Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Исследование влияния естественного и синтетического антиоксидантов на функцию щитовидной железы белых крыс

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Исследование влияния естественного и синтетического антиоксидантов на функцию щитовидной железы белых крыс"

РГ6 Ол

па правах рукописи

КОНДРАТЕНКО Елена Игоревна

ИССЛЕДОВАНИЕ ВЛИЯНИЯ ЕСТЕСТВЕННОГО И СИНТЕТИЧЕСКОГО АНТИОКСИДАНТОВ НА ФУНКЦИЮ ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ БЕЛЫХ

КРЫС

Специальность 03.00.13 — физиология человека и животных

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Астрахань 1996

Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии человека и животных Астраханского государственного педагогического университета.

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Д.Л. Теплый

• Официальные оппоненты: доктор медицииских наук, профессор В.Г. Шаляпина доктор биологических наук, профессор Ю.А. Даринский

Ведущая организация — Санкт-Петербургский Институт эволюционной физиологии и биохимии И.М. Сеченова РАН

Защита диссертации состоится 24 декабря 1996 г. в 10 час. на заседании диссертационного совета К113.71.01 при Астраханском государственном педагогическом университете по адресу:

414000, Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке АГПУ по адресу: 414000, Астрахань, пл. Шаумяна, 1.

Автореферат разослан " ноября 1996 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук, доцент } У) В.Ф. Савин

Общая характеристика работы

Актуальность темы. Проблема влияния антиоксидантов на различные органы и функциональные системы человека и животных разрабатывается многочисленными исследователями как в России (Колосова, Куликов, Матаев, 1986; Сейфулла и соавт., 1990 и др.), так и в других странах мира (Yatauchi, Yadi, Kato, 1993; Reiter, 1995; MeClain at al, 1995 и др.). Известно, что работа функциональных систем организма во многом определяется состоянием тиреовдного гомеостата (Carrasco, 1993; Држевецкая, 1994; Чернышева, 1995 и др.), поэтому воздействие антиоксидантов на функцию щитовидной железы является актуальной проблемой. Анализ результатов исследований последних десятилетий позволяет считать, что "классические" регуляторные механизмы, которыми оперирует гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная система, в основном, выявлены (Поленов, 1979; Алешин и др., 1983; Красновская, 1994; Акмаев, 1995).

Остается недостаточно изученным влияние на них гуморальных факторов, которые способны не только изменять порог чувствительности рецепторов щитовидной железы к тиреотропину, но и непосредственно влиять на биосинтез и секрецию тиреоидных гормонов. К числу таких факторов относятся антиоксиданты.

Еще 25 лет назад Вейзером и сотр. (Weiser, Achterrath, Boguth, 1973) установлено, что дефицит природного антиоксиданта (витамина Е) у крыс сопровождается гипофункцией щитовидной железы. Авторы пришли к заключению, что действие витамина Е (а-токоферола) на щитовидную железу определяется не антиоксидантными, а какими-то специфическими свойствами. Однако до настоящего времени физиологические механизмы влияния и фармакодинамические эффекты а-токоферола на функции органов и тканей, в частности, на щитовидную железу, изучены недостаточно, а гиповитаминоз и, тем более, авитаминоз Е для человека не характерны. Поскольку а-токоферол активно применяется в клинике (Яхнина, 1978; Сейфулла и др., 1990; Бобырев, Почерняев и др., 1991), необходимость дальнейшего изучения влияния супрафизиологических доз витамина Е на щитовидную железу остается актуальной.

Существуют данные, свидетельствующие о различных результатах

влияния витамина Е на животных разного пола (Simonescu, 1974; Теплый, 1984). Как отмечает Т.Г. Анищенко (1991), «традиционным объектом в экспериментальной физиологии остаются мужские особи, в силу чего женские особи выпадают из поля исследований, в медицине представление о человеке вообще пока еще не уступило место дифференцированному подходу к лечению больного мужчины и больной женщины». Половые аспекты в изучении влияния антиоксидантов, в частности, витамина Е, становятся особенно актуальными, поскольку С. Leneses и М. Mezez (1982) обнаружили влияние половых стероидов на транспорт липидов и жирорастворимых витаминов (А, Е) у животных разного пола. Установлены половые различия в концентрациях а-токоферола в надпочечниках и печени крыс (Feingold, Colby, 1992). Уровень витамина Е у самок намного выше, чем в аналогичных органах самцов. Анализ литературы показал, что половые различия во влиянии витамина Е на щитовидную железу и механизмы её регуляции не исследованы, что и предопределило теоретическую и практическую значимость их изучения. Поскольку В.И. Кирпатовским и др. (1993), Г.В. Донченко и др. (1993), A. Azzi и J. Boscoboinic, at al (1995) обнаружены специфические свойства витамина Е, не связанные с его антиоксидантными свойствами, возникает необходимость исследовать специфическое влияние витамина Е на щитовидную железу, что может быть обнаружено при сравнении его действия с влиянием синтетического антиоксиданта.

Цель исследования — выявить роль антиоксидантов как модуляторов функциональной активности щитовидной железы белых крыс и особенности их участия в механизмах регуляции тиреоидного гомеостата у животных разного пола.

Для выполнения намеченной цели были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Изучить влияние супрафизиологических доз витамина Е и ионола на щитовидную железу и выявить особенности их действия, связанные с полом животных.

2. Выявить приоритетное звено тиреоидной системы, наиболее чувствительное к воздействию антиоксидантов.

3. Исследовать изменения тиреостатического эффекта мерказолила,

связанные с влиянием а-токоферола.

4. Изучить морфофункциональные изменения щитовидной железы, вызванные введением трийодтиронина на фоне действия природного и синтетического антиоксидантов.

