Функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена К-ras мыши, связанных с развитием рака легких

Антонцева, Елена Вячеславовна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена К-ras мыши, связанных с развитием рака легких
ВАК РФ 03.00.15, Генетика

Автореферат диссертации по теме "Функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена К-ras мыши, связанных с развитием рака легких"

На правах рукописи УДК 575.224.22:577.214

Антонцева Елена Вячеславовна

ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ИНТЕРПРЕТАЦИЯ ЕДИНИЧНЫХ НУКЛЕОТИДНЫХ ЗАМЕН В ИНТРОНЕ 2 ГЕНА К-гаэ МЫШИ, СВЯЗАННЫХ С РАЗВИТИЕМ РАКА ЛЕГКИХ

03.00.15-генетика ,

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

НОВОСИБИРСК 2006

Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

доктор биологических наук Т.И. Меркулова

доктор биологических наук, Т.М. Хлебодарова

Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск

кандидат биологических наук А А. Бондарь

Институт химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, г. Новосибирск

Ведущее учреждение:

Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины РАМН г. Санкт-Петербург

Защита диссертации состоится »UûtsS^d 2006 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (3832)331278; e-mail: dissov@bionet.nsc.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.

Автореферат разослан « » Ок/ъДо/иЦ_2006 г.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Ученый секретарь диссертационного совета,

доктор биологических наук ——Груздев А.Д.

¿ооеА-

Актуальность темы. Ген K-ras является одной из наиболее перспективных моделей для изучения механизмов наследственной предрасположенности к развитию опухолей легких, поскольку он идентифицирован как ген, детерминирующий чувствительность к пульмоноканцерогенезу, и у человека и у экспериментальных животных. У мышей получено множество инбредных линий, различающихся по чувствительности к спонтанному и химически индуцированному раку легких. В результате генотипирования большого числа таких линий была установлена связь между единичными нуклеотидными заменами (Single nucleotide polymorphisms, SNPs) в интроне 2 гена K-ras и предрасположенностью к развитию опухолей легких. Показано, что у чувствительных к пульмоноканцерогенезу линий (A, GR, ICR) в позициях 288 и 296 п.н. относительно старта трансляции располагаются нуклеотиды С и А, у резистентных линий (AKR, DD, РТ, UT, СЗН, C57BL) - G и С, а у линии с промежуточным фенотипом (СВА)- С и С.

Поскольку имеются уже достаточно много данных об энхансерах, сайленсерах и отдельных регуляторных элементах, расположенных в ^ интронах генов, логично предполагать, что SNPs в интронах также могут

затрагивать регуляторные районы. В связи с этим изучение молекулярных механизмов, посредством которых SNPs в интроне могут оказывать влияние на фенотипические признаки, представляется весьма актуальным и перспективным направлением.

у гибридных мышей, полученных скрещиванием чувствительных и резистентных линий, было показано, что мутация происходит только в «чувствительном» аллеле этого гена, несмотря на полную идентичность нуклеотидной последовательности обоих аллелей в местах образования мутаций. Известен также феномен тканевой специфичности направленного мутагенеза. Например, под действием канцерогена уретана в печени и коже возникают мутации в 61-м кодоне гена #-га$, а в легких - в б 1-м кодоне гена К-гая. Такие закономерности дают основание думать об участии еще каких-то механизмов в обеспечении избирательности мутационного процесса. В частности, поскольку для гена К-гаь установлено, что чувствительность мышей разных линий к развитию рака легких коррелирует с БИР в его втором интроне, можно предполагать, что эти нуклеотидные замены могут приводить к специфическим, характерным только для чувствительного аллеля изменениям в структуре хроматина и/или конформации ДНК в районе 12-го и 13-го кодонов (экзон 1), что может способствать образованию аддуктов ДНК-канцероген и в последующем мутаций именно в этих позициях. Так как известно, что в формировании и/или поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК, можно думать, что сопряженные с чувствительностью к пульмоноканцерогенезу БИР затрагивают сайты связывания таких белков.

Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов, посредством которых единичные нуклеотидные замены во втором интроне протоонкогена К-гая могут влиять на формирование чувствительности к спонтанному и индуцированному раку легких у мышей, а также выяснение механизма высокой избирательности возникновения мутаций в кодоне 12 этого гена.

Задачи работы включали:

1) изучение влияния сопряженных с развитием рака легких мононуклеотдных замен в позициях 288 и 296 п.н. интрона 2 К-гав у М. ттси1т на связывание с ядерными белками и идентификацию транскрипционных факторов, взаимодействующих с полиморфным районом;

2) изучение влияния замены в позиции 311 п.н. интрона 2 К-га$, отличающей мышей устойчивого к пульмоноканцерогенезу вида М. зргеШз от чувствительных линий М.ти$си1ш, на связывание с транскрипционными факторами и их идентификацию;

3) изучение влияния различных вариантов ЭЫР на картину связывания ядерных белков с потенциальным композиционным элементом в начале интрона 2 гена К-газ, охватывающим область расположения всех трех сопряженных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен;

4) идентификацию белков экстракта ядер клеток легких, взаимодействующих с областью первого кодирующего экзона гена K-ras мыши, включающей кодоны 12 и 13, которые являются «горячими» точками возникновения мутаций в гене K-ras;

5) после того как нами были получены данные о том, что с областью локализации кодонов 12 и 13 гена K-ras мыши и с районом расположения связанных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен взаимодействуют транскрипционные факторы NF-Y и GATA-6, была поставлена также задача определения влияния пульмоноканцерогенов на активность этих факторов.

Научная новизна и практическая ценность работы. Впервые показано, что сопряженные с предрасположенностью к развитию рака легких у мышей SNPs во втором интроне гена K-ras являются потенциально регуляторными. Установлено, что CA вариант полиморфизма в позициях 288 и 296 п.н., характерный для чувствительных линий мышей вида M.musculus> соответствует комплексному сайту связывания транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6, а в случае "устойчивого" GC и "промежуточного" СС вариантов этот сайт оказывается разрушенным. Показано также, что в результате замены С—>Т в позиции 311 п.н. у мышей M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, происходит повреждение сайта связывания NF-Y и это отличает их от мышей чувствительных линий M.musculns. Полученные данные предполагают существование трех гаплотипов, определяющих предрасположенность к пульмоноканцерогенезу: двух устойчивых - GCC и CAT и одного чувствительного - САС.

Впервые продемонстрировано, что горячая точка мутагенеза в протоонкогене K-ras - область кодонов 12 и 13 - является сложным сайтом связывания белков NF-Y и GATA-б. Получены оригинальные данные о том, что под действием пульмоноканцерогенов 3-метилхолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) происходит усиление связывания факторов NF-Y и GATA-б с районом кодонов 12 и 13 и областью полиморфизма в начале интрона 2 гена K-ras, что является новым свидетельством вовлеченности регуляторных систем клетки в механизм действия химических канцерогенов.

Полученные результаты открывают новые перспективы для изучения молекулярных механизмов сайт-направленных генных мутаций, а также для развития представлений о роли регуляторных систем клетки в инициации и развитии канцерогенного процесса. Полученные данные также имеют значение для выяснения молекулярных основ генетической предрасположенности к пульмоноканцерогенезу.

Апробация работы. Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИЦиГ, на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003) и на международных

РОС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 3 БИБЛИОТЕКА

С.-Петербург ОЭ №Ьакт£{>9

конференциях: "Физико-химическая биология" (Новосибирск, 2006); "Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine" (Novosibirsk, 2006); "Genome Sequencing & Biology" (New York, 2001); "Mathematics and Engineering Techniques in Medicine and Biological Sciences" (Las Vegas, 2001).

Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ.

Структура н объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, результатов и обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Диссертация изложена на 108 страницах, содержит 21 рисунок. В списке литературы приводится 141 работа.

Работа проводилась при финансовой поддержке грантов РФФИ №№ 01-04-49860 и 04-04-48136.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В работе использовали 0,5-3 месячных мышей устойчивых к пульмоноканцерогенезу линий C57BL/6J, СЗН/А, AKR, DD и чувствительных линий ICR, А/Не, GR разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Геномная ДНК мышей M.spretus была любезно предоставлена Евгенией Пак (NIH, USA). Связывание ядерных белков с участками гена К -ray и ДНК-связывающую активность факторов транскрипции в экстрактах ядер изучали методом задержки ДНК-пробы в геле. Двуцепочечные олигонуклеотиды, используемые в качестве ДНК-проб были синтезированы зав. сектором химии нуклеиновых кислот В.Ф. Кобзевым, ИЦиГ СО РАН. Фрагменты длиной 84 п.н. были получены с помощью метода ПЦР с праймеров KE-Up и KE-Low. Экстракты ядер получали согласно (Gorski et ah, 1986) в модификации (Shapiro et al., 1988). Идентификацию факторов транскрипции осуществляли с использованием специфических антител "Santa Cruz Biotechnology Inc.". Содержание факторов транскрипции в ядерных экстрактах оценивали методом Вестерн-блот гибридизации, для визуализации результатов использовали ECL-систему фирмы "Amersham".

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Изучение связывания ядерных белков с районом локализации сопряженых с развитием рака легких однонуклеотидных замен в интроне 2 гена K-ras мыши.

Предрасположенность мышей к раку легких определяется тремя генетическими локусами, имеющими общее название Pas (pulmonary adenoma susceptibility). Известно, что локус Pasl расположен на хромосоме

б и включает ген K-ras. Исследования на трансгенных мышах показали, что наличие мутаций в кодонах 12, 13 и 61 протоонкогена K-ras приводит к трансформации клеток и развитию различных опухолей, включая опухоли легких. Кроме того, известно, что различная чувствительность инбредных линий мышей к развитию аденом легкого сопряжена с однонуклеотидными заменами (SNPs), в начале интрона 2 ген K-ras в позициях 288 и 29б п.н. относительно старта трансляции. Так у мышей чувствительных линий в указанных позициях стоят нуклеотиды С и А, соответственно, у резистентных линий - G и С, а у линий с промежуточным фенотипом - С и С (Chen et al., 1994; Тимофеева и др., 2002).

