузнецова Ю.М., Таужанова Т.В.// Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». -2010. -Т.195. -№19. -С.77-79

2. Басалаева НЛ. Особенности влияния различных доз йодида калия на функциональные параметры гипофзарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем самок-крысУ Басалаева НЛ., Стрижиков В.К., Мифтахутдинов Н.Т., Сычугов Г.В.. Кузнецова Ю.М., Таужанова Т.В.// Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». -2011. -Т.224. -№26. -С.72—75.

3. Басалаева НЛ. Особенности влияния многократного применения йодида калия на функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной системы самок - крыс У Басалаева НЛ., Стрижикова C.B., Рахманова Г.М., Коротеева Н.В.// Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». -2012. -Т.280. -№21. -С.63-65.

4. Басалаева НЛ. Содержание йода и натрий-йодного симпортера в яичниках самок-крыс при различных дозах йодида калия У Басалаева НЛ., Стрижиков В .К., Дружинина О.В., Сычугов Г.В...// Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». —2012. —Т.280. -№21. -С.66-69.

5. Басалаева H Л. Экспрессия каспазы 32 и каспазы8 в яичниках у самок-крыс при различных дозах йодида калияУ Басалаева H Л., Стрижиков В.К., Дружинина О.В., Сычугов Г.В..У/ Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». —2012. —Т.287. —№28. -С.67-69.

6. Басалаева НЛ. Особенности влияния различных доз йодида калия на содержание тиреотропного гормона и гипофизарных гонадотропинов в гипофизе и крови у самок-крысУ Басалаева Н.Л., Стрижиков В.К., Дружинина О.В., Сычугов Г.В., Кузнецова Ю.М..// Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». -2012. -Т.287. -№28. -С.69-73.

7. Басалаева НЛ. Содержание йода в щитовидной железе, гипофизе и яичниках у женщин и самок-крысУ Басалаева Н.Л., Стрижиков В.К., Дружинина О.В., Сабашвилли Э.М., Самойлова О.В.У/ Вестник ЮУрГУ, Серия

«Образование, здравоохранение, физическая культура». -2012. -Т.287. -№28. -С.79-83.

8. Басалаева H.JI. Динамика морфологических изменений при блокаде щитовидной железы/ Басалаева H.JI., Стрижикова С.В., Коротеева Н.В .//Вестник ветеринарии.-2013.-№64.-С.55-57.

9. Басалаева H.JI. Особенности влияния йод-индуцированной блокады щитовидной железы на функциональные параметры гипофизарно-тиреоидной системы самок-крыс./ Басалаева HJL, Исаев А.П., С.В. Стрижикова, Г.М. Рахманова, А.У. Шахеева.// Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». -2013. -Т.13.-№4.-С.78-81.

10. Басалаева H.JI. Влияние йод-индуцированой блокады щитовидной железы на экспрессию натрий-йодного симпортера и каспазы 32 в яичниках самок-крыс./ Басалаева H.JL, Исаев А.П.. В.К. Стрижиков, Г.В. Сычугов, А.У. Шахеева // Вестник ЮУрГУ. -2013, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура».—Т.13.-№4.-С.74-77.

11. Басалаева H.JL, Особенности влияния йод-индуцированной блокады щитовидной железы на региональную терморегуляцию самок-крысУ Исаев А.П. // Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». -2013. - Т.13.-№4.-С.90-93.

Публикации в зарубежных рецензируемых журналах

12. Basalaeva N.L. Signs of apoptosis in the pituitary, thyroid and ovaries of female rats after a single dose of potassium iodide./ Basalaeva N.L., Sychugov G., Miphtakhutdinov N.. Strizhikov V.// Endocr. Regul. - 2010. -V.44. -№3. - P. 83-89'

13. Basalaeva N.L. Expression of NIS in the thyroid and pituitary of female rats after a single dose of potassium iodide./ Basalaeva N.L., Sychugov G, StrizhikovV, Mikhailova E Jl Endocr. Regul. - 2011- V. 45. - P.23-28

14. Basalaeva N.L. Iodine concentration and signs of apoptosis in the thyroid and pituitary of female rats after different single doses of potassium iodide./ Basalaeva N.L., Sychugov G, StrizhikovV, Mikhailova E.// Endocr Regul - 2011 - V 45 P -183-190.