5. Определить влияние антиокислителей на характер включения радиоактивного тимндина в ткань щитовидной железы.

6. Исследовать показатели перекисного окисления липидов печени самцов и самок белых крыс при введении трийодтиронина и при его совместном применении с антиоксидантами.

Научная новизна. Впервые изучено влияние супрафизиолгических доз витамина Е (а-токоферола) на функцию щитовидной железы п условиях эксперимента.

Экспериментально обосновано заключение о том, что в основе действия витамина Е на функцию щитовидной железы лежат преимущественно антиоксидантные, а не другие специфические свойства, поскольку выявлено принципиальное сходство в действии на щитовидную железу как витамина Н , так и синтетического антиоксиданта — ионола.

Впервые обнаружена гормонозависимость в реакции щитовидной железы белых крыс на действие антиоксидантов, определяемая полом животных.

На основании данных, полученных на экспериментальных моделях, доказано существенное модифицирующее влияние антиоксидантов разно]"! природы на действие мерказолила и трийодтиронина, характер которого различен у самцов и самок белых крыс.

Показана противоположная реакция антиоксидантной системы самцов и самок на воздействие трийодтиронина и зависимость этого показателя у самок от фазы эстрального цикла.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Действие повышенных концентраций природного и синтетического антиоксидантов на функцию щитовидной железы самцов и самок белых крыс характеризуется половыми различиями процессов, приводящих к гипотиреозу.

2. Развитие гипотиреондного состояния у самок под влиянием антиоксидантов связано с нарушением функции самой железы, в частности, с

торможением экзоцитоза гормональных продуктов в полость фолликулов. У самцов крыс в тех же условиях гипотиреоз развивается в результате нарушения периферической утилизации тиреоидных гормонов.

3. В основе действия витамина Е на щитовидную железу интактных животных и животных с экспериментально измененным тиреоидным гомеостазом лежат его антиоксидантные свойства.

Теоретическая и практическая значимость. В результате исследования была выявлена гормонозависимостъ в действии антиоксидантов на щитовидную железу, определяемая стероидным профилем животных, что дает основание расширить представление о связи функции щитовидной железы с репродуктивными процессами и роли в этом витамина Е. Полученные данные углубляют представления о механизмах действия антиоксидантов на щитовидную железу и важны для понимания роли биоантиокислителей во взаимоотношениях компонентов гипоталамо-гипофизарно-тиреоидной системы. Полученные нами данные вносят вклад в понимание роли природных антиоксидантов в цитофизиологии внутрисекреторных процессов и могут быть полезны для углубления представлений об общебиологическом значении антиоксидантной системы организма в регуляции секреторного процесса путем модификации функционального состояния эндокринной системы при изменении баланса в организме анти- и прооксидантов.

Материалы диссертации включены в курсы лекций по физиологии в Астраханском государственном педагогическом университете, Астраханской государственной медицинской академии и Российском государственном педагогическом университете (Санкт-Петербург). Практическая значимость результатов исследований состоит в учете возможных изменений тиреоидного гомеостаза при использовании антиоксидантов в терапевтических целях, в необходимости дифференцированного подхода при назначении антиокислителей в зависимости от пола. Полученные данные расширяют также теоретическую базу для применения антиоксидантов в ветеринарии и животноводстве.

Апробация работы. Основные результаты настоящего исследования доложены и обсуждены на итоговых научных конференциях Астраханского государственного педагогического института (1994 -1996); Всероссийской

конференции «Нейроэндокринология — 95»; семинаре лаборатории нейроэндокринологии Санкт-Петербургского института эволюционной физиологии и биохимии им. И.М. Сеченова РАН (апрель 1996); Международной конференции «Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов» (Астрахань, 1996).

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов, результатов собственных исследований, обсуждения и выводов. Общий объем диссертации /93 страниц с 2 3 таблицами и 34 рисунками. Список литературы включает источник, из них iSO иностранных.

Организация и методы исследования.

Характеристика использованного материала. Объектами исследования служили половозрелые самцы и самки крыс линии Wistar весом 180-230 гр. В работе использовано 140 животных. Крысы содержались в стандартных условиях вивария (самцы и самки раздельно). Для обеспечения стабильного гормонального фона все серии экспериментов выполнялись в весенне -летний сезон.

Характеристика экспериментов.

Всего проводили 3 серии экспериментов.

I серия опытов (50 животных). Изучали функциональное состояние щитовидной железы после 14-дневного введения per os 5%-ного масляного раствора D, L, а-токоферолацегата в дозе 2 мг /100 г массы тела, мерказолила в дозе 5 мг/100 г массы тела и сочетания: мерказолил + а-токоферол в указанных дозах. Антиоксидант, мерказолил и их сочетания вводили ежедневно в одни и те же утренние часы. Контрольная группа оставалась без воздействия.

П серия опытов (57 животных). Изучали функциональное состояние щитовидной железы после двухнедельного воздействия D, L, а-токоферолацетатом в дозе 2 мг/100 г массы тела, ионола в дозе 4 мг/100 г массы тела, трийодтиронина (Berlin Xemi). Антиоксиданты и трийодтиронин вводили per os. Введение гормона начинали через 5 суток от начала введения а-токоферола и ионола и продолжали до конца опыта при нарастании суточных

доз в арифметической прогрессии в течение 9 дней. Исходная доза — 0,03 мкг/100 г массы тела животного. Суммарная доза трийодгиронина на каждое животное группы, прлучавшей только гормон или гормон в сочетании с тем или иным антиоксидантом из расчета на 100 г массы тела, составляла 0,67 мкг за весь период опыта. Животным других групп вводили а-токоферол в сочетании с трийодтиронином или ионол в сочетании с тем же гормоном в указанных дозах.