Мы предположили, что наблюдаемые нуклеотидные замены могут затрагивать участок связывания какого-либо регуляторного белка. Для проверки этого предположения, олигонуклеотиды, соответствующие трём аллельным состояниям участка от 278 до 307 п.н. относительно стартового кодона гена K-ras мыши (СА, СС и GC олигонуклеотиды, Рис. 1А), были использованы в экспериментах по задержке в геле белками ядерного экстракта легких мыши. Оказалось, что картина связывания в случае СА варианта SNPs существенно отличается от таковой для GC и СС вариантов наличием мощной полосы задерйски, соответствующей комплексу СА олигонуклеотида с неким белком/белками (Рис. 1Б).

д\. СА: 5'-cagtGTGCAAGAAA СГССАСТТ ATCATGAGAGCT-3' ' GC: 5'-cagtGTGCAAGAAASrCCACTTCrCATGAGAGCT-3' CC:5'-cagtGTGCAAGAAACrCCACTTCTCATGAGAGCT-3'

СА СС GC

!» •

Рис. 1. А) Последовательности олигонуклеотидов, охватывающих область от 278 до 307 п.н. интрона 2 гена K-ras и воспроизводящих "чувствительный" СА, "промежуточный" СС и "устойчивый" GC аллели. Мононуклеотидные замены подчеркнуты.

Б) Связывание белков экстракта ядер клеток легких J,

мышей с олигонуклеотидами СА (1,2), СС (3,4) и GC (5, 6). 1, 3, 5- свободный зонд; 2, 4 ,6- связывание белков экстракта ядер клеток легкого с олигонуклеотидами.

С помощью компьютерного метода распознавания сайтов связывания факторов транскрипции Пономаренко М.П. из лаборатории теоретической генетики ИЦиГ СО РАН, было сделано предположение, что СА вариант SNP приводит к образованию сайта связывания транскрипционного фактора семейства GATA. В результате экспериментов по задержке ДНК-пробы в геле в присутствии конкурентных олигонуклеотидов, соответствующих природным сайтам связывания белков GATA и Ets (контроль), а также антител против GATA-б (основного

представителя семейства GATA в легких) мы полностью подтвердили данное предположение (Рис. 2). Таким образом, "чувствительный" СА-вариант SNP интрона 2 гена K-ras соответствует сайту связывания фактора транскрипции GATA-6, а в случае "устойчивого" GC и "промежуточного" СС вариантов этот сайт разрушен.

Рис. 2. Идентификация белка, образующего комплекс с олигонуклеотидом СА. 1- подвижность свободного зонда в геле; 2- связывание зонда с белками экстракта ядер клеток легких; 3, 4, 5-связывание после инкубации экстракта ядер с антителами к белку GATA-6 (2, 3 и 4 мкг антител соответственно); 6-связывание в присутствии ЮОх I избытка олигонуклеотида GATA: 7- связывание в К. присутствии 1 ООх избытка олигонуклеотида Ets.

конкуренты Антитела к <-»

GATA-6

Поскольку GATA-б является ключевым фактором в дифференцировке легочной ткани и тканеспецифической регуляции экспрессии генов в легких можно думать, что наблюдаемые различия в связывании этого фактора с разными аллельными состояниями интрона 2 гена K-ras имеют отношение к формированию чувствительного или устойчивого к пульмоноканцерогенезу фенотипа. Однако, обнаружение "чувствительного" СА варианта SNP в интроне 2 гена K-ras у мышей другого вида - M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, поставило под сомнение саму мысль об участии этого полиморфизма в формировании предрасположенности к канцерогенезу в легких (Mancnti et al., 1995). Но мы обратили внимание, что у M.spretus в непосредственной близости от уже известных SNPs в позициях 288 п.н. и 296 п.н., приводящих к появлению или исчезновению сайта связывания фактора GATA6, имеется ещё одна мононуклеотидная замена С (M.muscuius) —* Т (M.spretus) в позиции 311 п.н., характерная для этого вида. Мы предположили, что эта замена также может затрагивать сайт связывания какого-то фактора транскрипции, и таким образом может быть связана с устойчивостью к раку легких M.spretus. Методом задержки ДНК-зонда в геле было показано, что замена С (олигонуклеотид 311-mus) —► Т (олигонуклеотид 311-spret) в позиции 311 п.н. интрона 2 гена K-Ras, приводит к ослаблению наименее подвижной полосы задержки (Рис. ЗБ), т.е. SNP, характерный для M.spretus, ухудшает сайт связывания некого транскрипционного фактора.

В результате компьютерного анализа нуклеотидных последовательностей для олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret с помощью пакета программ TESS в качестве кандидатов на связывание с

этим участком были отобраны транскрипционные факторы NF1, LKLF и NF-Y. Из рисунка 3 Б видно, что добавление к реакционной смеси в качестве конкурентной ДНК олигонуклеотидов соответствующих известным сайтам связывания NF1 и LKLF в ЮОх избытке не меняет картины связывания. В то время как уже 50х избыток олигонуклеотида, содержащего сайт связывания фактора NF-Y приводит к существенному ослаблению полосы, различающей картины связывания для 311-mus и 311-spret. Эксперименты с использованием антител к NF-Y подтвердили, что верхняя полоса задержки действительно соответствует комплексу транскрипционного фактора NF-Y с олигонуклеотидами 311-mus/311-spret. Таким образом, наличие Т в позиции 311 п.н. у M.spretus приводит к заметному ослаблению сайта связывания NF-Y, по сравнению с М. musculus.

А)

311-mus: 5'-cagtTCATGAGAGCTCAC CACAGAGAAAGAAAGT-3' 311-spret: 5'-cagtTCATGAGAGCTCAC IACAGAGAAAGAAAGT-3'

Рис, 3. А) Последовательности g> олигонуклеотидов, охватывающих область от 297 до 326 п.н. нитрона 2 гена K-ras мышей a«mo>nf-y - + вида M.musculus и вида M.spretus. 50*r^"_Y + -Монету клеотидные замены подчеркнуты •

Б) Идентификация белка, образующего комплекс с олигонуклеотидами 311 -mus (1, 2, 3. 7, 8, 9) и 311 -spret (4, 5, б). 1, 4, 7-связывание соответствующих олигонуклеотидов с белками экстракта ядер клеток легких: 2, 5- связывание в присутствии 50х избытка олигонуклеотида NF-Y; 3, б- связывание после инкубации экстракта ядер с антителами к белку NF-Y.5, Р- связывание в присутствии 1 ООх избытков олигонуклеотидов LKLF и Nfl.

<t «у

311-mus 311-sprot

311-ти

Вследствие близкого расположения выявленных нами в начале интрона 2 гена K-ras сайтов связывания транскрипционных факторов GATA-б и NF-Y, мы предположили, что они образуют более сложную регуляторную единицу - композиционный элемент. В пользу такого предположения свидетельствует также обнаружение подобных регуляторных единиц, образованных сайтами связывания NF-Y и GATA-6, в других генах (Peng, Jahroudi, 2003).

Для исследования предполагаемого регуляторного элемента с геномной ДНК мышей чувствительной линии ICR и устойчивой линии DD вида M.musculus, а также устойчивого вида M.spretus методом ПЦР с праймеров KE-Up и KE-Low (рис. 4А) были амплифицированы последовательности длиной 84 п.н. (далее ICR, DD и SPRET) охватывающие область расположения этих сайтов. Оказалось, что при

задержке таких фрагментов в геле белками ядерного экстракта во всех трех случаях наблюдаются разные картины связывания (Рис. 4Б), т.е. наличие SNPs, отличающих чувствительных животных от устойчивых, влияет на формирование белковых комплексов с этим районом. Видно, что при использовании ампликона SPRET происходит исчезновение полосы 5, наблюдаемой в случае ICR и DD, и появление двух других- 7 и 8. Кроме того, меняется интенсивность ряда других полос. С помощью программы Gel-pro 4.0 мы оценили интенсивность полос, присутствующих во всех трех случаях. За единицу была взята интенсивность полосы 1 в соответствующей дорожке. В случае фрагмента DD происходит усиление комплексов со 2-го по б-ой по сравнению с ICR в 1,5-2,2 раза в зависимости от полосы. Заметим, что в случае ампликона SPRET интенсивность комплексов 2, 3, 4 и 6 также ослаблена по сравнению с таковой в случае DD и напоминает ICR вариант. Сходство этих полос задержки в картине связывания между SPRET и ICR может быть объяснено наличием у них СА варианта SNPs в позициях 288 и 296 п.н.

Наиболее показательным является эффект однонуклеотидной замены в 311 позиции, отличающей мышей вида M.spretus от M.musculus. Ранее, при исследовании влияния этой замены на связывание с белками ядерного экстракта легких в составе олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret (длиной 30 п.н.), были получены данные лишь об ухудшении связывания последнего с фактором транскрипции NF-Y (Рис. ЗБ). В случае же более длинных фрагментов отличия становятся радикальными (одна полоса исчезает, появляются две новых). Следовательно, можно полагать, что значительно более существенное изменение в картине связывания в случае ампликона SPRET (длиной 84 п.н.) является результатом сложного взаимодействия факторов транскрипции, как с последовательностью ДНК, так и друг с другом. Это служит косвенным доказательством наличия в данном районе композиционного регуляторного элемента.

1 2 3 4 5 6

Антитела к NF-Y - + - + - +

12 3 4 5 6

+ - + . +

Рис. 4. Связывание белков экстракта ядер клегок легких с ампликонами SPRET (/, 2), ICR (3, 4) и DD (5, 6) и

влияние антител к КТ-У. А) и Б) разное время экспозиции с рентгеновской пленкой. 1, 3. 4-связывание фрагменюв с ядерными белками: .?, 4, б- связывание при

добавлении антител kNF-Y. А)

Б)

Эксперименты с использованием антител к NF-Y показали, что комплекс 2 образован этим белком (Рис. 4). Представляется удивительным, что этот комплекс не ослаблен в случае ампликона SPRET, тогда как ранее при использовании коротких фрагментов ДНК интрона 2 гена K-ras (297/326 п.н.) (Рис. ЗБ), нами были получены данные о повреждении NF-Y сайта у М. spretus. В связи с этим мы предположили, что в составе длинных фрагментов имеется еще один, возможно более сильный, сайт связывания данного транскрипционного фактора. Этот дополнительный NF-Y сайт был экспериментально найден в составе CA олигонуклеотида (278/307 п.н.) (Рис. ' 5), где, как оказалось, он перекрывается с сайтом связывания GATA-6 (Рис.

