Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Функциональная активность системы рецепторных тирозиновых протеиназ в лимфацитах селезенки крыс в условиях радиационного влияния

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Функциональная активность системы рецепторных тирозиновых протеиназ в лимфацитах селезенки крыс в условиях радиационного влияния"

КИЇВСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ (\|\імені ТАРАСА ШЕВЧЕНКА

V \ У

Г"Т

КІРПЕНКО ТЕТЯНА ОЛЕГІВНА

УДК 599:539.1.047+577.122.5

ФУНКЦІОНАЛЬНА АКТИВНІСТЬ СИСТЕМИ РЕЦЕПТОРНИХ ТИРОЗИНОВИХ ПРОТЕЇНКІНАЗ У ЛІМФОЦИТАХ СЕЛЕЗІНКИ ЩУРІВ ЗА УМОВ РАДІАЦІЙНОГО ВПЛИВУ

03. 00. 04 — біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

КИЇВ - 2000

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в лабораторії фізико-хімічної біології кафедри біохімії біологічного факультету Київського національного університету імені Тараса Шевченка.

Науковий керівник:

Офіційні опоненти:

Провідна установа:

доктор біологічних наук Остапченко Людмила Іванівна,

професор кафедри біохімії Київського національного університету імені Тараса Шевченка

доктор біологічних наук Тугай Василь Андрійович, провідний науковий співробітник Інституту біохімії

імені О. В. Палладіна НАН України

доктор біологічних наук, професор Мирошніченко Микола Степанович,

завідувач кафедри біофізики Київського національного університету імені Тараса Шевченка

Інститут

експериментальної патології, онкології і радіобіології імені Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ

Захист дисертації відбудеться засіданні спеціалізованої вченої ради

ООО р. о 1_0 год. на ,26.001.24 в Київському

національному університеті імені Тараса Шевченка за адресою: 03127, м. Київ, пр-т Глушкова, 2, корпус 12 (біофак), ауд. 215.

Поштова адреса: 01033, Київ, вул.Володимирська, 64, спецрада Д 26.001.24, біологічний факультет.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці університету: 01033, Київ, вул.Володимирська 58.

Автореферат розісланий ” 771&ЖгЬ$2000 р.

ов брайон

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради

Актуальність проблеми. До імунологічних наслідків, які розвиваються ік пізні прояви радіаційних ефектів, належать мієлоїдні та лімфоїдні ювоутворення, комплексні імунні захворювання, аутоагресивні імунні реакції -а інші дегенеративні захворювання імунологічної природи (Takashi, 1990). З >собливою ретельністю вивчається розвиток мієлоїдних та лімфоїдних іеоплазм у відповідь на дію випромінювання (Little, 2000). Під час іеопластичної трансформації клітин спостерігається накопичення великої :ількості онкогенних продуктів, які є нормальними або спотвореними лементами сигнальних систем ростових факторів (Boutin, 1996). Різноманітні юстові фактори, в свою чергу, виконують функцію регуляції росту, (иференціювання й імунної відповіді лімфоїдних клітин. Вони беруть участь в іктивації В- і Т-лімфоцитів шляхом зв’язування з поверхневими мембранними іецепторами цих клітин, після чого індукуються процеси сигнальної рансдукції (Ullrich, 1990). Необхідно відзначити, що в складний і іагатоступеневий процес неопластичної трансформації залучено численні іеханізми, що включають порушення експресії певних генів, аномальну іродукцію цитокінів, гіперекспресію їх рецепторів, спотворення передачі іегуляторних сигналів від специфічних рецепторів плазматичної мембрани до дра клітини і ряд інших (Liebow, 1992).

Одна із ланок сигнальної трансдукції ростових факторів включає ктивацію тирозинових ( протеїнкіназ (АТФ: протеїнфосфотрансферази; СФ 2.7.1.37), яка часто збільшується під впливом онкогенних продуктів Liebow, 1992). Питання функціонування рецепторних тирозинових ¡ротеїнкіназ за умов розвитку патологічного процесу є найбільш хвилюючим <а протязі останніх років наукового розвитку. Показано, що рецепторні ирозинові протеїнкінази виконують функцію ключової ланки сигнальної рансдукції епідермального ростового фактора (ЕРФ) - одного з найбільш ідомих цитокінів з широко показаними онкогенними властивостями Burke, 1997).

Згідно сучасних радіобіологічних поглядів клітини лімфоїдних органів озглядаються як гранично радіочутлива модель для досліджень впливу візуючого випромінювання на тваринний організм. Незважаючи на те, що в літинах гематопоетичного ряду було виявлено експресію цитокінів родини :РФ та їх рецепторів (Walz, 1995), роль ЕРФ у цих клітинах за умов розвитку ізних патологічних процесів ще не є досконально вивченою.

Мета та задачі дослідження. Метою даної роботи було дослідити собливості функціонування системи тирозинових протеїнкіназ рецептора РФ в лімфоїдних клітинах селезінки щурів в контрольних умовах та після дії шізуючої радіації в дозах 0,5 та 1 Гр. Для досягнення поставленої мети до івдань роботи входило:

. Оцінити рівні активності тирозинових протеїнкіназ у мембранах та цитозолі лімфоцитів селезінки опромінених тварин.