III серия опытов (32 крысы). Изучали влияние а-токоферола и ионола, вводимых в дозах и по схеме предыдущих опытов, на интенсивность включения 3Н-тимидина в ткань щитовидной железы и на уровень обмена веществ по количеству выдыхаемого в единицу времени углекислого газа.

Во всех сериях опытов по ходу экспериментов и перед их завершением изучали вагинальные мазки (Кабак, 1968) для определения фазы астрального цикла. В опыт брали самок в период мета - и диэсгруса.'

При формировании групп каждой серии опытов животных с целью их выравнивания по показателю реактивности к воздействию подвергали предварительному тестированию по методу открытого поля (Кремневская и др., 1991; Измайлов, 1992; Судаков, 1992). Перед декапитацией крыс наркотизировали внугрибрюшинным введением 5%-процентного раствора хлоралгидрата (25 мг/100 г массы тела).

Критериями' оценки эффектов антиоксидантов, мерказолила и трийодгиронина, а также сочетаний тиростатика и гормона с каждым из антиоксидантов были:

а) относительная масса щитовидной железы;

б) уровень перекисного окисления липидов печени;

в) концентрация трийодгиронина (Тз) и тетрайодгиронина (Тч) в плазме

крови;

г) морфологические показатели секреторного эпителия щитовидной железы;

д) содержание нуклеиновых кислот в тироцитах;

е) электронная микроскопия секреторного эпителия щитовидной железы;

ж) интенсивность включения тимидина, меченного тритием, в ткань щитовидной железы;

з) уровень обмена веществ, определяемый по количеству выдыхаемого животным в единицу времени COj.

Гистологическая обработка материала. Морфометрия. После декапнтации щитовидную железу животного фиксировали в смеси Буэна (для выявления нуклеиновых кислот — в смеси Карнуа). Последующую заливку в парафин осуществляли обычным способом. Срезы толщиной 6 мкм, ориентированные по длине железы (срединная часть органа) окрашивали гематоксилином Гарриса - эозином. Для дифференцированной оценки содержания нуклеиновых кислот использовали методику A. Rogue, at al (1965). Проводили полуколичественную оценку содержания РНК цитоплазмы по методу B.JI. Быкова (1978). Морфометрию производили, используя негативы, полученные с помощью микрофотонасадки МФН - 11 у 4.2 при увеличении бООх. Негативы проецировали на экран комбинированного диапроектора типа «Экран-4» при фиксированном расстоянии от экрана. Измеряли высоту тироцитов (Нт), площадь ядра тироцитов (Sn), площадь фолликулярного коллоида (Sk). Площади ядра и коллоида определяли по формуле эллипсоида вращения s.—</ •</ • гДе di и — два перпендикулярных диаметра ядра или

4 I 2

просвета фолликулярной полости. Результаты выражали в условных единицах.

Электронная микроскопия'. Во второй серии опытов из щитовидной железы крыс вырезали кусочки объемом не более 1 мм3 и фиксировали в 2,5% растворе глютаральдегида. Далее обрабатывали по стандартной методике.

Радиометрия". По окончании опытов наркотизированным животным вводили через бедренную вену раствор метил-^Н-тимидина на физиологическом растворе'в объеме 0,5 мл/100 г массы тела животного. Через 40 минут крыс декапитировали, навеску ткани щитовидной железы растворяли в концентрированной азотной кислоте на водяной бане при 75*С, затем к каждой навеске прибавляли по 10 капель пергидроля и выдерживали на водяной бане до обесцвечивания, после чего прибавляли сцинтилляционную жидкость СЖ-106 в количестве 8 мл. Для обеспечения прозрачности проб

" Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам НИИ по изучения лепры зав. отд. электронной микроскопии, к.м.н. А.К. Маслову и зав. отд. радиологии к.м.н. Е.С. Балыб|шу за предоставленную возможность и помощь в проведении нсследованиП по теме диссертации. " Радиометрическое исследование выполнено совместно с аспирантом кафедры анатомии п физиологии АГПУ Котелышковим А.П.

использовали ТгИоп-ХЮО. Флаконы с пробами выдерживали 12 часов для снижения влияния на результаты хемилюминесценции. подсчет импульсов производили на сцинтилляционном счетчике «Бета-2» (с учетом фона). Число импульсов просчитывали 8 мк Кю и рассчитывали процент включения 3Н-тимидина по отношению к вводимой дозе на 1 мг сырого веса ткани.

Радиоиммунным методом определяли уровень тироксина (Т«) и трийодгиронина (Тз) в плазме крови. Определение проводилось в эндокринологической лаборатории Физиологического института им. акад. И.П. Павлова РАН.

Интенсивность процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по уровню малонового диальдегида (МДА) в гомогенатах печени, а также по скорости спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ (Владимиров и Арчаков, 1972; Хи, \Vatkins, а! а1,1995).

Содержание МДА в исходных гомогенатах печени выражали в нмоль МДА/0,05 г сырого веса печени, кинетические параметры — в нмоль МДА/час.

Интенсивность обмена веществ определяли по количеству поглощенного избытком 40%-ной щелочи (КОН) углекислого газа, выдыхаемого животным за 30 минут (Ещенко, 1981). После расчетов количество СОа выражали в л/100 г массытела животного.

Математическая обработка данных. Полученные данные обрабатывали статистически, все приведенные результаты представляют собой средние арифметические значения ± средняя ошибка (М±м); оценку

достоверности различий проводили с помощью ^критерия Стьюдента, критерия Я. Колмогорова-Смирнова.