2). Поскольку добавление антител как к GATA-6, так и к NF-Y приводит к 1 полному исчезновению комплекса, представляется вероятным, что

ь связывание этих транскрипционных факторов с районом от 278 до 307 п.н.

интрона 2 гена K-ras мыши носит взаимозависимый характер.

Полученные данные позволяют предполагать, что у мышей чувствительных линий M.musculus в интроне 2 имеется регуляторный композиционный элемент, образованный двумя NF-Y сайтами и одним сайтом для GATA-6, а связанные с устойчивостью к пульмоноканцерогенезу SNPs разрушают его различные компоненты.

Рис. 5. Идентификация'сайта связывания транскрипционного фактора NF-Y внутри олигонуклеотида CA. /- связывание олигонуклеотида CA с белками ядерного экстракта легких^ -связывание с экстрактом в присутствии антител к NF-Y; 3- в присутствии 50х избытка олигонуклеотида. соответствующего сайту связывания NF-Y.

1 Это находит отражение в существенном усложнении картин

связывания ядерных белков с более длинными участками интрона 2 (ампликонами) (Рис. 4), по сравнению с олигонуклеогидами, входящими в их состав (Рис. 1Б, ЗБ). Так, последовательности ампликонов ICR и DD, как и последовательности ранее исследованных олигонуклеотидов (CA и GC, 30 п.н.), отличаются лишь двумя мононуклеотидными заменами, соответствующими позициям 288 и 296 п.н. в интроне 2 гена K-ras. Однако, если CA олигонуклеотид в отличие от GC олигонуклеотида образует мощную дополнительную полосу задержки за счет связывания с GATA-6 и NF-Y, то включающий этот олигонуклеотид более протяженный фрагмент ICR, напротив, характеризуется выраженным ослаблением полос задержки по сравнению с DD (Рис. 1Б и Рис. 4). Однонуклеотидная замена в позиции 311 п.н., отличающая мышей устойчивого вида М. spretus от мышей

устойчивых и чувствительных линии М. muscitlns, при исследовании в составе олигонуклеотидов 311-mus и 311-spret приводит к существенному ослаблению сайта NF-Y, тогда как в ампликона SPRET такого ослабления не заметно (Рис. ЗБ и Рис. 4). Известно, что в результате связывания фактора транскрипции NF-Y с ДНК происходит изгиб двойной спирали на 60-80° в зависимости от фланкирующей последовательности (Liberati et al., 1998). Такие изменения в конформации ДНК могут влиять на доступность сайтов для других белков ядерного экстракта. Наличие же двух рядом расположенных сайтов связывания NF-Y в случае ICR может приводить 1) к компенсаторному эффекту за счет двойного изгибания ДНК, 2) механическим затруднениям в посадке этих факторов.

Таким образом, комбинация нуклеотидных замен С (288п.н.), А (296 п.н.) и С (311 п.н.) в интроне 2 гена K-ras у мышей предрасположенных к пульмоноканцерогенезу линий вида М. musculus формирует потенциальный композиционный элемент, содержащий два сайта связывания NF-Y и один сайт связывания GATA-6. SNPs, присущие устойчивым линиям М. musculus (G 288 п.н. и С 296 п.н) или устойчивому виду М. spretus (Т 311 п.н.) разрушают различные компоненты этого композиционного элемента: GATA-6 сайт у М. musculus и NF-Y сайт у М. Spretus (Рис. 9). Связывающиеся с выявленными сайтами факторы транскрипции, по видимому, находятся в сложной системе взаимодействий (как синергических, так и антагонистических) между собой, а также с другими белками, которые могут взаимодействовать с данным районом. По-видимому, любое изменение в связывании индивидуальных факторов транскрипции в этом регуляторном узле может приводить к существенным изменениям в этих взаимодействиях, что находит косвенное отражение в связи различных SNPs в районе от 278 до 307 п.н. интрона 2 гена K-ras мыши с чувствительностью/устойчивостью к пульмоноканцерогенезу. Видимо, в данном случае можно говорить о существовании трех гаплотипов: двух устойчивых GCC и CAT и одного чувствительного к развитию рака легких САС.

Идентификация транскрипционных факторов, взаимодействующих с областью 12-ого кодона гена K-ras мыши.

У мышей, как и у человека, мутации гена K-ras наблюдаются преимущественно в кодонах 12, 13 и 61, причём как в спонтанных, так и химически индуцированных опухолях, включая опухоли лёгких. Предполагается, что избирательность образования аддуктов ДНК-канцероген в кодоне 12 может быть связана как с особенностями первичной структуры ДНК в районе расположения этого кодона и/или ее модификациями, так и с особенностями локальной структуры хроматина в этом районе. В то же время известно, что в формировании и/или поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК.

В связи с этим нами была проверена возможность связывания каких-либо ядерных белков с районом расположения кодона 12 в экзоне 1 гена liras. Был синтезирован олигонуклеотид 12 длиной 30 п.н., соответствующий району 12 и 13 кодонов (Рис. 6А). Методом задержки ДНК пробы в геле было показано, что некий белок/белки ядерного экстракта легкого мыши образует/ют комплекс с 12-mus олигонуклеотидом (Рис. 6Б).

В результате компьютерного анализа последовательности ДНК 1-ого экзона гена K-ras, были отобраны несколько белков- кандидатов на связывание с исследуемым районом GATA, NF-Y, LKLF, Ets. Использование синтетических двуцепочечных олигонуклеотидов, соответствующих известным сайтам связывания этих белков, в качестве конкурентов в опытах по задержке ДНК-пробы в геле позволило предположить, что комплекс образуется как минимум двумя белками: NF-Y и представителем семейства GATA. Эксперименты с использованием специфических антител против NF-Y и GATA6 (основного представителя семейства GATA в легких) полностью подтвердили это предположение (Рис. 6Б). Так как добавление и тех и других антител приводило к практически полному исчезновению комплекса, представляется вероятным кооперативное связывание транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с районом расположения кодона 12 гена K-ras мыши.

А) 12: 5'caqtTGGTGGTTGGAGCTGGTGGCGTAGGCAAGA G3'

Б) Антитела Антитела

к NF-Y к GATA-6

Рис. 6. А) Последовательность олигонуклеотида, - + " +

охватывающего область от 20 до 50 п.н. экзона I гена K-ras " ^

мыши (кодон 12 подчеркнут). Б) Идентификация белков образующих комплексы с олигонуклеотидом 12 с помощью специфических антител. 1,5-связывание с экстрактом, 2- связывание с экстрактом в присутствии антител к NF-Y, -А в присутствии антител к G ATA-6.

Согласно последним данным избирательность образования аддуктов в кодоне 12 гена K-ras при обработке различными канцерогенами обусловлена как особенностями первичной структуры ДНК в районе расположения этого кодона, так и с ее неустановленными пока модификациями, которые имеют место в составе нативного хроматина. Известно, что и NF-Y и представители семейства GATA способны инициировать процессы разрушения или ремоделирования нуклеосом. Поэтому представляется вероятным, что связывание этих факторов с местом расположения горячей точки мутагенеза в гене K-ras и районом полиморфизма вызывает локальное изменение структуры хроматина, что может играть определенную роль в обеспечении

доступности ДНК как для реакционно-способных канцерогенных соединений, так и для модифицирующих ферментов, и таким образом вносить свой вклад в механизм избирательности адцуктообразования.

Влияние легочных канцерогепов 3-метилхолантрена и нитрозоэтплмочевины на ДНК-связывающиУю активность транскрипционных факторов GATA-б и NF-Y.

Известно, что NF-Y является одним из ключевых регуляторов клеточного цикла, а GATA-б входит в число основных факторов, контролирующих онтогенез легочной ткани. Показано, что как недостаточная, так и избыточная экспрессия GATA-б приводит к серьезным нарушениям морфогенеза легких. В связи с этим можно предполагать, что связывание транскрипционных факторов NF-Y и GATA-б с местом расположения горячей точки мутагенеза в экзоне 1 гене K-ras и районом полиморфизма в начале интрона 2 может быть вовлечено в события, инициирующие развитие опухолей в этом органе. Опираясь на такое предположение, мы изучили влияние сильных легочных канцерогенов 3-метилхолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) на активность этих факторов и их способность взаимодействовать с районами кодона 12 и SNPs в начале интрона 2.

Оказалось, что после введения канцерогена 3-МХ мышам линии ICR, высокочувствительной к пульмоноканцерогенезу, в экстрактах ядер легких заметно увеличивалась ДНК-связывающая активность и GATA-б и NF-Y (Рис. 7А) и, соответственно, их взаимодействие с олигонуклеотидами, воспроизводящими области локализации кодона 12 и CA варианта полиморфизма гена K-ras мыши. Существенно более сильное влияние канцерогена на связывание NF-Y и GATA-б с районами кодона 12 и SNP в интроне 2 по сравнению с олигонуклеотидами, соответствующими сайтам связывания этих транскрипционных факторов, указывает на их кооперативное взаимодействие с этими районами. Наблюдаемый эффект является специфическим, так как под действием 3-МХ не наблюдалось изменения ДНК-связывающей активности транскрипционного фактора SRF, который в данном случае может рассматриваться в качестве внутреннего контроля. При введении 3-МХ мышам линии C57BL/6J, устойчивой к развитию опухолей легкого, увеличения активности NF-Y и GATA-б не наблюдалось (Рис. 7Б).

Аналогичные результаты были получены на двух других линиях мышей, контрастных по чувствительности к развитию рака легкого, - А/Не и СЗН/А. Введение другого пульмоноканцерогена - НЭМ также приводило к увеличению ДНК-связывающей активности факторов NF-Y и GATA-б в легких мышей линий, чувствительных к развитию опухолей легких (ICR, А/Не), но не устойчивых линий (C57BL/6J, СЗН/А).

123456789 10 123456789 10

З'-МХ - + - + - + -+ - + З'-МХ - + - + - + - + - +

Рис. 7. Связывание белков экстракта ядер легких мышей чувствительной к развитию рака легких линии ICR (А) и мышей устойчивых к развитию рака легких линии C57BL (Б), получивших 3-МХ с олигонуклеотидами 12 (/, 2), CA (3, 4) GATA (5, б). NF-Y (7, S), SRE (9, 10). I, 3. 5, 7, 9 контроль;?, 4, б, 8, 10 под действием канцерогена.