2. Виділити ЕРФ-рецепторну гирозинову протеїнкіназу із спленоцит: контрольних та опромінених тварин, вивчити її основні каталітичі властивості.

3. Проаналізувати чутливість рецептора ЕРФ у лімфоїдних клітинах селезінк до дії променевого фактору.

4. Дослідити участь рецепторних протеїнфосфатаз в регуляції ЕР сі рецепторних тирозинових протеїнкіназ в контрольних умовах та після д радіації.

5. Провести аналіз внутрішньоклітинних ефекторних ланок сигнальні системи ЕРФ та його рецепторів у лімфоїдних клітинах селезінк контрольних та опромінених тварин.

Наукова новизна роботи. Встановлено пострадіаційні порушенн функціональної активності тирозинових протеїнкіназ рецептора ЕРФ лімфоїдних клітинах селезінки щурів під впливом рентгенівськог опромінення. Вперше проведено комплексне дослідження впливу радіації н каталітичні властивості та регуляцію активності ЕРФ-рецепторни тирозинових протеїнкіназ, які було отримано з лімфоцитів селезінки через 1 годин після опромінення тварин у дозах 0,5 та 1 Гр. Показано, що порушенн регуляції ферменту в післяпроменевий період зумовлено часткової радіаційною інактивацією • системи рецепторних фосфатаз і проявляється вигляді розладів взаємодії ферменту з субстратами фосфотрансферазнс реакції. Виявлено участь внутрішньоклітинних сАМР-залежних протеїнкіназ радіоіндукованому шляху передачі сигналу від ЕРФ та його рецептора.

Практична значимість роботи. Результати, які було отримано під ча дослідження функціонування системи тирозинових протеїнкіназ рецептор ЕРФ в умовах дії променевого фактору, сприяють більш комплексном розумінню біохімічних механізмів радіоіндукованої сигнальної трансдукц лімфоїдних клітин селезінки. Оскільки процес розвитку неопластични трансформацій супроводжується подібними порушеннями функціонуванн даних ферментів, необхідним виявляється застосування засобів спрямоване корекції радіоіндукованих змін їх активності. Результати досліджень можут бути корисними при розробці науково-обгрунтованих шляхів створенн ефективних сполук, що здатні модифікувати дію іонізуючої радіації.

Особистий внесок здобувана. Здійснення інформаційного пошуку т оцінка літературних даних, проведення експерименту, аналіз та теоретичн обгрунтування результатів дослідження виконані дисертантом особистс Планування та розробка методичних підходів виконання комплекс лабораторних досліджень проведені з науковим керівником.

Зв’язок з наукового тематикою організації. Робота відповідає плану іауково-дослідної роботи кафедри біохімії біологічного факультету Сиївського національного університету імені Тараса Шевченка та виконана гідно з тематичним планом №97083 “Біохімічні механізми розвитку іроменевого ураження після дії іонізуючої радіації ” в рамках комплексної іаукової програми “Здоров’я людини”.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації викладені на /II Українському біохімічному з’їзді (Київ, 1997), III з’їзді по радіаційним іослідженням (Москва, 1997), II з’їзді українського біофізичного товариства Харків, 1998), ISREC Conference “Cancer and the cell cycle” (Switzerland, 1999), CRR Satellite Meeting “Biological Effects of Low Dose Radiation” (Ireland, 999), UICC Advanced Course on Cell Signaling and Cancer (Sweden, 1999), }ordon Research Conference (Singapore, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 4 статті в наукових курналах та 6 тез у матеріалах конгресів, конференцій, з’їздів.

Структура й обсяг дисертації. Дисертаційна робота складається з іступу, огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів юботи та їх обговорення, заключення, висновків, списку літератури, що ¡ключає 254 роботи. Дисертація викладена на 159 стор., має в своєму складі 5 рисунків, 2 таблиці. -

МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ.

В дослідженнях використовували білих щурів лінії Вістар обох статей іасою 130-150 г. Тварин опромінювали на установці РУМ-17 в дозах 0,5 і 1 Гр ;а умов: потужність дози в повітрі 24,5 сГр/хв, фільтри 1 мм Cu + 0,5 мм А1, іапруга 200 кВ, сила струму 5 мА, відстань до поверхні шкіри тварин 50 см.

Дослідження проводили через 12 годин після опромінення тварин, що є ерміном найбільш виражених порушень основних ланок метаболізму іімфоїдних клітин після опромінення в дозах 0,5 та 1 Гр (Кучеренко, 1996; )стапченко, 1998).

Лімфоцити селезінки отримували центрифугуванням клітинної суспензії m градієнті Ficoll-Paque (густина 1,077) за методом (Boyum, 1968).

Вміст циклічного аденозинмонофосфату в лімфоїдних клітинах визначали ;а методом (Steiner, 1972).