Принятые сокращения и условные обозначения: ОМЖ — относительная масса щитовидной железы; Бп — площадь ядра тироцитов; Бк — площадь фолликулярного коллоида; Ш высота тироцита; АО — антиоксиданты; М — мерказолил; Т — экзогенный трийодтиронин; ПОЛ — перекисное окисление липидов; МДА — малоновый диальдегид; ТФ — витамин Е (а-токоферол); И — ионол; ГГТС — гипоталамо-гипофизарно-тиреоидная система.

Результаты исследований и их обсуждение.

1. Морфо-функцнональные изменения щитовидной железы самцов и самок белых крыс при введении витамина Б и ионола.

1.1. Изменение ги сто структурных и морфометрическнх показателем. Относительная масса щитовидной железы (ОМЖ) у самцов, получавших витамин Е (ТФ) и ионол (И), изменилась незначительно. Тиреоидные фолликулы содержали гомогенный оксифильный плотный коллоид, слабо вакуолизированный по периферии. АО способствовали уменьшению высоты тироцитов (НО и площади их ядер — Бп (рис. 1), под влиянием ТФ № уменьшилась на 21% в сравнении с контролем (р < 0,05), Бп на 31% (р < 0,0!) Под влиянием И Ш уменьшилась на 37% , а Бп — на 47% (р < 0,001 в обоих случаях).

Площадь коллоида (Бк) имела тенденцию к увеличению при введении как ТФ, так и И (р > 0,05).

После двухнедельного воздействия ТФ ОМЖ самок несколько увеличилась (на 7,5%, р > 0,05), а под влиянием И возросла на 35% (0,1 > р > 0,05). Паренхима железы отличалась от контроля менее интенсивной окраской

Цифровые обозначения: 1.4- ТФ; 2 - М; 3- ТФ+М; 5-И; 6- Ту. 7 - ТФ+ Т>; 8 -И+Тз Рис. 1. Изменение площади ядра тироцитов (у.е.2) под влиянием аитиоксидантов, мерказолила, трийодтиронина и их сочетаний (1-ая и 2-ая серии опытов). Результаты представлены в виде % по отношению к контролю, принятому за 100 %. Достоверность различий: *-р<0,05; **-р<0,01; *** - р<0,001 в сравнении с контролем: □□□ - р<0.001 в сравнении с мерказолилом; +++ -р<0,001 в сравнении с трийодтиронипом. и большей степенью вакуолизации коллоида. Ж под влиянием ТФ уменьшилась на 6,4% (р > 0,05), а под влиянием ионола — на 13,0% (р < 0,05).

Sit самок при введении АО практически не изменилась (р > 0,05). Sk при введении ТФ уменьшилась па 48,4% (1817,63 + 367,049 у.е.г, в контроле — 3524,64 + 284,23 у.е.2), а при введении И — на 64,93% (1236,14 + 105,345 ул.1 при действии И, 3524,64 + 284,23 у.с.2 — в контроле, р < 0,001 в обоих случаях).

Таким образом, анализ морфологических показателей выявил следующие особенности влияния антиоксидантов на щитовидную железу белых крыс: 1) ТФ и И оказали однонаправленное действие, причем эффект синтетического АО был более значительным; 2) влияние АО способствовало согласованному изменению комплекса морфометрических показателей. Была установлена зависимость этих изменений от пола животного.

1.2. Изменение содержания РНК цитоплазмы тироиитов. Гистохимически было обнаружено, что под влиянием ТФ содержание РНК в цитоплазме тироцитов увеличивается. РНК-специфичная окраска цитоплазмы тироцитов самок выявила характерное уплотнение зернистости в апикальных участках тироцитов белых крыс, получавших как естественный, так и синтетический АО. У самцов аналогичной картины выявить не удалось. С целью — выяснить природу обнаруженных различий и динамику функциональной перестройки цитоплазматических структур тироцитов под влиянием АО, было проведено электронно-микроскопическое исследование ткани щитовидной железы животных, получавших ТФ и И.

1.3. Особенности ультраструктуры тироцитов. Наиболее характерные изменения были обнаружены в апикальном отделе тироцитов. Под влиянием ТФ (в большей степени) и И произошло накопление секреторных гранул в субапикальной зоне клеток только у самок. Ультраструктура ядра и ЭПР свидетельствует об активном биосинтетическом процессе (что согласуется с результатами определения РНК), протекающем в фолликулярных клетках самок. Отмечена даже большая степень развития эндоплазматического ретикулума и увеличение количества рибосом. Можно полагать, что у самок при введении АО интенсивность биосинтеза не уменьшается, а выведение секреторных продуктов в полость коллоида угнетается.

У самцов обнаружены признаки ослабления резорбтивных процессов при введении И. Околоядериый эндоплазматический ретикулум преимущественно пластинчатого строении, слабо развитая складчатость базальной

плазматической мембраны. Таким образом, ультрамикроскопия ткани щитовидной железы выявила, во-первых, половые различия в реакции щитовидной железы на антиокислители, во-вторых, более выраженный эффект от действия синтетического АО.

1.4. Влияние ТФ и И на уровень тиреоидных гормонов в крови и интенсивность включения 3Н-тимидина в ткань щитовидной железы. Радиоиммунологически обнаружено увеличение концентрации тироксина в крови белых крыс-самцов под влиянием ТФ и И (0,1 >р > 0,05 в обоих случаях).При высокой вариабельности индивидуальных показателей уровня тиреоидных гормонов в крови самок средний показатель выявил незначительное уменьшение уровня гормонов в сравнении с контролем, это различие оказалось статистически недостоверным. Самцы Самки

Поглощение 'Н-тимидина тканью щитовидной железы

в

5

4

3

2

1

О

Контроль Витамин Е Ионол

Поглощение 'Н-тимидина тканью щитовидной железы

5 *_

4,5

4 тая

ЙЙ чМ

3,5 ня

3 и *

2,5 ---- в

2 • н

1.5 1 В

0,5 ■ к

п ЕШЯ кя

Контроль Витамин Е Ионол

Рис. 2. Включение - пшмидина в ткань щитовидной железы в условиях обо.-шцс.иия .¡рлшизми аштшксндантами (по вертикали - % включения (мккю на I л."! сырого веса по отношению к вводимой дозе изотопа). * - р<0,05; ** - р<0.01; *** -р<0.001 в сравнении с контролем.