С помощью Вестерн-блот гибридизации мы показали, что наблюдаемый эффект не связан с изменением концентрации транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 в ядерных экстрактах после введения животным пульмоноканцерогенов (Рис. 8). Поэтому можно предполагать, что увеличение их ДНК-связывающей активности под действием канцерогена в легких мышей чувствительных линий обусловлено какими-то модификациями этих белков, а не увеличением их концентрации.

Рис. 8. Вес герн блот гибридизация с антителами к NF-Y (/, 2, 3, 4) и GATA-6 (5, 6. 7, S). 1. 2, 5, 6 -экстракт ядер легкого мышей линин !CR,3, •/, 7.8 • экстракт ядер легкого мышей линии C57BL/6JJ, 3. 5, 7 -контрольные животные, 2, 4, 6. 8 -обработанные пульмоноканцсрогеномЗ'-МХ.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В современной молекулярной генетике уделяется большое внимание выявлению и изучению однонуклеотидных замен (SNPs). Завершение программы по секвенированию генома человека предоставило новые возможности в исследовании вариаций генома человека для понимания причин, лежащих в основе наследуемых заболеваний и лекарственной устойчивости.

Интерес к изучению протоонкогена K-ras у мышей вызван тем, что мутации в нем наблюдаются в тех же кодонах в спонтанных и химически

NF-Y GATA-6

■-\ t ^

ICR C57BL ICR C578L

3 4 5 6 7 8

индуцированных опухолях легкого, селезёнки и прямой кишки, что и у человека.

Устойчивые пинии M.musculus

зеа где Mi

GC С

Чувствительные линии ftf.muscu/us

2ВВ 253 311

CA С

Устойчивый вид ШртШ

288 238 311

i« CA Т

GATA-6 NF-Y

Рис. 9. Предполагаемые композиционные элементы в районах кодона 12 и полиморфизма в начале интрона 2 гена К-гая мышей вида М.тизсика и вида М.яргеШ.

Из литературы известно, что наличие чувствительного к пульмоноканцерогенезу варианта полиморфизма в интроне 2 гена K-ras оказывает цис-эффект на образование или фиксацию мутаций в кодонах 12 и 61. Вероятнее всего, именно различия в связывании транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с различными аллельными состояниями интрона 2 гена K-ras мыши, лежат в основе событий, приводящих к формированию чувствительного или устойчивого к развитию рака легких фенотипа. Мы предполагаем, что, в результате наблюдаемых различий в связывании идентифицированных нами факторов с областью расположения SNPs изменяется архитектоника хроматина в данном районе гена, тем более, что транскрипционному фактору NF-Y свойственно изгибать нить ДНК на 6080° в зависимости от фланкирующей последовательности. Изменения в структуре хроматина могут открывать кодон 12 действию кацерогенов или нарушать работу ферментов репарации в данном районе, и таким образом способствовать возникновению мутаций. Это предположение поддерживают

полученные нами данные об увеличении ДНК-связывающей активности факторов NF-Y и GATA-6 и усилении их связывания с районами кодонов 12,13 и точкового полморфизма в начале интрона 2 гена K-ras в условиях in vitro после введения легочных канцерогенов нитрозэтилмочевины и 3-метилхолантрена мышам чувствительных линий.

Таким образом, SNPs в начале интрона 2 гена K-ras обладают выраженным регуляторным потенциалом и требуют дальнейшего всестороннего изучения.

ВЫВОДЫ

1. Показано, что SNPs в интроне 2 гена K-ras в позициях 288 и 296 п.н., сопряженные с предрасположенностью мышей M.musculus к раку легких, формируют комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-б и NF-Y. Взаимодействие GATA-б и NF-Y с районом локализации SNPs (278/307 п.н.) носит взаимозависимый характер.

2. Мононуклеотидная замена в позиции 311 п.н. интрона 2 гена K-ras, отличающая чувствительные к развитию рака линии мышей вида M.musculus от мышей устойчивого вида M.spretus, приводит к ухудшению выявленного нами дополнительного сайта связывания NF-Y,

3. Набор SNP С (288п.н.)', А (296 п.н.) и С (311 п.н.) в интроне 2 гена K-Ras у мышей чувствительных к раку легких линий М. Musculus формирует потенциальный композиционный элемент, включающий два NF-Y сайта и один сайт GATA-6. Мононуклеотидные замены, характерные для устойчивых линий, элиминируют различные компоненты этого композиционного элемента: GATA-6 сайт у M.Muscu!us и NF-Y сайг у M.Spretus.

4. Район экзона 1 гена K-Ras (от 20 до 50 п.н.), включающий кодон 12 (горячая точка мутагенеза), также содержит комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y.

5. Показано, что при введении легочных канцерогенов 3-метилхолантрена и нитрозоэтилмочевины животным происходит увеличение ДНК-связывающей активности NF-Y и GATA-6, а также усиление их связывания с обоими выявленными нами GATA-6/NF-Y комплексными сайтами в условиях in vitro. Эффект канцерогенов наблюдается у мышей чувствительных к развитию рака легких линий ICR, GR и А/Не, но не у резистентных линий C57BL и СЗН.

6. Происходящее под действием пульмоноканцерогенов увеличение ДНК-связывающей активности NF-Y и GATA-б не связано с изменением концентрации транскрипционных факторов NF-Y и GATA-б в ядерных экстрактах, что предполагает какие-то модификации этих белков.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Е.В. Горшкова (Антонцева), В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И. Меркулова. SNP в начале интрона 2 гена K-ras мыши, ассоциированные сразвитием рака легких, влияют на связывание с факторами транскрипции. // Бюлл. Эксп. Биол. Мед, 2006, №6, с.681-684.

2. Е.В. Горшкова (Антонцева), В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И. Меркулова. Область кодона 12 гена K-ras является местом связывания транскрипционных факторов GATA-б и NF-Y in vitro. II Биохимия, 2005, т.70, №10, с.1432-1437.

3. Ponomarenko JV, Merkulova TI, Orlova GV, Fokin ON, Gorshkova (Antontceva) EV, Frolov AS, Valuev VP, Ponomarenko MP. rSNP_Guide: a database system for analysis of transcription factor binding to DNA with variations: application to genome annotation. //Nucleic Acids Res, 2003, V.31(l), p.118-121.

4. O.A. Тимофеева, E.B. Горшкова (Антонцева), З.Б. Левашова, В.Ф. Кобзев, M.JI. Филипенко, В.И. Каледин, Т.И. Меркулова. Ассоциированный с чувствительностью к канцергенезу в легких точковый полиморфизм в интроне 2 гена K-ras влияет на связывание с фактором GATA-б, но не на уровень экспрессии гена. // Мол биол. 2002, том 36, №5, с.817-824.

5. Julia Ponomarenko, Tatyana Merkulova, Galina Orlova, Oleg Fokin, Elena Gorshkova (Antontceva), Mikhail Ponomarenko. Mining DNA sequences to predict sites which mutations cause genetic diseases. // Knowlege-Based Systems, 2002, V.15, p.225-233.

6. Ponomarenko JV, Orlova GV, Merkulova TI, Gorshkova (Antontceva) EV, Fokin ON, Vasiliev GV, Frolov AS, Ponomarenko MP. rSNP_Guide: an integrated database-tools system for studying SNPs and site-directed mutations in transcription factor binding sites. // Hum Mutat, 2002, V.20(4), p.239-248.

7. E.B. Горшкова (Антонцева), Т.И. Меркулова, В.И. Каледин. Единичные нуклеотидные замены в интроне 2 гена K-ras мыши, сопряженные с развитием рака легких, влияют на связывание факторов транскрипции. // Международная конференция "Физико-химическая биология", 2006, с.24-25.

8. Gorshkova (Antontceva) E.V., Medkulova T.I., Kaledin V.I. Functional interpretation of pulmonary carcinogenesis susceptibility-associated SNP in K-Ras intron 2. // 3rd International conference "Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine", 2006, p. 105.

9. Горшкова (Антонцева) E.B., Меркулова Т.И. Единичные нуклеотидные замены в интроне 2 гена K-ras мыши, ассоциированные с развитием рака легких. // 7-ая Пущинская школа-конференция молодых ученых, 2003, с.322.

10. Julia Ponomarenko, Galina Orlova, Tatyana Merkulova, Elena Gorshkova (Antontceva), Mikhail Ponomarenko. Predicting the transcription factor binding

site-candidate which presence/absence in SNP alleles could explain the SNP-related influence of genome sequence alterations on disease susceptibility/resistance. // Genome Sequencing & Biology, 2001, p. 194.

11. J. Ponomarenko, T. Merkulova, O. Fokin, M. Ponomarenko, G. Orlova, E. Gorshkova (Antontceva). By taking into account gel mobility shift assay data, knowledge discovery of regulatory protein binding site-candidate may explain disease penetration. // Proceedings of the International Conference of Mathematics and Engineering Techniques in Medicine and Biological Sciences, 2001, p.47-53.

Подписано к печати 18.10.2006г.

Формат бумаги 60 х 90, 1/16. Печ. л. 1. Уч. изд. л. 0,7

Тираж 100 экз. Заказ 118.

Ротапринт Института цитологии и генетики СО РАН 630090, Новосибирск, пр. ак. Лаврентьева, 10.