Препарат ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ отримували за >екомендаціями (Boutin, 1996) з використанням лінійного градієнта сонцентрації NaCl при елюції ферменту з BrCN-активованої сефарози ‘Sigma”, яку було попередньо зв’язано з моноклональними інтифосфотирозиновими антитілами 4G10 “INSERM”.

Інгібіторний аналіз отриманого препарату ЕРФ-рецепторних тирозинови протеїнкіназ проводили за рекомендаціями (Boutin, 1996) з використання! тирфостина та геністеїна “Sigma”.

Визначення активності ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ т вивчення їх автофосфорилювання проводили за методом (Glyn, 1992).

Визначення активності сАМР та cGMP-залежних протеїнкіназ проводил за методом (Gill, Walton, 1979); активності Са2+, фосфоліпідзалежни протеїнкіназ - за методом (Mire, 1985); активність Са2+, кальмодулінзалежни протеїнкіназ - як рекомендовано в роботі (Sato, 1990).

Активність усіх досліджуваних протеїнкіназ визначали за включення? 32Р з у-32Р/-АТР до білкових субстратів фосфотрансферазної реакції Радіоактивність вимірювали в толуольному сцинтиляторі ЖС-107, на рідинно сцинтиляційному лічильнику Delta (USA). Питому активність ферменті виражали в пмоль 32РН за 1 хвилину на 1 мг білка.

Активність ЕРФ-рецепторних протеїнфосфатаз визначали з модифікованим методом (Hardrer, 1994) по кількості неорганічного фосфату відщепленого від білкового субстрату. Питому активність протеїнфосфата виражали пмоль Рн за 1 хвилину на 1 мг білка.

Автофосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіна визначали методом гель-електрофорезу з подальшою авторадіографієк (Laemmli, 1970). ,

Концентрацію білка визначали за методом (Lowry, 1951) та (Bradford 1976). ,

Кінетичний аналіз отриманих результатів виконували за допомогою модифікованої програми “ENSFITTER”. Статистичну обробку результатів т побудову графіків проводили на IBM PC ET з використанням стандартни: пакетів прикладних програм.

РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Велика кількість онкогенних продуктів, накопичення яки спостерігається під час неопластичної трансформації клітин, являють собоь нормальні або спотворені елементи сигнальних систем ростових факторін Різноманітні ростові фактори, в свою чергу, виконують функцію регуляці росту, диференціювання й імунної відповіді лімфоїдних клітин. Вони берут участь в активації В- і Т-лімфоцитів шляхом зв’язування з поверхневим] мембранними рецепторами цих клітин. Завдяки відкриттю взаємозв’язку мі) ростовими факторами й онкогенами було виявлено, що онкогенн понадстимуляція сигнальної трансдукції реалізується через нормальну ростов; відповідь. Одна із ланок цієї сигнальної послідовності включає активаціє

ирозинових протеїнкіназ, яка часто інтенсифікується під впливом онкогенних родуктів (Liebow, 1992). Надмірна чи невідповідна продукція гормонів, ігандів (ростових факторів), рецепторів, тирозинових протеїнкіназ або їх убстратів може призводити до надлишкового росту клітини. Будь-яке омилкове збільшення активності тирозинових протеїнкіназ у рамках игнальної трансдукції викликає дисбаланс системи контролю росту ормальних клітин, що спричиняє клітинну трансформацію.

Нами вивчалася активність тирозинових протеїнкіназ у різних фракціях імфоїдних клітин селезінки щурів. У ході дослідження було виявлено, що ктивність тирозинових протеїнкіназ у цитозолі лімфоцитів селезінки щурів у рази перевищувала активність даного ферменту в мембранах.

У результаті дослідження впливу рентгенівського випромінювання у дозі ,5 Гр не було виявлено перерозподілу активності тирозинових протеїнкіназ у імфоїдних клітинах селезінки. В той же час підвищення дози «промінювання до 1 Гр призводило до істотного збільшення ярозинпротеїнкіназної активності в плазматичних мембранах досліджуваних літин. Спостережене підвищення тирозинпротеїнкіназної активності в ембранах лімфоцитів селезінки щурів через 12 годин після дії тотального ентгенівського опромінення в дозі 1 Гр можна розглядати як критичну стадію адіоіндукованої сигнальної трансдукції в лімфоїдних клітинах селезінки.

Відомо, що активація ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ ідбувається за міжмолекулярним механізмом шляхом взаємодії з цитокінами одини ЕРФ. Оскільки ліганд-рецепторна асоціація є головною та ершорядною умовою активації тирозинових протеїнкіназ, великий інтерес «кликало дослідження ЕРФ-індукованої активності тирозинових протеїнкіназ умовах дії рентгенівського випромінювання в досліджуваних дозах оказано, що за умов преінкубації лімфоцитів селезінки з ЕРФ активність ірозинових протеїнкіназ зростала в 4 рази в плазматичних мембранах зсліджуваних клітин (рис. 1).