. Радиометрия (рис. 2) показала, что ТФ снижает интенсивность включения 3Н-тимидина в ткань ЩЖ самцов (3,82 + 0,4% ; 5,33 + 0,65% — в контроле, р < 0,05). И оказывает однонаправленный, но более выраженный эффект, уменьшая процент включения метки у самцов до 2,68 + 0,36%, р < 0,01). У самок, напротив, ТФ вызвал значительное увеличение интенсивности поглощения метки (4,45 + 0,33%, 2,69 + 0,07% — в контроле, р < 0,001). Под влиянием И этот показатель увеличился более чем в 1,5 раза, при высокой вариабельности индивидуальных показателей, что позволило сделать вывод лишь о выраженной тенденции к увеличению интенсивности поглощения 3Н-тимидина в этих условиях.

1.5. Изменение интенсивности процессов ПОЛ. При изучении эффекта антиоксидантов на уровень свободнорадикальных процессов в организме животных оказалось, что ТФ и И оказывают характерное для них антиоксидантное действие, статистически значимое при введении АО самцам и самкам (рис.З).Так, при воздействии ТФ скорость спонтанного ПОЛ уменьшилась у самцов крыс на 77%,а у самок — на 69%.Менее выраженное действие оказал ионол: уменьшение спонтанного ПОЛ у самцов и самок составило соответственно 36% и 31,4% в сравнении с контролем, причем у самцов антноксидантный эффект ТФ и И был более выраженным, чем у самок белых крыс.

1.6. 'Изменение интенсивности обмена веществ. Под влиянием ТФ средний объем СОг, выдыхаемого животным за 30 минут пребывания в экспериментальной камере, значительно уменьшился, причем у самцов уменьшение объема СОг оказалось более выраженным: 0,08 + 0,0135 л — в контроле; 0,028 + 0,0034 л при действии ТФ, (р < 0,01), у самок — 0,09 + 0,003 л в контроле; 0,074+0,0048 л при действии ТФ, (р < 0,05). Аналогичный эффект на животных обоего пола оказал И.

Итак, результаты проведенных исследований выявили принципиальное сходство в действии на щитовидную железу биоантиоксиданта и синтетического антиокислителя. Имеющиеся различия, в основном, состоят в степени проявления эффекта, что вполне закономерно, поскольку в основе механизма действия испытываемых АО лежит реакция молекулы ингибитора с радикалами, ведущими цепи окисления (Владимиров и др., 1972 Сергеев, 1984).

Самцы

Самки

Изменение содержания малонового диальдегида

Изменение содержания малонового диальдегида

Рис. 3. Влияние витамина Е, ионола, трийодтиронина и их сочетаний на содержание МДА в исходном гомогенате печени белых крыс (по вертикали - концентрация МДА в нмоль/0,05 г сырого веса печени). * - р<0,05; ** - р<0,01; *** - р<0,001 в сравнении с контролем. + -р<0,05; ++ -р<0,01; +++ -р<0,001 в сравнении с трийодтиронином.

Различия в реакции щитовидной железы самцов и самок белых крыс на повышенные дозы антиоксидантов определяются, вероятно, разными механизмами. Так, у самок изменения морфологических, радиометрических и других показателей функционального состояния щитовидной железы при уменьшении уровня в крови тиреоидных гормонов свидетельствуют, по-видимому, об усилении тнреотропной стимуляции секреторной активности щитовидной железы, напоминающем тиреостатический эффект (Алешин и др., 1983; Олейник, Халангот и др., 1989).

Анализ полученных результатов позволяет предположить, что первичной мишенью действия АО на самок является щитовидная железа. Возможно, что при этом у самок нарушается процесс йодирования тироглобулина, протекающий по радикальному механизму (Таш^ а1, 1994). Поскольку витамин Е обладает свойствами «ловушки» свободных радикалов

(Владимиров и Арчакоп, 1972; Бурлаком, Храпова, 1986), то он, вероятно, может блокировать процесс иодировании. Воздействие АО приводит К возникновению нссоотвегсшия, между процессами биосинтеза и экзоцитоза секреторных продуктов в интралюминальпую полость, либо только к нарушению экзоцитоза. Известно (Tsunoda, 1993),что необходимым условием успешного экзоцитоза является внутриклеточный сигнал, зачастую инициирующий повышение концентрации свободного Са!+ в цитозоле. По данным О.Д. Левицкого(1990), E.H. Горбаня (1991),при введении животным АО уровень кальция в цитозоле снижается.

Вполне вероятно, что подавление экзоцитоза тиреоидных гормонов у самок в наших опытах связано с угнетением Са-завнсимых процессов.