JrtIF

Р21468

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Антонцева, Елена Вячеславовна

1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Семейство протоонкогенов ras

2.1.1. Функциональная значимость белков семейства Ras

2.1.2. Структура Ras белков

2.1.3. Ген K-Ras и канцерогенез лёгких

2.2. Единичные нуклеотидные замены

2.3. Транскрипционные факторы

2.3.1. Транскрипционный фактор NF-Y

2.3.2. Транскрипционный фактор GATA

3. Материалы и методы

3.1. Материалы, использованные в работе

3.2. Олигонуклеотиды

3.3. Животные

3.4. Выделение геномной ДНК из лёгких мыши

3.5. Получение препаратов ДНК с использованием полимеразной цепной реакции (ПЦР)

3.6. Выделение продуктов ПЦР из агарозного геля

3.7. Получение экстракта ядер лёгких мышей

3.8. Введение метки в ДНК с помощью фрагмента Клёнова

3.9. Введение концевой метки в ДНК

3.10. Метод задержки ДНК-зонда в ПААГ белками ядерного 52 экстракта

3.11. Вестерн-блот анализ

3.12. Поиск сайтов гиперчувствительности К ДНК-азе I

3.12.1. Обработка ядер клеток легкого ДНК-азой I

3.12.2. Гибридизация по Саузерну

4. Результаты и обсуждение

4.1. Изучение связывания ядерных белков с районом 58 локализации сопряженых с развитием рака легких однонуклеотидных замен в интроне 2 гена K-Ras мыши

4.2. Идентификация транскрипционных факторов, 73 взаимодействующих с областью 12-ого кодона гена K-Ras мыши

4.3. Влияние легочных канцерогенов 3-метилхолантрена 79 и нитрозоэтилмочевины на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов GATA-6 И NF-Y

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена К-ras мыши, связанных с развитием рака легких"

Актуальность темы.

Ген K-ras является одной из наиболее перспективных моделей для изучения механизмов наследственной предрасположенности к развитию опухолей легких, поскольку он идентифицирован как ген, детерминирующий чувствительность к пульмоноканцерогенезу, и у человека и у экспериментальных животных. У мышей получено множество инбредных линий, различающихся по чувствительности к спонтанному и химически индуцированному раку легких. В результате генотипирования большого числа таких линий была установлена связь между единичными нуклеотидными заменами (Single nucleotide polymorphisms, SNPs) в интроне 2 гена K-ras и предрасположенностью к развитию опухолей легких [Chen et al., 1994а]. Показано, что у чувствительных к пульмоноканцерогенезу линий (А/Не, GR, ICR) в позициях 288 и 296 п.н. относительно старта трансляции располагаются нуклеотиды С и А, у резистентных линий (AKR, DD, РТ, UT, СЗН/А, C57BL) - G и С, а у линии с промежуточным фенотипом (СВА)- С и С [Chen et al.,1994а; Тимофеева и др.,2002].

Стремительно возрастающий в последние годы интерес к выявлению и исследованию SNPs в различных генах вызван тем, что они часто оказываются связанными с разнообразными фенотипическими проявлениями, включающими предрасположенность ко многим заболеваниям. При этом наиболее интенсивно изучаются SNPs, расположенные в кодирующих районах генов, что обусловлено относительной простотой их интерпретации, в особенности, в тех случаях, когда SNPs приводят к заменам аминокислот. Начинают развиваться и работы по исследованию потенциально регуляторных SNP, расположенных в промоторных районах генов. Среди SNPs, расположенных в интронах генов, наиболее изученными являются варианты, влияющие на сплайсинг мРНК. Расположенные в интронах SNPs, способные хотя бы потенциально влиять на интенсивность экспрессии генов, остаются почти не исследованными. Поскольку имеются уже достаточно много данных об энхансерах, сайленсерах и отдельных регуляторных элементах, расположенных в интронах генов, логично предполагать, что SNPs в интронах также могут затрагивать регуляторные районы. В связи с этим изучение молекулярных механизмов, посредством которых SNPs в интроне могут оказывать влияние на фенотипические признаки, представляется весьма актуальным и перспективным направлением.

Ген K-ras является одним из наиболее известных протоонкогенов, мутации в котором (как спонтанные, так и индуцированные химическими канцерогенами) локализованы почти исключительно в трех «горячих» точках - ко донах 12, 13 и 61 [Minamoto et al., 2000]. В настоящее время подобную направленность мутагенеза связывают, главным образом, с особенностями локальной структуры ДНК в местах предпочтительного возникновения мутаций [Krawczak, Cooper, 1996; Krawczak et al.,2000; Loechler, 1996]. Однако такое объяснение является далеко не всеобъемлющим. Например, при анализе мутаций, затрагивающих ко доны 12, 13 и 61 гена K-ras, в опухолях легких у гибридных мышей, полученных скрещиванием чувствительных и резистентных линий, было показано, что мутация происходит только в «чувствительном» аллеле этого гена, несмотря на полную идентичность нуклеотидной последовательности обоих аллелей в местах образования мутаций [Chen et al., 1994а]. Известен также феномен тканевой специфичности направленного мутагенеза. Например, под действием канцерогена уретана в печени и коже возникают мутации в 61-м ко доне гена Н-гая, а в легких - в 61-м ко доне гена К-гая [ВагЫп, 2000]. Такие закономерности дают основание думать об участии еще каких-то механизмов в обеспечении избирательности мутационного процесса. В частности, поскольку для гена К-газ установлено, что чувствительность мышей разных линий к развитию рака легких коррелирует с 8ЫР в его втором интроне, можно предполагать, что эти нуклеотидные замены могут приводить к специфическим, характерным только для чувствительного аллеля изменениям в структуре хроматина и/или конформации ДНК в районе 12-го и 13-го ко донов (экзон 1), что может способствать образованию аддуктов ДНК-канцероген и в последующем мутаций именно в этих позициях. Так как известно, что в формировании и/или поддержании определенной структуры хроматина участвуют транскрипционные факторы, связывающиеся с ДНК, можно думать, что сопряженные с чувствительностью к пульмоноканцерогенезу 8ЫР затрагивают сайты связывания таких белков.

Цель и задачи исследования

Целью исследования являлось выяснение молекулярных механизмов, посредством которых единичные нуклеотидные замены во втором интроне гена К-гая могут влиять на формирование чувствительности к спонтанному и индуцированному раку легких у мышей, а также выяснение механизма высокой избирательности возникновения мутаций в 12-м кодоне протоонкогена К-гая.

Задачи работы включали:

1. Изучение влияния сопряженных с развитием рака легких мононуклеотдных замен в позициях 288 и 296 п.н. интрона 2 К-гая у М. тшси1ш на связывание с ядерными белками. Идентификация транскрипционных факторов, взаимодействующих с полиморфным районом.

2. Изучение влияния замены в позиции 311 п.н. интрона 2 K-ras, отличающей мышей устойчивого к пульмоноканцерогенезу вида М. spretus от чувствительных линий М. Musculus, на связывание с транскрипционными факторами и их идентификация.

3. Изучение влияния различных вариантов SNP на картину связывания ядерных белков с потенциальным композиционным элементом в начале интрона 2 гена K-ras, охватывающим область расположения всех трех сопряженных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен.

4. Идентификация белков экстракта ядер клеток легких, взаимодействующих с областью первого кодирующего экзона гена K-ras мыши, включающей ко доны 12 и 13, которые являются «горячими» точками возникновения мутаций в гене K-ras.

5. После того как нами были получены данные о том, что с областью локализации ко донов 12 и 13 гена K-ras мыши и с районом расположения связанных с чувствительностью к раку легких мононуклеотидных замен взаимодействуют транскрипционные факторы NF-Y и GATA-6, была поставлена также задача определения влияния пульмоноканцерогенов на активность этих факторов.

Научная новизна и практическая ценность работы.

Впервые показано, что сопряженные с предрасположенностью к развитию рака легких у мышей SNPs во втором интроне гена K-ras являются потенциально регуляторными. Установлено, что CA вариант полиморфизма в позициях 288 и 296 п.н., характерный для чувствительных линий мышей вида M.musculus, соответствует комплексному сайту связывания транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6, а в случае "устойчивого" GC и "промежуточного" СС вариантов этот сайт оказывается разрушенным. Показано также, что в результате замены С—>Т в позиции 311 п.н. у мышей

M.spretus, устойчивых к пульмоноканцерогенезу, происходит повреждение сайта связывания NF-Y и это отличает их от мышей чувствительных линий M.musculus. Полученные данные предполагают существование трех гаплотипов, определяющих предрасположенность к пульмоноканцерогенезу: двух устойчивых - GCC и CAT и одного чувствительного - САС.

Впервые продемонстрировано, что горячая точка мутагенеза в протоонкогене K-ras - область 12-го ко дона - является сложным сайтом связывания белков NF-Y и GATA-6. Получены оригинальные данные о том, что под действием пульмоноканцерогенов 3-метилхолантрена (3-МХ) и нитрозоэтилмочевины (НЭМ) происходит усиление связывания факторов NF-Y и GATA-6 с районом 12 ко дона и областью полиморфизма в начале интрона 2 гена K-ras, что является новым свидетельством вовлеченности регуляторных систем клетки в механизм действия химических канцерогенов.

Апробация работы.

Результаты работы были представлены на межлабораторных семинарах ИЦиГ, на 7-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых (Пущино, 2003) и на международных конференциях: "Физико-химическая биология" (Новосибирск, 2006); "Genomics, proteomics, bioinformatics and nanotechnologies for medicine" (Novosibirsk, 2006); "Genome Sequencing & Biology" (New York, 2001); "Mathematics and Engineering Techniques in Medicine and Biological Sciences" (Las Vegas, 2001).

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Генетика", Антонцева, Елена Вячеславовна

6. выводы

1 Показано, что SNPs в интроне 2 гена K-ras в позициях 288 и 296 п.н., сопряженные с предрасположенностью мышей M.musculus к раку легких, формируют комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y. Взаимодействие GATA-6 и NF-Y с районом локализации SNPs (278/307 п.н.) носит взаимозависимый характер.

2 Мононуклеотидная замена в позиции 311 п.н. интрона 2 гена K-ras, отличающая чувствительные к развитию рака линии мышей вида M.musculus от мышей устойчивого вида M.spretus, приводит к ухудшению выявленного нами дополнительного сайта связывания NF-Y.

3 Набор SNP С (288п.н.), А (296 п.н.) и С (311 п.н.) в интроне 2 гена К-Ras у мышей чувствительных к раку легких линий М. Musculus формирует потенциальный композиционный элемент, включающий два NF-Y сайта и один сайт GATA-6. Мононуклеотидные замены, характерные для устойчивых линий, элиминируют различные компоненты этого композиционного элемента: GATA-6 сайт у M.Musculus и NF-Y сайт у M.Spretus.

4 Район экзона 1 гена K-Ras (от 20 до 50 п.н.), включающий ко дон 12 (горячая точка мутагенеза), также содержит комплексный сайт связывания транскрипционных факторов GATA-6 и NF-Y.