Вивчення дії випромінювання на цей процес показало, що при цьому юстерігається статистично значуще зниження стимулюючої дії ЕРФ на співність рецепторних форм тирозинових протеїнкіназ (рис. 1). Цікавим ^являється те, що після дії рентгенівського випромінювання на тваринний зганізм не спостерігається зниження активності даного ферменту в клітинах, сі не було преінкубовано з ЕРФ. Радіоіндуковане зниження активуючої дії РФ поряд із підвищенням активності ЕРФ- рецепторних тирозинових зотеїнкіназ під впливом випромінювання в дозі 1 Гр може свідчити про шикнення порушень у взаємодії ЕРФ з його мембранними рецепторами, рім того, виявлений ефект може бути пов’язаним із залученням інших еханізмів, які викликають гіперактивацію ЕРФ-рецепторних тирозинових наз у післяпроменевий період.

І II III

Рис. 1. Вплив ЕРФ на активність [(А), пмоль(хв х мг)'1] ЕРФ - рецептори тирозинових протеїнкіназ у плазматичних мембранах лімфоцитів селезінь щурів у контролі (І) та після випромінювання в дозах 0,5 (II) і 1 Гр (III). білий колір - середовище інкубації без ЕРФ чорний колір - у присутності ЕРФ.

№фРаі*4*

Рис. 2. Профіль елюції ЕРФ-рецепторної тирозинової протеїнкінази лімфоцитів селезінки щурів при хроматографії на ВгСЫ-активованш сефаро: з антифосфотирозиновими антитілами. 1 - активність ферменту в присутнос' тирфостина; 2 - без тирфостина.

Серед таких механізмів, перш за все, можуть бути радіоіндуковаї конформаційні перебудови структури ферменту, які можуть привести д порушення його взаємодії з субстратами фосфотрансферазної реакції та регуляторами його активності

Для з’ясування можливих механізмів змін активності тирозинових кіназ у рамках досліджуваної моделі використовували ферментативний препарат ЕРФ- рецепторних тирозинових протеїнкіназ, який було отримано на колонці з BrCN-активованою сефарозою, попередньо зв’язаною з моноклональними інтифосфотирозиновими антитілами. ЕРФ-рецепторні тирозинові протеїнкінази елюювалися з колонки у вигляді одного виразного піка в інтервалі іонної сили 0,3-0,4 М градієнта NaCl (рис. 2). Причому, умови ілюції ферменту не змінювалися після опромінення тварин у дозах 0,5 і 1 Гр. Зстаннє може свідчити про відсутність будь-яких конформаційних змін ЕРФ-эецепторних тирозинових протеїнкіназ під впливом рентгенівського зипромінювання в досліджуваних дозах. Отриманий ферментативний трепарат було протестовано на тирозинпротеїнкіназну активність у присутності інгібіторів тирозинового фосфорилювання тирфостина та ■еністеїна. В ході інгібіторного аналізу виявилося, що тирфостин, який є зисоко селективним інгібітором ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ, юлодів виразним інгібіторним ефектом на досліджувану ферментативну іктивність. Геністеїн, який є тирозинпротеїнкіназним інгібітором загального гипу, взагалі не виявив гальмуючої дії. Цей факт дозволяє вважати, що іосліджуваний ферментативний препарат є саме ЕРФ-рецепторною гирозиновою протеїнкіназою.

Тирозинові протеїнкінази - це бісубстратні ферменти, які каталізують іереніс фосфатних груп від АТР на Тут залишки білкових субстратів. Тому в юдальшому було досліджено взаємодію ЕРФ-рецепторних тирозинових іротеїнкіназ із білковими субстратами та АТР.

В результаті вивчення субстратно! специфічності ЕРФ - рецепторних ирозинових протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки щурів по відношенню до >ізних екзогенних субстратів (пептид А: ARG- ARG-LEU-ILE-GLU-ASP-ASN-jLU-TYR-THR-ALA-ARG-GLY'; пептид В: ARG- ARG-LEU-ILE-GLU-ASP-VLA-GLU-TYR-ALA-ALA-ARG-GLY та ангіотензин II) виявилося, що іайкращим субстратом за нормальних умов протікання фосфотрансферазної »еакції є ангіотензин II (рис. 3). Гірше всього відбувалося включення фосфату io пептиду А. Опромінення тварин у досліджуваних дозах призводило до уттєвих змін субстратиої специфічності ферменту. Так, після опромінення в юзі 0,5 Гр найбільш активно фосфорилювався пептид В, що може вказувати іа неоднотиповий прояв дії радіації на взаємодію ферменту з субстратами іаної фосфотрансферазної реакції. Кінетичний аналіз не виявив суттєвих змін порідненості ферменту до білкового субстрату (ангіотензина II) в іісляпроменевий період. Пострадіаційне порушення було встановлено при іослідженні взаємодії даного ферменту з іншим субстратом зосфотрансферазної реакції - АТР, про це свідчить зменшення в 2,2 рази його порідненості до АТР при опроміненні тварин у дозі 1 Гр ( рис. 4).