15. Basalaeva N.L. Iodine - induced thyroid blockade: role of selenium and iodine in thyroid and pituitary glands. /Basalaeva N.L.// Biol Ttrace Elem Res -2013. -154(2). —P.—244-254.

Публикации в научных журналах, сборниках, материалах конференций

16. Катачкова И.М. Информативность эхографии в оценке эффективности гормональной терапии гиперпластических процессов/ Катачкова И.М., Басалаева H.JL, Аксамидная Т.В .//Международный конгресс «Профилактика^ диагностика и лечение гинекологических заболеваний», Москва, 12-16 мая 2003г.: тезисы докладов,- М.,2003. - С.94.

17. Катачкова И.М. Особенности гормонального статуса у больных с хроническим сальпингоофоритом./ Катачкова И.М., Басалаева H.JI., Аксамидная Т.В.//2 съезд акушеров и гинекологов Челябинской области,

Челябинск, 25 октября 2005г.: сборник научно-практических трудов,-Издательство «РЕКПОЛ»,2005.-С.87-88.

18. Басалаева H Л.Оптимизация гормональной терапии гиперпластических процессов эндометрия с учетом состояния местного гормонального рецепторного статуса./ Басалаева HJL, Казачков ЕЛ., Сычугов Г.В.// Материалы Всероссийской научно-практической паталогоанатомической конференции, г. Миасс Челябинской области, 28-31 мая 2008г.- Издательство ЧелГМА, 2008.- С.202-203.

19. Басалаева H.J1. Роль состояния йодного обмена в слизистой оболочке матки в регуляции плотности рецепторов к половым стероидным гормонам эпителиоцитов эндометрия./ Басалаева H.JL, Казачков ЕЛ., Михайлова Э.Н., Сычугов Г.В У/ Вестник ЮУрГУ, Серия «Образование, здравоохранение, физическая культура». -2008. -Т.104. -№4. -С.53-55

20. Басалаева НЛ. Определение содержания йода в биосубстратах организмов количественным микрорентгеноспектральным методом У Басалаева НЛ., Михайлова Э.Н., Самойлова О.В., Казачков ЕЛЛ 22 российская конференция по электронной микроскопии, Черноголовка, 2-6 июня 2008 г.: тезисы докладов.- Издательство «Богородский печатник», 2008,- С.256.

21. Басалаева H.JI. Влияние йодида калия на морфологию щитовидной железы./ Басалаева Н.Л., Стрижикова C.B., Коротеева H .В 7/ Материалы юбилейной научно-практической конференции к 50-летию факультета ветеринарной медицины АГАУ, 100-летию со дня рождения М.С. Ржанициной, Барнаул, 11октября 2012г.- 2012, С. 3-5.

22. Basalaeva N.L. Iodine and selenium mapping in endocrine organs using wavelength-dispersive, spectrometry ./Basalaeva N.L7/ The Federation of the European Societies for Trace Elements and Mineral (FESTEM) fifth congress in Avignon from May 22nd to 24th, 2013, p.73.

Список сокращений

ЙИ БЩЖ - йод-индуцированная блокада щитовидной железы

ВДС - волновой дисперсионный спектрометр

ЙПТ — йод-позитивные точки

КЙ - калия йодид

ЛГ - лютеинизирующий гормон

НИС - натрий-йодный симпортер

РМА — рентгеноспектральный микроанализ

РФА - рентген-флюоресцентный микроанализ

СеПТ — селен-позитивные точки

Тз —трийодтиронин

Ti - тироксин

ТТГ - тиреотропный гормон ФСГ - фолликулостимулирующий гормон ЭДС - энергодисперсионный спектрометр % ЙПТ - процент йод-позитивных точек % Се ПТ- процент селен-позитивных точек

Подписано в печать 02.07.2014. Формат 60x90/16. Тираж 150 экз Усл. печ. л. 2,75. Заказ № 018. Набор компьютерный. Отпечатано ИП Петров А.И. Патент № 7447130000442. 454001, г. Челябинск, ул. Братьев Кашириных,108-а-64.

Информация о работе

Басалаева, Надежда Львовна
доктора медицинских наук
Курган, 2014
ВАК 03.03.01

Автореферат

Функциональное состояние гипофизарно-тиреоидной и гипофизарно-гонадной систем самок-крыс при влиянии йод-индуцированной блокады щитовидной железы - тема автореферата по биологии, скачайте бесплатно автореферат диссертации

Похожие работы