5 Показано, что при введении легочных канцерогенов 3-метилхолантрена и нитрозоэтилмочевины животным происходит увеличение ДНК-связывающей активности NF-Y и GATA-6, а также усиление их связывания с обоими выявленными нами GATA-6/NF-Y комплексными сайтами в условиях in vitro. Эффект канцерогенов наблюдается у мышей чувствительных к развитию рака легких линий ICR, GR и А/Не, но не у резистентных линий C57BL и СЗН.

6 Происходящее под действием пульмоноканцерогенов увеличение ДНК-связывающей активности NF-Y и GATA-6 не связано с изменением концентрации транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 в ядерных экстрактах, что предполагает какие-то модификации этих белков.

5. ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Интерес к изучению протоонкогена K-ras у мышей вызван тем, что мутации в нем наблюдаются в тех же кодонах в спонтанных и химически индуцированных опухолях легкого, селезёнки и прямой кишки, что и у человека [Tuveson, Jacks, 1999; Ramakrishna et al., 2000].

Нами впервые было показано, что район горячей точки мутагенеза -ко донов 12 и 13 гена K-ras мыши- является местом кооперативного связывания транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6. Было показано также, что у мышей чувствительных линий M.musculus в начале интрона 2 имеется регуляторный композиционный элемент, образованный двумя NF-Y сайтами и одним сайтом для GATA-6, а связанные с устойчивостью к пульмоноканцерогенезу SNPs разрушают его различные компоненты: GATA-6 сайт у мышей устойчивых линий M.musculus и NF-Y сайт у вида M.spretus (Рис. -f"?). Из литературы известно, что наличие чувствительного к пульмоноканцерогенезу варианта полиморфизма в интроне 2 гена K-ras оказывает цис-эффект на образование или фиксацию мутаций в кодонах 12 и 61. Вероятнее всего, именно различия в связывании транскрипционных факторов NF-Y и GATA-6 с различными аллельными состояниями интрона 2 гена K-ras мыши, лежат в основе событий, приводящих к формированию чувствительного или устойчивого к развитию рака легких фенотипа. Мы предполагаем, что, в результате наблюдаемых различий в связывании идентифицированных нами факторов с областью расположения SNPs изменяется архитектоника хроматина в данном районе гена, тем более, что транскрипционному фактору NF-Y свойственно изгибать нить ДНК на 60-80° в зависимости от фланкирующей последовательности. Изменения в структуре хроматина могут открывать ко дон 12 действию кацерогенов или нарушать работу ферментов репарации в данном районе, и таким образом способствовать возникновению мутаций. Это предположение поддерживают полученные нами данные об увеличении ДНК-связывающей активности факторов NF-Y и GATA-6 и усилении их связывания с районами кодонов 12,13 и точкового полморфизма в начале интрона 2 гена K-ras в условиях in vitro после введения легочных канцерогенов нитрозэтилмочевины и 3'-метилхолантрена мышам чувствительных линий.

Автор выражает искреннюю благодарность Т.И. Меркуловой за общее руководство работой, В.И. Каледину за предоставление прекрасно подготовленной экспериментальной модели для изучения роли аллельных вариантов гена K-ras в механизмах пульмоноканцерогенеза, а также за консультации и за помощь при работе с животными, Г.В. Васильеву за помощь в овладении методической базой, O.A. Тимофеевой и З.Б. Левашовой за работы, положившие начало данному исследованию, В.Ф. Кобзеву за синтез олигонуклеотидов и М.П. Пономаренко за компьтерный поиск сайтов связывания ТФ в изучаемых последовательностях.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Антонцева, Елена Вячеславовна, Новосибирск

1. Вингендер Э. Классификация транскрипционных факторов эукариот. // Молекулярная биология. 1997. Т.31. С.584-600.

2. Морозов И.В. Сравнительный структурно-функциональный анализ генов тирозинаминотрансферазы человека и крысы: дис. канд. биол. наук. Н.: Новосибирский институт биоорганической химии, 1998.

3. Остерман JI.A. Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: Электрофорез и ультроцентрифугирование //Москва, Наука, 1981, 286с.

4. Смагулова Ф.А. Молекулярная природа фенилкетонурии в Новосибирской области. // диссертация на соискание степени кандидата биологических наук, Новосибирск, 2000г.

5. Тимофеева О.А., Филипенко M.JL, Каледин В.И. Изучение корреляции между генотипом K-ras и чувствительностью мышей к химически индуцированному раку лёгких//Генетика. 1999. Т.35. С.1309-1312.

6. Adjei A.A. Blocking oncogenic Ras signaling for cancer therapy // J. Natl. Cancer Inst2001. V.93. P.1062-74.

7. Alemany R., Ruan S., Kataoka M., Koch P.E., Mukhopadhyay Т., Cristiano R.J., Roth J.A., Zhang W-W. Growth inhibitory effect of anti-K-ras adenovirus on lung cancer cells // Cancer Gene Therapy. 1996. V.3. P.296-301.

8. Arents G., Moudrianakis E.N. The histone fold: a ubiquitous architectural motif utilized in DNA compaction and protein dimerization // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1995. V.92. P.l 1170-4.

9. Balasubramanian S., Xia Y., Freinkman E., Gerstein M. Sequence variation in G-protein-coupled receptors: analysis of single nucleotide polymorphisms. //Nucleic Acids Res. 2005. V.33. P.1710-21.

10. Barbacid M. ras genes // Ann. Rev. Biochem. 1987. V.56. P.779-827. Barbin A. Etheno-adduct-forming chemicals: from mutagenicity testing to tumor mutation spectra. // Mutat. Res. 2000. V.462. P.55-69.

11. Bellorini M., Zemzoumi K., Farina A., Berthelsen J., Piaggio G., Mantovani R. Cloning and expression of human NF-YC // Gene. 1997. V.193. P.119-25.

12. Bi W., Wu L., CoustryF., de Crombrugghe B., MaityS.N. DNA binding specificity of the CCAAT-binding factor CBF/NF-Y // J. Biol. Chem. 1997. V.272. P.26562-72.

13. Bos J.L. Ras oncogenes in human cancer: a review // Cancer Res. 1989. V.49. P.4682-9.

14. Cirillo L.N., Lin F.R., Cuesta I., Friedman D., Jarnik M., Zaret K.S. Opening of compacted chromatin by early developmental transcription factors HNF3 (FoxA) and GATA-4. // Mol. Cell. 2002. V.9. P.279-289.

15. Charron F., Paradis P., Bronchain O., Nemer G., Nemer M. Cooperative interaction between GATA-4 and GATA-6 regulates myocardial gene expression // Mol. Cel. Biol. 1999. V.19. P.4355-4365.

16. Chen K.Y. Transcription factors and the down-regulation of Gl/S boundary genes in human diploid fibroblasts during senescence. // Front Biosci. 1997. V.2. P.d417-26.

17. Chen B., Johanson L., Wiest J.S., Anderson M.W., You M. The second intron of the K-ras gene contains regulatory elements associated with mouse lung tumor susceptibility //Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994a. V.91. P. 15891593.

18. Chen B., You L., Wang Y., Stoner G.D., You M. Allele-specific activation and expression of the K-ras gene in hybrid mouse lung tumors induced by chemical carcinogens // Carcinogenesis. 1994b. V.15. P.2031-2035.

19. Coustry F., Sinha S., Maity S.N., Crombrugghe B. The two activation domains of the CCAAT-binding factor CBF interact with the dTAFIIllO component of the Drosophila TFIID complex // Biochem. J. 1998. V.331. P.291-7.

20. Coustry F., Hu Q., de Crombrugghe B., Maity S.N. CBF/NF-Y functions both in nucleosomal disruption and transcription activation of the chromatin-assembled topoisomerase Ilalpha promoter. Transcription activation by

21. CBF/NF-Y in chromatin is dependent on the promoter structure // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.40621-30.

22. Crossley M., Merika M., Orkin S.H. Self-association of the erythroid transcription factor GATA-1 mediated by its zinc finger domains. // Mol. Cell Biol. 1995. V.15. P.2448-56.

23. Donfack J., Schneider D.H., Tan Z., Kurz T., Dubchak I., Frazer K.A., Ober C. Variation in conserved non-coding sequences on chromosome 5q and susceptibility to asthma and atopy. // Respir. Res. 2005. V.6. P. 145.

24. Eisenberg E., Adamsky K., Cohen L., Amariglio N., Hirshberg A., Rechavi G., Levanon E.Y. Identification of RNA editing sites in the SNP database. // Nucleic Acids Res. 2005. V.33. P.4612-7.

25. Elkon R, Linhart C., Sharan R., Shamir R., Shiloh Y. Genome-wide in silico identification of transcriptional regulators controlling the cell cycle in human cells. // Genome Res. 2003. V.13. P.773-780.

26. Ellis C.A., Clark G. The importance of being K-Ras // Cell. Signal. 2000. V.12. P.425-434.

27. Espinas M.L., Roux J., Ghysdael J., Pictet R., Grange T. Participation of Ets transcription factors in the glucocorticoid response of the rat tyrosine aminotransferase gene // Mol. Cell. Biol., 1994. V.14. P.4116-25.

28. Fairbrother W.G., Holste D., Burge C.B., Sharp P.A. Single nucleotide polymorphism-based validation of exonic splicing enhancers. // PLoS Biol. 2004. V.2. P.1388-95.

29. Feng Z., Hu W., Komissarova E., Pao A., Hung M.C., Adair G.M., Tang Ms. Transcription-coupled DNA repair is genomic context-dependent. // J. Biol. Chem. 2002. V.277. P.12777-83.

30. Field L.L. Bonnevie-Nielsen V., Pociot F., Lu S., Nielsen T.B., BeckNielsen H. OAS1 splice site polymorphism controlling antiviral enzyme activity influences susceptibility to type 1 diabetes. // Diabetes. 2005. V.54. P.1588-91.

31. Fung TK, Poon RY. A roller coaster ride with the mitotic cyclins. // Semin. Cell Dev. Biol. 2005. V.16. P.335-42.

32. Gorski K., Carnero M., Schibler U. Tissue-specific in vitro transcription from the mouse albumin promoter // Cell. 1986. V. 47. P. 767-776.

33. Gray D., Warshawsky D., Xue W., Nines R., Wang Y., Yao R., Stoner G.D. The effects of binary mixture of benzo(a)pyrene and 7H-dibenzo(c,g)carbazole on lung tumors and K-ras oncogene mutations in strain A/J mice // Exp. Lung Res. 2001. V.27. P.245-253.