Влияние АО па тнреоидной гомеостаз самцов носит иной, во многом противоположный, характер. Высота гнроцитов и площадь их ядер уменьшаются, площадь коллоида имеет тенденцию к увеличению. Изменение ультраструктурных, гистохимических и радиометрических показателей свидетельствует об ослаблении тирсотропной стимуляции у самцов, получавших повышенные дозы АО. При этом уровень тироксина в крови увеличивается. Несоответствие между морфометрическими и радиоиммунными данными становится вполне понятным, если предположить, что под воздействием ангиоксидантов изменяется скорость периферической утилизации тиреоидных гормонов. 15 литературе имеются данные о способности ТФ задерживать бпотраисформацню кортикостсроидов и, тем самым, поддерживать их концентрацию в крови на высоком уровне (Акимова, Лашманова, 1986). Обнаружено также (Inoue, Yamainoto, 1991),что жирные кислоты с длинной цепью, количество которых увеличивается под влиянием ТФ (Бурлакова, 1981), являются мощными ингибиторами ядерных рецепторов тиреоидных гормонов. Поскольку под влиянием как ТФ (в большей степени), так и ионола у самцов уменьшается обьем выдыхаемого в единицу времени СОг, имеет место значительный прирост массы тела животных, а концентрация тиреоидных гормонов и крови, наоборот, повышена, предположение о нарушении периферической утилизации гормонов щитовидной железы представляется более обоснованным. Таким образом, несмотря на разницу в механизмах действия АО на животных разного иола, проявившуюся в различии

результатов морфометрического и радиометрического анализов функционального состояния щитовидной железы, влияние АО, вне зависимости от их природы, имеет общий конечный результат — развитие гипотиреондного состояния.

2. Морфо-функциональные изменения щитовидной железы самцов и самок белых крыс под влиянием мерказолила (М) на фоне введения ТФ.

Воздействие мерказолилом вызвало характерный тиреостатический эффект у крыс обоего пола: достоверно увеличилась ОМЖ (р < 0,01 у самцов и р < 0,001 — у самок), резко увеличились показатели Ш и Бп(р <0,001), (рис I), а концентрация тироксина в крови уменьшилась до следовых количеств. ТФ. введенный совместно с тиростатиком, существенно модифицировал действие последнего. В этих условиях у самцов Ш увеличилась в большей степени (р < 0,05), чем при действии одного М (35,75 + 0,686 у.е. при введении М; 38,5+0,63 у.е. при введении ТФ и М; 25,82 + 0,39 у.е. — в контроле). У самок, напротив, при сочетанном применении М и ТФ наблюдалось значительное (р < 0,001) уменьшение Ш по сравнению с изолированным действием М (23,90 + 0,36 у.е. в контроле; 45,96 + 0,94 у.е. при введении М и 39,72 + 0,71 у.е. при введении ТФ и М). Совместное введение ТФ и М у самцов обнаружило увеличение Бп в степени, характерной для действия одного М (143,49 + 1,55 у.е.2 в контроле; 155,63 + 2,69 у.е.2 при введении М; 155,49 + 2,072 у.е.2 при введении ТФ и М). У самок при аналогичном воздействии увеличение Бп было выражено значительно слабее(р < 0,001),чем при изолированном действии М (123,7+2,05 у.е.2 в контроле; 167,37 + 3,26 у.е.2 при введении М; 141,44 + 1,84 у.е.2 при введении ТФ и М). Уровень тироксина в крови самцов и самок белых крыс при введении М на фоне ТФ (по сравнению с действием одного М) повышается у самцов (р < 0,01) и самок(0,1 > р > 0,05). Данные РИА согласуются с результатами морфометрии и свидетельствуют о том, что у самок происходит ослабление тиреостатического эффекта. Вероятно, реакция гипофиза в наблюдаемой закономерности не является первичной; аденогипофизарная стимуляция ослабляется в соответствии с менее значительным понижением уровня тиреоидных гормонов в крови. Возможно, что модифицирующее действие ТФ на тиреостатический эффект осуществляется либо путем нарушения периферической утилизации тироксина, что сопровождается

уменьшением его клиренса в крови, либо путем прямого ингибирования действия мерказолила на щитовидную железу. Таким образом, результаты опытов свидетельствуют о том, что в условиях предварительного четырехдневного введения ТФ щитовидная железа самцов оказывается более реактивной к действию тиростатика, чем у крыс, не получавших ТФ. Поскольку 14-дневное введение ТФ приводит к угнетению функции щитовидной железы самцов вследствие ослабления ее аденогипофизарной стимуляции, то, вероятно, к началу введения М тироциты самцов оказываются гиперсенсибилизированными к тиротропину, что подтверждается литературными данными о регуляции тиротропином аффинности собственных рецепторов в тироцитах (Morris, Bergert at al., 1993).Следовательно, на десятые сутки введения М реакция щитовидной железы оказалась более выраженной, чем при действии М на животных, не получавших ТФ. Это проявилось в несколько большем увеличении ОМЖ и Ht у самцов, получавших один тиростатик. Последнее обстоятельство свидетельствует о более интенсивной резорбции гормональных продуктов .вследствие чего уровень тироксина в крови по сравнению с действием одного М оказывается повышенным.

3. Морфо-функциональные изменения щитовидной железы белых крыс под шшшшем трийодтиронина на фоне введения естественного и синтетического антиокендантов.

Полученные данные свидетельствуют о тормозящем влиянии экзогенного трийодтиронина (ТЗ) на функцию щитовидной железы и о большей реактивности самок к действию экзогенного гормона по сравнению с самцами. Об этом говорит более выраженное уменьшение(по сравнению с контролем) уровня тироксина в крови самок. Поскольку в стадии мета- и диэструса происходит ослабление функциональной активности щитовидной железы (Самсонова и Бабичев, 1977), то вполне вероятно, что на этом фоне угнетающее влияние Тз на щитовидную железу самок оказывается более выраженным, чем у самцов. При введении самцам Tj на фоне АО (вне зависимости от их природы), Sn и Ht тироцитов самцов существенно уменьшились в сравнении с величиной этих показателей как в контроле, так и при введении крысам одного гормона (р < 0,001 во всех случаях). У самок, напротив, совместное воздействие Тз и АО способствовало увеличению Ht и Sn

по сравнению с величиной этих показателей в группе животных, получавших один Тз ( р < 0,001 во всех случаях). При совместном применении АО и Тз изменение уровня тироксина в крови соответствует изменению морфометрических показателей: у самцов введение Тз как на фоне ТФ, так и И привело к более значительному понижению уровня тироксина, чем при действии одного Тз (р < 0,05 в обоих случаях), а у самок обнаружилось увеличение уровня тироксина при совместном введении Т3 с И (р < 0,01) и Тз с ТФ (0,1 > р > 0,05) по сравнению с изолированным действием гормона.

Таким образом, в опытах с введением Тз была обнаружена существенная модификация эффектов Тз антиоксидантами. При этом обнаружилось, что АО ослабляют действие Тз на щитовидную железу самок. При изучении уровня ПОЛ в этой серии опытов оказалось, что Тз способствует уменьшению концентрации МДА в исходном гомогенате печени самцов (0,1 > р > 0,05), а у самок, напротив, она достоверно увеличилась (р < 0,01).

Характер изменения скорости спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ свидетельствует о выраженном антиоксидантном эффекте Тз у самцов и прооксидантном — у самок (скорости спонтанного и аскорбатзависимого ПОЛ увеличились у них соответственно на 32,9% и 24%). Однако при совместном воздействии на животных Тз и ТФ проявился четкий антиоксидантный эффект (р < 0,05), независимый от пола животных. Особенностью совместного применения в опытах синтетического АО ионола с Тз было ослабление эффекта гормона на скорость спонтанного ПОЛ в гомогенатах печени у самцов. У самок при исследовании скорости спонтанного ПОЛ в тех же условиях наблюдался выраженный прооксидантный эффект.

Сопоставление полученных данных с характером модификации тиростатического эффекта ТФ показало, что ТФ модулирует действие М и Тз, то есть веществ с различными механизмами действия — сходным образом. Причем характер модификации в обоих случаях зависит от пола животного. Сходный характер модификации может быть обусловлен единым механизмом действия антиоксидантов, а также тем обстоятельством, что под воздействием как М, так и Тз, уровень тироксина в крови крыс обоего пола понижается. Следовательно, конечным результатом различных механизмов их действия в наших опытах является гипотиреоидное состояние.

Результаты исследований показали, что эффекты АО на щитовидную железу зависят от пола животных. При попытке установить причины подобных различий мы сочли необходимым обратить внимание на следующие обстоятельства: во-первых, не исключена возможность различной реакции гипотапамо-гипофизарной системы самцов и самок белых крыс на введение АО (Теплый, 1984). Однако вопрос о причинно-следственных взаимоотношениях при формировании реакции гипоталамо-гипофизарной системы на введение естественных и синтетических АО совершенно не изучен из-за отсутствия информации о динамике изменений состояния ГГТС в процессе воздействия АО; во-вторых, известный факт о влиянии стероидных гормонов на процессы ПОЛ (Сергеев, 1984) делает весьма вероятным их участие в сложных механизмах регуляции этого процесса в организме животных.

В-третьих, обнаружены различия в метаболизме самого ТФ: оказалось, что его содержание в надпочечниках и печени самок намного выше, чем в тех же органах у самцов (Feingold, Golby, 1992). Все это указывает на необходимость постановки специальных экспериментов и дальнейшего углубленного анализа половых различий в действии витамина Е и других антиоксидантов на тиреоидный гомеостат и другие функциональные системы организма.

Выводы

1. В экспериментах на половозрелых линейных белых крысах обнаружена гормонозависимость в действии природного (витамин Е) и синтетического (ионол) антиоксидантов на комплекс показателей функционального состояния щитовидной железы. У самок животных антиоксидангы оказывают тиростатический эффект, сопровождающийся изменением морфометрических показателей, накоплением секреторных продуктов в апикальной зоне тироцитов (обнаруженном при ультраструктурных исследованиях), увеличением поглощения щитовидной железой тимвдина, меченного тритием. Уровень тироксина в крови самок при этом не изменяется, либо понижается, а у самцов, напротив, происходит повышение уровня тиреоидных гормонов в крови, торможение резорбтивных процессов и ослабление поглощения тканью щитовидной железы 3Н-тимидина.

2. Витамин Е существенно модифицирует тиростатический эффект мерказолила. Изменение гистоструктурных и морфометрических показателей функционального состояния щитовидной железы свидетельствует об ослаблении биоантиокислителем тиростатического эффекта у самок, при этом уровень тироксина в крови животных обоего пола при совместном введении а-токоферола и мерказолила повышается в сравнении с действием одного тиростатика.

3. Введение трийодгиронина по схеме, рекомендуемой при его клиническом применении (при соответствующей экстраполяции), сопровождается типичным для действия гормона подавлением функциональной активности щитовидной железы и уменьшением уровня эндогенного тироксина в крови. Щитовидная железа самок, исследованных в стадии мета- и диэструса, проявляет более высокую,чем у самцов;реактивность к трийодгиронину.

4. Влияние трийодгиронина на функциональное состояние щитовидной железы при совместном введении с антиоксидантами существенно отличается от действия одного трийодгиронина. Характер модификации зависит от пола животного: у самцов эффект трийодгиронина усиливается, а у самок -ослабляется, что выражается согласованным изменением гнсто-, ультраструктурных, морфометрических и радиоиммунных показателей функционального состояния щитовидной железы.

5. Природный антиоксидант — витамин Е в дозе 2 мг/100 г массы тела оказывает более выраженное антиокислительное действие, чем синтетический — ионол в дозе 4 мг/100 г.

6. Реакция антиоксидантной системы самцов и самок на воздействие трийодгиронина различна: у самцов трийодтиронин оказывает антиоксидантный, а у самок - прооксидантнын эффект. При совместном введении трийодгиронина и антиокислителей проявляется только антиоксидантный эффект.

7. Влияние витамина Е и ионола на показатели функционального состояния щитовидной железы сходно. В основе действия антиокислителей как на интактных животных, так и на животных с экспериментально измененным тиреоидным гомеостатом, лежат их антиоксидантные свойства.

8. Результаты опытов указывают на то, что витамин Е влияет на щитовидную железу не только непосредственно, но и опосредованно через изменение функции гипоталамо-гипофизарной системы, а также на уровне периферической утилизации тиреоидных гормонов.

Список публикаций по материалам диссертации

1. Калмыков А.П., Тёплый Д.Л., Кондратенко Е.И., Терентьев А.Е., Кузнецова Н.В. Сезонные и половые различия во влиянии витамина Е и ионола на частоту сердечных сокращений белых крыс // Тез. докл. итоговой науч. конф. АГПИ им. С.М. Кирова, 20-21 апр. 1994. -Астрахань: АГПИ, 1994. -Вып. 4. -С-57.

2. Кондратенко Е.И., Семернева Е.Б., Тёплый Д.Л. Влияние натурального и синтетического антиоксидантов на показатели функционального состояния щитовидной железы белых крыс // Тез. докл. итоговой науч. конф. АГПИ им. С.М. Кирова, 20-21 апр. 1994. -Астрахань: АГПИ, 1994. -Вып. 4. -С.58.

3. Кондратенко Е.И., Дерябина Т.В., Горден М.В. О нарушении баланса антиоксидантной активности и свободнорадикального окисления в плазме крови, белых крыс, вызванном длительным воздействием натурального и синтетического антиоксидантов // Тез. докл. итоговой науч. конф. АГПИ им. С.М. Кирова, 20-21 апр. 1994. -Астрахань: АГПИ, 1994. -Вып. 1. -С.59.

4. Кондратенко Е.И., Тёплый Д.Л., Морозова ГЛ., Горбачёв A.B. Морфометрическая характеристика изменений тиреоидной функции белых крыс, вызванных природным и синтетическим антиоксидантами // Тез. 4-й Всерос. конф. «Нейроэндокринология — 95». -СПб., 1995. -С.Зб.

5. Кондратенко Е.И. Морфо-физиологическое исследование щитовидной железы белых крыс в условиях её блокады мерказолилом, модифицированной антиоксидантами // Учёные записки. Матер, итоговой научн. конф. 20-21 апр. 1994. - Астрахань: Изд-во Астраханского пед. ин-та, 1996. -Ч.Ш. Естественные и физ.-мат. науки. -С. 10-20.

6. Тёплый Д.Л., Кондратенко Е.И. Электронно-микроскопические изменения ткани щитовидной железы белых крыс после воздействия антиоксидантами // Тез. докл. итоговой научн. конф. АГПИ им. С.М. Кирова, 23 апр. 1996. -Астрахань: АГПИ, 1996. -С.35.

7. Кондратенко Е.И., Волчкова О.И., Жукова O.K. Динамика эстрального цикла белых крыс при действии натурального и синтетического антиоксидантов //Тез. докл. итоговой научи, конф. АГПИ им. С.М. Кирова, 23 апр. 1996. -Астрахань: АГПИ, 1996. -С.38.

8. Кондратенко Е.И., Кузько О.П., Бисултанова Ж.И., Кузнецова Н.В. Качественная оценка изменения уровня РНК и ДНК в тнроцитах белых крыс под влиянием синтетического и натурального антиоксидантов // Тез. докл. итоговой научн. конф. АГПИ им.С.М. Кирова, 23 апр. 1996. -Астрахань: АГПИ, 1996.-С.39.

9. Кондратенко Е.И., Тёплый Д.Л., Маслов А.К. Экспериментальная оценка функционального состояния щитовидной железы белых крыс при введении антиоксидантов, трийодтироннна и их сочетаний // Учёные записки. Матер, докл. итоговой научн. конф., 28-29 апр. 1995. -Астрахань: Изд-во Астраханского пед. ун-та, 1996. -4.II. Есгест. и физ. мат. науки. -С.47-55.

10. Котельников A.B., Тёплый Д.Л., Балыбин Е.С., Кондратенко Е.И., Калмыков А.П. Влияние натурального и синтетического антиоксидантов на защитную и регуляторную функции гисго-гематических барьеров гипоталамо-гипофизарно-тиреодной системы // Учёные записки. Матер, докл. итоговой научн. конф., 28-29 апр. 1995. -Астрахань: Изд-во Астраханского пед. ун-та, 1996. -Ч.И. Есгест. и физ. мат. науки. -C.6V—CV

П.Кондратенко Е.И., Чинтимирова И.В., Тёплый Д.Л. Реакции щитовидной и паращитовидной желёз белых крыс на мерказолил и их модификация природным и синтетическим антиоксидантамк II Матер. Междунар. научн. конф., посвящ. 100-летию со дня рожд. проф. Н.В. Поповой-Латкиной («Структурные преобразования органов и тканей на этапах онтогенеза в норме и при воздействии антропогенных факторов. Проблемы экологии в медицине»). -Астрахань: АГМА, 1996. -С.91.

12. Кондратенко Е.И., Жижимова С.Н. Влияние витамина Е, иоиола, трийодтиронина и их сочетаний на уровень и кинетические характеристики перекисного окисления липидов // Тез. докл. Поволжской научн. конф. «Эколого-биологические проблемы Волжского региона Северного Прикаспия», 2-4 окт. 1996. - Астрахань: АГПИ, 19"'- п