Рис. 7 Вплив рентгенівського випромінювання на ступень фосфорилюванн різних екзогенних субстратів ЕРФ-рецепторними тирозиновим протеїнкіназами з лімфоцитів селезінки щурів.

А- контроль; В- випромінювання 0,5 Гр; С- випромінювання 1 Гр.

1- Пептид А; 2- Пептид В; 3- ангіотензин II.

А, пмоль(хв х мг)'1 А. пмольїхв х мгУ1

[АТР], мкмоль/л [ангіотензин II], мкмоль/л

Рис. 2. Залежність активності (А) ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіна

із лімфоцитів селезінки контрольних (----) та опромінених у дозах 0,5 (....

і 1 (—) Гр тварин від концентрації АТР й ангіотензина II.

Описаний характер радіаційного впливу на взаємодію ферменту з АТР цілком корелює з рівнем його активності через 12 годин після дії досліджуваних доз рентгенівського випромінювання (табл.). Це надає підстави зробити припущення про причетність порушень у взаємодії АТР з даним ферментом до його гіперактивації під впливом рентгенівського випромінювання в дозі 1 Гр.

Таблиця.

Активність ферментативного препарату ЕРФ-рецепторних тирозинових

протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки контрольних та опромінених тварин (М ± ш; п=3-5).

Стан Активність ферменту,

пмоль/(хв х мг)

Контроль 33,30+ 0,32

Випромінювання в дозі 0,5 Гр 31,95 ±0,28

Випромінювання в дозі 1 Гр 57,76 ±0,18*

’р<0,05 порівняно з контролем

Взаємодія ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ з АТР взагалі набуває функціональної значущості для цих ферментів. Фосфорильовані внаслідок цього тирозинові залишки виконують функцію адапторних модулів зв’язування ферменту з тригерними сигнальними молекулами. З іншого боку, фізіологічна активність рецепторних тирозинових протеїнкіназ забезпечується компенсаторною дією системи рецепторних тирозинових фосфатаз, яка спрямована на автофосфорильовані тирозинові залишки, що входять до структури каталітичних доменів рецепторів ЕРФ. Таким чином, зв’язування рецепторних тирозинових протеїнкіназ із тригерними молекулами цілком залежить від ступеня їх автофосфорилювання.

Встановлено, що рентгенівське опромінення тварин у дозі 1 Гр викликає значне збільшення ступеня автофосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ, що супроводжується порушенням кінетичних констант (Км і Утах) (рис. 3). Результати, які було отримано при дослідженні зівня мембранозв’язаної фосфатазної активності в умовах дії радіації, дозволяють припустити залучення системи рецепторних тирозинових фосфатаз до радіоіндукованої зміни ступеня автофосфорилювання ЕРФ-зецепторних тирозинових протеїнкіназ (рис .4).

Таким чином, визначене нами гіперфосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинових кіназ з лімфоцитів селезінки тварин, опромінених у дозі 1 Гр, ноже розглядатися як наслідок часткової радіоіндукованої інактивації фосфатаз, що в свою чергу призводить до збільшення кількості {юсфотирозинових залишків у складі ЕРФ-рецепторних тирозинових кіназ. Зстаннє потенціює зв’язування цих ферментів з їх субстратними мішенями, хжільки фосфотирозинові залишки у складі досліджуваних кіназ виконують функцію модулів зв’язування сигнальних молекул.

А,

пмоль(хв х мг)"1

Рис. 3. Залежність автофосфорилювання ЕРФ-рецепторних тирозинови> протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки контрольних (—) та опромінених у доза* 0,5 (.) та 1 (—) Гр тварин від концентрації АТР.

Рис. 4. Активність (А) тирозинових протеїнфосфатаз мембран лімфоцити селезінки щурів в умовах променевого впливу.

1-контроль; 2- рентгенівське випромінювання в дозі 0,5 Гр;

1- рентгенівське випромінювання в дозі 1 Гр.

Порушення функціональної активності ЕРФ-рецепторних тирозинових ротеїнкіназ, які виникають внаслідок дії випромінювання, надають підставу чікувати дисбаланс тригерних внутрішньоклітинних сигнальних ослідовностей, які мають місце при трансдукції сигналу від ЕРФ та його ецепторів.

Нами було досліджено внутрішньоклітинну активність циклонуклеотид-, альцій-залежних і тирозинових протеїнкіназ у відповідь на ЕРФ стимуляцію імфоїдних клітин селезінки контрольних та опромінених у досліджуваних озах тварин (рис. 5). Як за контрольних умов, так і після опромінення не було иявлено статистично значимих коливань рівнів активності сСМР-, !а2+/фосфоліпід-, кальмодулінзалежних та тирозинових протеїнкіназ у итозолі спленоцитів щурів, які було попередньо преінкубовано з ЕРФ. Однак, ри цьому спостерігалося дворазове ЕРФ-індуковане підвищення активності АМР-залежної протеїнкінази лімфоцитів селезінки контрольних тварин. Іпромінення тварин у дозі 0,5 Гр не призводило до статистично значимих шн ЕРФ-індукованої внутрішньоклітинної А-кіназної активності. Однак, під пливом іонізуючого випромінювання в дозі 1 Гр спостерігалося зниження ктивності ферменту в 1,3 рази.

Післяпроменева зміна сАМР-залежної протеїнкіназної активності в итозолі преінкубованих з, ЕРФ лімфоцитів селезінки цілком узгоджується з івнем мембранної тирозинкіназної активності рецептора ЕРФ у цих клітинах і умов дії радіації. ._

Таким чином, отримані результати дають можливість очікувати, що в імфоїдних клітинах селезінки щурів в процес передачі сигналу від ЕРФ та ого рецептора може залучатися аденілатциклазна система.

Для з’ясування механізмів такої участі було визначено вміст циклічного ценозинмонофосфату в цитозолі лімфоцитів селезінки щурів, які було опередньо преінкубовано з ЕРФ. Результати проведеного дослідження не иявили статистично значимих змін вмісту циклічного аденозинмонофосфату ід впливом стимуляції клітин ЕРФ як за контрольних умов, так і за умов гнтгенівського випромінювання у досліджуваних дозах. Тому, вірогідно, становлений ефект пригнічення ЕРФ-індукованої А-кіназної активності в острадіаційний період можна пояснити зниженням спорідненості цього ерменту до сАМР, що було раніше встановлено дослідниками нашої абораторії при вивченні особливостей зв’язування цього циклічного уклеотиду з сАМР-залежними протеїнкіназами лімфоцитів щурів в умовах пливу радіації (Остапченко, 1997). В свою чергу, зниження спорідненості А-¡наз під впливом випромінювання опосередковується радіоіндукованою перактивацією ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ у лімфоїдних іітинах селезінки.

8.Й.Й..а

ш

40

35

^ 30 5

X 25 а

і 15

І 10 ■ с

5

II

° із

III

Рис. 5. Активність [пмоль/(хв х мг)] різних протеїнкіназ у цитозолі лімфоциті селезінки контрольних (І) та опромінених у дозах 0,5 (II) і 1 Гр (III) тварин.

А - сАМР-залежні протеїнкінази; й - сОМР-залежні протеїнкінази;

С - Са2+/фосфоліпід-залежні протеїнкінази; .

КМ - кальмодулін-залежні протеїнкінази; ТК - тирозинові протеїнкінази; чорний колір- преінкубація клітин з ЕРФ; сірий колір- без ЕРФ.

15

5

Результати представленої роботи свідчать, що ЕРФ-рецепторні ирозинові протеїнкінази залучені до механізмів радіаційноіндукованої ідповіді імунокомпетентних клітин селезінки щурів та опосередкують ефекти игнальної трансдукції епідермального ростового фактора в цих клітинах за мов дії випромінювання в дозі 1 Гр, що може бути графічно відображено аступним чином:

хема сигнальної трансдукції Епідермального Ростового Фактору (ЕРФ) лімфоцитах селезінки щурів.

X - вплив рентгенівського випромінювання в дозі 1 Гр.

Ц-аденілатциклаза; РТФ-рецепторна тирозинова фосфатаза; РТП-рецепторна фозинова протеїнкіназа; ПКА-протеїнкіназа А; ПКС-протеїнкіназа С; ОгЬ2-іапторний білок; ФІ-ЗК-фосфоінозитид-З-кіназа; ФЛС-фосфоліапза С; [АРК-мітоген активована протенкіназа; с-Гоб, с-іип, БЯР-фактори )анскрипції;

формі куль зображено фосфотирозинові залишки, тінню відмічено ідіоіндуковані механізми сигнальної трансдукції.

ВИСНОВКИ

1. Встановлено, що рецепторні тирозинові протеїнкінази виконують функці молекулярного механізму, який опосередкує ефекти сигнальної трансдуки епідермального ростового фактора (ЕРФ) в лімфоцитах селезінки щурів бере безпосередню, участь у формуванні радіоіндукованої відпові. імунокомпетентних клітин на дію рентгенівського випромінювання в до ІГр.

2. Вивчено вплив ЕРФ на активність мембранозв’заних тирозиновг протеїнкіназ у лімфоїдних клітинах селезінки та виявлено пригнічення йоі активуючої дії після радіаційного впливу в дозі 1 Гр.

3. З мембран лімфоцитів селезінки в контролі та через 12 годин піс; опромінення методом імуноафінної хроматографії було виділено EPd рецепторну тирозинову протеїнкіназу, активність якої зберігалас незмінюваною під впливом випромінювання в дозі 0,5 Гр та зроста; на 58 % при опроміненні в дозі 1 Гр.

4. Вивчено взаємодію ферменту з субстратами фосфотрансферазної реакці ангіотензином II та АТР. При опроміненні тварин у дозі 1 Гр встановлеї порушення спорідненості ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ і АТР (збільшення в 2 рази).

5. Методом авторадіографії проаналізовано ступінь автофосфоршпованг ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ. Встановлено, що за умов д випромінювання в дозі 1 Гр процес автофосфорилювання інтенсифікуєтьс що супроводжується збільшенням Vmax у 2 рази.

6. Досліджено активність ЕРФ-рецепторних протеїнфосфатаз як регуляторні ланки функціонування рецептора ЕРФ у лімфоцитах селезінкі встановлено двократне пригнічення їх активності після впливу радіації.

7. Встановлено залучення сАМР-залежних протеїнкіназ до реалізації ефект радіоіндукованої активації ЕРФ-рецепторних тирозинових протеїнкіназ.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Томачинська Л. І., Долішняк О. І., Кірпенко Т. О. Са2+, кальмодулінзалежі протеїнкінази лімфоцитів селезінки щурів: особливості виділення і властивості // Вісник КУ. - 1998, № 27. - С. 18-20.

2. Остапченко Л. І., Нальовіна О. Є., Кірпенко Т. О. Автофосфоршиоваш сОМР-залежних протеїнкіназ із лімфоцитів селезінки щурів // Вісник КУ.

1998, №27.-С. 23-25.

3. Кірпенко Т. О., Остапченко JI. I., Кучеренко М. Є Вплив випромінювання на активність тирозинових протеїнкіназ в лімфоїдних клітинах селезінки та тимусу щурів //Доповіді НАН України. - 1999, № 6. - С. 173-176

4. Кірпенко Т. О., Остапченко Л. І., Шаповал І.М. Вивчення фосфорилювання білкових субстратів тирозиновими протеїнкіназами лімфоцитів селезінки щурів під впливом променевого й онкологічного факторів і! Вісник КУ -1999, №29. -С.32-34.

5. Остапченко Л. І., Нальовіна О. Є., Долішняк О. І., Кірпенко Т. О. Дослідження властивостей Са2+, кальмодулінзалежної протеїнкінази лімфоцитів селезінки щурів // VII Український біохімічний з'їзд. - Київ. -1997. -С. 183.

). Остапченко Л. И., Нальовина О. Е., Кириенко Т. О. Влияние рентгеновского облучения в дозах 0,5 .и 1 Гр на регуляцию активности циклонуклеотид- и кальцийзависимых протеинкиназ из лимфоцитов селезёнки крыс /7 III съезд по радиационным исследованиям. Москва. -1997. - С.124-125.

’ Кірпенко Т. О., Остапченко Л. I., Остапченко С. Г., Нальовіна О. Є. Вивчення впливу випромінювання на конформаційний стан систем фосфорилювання лімфоцитів селезінки // II з’їзд українського біофізичного товариства. Харків. - 1998. - С. Зс.

. Kirpenko Т. О., Naloviiîa О. Е., Ostapchenko L. I. Tyrosine Protein Kinase activity in lymphoid cells of spleen and thymus under the influence of X-ray irradiation // ISREOConference “Cancer and the cell cycle”. Switzerland. -

1999.-P.46.

. Kirpenko Т. O., Nalovina О. E., Ostapchenko L. I. Possible causes of tyrosine protein kinase activity disruption in lymphoid cells of thymus under the influence of X- ray inadiation in low doses // UICC Advanced Course on Cell Signaling and Cancer. Sweden. - 1999, — P. 119.

0.Kirpenko Т. O., Nalovina О. E., Ostapchenko L. I. The changes in autophosphorylation degree of EGF receptor Tyrosine Protein kinase from spleen lymphocytes under the influence of X-ray irradiation and downstream signaling events // Gordon Research Conference. Singapore. - 1999. - P.24.

АНОТАЦІЯ

Кірпенко T. О. Функціональна активність системи рецепторних ірозинових протеїнкіназ у лімфоцитах селезінки щурів за умов радіаційного їливу. - Рукопис.

исертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за іеціальністю 03.00.04 - біохімія. - Київський національний університет імені іраса Шевченка, Київ, 2000.

Узагальнено результати вивчення функціонування ЕРФ - рецепторни тирозинових протеїнкіназ у лімфоцитах селезінки щурів за умов радіаційног впливу. Встановлено порушення активуючого ефекту епідермальног ростового фактора на активність рецепторних тирозинових протеїнкіназ післ дії рентгенівського випромінювання в дозі 1 Гр, яке супроводжується ЗМІНО! взаємодії ферменту з субстратом фосфотрансферазної реакції - АТР. Пр цьому спостерігається інтенсифікація процесу автофосфорилювання ЕРФ рецепторних тирозинових протеїнкіназ, що обумовлено виникнення! дисбалансу в функціонуванні системи рецепторних тирозинових фосфата: сАМР-залежне фосфорилювання є залученим до реалізац внутрішньоклітинних ефектів радіоіндукованої активації ЕРФ-рецепторни тирозинових протеїнкіназ в лімфоцитах селезінки.

Ключові слова: цитокіни, рецепторні тирозинові протеїнкіназі

протеїнфосфатази, рентгенівське випромінювання, лімфоцити селезінки.

АННОТАЦИЯ

Кириенко Т. О. Функциональная активность системы рецепторны тирозиновых протеинкиназ в лимфоцитах селезёнки крыс в условия радиационного воздействия. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук п специальности 03.00.04 - биохимия. - Киевский национальный университе имени Тараса Шевченко, Киев, 2000.

Обобщены результаты изучения функционирования ЕРФ - рецепторны тирозиновых протеинкиназ в лимфоцитах селезёнки крыс в условия радиационного воздействия. Выявлено нарушение активирующего эффект ЕРФ на активность рецепторных тирозиновых протеинкиназ после действи рентгеновского излучения в дозе 1 Гр, которое сопровождается изменение: взаимодействия фермента с субстратом фосфотрансферазной реакции - ATI При этом наблюдается интенсификация процеса автофосфорилирования ЕР<Е рецепторных тирозиновых протеинкиназ, что обусловлено возникновение] дисбаланса в функционировании системы рецепторных тирозиновы фосфатаз. В реализации внутриклеточных эффектов радиоиндуцированно активации ЕРФ-рецепторных тирозиновых протеинкиназ в лимфоцита селезёнки принимает участие сАМР-зависимое фосфорилирование.

Ключевые слова: цитокины, рецепторные тирозиновые протеинкиназь протеинфосфатазы, рентгеновское излучение, лимфоциты селезёнки.

ANNOTATION

Kirpenko T. O. The functioning of receptor tyrosine protein kinase’s system l rat spleen lymphocytes under the influence of X-ray radiation, lissertation for the obtaining of the scientific degree of the specialized in 00.03.04 -iiochemistry, Taras Shevchenko Kyiv national university. Kyiv, 2000

The Epidermal Growth Factor Receptor (EGF-R) has been shown to play a rucial role in radio-induced signaling response in rat spleen lymphocytes. The ;sults of study of EGF receptor tyrosine protein kinase’s functioning in rat spleen rmphocytes under the influence of X-ray radiation have been summarized. The 2-)ld increase of its Tyrosine Protein kinase domain activity under the influence of >ray irradiation in dose of 1 Gy has been established. At the same time there is no atistically significant alteration in the level of enzyme activity after irradiation of its in dose of 0.5 Gy. However, we have also determined a partial reduction of GF stimulating action on its receptor Tyrosine kinase activity in conditions of radiation. To clarify a reason of hyper-activation of EGF-R Tyrosine kinase we ave carried out partial purification procedures with using the antiphosphotyrosine itibodies and then valued the autophosphorylation rate of this enzyme by jtoradiography and kinetic analysis. These data reveal the significant itensification of EGF-R tyfosine kinase autophosphorylation in combining with a screased binding constant of autophosphorylated enzyme to ATP under the ifluence of X-ray irradiation in dose of 1 Gy. Although, kinetic analysis of enzyme iteraction with a various exogenous substrates performed by us earlier has not îown a disruption on the level of enzyme-substrate association under the influence f X-ray irradiation.

The post-radiation intensification of EGF-R tyrosine kinase itophosphorylation in combining with a decreased binding constant of jtophosphorylated enzyme to ATP could suggest a protein phosphotase system ivolvement in radiation-induced signaling of EGF and its receptor. As a result of îrformed research we established a decrease of EGF-R phosphatases activity in mditions of radiation. For instance, the irradiation in dose of 1 Gy leads up to 2-ild inactivation of EGF-R phosphatases. The influence of X-ray irradiation in dose f 0.5 Gy is characterized by the same type effect.

Consequently, the above mentioned hyperphosphorylation of EGF-R tyrosine otein kinase in spleen lymphocytes of rats irradiated in dose of 1 Gy could be )nsidered like a result of partial phosphatase inactivation. Apparently, this event in m provokes the increased number of phosphorylated residues within EGF-R, hich have been shown to play a role of adapter sites in interaction with nvnstream signaling molecules. In this way it is appeared the probability of )tentiation of EGF-R tyrosine kinase trigger molecules.

Obviously, the above mentioned disruptions might result in alteration of nvnstream signaling pathways, which include activation of distinct Protein

kinases. As a result of examination of intracellular Protein kinases activitie (cAMP-, cGMP-, Ca2+/phoshpolipid- and Calmodulin-dependent Protein kinases after spleenocytes stimulation by EGF we have observed a significant increase c cAMP-dependent Protein kinase activity in control rats, while it has been reduce under the influence of X-ray irradiation in dose of 1 Gy.

After performed researches we suggest that cytosolic cAMP-dependent Protei kinase participates in radio-induced signal transduction pathways through EGF an its receptor in rat spleen lymphocytes and it is accompanied by EGF-R Tyrosin kinase domain hyperautophosphorylation.

Thus, EGF-R tyrosine protein kinases are involved in radiation-induce response of immune competent spleen cells and mediate the effects of EGF signe transduction in these cells in 12 hours after rat’s irradiation in dose of 1 Gy.

Key words: cytokines, receptor tyrosine protein kinases, protein phosphatase: X-ray radiation, spleen lymphocytes.