34. Guerra C., Mijimolle N., Dhawahir A., Dubus P., Barradas M., Serrano M., Campuzano V., Barbacid M. Tumor induction by an endogenous K-ras oncogene is highly dependent on cellular context // Cancer Cell. 2003. V.4. P.111-120.

35. Guo B., Odgren P.R., van Wijnen A.J., Last T., Nickerson J., Penman S., Lian J., Stein G. The nuclear matrix protein NMP-1 is the transcription factor YY1. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V. 92. P. 10526-10530.

36. Gusmaroli G., Tonelli C., Mantovani R. Regulation of the CCAAT-Binding NF-Y subunits in Arabidopsis thaliana // Gene. 2001. V.264. P.173-85.

37. Halushka M.K., Fan J.B., Bentley K., Hsie L., Shen N., Weder A., Cooper R., Lipshutz R, Chakravarti A. Patterns of single-nucleotide polymorphisms in candidate genes for blood-pressure homeostasis. // Nat Genet. 1999. V.22. P.239-247.

38. Hancock J.F., Cadwallader K., Marshall C.J. Methylation and proteolysis are essential for efficient membrane binding of prenylated p21K-ras(B) // EMBOJ. 1991a. V.10. P.641-6.

39. Hancock J.F., Cadwallader K., Paterson H., Marshall C.J. A CAAX or a CAAL motif and a second signal are sufficient for plasma membrane targeting of ras proteins // EMBO J. 1991b. V.10. P.4033-9.

40. Hu W., Feng Z., Tang M-s. Preferential carcinogen-DNA adduct formation at codon 12 and 14 in the human K-ras gene and their possible mechanisms // Biochemistry. 2003. V.42. P. 10012-23.

41. Huang D.Y., Kuo Y.Y., Lai J.S., Suzuki Y., Sugano S, Chang Z.F. GATA-1 and NF-Y cooperate to mediate erythroid-specific transcription of Gfi-IB gene //Nucleic Acids Res. 2004. V.32. P.3935-46.

42. Huggon I.C., Davies A., Gove C., Moscoso G., Moniz C., Foss Y., Farzaneh F., Towner P. Molecular cloning of human GATA-6 DNA binding protein:high levels of expression in heart and gut. // Biochim. Biophys. Acta. 1997. V.1353. P.98-102.

43. Imbriano C., Bolognese F., Gurtner A., Piaggio G., Mantovani R. HSP-CBF is an NF-Y-dependent coactivator of the heat shock promoters CCAAT boxes // J. Biol. Chem. 2001. V.276. P.26332-9.

44. Jackson J.H., Li J.W., Buss J.E., Der C.J., Cochrane C.G. Polylysine domain of K-ras 4B protein is crucial for malignant transformation // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P. 12730-4.

45. Jiang R, Duan J., Windemuth A., Stephens J.C., Judson R., Xu C. Genome-wide evaluation of the public SNP databases. // Pharmacogenomics. 2003. V.4. P.779-789.

46. Jin S., Scotto K.W. Transcriptional regulation of the MDR1 gene by histone acetyltransferase and deacetylase is mediated by NF-Y // Mol. Cell Biol. 1998. V.18.P.4377-84.

47. Johnson L., Mercer K., Greenbaum D., Bronson R.T., Crowley D., Tuveson D.A., Jacks T. Somatic activation of the K-ras oncogene causes early onset lung cancer in mice //Nature. 2001. V.410. P.l 111-16.

48. Jones-Bolin S.E., Johansson E., Palmisano W.A., Anderson M.A., Wiest J.S., Belinsky S.A. Effect of promoter and intron 2 polymorphisms on murine lung K-ras gene expression // Carcinogenesis. 1998. V.19. P.1503-1508.

49. Kato K., Cox A.D., Hisaka M.M., Graham S.M., Buss J.E., Der C.J. Isoprenoid addition to Ras protein is the critical modification for its membrane association and transforming activity // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P.6403-7.

50. Ketola I., Otonkoski T., Pulkkinen M.A., Niemi H., Palgi J., Jacobsen C.M., Wilson D.B., Heikinheimo M. Transcription factor GATA-6 is expressed in the endocrine and GATA-4 in the exocrine pancreas. // Mol. Cell Endocrinol. 2004. V.226. P.51-7.

51. Koera K., Nakamura K., Nakao K., Miyoshi J., Toyoshima K., Hatta T., Otani H., Aiba A., Katsuki M. K-ras is essential for the development of the mouse embryo. // Oncogene. 1997. V.15. P.1151-59.

52. Koutsourakis M., Langeveld A., Patient R., Beddington R., Grosveld F. The transcription factor GATA6 is essential for early extraembryonic development. //Development. 1999. V.126. P.723-32.

53. Krawczak M., Cooper D.N. Single base-pair substitutions in pathology and evolution: two sides to the same coin. // Hum. Mutat. 1996. V.8. P.23-31.

54. Krawczak M., Chuzhanova N.A., Stenson P.D., Johansen B.N., Ball E.V., Cooper D.N. Changes in primary DNA sequence complexity influence the phenotypic consequences of mutations in human gene regulatory regions. // Hum. Genet. 2000. V.107. P.362-5.

55. LaVoie H.A., 2003 The role of GATA in mammalian reproduction. // Exp. Biol. Med. 2003. V.228. P.1282-90.

56. Liberati C., Ronchi A., Lievens P., Ottolenghi S., Mantovani R. NF-Y organizes the gamma-globin CCAAT boxes region // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.16880-9.

57. Liu C., Ikegami M., Stahlman M.T., Dey C.R., Whitsett J.A. Inhibition of alveolarization and altered pulmonary mechanics in mice expressing GATA-6. // Am. J. Physiol. Lung Cell Mol. Physiol. 2003. V.285. P.L1246-54.

58. Loechler E.L. The role of adduct site-specific mutagenesis in understanding how carcinogen-DNA adducts cause mutations: perspective, prospects and problems. // Carcinogenesis. 1996. V.17. P.895-902.

59. Macara I.G., Lounsbury K.M., Richards S.A., McKiernan C., Bar-Sagi D. The Ras superfamily of GTPases // FASEB J. 1996. V.10. P.625-630.

60. Malumbers M., Pellicer A. Ras pathways to cell cycle control and cell transformation//Front. Biosci. 1998. V.3. P.d887-d912.

61. Manenti G., Falvella F.S., Gariboldi M., Dragani T.A., Pierotti M.A. Different susceptibility to lung tumorigenesis in mice with an identical Kras2 intron 2. // Genomics. 1995. V.29. P.438-444.

62. Mantovani R. A survey of 178 NF-Y binding CCAAT boxes // Nucleic Acids Res. 1998. V.26. P.l 135-43.

63. Marvit J., DiLella A.G., Brayton K., Ledley F.D., Robson K., Woo S. GT to AT transition at a splice donor site causes skipping of the preceding exon in phenilketonuria. //Nucl. Res. Comm. 1987. V.15. P.5613-5628.

64. Matuoka K., Chen K.Y. Nuclear Factor Y (NF-Y) and Cellular Senescence // Experimental Cell Research. 1999. V.253. P.365-371.

65. Matzinger S.A, Chen B, Wang Y., Crist K.A., Stoner G.D., Kellof G.J, Lubet R.A, You M. Tissue-specific expression of the K-ras allele from the A/J parent in (A/J x TSG-/?53) F, mice // Gene. 1997. V.188. P.261-269.

66. Meuwissen R, Linn S.C, van der Valk M, Mooi W.J, Berns A. Mouse model for lung tumorigenesis through Cre/lox controlled sporadic activation of the K-ras oncogene // Oncogene. 2001. V.20. P.6551-58.

67. Miller R.D, Phillips M.S, Jo I, Donaldson M.A, Studebaker J.F, et.al.; The SNP Consortium Allele Frequency Project. High-density single-nucleotide polymorphism maps of the human genome. // Genomics. 2005. V.86. P.l 17-26.

68. Minamoto T, Mai M, Ronai Z. K-ras mutation: early detection in molecular diagnosis and risk assessment of colorectal, pancreas and lung cancers // Cancer Detect. Prevent. 2000. V.24. P.l-12.

69. Molkentin J.D.The zinc finger-containing transcription factors GATA-4, -5, and -6. Ubiquitously expressed regulators of tissue-specific gene expression. // J. Biol. Chem. 2000. V.275. P.38949-52.

70. Morrisey E.E, Ip H.S, Lu M.M, Parmacek M.S. GATA-6: a zinc finger transcription factor that is expressed in multiple cell lineages derived from lateral mesoderm. //Dev. Biol. 1996. V.177. P.309-22.

71. Morrisey E.E, Ip H.S, Tang Z, Parmacek M.S. GATA-4 activates transcription via two novel domains that are conserved within the GATA-4/5/6 subfamily. // J. Biol. Chem. 1997a. V.272. P.8515-24.

72. Morrisey E.E, Ip H.S, Tang Z, Lu M.M, Parmacek M.S. GATA-5: a transcriptional activator expressed in a novel temporally and spatially-restricted pattern during embryonic development. // Dev. Biol. 1997b. V.183. P.21-36.

73. Mottagui-Tabar S, Faghihi M.A, Mizuno Y, Engstrom P.G, Lenhard B, Wasserman W.W, Wahlestedt C. Identification of functional SNPs in the 5-prime flanking sequences of human genes. // BMC Genomics. 2005. V.6. P.18.

74. Mu D.Q, Peng Y.S, Xu Q.J. (2004) World J. Values of mutations of K-ras oncogene at codon 12 in detection of pancreatic cancer: 15-year experience. // World J Gastroenterol. 2004. V.10. P.471-5.

75. Muro-Pastor M.I, Gonzalez R, Strauss J, Narendja F, Scazzocchio C. The GATA factor AreA is essential for chromatin remodelling in a eukaryotic bidirectional promoter. // EMBO J. 1999. V.18. P. 1584-97.

76. Nakshatri H., Bhat-Nakshatri P., Currie R.A. Subunit association and DNA binding activity of the heterotrimeric transcription factor NF-Y is regulated by cellular redox // J. Biol. Chem. 1996. V.271. P.28784-91.

77. Naukkarinen J., Gentile M., Soro-Paavonen A., Saarela J., Koistinen H.A., Pajukanta P., Taskinen M.R., Peltonen L. USF1 and dyslipidemias: converging evidence for a functional intronic variant. // Hum. Mol. Genet. 2005. V.14. P.2595-605.

78. Ngwenya S., Safe S. Cell context-dependent differences in the induction of E2F-1 gene expression by 17 beta-estradiol in MCF-7 and ZR-75 cells // Endocrinology. 2003. V.144. P. 1675-85.

79. Oetting W.S. 2005 Human Genome Variation Society Scientific Meeting. // Hum. Mutat. 2006. V.27. P.286-9.

80. Omichinski J.G., Clore G.M., Schaad O., Felsenfeld G., Trainor C., Appella E., Stahl S.J., Gronenborn A.M. NMR structure of a specific DNA complex of Zn-containing DNA binding domain of GAT A-1. // Science. 1993. V.261. P.438-46.

81. Orkin S.H. Embryonic stem cells and transgenic mice in the study of hematopoiesis. // Int. J. Dev. Biol. 1998. V.42. P.927-34.

82. Osada H., Grutz G., Axelson H., Forster A., Rabbitts T.H. Association of erythroid transcription factors: complexes involving the LIM protein RBTN2 and the zinc-finger protein GATA1. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. V.92. P.9585-9.

83. Peng Y., Jahroudi N. The NFY transcription factor inhibits von Willebrand factor promoter activation in non-endothelial cells through recruitment of histone deacetylases // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.8385-94.

84. Perlman H., Suzuki E., Simonson M., Smith R.C., Walsh K. GATA-6 induces p21(Cipl) expression and G1 cell cycle arrest. // J. Biol. Chem. 1998. V.273. P.13713-8.

85. Procudina L., Castillejo-Lopez C., Oberg F., Gunnarsson I., et.al. A regulatory polymorphism in PDCD1 is associated with susceptibility tosystemic lupus erythematosus in humans // Nature Genetics. 2002. V.32. P.666-669.

86. Pruitt K., Der C.J. Ras and Rho regulation of the cell cycle and oncogenesis//Cancer Letters. 2001. V.171. P.l-10.

87. Ramakrishna G., Biakovska A., Perella C., Birely L., Fornwald L.W., Diwan B.A., Schiao Y-H., Anderson L.M. Ki-ras and characteristics of mouse lung tumors // Mol. Carcinogenesis. 2000. V.28. P. 156-167.

88. Riva A., Kohane I.S. .A SNP-centric database for the investigation of the human genome. // BMC Bioinformatics. 2004. V.5. P.33.

89. Romero F., Martinez-A C., Camonis J., Rebollo A. Aiolos transcription factor controls cell death in T cells by regulating Bcl-2 expression and its cellular localization // EMBO J. 1999. V.18. P.3419-30.

90. Romier C., Cocchiarella F., Mantovani R., Moras D. The NF-YB/NF-YC structure gives insight into DNA binding and transcription regulation by CCAAT factor NF-Y // J. Biol. Chem. 2003. V.278. P.1336-45.

91. Ryan J., Barker P.E., Nesbitt M.N, Ruddle F.H. KRAS2 as a genetic marker for lung tumor susceptibility in inbread mice // J. Natl. Cancer Inst. 1987. V.79. P.1351-57.

92. Ryan W.A, Franza B.R, Gilman M.L. Two distinct cellular phosphoproteins bind to the c-fos serum response element // EMBO J. 1989. V.8. P.1785-1792.

93. Sakai Y, Nakagawa R, Sato R, Maeda M. Selection of DNA binding sites for human transcriptional regulator GATA-6. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1998. V.250. P.682-8.

94. Schuettengruber B., Simboeck E, Khier H., Seiser C. Autoregulation of mouse histone deacetylase 1 expression // Mol. Cell Biol. 2003. V.23. P.6993-7004.

95. Schug J., Overton G.C. TESS: Transcription element search software on the WWW // Technical report CBIL-TR-1997-1001-v0.0, of the Computational Biology and Informatics Laboratory, School of Medicine, University of Pensilvania. 1997.

96. Shah N., Teplitsky M.V., Minovitsky S., Pennacchio L.A., Hugenholtz P., Hamann B., Dubchak I.L. SNP-VISTA: an interactive SNP visualization tool. //BMC Bioinformatics. 2005. V.6. P.292.

97. Shapiro D.G., Sharp P.A., Wahli W.W., Keller M.J. A high-efficiency HeLa cell nuclear transcription extract // DNA. 1988. V.7. P.47-55.

98. Shaw-White J.R., Bruno M.D., Whitsett J.A. GATA-6 activates transcription of thyroid transcription factor-1. // J. Biol. Chem. 1999. V.274. P.2658-64.

99. Shen L.X., Basilion J.P., Stantion V.P. Single-nucleotide polymorphisms can cause different structural folds of mRNA. // Biochemistry. 1999. V.96. P.7871-7876.

100. Shimkin M.B., Stoner G.D. Lung tumors in mice: application to carcinogenesis bioassay.//Adv. Cancer Res. 1975. V.21. P.1-58.

101. Sinha S., Maity S.N., Seldin M.F., de Crombrugghe B. Chromosomal assignment and tissue expression of CBF-C/NFY-C, the third subunit of the mammalian CCAAT-binding factor // Genomics. 1996a. V.37. P.260-3.

102. Stamm S., Riethoven J.J., Le Texier V., Gopalakrishnan C., Kumanduri V., Tang Y., Barbosa-Morais N.L., Thanaraj T.A. ASD: abioinformatics resource on alternative splicing. // Nucleic Acids Res. 2006. V.34. P.D46-55.

103. Stenson P.D., Ball E.V, Mort M., Phillips A.D., Shiel J.A., Thomas N.S., Abeysinghe S., Krawczak M., Cooper D.N. Human Gene Mutation Database (HGMD): 2003 update. // Hum. Mutat. 2003. V.21. P.577-81.

104. Suzuki A., Yamada R., Chang X., Tokuhiro S., et.al. Functional haplotypes of PADI4, encoding citrullinating enzyme peptidylarginine deiminase 4, are associated with rheumatoid arthritis. // Nature Genetics. 2003. V.34. P.395-402.

105. Suzuki E., Evans T., Lowry J., Truong L., Bell D.W., Testa J.R., Walsh K. The human GATA-6 gene: structure, chromosomal location, and regulation of expression by tissue-specific and mitogen-responsive signals // Genomics. 1996. V.38. P.283-290.

106. Trahey M., McCormick F. A cytoplasmic protein stimulates normal N-ras p21 GTPase, but does not affect oncogenic mutants. // Sciense. 1987. V.238. P.542-545

107. Tuveson D.A., Jacks T. Modeling human lung cancer in mice: similarities and shortcomings // Oncogene. 1999. V.18. P.5318-24.

108. Wade C.M., Daly M.J. Genetic variation in laboratory mice. 11 Nature Genetics. 2005. V.37. P. 1175-80.

109. Walitza S., Renner T.J., Dempfle A. Konrad K., et.al. Transmission disequilibrium of polymorphic variants in the tryptophan hydroxylase-2 gene in attention-deficit/hyperactivity disorder. // Mol. Psychiatry. 2005. V.10. P.1126-32.

110. Wang L., Liu S., Niu T., Xu X. SNPHunter: a bioinformatic software for single nucleotide polymorphism data acquisition and management. // BMC Bioinformatics. 2005. V.6. P.60.

111. Wang X., Tomso D.J., Liu X., Bell D.A. Single nucleotide polymorphism in transcriptional regulatory regions and expression of environmentally responsive genes. // Toxicol. Appl. Pharmacol. 2005. V.207. P.84-90.

112. Wennerberg K., Rossman K.L., Der C.J. The Ras superfamily at a glance // J.Cell. Science. 2005. V.l 18. P.843-846.

113. Whitsett J.A, Tichelaar J.W. Forkhead transcription factor HFH-4 and respiratory epithelial cell differentiation. // Am. J. Respir. Cell Mol. Biol. 1999. V.21. P.153-4.

114. Whyatt D.J., deBoer E., Grosveld F. The two zinc finger-like domains of GATA-1 have different DNA binding specificities. // EMBO J. 1993. V.12. P.4993-5005.

115. Xing Y., Zhang S. Olesen J.T., Rich A., Guarente L. Subunit interaction in the CCAAT-binding heteromeric complex is mediated by a very short alpha-helix in HAP2 // Proc. Natl Acad. Sci. USA. 1994. V.91. P.3009-13.

116. Xu Y., Banville D., Zhao H.F., Zhao X., Shen S.H. Transcriptional activity of the SHP-1 gene in MCF7 cells is differentially regulated bybinding of NF-Y factor to two distinct CCAAT-elements // Gene. 2001. V.269. P.141-53.;

117. Yamamoto M., Ko L.J., Leonard M.W., Beug H., Orkin S.H., Engel J.D. Activity and tissue-specific expression of the transcription factor NF-E1 multigene family. // Genes Dev. 1990. V.4. P. 1650-62.

118. Yang H., Lu M.M., Zhang L., Whitsett J.A., Morrisey E.E. GATA6 regulates differentiation of distal lung epithelium. // Development. 2002. V.129. P.2233-46.

119. You M., Wang Y., Stoner G., You L., Maronpot R., Reynolds S.H., Anderson M. Parental bias of Ki-ras oncogenes detected in lung tumors from mouse hybrids. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1992. V.89. P.5804-5808.

120. Yue P., Melamud E., Moult J. SNPs3D: candidate gene and SNP selection for association studies. // BMC Bioinformatics. 2006. V.7:166.

121. Ziegel R., Shallop A., Jones R., Tretyakova N. K-rcis gene sequence effects on the formation of 4-(methilnitrosamino)-l-(3-pyridyl)-l-butanone (NNK) DNA adducts // Chem. Res. Toxicol. 2003. V.16. P.541-550.

Информация о работе

Антонцева, Елена Вячеславовна
кандидата биологических наук
Новосибирск, 2006
ВАК 03.00.15

Диссертация

Функциональная интерпретация единичных нуклеотидных замен в интроне 2 гена К-ras мыши, связанных с развитием рака легких - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы