Функционализация клеток микроорганизмов с использованием полиэлектролитов и наночастиц

Фахруллин, Равиль Фаридович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Функционализация клеток микроорганизмов с использованием полиэлектролитов и наночастиц
ВАК РФ 03.02.03, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Функционализация клеток микроорганизмов с использованием полиэлектролитов и наночастиц"

4852728

фахруллин Равмль Фаридович

ФУЖЦИОНАЛИЗАЦИЯ {СЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ И НАНОЧАСТИЦ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических на)-к

8 СЕН 2011

На правах рукописи

Фахруллин Равиль Фарцдович

ФУШЩИОНАЛИЗАЦИЯ Ю1ЕТОК МИКРООРГАНИЗМ О В С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ПОЛИЭЛЕКТРОЛИТОВ И НАНОЧАСТИЦ

03.02.03 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени доктора биологических наук

Работа выполнена в ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г. Казань, Республика Татарстан.

Научный консультант:

Член -- корр. АН РТ, доктор биологических наук, профессор

Ильинская Ольга Николаевна

Официальные оппоненты:

Член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор

Ведущая организация: Ульяновский государственный университет

Защита диссертации состоится «29» сентября 2011 г. в 13°° на заседании диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, 18, КФУ, Главный корпус, ауд. 211.

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.

Ившииа Ирина Борисовна

доктор медицинских наук, профессор

Поздеев Оскар Кимович

доктор биологических наук, профессор

Чернов Владислав Моисеевич

Автореферат разослан

Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук

З.И. Абрамова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. В последние годы развитие пршлически-

ориептироваиных технологий на стыке биологии, физики, химки. электроники и материаловедения привело к формированию нового взгляда на роль микроорганизмов в создании биоашииглчееких и биоэлектронных ycipoñeiB, которые уже в ближайшее время мот ю прототинных проектов преврати ься в рабочие инструменты биомедшшны, -жо логического мониторинга и вычислительной техники.

Микроорганизмы рассматриваются как перспективный объект исследований в области синтетической биологии и биомиметики, междисциплинарных науках, целями которых являются создание искусственной жпзни и биоимитирующих материалов и функциональных устройств, соответственно. Достижении синтетической биологии н биомиметики позволяют конструировать новые, основанные на биологических механизмах и процессах, технологии и устройства, применяемые практически во всех областях хозяйственной деятельное™ человека. Так, генетически модифицированные микроорганизмы могут быть использованы в качестве элементов биосенсоров (Huang et al., 2008), u масштабном производстве рекомбинантных белков и лекарств, а также в выработке биотоплива (Ro el al.. 2006; Atsumi et al., 2009). а такие свойства микробных сообществ как, например, чувство кворума, могут быть использованы в логических устройствах и в микроэлектронике (Si Iva-Rocha, Lorenzo, 2008;' Danino el al.. 2010). В связи с развитием наиотехнологии как междисциплинарной области исследований, возник особый интерес исследователей к работам, в которых осуществляется комбинация функциональных свойств микробных- клеток и наноразмерных ыруктур (нанопленок, наночастиц, квантовых точек, наиотрубок и т.д.) (Berry, Saraf, 2005; Suguuati el al., 2007). В результате были получены и описаны гибридные биоимитирующие системы, состоящие из клеток микроорганизмов и наночастиц (Bai et al.. 200У). Предполагается, что такие системы могут быть использованы в качестве электронных микроконтактов (Berry el al.. 2005). микропроводов (Li el al.. 2003) и средств -эффективной терапии онкологических заболеваний (Kuo el al., 2008). Кроме того, модификация клеток микроорганизмов позволяет придать им дополнительные функции, не свойственные исходным, но модифицированным клеткам. Например, искусственный магнстогаксис. обусловленный комбинацией мапшпшх наночастиц и микробных клеток, обсспсчииаег осуществление манипуляций с модифицированными клетками в пространстве с использованием внешнего магнитного ноля, что, в итоге, дает- возможность создания новых сорбентов и ферментативных комплексов на основе микроорганизмов (Salarik et al., 2007). Кроме того, были разработаны методы упорядоченной иммобилизации клеток на поверхностях биозлектронных устройств (Berry el al.. 2004) и созданы прикрепленные к субстратам биоплешеи (Eun, Weibel, 2009), имеющие строго определенную геометрическую форму. В ряде последних публикаций наблюдается тенденция к переходу от работы с миллиардами клеток к использованию единичных, индивидуальных клеток микроорганизмов (Song et al., 2005), организованных в виде искусственных многоклеточных кластеров (Gupta et al.. 2008; Gupta et al., 2010; Regot ct a!.. 2011). Таким образом, функционализмцня клеток микроорганизмов, то есть контролируемое придание клеткам новых

функциональных возможностей, и создание биоанолитнческпх устройств и упорядоченных многоклеточных кластеров являетоя одним из наиболее перспективных направлений на стыке микробиологии, физической и коллоидной химии, ппнотекиологни и биоэлектроники.

В соответствии с вышеизложенным были определены цель и задачи настоящего исследования.

Целы« работы стала разработка методологических основ функкионализадая клеток микроорганизмов с помощью модификации поверхности микробных клеток полимерными нанопленками и наночастицами различной природы и формирования на их основе гибридных биоана литических систем и упорядочен![ых многоклеточных кластеров.

Основные задачи исследования:

1. Разработка бкосовместиммх методов функштонализации клеток мшероор! аннзмов при помощи многослойных пленок полизлектролитов, локированных наиочаошцоми золога, серебра, оксида железа и углеродными нанотрубкамн.

2.Виоимитируюгцая микроннкапеуляция клеток микроорганизмов при помощи мезопорисгых неорганических микроободочек из карбоната кальция.

3.РазраОкнка методов пробытодтотовки образцов микроорганизмов для их характеристики при помощи поверхностно-усиленной спектроскопии комбинацинного рассеяния (Романовской спектроскопии).

4.0нрсделснис возможности использования функционализированных клеток микроорганизмов в качестве биоредепторвых элементов электрохимических биосенсоров и микрофаюидиых аналитические устройств.

5.0ценка эффективности использования функционализированных клеток-биорепортеров в анализе токсичности жидких сред.

6.Конструирование трехмерных многоклеточных кластеров определенной геометрии с использованием функционализированных клеток микроорганизмов и неорганических темплзтов.

Научная нотпна и значимость работы. Разработан универсальный метод функционализации клеток микроорганизмов при помощи функциональных нзночастшь включенных в состав многослойных пленок полюлиаролнтов, позволяющий сохранить жизнеспособность клеток. Показано сохранение жизнеспособности и ферментативной активности в функционализированных клетках. Установлено, что некоторые аспекты жизнедеятельности и биохимического состава фуикцнонализированиых клеток могут быть изучены с использованием спектроскопических и электрохимических методов.

Впервые показан феномен образования микрооболочек из карбоната кальция (фатерита) иа поверхности клеток микроорганизмов в процессе копреиииитации ионов Са21' и СО/' в водной среде без • утраты жизнеспособности ш нсапсу.шроваин ых клеток.

Установлено, что фушеционализация клеток микроорганизмов при помоши биосовместимых полимер-стабилизированных магнитных ианочастин не оказывав! ингибирующего воздействия на геногоксин-обусловленный синтез зеленого флуоресцентного белка в клетках дрожжей Saccharomyves ceivrisiae и люциферазы в бактериях Acinetobacter baylyi, а также на процесс фотосинтеза п одноклеточны* водорослях Chlorellapyrenoidosa.

- - Впервые были получены и охаратсгеризованы стабильные трехмерные многоклеточные кластеры (названные нами цитозомами). представляющие собой fибридпые коллоидные микрочастицы, состоящие н-л живых клеток дрожжей, включенных в микроскопические полизлектролиптме полые капсулы с определенной и контролируемой геометрической структурой. Морфологическое сходство цитозом с некоторыми примитивными колониальными и. многоклеточными организмами. а также простота и широкая распространенность в природе частиц, подобных использованным нами темплатам (микрокристаллы и мвкропузырьки воздуха) дает основание предполагать, что аналогичный процесс мог иметь место в эволюционном процессе возникновения многоклеточных организмов.

Практическая значимость работы. Разработан метод иммобилизации широкого спектра наноматериалов на поверхности клеточных стенок микроорганизмов (Патент РФ № 23773)0). На основе данного метода разработаны электрохимические биосенсоры для определения общей токсичности среды и гербицидов триазтювого ряда с использованием фушеционализированпых клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и одноклеточных водорослей Chlorella pyrenoidosa. Впервые разработана методика пробоподготовки образцов микроорганизмов путем послойной функционализации единичных клеток с помощью полимерных пленок и наночастиц благородных металлов для их идентификации при помощи Римановской спектроскопии.

Разработана .эффективная методика синтеза стабильных гидрофильных биосовмесшмых наночастиц (средний диаметр 15 нм) оксида железа. С использованием данных наночастиц в качестве модификаторов поверхности клеток были впервые созданы микрофлюидные биоапалитические устройства для анализа генотоксичности (на основе магнитно-модифицированных клеток дрожжей GгеепScгееп1М) и магнитно-модифицированные клеткн-биорепортеры для анализа широкою спектра токсикантов (салициловая кислота, толуол, алканы с различной длиной углеродной цепи) на основе штаммов бактерий Acimtobacter haylyi (заявка на Патент Китайской Народной Республики № ZJ .201010513790.5).

Разработанная методика контролируемого нанесения клеток на поверхности коллоидных чаешц позволит оптимизировать методические подходы в создании биологических микрореакгоров, а также в тканевой инженерии.

Материалы диссертации используются в лекционных курсах «Основы бионанотехнологии» и «Философские вопросы в биологии» биолого-почвенного факультета Казанского (Приволжского) федерального университета: "Topies in Physical Chemistry" химического отделения университета г. Халл (IJmvcrsifv of Hüll. United Kingdom) u учебном курсе «Основы биологической химии» для студентов специальности «Химическая технология пищевых добавок и косметических средство в Национальном университете «Лынвська Полпехнтка». Львов, Украина.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Разработанный метод фушошопализащш клеток микроорганизмов, основанный на послойном нанесении тонких пленок полиэлектролитов, допированных наночаетицами золота, серебра, оксида железа и углеродными нанотрубками. применим для создания новых биоимитирутоших. систем.

2. Реакция соосаждепия ионов СО3" « Са*"" из раетовора в присутствии клеток микроорганизмов приводи) к образованию мезопористых неорганических микрооболочек из карбоната кальция на клеточных стенках.

3. Модификация поверхности микробных клеток функциональными паночасгицами (нанопастшш благородных металлов, оксида железа, углеродные нанотрубки) позволяет осуществлять характеристику микроорганизмов методом поверхностно-усиленной Римановской спектроскопии и использовать их в качестве биорсцепторных ■»лсментон в микрофлюидных и электрохимических биоаиалитическнх устройствах.

4. Микроорганизмы и неорганические темнлагы, модифицированные при помощи MHoi ослойных полюлектролитных пленок, образую г трехмерные многоклеточные кластеры (цитоюмы), воспроизводящие геометрическую форму icMiuiara и являющиеся гишлсти ческой моделью первичных колониальных м и к рооргаи измов.

Апробации работы. Основные результаты исследований были представлены и обсуждены на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского " государственного университета (2008-2010 гг.); И и IV международных конференциях «Современные достижения бионаиоскопии» (Москва, 2008. 2010): II международной научно-практической конференции "Постгаюмная эра в биолог ии и проблемы биотехнологии" (Казань. 2008); XII и XIV международных научных молодежных школах "Когерентная Оптика и оптическая спектроскопия" (Казань, 2008, 2010); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); всероссийской школе для студентов, аспирантов и молодых ученых «Нанотехнологин: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010, пленарный доклад), 2nd Saint - Petersburg international ccmfercnce of Nan о Bi oTechno! ogi es «NanoBio'08» (С.-Петербург, 2008); VIII научной конференции научно-образовательного центра КГУ «Материалw и технологии XXI века» (Казань, 2008); XIII всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Казань. 2009); Annual Materials Research Society Fall Meeting (Boston, USA, 2009); XIII международной конференции «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений V Кирпичпиковские чгешш> (Казань. 2009); 13л Annual European Symposium «SymBioSlî 2009: «Biology: expansion ol" Borders» (Kazan,. 2009): 14Ih UK Polymer Colloids Forum Annual Meeting (Hull, United Kingdom, 2009); V МЗжнародиа коиферешвя^БЬяопж вщ молекули до бюсфсри" (Харыав, Украша, 2010, пленарный доклад); Ist International Conference of Young Scientists "Chemistry and Chemical Technology" (Lviv, Ukraine, 2010, приглашенный доклад); 14th International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Groiiingen, Tlie Netherlands, 2010).

Место выполнении работы и личный вклад! соискателя. Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала базируются на результатах собственных исследований автора. Личный вклад автора состоял в планировании и проведении исследований, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов, их оформлении для публикаций. Экспериментальные данные были получены авгором за время работы на кафедрах биохимии и микробиологии Казанского (Приволжского) федеральною университета. Эксперименты но характеристике

1с.:е:ок- с помощью сканирующей -.иеюроинон микроскопия н Римановской микроскопии проведены и лаборатории др-а М. Чулха ил клфо.чрс юно!шеи и бноинженерии университета Йе/ииепе (>Чч!11ере Iiimcrsltc-.se. Стамбул. Турция). Исследования по созданию цин>'!<>м и сшиву маишшых наночастиц проведены в лайораюрии др-а В. Наумова на кафелре химии \iiimepcmeia ]. Халл П.'¡нмччиу оГ1ш11. Халл, Великобритания). Исследования по магнитной фушециоиалнчации и характеристике бшаериальнын биорепор1ерн«ч клеток 'осуществлены I» лаборатории '.экологической микробноло!ин др-а И. Хуаша и Иееледовагсльском институте Крото университета г. Шеффилд (1)ш\еш1у о1' ХЬе1'йе1<1 Шеффилд. Великобритания).

С'ввчь работы с научными программами. Работа выполнялась в еоо течетвии с темами НИР Кзл-шекот (Приволжскою) федерального университета: «Механизмы регуляции функциональной активности клетки» л «Исследование биомакромолекул, учасп-лчощих в регуляции метаболизма животных и растительных клеток. Разработка панотехиологически.ч методой определения компонентов». Исследования выполнены при поддержке граню» Правительство Республики Татарстан «Алгарыш» (2006. 2008). Академии наук Республики Татарскш №1+Т5 (I>2009 и РФФИ № 09-04-05079-6. а также персональных стипендий университеюв 1. Халл, Великобритания (2009, 2010). I. Шеффилд. Великобритании (2010) и уииверстшета Йедитсис, Стамбул. Турция (2007. 2008.2009).

Пу&шкакни результатов исследования. По теме диееер1ацнн

опу бликовано 49 печатных работ. 18 из которых представлены в рецензиру емых журналах, рекомендованных ВАК. Получен патент Российской Федерации и подана заяви на патент Китайской Народной Республики. Также опубликованы: глава в учебно-методическом пособии. 4 статьи в сборниках материалов конференций и 24 тезиса докладов научных конференций.

Объем и структура диссертационной работы. Работа изложена па 340 страницах машинописно!'о текста, содержит 7 таблиц и 133 рисунка. Днсссрташм соаоич из введения, обзора литергпуры, описания материалов и методов исследования, четырех глав, где описаны и обсуждены результаты исследований, выводов, списка цитируемой лшературы. включающего 400 источников и приложения.

СОДЕРЖАНИЕ РАВОТЫ МАТЕРИАЛЫ II МЕТОДЫ 11 С'СДКДОВЛН11Я

Микроорганмшы. В работе использовали пищевые дрожжи Хасс/ыптп-зсех счкНчше (ЛШяоп). а гакже рекомбинашные дрожжи Л'. сегеиМае С.гееп.Чсгееп1М (ОеШготх ы.). Культу ру дрожжей поддерживали с использованием стерильных сред, согласно меГодике фирмы ОеШгош.ч Ы. В геноме дрожжей С.геепЯегееи™ в последовательное!!. промотора гена ЯШУ, кодирующего комплекс ферменчов, отвечающих за репарацию ДНК. введен 1ен, кодирующий экспрессию усиленною зеленого флуоресцентного белка (уЕОРР). При взаимодействии дрожжей Огееп^сгееп11' с геншокоичными веществами, вызывающими повреждения ДНК. активизируется синтез ферментов репарации под промотором 1спа НЛИ.Ч. что нниниирует сиачеч уЕОРР, флуоресцирующего при возбуждении клеток свеюм с длиной волны 488 нм. нри этом интенсивность фяуоресиснннн нронорцноналыш

icolщешрши;и !"(.'истоксмчио!о вещества n среди (Van Compel et al., 2005; Knight et ill., -iüi-ii (¿(кюрии Ем-hi'richUt coli и Siuphibcoccus cohnii т коллекции микроорганизмов кафедры генежки и биоинженерии УШШОреНТСШ ЙеДИТСНС культивировали с. чашках Петри на питательном arapc (Sigma) и аэробных условиях г; i счсппе 24 ч при 37"С. Бактерии Acinetobacter bavlvi дикого типа и три 6iiopc!k>pivp!u.i4 штамма были получены и лаборатории -экологической микрпСжйжчт Мссясдонагеяьекпго HiiciMiyia Крою, уннверсигег г. Шеффилд: Л. Nniyi ADI'líBD I 13) (лиюIii ran) и I ) A. bay hi ADPWH lux - биорепоргер. реагирующий ii:i присутствие- и среде салициловой кислоты; 2) A. bavlvi ADI'WtI alt; - биорепоргер. реагирующий на присутствие в среде предельных углеводородов (ялкапов) и .Я) A. baylyi ADPWH-Pu-hix-xyIR. - биорепоргер, реагирующий на присутствие в среде толуола. Бнорепортерные штаммы Л. bavlvi были получены путем вставки нлазмиды pSB4l7. содержащей ген люниферазы lu.xCD.Wt!: 1) между генами sa'A и sallt 2) »веденный в последовательность гена (.-/A i / и .>) между гонами salA и тШ, при этом также в ген salA был введен геи лт!Я. содержащий coGctaeiiUbiii промотор. Все гены были расположены на Гхнае-рщ.лыюи хромосоме (Huang ef al., 2005). Наеденный в теистический аппарат oriopeiiopiepon ген дктефиразы (iaxCiMBl!) обеспечивает биолюминесцентный сигнал клеток в отпет на ирщ-уютвие п среде -»кзогеннмх индукторов, которые взаиАшдейегвукп » клаке с регу.шормылж белками (SaIR, XyíR иди AlkR), ирпвогч к активации промоторов, ассоциированных с геном hixCDA.BE. В результате-активации данного гена происходит индуктор-зависимое накопление люцифераэы в клетках. Клет ки ,1. bmh'i культивировали на среде Лурия-Бетани (ЛП-с-рсда) в минимальной среде. Культуры одноклеточных водорослей Chlorella pvroieidnsn и Dtmafie/la maritima выращивали в стеклянных, плоскодонных колбах Собьем 500 мл) и к-чепие 5 суток при температуре 25"С с периодическим включением освещения н принудительной аэрации. Жизнеспособность микроорганизмов определяли с помощью витальных красителей три пакового синего. диацсluía фдуоресцеима (Brccu«vor et al., 1995). Live/Dead (Sigma), и uo числу колоиие-обрапующих единиц (КОК/мл) при посевах клеточных суспензий на агаризоваиные среды, а для фмотрофов по автофлуореепенции хлорофилла ("Сhonget al., 2008).

\ía ¡epiísuiw. si ре£1К(Т!»ы. Для пригоюилелия всех растворов, питательных сред, буферов и для диализа использовали деиопизироваиную воду, очищенную iivicM обраиюю осмоса с использованием системы очистки воды MilliQ íMillipow). Основные реаьчивы: ио.ша.т.тпламина гидрохлорид (РАН) (15 1сДа н 70 кДя) m vi ист н рол сульфонат (PRS) (70 кД»), полиакриловая кислота (РАА) (3.5 к"Да,|. флчоресцйип нзоточиатп-но.жаллиламииа i идрохлорид (FITC-PAH) (16 кДа). флуороеценна диацсип (ФДА). карбокиимеги.тцеллю.юза (CMC) и ¡ с гра м ст и л ам мои и я гидроьморил (ТМА) (Sijmw-Alílrieh и Flu ka) использовали без дополнительной очиегкк , .Методы. Измерении С-шисициада клеток и напочастиц, а юкже iидродииамичсско!о диаметра напочастиц проводили на анализаторах Mähern '/.etasizer 3000 HS и Z.etasirer Nano ZS. оснащенных гелиево-неоновым лазером с использованием стандартных кн.вет. Кварцевый мнкрогравиметричес-киП анализ лннамнки адсорбции полимеров осуществляли с использованием микрограинмстричсското анадизатри (,>ОМ 200 (Stanford Research Systems). Микровесы были оспашеиь! Уксшиыюй про i o« то- и нжекиио! it-ioíi ячейкой.

фиксатором резонатора, и электронным осциллятором. Использовали кварцевые полированные резонаторы с золотыми электроламп, поминальная час toi а которых, составляла 5 МГц. Динамику адсорбции изучали в проточтю-инжегащонпом режиме. В качестве индикаторов изменения массы вещества на границе раздела сред «электрод - раствор полиэлектролита» на поверхности резонатора фиксировали изменения резонасиой частоты и сопротивления в реальном времени. Для регистрации аналитических сигналов использовали программу l.-abViewl .0. Для обработки и диспергирования ианочастиц. микрочастиц и клеток применяли ультразвуковые зопдовые генераторы Branson Digital Sonifier Model 450. с диаметром зонда 5 мм и максимальной мощностью 400 Вт и Bandelin Sonoplus с диаметром зонда 3 мм и максимальной мощностью 250 Вт. Для очистки поверхностей от загрязнений, солюбилн.зации углеродных нанотрубок и щадящеш диспергирования клеток использовали ультразвуковую баню Bransomc Е-1200. Анализ магнитных свойств наночастиц оксида железа и клеток, функционализироаашгых магнитными наночастицами, осуществляли при 300 К с использованием магнитного спектрометра коэрцивности (Jasonov et al., 1998).

Спектроскопические иссдедопаиия в ультрафиолетовой и видимой областях спектра проводили с использованием дву.тучевых сканирующих спектрофотометров Perkin Elmer Lambda 25 и Shimc.dzu UV 1800. Эиергодпспсрсионную рентгеновскую спектроскопию осуществляли при помощи спектрометра энергодисперсионного рентгеновского анализа INCA 350 EDX фирмы Oxford Instruments, присоединенного к электронному микроскоп}'. Спектры комбинационного (Рамановского) рассеяния и соответствующие изображения получали с использованием автоматизированного Рамановского микроспскгроскопа InVia Reflex (Reutshaw), на базе оптического микроскопа Leica и оснашекиого сиетодиодом (830 им) и аргоновым лазером (514 им).

Микроскопическое исследование иптактттых и модифицированных ¡слеток, микрочастиц, интактных и модифицированных микрокриеталлов и искусственных многоклеточных систем проводили в белом и поляризованном свете при помощи оптических и конфокальных микроскопов,, оснащенных цифровыми CCD видеокамерами (модель указана в скобках). Были использованы прямые микроскопы: Carl Zeiss Jenamed 2 (Webbers MyScope 320M): Carl Zeiss AxioScope Al (AxioCam MRcS); Carl Zeiss AxioPlan 2 Imager (AxioCani MRc5); Olvmpus BX 51 (DP 70): Leica DM 1000 (DFC 290) и инвертированные микроскопы Leica DMIL (Leica DFC 420); Olympus 1X71 (F-Vicw II); Nikon Eclip.sc ТЕ 200 (1300 VDS Voskiihler). Конфокальnvio микроскогшю осуществляли при иомощи микроскопов Nicon Eclipse ТЕ 20001-;. оснащенного системой лазеров Biorad и Leica DMIRE 2, оснащенного системой лазеров Leica. Сканирующую ■электрон] то м и ксюс кон ню (СЭМ) осуществляли с использованием микроскопов Carl Zeiss EVO 40; Carl Zeiss EVO'50 XVP и Cad Zeiss EVO 60 (с полевой эмиссией). Анализ объектов проводился в режиме низкого вакуума при напряжении 5-20 КэВ. Просвечивающую электронную микроскопию (ПУМ) осуществляли с использованием микроскопов Jeol 1200 EX и JEM 2011. Для визуализации наночастиц при помощи 11ЭМ образцы наночастиц наносили на медные ПЭМ-решетки, покрытые углеродной пленкой. Для подготовки тонких срезов клетки фиксировали 2,5?'» глугаровым альдегидом и 1.5% нараформальдегидом в фосфатном буфере (0.1 М. pH 7,4) в течение 2 часов при

комнатной температуре )i обрабатывали l'-o Оч(>( в течение часа. После дегидратации образцы помещали в смолу Ероп, с помощью микротомов LKB Uitracut Ш или Leica ЕМ UC6 получали ультратонкие срезы и устанавливали их на медную решетку с предварительно нанесенной тонкой пленкой формвара. После этого срезы окрашивали 2% водным раствором ацетата урана и цитрата свинца при комнатной температуре. Изображения получали при напряжении 80 К>В. . Атомио-силовую микроскониию (АСМ) в нолукоитакшом режиме осуществляли с помощью микроскоттов NT-MDT NTEGRA Prima и Park Systems ХЕ-100. осиашсииых сканером на 50 мкм с емкостными датчиками. В работе применяли кремниевые кантилеверы NSG03 н NSG20 с радиусом кривизны острия 10 им. Электрохимические исследования осуществляли с использованием анализаторов Ecotest-VA и Autolab PGSTAT12. Микрофлюидные м hoi pi ралиентн ыс чины были изгот овлены по схемам «стекло на стекло» и «нодидиметилсилоксан па стекле», перемещение жидкости ио микрокапалам осущест вляли с использованием шприцеиых насосов KDS-200CE (Garcia-Alonso et al., 2009).

Синтез и характеристика наноматсриалов. Цат рат-стабил из ированиые наночастицы благородных металлов (золотые наночастицы (АиНЧ), серебряные наночастицы (AgH4) были синтезированы но методам (Lee cl al. 1982) и (Handley, 1989), Наночастицы оксида железа (магнитные наночастицы) синтезировали в стабилизировали с использованием ПАВ ТМА (Lu el al., 2006) и катиокмого полимера РАИ (JFakhrulIm et al., 2009). Также были синтезированы флуоресцентно-меченые магнитные ианочастицы. стабилизированные FITC-PAH. Солюбнлизацию многое генных утлеродных нанотрубок (MNWT, Sigma) осуществляли по методу (Panlmis. Paunov. 2005). Синтез мнкрокристаллои арагонита и кальцита осуществляли в процессе копреципитации эквимолярных. ¿одных растворов СаС13 и NajCO? (Wang el al.. 1999).

Для нанесения поли.злекгролишых пленок на поверхность клеточных стенок применяли метод послойного нанесения (Krol et al., 2003). Био.иоминсснеинию в клетках Л. baylvi определяли при помощи микроаааншешого фотометра fofmite М200 фирмы ТЕСАК Group. Оценку динамики биолюминесценции и построение калибровочных графиков осуществляли при помощи программы Magellan.

Цитозомы получали с использованием в качество темшгатов микропузырьков воздуха и микрокристаллов различной морфологии, па поверхность которых послойно наносили тюлдалсктролишые пленки, наночастицы и живые функционализированные клетки.

Статистическую обработку осуществляли, используя t-критерий Стмодента и метод ANOVA Dunnett's ТЗ post hoc (р< 0,05) (с использованием программы SPSS 16.0).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Характеристика сшггсзирокаиных наноматсриалов и мнк рокрнст а.ч.т ов

Золотые и серебряные наночастицы, ТМА-стабклизироваиныс магнитные наночастицы. содюбилизироваипые многостопные углеродные 1ШН01 рубки.

микрокристаллы карбоната кальция и многослойные пленки полиэлектролитов были получены по ранее опубликованным методикам, тогда как РАН-стабилизированные магнитные ианочастицы и магнитные микрокрксталлы кальцита были получены по впервые разработанным нами оригинальным методикам. Получены (Рис. !) цитрат-стабилизированные сферические наночаетнцы: золотые (20±4 км); серебряные (50±7 им), ТМА-стабилизированные магнитные наностержни (длина 60±15 нм, ширина 13±3 нм) и РАН-стабилизированные сферические магнитные наночаетнцы (25±4 нм).

Рис. 1, ПЭМ-микрофотографии (а) - золотых, (Ь) - серебряных и (с) -

магнитных наночастиц; (сГ) - мкогостеяных углеродных нанофубок.

Магнитные наностержни и наночаетнцы обладали суперпараыагнитяыми свойствами. Средний диаметр многослойных углеродных нанотрубок (по внешнему ободу) составил от ¡0 до 30 нм, при этом их длина варьировала от 0,1 до 0,5 мкм. При включении наночастиц и углеродных нанозрубок в состав многослойных плевок полиэлектролитов учитывали заряд наноматериалов, чтобы сформировать устойчивую сэндвич-структуру полимер-НЧ-полимер. Значения потенциала наночастиц и углеродных нанотрубок приведены в Таблице 1.

Таблица 1. Значения ^-потенциала (мВ) наночастиц и углеродных нанотрубок.

Объект АиНЧ АЙНЧ МНЧ(РАН) МНЧ(ТМА) мш

С-потенцяал, мВ -34±2 -38±2 +48±5 - 60±4 -35±3

Для определения оптимальных условий нанесения полиэлектролитов на поверхность клеток был изучен процесс формирования многослойных пленок из полиэлектролитов на пленарных поверхностях. С помощью кварцевого наногравиметрического анализа установлено оптимальное время адсорбции

полиэлектролитов на противоположно заряженные поверхности (от 5 до J 5 мин): для адсорбции РАН потребовалось ~ 5 минут, для PSS к CMC - ~ 15 минут. Адсорбция не зависит от концентрации полимера в диапазоне от 0,5 мг/мл до 10 мг/мл.

2. Фз национализация микроорганизмов при помощи полимерных пленок; наночаствд и иаиотрубок, включенных в состав полимерных пленок; полимер-стабилкшрованных наночастиц и мезопористых оболочек из карбоната кальция

2.1. Многослойные пленки полиэлектролитов для модификации поверхностей живых клеток микроорганизмов

Для послойной модификации клеток был использован ряд полимеров: РАН; PSS. CMC. РАА и полиэтиленом як. Наилучшие результаты были показаны для систем, содержащих многослойные пленки РАИ, PSS и CMC на поверхности клеток.

Таблица 2. Значения ^-потенциала интактных меток микроорганизмов.

Объект

-потенциал, мВ

С.

vyrenoidosa

-18±6

Дрожжи GfreenScreen™

-16±5

Ра^уиичдггво "Мш^фоте^афии! ш.ищюток, модифицированных при помощи РАН/РББ/РАН/РЗЗ/НТС-РАН/РБв/РАН/РЗВ: (а) - С. ругепоШа (а) и (Ь) А. Ьау1ук (с) - чередующееся изменение ц-потенциала дрожжей в зависимости от количества полимерных слоев.

Дрожжи

Л В

♦

С. pyrenoidosa А. baylyi

С *

го ■

а ¡о

^ 5

1 0 5 .5 1 « > S 5 = -10 6 7 8 9 10 11

-15 ■

■20

■25

Е. coli

-15±3

5. cohn И

baylyi.

-24+4 - 28±7 -19±3

Микроорганизмы, использованные ! данной работе, обладают отрицательным поверхностным зарядом, что согласуется с опубликованными ранее данными (УеегаЬаётап е1 а!., 2007). Значения ^-потенциала клеток приведены в Таблице 2. Отрицательный поверхностный заряд клеток обуславливает использование поликатиона в качестве первого полимерного слоя при нанесении полиэлектролитов на поверхность результате

клеток. В

последовательного формируется многослойная Флуоресцентная подтверждает многослойных

нанесения полимерная оболочка, микроскопия формирование пленок на

поверхности клеток (Рис. 2, а, Ь). Нанесение полизлектролита на поверхность клеточной стенки приводит к инверсиии ц-потенциала в зависимости от количества слоев (Рис. 2, с).

1,2. Модификация микроорганизмов при помощи полизлектролитпых нанопленок н ианомагерналов.

Наночастицы благородных металлов, Клетки S. cerevisiae модифицировали полиэлектролитами в следующем порядке: PAH/PSS/PAH. Затем клетки, несущие на своей поверхности суммарный положи тельный заряд, вносили, в суспензию каиочастиц или миогостенпых углеродных нанотрубок, После инкубации и отмывки, наносили зацепляющий бислой PAH/PSS.

Для характеристики фу нкционализиро ванных клеток дрожжей, были применены методы

ПЭМ, СЭМ и АСМ. На ПЭМ-микрофотографиях клеток дрожжей (Рис. 3) четко различимы золотые наночастицы. включенные в

полимерные пленки. После иммобилизации пол иэлектроя итных пленок и наночастнц (обладающих характерной окраской) на поверхности клеток.

Рис. 3. ПЭМ-микрофотографии дрожжей: (а) интактных; (Ь) функционализированных полиэлектролитами и золотыми наночастицами.

можно видеть изменение окраски обработанных сегехчхше. С'ЭМ-и зображения показывают неоднородный характер Д

формирования наноструктур ированных пленок, что может быть связано с пространственным строением комплексов

полимеров. На трехмерных АСМ-изображениях (Рис. 4) интактных клеток видно, что профиль клеток гладкий и однородный, однако после иммобилизации наноматериалов значительно увеличивается шероховатость поверхности модифициро ва иных клеток, что вызывает увеличение поверхностной площади модифицированных клеток.

наночастицами суспензий S.

Рис. 4. АСМ-изображения поверхности клеточной стенки дрожжей: (а) интактных: (Ь) функционализированных полиэлектролитами и золотыми наночастицами.

Изменения параметра шероховатости приведены в Таблице 3. Результаты ПЭМ и АСМ исследований подтверждают присоединение к клеточной стенке как единичных наночастиц, так и их агрегатов, Наночастипы прочно прикреплены к поверхности клеточных стенок, при этом не наблюдается их проникновения в цитоплазму. Толщина монослоя составила 25 нм для АиНЧ и 50 нм для AgH4.

Таблица 3. Значения параметра среднеквадратичной шероховатости поверхности

Параметр среднеквадратичной шероховатости (Sq) поверхности клеток дрожжей, нм

Интактные: Р AH/PSS/АиНЧ: Р AH/PSS/AgH4:

1,6 ±0,1 11,5±0,3 2,3±0,1

Аналогичные результаты: получены с использованием бактерий, отличающихся: по форме и биохимическому составу клеточной стенки, а именно грампояожительного вида S. cohrtii и грамотрицательных видов Е. coli и А. baylyi. Микрофотографии клеток Е. coli, покрытых композитной пленкой Р АН/PS S/P АН/АиНЧ/РАН/РSS (Рис. 5), демонстрируют присутствие единичных наночастиц и их агрегатов.

Рис. 5. СЭМ-микрофотографии клеток Е. coli: (а) - интактных: покрытых полиэлектролитами PA H/PS S/PAH/PSS/P AH/PSS;. (с) -покрытых пленкой PAH/PSS/PAH/AuH4/PAH/PSS; (d) - покрытых пленкой PAH/PSS/PAH/AgH4/PAH/PSS.

Сравнивая микрофотографии интактных клеток; клеток, модифицированных исключительно полиэлектролитами (РАН/Р88Ь, и ¡снеток, покрытых как полиэлектролитами, так и наночастицами, можно убедиться, что полиэлектролитная пленка сама по себе не обуславливает изменения поверхности

клеточной стенки.

Магнитные наночастицы. На Рис. 6 показаны оптические микрофотофифии образцов дрожжей, покрытых композитной наиопленкой РАН/Р&$/РАН/МН Ч(ТМА-стабилизированные)/Р АН/РББ и интактных клеток. Оптическая: микроскопия позволяет достоверно отличить магнитно-модифицированные клетки от интактных по характерному буро-коричневому окрашиванию. Магнитно-модифицированные клетки притягиваются к. постоянкому магниту и могут быть удержаны ¡три его помощи.

Ряс. 6. Оптические микрофотографии (а) интактных клеток дрожжей: (Ь) клеток дрожжей, модифицированных пленкой РАН/Р$5/РАН/МНЧ(ТМА-стабилизированные)/РАИ/Р58; (с) магнитные свойства клеток (Ь). сгруппировавшихся вблизи от постоянного магнита.

На ПЭМ-микрофотографиях (Рис. 7) видно формирование тонкой пленки (толщиной 50-80 им), содержащей магнитные наностержни или сферические наночастицы.

Рис. 7. ПЭ.М-микрофотографии (а) и н такт ной клетки дрожжей; (Ь) - клетки дрожжей, модифицированной пленкой РАН/Р58/РАН/МНЧ(ТМА-стаб.)/РАН/Р5;5 (в присутствии ТМА); (с) - клетки дрожжей, модифицированной пленкой Р АН/РЗБ/Р АН/МНЧ(ТМА-стаб.)/РАН/РББ (без ТМА); (с!) - клетки дрожжей, модифицированной пленкой РАН/Р55/РАН/Р55/МНЧ(РАН-стаб.) /РББ/РАН/т.

Формирование пленки в результате электростатического взаимодействия между полиэлектролитами и наночастицами приводит к визуальному изменению окраски суспензии клеток, отчетливо различимому гои оптической микроскопии.

Углеродные нанотрубки. Клетки Я сегелпя'юе модифицировали также с помощью пол«электролитов (РАИ и РБЗ) и содюбтаизированных многостенных углеродных нанотрубок. На ЛЭМ-микрофотографиях (Рис. 8). видно, что поверхность клеточной стенки дрожжей после нанесения полиэлектролитных слоев и миогостенных углеродных нанотрубок приобретает «ворсистый» вид из-за расположения нитей углеродных нанотрубок на поверхности клеток.

Рис. 8. ПЭМ (верхний ряд) и СЭМ (нижний ряд) микрофотографии клеток дрожжей ЯсегвуШае-. (а) - интакгные и (Ь, с) модифицированные РАН/РБЗ^ШКТ/РАН/РББ клетки.

Толщина многослойной пленки, содержащей углеродные нанотрубки, составляет около 80 нм, ¡три этом на микрофотографиях можно обнаружить как более тонкие (20-30 нм), так и более широкие (200 нм) участки, что связано со спонтанным формированием агрегатов углеродных нанотрубок. Нанотрубки ориентированы на поверхности модифицированных клеток хаотично, некоторые из них достаточно плотно прилегают к клеточным стенкам, тогда как другие прикреплены к поверхности лишь частично и направлены наружу. Иммобилизация многослойных углеродных нанотрубок приводит к формированию однородного, равномерного покрытия из нанотрубок и пленок на поверхности дрожжей, которое четко видно при сравнении СЭМ-изображений интактных и модифицированных клеток. Клетки, функционализированные частично прикрепленными углеродными нанотрубками, могут найти применение в качестве микроконтактов в микроэлектронных устройствах (Вепу, БатаЕ, 2005;

\Veibel еЕ а!.. 2007).

2.3. Одностадийная фуикчщокалнзация микробных клеток при помощи РАН-стабмлиз»ровянны\ магнитных наночастиц

Послойная модификация предполагает существенные затраты времени на нанесение последователных слоев полимеров, промежуточные циклы отмывки/центрифугирования и т.д. Интересным представлялось изучить возможность одноэтапного закрепления РАН-стабилизироваиных магнитных наночас тиц на поверхности клеток.

^ а»

к :' ^......

~ , , ,хЛф §к ^РШЩР^Шиш

ат ' / ± Ц, „

Рис. 9. ПЭМ-микрофотографии клеток дрожжей, модифицированных РАН-стабилизированными магнитными наночастицами, диспергированными в растворе РАН (а) и (Ь); и в воде (с).

Использовали два типа РАН-стабилизироваиных наночастиц диспергированные в растворе свободного РАН и диспергированные в воде. Магнитные свойства клеток, модифицированных при помощи РАН-етабидизированных магнитных наночастиц, соответствовали таковым у образцов, модифицированных при помощи многослойных пленок полиэлектролитов и магнитных наночастиц. Микроскопическая характеристика клеток, модифицированных РАН-стабилизированными наночастицами, показала, что магнитно-модифицированные клетки приобретают характерную буро-коричневую окраску, что согласуется с результатами, полученными с использованием многослойных пленок и ТМА-стабилизированных наночастиц. Ультраструктура дрожжей, модифицированных РАН-стабилизированными магнитными наночастицами, изучена с помощью ПЭМ (Рис. 9). Наночастицы формируют на поверхности клеток равномерный слой толщиной около 70 им. Характер расположения наночастиц не отличается от такового при модификации клеток многослойной пленкой полиэлектролитов. Использование РАН-стабилизированных магнитных наночастиц представляется более удобным, чем магнитная модификация клеток при помощи многослойных пленок полиэлектролитов и наночастиц, включенных в их состав. РАН-стабилизированные магнитные наночастицы были использованы также для магнетизации одноклеточных пресноводных (С. рутктккча) и морских (и. пюпИта) зеленых водорослей. После магнитной модификации при помощи РАН-стабилизированных магнитных наночастиц клетки водорослей приобретают бурую окраску в результате присоединения магнитных наночастиц к поверхности

клеток. ТIЭМ-иикрофотографии тонких срезов магнитно-модифицированных клеток С. ¡шепоикка показывают равномерное распределение слоя наночастиц (70-90 нм) на их поверхности (Рис. 10, а). Проникновение наночастиц в цитоплазму магнитно-модифицированных клеток обнаружено не было. Водоросли, модифицированные РАН-стаби локированными магнитными наночастицамй, быстро и эффективно реагируют на манипуляция, опосредованные постоянным маги итом.

шш

I :;

Щ' i .

Шш ■

12 *

"¡Вункимипалюиповшцц«^

шгтактиые

¡■¡И ШШрГ

- .

^штт'

■ 20 ••—--5000

5000

-зооо -юсе 1000 зооо

Напряженность матитною поля (Э)

Рис. 10. (а) - ПЭМ-м икрофотография клеток С. pyvenoidosa, функционализированных РАН-стабилизированными магнитными

наночастицами; (Ь) - кривые изотермической магнетизации магнитно-функционализированных и интакгных клеток С. pyrenoidosa.

Магнитно-модифицированнные клетки С. pyrenoidosa обладают суперпара магнитным и свойствами, тогда как иктактные водоросли проявляют исключительно диамагнитные свойства (Рис. 10, Ь).

Также получены магнитко-функционализированные образцы А. Ьау1у1 дикого типа и биорепортеркых штаммов. Магнитные свойства клеток А. Ьау1уI не отличались от таковых у описанных ранее клеток дрожжей и водорослей. Анализ данных флуоресцентной и просвечивающей электронной

микроскопии (Ряс. ¡1) позволяет установить, что клетки А. ¿от/у/ покрыты монослоем РАН-стабилизированных наночастиц. В ряде случаев наблюдали присутствие участков клеточной стенки, свободных от наночастиц. Э то может быть связано с биохимическими особенностями строения клеточной стенки бактерий.

а 1 щ 1-м Ь • , -

■ | Щ Я8Р1 ШШ «1

Ж ^ f <р> 1 " ,v t'4'

Л.(|П

>,¿4,....,- 'С 1 - г d

гл * ;;' -

hoviv. ^ 1ЖТ ^ 100 т ч,

Рис. П. (а) микрофотография магиитно-функиионализированяых клеток A. baytyi (FITC-PА Н-наночастицы); (b-d) - ПЭМ-микрофото! рафии магнитно-

функционализированных клеток A. bay/yi.

3.3. Ммкроинкапсуляцин микробных мнкрооболочкв из карбоната кальция

клеток в мезопористые

станоилепо, микрооболочки из карооната микроорганизмов, присутствующих копреципитации ионов Са2~ и СО/". Клетки дрожжей вносили в водный раствор Са" , после чего осуществляли синтез микрочастиц карбоната кальция путем внесения в среду эквимоляркого количества ионов СО}2". Микроскопическое исследование полученных частиц в поляризованном свете показало, что изотропные частицы практически отсутствовали, однако выявлялись овальные оптически анизотропные микрочастицы, по внешнему виду напоминающие клетки дрожжей (Рпс, 12). Подобные структуры были обнаружены только в случае прекращения реакции

копреципитации в течение 1-5 мин после смешивания водных растворов ионов Са2' и СОД Если реакция продолжалась далее, то микросферы в образцах отсутствовали. Очевидно, что клетки служат центрами кристаллизации на начальных стадиях образования карбоната кальция.

то в жидкой среде формируются мезопористые

кальция на поверхностях живых клеток в реакционной среде в процессе

И^тш ь 10 ,шп

нив

Ч ОоЬ ■яУмм <1 ж * л %%

в белом свете (слева) и в поляризованном свете (справа) дрожжей (а,Ь) и клеток, инкапсулированных в мезопористые оболочки карбоната кальция (с,а).

£ НУКЯи

20 30

■«/■ус

40 50 60 2 8(град)

70 80

Рис, 13. Рентгеноструктурный анализ гибридных микрокапсул.

Карбонат кальция представляет сооон мезопористый (диаметр пор от 2 до 10 им) материал. Значения ц -потенциала микросфер (-27 мВ) совпадали с таковыми у микрочастиц карбоната кальция (-28 мВ). При резком понижении рН оптические свойства образца при исследовании в поляризованном свете менялись, при этом суспензия оптически

анизотропных микросфер превращалась в суспензию изотропных клеток дрожжей. При растворении1

микрооболочек с помощью ЭДТА наблюдали почкующиеся клетки.

Образцы клеток, микросфер СаССЬ и гибридных микрокапсул (после окраски ФДД) изучали при помощи микроскопии в белом свете, в поляризованном свете и в режиме эпифлуоресцентной микроскопии (Рис. 14). Интактные клетки обладают характерной ФДА-обусловленной флуоресценцией, однако не визуализируются в поляризованном свете. Микросферы карбоната кальция визуализируются при помощи поляризованной микроскопии, однако их флуоресцентные изображения, отсутствуют, так как для активации ФДА-сйусловлекной флуоресценции необходимы эстеразы.

Рис. 14. Микрофотографии в белом свете (дифференциально-интерференционный контраст), в поляризованном свете и в режиме эгткфлуоресцентной микроскопия образцов суспензий (после инкубации в присутствии ФДА): (аДхс) - иитактных дрожжей; (с!.с.Г) - микросфер карбоната кальция, синтезированных в отсутствие клеток; - микросфер карбоната кальция, синтезированных совместно с

клетками (гибридных микрокапсул); (¡,к,1) - дрожжей, полученных в результате химической декомпозиции карбоната кальция при помощи ЭДТА.

В образцах гибридных микрокапсул наблюдается как изображение в поляризованном свете (обусловлено кристаллической структурой оболочек), так и флуоресцентное изображение (обусловлено эс-теразной активностью инкапсулированных ¡слеток). Суперпозиция поляризационных и флуоресцентных микрофотографий позволяет однозначно локализовать источники света и установить, что клетки инкапсулированы в микрооболочках карбоната кальция.

Анализ изображений меток, полученных при химическом удалении микрооболочек, подтверждает сделанные выводы. Поступление ФДА внутрь клеток, покрытых микрооболочками карбоната кальция, указывает на их мезопористую структуру. Толщина микрооболочек составляет около 1,5 мкм, при этом соотношение «длинаУширина» остается неизменным, что говорит о сохранении овальной формы клеток дрожжей у гибридных микрокапсул (Таблица 4). СЭМ-микрофотографии (Рис. 15) иллюстрируют разброс размеров и форму гибридных микрокапсул.

Таблица 4. Размеры клеток дрожжей и гибридных микрокансул.

Объект: Дрожжи

Длина (мкм): 5.8±0.7

Ширина (мкм): 4.8±0.8

Длина/ширина:

Гибридные

7.4±1.4

б.3±1.2

Частично разрушенная оболочка без клетки (Рис. 15, с) демонстрирует толщину и мезопориетую структуру микрооболочек из карбоната кальция.

Анализ результатов

рентгеноструктурного анализа (Рис. 13) порошка полученных микрочастиц в сравнении с характерными пиками изоморфов карбоната кальция позволяет заключить, что

микрооболочки состоят из фатерита. одной из кристаллических форм карбоната кальция. Фатерит является нестабильной формой, которая достаточно быстро превращается в гораздо более стабильный кальцит, что наблюдается при длительной инкубации г ибридных микрокапсул.

Рис. 15. СЭМ-микрофотографии гибридных микрокапсул.

2.4. Жизнеспособность функнионалгоированиых клеток микроорга н измок

Принципиальным условием успешной функциоиализации клеток многослойными полиэлектролитными пленками (как таковыми, так и дотированными наноматериалами) и полиэлектролит-стабилизироваяными наночастицами является сохранение жизнеспособности клеток. Ранее было показано, что полиэлектролитные пленки не влияют на жизнеспособность клеток (Klabunde et aä„ 2001; Diaspro et al„ 2002), а металлические наночастицы (Lewinski et al., 2008; Miura et al., 2009; Parkas et al„ 2010) и углеродные накотрубки в определенных условиях цитотоксичны (Isobe et al, 2006; Zhu et ai. 2007). Включение наночастиц в структуру многослойной пленки позволяет избежать непосредственного контакта наночастиц с поверхностными

структурами клеток и проникновения наночастиц в цитоплазму, обуславливая сохранение жизнеспособности и физиологической активности функционализированных клеток. Важным свойством полимерных пленок является их способность связывать противоположно заряженные ионы металлов, которые представляют собой основной фактор токсичности наночастиц.

С использованием витального красителя ФДА установлено, что модифицированные полиэлектролитами клетки сохраняют жизнеспособность. Почкующиеся клетки дрожжей, обнаруженные в образцах клеток, модифицированных РАН и CMC, указывают на сохранение способности к размножению у модифицированных клеток. Количество жизнеспособных дрожжей (Рис. 16), Е. coli и S. cohnii, модифицированных многослойными пленками полюлектролитов и наночасшцами или нанотрубками, также не сокращается.

Рис. 16. Микрофотографии (совмещенные изображения в проходящем свете и флуоресцентные) клеток дрожжей, модифицированных (а) -РАНЛ^/РАН/ЛиНЧ/РАНЛ^; (Ь) - РЛН/Р88/РАН/АёНЧ/РАН/Р85; (с) -РАН/РБ 8/РАНЛ;НТ/РАН/Р8 8.

Анализ микрофотографий модифицированных и интактных клеток позволяет сделать вывод, что процентное соотношение живых и мертвых клеток в образцах совпадает как для навомодифицированных, так и для интакгиых ¡слеток (Таблица 5).

Таблица 5. Жизнеспособность функционализированных, клеток.

Микроорганизм Жизнеспособные клетки (%) Функционализация

Контроль Опыт

S. cerevisiae 87±7 88±3 (PAH/PSS) Au

S. cerevisiae 90±6 92±7 (PAH/PSS) Ag

S. cerevisiae 89±4 9 ¡±4 (PAH/PSS) УНТ

E coli 95±2 97±2 (PAH/PSS) Ag

S. cohnii 90 ±4 87±5 (PAH/PSS) Ag

О способности к размножению модифицированных ваночастицами дрожжей 5. сегемяас свидетельствует большое количество почкующихся клеток в образцах, покрытых как золотыми, так и серебряными наночастицами. Дочерние клетки не несут на своей поверхности наномастицы, из чего можно предположить, что клетки способны разрывать полиэлектролитные оболочки при почковании.

Влияние макромолекул-стабилизаторов магнитных наночастиц на жизнеспособность дрожжей изучали с использованием ФДЛ (Рис. 17). Магнитно-модифицированные клетки дрожжей сохраняют жизнеспособность во всех случаях, за исключением применения ТМА-стабилизированных наночастиц в присутствии ТМА. Применение наночастиц без предварительной очистки их от остаточных количеств ТМА приводит к гибели магнетизированных клеток (БаГапк й а!., 2007). Очистка наночастиц от ТМА является трудоемким и слабо контролируемым процессом, приводящим к агрегации наночастиц.

Рис. 17. Оптические и флуоресцентные микрофотографии: (а) и (Ь) - дрожжей, модифицированных композитной многослойной . пленкой

РАН/Р58/РАНМНЧ(ТМА-стабилизированные)/РАН/Р58 (в присутствии свободного ТМА); (с) и (с!) - дрожжей, модифицированных композитной многослойной пленкой РАН/Р85/РАН/МНЧ(ТМА-стабилизированные)/РАШР85 (без свободного ТМА); (е) и ({) - дрожжей, модифицированных композитной многослойной пленкой РАН/Р55/РАН/Р8Б/МНЧ(РАН-стабилизированнь(е) /Р8Я/РА1Н/РЯ8; (§) (Ь) - дрожжей, модифицированных РАН-стабилизированными м агнитны м и на ночастицами.

Рис. 18. (а) - Жизнеспособность клеток А. Ьау/уч, модифицированных РАН-стабшшзированиыми магнитными наночастицами; (Ъ) ~ гистограмма, иллюстрирующая жизнеспособность и соотношение магнитных и немодифицированных клеток А. Ьау1ук (с) - кривая роста магнитных и немо дифи (дарованных клеток А. Ьау/уч.

Жизнеспособность А. Ьау1у/, модифицированных при помощи РАН-етабилизировакных магнитных наночастиц определяли с использованием ФДА и

по числу К'ОЕ. Для подсчета клеток использовали две фракции - магнитно-модифицированные и свободные клетки, не реагирующие на постоянный магнит. 99,96% клеток А. baylyi были эффективно магнетизированы с сохранением жизнеспособности и способности к образованию колоний. Динамика деления не отличается от таковой у интактных клеток. В результате деления клеток постепенно увеличивается: популяция свободных клеток (от 0% то 12% через 2

Жизнеспособность водорослей С. pyrenoidosa. модифицированных Р АН-стабилизированным и магнитными наночастицами,

определяли по автофлуоресценции водорослей при возбуждении светом 1-540 нм, что соответствует максимуму поглощения

хлорофилла В (Chong et aJ, 2008). Магнитная функционализация клеток водорослей не оказала отрицательного эффекта на их жизнеспособность (Рис. 19). Было установлено; что 85±4% магнитно-модифицированных клеток С pyrenoidosa сохраняют

жизнеспособность, что согласуется с данными по жизнеспособности интактных клеток (87±3%). На вставке (Рис. 19, Ь) приведена м икрофотография, иллюстрирующая

жизнеспособность изолированной клетки, покрытой F1TC-PAH-стабилизированными магнитными наночастицами,

обуславливающими зеленый

флуоресцентный ободок по краям клетки.

3. Функциоиалкзированиме микроорганизмы как компоненты биоаналитических устройств

3.1. Характеристика микроорганизмов с использованием поверхноетко-усилеиной Рамановской спектроскопии

Характеристика микроорганизмов с помощью поверхностно-усиленной Рамановской спектроскопии (Otto, 1999) является одним из важных направлений в анализе микроорганизмов. Применительно к микроорганизмам имеется существенное ограничение - для эффективного анализа необходимо достаточно большое количество исследуемого образца, что делает невозможным получение информативного сигнала от единичных клеток. Преодолеть это ограничение

часа инкубации)

Рис. 19. Микрофотографии (а) интактных; (Ь)

функцио на лиз ированных Р АН-

стабилизиро ванным и м агн итиым и наночастицами клеток С. pyrenoidosa.

агрспфовянщ.гс клетки

; единичные клетки hfl

V V \

У \ /in

m мой ta»

эл новое число |е"Л

позволяет поверхностно-усиленная Рамановская спектроскопия (SERS). В качестве усилителей применяют наночастицы благородных металлов, поверхностные плазмоны которых взаимодействуют с электромагнитным излучением и усиливают интенсивность сигнала Рамановского спектра (Goeller, Riley, 2007). Наночастицы должны находиться в непосредственной близости от объекта. Профподготовка является важным этапом SERS-анализа (Tang et al.,. 2007; Kneipp et al., 2009). Непосредственное смешивание наночастиц и клеток (Premasari et al.. 2005) приводит к нерав но м ер н о му распределению наночастиц и а1~регации клеток (Kahraman et al., 2008). Функционаяизация клеток при помощи полимеров и наночастиц позволяет избежать агрегации. В качестве модельных объектов использовали

функционализированные бактерии Е. coli и S. cohnii. Были изучены два подхода к модификации поверхности клеток бактерий: 1) на поверхность клеток наносили многослойную пленку

PAH/PSS/PAH/AgfW/PAH/PSS или PAH/PSS/PAH/AUH4/PAH/PSS; 2) на поверхность клеток наносили многослойную пленку

PAH/AgHWPAH или

РАН/АцНЧ/РАН. Установлено, что SERS-спектры клеток II coli, модифицированных как первым, так и вторым способом, содержат характерные спектральные пики. Применение пленок

PAH/AgH4/PAH или

РАНУАиНЧ/РАН позволяет

получить более интенсивный SERS-спсктр, чем при

использовании пленок

PAH/PSS/PAH/AgH4/PAH/PSS или РА Н/Р S S/P АН/АиНЧ/Р АН/Р S S. Наибольшая интенсивность

сигнала наблюдается для клеток, модифицирова иных PAH/ÀgH4/PAH.

i .

I АиНЧ

Ш 11005 3200

Волновое число да1)

I $. cuhtm Г

m *

Ы *Ч «я iî

Jkfi. П.

В, cdi

ш ж ш ме КОЗ i*0C <мо Волновое число 1«г>'|

Рис. 20. SERS-спектры клеток (а) S. cohnii, модифицированных PAH/AgH4/PAH, полученных при исследовании агрегатов и единичных клеток; (b) S. cohnii, модифицированных PAH/AgH4/PAH и РАН/АиНЧ/РАН; (с) 8, cohnii и Е. coli,

модифицированных РАН/AgH4/PAH.

Анализ 5ЕИ5-спектров (Рис. 20) выявил характерные отличия в спектральных линиях клеток. Возникновение пика при 730 см4 обусловлено Раман-активностью

молекул флавииадениндииуклеотида. М-ацетил-Ы-глюкозоамипа и N-ацетилмурамовой кислоты (Zciri el а], 2004; Jarvis et al, 2004). Флавинадениидинукпеотид локализуется., в основном, во внутренней цитоплазмагической мембране бактерий. (Efrinia, Zciri, 2009). Вероятно, наблюдаемый интенсивный пик при 730 см"1 на $ERS-cneicrpax.E coli обусловлен проникновением наночасгиц в цитоплазму. При применении послойной модификации клеточной стенки бактерий Е, coli пленками РАН и серебряными нэночаетвдами пик при 730 см"' имел крайне низкую интенсивность. Обработка клеток тгодикатиоиом РАН увеличивает стабильность внешней мембраны клеток и препятствует проникновению наночасгиц в цитоплазму. По данным литературы, SERS-спектры, полученные при неопосредованном смешивании бактерий и серебряных наночасгиц, дают представление о биохимическом составе большого количества клеток, формирующих агрегаты, при этом не исключена возможность возникновения помех от спектров иных видов, микроорганизмов, присутствующих в агрегатах .(Jarvis, Goodacre, 2004; Jarvis et al, 2008). Получение спектральной информации от единичных клеток при ¡«опосредованном смешивании крайне затруднено (Jarvis et al, 2004). Основным преимуществом разработанного метода модификации, поверхности клеток бактерий полимерными пленками it наночастицами является слабая агрегация клеток, что позволяет характеризовать изолированные клетки.

3,2. Электрох ими чески й биосенсор на основе клеток дрожжей, фушецшшалшировашшх полиэлектролитными пленками и лшогостенньшн }тлеродпыми паиотрубками

Углеродные нанотрубки являются эффективными усилителями, применяемыми в электрохимических биосенсорах (Zhao et al., 2006). Углеродные нанотрубки обычно нанося т на поверхность электродов, на которые затем наносят рсценториый слой (ферменты, ДНК, микробные клетки и т.н.) (Zhang et al, 2007), В данной работе углеродные нанотрубки были закреплены на поверхности живых микробных клеток, иммобилизованных .на электродах. Таким образом, вся поверхность кдетки становится покрытой множеством нштоэлетродов, связанных с макроэлектродом. Фук-нциопализированиые дрожжи включали в полимерные пленки па поверхности стеклоуглеродиых электродов (Рис. 21). Об активности иммобилизованных клеток судили, по величине тока восстановления феррит (ианид-йона и по соотношению пиков на вольтамперограммах. характерных для .квазиобратимого переноса электрона. Наблюдается смещение величины стандартного рсдокс-потенциала, определяемого, как полусумма потенциалов пика окисления и восстановления, в направлении несколько меньших анодных значений (Е0-+200 м.В относительно Ag/AgCl) но сравнению со значением, полученным с использованием немодифицировашюго электрода. Это связано с ограничением скорости переноса электрона через слои многослойной полиэлсктролитпой плёнки (PAH/PSS)*. Установлено, что линейная зависимость тока в координатах I - Vo (I г ток пика восстановления феррициаиида, мкА, и -скорость сканирования потенциала, мВ/с) характерна для диффузионного контроля переноса электрона (то есть замедленной стадии переноса [Fe(CN)G]3").

полиэлектролиты

п ол 11 эл е кл рол

СУ

электрод;

! РАН.

;

клетки-нанотруоки

Ряс. 21. Схема иммобилизации дрожжей (функционализировашшх при помощи полизлектролитов и углеродных нанотрубок) на поверхности стеклоуглеродного (СУ) электрода.

После включения слоя живых ^модифицированных клеток дрожжей в многослойную полимерную пленку значение тока восстановления [Ре(СЫ)л]'" значительно сократилось, что объясняется участием (Ре(СМ)«]3" в переносе электрона в электрон-транспортной цепи живых дрожжей. При использовании мертвых клеток регистрируемое значение тока не только не снижалось, но даже незначительно возросло. Изменение величины тока пика восстановления ¡Те(СМ)6]3" при иммобилизации живых клеток составило 2,2±0,1 мкА, что составляет около 20% от первоначальной величины тока в отсутствие клеток. Полученные вольтамперограммы [Ре(СЫ)й]'1" на электродах, модифицированных иммобилизованными клетками (функционалгоированными

РАШРвв/МУТОТ/РАН/РЗв) и электродах, покрытых только пленкой (РАН/РЗБ).,, практически совпадали.

Величина тока восстановления [Ре(С1\)й]3" при внесении в поверхностный сдой живых дрожжей, модифицированных РАН/Р88/М\УМТ/РАН/Р88, уменьшалась и составила 9,0±0,2 мкА, тогда как при использовании мертвых дрожжей, модифицированных РАН/Р88/Ш¥1ЧТ/РАН/Р88, это значение составило 12,0±О,1 мкА. Изменение тока в экспериментах с живыми и мертвыми клетками, модифицированными многослойными полиэлектролитными пленками и многостенными углеродными нанотрубками, значительно превышало таковое у интактных живых и мертвых клеток, говоря об усилении сигнала.

Дополнительным параметром, позволяющим определить разницу в электрохимическом поведении навомодифицированных живых и мертвых клеток, стало использование отмывки электродов после измерения и проведение повторных измерений (Рис. 22). Токи, отнесенные к восстановлению ^(СЫ)«]'", снижались практически до нуля после ¡0 мин, что говорит о стремительном высвобождении феррицианид-ионов из поверхностного слоя. При использовании электродов, на поверхности которых были иммобилизованы фукюдионализнрованные клетки, фиксировали увеличение тока восстановления на 15% от первоначального значения. В динамике, величина аналитического отклика в течение 3 минут отмывки достигала 50% от начального значения. Такое изменение величины тока является достаточным для распознавания живых и мертвых клеток.

oí

а 5

i__,_________

ннактивироваикые жизнеспособные

12 18 24 Время {мин} Рис. 22. Зависимость восстановления [Fe(CN)<,]''

тока от

жизнеспосоонеега

модифицированных

PAH/PSS/MWNT/PAH/PSS.

дрожжей,

Эффективность переноса

электрона на [Ре(СМ)г,]3", определяемая как падение тока пика восстановления (по сравнению с электродом, модифицированным слоем

(РАН/Р85)4), существенно

увеличивалась при

использовании

функционализированных клеток. Вероятно, это обусловлено частичным взаимным

электростатическим отталкиванием отрицательно заряженных редокс-анионов и отрицательно же заряженных многостенных углеродных нанотрубок.

Биосексор позволяет определять инактивацию иди гибель клеток, вызванную токсичным веществом, находящимся в исследуемой жидкости. Фушщионализация клеток при помощи полимерных пленок и углеродных нанотрубок позволяет значительно усилить сигнал, обусловленный участием [Fe(CN)6f' в процессе переноса электрона в электрон-транспортной цепи клеток дрожжей. В качестве сенсорного элемента могут быть использованы любые микроорганизмы, что делает данный метод универсальным доя создания респираторных микробных сенсоров или в противомикробных тестах для селективного определения антимикробной активности лекарственных препаратов или оценки показателей жизнеспособности клеток.

2.3. Магиитно-модифицнрованиые клетки как компоненты биосенсоров для определения токсических веществ

Разработка эффективных подходов к иммобилизации микроорганизмов на поверхности физического преобразователя при конструировании микробных биосенсоров остается одной из нерешенных проблем. Существующие ныне способы закреачения клеток на рабочих поверхностях биосенсоров основаны на ковалентой кросс-сшивке клеток или на их включении в полимерную матрицу. Сушественымн недостатками данных способов является: 1) химическое воздействие на клетки, часто приводящее к их гибели и 2) необратимая иммобилизания клеток, делающая невозможньм замену биорецепторного слоя. Дистанционное удерживание функционализированных микроорганизмов на рабочей поверхности биосенсора при помощи магнитного поля может стать перспективным решением. Ранее была описана магнитная модификация клеток при помощи наночастиц, приводивши к их гибели, что делало невозможным применение магнитно-модифицированных клеток в биоанализе (Safarik et al., 2007). Метод прямой модификации клеток при помощи РАН-стабилизированных магнитных частиц обеспечивает сохранение жизнеспособности клеток, что

гкшсяияет использовать их для фута биосенсорах и биоаналитических микро1 Схематическое изображение

биоаналитического мккрофтоидного чипа, основанного на магнитном удерживании клеток, представлено на Рис. 23. Микроячейки чипа предназначены для удерживания магни-шо-фу.нкцнона.'шзированных клеток при помощи постоянного магнита. Клетки могут быть иммобилизованы в ячейках, а после анализа удалены в процессе отмывки. Аналитическим сигналом служит интенсивность yEGFP-

опосредоваиной флуоресценции,

пропорциональная концентрации геиотоксичного вещества в среде. Установлено, что иаиочастицы не оказывают влияния на индукцию yiiGFP в клетках. Дрожжи GreenS сгеен™ были

фушеционализированы с

использованием ряда концентраций магнитных наночастиц. после чего магнитно-мо дифип ированные клетки помещали в лунки микропланшета и инкубировали н присутствии геиотоксичного метил-

метансульфона га (ММС). Наряду с магнитно»

модифицированными клетками

использовали и иктактные клетки, а также клетки, покрытые РАН. Отсутствие ингибирования индукции yEGFP в результате геиотоксичного воздействия ММС показано на гистограмме удельной интенсивности флуоресценции (Рис. 24). Это связано с высокой биосовместимостью РАН-стабилизированных магнитных

наночастиц, что согласуется и с данными других исследователей (Diaspro ei al, 2002. Кто! el al, 2005). Размеры микрочипа позволяют наблюдать одновременно за всеми микрокамерами при помощи иивер 1 ированно го м икрос ко па.

ционалтации клеток и впоследствии в ■шпах.

м щш

'1т,

¿¡шш

to »vC 'JN

Рис. 23. Схематическое изображение магнитного биочипа (а), градиент концентраций (Ь) и магнитно-фунюцгонализированные дрожжи в микрокамерах, удерживаемые при

ц вшшящя а

Юрт

Контроль Оиьи (лмнлоксии)

|{ | мягптшх 114 (иг/ил)

Рис. 24. Микрофотографии (1.5-интактных и (2) - магнитно-модифицированных ГМ- дрожжей

GreenScreen™ после индукции yEGFP'с помощью ММС. (3) - гистограмма интенсивности флуоресценции.

На Рпе. 23, с покачана самосборка ,чтпнппо~,модифицированных клеток в «шкроьзксш». Сила постоянного магнита и скорость потока жидкости позволяет удерживать клетки в микрокамсрах в течение длительного времени (до 14 часов). При удалении постоянного магнита клетки немедленно вымываются из микрокамер с потоком жидкости, что позволяет с легкостью заменить клетки после проведения анализа. Аналитический отклик микрофлюидного чипа-анализатора генотокснчпости на основе магнитно-модифицированных клеток ОгеепБетеег!™ определяли, пропуская через микрокамеры поток жидкости, содержащей градиент концентраций ММС (Рис. 23, Ь). Увеличение концентрации генотоксичного ММБ в микрокамерах приводит к пропорциональному Увеличению интенсивности флуоресценции магнитно-фунхционалнзированных ¡слеток. Гистограмма удельной интенсивности флуоресценции (Рис. 25) демонстрирует увеличение аналитического сигнала с увеличением концентраций ММС (от 0 до 450 мкМ). Фоновая флуоресценция обусловлена нормальной активностью синтеза ферментов репарации, обуславливающего наличие небольших количеств уЕОГР к клетках СпеепЗсгееп™. Таким образом, впервые показано применение магкитно-фуикционализированных клеток в качестве сенсорного элемента в микрофлюидных биоаналит ических чинах.

Рис, 25. (а) - МШ-индукция уКОРР-флуоресценцян в магнитно-модифицированных дрожжах Огееп5сгееп',м (интенсивность флуоресценции в метках пропорциональна градиенту концентрации ММ$ в камерах). (Ь) гистограмма интенсивности уЕОРР-флуоресценции.

Масиитно-фуикциоиалипированные клетки С. ругспШо&а использовали в ампсрометричсских бносеисорах на основе печатных электродов. Клетки закрепляли на поверхности электрода при помощи постоянного магнита. Для размещения магнита под печатным электродом была изготовлена фторопластовая подножка (Рис. 26, а) с цилиндрической выемкой для закрепления магнита (2 мм). Магнит обеспечивал присоединение клеток к поверхности рабочего электрода (Рис. 26, Ь) в течение длительного времени. Гербициды триазииового ряда вызывают гибель клеток водорослей в результате блокировки фотосистемы II, приводя к ингибнровтгато переноса электрона на уровне фотохимического реакционного центра кЧЬПапан еГ а!., 2005; Окнщ е1 а!.. 2008; ЬМапйа ег а!.. 2009). Концентранич тербицидов может быть определена при помоши

амиеро.метричееких биосенсоров на основе иммобилизованных водорослей (Védrine et al.. 2003). Блокировка переноса электрона в фотосистеме II растений гербицидами приводит к релаксации системы в процессе эмиссии фотона в виде автофлуоресценции (Giardi et al.. 2001 ).

функционалишрованныс клетки (3

подложка

Рис, 26. (а) - схематическое изображ основанного на магиитно-модифицированньтх клетках С. рутпоиЬ.ча. удерживаемых на поверхности печатного электрода при помощи постоянного мандата: (Ъ) - эпифлуоресцентиая микрофотография магнитно-модифицированных клеток С. рутюикш на поверхности печатного электрода (при меньшем и большем увеличении).

I "е Расстояние (мк&) 15 Рис. 27. Индукция флуоресценции под воздействием пропазина (гербицида триззинового ряда) в магнитно-модифицированных клетках С ругепо/Жка. Верхний ряд типичные флуоресцентные микрофотографии клетки до (слева) и после (справа) воздействия пропазина. Нижний ряд денситограммы интенсивности флуоресценции

Интенсивность автофлуоресценции хлорофилла В в интактиых клетках усиливается при контакте клеток с триазиновыми гербицидами.

Установлено. что магнитно-модифицированные водоросли

сохраняют способность к индукции автофлуоресценции под влиянием триазиновых гербицидов (Рис. 27). Магнитно-модифи цированные клетки С. pvrenoiäosa инкубировали в присутствии пропазина (I. I4*I0"3 М) в течение 1 часа (25 °С). после чего были получены микрофотографии клеток Для определения интенсивности фоновой автофлуоресценции в качестве контроля использовали интактные магнитно-

модифицированные клетки С. pyrenokJosa. Установлено. что пропазин вызывает индукцию флуоресценции в клетках водорослей, значения и нтенс и вности

флуоресценции составили 98+-11 o.e. (контроль) и 151 + 13 o.e. (опыт).

Аналогичные результаты получены с использованием атразина. Результаты свидетельствуют о том. что слой магнитных наночастицна поверхности клеток не препятствует проникновению триазииовых гербицидов внутрь клетки. Содержание гербицидов при помощи биосенсора определяли с

использованием водных растворов гербицидов триазинового ряда. Аликвоты магнитно-

модифицированных клеток помещали в растворы, содержащие KiFe(CN)f,) и Na2$Ob после чего клетки наносили на электрод. Клетки самоорганизуются вокруг постоянного магнита (Рис. 26, Ь). Амперометрические измерения проводили при - 600 мВ.

Удаление помех, связанных с фоновым током, позволяет исключить влияние неравномерного■ распределения молекул гербицидов в жидкости. Использование мертвых магнитно-модифицированных клеток обуславливало сигнал, составляющий 2-3% от величины сигнала, полученного с использованием, живых клеток. Зависимость величины аналитического отклика биосенсора от концентрации гербицидов (атразина и пропазина) показана на Рис. 28. Линейная зависимость аналитического отклика биосенсора от концентрации гербицидов триазинового ряда наблюдается в области концентраций от 0,6 до 120 мкМ для пропазина и от 0,9 до 74 мкМ для атразина. Предел обнаружения гербицидов составил 0,4 мкМ для пропазина и 0,7 мкМ для атразина.

2.5. Магнитно-модифицированные бактериальные биорепортерные клетки (клеткн-биосенсоры)

Бактериальные биорепортеры Л. baylyi (ADPWHJux, ADPWH-Pu-lux-xyíR и ADPWH Alk) в ответ на присутствие в среде токсина аккумулируют люминесцентный белок люциферазу, обуславливающую интенсивную биолюминесценцию клеток (Huang et al., 2006). Для получения информации о содержании индуктора в среде биорепортеры A. baylyi использовали per se, без каких-либо трапсдьюсеров. Количественную оценку интенсивности биолюминесценции проводили при помощи планшетных люминометров. Магнитная модификация клеток A. baylyi была направлена на выделение и концентрирование клеток после их инкубации в среде (водные растворы токсинов, суспензии почв или песка). Штамм ADPWHJux является биорепортером, реагирующим на присутствие в среде салициловой кислоты. Для индукции биолюминесценции. индуктору необходимо преодолеть цитоплазматическую мембрану, при этом в цитоплазме происходит взаимодействие индуктора с ретулягорньш белком SaIR, который, после изменения конформации, вызванной воздействием салициловой кислоты, активирует соответствующий промотор, вызывающий экспрессию гена htxCDAfílü обуславливающего синтез люциферазы и, соответственно, биолюминесценцию.

10Q.

во. • пропазин

о атразин

» м-

40 •

20- ♦ «

Концентрация (мкМ) Рис. 28. Зависимость изменения тока от концентрации гербицидов (атразина н пропазина).

А МягвегяшршипыгнлпкнЛЬцф'/ЛДО^ОД [их

5 141

■Г

11» мк-М 2 мкМ

ПК» ИМ 5« ИМ контри.»!

Нятияныиклггкн .4. (нц?1у( АПРХ>'Н_1о.т

* |«*Г< § 4

я 8

10(1 мк-М 1«мкМ 1 МкМ 100 вМ 50 яМ

|.ОН I ро и.'

Рис. 29. Индукция биорепортерного сигнала салициловой кислотой у (а) магнитно-модифицированных и (Ь) - интактных клеток А. Ъау1уч АОР\¥Н_1их.

& ю

контроль £

&15нкс«^чкЦ1Ш95>ей кмсявты (гакМ) «МЕРК К»»ггрояь

гл>кгр-:т б 60

Канис«тргцкя толуола (жМ) «МБРК Контроль

дожм п»трад(!Кйн

* ЭДБРК Kcirrpa.ua>

Штампы МБРК

у. контроль шкпрога.+скгедвкгак

>с индуктор »«(¡джгор+еа.тадй.'ал

Рис. 30. Биорепортерная активность магнитно-модифицированных и интакгных клеток А. Ьау1у/. Аналитический отклик магнитно-модифицированных и интактных (а) - клеток А. Ьау1у> АОР\^Н_1их, обусловленный воздействием салициловой кислоты в концентрациях от 50 нМ до 100 мМ; (Ь) - клеток Л. Ьау1у1 АОРУ/Н-Ри-1их-ху1К, обусловленный воздействием толуола в концентрациях от 6 до 600 мМ; (с) - клеток А. Ьау1у1 АОР\УН_А1к, обусловленный воздействием октана, додекана, тетрадекана и октадскана; (с!) - специфичность биорепортероной активности магнитно-модифицированных и интактных клеток А. Ьау1)ч (АОРУ/Н_1их, АОР\¥Н-Ри-1«х-хуП1 и АОР\¥Н_А1к) в насыщенном октадекане, 1 мМ салициловой кислоте и 300 мМ толуола (в присутствии или отсутствии насыщенного октадекана).

Относительную биолюминесценцию определяли в динамике как отношение абсолютной люминесценции к числу клеток. В качестве контроля использовали интактные клетки А. baylyi ADPWR_Lux. Наблюдается одинаковая зависимость динамического изменения относительной биолюминесценции и максимальной величины аналитического отклика в образцах интактных к магнитно-модифицированных клеток (Рис. 29), что свидетельствует о проникновении салициловой кислоты в клетки и о ненарушенном процессе индукции синтеза люциферазы (предел обнаружения для салициловой кислоты - 50 нМ). Несколько сниженные значения отклика в образцах магнитно-модифицированных биореоортеров связаны, вероятно, с оптическим эффектом наночастиц. Изучена индукция биолюминесценции в штаммах ADPWH-Pu-lux-xylR и ADPWH_Aik, предназначенных для определения толуола к алканов, соответственно. Гидрофобные вещества проникали в цитоплазму магнитно-модифицированных клеток, интенсивность биолюминесценции практически не отличалась от таковой в интактных клетках. Установлено, что включение октадекана в исследуемую смесь не приводило к индукции биолюминесценции ADPWH-Pu-Iux-xyiR и ADPWH lux, однако индукция биолюминесценции имела место при использовании клеток штамма ADPWH_AIk (Рис. 30). При анализе образцов почвы и речного песка в среду была внесена салициловая кислота. Суспензии почвы к песка были смешаны с аликвогами магнитно-модифицированных клеток А. baylyi ADPWHJux, после инкубации клетки отделяли при помощи постоянного магнита, ресуспендировали и помещали в лунках микроплантдета. Наблюдается зависимость относительной биолюминесценции от концентрации салициловой кислоты в речном, песке и почве (Рис. 31).

& 4ЙЯ ■ я

& т

<£ 1003 а

1С

® .*»

К §

.ш

Ь t?ö0ö

w ''

| «w -

I 3Si«

| тъ

V» -Луз;

, ¿ш

(С] С.'АЛ»К.Й.ЯО«ОЙ ККС.КНЫ <МГГКГ кескя)

Ö 0 14 LA и ни

{С} галйцшюной кислоты (мг/кг «очны)

в;

Рис. 31. Интенсивность биолюминесценции при определении салициловой кислоты с помощью магнитно-модифицированных клеток-биорепортеров А. Ьау1у< АОРУ/Н_1их в суспензиях речного песка (а) и почвы (Ь) через 90 мин инкубации после магнитного выделения клеток.

Различия в сенсорном отклике образцов песка и почвы связаны с многокомпонентным характером исследуемых образцов, не исключающими ингибироваиия или усиления проникновения салициловой кислоты в клетку. В образцах почвы, содержащих высокие концентрации салициловой кислоты (14 мг/мл и 140 мг/мл), могло произойти насыщение клеток салицилатом, что дает предельные значения биолюминесценции.

4* Искусственные многоклеточные системы (цитозомы) на основе функционализировакных микроорганизмов

В работе были впервые получены трехмерные упорядоченные структуры из живых клеток микроорганизмов, получившие название «цитозомы» (по аналогии с коляоидосомами (Уе1еу, Маёауата, 1997)).

1} Модификация дрожжей РАН 2) Образование Модификация цитозом полианионом

- РАИ

? РАК/С МС-' дрожжи

Арагонит 1) Модификации 2> Модификации мккрокоистаяпов миьрохристалоп

РДН Н«МОЧКСТИЦЗЧ'И

3| Модкфнкац* микро- 4} Фомирокомчв кристаллов РАН.Ф55;РАИ монослоя клеток

Магнитные наночасткцы

Арвгокит 1) 1) Модификация 2) Модификация мчкрокркс? ал поо к иьрокрист апов РАН наночлстипшн

-- РАН — РБ5

НС! мои ЭДТА

? РАН.СМС-дрожжи

3) Модификэцп микро- «5) Удаление темгтлатз 3? Фс»»ре*ян»с кристаипов РАН/РЗЭ/РАМ момоспоя клеток

Рис. 32. Схематическое изображение путей получения цитозом из клеток-дрожжей, с использованием в качестве темплатов: (а) - микропузырьков воздуха; (Ь) - микрокристаллов арагонита и кальцита (без предварительной магнитной модификации микрокристаллов); (с) - микрокристаллов арагонита и кальцита (с предварительной магнитной модификацией микрокристаллов); (б) - изначально полых микрокапсул, полученных с использованием магнитно-модифицированных микрокристаллов арагонита и кальцита.

В цитозомах клетки иммобилизованы в полиэлектролитной: матрице, предварительно сформированной на поверхности тем плата. После удаления темпдатое были получены полые трехмерные капсулы, обладающие внешней оболочкой, (повторяющей трехмерную форму темготата), состоящей из монослоя живых клеток, включенных в многослойную плимерную пленку. Схематическое изображение путей создания цитозом показано на Рис. 32. Использовали дрожжи, функционализированные многослойными пояиэлектрояитными пленками РАН и CMC. В качестве гемплатов использовали: 1) микропузырьки воздуха; 2) микрокристаллы арагонита и кальцита, ^модифицированные и 3) предварительно модифицированные при помощи ТМА-стабилизированных магнитных ааиочастиц; 4) пояые магнитно-модифицированные микрокапсулы. Были получены изотропные (сферические, кубические) и анизотропные (игловидные, прямоугольные) цитозомы.

4.1. Сферические цитозомы на основе мигеропузырьков воздуха

Стабилизация эмульсий и пен при помощи твердых коллоидных частиц длительное время используется на практике (Shchukin et al., 2005; Winterhalter, Sonnen, 2006). Клетки микроорганизмов также способны к стабилизации эмульсий, однако в стабилизации пузырьков газа, диспергированного в жидкости, метки ранее не применялись, что обусловлено одноименным отрицательным поверхностным зарядом клеток и микропузырьков воздуха в воде (Marinova et al., 1996, Yang et al., 2001). Использование микропузырьков воздуха в воде в качестве темплата для самосборки клеток приводит к исключительно простой системе, которая могла иметь место в естественных условиях. Поверхностный заряд клеток инвертируется после их модификации пленкой РАН/СМС/РАН (^-потенциал: + 20 мВ). Клетки, несущие положительный заряд, эффективно стабилизируют мшфопузырьки воздуха в воде. Для получения сферических цитозом отбирали верхнюю часть суспензии, содержащую стабилизированные клетками микропузырьки воз,чуха, а свободные клетки оседали на дно сосуда. Воздух самопроизвольно диффундировал из микропузырьков, в результате клетки формировали полую сферическую структуру, воспроизводящую по форме и размерам исходный микропузырек (Рис. 33).

Рис. 33. Процесс самосборки цитозом. (а) - микропузырек воздуха, стабилизированный монослоем клеток дрожжей; (Ь) - микропузырьки сосуществуют с цитозомами; (с) - воздух постепенно диффундирует из микропузырьков, стабилизированных клетками, приводя к образованию (<1) полых цитозом (трехмерная оптическая реконструкция).

После удаления воздуха, цитозомы покрывали трехслойной пленкой СМС/РАН/СМС для фиксации клеток в полиэлектролитиой мембране. Цитозомы обладали высокой механической стабильностью, например, они не были разрушены при высушивании и помещении в вакуум при СЭМ. СЭМ-микрофотографии (Рис. 34) демонстрируют распределение размеров цитозом (20 до 200 мкм), что определяется диаметром клеток (5-7 мкм) и максимальным стабильным диаметром микропузырьков. Размеры дегидратированных цитозом в среднем на 30% меньше аналогичных размеров нативных цитозом, определенных с использованием оптической микроскопии, что связано с усыхакием клеток дрожжей при подготовке образца для СЭМ.

4.2. Анизотропные цитозомы на основе мккрокристаллов карбоната кальция

Для получения анизотропных цитозом в качестве т:емплатов использовали микрочастицы карбоната кальция. Для арагонита характерна игловидная или веретеновндная форма (с некоторой примесью пластинчатых микрокристаллов), а для кальцита - кубическая форма. Химическая декомпозиция карбоната кальция осу ществляется в кислой среде либо с помощью хелатирующих реагентов.

Рис. 34. СЭМ-микрофотографии сферических цитозом, помешенных на стеклянные подложки.

Микрокристаллы модифицировали полиэлектролитами (PAH/PSS/PAH) для последующего присоединения к ним отрицательно заряженных дрожжей. Дрожжи, функционализированные пленкой РАН/CMC, и микрокристаллы

смешивали, инкубировали и отделяли от свободных клеток в процессе многократной элиминации супернатанта от осадка. Обработав подученные

м икроструктуры

дополнительными слоями

РАН/СМС, получали

многоклеточные системы,

состоящие из микрокристаллов арагонита и кальцита, покрытых монослоем клеток дрожжей (Рис. 35). Монослой клеток эффективнее формируется на поверхности кальцита, что объясняется большей площадью граней микрокубиков.

Присутствие свободных клеток обусловлено недостаточной

эффективностью разделения микрокристаллов, покрытых клетками, от суспензии, свободных клеток. Для получения полых цитозом микрокристаллы удаляли при помощи ЭДТА.

ВИвЯИЯЯГ, •

Рис. 35. Оптические микрофотографии микрокристаллов (а) - арагонита и (d) -кальцита; (Ь) и (е) - микрокристаллов, покрытых полиэлектролчтами и клетками; (с) и (f) - анизотропных цитозом на их основе.

Геометрическая форма цитозом воспроизводит форму использованных микрокристаллов. Состав полимерных пленок был подобран нами таким образом, что последним полкэлектролитным слоем всегда служил отрицательно заряженный полиион (PSS или CMC), что позволяло предотвратить электростатическое прилипание клеток, микрокристаллов и цитозом к пластиковым стенкам мнкропробирок.

4,3, Анизотропные цитозомы на основе магнитно-модифицированных микрокристаллов карбоната кальция

Использование магнитных наночастиц дня разделения компонентов в сложной смеси является перспективным подходом для отделения цитозом от свободных клеток. Для магнитной модификации микрокристаллы покрывали полиэлектролитами, а затем магнитными наночастицами. Магнитные отрицательно заряженные ТМА-стабилизированные наночастицы наносили на РАН-модифицированные микрокристаллы, после чего их окраска становилась буро-коричневой (Рис. 36). Полимерная пленка на поверхности микрокристаллов, дотированная наночастицами, состояла из РАН/ШЧ/PAH/PSS/PAH/PSS/PAH. В ряде экспериментов использовали магнитно-восприимчивые микрокристаллы кальцита, содержащие магнитные наночасттщы внутри микрокристалла. Магнитная модификация микрокристаллов позволяет использовать внешнее магнитное поле для отделения микрокристаллов от раствора. Ориентация магнитно-модифицированных микрокристаллов кальцита и арагонита вдоль линий магнитного поля является характерным признаком магнитно-

восприимчивых микрочастиц. При создании цигозом магнитно-модифицированные микрокристаллы вносили в суспензию дрожжей. покрытых РАН/СМС.

1 " 4 1 ^ V* " 25 цш ^НКЦш^^ е ,.; 25 М"'

Ф 5 цт 1 ф 100 цш % ' 25 цш Jm Щ 25 цт ■шШк Wat

Рис. 36. Оптические микрофотографии (a) (g) - микрокристаллов арагонита я кальцита, модифицированных РАН/МНЧ; (Ь) и (h) - магнитных микрокристаллов, покрытых пояюлектродитами и клетками; (с-е) и (i-k) - магнитных анизотропных цигозом.

После инкубации микрокристаллы, покрытые клетками дрожжей, отделяли при помощи постоянного магнита и модифицировали дополнительно бислоем РАН/CMC. В результате, получены суспензии микрокристаллов, покрытых клетками дрожжей, не содерлсавшие свободных клеток. Клетки формируют монослой на поверхности микрокристаллов, в котором практически отсутствуют промежутки между клетками. Микрокриоталлы тобой геометрии (иглы, кубики в планарньте частицы) покрыты клетками одинаково, что говорит об универсальности метода. Магнитная функционалкзащъ:

позволила установить, что присутствие свободных клеток в образцах покрытых клетками микрокристаллов обусловлено не диссоциацией клеток с поверхности микрокристаллов, а несовершенной системой очистки образцов от свободных клеток. После удаления темплатов в ЭДТА получены, полые цитозомы. отделяемые от суспензии свободных клеток с помощью магнита. Обработка ЭДТА не приводит к отсоединению клеток с поверхности микрокристаллов. Цитозомы являются хрупкими конструкциями, существенное локальное изменение давления приводит рис. 37. к их разрушению. микрофотография

цитозом.

Флуоресцентная анизотропных

Магнитное разделение позволяет избежать-разрушения птозом, имеющего место в случае центрифугирования образцов, или иного механического воздействия, тогда как неразрушающее воздействие магнитного поля дает возможность существенно повысить эффективность получения цитозом (на 78% в сравнении с использованием ^модифицированных микрокристаллов). Наиболее эффективно самосборка клеток происходила на пленарных микрокристаллах, имевших наибольшую ширину, что связано с минимальным стерическим отталкиванием одноименно заряженных клеток в таких системах. Упорядоченное расположение клеток на поверхности цитозом напоминает эпителиальный слой клеток, наблюдаемый на микроскопических препаратах простейших многоклеточных организмов. Мшсрофотография, представленная на Рис. 37, позволяет однозначно определить наличие клеток на фронтальных поверхностях цитозом.

4.4. Анизотропные цитозомы на основе полых микрокапсул, полученных с использованием магнитно-модифицированных микрокристаллов арагонита и кальцита

Разработана альтернативная техника получения цитозом, позволяющая исключить стадию химической декомпозиции микрокристалла. Микрокристадлы калщита к арагонита были модифицированы путем последовательного нанесения полиэлектролитных пленок и ТМА-стабшгазированных магнитных наночастиц (РАН/МНЧ/РАМ/Р58/РАН), после чего их растворяли в НС1 или ЭДТА. В результате получены полые микрокапсулы, форма которых воспроизводила форму исходных микрокристаллов (Рис. 38).

Рис. 38. СЭМ-микрофотографии полых магнитных микрохапсул.

Микрокапсулы выдерживают механическое воздействие (встряхивание, центрифугирование) и обладают магнитными свойствами, что позволяет отделять их от меточной суспензии при помощи магнита, сокращая риск разрушения микрокапсул в процессе ианесения клеток. В основе стабильности полых магнитно-модифицированных микрокапсул лежит слой магнитных наночастиц, формирующих плотную оболочку. Микрокапсулы игловидной и кубической формы использовали для создания анизотропных магнитных цитозом. В результате электростатического взаимодействия к/тетки формировали монослой на поверхности микрокапсул. Отделение цитозом от суспензии свободных клеток осуществляли при помощи постоянного магнита. Микрофотографии цитозом

представлены на Рис. 39. Характерное расположение клеток на поверхности полых мшфокапсул в виде монослоя хорошо просматривается как на игловидных, так и на пластинчатых композитных микрочастицах.

Рис. 39. Оптические микрофотографии полых микрокапсул (а,0 и магнитных цитозом, полученных с использованием игловидных (верхний ряд) и кубических (нижний ряд) микрокапсуя.

Конфокальные изображения (Рис. 40) и СЭМ-микрофотографии (Рис. 41) игловидных и кубических цитозом иллюстрируют формирование моиосдоя клеток на поверхности полых микрокапсул. Сохранение жизнеспособности клеток бьнто ожидаемым, ведь в процессе получения цитозом клетки, фактически, модифицируются исключительно бислойной пленкой РАН/СМС, которая не оказывает отрицательного влияния на жизнеспособность (Рис.42). Жизнеспособность клеток сохранялась до 4 недель при хранении цитозом при 4°С з стерильных условиях.

Рис. 40. Конфокальные изображения магнитных цитозом, полученных с использованием полых игловидных (а.Ь) и кубических (с) микрокапсул.

Рис, '41, СЭМ-микрофотографии магнитных цитозом. полученных с использованием полых игловидных (а,Ь) и кубических (с,б) микрокапсул.

Полученные in vitro искусственные трехмерные кластеры клеток имеют существенное внешнее сходство с некоторыми существующими в природе колониальными микроорганизмами (например, f'ohvx spp). Эволюционный процесс возникновения многоклеточных организмов из одноклеточных до сих пор неясен (King, 2004; Kirk, 2005). Считается, что процесс перехода от одноклеточных к многоклеточным организмам происходил многократно и независимо (Brooke. Holland. 2003).

Рис. 42. Жизнеспособность цитозом: оптические и соответствующие им флуоресцентные микрофотографии цитозом после инкубации с ФДА.

Колониальная теория возникновения многоклеточпости является одной из наиболее признанных (ОевшЫа, ¡993; МюЬоб ег а!., 2006), однако какие-либо ископаемые, позволяющие подтвердить или опровергнуть ее, отсутствуют. В данной работе были получены многоклеточные кластеры, состоящие из црлимерной мембраны, содержащей клетки, и внешне представляющие собой подую сферическую, кубическую или игловидную трехмерную микроструктуру. Сгрчючрз цитозом стабильна, клетки в их составе сохраняют свою

жизнеспособность в течение; нескольких недоль Фактически, данные миоюклс!очные структуры являются крайне примитивной рукотворной моделью многоклеточного организма. В колониальных микроорт анизмах и простейших многоклеточных организмах наблюдается такое же принципиальное строение -имеется полимерная мембрана (внеклеточная матрица), в которой заключены клетки. Безусловно, живые организмы устроены гораздо сложнее. Тем не менее, цитозомы также содержат искусственную внеклеточную матрицу (м(«послойная полимерная пленка), содержащую живые клетки, при этом трехмерная форма матрицы воспроизводит форму использованного тсмплша. Так как в работе использовали широко распространение и природе темн.тагы (и микрокрисгаллы карбоната кальция, и особенно микронузырьки воздуха присутствовали в водах мирового океана задолго до возникновения жизни на Земле), то не исключено, что аналогичные путь формирования многоклеточных организмов мог иметь место в эволюционном процессе. Одноклеточные организмы могли колонизировать микрокрнсталлы, -затем ими могла быть сформирована внеклеточная матрица, возникали межклеточные контакты, а затем продукты жизнедеятельности клеток способствовали растворению п удалению микрокрнстадлов. Подобный процесс мог происходить и с пузырьками газа, образовавшимися в среде, населенной одноклеточными организмами. Данный процесс был воспроизведен с использованием неорганических темплатов, мн кронузы рьков воздуха и полиэлектродит-функционализироватшых дрожжей. Бесспорно, по сложности своей организации цитозомы не сравнимы е существующими сегодня простейшими колониальными организмами. Тем не менее простота с которой могут быть получены цитозомы. и в особенности то, что для их получения необходимы широко распространенные в природе микрочастицы, дает основание предположить, что в одном из путей эволюционного возникновения мнет оклеточпосш могло иметь место формирование многоклеточных кластеров на основе неорганических микрочастиц.

ВЫВОДЫ

1. Разработан биосовместимый метод фушециоиа лизани и клеток микроорганизмов при помощи пленок цолиэлекгродитов, дотированных паиочаетицами золота, серебра, оксида железа и углеродными нанотрубками, а также методы прямой магнитной модификации клеток при помощи полимер-стабилизироваиных магнитных наночастиц.

2.Впервые установлено, что микроорганизмы в растворе являются центрами образования микрокристаллов карбоната кальция (фатерита), образующего мсзотюристые неорганические микрооболочки на поверхности жизнеспособных клеток.

3. Разработан метод иробоподгоговки образцов микроорганизмов для их характеристики при помощи поверхностно-усиленной спектроскопии комбинационного рассеяния (Романовской спектроскопии), основанный на функционализацни микробных клеток при помощи полимерных пленок и наночастиц благородных металлов.

4. Показано, что функционализация микроорганизмов при помощи магнитных наночастиц и углеродных нанотрубок позволяет использовать их в качестве биорецепторных элементов электрохимических биосснсоров и мнкрофлюидных аналитических устройств для определения генотокеичных веществ и теруицндов.

5. Впервые осуществлена магнитная модификация бактерий, экепресспрующих. биолюминеецен шые маркерные белки (Mai метизация кяеток-биорепортеров) и продемонстрирована возможность их использования для анализа токсичности многокомпонентных сред.

6. Впервые с использованием фунгашонализированных клеток микрорганизмоп и неорганических тсмодатов получены и охарактеризованы трехмерные многоклеточные кластеры (питозомы).

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в журналах, рекомендованных ВАК

1. Znmaleeva, A.I. A whole-cell amperometric herbicide biosensor based on magnetically functionalised microalgae and screen-printed electrodes / A.I. Zainalecva.'l.R. Sharipova. R.V. Shamagsuinova, A.N. Ivanov, G.A. Evtugyn. D.G. Islunuchametova, R.K. Fakhrullm U Anal. Methods - 2011. - V. 3. - P. 509-513.

2. Zhang, D. Functionalization of whole cell bacterial reporters with magnetic nauoparliclcs / D. Zhang*, R.F. Fakhrullin*. M. Ornea, H. Wang, J Wang, V.N.

- Paunov , O. L¡, W.E. Huang // Microb. Biotech. 2011. - V. 4. - P. 89-97. (* -contributed equally).

3. Gareia-Alonso, J. Micro-screening toxicity system based on living magnetic yeast and gradient chips / J. Gnrote-Akmso, R.F. Fakhrullin, V. "N. Paunov, Z. She», J. D. Hardege, N. Pamroe. S. J. Ilaswell, G. M. Green way !i Anal. Bioanal. СЬеш. -2011. - V. 400. - P. 1009-1013.

4. Fakhrullin, R.F. live celloidosome stniclavcs based on the assembly of individual cells by colloid interactions / R.I'. FakhrulUu, M.-L. Brandv, O.J. Cayrc, O.D. Velev, V.N. Paunov ¡i Plivs. Chem . Chem. 1'hys. - 2010. V. 12......P. 11912-11922.

5. Fakhrullin, R.F. Interfacing living unicellular algae cells with biocompatible polyelectrolyte-stabilised magnetic- nanoparticies / R.F. Fakhrullin, L.V. Shlykova, A.Í. Zamalee-va, D.K. Nurgaliev, Y.N. Osin, J. García-Alonso, V. N. Paunov // Macromol. Biosci. -2010. -V. 10. - P. 1257 1264.

6. Порфирьева, A.B. Биосенсоры из основе полиэлектролитных комплексов ДНК и электрополимеризовапных материалов / А.В. Порфирьева, В.Б. Костмлева, А.14. Замалеева, ГА. Евтюгии, Р.Ф. Фахрулдин. В.З. Латыпова If Ученые записки Казанского государственного университета. Серия "Естественные пауки". -2010. - Т. 152, №3. - С.123-133.

7. Brandv, M.-L. Directed assembly of yeast cells into living celloidosomes by microbubble (emplaiing / M.-L. Brand)', O.J. Cayre. R.F. Fakhrullin. O.D. Velev, V.N. Paunov'' Soft Matter-2010. -V. б. -V. 3494 -3498. (coverpage article)

8. García-Alonso, J. Rapid and direct magnetization of GFP-reporter yeast for micro-screening systems / J. García-Alonso*. R.F. Fakhrullin*, V.N. Paunov // Biosens. Bioelecli on* 2010, V. 25. P. 1816 -1819. (* - contributed equally).

9. FakhruUiii, R.F. A direct technique for preparation of magnetically functionalised living veast cells / R.F. Fakhrullin, J. Garcia-Alonso, V.N. Paunov ¡¡ Soft Matter ■ 2010. ' V, 6. P. 391 -397.

10. Замалеева. А.И. Микроскопические методы для характеристики наномолифииироваииых клеток микромицетов А.И. Замалеева, Ф.К. Алимова, Д.Г. Ишмухамстова, Р.Ф. Фахруляия Н Ученые записки Казанского государственного университета. Серия "Естественные науки". 20.10. Т. 152, .Na!. С. ПО- 120.

П. Zamaleeva. A..]. Polyclcctrolyte-mcdiatcd assembly of multi-walled carbon nanotubes on living vcast cells i A.I. Zamaleeva. I.R. Sharipova. A.V. Porftreva. G.A. Evtugyn, R.F. Fakhrullin // Langmuir 2010. V. 26. № 4. P. 2671 2679. 12.. Kalnamati, M. Layer-by-layer coating of bacteria with noble metal nanoparticles for surface-enhanced Raman scattering / M. Kahraman. A.l. Zamaleeva, R.F. Fakhrullin, M. Culha// Anal. Bioanal. Cliem. - 2009. • V. .195. - P. 2559-2567.

13. Fakhrullin, R.F. Hybrid cellular inorganic core shell micropartieles: encapsulation of individual living cells in calcium carbonate microshells / R.F. Fakhrullin. R. T. MinullmaИ Langmuir.....2009. - V. 25, № 12. - P. 6617 6621.

14. Fakbrollin, R.F. Magnetically responsive calcium carbonate microcrystals / R.F. Fakhrullin. A.G. Bikmullin, D.K. Nurgalicv /7 ACS Appl. Muter. Interlaces 2009. V. 1.№9.-V. 1847-1851.

15. Замалссва, А.И. Наномодифициропанныс бактерии: детекция единичных клеток .методом поверхностно-усиленной романовской спектроскопии / А.К. Замалссва, М. Кахраман. М. Чумка, Р.Ф. Фахруллин // Ученые -записки Казанского государственного университета. Серия "Физико-математические науки". - 2009. ■-- Т. 151, № 1. - С. 82-90.

16. Fakhrullin, R.F. Fabrication of living cellosonics of rod-like and rhombohedral morphologies based on magnetically responsive templates / R.F. Fakhrolliti, V.N. Paunov i! Cheni. Commun. - 2009. - P. 2511-2513.

17. Fakhrullin, R.F. Living fungi cells encapsulated in polyelcctrolyte shells doped with metal nanoparticles^ R.F. Fakhrullin. A.I. Zamaleeva, M.V. Morozov, D.l. Tazetdinova. F.K. Alimova, A.K. Hilmtitdinov, R.I. Zhdanov. M. Kahraman, M. Culha /.' Langmuir - 2009. - V. 25, № 8. - V. 462S-4634.

18. Fakhrullin R.F. Quartz crystal microbalance immtmosensor for the detection of antibodies to double-stranded DNA ' R.F. Fakhrallin. V.G. Vinter. A.I. Zamaleeva, M.V. Malvceva. R.A. Kottrbanov, B.K. Tcmesgen, D.O. Ishmiichametova, Z.I. Abramova, OA. Konovalova, M.K. Salakhov /.'Anal. Bioanal. Chera. 2007. V. 388. - P. 367-375.

Патенты

1. «Construction and application of magnetic lianopartieles (MNPs) coated whole cell biosensors» Y. Zeng, W.E. Huang, D. Zhang, R.F. Fakhrullin, M. Ozmen. V.K Paunov, Peoples Republic of China patent application № Z1.201010513790.5 (2010)

2. «Способ модификации живой клетки». А.И. Замалеева, Ф.К. Алимова, Р.Ф. Фахруллин. Патент РФ № 2377310. 2009. Бюл. №36.

Г лава в учебном пособии I. Фахруллин, Р.Ф. Биомиметика - имитация биологических систем и устройств в конодиалазоис I Р.Ф. Фахруллин''/ Сборник учебно-методических материалов для слушателей Вссроснйской школы-ссминара «Нанобии технологии, проблемы и перепет ивы», изд-во БелГУ, - 2010. С. 55-59.

Статьи в сборниках материалов конференций

1. Fakhrullin, R.F. Hybrid biomimetic structures based on inorganic nauopavticles. synthetic polymers and living cells / First International Confcrcncc of Young Scientists "Chemistry and Chemical Technology": proceedings, Lviv. Ukraine. -2010.-P. 200-201. '

2. Tarn, M.D. Magnetically actuated particle-based procedures in continuous How : M.D. Таге, S.A.'Peyman. R.F. Fakhrullin. A. lies, V.N. Paunov. N. Famine 14th

Internationa! Conference "Miniaturized Systems for Chemistry and Life- Sciences'": proceedings, Groningen, The Netherlands. - 2010, - P. 1679-1681.

3. Морозов M.B. Спектроскопический и морфологический анализ лаиомодифицированнм* клеток грибов / М.В. Морозов. А.И. Замалеева, Д.И. Тазетдшюва, Р.Ф. Фахруллшт, М.О. Сибгатуллин, Ф.К. Алимова, А..Х. Гильмутдниов, М.Х. Салахов /■' XIV международная молодежная научная школа «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия»: сб. материалов, Казань.-2010.-С. 101-104.

4. Замалеева, А. И. Модификация микроорганизмов наночастицами для их детекции методом поверхностно-усиленной Римановской шектроскоиии / А.И. Замалеева. М. Kaliraimm, М. £uiha, Р.Ф. Фахруддни // XII международная молодежная научная школа «Когерентная оптика и оптическая спектроскопия»: сб. материалов, Казань, - 2008. - С. 157-160.

Тезисы в сборниках материалов конференции

1. Коннова, С.А. Функциональные искусственные свободно плавающие живые биопленки: получение н характеристика / С.А. Коннова, А.И. Замалеева, Р.Ф. Фахруллнн /.' Всероссийская школа-семинар «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы»: сб. тез., Белгород. - 2010. С. 6.1-62.

2. Коннова.. С.А. «Симбиотичсокие» искусе! венные бионлешеи ' С.А. Коннова, А.И. Замалеева. Р.Ф. Фахрул.чин /';' Ш Всероссийски?, конгресс «Симбиоз-Россия - 2010»: сб. материалов, Нижний Новгород, - 2010. - С.58-59.

3. Минуллина, Р.Т. Живые клетки в неорганических оболочках: биоимитируюшая инкапсуляция ' Р.Т. Минуллина. Р.Ф. Фахруллтш Н III Всероссийский конгресс «Симбиоз-Россия - 2010»: сб. материалов, Нижний Новгород. - 2010. -С. 63.

4. Шарапова, И. Р. Гибридные микрочастицы, состоящие из живых клеток, нолизлектроли тов и углеродных нанотрубок»' И. Р. Шаринова, А.И. Замалеева, Р.Ф. Фахруллтш // III Всероссийский конгресс «Симбиоз-Россия - 2010»: сб. материалов, Нижний Новгород, - 2010. - С. 82.

5. Бикмуллин. А Г. Получение и характеристика неорганических микрочастиц различной морфологии, обладающих магнитными свойствами / А.Г. Бикмуллин, Д.К. Нургалиев, Р.Ф. Фахруллтш !( III Всероссийский конгресс «Симбиоз-Россия - 2010»: сб. материалов. Нижний Новгород. - 2010. - С. 163.

6. Бикмуллин, А.Г. Магнитные микрокристаллы карбоната кальция как основа для получения полых микрокапсул / А.Г. Бикмуллин, Р.Ф. Фахруллав ■■'/ Всероссийская школа-ссминар «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы»: сб. тез., Белгород, - 2010, - С. 29-30.

7. Замалеева, А.И. Иммобилизация шшоматериалов на иоверноегь клеток и их характеристика методами микроскопии ■ А.И. Замалеева, И.Р. Шарнпова, JLB. Шлыкова, М. Kahraroan, М. Culha, Р.Ф. Фахруллин /••' IV Международная 'конференция «Современные достижения бионаиоскопии»: сб. материалов, Москва, - 2010. - С.28.

8. Замалеева, А.И. Инкапсуляция живых .клеток в полнэлектролвтные нанонлешш, содержащие металлические наночаепшы и углеродные ианогрубкн / А.И. Замалеева, И.Р. Шарнпова. Р.Ф. Фахруллин // Всероссийская конференция «Структура и динамика молекулярных систем»: со материалов, Казань. - 2009......С. 24.

9. FakhrulUn, R.F. Fabrication of living yeast ccllosomes bv polvclcctrolytc mediated assembly and magnetically responsive templates / R.F. Fakhrullin. J.R. Garcia-Alcmso. V.M. Paunov // Materials Research Society Fall Meeting. Boston. USA. -2009. -- P. X372.

10. Minullina, R.T. The fabrication of hybrid core-shell microparticles: encapsulation of individual living cells in calcium carbonate microshells ; R.T. Minullina, R.F. Fakhrullin '/ 13Ul annual symposium «SymBioSE 2009»: abstracts. Kazan. - 2009 -P. 83.

11. Fakhrullin, R.F. Fabrication of living yeast ccllosomes by polyelectroiyte niedialed assembly and magnetically responsive templates / R. F. Fakhrullin, M.-L. Brandy, O. Cayre. O. D. Velev, V. N. Paunov // 14th UKPCF Annual Meeting «Polymers and colloids»: proceedings. Kingston upon Hull, UK, - 2009. - P. 34.

12. Zamalceva. A.I. Encapsulation of individual living cclls in polymer shells doped with inorganic nanoparticlcs and microparticles / A.I. Zamalceva, R.T. Minullina, R.F. Fakhrullin, M. Culha, M. Kahraman, F.K. Alimova, .T. Garcia-Alonso. V, N. Pauuov H 14th UKPCF Annual Meeting «Polymers and colloids»: proceedings. Kingston upon Hull, UK, - 2009, - P. 22-23.

13. Замалеева, А.И. Иаиомодифнцировшише микроорганизмы: пансеепие полимерных оболочек и наночастиц па новерхисхль клеточных сгснок / А.И. Замалеева, И.Р. Шарипова, Р.Ф. Фахрудаип // Международная конференция «Синтез, исследование свойсгв, модификация и переработка высокомолекулярных соединений V Кирпичниковскис чтения»: сб. материалов. Казань, - 2009. - С. 342.

.14. Фахруллин, Р.Ф. Живые цитозомы ■■■• новый класс биоколлоидных микрочастиц / Р.Ф. Фахруллин, В.Н. Паунов // Международная конференция «Синтез. исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений V Кирпичниковскис чтения»: сб. материалов, Казань, - 2009. С. 171.

15. Замалеева, А.И. Поверхностная структура клеток дрожжей, покрытых полимерными тонкими пленками и золотыми наночаешцами / А.И. Замалеева. Д.И. Тазещииова. М.В. Морозов, Ф.К. Алимова, АХ. Гильмутдипов. Р.Ф. Фахделлпи U И Международная коифсрсшшя «Современные достижения бионаносконии»: сб. материалов, Москва. - 2008. - С. 24.

16. Fakhrullin, RF. Anisotropic microcapsules coaled with metal nanopariicies R.F. Fakbrullin, R.I. Khakimova, A.I. Zamalceva, Z.I. Abramova. V.N. Paunov / second Saint-Pctcrsburg international conference «NanoBio' 08»: proceedings, St. Petersburg, - 2008. - P. 65-66.

17. Фахруллин, Р.Ф. Цитозомы - искусственные многоклеточные структуры Р.Ф. Фахруллин, О.Ж. Каире, О.Д. Велев, В.Н. Паунов И IV съезд Российскою общества биохимиков и молекулярных биологов: сб. материалов, Новосибирск, - 2008. - С. 305.

18. Коинова, С.А Микросферы и мнкрокрнсталлы, содержащие металлические иаиочастшда / С.А. Коинова, Р.Х. Хакнмова, А.И. Замалеева, Р.Ф. Фахруллин // II Международная конференция «Поетгеыомная эра в биолотин и проблемы биотехнологии»: сб. материалов. Казань, - 2008. - С. 55.

19. Мамаков. Т.В. Микрокристаллы и микросферы с магнитными свойствами / Т.В. Мамаков. А.Г. Бикмулдин, А.И. Замалеева, Р.Ф. Фахруллин :< 11

Международная конференция «Постгсномиая эра в биологии и проблемы биотехнаюги.'!»: сб. материалов, Казань, - 2008. - С. 77.

20. Мин«,-длина. Р.Т. Модификация живых, клеток неорганическими микчюеферами и металлическими наночастицами Р.Т. Минуллина. Р.К. Вафина, A.M. Замплеева, Р.Ф. Фахруллпяг /'■•' II Международная конференция «Поен ено.мная ара в биологии и проблемы биотехнологии»: сб. материалов, Казань.-2008......С. 85.

21. Замалеепа. А.И. Идентификация единичных клеток бактерий, покрытых иапоилепками и наночастицами '' А.И. Зам алее ва, М. Kahraman, М. ^uüia, Р.Ф. ф ах рул л ни // VIII Конференция «Материалы и технологии XXI века»: сб. материалов, Казань. - 2008. С. 37.

22. Мамакоп, Т. В. Синтез неорганических микрочастиц, • содержащих нашчастицы / Т В. Мамаков. Р.Х. Хохимова, СЛ. Кониова, А.Г. Бикмудлин, А.И. Замалеевэ, Р.Ф. Фахрулшш // VIII Конференция «Материалы и технологии XXI иска»: сб. материалов, Казань, - 2008. -C.S4.

23. Мииуллииа, Р.Т Инкапсуляция микромицетов в оболочки, содержащие неорганические микросферы и металлические нашчастицы / Р.Т. Минуллина, Р.К. Вафипа. А.И. Замалеева, Р.Ф. Фахруллин /V VIII Конференция «Материалы и технологии XXI века»', сб. материалов, Казань, - 2008. - С.56.

Благодарности

Искреннюю благодарность и признательность автор выражает научному консультанту проф. д.б.н. Ольге Николаевне Ильинской за неоценимую помощь и моральную поддержку при подготовке диссертации.

Автор выражает глубокую благодарность проф. д.б.н. Д.П. Ишмухаметовой (КФУ), д-ру В.II. Иаунову (Университет г. Халл, Англия), д-ру М. Чулхе (Университет Йедитеие, Турция), д-ру В. Хуатцу (Университет г. Шеффилд. Англия), д-ру X. Гарсиа-Алонсо (Университет Республики. Мотггевщ(ео, Уругвай), проф. д.х.н. Г.А Ввтюгину (КФУ). п{юф. д.г-м.н. Д.К. Нургалиеву (КФУ), проф. д.м.и. А. П. Киясову (КГМУ), проф. д.ф-м.и. А.Х. Гильмутдинову (КФУ), ииж. B.C. Гпврияооу (КФУ), к.б.н. И.С. Газизову (МОиН РТ), Н.Н. Кузнецовой (КФУ), проф. д.б.н. Г.Ф. Ситдиковой (КФУ), к.б.н. А.В. Яковлеву (КФУ), Ф. Н. Имамутдинову (КФУ) и к.б.н. А.И. Колпакову (КФУ).

Автор благодарит за техническое содействие М. Кахрамана, К. Татдыдиль, Ю.Н. Осипа, д.б.н. В.В. Сальникова, А. Лоури. А. Сипклэйр, М. Озмена, д-ра Д. Джаига и М.В. Морозова.

Автор благодарит своих коллег по лаборатории биомагериалов и

нано.мотериалов КФУ.....ассистента кафедры биохимии к.б.н. Алсу Замалсеву и

студентов Ренату Мииуллииу, Светлану Кониову, Ильзшо Шарипову и Марию Дзамукову за помощь и поддержку.

Наконец, но не в последнюю очередь, автор благодарит родителей - Фарида Фахразиевича и Татьяну Зульфатовиу, а также брата Рамнля за моральную и материальную поддержку, без которых диссертационная работа не могла бы быть выполнена.

Отзывы на автореферат просьба отправлять по адресу: 420008, Казань, ул. Кремлевская. д.1К, КФУ. Отдел аттестации научных кадров, Диссертационный совет Д 212.081.08. Ученому секретарю З.И. Абрамовой, факс: (843)238-76-01

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Фахруллин, Равиль Фаридович

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Современные биоаналитические системы, основанные на 21 микроорганизмах

1.2. Биоимитирующие системы на основе клеток 27 микроорганизмов

1.3. Наномодифицированные микроорганизмы.

Функционализация единичных клеток и их применение в качестве компонентов функциональных устройств 1.4. Характеристика метода послойного нанесения пленок 53 полиэлектролитов как эффективного способа функционализации поверхностей и коллоидных частиц

1.5. Применение метода послойного нанесения пленок 67 полиэлектролитов для поверхностной модификации клеток

1.6. Искусственные многоклеточные кластеры из клеток 75 микроорганизмов

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

II. 1. Материалы и аналитические методы

II. 1.1. Материалы и реактивы

II. 1.2. Микроорганизмы

11.1.2.1. Дрожжи

11.1.2.2 Бактерии

II. 1.2.3. Одноклеточные водоросли

II. 1.3. Физико-химические методы исследования 86 II. 1.3.1. Динамическое светорассеяние (ДСР) для определения размеров и поверхностного потенциала (^-потенциала) клеток и частиц

II. 1.3.2. Кварцевый микрогравиметрический анализ динамики 86 адсорбции полимеров

II. 1.3.3. Ультразвуковая обработка

II. 1.3.4. Микроскопические методы

II. 1.3.5. Спектроскопические методы

II. 1.3.6. Рентгеноструктурный анализ

II. 1.3.7. Магнитометрические исследования

II. 1.3.8. Методы определения жизнеспособности клеток

11.2. Синтез, очистка, функционализация и характеристика 95 наночастиц, углеродных нанотрубок и микрокристаллов

11.2.1. Синтез золотых наночастиц

11.2.2. Синтез серебряных наночастиц

11.2.3. Синтез и стабилизация магнитных наночастиц

11.2.4. Солюбилизация многостенных углеродных нанотрубок

11.2.5. Синтез и характеристика микрокристаллов карбоната 98 кальция

11.3. Функционализация клеточных стенок микроорганизмов при 99 помощи полиэлектролитов и наноматериалов

11.3.1. Функционализация клеточных стенок микроорганизмов 99 полиэлектролитами

11.3.2. Функционализация клеточных стенок микроорганизмов 100 полиэлектролитами и наночастицами (нанотрубками)

11.3.3. Функционализация клеточных стенок микроорганизмов 101 полиэлектролит-стабилизированными наночастицами оксида железа (биосовместимым магнитными наночастицами)

11.3.4. Инкапсуляция микроорганизмов с помощью 101 мезопористых оболочек из карбоната кальция

11.4. Клеточные биосенсоры на основе клеток микроорганизмов, функционализированных при помощи магнитных наночастиц и углеродных нанотрубок

11.4.1. Микрофлюидные системы (микрочипы) — дизайн, 102 создание микрочипов и оптимизация их операционных характеристик

11.4.2. Электрохимические биосенсоры на основе живых клеток 105 микроорганизмов, функционализированных углеродными нанотрубками или магнитными наночастицами

11.4.2.1. Электрохимический биосенсор на основе клеток 106 пекарских дрожжей, функционализированных углеродными нанотрубками и стеклоуглеродных электродов

11.4.2.2. Электрохимический биосенсор на основе магнитно- 107 модифицированных клеток водорослей Chlorella pyrenoidosa, и печатных электродов

11.4.3. Клеточные биосенсоры на основе магнитно- 109 модифицированных ГМ-биорепортерных клеток бактерий Acinetobacter baylyi

11.4.4. Многоклеточные трехмерные кластеры (цитозомы) - 112 техника формирования и характеристика

11.4.4.1. Методы получения цитозом

11.4.4.2. Сферические (изотропные) цитозомы

11.4.4.3. Анизотропные цитозомы иглообразной, планарной и 113 кубической формы

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

III. ХАРАКТЕРИСТИКА СИНТЕЗИРОВАННЫХ

НАНОМАТЕРИАЛОВ И МИКРОКРИСТАЛЛОВ

III. 1. Наночастицы благородных металлов (золота и серебра)

111.2. Суперпарамагнитные наночастицы оксида железа

111.3. Характеристика многостенных углеродных нанотрубок

111.4. Характеристика микрокристаллов карбоната кальция

III.5. Формирование многослойных полиэлектролитных пленок на планарных поверхностях и на неорганических микрочастицах

IV. ФУНКЦИОНАЛИЗАЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ ПРИ ПОМОЩИ ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЕНОК, НАНОЧАСТИЦ И НАНОТРУБОК, ВКЛЮЧЕННЫХ В СОСТАВ ПОЛИМЕРНЫХ ПЛЕНОК; ПОЛИМЕР-СТАБИЛИЗИРОВАННЫХ НАНОЧАСТИЦ И МЕЗОПОРИСТЫХ ОБОЛОЧЕК ИЗ КАРБОНАТА КАЛЬЦИЯ

IV. 1. Многослойные пленки полиэлектролитов для модификации поверхностей живых микроорганизмов IV.2. Модификация поверхностей живых микробных клеток при помощи многослойных пленок полиэлектролитов, допированных наночастицами и нанотрубками IV.2.1. Алгоритм метода поверхностной модификации клеток IV.2.2. Модификация клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae при помощи полиэлектролитных нанопленок и наноматериалов IV.2.3. Модификация клеток бактерий Escherichia coli, Acinetobacter baylyi и Staphilococcus cohnii при помощи многослойных полиэлектролитных нанопленок и наноматериалов

IV.2.4. Функционализация клеток дрожжей, одноклеточных водорослей Chlorellapyrenoidosa и бактерий Acinetobacter baylyi и Staphilococcus cohnii при помощи РАН-стабилизированных магнитных наночастиц

IV.3. Оценка жизнеспособности клеток микроорганизмов, функционализированных при помощи многослойных полиэлектролитных нанопленок и наноматериалов

IV.4. Микроинкапсуляция клеток микроорганизмов в мезопористые микрооболочки из карбоната кальция

V. ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫЕ МИКРООРГАНИЗМЫ

КАК КОМПОНЕНТЫ БИОАНАЛИТИЧЕСКИХ УСТРОЙСТВ

У.1. Характеристика микроорганизмов с использованием поверхностно-усиленной Рамановской спектроскопии

У.2. Электрохимический биосенсор на основе клеток дрожжей, функционализированных полиэлектролитными пленками и многостенными углеродными нанотрубками

У.З. Магнитно-модифицированные клетки как компоненты 221 биосенсоров для определения токсических веществ

V.4. Магнитно-модифицированные бактериальные 239 биорепортерные клетки (клетки-биосенсоры)

VI. ИСКУССТВЕННЫЕ МНОГОКЛЕТОЧНЫЕ СИСТЕМЫ 248 (ЦИТОЗОМЫ) НА ОСНОВЕ ФУНКЦИОНАЛИЗИРОВАННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ

VI. 1 Создание сферических цитозом на основе микропузырьков 250 воздуха

У1.2. Создание анизотропных цитозом на основе 255 микрокристаллов карбоната кальция

У1.3. Создание анизотропных цитозом на основе магнитно- 262 модифицированных микрокристаллов карбоната кальция У1.3.1. Магнитная модификация микрокристаллов карбоната 262 кальция

УТ.3.2. Формирование цитозом с использованием в качестве 267 темплатов магнитно-модифицированных микрокристаллов карбоната кальция

У1.4. Создание анизотропных цитозом на основе полых 274 микрокапсул, полученных с использованием магнитно-модифицированных микрокристаллов арагонита и кальцита УТ.4.1. Получение полых анизотропных магнитно- 274 модифицированных микрокапсул

У1.4.2. Формирование цитозом с использованием полых анизотропных магнитно-модифицированных микрокапсул

ВЫВОда

Введение Диссертация по биологии, на тему "Функционализация клеток микроорганизмов с использованием полиэлектролитов и наночастиц"

Актуальность темы

В последние годы развитие практически-ориентированных технологий на стыке биологии, физики, химии, электроники и материаловедения привело к формированию нового взгляда на роль микроорганизмов в создании биоаналитических и биоэлектронных устройств, которые уже в ближайшее время могут из прототипных проектов превратиться в рабочие инструменты биомедицины, экологического мониторинга и вычислительной техники.

Микроорганизмы рассматриваются как перспективный объект исследований в области синтетической биологии и биомиметики, междисциплинарных науках, целями которых являются создание искусственной жизни и биоимитирующих материалов и функциональных устройств, соответственно. Достижения синтетической биологии и биомиметики позволяют конструировать новые, основанные на биологических механизмах и процессах, технологии и устройства, применяемые практически во всех областях хозяйственной деятельности человека. Так, генетически модифицированные микроорганизмы могут быть использованы в качестве элементов биосенсоров (Huang et al., 2008), в масштабном производстве рекомбинантных белков и лекарств, а также в выработке биотоплива (Ro et al., 2006; Atsumi et al., 2009), а такие свойства микробных сообществ как, например, чувство кворума, могут быть использованы в логических устройствах и в микроэлектронике (Silva-Rocha, de Lorenzo, 2008; Danino et al., 2010). В связи с развитием нанотехнологии как междисциплинарной области исследований, возник особый интерес исследователей к работам, в которых осуществляется комбинация функциональных свойств микробных клеток и наноразмерных структур (нанопленок, наночастиц, квантовых точек, нанотрубок и т.д.) (Berry, Saraf, 2005; Sugunan et al., 2007). В результате были получены и описаны гибридные биоимитирующие системы, состоящие из клеток микроорганизмов и наночастиц (Baia et al., 2009). Предполагается, что такие системы могут быть использованы в качестве электронных микроконтактов (Berry et al., 2005), микропроводов (Li et al., 2003) и средств эффективной терапии онкологических заболеваний (Kuo et al., 2008). Кроме того, модификация клеток микроорганизмов позволяет придать им дополнительные функции, не свойственные исходным, не модифицированным клеткам. Например, искусственный магнетотаксис, обусловленный комбинацией магнитных наночастиц и микробных^ клеток, обеспечивает осуществление манипуляций с модифицированными клетками в пространстве с использованием внешнего магнитного поля, что, в итоге, дает возможность создания новых сорбентов и ферментативных комплексов на основе микроорганизмов (Safarik et al., 2007). Кроме того, были разработаны методы упорядоченной иммобилизации клеток на поверхностях биоэлектронных устройств (Berry et al., 2004) и созданы прикрепленные к субстратам биопленки (Eun, Weibel, 2009), имеющие строго определенную геометрическую форму. В ряде последних публикаций наблюдается тенденция к переходу от работы с миллиардами клеток к использованию единичных, индивидуальных клеток микроорганизмов (Song et al., 2005), организованных в виде искусственных многоклеточных кластеров (Gupta et al., 2008; Gupta et al., 2010; Regot et al., 2011). Таким образом, функционализация клеток микроорганизмов, то есть контролируемое придание клеткам новых функциональных возможностей, и создание биоаналитических устройств и упорядоченных многоклеточных кластеров является одним из наиболее перспективных направлений на стыке микробиологии, физической и коллоидной химии, нанотехнологии и биоэлектроники.

В соответствии с вышеизложенным были определены цель и задачи настоящего исследования.

Целью работы стала разработка методологических основ функционализии клеток микроорганизмов с помощью модификации поверхности микробных клеток полимерными нанопленками и функциональными наночастицами различной природы и формирование гибридных биоаналитических систем и упорядоченных многоклеточных кластеров.

Основные задачи исследования:

1. Разработка биосовместимых методов функционализации клеток микроорганизмов при помощи многослойных пленок полиэлектролитов, допированных наночастицами золота, серебра, оксида железа и углеродными нанотрубками.

2. Биоимитирующая микроинкапсуляция клеток микроорганизмов при помощи мезопористых неорганических микрооболочек карбоната кальция.

3. Разработка методов пробоподготовки образцов микроорганизмов для их характеристики при помощи поверхностно-усиленной спектроскопии комбинацинного рассеяния (Рамановской спектроскопии).

4. Определение возможности использования функционализированных клеток микроорганизмов в качестве биорецепторных элементов электрохимических биосенсоров и микрофлюидных аналитических устройств.

5. Оценка эффективности использования функционализированных клеток-биорепортеров в анализе токсичности жидких сред.

6. Конструирование трехмерных многоклеточных кластеров определенной геометрии с использованием функционализированных клеток микроорганизмов и неорганических темплатов.

Научная новизна и значимость работы

Разработан универсальный метод функционализации клеток микроорганизмов при помощи функциональных наночастиц, включенных в состав многослойных пленок полиэлектролитов, позволяющий сохранить жизнеспособность клеток. Показано сохранение жизнеспособности и ферментативной активности в функционализированных клетках. Установлено, что некоторые аспекты жизнедеятельности и биохимического состава функционализированных клеток могут быть изучены с использованием спектроскопических и электрохимических методов.

Впервые показан феномен образования микрооболочек из карбоната кальция (фатерита) на поверхности клеток микроорганизмов в процессе копреципитации ионов Са2+ и СО32" в водной среде без утраты жизнеспособности инкапсулированных клеток.

Установлено, что функционализация клеток микроорганизмов при помощи биосовместимых полимер-стабилизированных магнитных наночастиц не оказывает ингибирующего воздействия на генотоксин-обусловленный синтез зеленого флуоресцентного белка в клетках дрожжей Saccharomyces cerevisiae и люциферазы в бактериях Acinetobacter baylyi, а также на процесс фотосинтеза в одноклеточных водорослях Chlorella pyrenoidosa.

Впервые были получены и охарактеризованы стабильные трехмерные многоклеточные кластеры (названные нами цитозомами), представляющие собой гибридные коллоидные микрочастицы, состоящие из живых клеток дрожжей, включенных в микроскопические полиэлектролитные полые капсулы с определенной и контролируемой геометрической структурой. Морфологическое сходство цитозом с некоторыми примитивными колониальными и многоклеточными организмами, а также простота и широкая распространенность в природе частиц, подобных использованным нами темплатам (микрокристаллы и микропузырьки воздуха) дает основание предполагать, что' аналогичный процесс мог иметь место в эволюционном процессе возникновения многоклеточных организмов.

Практическая значимость работы

Разработан метод иммобилизации широкого спектра наноматериалов на поверхности клеточных стенок микроорганизмов (Патент РФ № 2377310). На основе данного метода разработаны электрохимические биосенсоры для определения общей токсичности среды и гербицидов триазинового ряда с использованием функционализированных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae и одноклеточных водорослей Chlorella pyrenoidosa. Впервые разработана методика пробоподготовки образцов микроорганизмов путем послойной функционализации единичных клеток с помощью полимерных пленок и наночастиц благородных металлов для их идентификации при помощи Рамановской спектроскопии.

Разработана эффективная методика синтеза стабильных гидрофильных биосовместимых наночастиц (средний диаметр 15 нм) оксида железа. С использованием данных наночастиц в качестве модификаторов поверхности клеток были впервые созданы микрофлюидные биоаналитические устройства для анализа генотоксичности (на основе магнитно-модифицированных клеток дрожжей GreenScreen™) и магнитно-модифицированные клетки-биорепортеры для анализа широкого спектра токсикантов (салициловая, кислота, толуол, алканы с различной длиной углеродной цепи) на основе штаммов бактерий Acinetobacter baylyi (заявка на Патент Китайской Народной Республики № ZL201010513790.5).

Разработанная методика контролируемого нанесения клеток на поверхности коллоидных частиц позволит оптимизировать методические подходы в создании биологических микрореакторов, а также в тканевой инженерии.

Основы биологической химии» для студентов специальности «Химическая технология пищевых добавок и косметических средств» в Национальном университете «Львівська Політехніка», Львов, Украина.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Разработанный метод функционализации клеток микроорганизмов, основанный на послойном нанесении тонких пленок полиэлектролитов, допированных наночастицами золота, серебра, оксида железа и углеродными нанотрубками, применим для создания новых биоимитирующих систем.

2. Реакция соосаждения ионов СО3" и Са2+ из растовора в присутствии клеток микроорганизмов приводит к образованию мезопористых неорганических микрооболочек из карбоната кальция на клеточных стенках.

3. Модификация поверхности микробных клеток функциональными наночастицами (наночастицы благородных металлов, оксида железа, углеродные нанотрубки) позволяет осуществлять характеристику микроорганизмов методом поверхностно-усиленной Рамановской спектроскопии и использовать их в качестве биорецепторных элементов в микрофлюидных и электрохимических биоаналитических устройствах.

4. Микроорганизмы и неорганические темплаты, модифицированные при помощи многослойных полиэлектролитных пленок, образуют трехмерные многоклеточные кластеры (цитозомы), воспроизводящие геометрическую форму темплата и являющиеся гипотетической моделью первичных колониальных микроорганизмов.

Апробация работы

Основные результаты исследований были представлены и обсуждены на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета (2008-2010 гг.); II и IV международных конференциях

Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2008, 2010); II международной научно-практической конференции "Постгеномная эра в биологии и проблемы биотехнологии" (Казань, 2008); XII и XIV международных научных молодежных школах "Когерентная оптика и оптическая спектроскопия" (Казань, 2008, 2010); IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008); всероссийской школе для студентов, аспирантов и молодых ученых

Нанотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2010, пленарный доклад), 2nd Saint — Petersburg international conference of NanoBioTechnologies

NanoBio'08» (С.-Петербург, 2008); VIII научной конференции научнообразовательного центра КГУ «Материалы и технологии XXI века» (Казань,

2008); XIII всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем (Казань, 2009); Annual Materials Research Society Fall

Meeting (Boston, USA, 2009); XIII международной конференции «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных tii соединений - V Кирпичниковские чтения» (Казань, 2009); 13ш Annual European Symposium «SymBioSE 2009: «Biology: Expansion of Borders» (Kazan, 2009); 14th UK Polymer Colloids Forum Annual Meeting (Hull, United Kingdom, 2009); V Міжнародна конференція"Біологія: від молекули до біосфери" (Харьків, Україна, 2010, пленарный доклад); 1st International Conference of Young Scientists "Chemistry and Chemical Technology" (Lviv, tin

Ukraine, 2010, приглашенный доклад); 14 International Conference on Miniaturized Systems for Chemistry and Life Sciences (Groningen, The Netherlands, 2010).

Место выполнения работы и личный вклад соискателя

Научные положения диссертации и выводы, вытекающие из анализа полученного экспериментального материала базируются на результатах собственных исследований автора. Личный вклад автора состоял в планировании и проведении исследований, анализе, обобщении и интерпретации полученных результатов, их оформлении для публикаций. Экспериментальные данные были получены автором за время работы на кафедрах биохимии и микробиологии Казанского (Приволжского) федерального университета. Эксперименты по характеристике клеток с помощью сканирующей электронной микроскопии и Рамановской микроскопии проведены в лаборатории др-а М. Чулха на кафедре генетики и биоинженерии университета Йедитепе (Yeditepe Universitese, Стамбул, Турция). Исследования по созданию цитозом и синтезу магнитных наночастиц проведены в лаборатории др-а В. Паунова на кафедре химии университета г. Халл (University of Hull, Халл, Великобритания). Исследования по магнитной функционализации и характеристике бактериальный биорепортерных клеток осуществлены в лаборатории экологической микробиологии др-а В. Хуанга в Исследовательском институте Крото университета г. Шеффилд (University of Sheffield, Шеффилд, Великобритания). Автор выражает искреннюю благодарность коллективам названных лабораторий.

Связь работы с научными программами

Работа выполнялась в соответствии с темами НИР Казанского (Приволжского) федерального университета: «Механизмы регуляции функциональной активности клетки» и «Исследование биомакромолекул, участвующих в регуляции метаболизма животных и растительных клеток. Разработка нанотехнологических методов определения компонентов». Исследования выполнены при поддержке грантов. Правительства Республики Татарстан «Алгарыш» (2006, 2008), Академии наук Республики Татарстан №14/15 (Г)-2009 и РФФИ № 09-04-05079-6, а также персональных стипендий университетов г. Халл, Великобритания (2009, 2010), г. Шеффилд, Великобритания (2010) и универститета Йедитепе, Стамбул, Турция (2007, 2008, 2009).

Публикация результатов исследования

По теме диссертации опубликовано 49 печатных работ, 18 из которых представлены в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК. Получен патент Российской Федерации и подана заявка на патент Китайской Народной Республики. Также опубликованы: глава в учебно-методическом пособии, 4 статьи в сборниках материалов конференций и 24 тезиса докладов научных конференций.

Объем и структура диссертационной работы

Работа изложена на 340 страницах машинописного текста, содержит 7 таблиц и 133 рисунка. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав, где описаны и обсуждены результаты исследований, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 400 источников и приложения.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Фахруллин, Равиль Фаридович, Казань

1. Дерябин, Д.Г. Применение природных и рекомбинантных люминисцирующих микроорганизмов для биотестирования минеральных вод / Д.Г. Дерябин, Е.С. Алешина // Прикладная биохимия и микробиология. — 2008. - Т. 44., № 4. - С. 417-421.

2. Дерябин, Д.Г. Влияние солей на свечение биосенсора на основе природного и рекомбинантного штаммов люминесцирующих бактерий /Д.Г. Дерябин, Е.С. Алешина // Прикладная биохимия и микробиология. -2008. -Т. 44, №3.-С. 324-329.

3. Плакунов, В.К. Персистенция и адаптивный мутагенез в биопленках / В.К. Плакунов, Е.А. Стрелкова, М.В. Журина // Микробиология. 2010. - Т. 79, №4. - С. 447-458.

4. Понаморева, О.Н. Микробные биосенсоры для определения биологического потребления кислорода / О.Н. Понаморева, В.А. Арляпов, В.А. Алфёров, А.Н. Решетилов // Прикладная биохимия и микробиология. -2011.-Т. 47, №1.-С. 5-15.

5. Решетилов, А.Н. Микробные, ферментные и иммунные биосенсоры для экологического мониторинга и контроля биотехнологических процессов / А.Н. Решетилов // Прикладная биохимия и микробиология. 2005. -Т. 41, № 5. - С. 504-513.

6. Смирнова, Т.А. Структурно-функциональная характеристика бактериальных биопленок / Т.А. Смирнова, JI.B. Диденко, P.P. Азизбекян, Ю.М. Романова //Микробиология. 2010. - Т. 79, №4. - С. 435-446.

7. Феофилова, Е.П. Клеточная, стенка грибов: современные представления о составе и биологической функции / Е.П. Феофилова // Микробиология. 2010. - Т. 79, №6. - С. 723-733.

8. Abbott, A. Cell culture: biology's new dimension / A. Abbott // Nature 2003. - V. 424. - P. 870-872.

9. Agarwal, M. Conductive paper from lignocellulose wood microfibers coated with a nanocomposite of carbon nanotubes and conductive polymers / M.Agarwal, Q. Xing, B.S. Shim, N. Kotov, K. Varahramyan, Y. Lvov // Nanotechnology- 2009. V. 20. - P. 215602.

10. Ai, H. Electrostatic layer-by-layer nanoassembly on biological microtemplates / H. Ai, M. Fang, S.A. Jones, Y. Lvov // Platelets. Biomacromolecules 2002. - V. 3. - P. 560-564.

11. Alonso-Lomillo, M.A. Screen-printed biosensors in microbiology: a review / M.A. Alonso-Lomillo, O. Dominguez-Renedo, M.J. Arcos-Martinez // Talanta 2010.- V. 82. - P. 1629-1636.

12. Alp, B. Formation of artificial, structured microbial consortia (ASMC) by dielectrophoresis / B. Alp, G.M. Stephens, G.H. Markx // Enzyme Microb. Tech. 2002. - V. 31. - P. 35-^-3.

13. An, Z. Fabrication and characterization of human serum albumin and L- a -dimyristoylphosphatidic acid microcapsules based on template technique / Z. An, C. Tao, G. Lu, H. Mohwald, S. Zheng, Y. Cui, J. Li // Chem. Mater. 2005 -V. 17(10).- P. 2514-2519.

14. Andersen, J.B. New unstable variants of green fluorescent protein for studies of transient gene expression in bacteria / J.B. Andersen, C. Sternberg, L.K. Poulsen, S.P. Bj0rn, M. Givskov, S. Molin // Appl. Environ. Microb. 1998. - V. 64.-P. 2240-2246.

15. Anzai, J. Construction of multilayer thin-films of enzymes by means of sugar-lectin interactions /J. Anzai, Y. Kobayashi // Langmuir 2000. - V. 16 -P.2851-2856.

16. Applegate, B.M. A chromosomally based tod-lux CDABE whole-cell reporter for benzene, toluene, ethybenzene, and xylene (BTEX) sensing / B.M. Applegate, S.R. Kehrmeyer, G.S. Sayler // Appl. Environ. Microb. 1998. - V. 64. -P. 2730-2735.

17. Arida, A.I. Encapsulation of ketoprofen for controlled drug release / A. I. Arida, M.M. Al-Tabakha // Eur. J. Pharm. Biopharm. 2007. - V. 66. - P. 4854.

18. Aruoja, V. Toxicity of nanoparticles of CuO, ZnO and Ti02 to microalgae Pseudokirchneriella subcapitata / V. Aruoja, H.C. Dubourguiera, K. Kasemetsa, A. Kahrua // Sci. Total. Environ. 2009. - V. 40(7). - P. 1461-1468.

19. Asharani, P.V. Cytotoxicity and genotoxicity of siver nanoparticles in human cells / P.V. Asharani, G.L. Kah Mun, M.P. Hande, S. Valiyaveettil // ACS Nano 2009. - V. 3. - P. 279-290.

20. Atsumi, S. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde / S. Atsumi, W. Higashide, J. C. Liao // Nat. Biotechnol. 2009. -V. 27.-P. 1177-1180.

21. Audet, P. Two-phase dispersion process for the production- of biopolymer gel beads: effect of various parameters on bead size and', their distribution / P. Audet, C. Lacroix // Process Biochem. 1989. - V. 12. - P. 217226.

22. Autio; K. Detection» of active yeast cells (Saccharomyces cerevisiae) in, frozen dough sections / K. Autio, T. Matilla-Sandholm // Appl. Environ. Microb. -1992.-V. 58.-P. 2153-2157.

23. Baia, B. A novel yeast bio-template route to synthesize Cr203 hollow microspheres / B. Baia, P. Wang, L. Wu, Li. Yang, Z. Chen, // Mater. Chem. Phys. -2009. V. 114.-P. 26-29.

24. Balkundi, S.S. Encapsulation of bacterial spores in nanoorganized polyelectrolyte shells / S.S. Balkundi, N.G. Veerabadran, D.M. Eby, G.R. Johnson, Y.M. Lvov//Langmuir-2009.-V. 25.-P. 14011-14016.

25. Baronian, K.H.R. The use of yeast and moulds as sensing elements in biosensors / K. H. R. Baronian // Biosens. Bioelectron. 2004. - V.19. - P.953-962.

26. Bäumler, H. Biological cells as templates for hollow microcapsules / H. Bäumler, B. Neu, A. Voigt, R. Mitlöhner, S. Leporatti, C.Y. Gao, E. Donath, H. Kiesewetter, H. Möhwald, H.J. Meiselman // J. Microencapsul. 2001. - V. 18(3). -P. 385-395.

27. Bechor, O. Recombinant microorganisms as environmental biosensors: pollutants detection by Escherichia coli bearing fabAr.lux fusions / O. Bechor, D.R. Smulski, T.K. Van Dyk, R.A. LaRossa, S. Belkin // J. Biotechnol. 2002. -V. 94.-P. 125-132.

28. Bekyarova, E. Functionalized single-walled carbon nanotubes for carbon fiber-epoxy composites / E. Bekyarova, T. Thostenson, A. Yu, M. E. Itkis, D. Fakhrutdinov, T-W. Chou, R. C. Haddon // J. Phys. Chem. C 2007. - V.lll (48).-P. 17865-17871.

29. Belkin, S. Microbial whole-cell sensing systems of environmental pollutants / S. Belkin // Curr. Opin. Microbiol. 2003. - V. 6. - P. 206-212.

30. Belkin, S. Oxidative stress detection with Escherichia coli harboring a katG::hix fusion / S. Belkin, D.R. Smulski, A.C. Vollmer, T.K. Van Dyk, R.A. LaRossa // Appl. Environ. Microb. 1996. - V. 62. - P. 2252-2256.

31. Ben-Yoav, H. A whole cell electrochemical biosensor for water genotoxicity bio-detection / H. Ben-Yoav, A. Biran, R. Pedahzurb, S. Belkin, S. Buchinger, G. Reifferscheid, Y. Shacham-Diamanda // Electrochim. Acta. 2009. -V. 54.-P. 6113-6118.

32. Bergbreiter, D.E. Polyvalent hydrogen-bonding fiinctionalization of ultrathin hyperbranched films on polyethylene and gold / D.E. Bergbreiter, G.L.Tao, J.G. Franchina, L. Sussman // Macromolecules 2001. - V. 34 - P. 30183023.

33. Berry, V. Deposition of CTAB-terminated nanorods on bacteria to form highly conducting hybrid systems / V. Berry, A. Gole, S. Kundu, C.J Murphy, R.F. Saraf//J. Am. Chem. Soc.-2005. V.127.-P. 17600-17601.

34. Berry, V. Highly selective, electrically conductive monolayer of nanoparticles on live bacteria / V. Berry, S. Rangaswamy, R. F. Saraf // Nano Lett. 2004. - V. 4(5). - P.939 -942.

35. Berry, V. Self-assembly of nanoparticles on live bacterium: an avenue to fabricate electronic devices / V. Berry, R. F. Saraf // Angew. Chem. Int. Edit. — 2005. -V. 44. P. 6668 -6673.

36. Beunink, J. Coupled reductive and oxidative degradation of 4-chloro-2-nitrophenol by a co-immobilized mixed culture system / J. Beunink, H.J. Rehm // Appl. Microbiol. Biotech. 1990. - V. 34. - P. 108-115.

37. Binks, B.P. Emulsions stabilised solely by colloidal particles / B.P. Binks, R. Aveyard, J.H. Clint // Adv. Colloid Interface 2003. - V. 100-102. - P. 503-546.

38. Binks, B.P. Naturally occurring spore particles at planar fluid interfaces and in emulsions / B.P. Binks, J.H. Clint, G. Mackenzie, C. Simcock, C.P. Whitby // Langmuir 2005. - V. 21 - P. 8161-8167.

39. Binks, B.P. Particle-stabilized emulsions: a bilayer or a bridging monolayer / B.P. Binks, T.S. Horozov // Angew. Chem. Int. Edit. 2006. - V. 45. -P. 773-776.

40. Binks, B.P. Particle-stabilised foams: an interfacial study / B.P. Binks, A. Stocco, W. Drenckhan, E. Rio, D. Langevin // Soft Matter 2009. - V. 5. - P. 2215-2222.

41. Biran, A. Bacterial genotoxicity bioreporters / A. Biran, S. Yagur-Kroll, R. Pedahzur, S. Buchinger, G. Reifferscheid, H. Ben-Yoav, Y. Shacham-Diamand, S. Belkin // Microb. Biotechnol. 2010. - V. 3. - P. 412-427.

42. Blodgett, K. B. Monomolecular films of fatty acids on glass / K. B. Blodgett // J. Am. Chem.Soc.- 1934. V.56.-P.495- 513.

43. Blodgett, K. B. Build-up films of barium stearate and their optical properties / K. B. Blodgett, I. Langmuir // Phys. Rev. 1937. - V.51. - P. 964-982.

44. Bottomley, L. A. Impact of nano- and mesoscale particles on the performance of microcantilever-based sensors / L. A. Bottomley, M. A. Poggi, S. Shen // Anal. Ghem. 2004. - V.76 (19). - P. 5685-5689.

45. Brogan, K.L. Optical fiber-based- sensors: application to. chemical biology / K.L. Brogan, D.R. Walt //• Curr. ©pin; Chem. Biol. 2005. - V. 9. - P. 494-500.

46. Brooke, N.M. The evolution of multicellularity and" early animal genomes / N.M. Brooke, P.W.H. Holland // Curr. Opin. Genet. Dev. 2003. - V. 13.-P. 599-603.

47. Brynda, E. Characterization of flexibility of ultrathin protein films by optical sensing / E. Brynda, M. Houska, A. Wikerstal, Z. Pientka, J. E. Dyr, A. Brandenburg // Langmuir 2000. - V. 16. - P. 4352-4357.

48. Byfield, M.P. Biochemical aspects of biosensors / M.P. Byfield, R.A. Abuknesha // Biosens. Bioelectron. 1994. - V. 9. - P. 373-399.

49. Caruso, F. Assembly of alternating polyelectrolyte and protein multilayer films for immunosensing / F. Caruso, K. Niikura, N. Furlong, Y. Okahata // Langmuir 1997. - V.13. -P. 3427-3433.

50. Caruso, F. Magnetic nanocomposite particles and hollow spheres constructed by a sequential layering approach / F. Caruso, M. Spasova, A. Susha, M. Giersig, R.A. Caruso // Chem. Mater. 2001. - V. 13(1). - P. 109-116.

51. Caruso, F. Enzyme encapsulation in layer-by-layer engineered polymer multilayer capsules / F.Caruso, D. Trau, H. Mohwald, R. Renneberg // Langmuir -2000. —V.16(4). — P.1485-1488.

52. Cassidy, M.B. Environmental applications of immobilized microbial cells: a review / M.B. Cassidy, H. Lee, J.T. Trevors // J. Ind. Microbiol. Biot. -1996.-V. 16.-P. 79-101.

53. Cayre, O.J. Fabrication of novel colloidosome microcapsules with gelled aqueous cores / O.J. Cayre,- P.F Noble, V.N. Paunov // J. Mater. Chem. -2004.-V. 14.-P. 3351-3355.

54. Chang, R. K. Surface enhanced Raman scattering / R. K. Chang, T. E. Furtak // Plenum Press publishing 1982. - P. 432.

55. Channon, K. Synthetic biology through biomolecular design and engineering / K. Channon, E.H.C. Bromley, D.N. Woolfson // Curr. Opin. Struc. Biol. 2008. - V. 18. - P. 491-498.

56. Chen, H. A novel approach based on ferricyanide-mediator immobilized in an ion-exchangeable biosensing film for the determination of biochemical' oxygen demand / H. Chen, T. Ye, B. Qiu, G. Chen, X. Chen // Anal. Chim. Acta. 2008. - V. 612. - P. 75-82.

57. Chen, L. Bacteria-mediated synthesis of metal carbonate minerals with unusual morphologies and structures / L. Chen, Y. Shen, A. Xie, B. Huang, R. Jia, R. Guo, W. Tang // Cryst. Growth Des. 2009. - V. 9. - P. 743-754.

58. Chen, X. Interfacing carbon nanotubes with living cells / X. Chen, U.C. Tam, J.L. Czlapinski, G.S. Lee, D. Rabuka, A. Zettl, C.R. Bertozzi // J. Am. Chem. Soc. 2006. - V. 128. - P. 6292-6293.

59. Cheng, L. Electrochemical-behavior and electrocatalytic properties of ultrathin films containing silicotungstic heteropolyanion SiW120404 / L. Cheng, S. J. Dong // J. Electrochem. Soc. 2000. - V.147. - P. 606-612.

60. Cheung, J.H. Molecular-level processing of conjugated polymers. Layer-by-layer manipulation of polyaniline via electrostatic interactions / J.H. Cheung, W.B. Stockton, M.F. Rubner // Macromolecules 1997. - V. 30(9). -P.2712-2716.

61. Choi, S.H. A whole cell, bioluminescent biosensor for the detection of membrane-damaging toxicity / S.H. Choi, M.B.Gu // Biotechnol. Bioproc. E. 1999.-V. 4.-P. 59-62.

62. Chong, K.F. Whole cell environmental biosensor on diamond / K.F. Chong, K.P. Loh, K. Ang ,Y.P. Ting // Analyst 2008. - V. 133(6). - P. 739-743.

63. Chouteau, C. A bi-enzymatic whole cell conductometric biosensor for heavy metal ions and pesticides detection in water samples / C. Chouteau, S. Dzyadevych, C. Durrieu, J.M. Chovelon // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 21. -P. 273-281.

64. Chouteau, C. Development of novel conductometric biosensors based on immobilised whole cell Chlorella vulgaris microalgae / C. Chouteau, S. Dzyadevych, J. Chovelon, C. Durrieu // Biosens. Bioelectron. 2004. - V. 19. - P. 1089-1096.

65. Chu, L.Y. A molecular-recognition microcapsule for environmental stimuli-responsive controlled release / L.Y. Chu, T. Yamaguchi, S. Nakao // Adv. Mater. 2002. - V.14. - P. 386-389.

66. Colville, K. Effects of poly(L-lysine) substrates on attached Escherichia coli bacteria / K. Colville, N. Tompkins, A.D. Rutenberg, M.H. Jericho // Langmuir 2010. - V. 26. - P. 2639-2644.

67. Correa-Duarte, M.A. Layer-by-layer assembly of multiwall carbon nanotubes on spherical colloids / M.A. Correa-Duarte, A. Kosiorek, W. Kandulski, M. Giersig and L.M. Liz-Marzan // Chem. Mater. 2005 - V. 17(12). - P. 3268 -3272.

68. Cortez, C. Targeting and uptake of multilayered particles to colorectal cancer cells / C. Cortez, E. Tomaskovic-Crook, A.P.R. Johnston , B. Radt, S.H. Cody, A.M. Scott, E.C. Nice, J.K. Heath, F. Caruso // Adv. Mater. -2006. V.18. -P. 1998-2003.

69. Crespilho, F. N. Electrochemistry of layer-by-layer films: a review / F. N. Crespilho, V. Zucolotto, O. N. Oliveira Jr., F. C. Nart // Int. J. Electrochem. Sc. -2006.-V.1.-P. 1194-1214.

70. Culha, M. Characterization of thermophilic bacteria using surface-enhanced raman scattering / M. Culha, A. Adiguzel, M.M. Yazici, M. Kahraman, F. Sahin, M. Gulluce // Appl. Spectrosc. 2008. - V. 62. - P.1226-1232.

71. Dahne, L. Tailor-made polyelectrolyte microcapsules: from multilayers to smart containers / L. Dahne, C.S. Peyratout // Angew. Chem. Int. Edit. 2004. -V. 43.-P. 3762-3783.

72. Dai, Z.F. Highly stable and biocompatible nafion-based capsules permeability for low molecular weight species / Z.F. Dai, H. Mohwald // Chem.-Eur. J. 2002 - V. 8. - P. 4751-4755.

73. Daligault, F. Microalga Chlorella sorokiniana: a new sulfoxidation biocatalyst / F. Daligault, C. Nugier-Chauvin, H. Patin // Org. Biomol. Chem. -2006.-V. 4.-P. 1474-1477.

74. Damosa, F. S. Dissolved oxygen amperometric sensor based on layer-by-layer assembly using host-guest supramolecular interactions / F. S. Damosa, R. C.S. Luza, A. A. Tanakac, L. T. Kubota // Anal. Chim. Acta. 2010. - V. 664. -P.144-150.

75. Danino, T. A synchronized quorum of genetic clocks / T. Danino, O. Mondragon-Palomino, L. Tsimring, J. Hasty // Nature 2010. - V. 463. - P.326-330.

76. Davidov, Y. Improved bacterial SOS promoter: lux fusions for genotoxicity detection / Y. Davidov, R. Rozen, D.R. Smulski, T.K. Van Dyk, A.C. Vollmetr, D.A. Elsmore, R.A. LaRossa, S. Belkin // Mutat. Res.- Gen. Tox. En. -2000.-V. 466.-P. 97-107.

77. Davidson, M.W. Optical microscopy / M.W. Davidson, M. Abramowitz // Molecular expressions: optical microscopy primer. — 1999. 41p.

78. Davis, S.A. Bacterial templating of ordered macrostructures in silica and silica-surfactant mesophases / S.A. Davis, S.L. Burkett, N.H. Mendelson, S.Mann // Nature 1997. - V. 385. - P. 420-423.

79. Decher, G. Fuzzy nanoassemblies: toward1 layered polymeric multicomposites / G. Decher // Science 1997. - V.277. - P. 1232-1237.

80. Decher, G. New nanocomposite films for biosensors: layer-by-layer adsorbed films ofpolyelectrolytes, proteins or DNA / G. Decher, B. Lehr, K. Lowack, Y. Lvov, J. Schmitt // Biosens. Bioelectron. 1994. - V. 9. - P. 677-684.

81. Decher, G. Multilayer thin films / G. Decher, J. B. Schlenoff// Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. 2002. -P. 535.

82. Decher, G. Fine-tuning of the film thickness of ultrathin multilayer composed of consecutively alternating layers of anionic and cationic polyelectrolyte / G. Decher, J. Schmitt // J. Colloid Polym. Sei. 1992. - V.89. -P. 160-164.

83. DeFraia, C.T. A rapid biosensor-based method for quantification of free and glucose-conjugated salicylic acid / C.T. DeFraia, E.A Schmelz, Z. Mou // Plant Methods 2008. - V. 4. - P. 28-39.

84. Desnitski, A.G. On the origins and early evolution of multicellularity / A.G. Desnitski //Biosystems 1993. - V. 29. - P. 129-132.

85. Diaspro, A. Single living cell encapsulation in nano-organized polyelectrolyte shells / A. Diaspro, D. Silvano, S. Krol, O. Cavalleri, A. Gliozzi // Langmuir 2002. - V. 18. - P.5047-5050.

86. Ding, L. Trends in cell-based electrochemical biosensors / L. Ding, D. Du, X. Zhang, H'. Ju // Curr. Med. Chem. 2008. - V. 15. - P. 3160-3170.

87. Dinsmore, A.D. Colloidosomes: selectively permeable capsules composed of colloidal particles / A.D. Dinsmore, M.F. Hsu, M.G. Nikolaides, M. Marquez, A.R. Bausch, D.A. Weitz // Science 2002. - V. 298. - P. 1006-1009.

88. Donath, E. Novel hollow polymer shells by colloid-templated assembly of polyelectrolytes / E. Donath , G. B. Sukhorukov, F. Caruso, S. A. Davis, H. Möhwald // Angew. Chem. Int. Edit. 1998. - V. 37(16). - P: 2202-2205.

89. Dorobantu, L.S. Stabilization of oil-water emulsions by hydrophobic bacteria / L.S. Dorobantu, A.K.C. Yeung, J.M. Foght, M.R. Gray // Appl. Environ. Microb. 2004. - V. 70. - P. 6333-6336.

90. D'Souza, S.F. Microbial biosensors / S.F. D'Souza // Biosens. Bioelectron. — 2001. V. 16.-P. 337-353.

91. Dubas, S.T. Polyelectrolyte multilayers containing a weak polyacid -construction and deconstruction / S.T. Dubas, Schlenoff // Macromolecules 2001. -V. 34.-P. 3736-3740.

92. Eckle, M. Tuning the performance of layer-by-layer assembled OLEDs by controlling the position of isolating clay barrier sheets / M. Eckle, G. Decher // Nano Lett. 2001. - V. 1. - P.45-49.

93. Efrima, S. Understanding SERS of bacteria / S. Efrima, L. Zeiri // J. Raman Spectrosc. 2009. - V. 40. - P. 277-288.

94. Elasri, M.O. Response of a Pseudomonas aeruginosa biofilm community to DNA-damaging chemical agents / M.O. Elasri, T. Reid, S. Hutchens, R.V. Miller // FEMS Microbiol. Ecol. 2000. - V. 33. - P. 21-25.

95. Elbert, D. Thin polymer layers formed by polyelectrolyte multilayer techniques on biological surfaces / D. Elbert, C. Herbert, J. Hubbell // Langmuir -1999. -V. 15. -P: 5355-5362.

96. El-Sayed, I.H. Surface plasmon resonance scattering and absorption-of anti-EGFR antibody conjugated gold nanoparticles in cancer diagnostics: applications in oral cancer / I.H. El-Sayed, X. Huang, M.A. El-Sayed // Nano Lett. -2005.-V. 5.-P. 829-834.

97. Eun, Y J. Fabrication'of microbial biofilm arrays by geometric control of cell adhesion / Y.J. Eun, D.B. Weibel // Langmuir 2009. - V. 25. - P. 46434654.

98. Fahrner, W. R. Nanotechnology and nanoelectronics: materials, devices, measurement techniques / W.R. Fahrner. Springer-Verlag Berlin Heidelberg. - 2005. - P.254.

99. Fakhrullin, R.F. A direct technique for preparation of magnetically functionalised living yeast cells / R.F. Fakhrullin, J. Garcia-Alonso, V.N. Paunov // Soft Matter 2010. - V.6. - P.391 - 397.

100. Fan, X. Bio-inspired, smart, multiscale interfacial materials / X. Fan, J. Lei // Adv. Mater. 2008. - V. 20. - P. 2842-2858.

101. Firkowska, M. O. Highly ordered MWNT-based matrixes: topography at the nanoscale conceived for tissue engineering / M.O. Firkowska, N. Pazos-Perez, J. Rojas-Chapana, M. Giersig, // Langmuir 2006. - V. 22. - P. 5427-5434.

102. Gabier, A.-C. Intracellular physiological events of yeast Rhodotorula glutinis during storage at +4 / A.-C. Gabier, P. Gourdon , J. Reitz , J.-Y. Leveau, M. Bouix // Int. J. Food Microbiol. 2005. - V. 105. - P. 97-109.

103. Galluzzi, L. Intracellular redox equilibrium and growth phase affect the performance of luciferase-based biosensors / L. Galluzzi, M. Karp // J. Biotechnol. -2007. V. 127.-P. 188-198.

104. Gao, X. H. In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots / X. H. Gao, Y.Y.Cui, R. M. Levenson, L. W. K. Chung & S. M. Nie // Nat. Biotechnol. 2004. - V.22 (8). - P.969-976.

105. García-Alonso, J. A prototype microfluidic chip using fluorescent yeast for detection of toxic compounds / J. García-Alonso, G. Greenway, J. Hardege, S. Haswell // Biosens. Bioelectron. 2009. - V. 24. - P. 1508-1511.

106. García-Alonso, J. Rapid and direct magnetization of GFP-reporter yeast for micro-screening systems / J. García-Alonso, R.F. Fakhrullin, V.N. Paunov // Biosens. Bioelectron. 2010. — V.25. — P.1816-1819.

107. Gautier, C. Label-free detection of DNA hybridization based on EIS investigation of conducting properties of functionalized polythiophene matrix / C. Gautier, C. Cougnon, J.F. Pilard, N. Casse // J. Electroanal. Chem. 2006: - V. 587.-P. 276-283.

108. Giardi, M.T. Photosystem II-based biosensors for the detection of pollutants / M.T. Giardi, M. Koblizek, J. Masojidek // Biosens. Bioelectron. -2001.-V. 16.-P. 1027-1033.

109. Gin, H. Agarose encapsulation of islets of Langerhans: reduced toxicity in vitro / H. Gin, B. Dupuy, C. Baquey, D. Ducassou, J. Aubertin // J. Microencapsul. 1987. - V. 4'. - P. 239-242.

110. Glinel, K. Influence of polyelectrolyte charge density on the formation of multilayers of strong polyelectrolytes at low ionic strength / K. Glinel, A. Moussa, A.M. Jonas, A. Laschewsky // Langmuir 2002. - V.18(4). - P. 14081412.

111. Goodman, T.T. Increased nanoparticle penetration in collagenase-treated multicellular spheroids / T.T. Goodman, P.L. Olive, S.H. Pun // Int. J. Nanomed. 2007. - V. 2. - P. 265-274.

112. Graham, D. Control of enhanced Raman scattering using a DNA-based assembly process of dye-coded nanoparticles nature nanotechnology / D. Graham, D.G. Thompson, W.E. Smith, K. Faulds // Nat. Nanotechnol. 2008. - V. 3. -P. 548-551.

113. Green, V.S. Assay for fluorescein diacetate hydrolytic activity: optimization for soil samples / V.S. Green, D.E. Stott, M. Diack // Soil Biol. Biochem. 2006. - V.38. - P.693-701.

114. Griffith, L.G. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro / L.G. Griffith, M.A. Swartz // Nat. Rev. Mol. Cell Bio. 2006. - V. 7. - P. 211-224.

115. Gu, M.B. Whole-cell-based biosensors for environmental biomonitoring and application / M.B. Gu, R.J. Mitchell, B.C. Kim // Adv. Biochem. Eng. Biot. 2004. - V. 87. - P. 269-305.

116. Gupta, S. On-chip dielectrophoretic coassembly of live cells and particles into responsive biomaterials / S. Gupta, R.G. Alargova, P.K. Kilpatrick, O.D. Velev // Langmuir 2010. - V, 26. - P. 3441-3452.

117. Gupta, S. On-chip electric field driven assembly of biocomposites from live cells and functionalized particles / S. Gupta, R.G. Alargova, P.K. Kilpatrick, O.D. Velev // Soft Matter 2008. - V. 4. - P. 726-730.

118. Haixia, Y. Carbon nanotube capsules self-assembled by W/O emulsion technique / Y. Haixia, S. Huaihe, C. Xiaohong // Langmuir 2007. - V. 23. - P. 3199-3204.

119. Handley, D.A. Colloidal gold: principles, methods, and applications. -N.Y: Academic press 1989. - 13 lp.

120. Havel, M. Transparent thin films of multiwalled carbon nanotubes self-assembled on polyamide nanofibers / M. Havel, K. Behler, G. Korneva, Y. Gogotsi // Adv. Funct. Mater. 2008. - V. 18. - P. 2322-2327.

121. He, P. Layer-by-layer fabrication and characterization of DNA-wrapped single-walled carbon nanotube particles / P. He, M. Bayachou // Langmuir 2005. - V.21. - P.6086-6092.

122. Hillberg, A. L. Biorecognition through layer-by-layer polyelectrolyte assembly: in-situ hybridization on living cells /A. L. Hillberg, M. Tabrizian // Biomacromolecules 2006. - V.7. - P. 2742-2750.

123. Ho, V.H.B. Generation and manipulation of magnetic multicellular spheroids / V.H.B. Ho, K.H. Müller, A. Barcza, R. Chen, N.K.H. Slater // Biomaterials 2010. - V. 31. - P. 3095-3102.

124. Holz, C. Bacterial motility and clustering guided by microcontact printing / C. Holz, D. Opitz, J. Mehlich, B.J. Ravoo, B. Maier // Nano Lett. 2009. -V. 9.-P. 4553-4557.

125. Hoogeveen, N. G. Formation and stability of multilayers of polyelectrolytes / N. G. Hoogeveen, M. A. C. Stuart, G. Fleer, M. R. Böhmer // Langmuir -1996.- V. 12. P. 3675-3 681.

126. Huang, W.E. Characterizing the regulation of the Pu promoter in Acinetobacter baylyi ADP1 / W.E. Huang, A.C. Singer, AJ. Spiers, G.M. Preston, A.S. Whiteley // Environ. Microbiol. 2008. - V. 10. - P. 1668-1680.

127. Hyde, K. Layer-by-layer deposition of polyelectrolyte nanolayers on natural fibres: cotton / K. Hyde, M. Rusa, J. Hinestroza // Nanotechnology 2005. -V. 16.-P. 422-428.

128. Inacker, O. Manipulation in molecular dimensions / O. Inacker, H. Kuhn, D. Mubius, G. Debuch, // J. Phys. Chem. 1976. - V.101. - P.337-360.

129. Ismagilov, R.F. Can we build synthetic, multicellular systems by controlling developmental signaling in space and time? / R.F. Ismagilov, M.M. Maharbiz // Curr. Opin. Chem. Biol. 2007. - V. 11. - P. 604-611.

130. Jain, P.K. Noble metals on the nanoscale: optical and photothermal properties and some applications in imaging, sensing, biology, and medicine / P.K. Jain, H.I.,Huang, M.A. El-Sayed-// Acc. Chem. Res. 2008. - V. 41. - P. 15781586.

131. Jan, E. Successful differentiation of mouse neural stem cells on layer-by-layer assembled single-walled carbon nanotube composite / E. Jan, N. A. Kotov // Nano Lett. 2007. - V. 7. - P. 1123-1128.

132. Jarvis, R. M. Rapid analysis of microbiological systems using SERS / R. M: Jarvis, A. Brooker, R. Goodacre // Anal. Chem. 2004. - V. 76. - P. 51985202.

133. Jarvis, R.M. Rapid discrimination of bacteria using surface enhanced Raman spectroscopy/ R.M. Jarvis, R. Goodacre // Anal. Chem. — 2004: V. 76. -P.40-47.

134. Jarvis, R.M. Surface-enhanced Raman scattering from intracellular and extracellular bacterial locations / R. M. Jarvis, N. Law, I. T. Shadi, P.O'Brien, J. R. Loyd, R.Goodacre // Anal. Chem. 2008. - V.80 (17). - P.6741-6746.

135. Jasonov, P.G. A modernized coercivity spectrometer / P.G. Jasonov, D.K. Nurgaliev, B.V. Burov, F. Heller // Geol. Carpath. 1998. - V. 49. - P. 224225.

136. Jha, S.K. Entrapment of live microbial cells in electropolymerized polyaniline and their use as urea biosensor / S.K Jha, M. Kanungo, A. Nath, S.F. D'Souza // Biosens. Bioelectron. 2009. -V. 24. - P. 2637-2642.

137. Jing, W. Transmission electron microscopy and atomic force microscopy characterization of nickel deposition on bacterial cells / W. Jing., H. ShiYing, X. LiNa, G. Ning // Chinese Sci. Bull. 2007. - V.52. - P.21-27.

138. Joel, I. Theory of enhanced light scattering from molecules adsorbed at the metal-solution interface /1. Joel, L. Ronald, R. John // Phys. Rev. Lett. 1979. -V.43.-P. 147-150.

139. Johnson, A.P.R. Layer-by-layer ingineered capsules and their applications / A.P.R Johnson, C. Cortez, A.S. Angelatos, F. Caruso // Curr. Opin. Colloid Interface 2006. - V.l 1(4). - P. 203-209.

140. Kahraman, M. Convective assembly of bacteria for surface-enhanced Raman scattering / M. Kahraman, M. M. Yazici, F. Siiahin, M. Culha // Langmuir -2008. V. 24.-P. 894-901.

141. Kahraman, M. Reproducible surface-enhanced Raman scattering spectra of bacteria on aggregated silver nanoparticles / M. Kahraman, M.M. Yazici, F. Siiahin, M. Culha, O.F. Bayrak, // Appl. Spectrosc. 2007. - V. 61. - P. 479-485.

142. Karoubi, G. Single-cell hydrogel encapsulation for enhanced survival of human marrow stromal cells / G. Karoubi, M.L. Ormiston, D.J. Stewart, D.W. Courtman // Biomaterials 2009. - V. 30. - P. 5445-5455.

143. Kayushina, R. Construction and X-ray reflectivity study of self-assembled lysozyme polyions multilayers / R. Kayushina, Y. Lvov, N. Stepina, Y.Khurgin // Thin Solid Films 1996. - V. 284. - P. 246-248.

144. Keane, A. Exposing culprit organic pollutants: A review / A. Keane, P. Phoenix, S. Ghoshal, P.C.K. Lau // J. Microbiol. Meth. 2002. - V. 49. - P. 103119.

145. Kelm, J.M. Microscale tissue engineering using gravity-enforced cell assembly / J.M. Kelm, M. Fussenegger // Trends Biotechnol. 2004. - V. 22. - P. 195-202.

146. Kim B.-S., Hydrogen-bonding layer-by-layer assembled biodegradable polymeric micelles as drug delivery vehicles from surfaces / B.-S. Kim, S. W. Park, P. T. Hammond // ACS Nano. 2008. - V.2. - P.386-392.

147. Kim, M.N. Construction and comparison of Escherichia coli whole-cell biosensors capable of detecting aromatic compounds / M.N. Kim, H.H. Park, W.K. Lim, H.J. Shin // J. Microbiol. Meth. 2005. - V. 60. - P. 235- 245.

148. King, N. The unicellular ancestry of animal development / N. King // Dev. Cell. 2004. - V. 7. - P. 313-325.

149. Kirk, D.L. A twelve-step program for evolving multicellularity and a division of labor / D.L. Kirk // Bioessays. 2005. - V. 27. - P. 299-310.

150. Klabunde, K. J. Nanoscale materials in chemistry / K. J. Klabunde. -John Wiley & Sons, Inc. 2001.

151. Knaebel, D.B. Immobilization of bacteria in macro- and microparticles / D.B. Knaebel, K.E. Stormo, R.L. Crawford // Bioremediation Protocols 1996. -P. 67-78.

152. Knauer, M. Surface-enhanced Raman scattering-based label-free microarray readout for the detection of microorganisms / M. Knauer, N. P. Ivleva, X. Liu, R. Niessner, C. Haisch // Anal. Chem. 2010. - V.82 (7). - P. 2766-2772.

153. Kneipp, J. Optical probing and imaging of live cells using SERS labels / J.Kneipp, H. Kneipp, A. Rajadurai, R.W. Redmond, K. Kneipp // J. Raman Spectrosc. 2009. - V. 40. - P. 1-5.

154. Knight, A.W. A yeast-based cytotoxicity and genotoxicity assay for environmental monitoring using novel portable instrumentation / A.W. Knight, P.O. Keenan, N.J. Goddard, P.R. Fielden, R.M. Walmsley // J. Environ. Monitor. -2004.-V. 6.-P. 71-79.

155. Ko, H. Carbon nanotube arrays encapsulated into freely suspended flexible films / H. Ko, C. Jiang, H. Shulha, V.V. Tsukruk // Chem. Mater. 2005. -V. 17.-P. 2490-2493.

156. Kong; W. Immobilized bilayer glucose isomerase in porous trimethylamine polystyrene based on molecular deposition / W. Kong, L. Wang, M. Gao, H. Zhou, X. Zhang, W. Li, J. Shen // J. Chem. Soc., Chem. Comm. -1994.-V. 11.-P. 1297-1298.

157. Kotov, N.A Ordered layered assemblies of nanoparticles / N.A. Kotov // MRS Bull. 2001. - V. 26 (12). - P.992-997.

158. Kroger, S. Biosensors for marine applications We all need the sea, but does the sea need biosensors / S. Kroger, R.J. Law // Biosens. Bioelectron. 2005. -V. 20.-P. 1903-1913.

159. Krol, S. Encapsulated yeast cells inside Paramecium primaurelia\ a model system for protection capability of polyelectrolyte shells / S. Krol, O. Cavalleri, P. Ramoino, A. Gliozzi, A. Diaspro // J. Microscopy. 2003. - V. 212. -P. 239-243.

160. Krol, S. Encapsulated living cells on microstructured surfaces / S. Krol, M. Nolte, A. Diaspro, D. Mazza, R. Magrassi, A. Gliozzi, A. Fery // Langmuir -2005. V. 21. - P.705-709.

161. Kuang, Y. Living bacterial cell array for genotoxin monitoring / Y. Kuang, I. Biran, D.R. Walt // Anal. Chem. 2004. - V. 76. - P. 6282-6286.

162. Kuhn, H. Systeme aus monomolekularen schichten- Zusammenbau und chemisches verhalten / H. Kuhn, D. Mubius // Angew. Chem. Int. Edit. 1971. -V.83. — P.672-690.

163. Kuo, W.S. Biocompatible bacteria@Au composites for application in the photothermal destruction of cancer cells /W.S. Kuo, C.M. Wu, Z.S. Yang, S.Y. Chen, C.Y. Chen, C.C. Huang, W.M. Li, C.K. Sun, C.S. Yeh // Chem. Commun. -2008. V. 37. - P. 4430-4432.

164. Kurth, D.G. Ultrathin composite films incorporating the nanoporous isopolyoxomolybdate keplerate (NH4)(42)(Moi320372(Ch3Coo) (30)(H20)(72)) / D.G. Kurth, D. Volkmer, M. Ruttorf, B. Richter, A. Muller// Chem. Mater. 2000. -V. 12.-P. 2829-2834.

165. Lange, S.A. Microcontact printing of DNA molecules / S.A. Lange, V. Benes, D.P. Kern, J.K. Heinrich Hörber, A. Bernard // Anal. Chem. 2004. - V. 76.-P. 1641-1647.

166. Laucks, M.L. Comparison of psychro-active arctic marine bacteria and common mesophillic bacteria using surface-enhanced Raman spectroscopy / M.L. Laucks, A. Sengupta, K. Junge, E.J. Davis, B.D. Swanson // Appl. Spectrosc. -2005. -V. 59. P. 1222-1228.

167. Layton, A.C. Construction of a bioluminescent reporter strain to detect polychlorinated biphenyls / A.C. Layton, M. Muccini, M.M. Ghosh, G.S. Sayler // Appl. Environ. Microb. 1998. - V. 64. - P. 5023-5026.

168. Lebedeva, O.V. Mechanical properties of polyelectrolyte-filled multilayer microcapsules studied by atomic force and confocal microscopy / O.V. Lebedeva, B.S. Kim, O.I. Vinogradova // Langmuir 2004. - V. 20(24). -P.10685-10690.

169. Lee C.-W. Study of gold nanoparticles and live cells interactions by using planar evanescent wave excitation / C.-W. Lee, E.-H. Lin, J.-Y. Cheng // J. Biomed. Opt. 2009. - V. 14. - P. 1-6.

170. Lee, J.H. A cell array biosensor for environmental toxicity analysis / J.H. Lee, R.J. Mitchell, B.C. Kim, D.C. Cullen, M.B. Gu // Biosens. Bioelectron. -2005.-V. 21.-P. 500-507.

171. Lee, J.H. Chemical-specific continuous biomonitoring using a recombinant bioluminescent bacterium DNT5 (nagR-nagAa: :luxCDABE) / J.H. Lee, R.J. Mitchell, M.B. Gu // J. Biotechnol. 2007. - V. 131. - P. 330-334.

172. Lee, K.T. Synthesis of tin-encapsulated spherical hollow carbon for anode material in lithium secondary batteries / K.T. Lee, Y.S. Jung, S.M. Oh // J. Am. Chem. Soc. 2003. - V. 125. - P. 5652-5653.

173. Lee, M.-J. Electrical manipulation of nanofilaments in transition-metal oxides for resistance-based memory/ M.-J. Lee, S. Han, S. H. Jeon // Nano Lett. -2009. -V.9 (4). -P.1476-1481.

174. Lee, P.C Adsorption and surface-enhanced Raman of silver and gold sols / P.C Lee, D. Meisel // J. Phys. Chem. 1982. - V.86. - P.3391-3395.

175. Lee, S.T. Biodégradation of pyridine by freely suspended and immobilized Pimelobacter sp / S.T. Lee, S.K. Rhee, G.M. Lee // Appl. Microbiol. Biot. 1994. -V. 41. - P. 652-657.

176. Leenen, E.J.T.M. Characteristics of and selection criteria for support materials for cell immobilization in wastewater treatment / E.J.T.M. Leenen, V.A.P. Dos Santos, K.C.F. Grolle, J. Tramper, R.H.Wijffels // Water Res. 1996. -V.30.-P. 2985-2996.

177. Leor, J. Cells, scaffolds, and molecules for myocardial tissue engineering / J. Leor ,Y. Amsalem, S. Cohen // Pharmacotherapy 2005. -V. 105. -P. 151-163.

178. Lewinski, N. Cytotoxicity of nanoparticles / N. Lewinski, V. Colvin, R. Drezek // Small 2008. - V.4. - P. 26- 49.

179. Li, C. Controlling the growth behaviour of multilayered films via layer-by-layer assembly with multiple interactions / C. Li, J. Zhang, S. Yang, B.-L. Li, Y.-Y. Li, X.-Z. Zhang R.-X. Zhuo // ChemPhysChem 2009. - V. 11. - P. 88358840.

180. Li, J. An electrochemical immunosensor for carcinoembryonic antigen enhanced by self-assembled nanogold coatings on magnetic particles / J. Li, H. Gao, Z. Chen, X. Wei, C. F. Yang // Anal. Chim. Acta. 2010. - V. 665. - P. 98104.

181. Li, Z. Living templates for the hierarchical assembly of gold nanoparticles / Z. Li, S.W. Chung, J.M. Nam, D.S. Ginger, C.A. Mirkin // Angew. Chem. Int. Edit. 2003: - V. 42. - P. 2306-2309.

182. Li, Z.Q. One-step solution-based catalytic route to fabricate novel a-Mn02 hierarchical structures on a large scale / Z.Q. Li, Y. Ding, Y.J. Xiong, Q. Yang, Y. Xie // Chem. Commun. 2005. - V. 7. - P. 918-920.

183. Li, J. Amplifying the electrical hybridization signals of DNA array by multilayer assembly of Au nanoparticle probes / J. Li, M. Xue, H. Wang, L. Cheng, L. Gao, Z. Lu, M. Chan // Analyst 2003. - V. 128. - P. 917-923.

184. Lian B. Carbonate biomineralization induced by soil bacterium Bacillus megaterium / B. Lian, Q. Hu, J. Chen, J. Ji, H.H. Tengon // Geochim. Cosmochim. Ac. 2006. - V. 70. - P. 5522-5535.

185. Lin, R.Z. Recent advances in three-dimensional multicellular spheroid culture for biomedical research / R.Z. Lin, H.Y. Chang // Biotechnol. J. 2008. -Y.3.-P. 1172-1184.

186. Little, A.E.F. Rules of engagement: interspecies interactions that regulate microbial communities / A. E. F. Little, C. J. Robinson, S. B. Peterson, K. F. Raffa, J. Handelsman // Annu Rev. Microbiol. 2008. - V. 62. - P. 375-401.

187. Liu, C. Direct toxicity assessment of toxic chemicals with electrochemical method / C. Liu, T. Sun, X. Xu, S. Dong, //Anal. Chim. Acta. -2009.-V. 641.-P. 59-63.

188. Liu, Z. Carbon nanotubes in biology and medicine: in vitro and in vivo detection, imaging and drug delivery / Z. Liu, S. Tabakman, K. Welsher, H. Dai // Nano Res. 2009. - V. 2. - P. 85-120.

189. Liu, Z.-Y. Synthesis of gold nanoparticles on the cell wall of Bacillus megatherium / Z.-Y. Liu, J.-M. Wu, B.-Q. Fu, R. Xue, J.-Z. Zhou, Q.-X. Zheng, Y.-Y. Liu, J.-K. Fu // Acta Chim. Sin. 2004. - V. 62. - 1829-1834.

190. Liu, K. Self-assembly of inorganic nanorods/ K. Liu, N. Zhao, E. Kumacheva // Chem. Soc. Rev. 2011. - V. 40. - P. 656-671.

191. Lohe, M. R. Heating and separation using nanomagnet-functionalized metal-organic frameworks / M. R. Lohe, K. Gedrich, T. Freudenberg, E. Kockrick, T. Dellmann, S. KaskeM Chem. Commun. -2011. -DOI: 10.1039/c0cc05278g.

192. Lowe, C.R. Handbook of biosensors and biochips / C.R. Lowe, R. S. Marks, D. C. Cullen, I. Karube, H.H. Weetall Wiley, Chichester, - 2007. - V. 1. -P. 7-22.

193. Lu, Z., Effects of the concentration of tetramethylammonium hydroxide peptizer on the synthesis of Fe3CVSiC)2 core/shell nanoparticles / Z. Lu, G. Wang, J. Zhuang, W. Yang // Colloid Surface A. 2006. - V. 278. P.140-143.

194. Luckarift, H.R. Enzyme immobilization in a biomimetic silica support / H.R. Luckarift, J.C. Spain, R.R. Naik, M.O. Stone // Nat. Biotechnol. 2004. - V. 22.-P. 211-213.

195. Luo, D. Cell encapsules with tunable transport and mechanical properties / D. Luo, S. R. Pullela, M. Marquez, Z. Cheng // Biomicrofluidics — 2007. V.l. - P. 034102 - 034106.

196. Luo, L. Fabrication of layer-by-layer deposited multilayer films containing DNA and its interaction with methyl green / L. Luo, J. Liu, Z. Wang, X. Yang, S. Dong, E. Wang, // Biophys. Chem. 2001. - V.94. - P. 11-22.

197. Lvov, Y. Assembly of multicomponent protein films by means of electrostatic layer-by-layer adsorption / Y. Lvov, K. Ariga, I. Ichinose, T. Kunitake // J. Am. Chem. Soc. 1995. - V. 117. - P. 6117-6123.

198. Lvov, Y. Layer-by-layer assembly of alternate protein-polyion ultrathin films / Y. Lvov K. Ariga, T. Kunitake // Chem. Lett. 1994. - P: 2323-2326.

199. Lvov, Y. Assembly, structural characterization and thermal behavior of layer-by-layer deposited ultrathin films of polyvinylsulfonate and polyallylamine / Y. Lvov, G. Decher, H. Mohwald // Langmuir. 1993. - V. 9. - V. 481-486.

200. Lvov, Y. Assembly of thin films by means of successive deposition of alternate layers of DNA and poly(allylamine) / Y. Lvov, G. Decher, G. Sukhorukov // Macromolecules 1993. - V. 26. - P. 5396-5399.

201. Lvov, Y. Protein architecture: assembly of ordered films by means of alternated adsorption of oppositely charged macromolecules / Y. Lvov, G.B. Sukhorukov//Membr. Cell Biol.-1997.-V. 11.-P. 277-303.

202. Ma, H. A novel electrochemical DNA biosensor fabricated with layer-by-layer covalent attachment of multiwalled carbon, nanotubes and gold nanoparticles / H. Ma, L. Zhang, Y. Pan, K. Zhang, Y. Zhang // Electroanalysis2008. V.20. — P.1220-1226.

203. Maheshwari, V. Ion mediated monolayer deposition of gold nanoparticles on microorganisms: discrimination by age / V. Maheshwari, E. Fomenko, G. Singh, R. F. Saraf// Langmuir 2010. - V. 26. - V. 371-377.

204. Manna, U. Layer-by-layer self assembly of modified hyaloronic acid/chitosan based on hydrogen bonding / U. Manna, S. Bharani, S. Patil // Biomacromolecules 2009. - V.10. - P. 2632-2639.

205. Mantzila, A.G. Development of a faradic impedimetric immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium in milk / A.G. Mantzila, V. Maipa, M.I. Prodromidis // Anal. Chem. 2008. - V. 80. - P. 1169-1175.

206. Maraha, N. Monitoring physiological status of GFP-tagged Pseudomonas fluorescens SBW25 under different nutrient conditions and in soil by flow cytometry / N. Maraha, A. Backman, J.K. Jansson // FEMS Microbiol. Ecol. -2004.-V. 51.-V. 123-132.

207. Marinova, K.G. Charging of oil-water interfaces due to spontaneous adsorption of hydroxyl ions / K.G. Marinova, R.G. Alargova, N.D. Denkov, O.D. Velev, D.N. Petsev, I.B. Ivanov, R.P. Borwankar // Langmuir 1996. - V. 12. - P. 2045-2051.

208. Mathews, C.K. Biochemistry / C.K. Mathews, K.E. van Holde, K.G. Ahern San Francisco: Addison-Wesley. - 1999. -305 p.

209. Mbeunkui, F. Bioavailable nitrate detection in water by an immobilized luminescent cyanobacterial reporter strain / F. Mbeunkui, C. Richaud, A.L. Etienne, R.D. Schmid, T.T. Bachmann // Appl. Microbiol. Biot. 2002. - V. 60. -P. 306-312.

210. Mercier-Bonin, M. Study of bioadhesion on a flat plate with a yeast/glass model system / M. Mercier-Bonin, K. Ouazzani, P. Schmitz,S. Lorthois // J. Colloid. Interface Sci. 2004. - V. 271, - P. 342-350.

211. Michod, R. E. Life-history evolution and the origin of multicellularity / R.E. Michod, Y. Viossat, C.A. Solari, M. Hurand, A.M. Nedelcu // J. Theor. Biol. 2006. - V. 239. - P. 257-272.

212. Mironov, V Organ printing: tissue spheroids as building blocks / V. Mironov, R.P. Visconti, V. Kasyanov, G. Forgacs, C.J. Drake, R.R. Markwald // Biomaterials 2009 - V. 30, № 12. - P. 2164-2174.

213. Miura, N. Cytotoxic effect and apoptosis induction by silver nanoparticles in HeLa cells / N. Miura, Y. Shinohara // Biochem. Bioph. Res. Co. -2009. V. 390. - P. 733-737.

214. Morita, R.Y. Calcite precipitation by marine bacteria / R.Y. Morita // Geomicrobiol. J. 1980. - V. 2. - P. 63-82.

215. Morris, K. Ferricyanide mediated biochemical oxygen demand -development of a rapid biochemical oxygen demand assay / K. Morris, K. Catterall, H. Zhao, N. Pasco, R. John // Anal. Chim. Acta 2001. - V. 442. - P. 129-139.

216. Moslemy, P. Production of size-controlled gellan gum microbeads encapsulating gasoline-degrading bacteria / P. Moslemy, S.R. Guiot, RJ. Neufeld // Enzyme Microb.Tech. 2002. - V. 30. - P. 10-18.

217. Moya, S. Polyelectrolyte multilayer capsules templated on biological cells: core oxidation influences layer chemistry / S. Moya, L. Dahne, A. Voigt, S. Leporatti, E. Donath, H. Mohwald // Colloid Surface A 2001. - V. 183-185. - P. 27-40.

218. Mohwald, H. From Langmuir monolayers to nanocapsules / H. Mohwald // Colloid Surface A 2000. - V. 171 (1-3). - P. 25-31.

219. Mueller, R. Melting of PDADMAC/PSS capsules investigated with AFM force spectroscopy / R. Mueller, K. Kohler, R. Weinkamer, G. Sukhorukov, A. Fery //Macromolecules — 2005. — V. 38(23).-P. 9766-9771.

220. Mugweru, A. Voltammetric sensor for oxidized DNA using ultrathin films of osmium and ruthenium metallopolymers / A. Mugweru, B.Wang, J. Rusling // Anal. Chem. 2004. - V.76. - P.5557-5563.

221. Munoz, L. Paradoxial changes in the expression of estrogen receptor alpha in breast cancer multicellular spheroids / L. Munoz, M. Espinosa, V. Quintanar-Jurado, A. Hidalgo, J. Melendez-Zajgla, V, Maldonado 11 Tissue Cell -2010.-V. 42.-P. 334-337.

222. Murray, C. B. Synthesis and characterization of monodisperse nanocrystals and close-packed nanociystal assembles / C. B. Murray, C. R. Kagan, M. G. Bawendi // Ann. Rev. Mat. Sci. 2000. - V. 30 (1). - P.545-610.

223. Naessens, M. Fiber optic biosensor using Chlorella vulgaris for determination of toxic compounds / M. Naessens, J.C. Leclerc, C. Tran-Minh // Ecotox. Environ. Safe. 2000. - V. 46. - P. 181-185.

224. Naessens, M. Whole-cell biosensor for direct determination of solvent vapours / M. Naessens, C. Tran-Minh // Biosens. Bioelectron. 1998. - V. 39. - P. 341-346.

225. Nassif, N. Living bacteria in silica gels / N. Nassif, O. Bouvet, M.N. Rager, C. Roux, T. Coradin, J. Livage // Nat. Mater. 2002. - V. 1. - P. 42-44.

226. Naumann, D. The characterization of microorganisms by Fourier transorm infrared spectroscopy (FT-IR) / D Naumann, D. Helm, H. Labischinski, P.Giesbrecht // Modern Techniques for Rapid Microbiological Analysis. — 1991. — P.133-141.

227. Nguyen-Ngoc, H. Fluorescent biosensor using whole cells in an inorganic translucent matrix / H. Nguyen-Ngoc, C. Tran-Minh // Anal. Chim. Acta. -2007. — V. 583.-P. 161- 165.

228. Nguyen-Ngoc, H. Sol-gel process for vegetal cell encapsulation / H. Nguyen-Ngoc, C. Tran-Minh // Mater. Sci Eng.C. 2007. - V. 27. - P. 607-611.

229. Nie, Z. Patterning surfaces with functional polymers / Z. Nie, E. Kumacheva // Nat. Mater. 2008. - V. 7. - P. 277-290.

230. Nir, R. Single-cell entrapment and microcolony development within uniform microspheres amenable to flow cytometry / R. Nir, R. Lamed, L. Gueta, E. Sahar// Appl. Environ. Microb. 1990. -V. 56. - P. 2870-2875.

231. Nolte, M. Coupling of individual polyelectrolyte capsules onto patterned substrates / M. Nolte, A. Feiy // Langmuir 2004. - V. 20(8). - P. 29952998.

232. Nomura, T. Fabrication of silica hollow particles using Escherichia coli as a template / T. Nomura, Y. Morimoto, H. Tokumoto, Y. Konishi // Mater. Lett. 2008. - V.62. - P. 3727-3729.

233. Novitsky, J.A. Calcium carbonate precipitation by marine bacteria / J.A. Novitsky // Geomicrobiol. J. 1981. - V. 21 - P. 375-388.

234. O'Connor, K. M. The alchemical creation of life (takwin) and other concepts of Genesis in medieval Islam / K.M. O'Connor // PhD Thesis submitted at University of Pennsylvania, 1994.

235. Oh, B.K. Surface plasmon resonance immunosensor for the detection of Salmonella typhimurium / B.K. Oh, Y.K. Kim, K.W. Park, W.H. Lee, J.W. Choi // Biosens. Bioelectron. -2004. V.19. -P. 1497-1504.

236. Onda, M. Sequential reactions by glucose oxidase/peroxidase molecular films assembled by layer-by-layer alternate adsorption / M. Onda, Y. Lvov, K. Ariga, T. Kunitake // Biotechnol.Bioeng. 1996. - V.51. - P. 163-166.

237. Onda, M. Sequential reaction and product separation on molecular films of glucoamylase and glucose oxidase assembled on an ultrafilter / M. Onda, Y. Lvov, K. Ariga, T. Kunitake // J. Ferment. Bioengin. 1997. - V.82. - P.502-506.

238. Otto, A. Investigations of electrode surfaces in acetonitrile solutions using surface-enhanced Raman spectroscopy / A.Otto Light Scattering in Solids. -V. 4.-P. 289.

239. Palath, N. Polypeptide multilayer nanofilm artificial red blood cells / N. Palath, S. Bhad, R. Montazeri, C. A. Guidry, D. T. Haynie // J. Biomed. Matter. Res.: Appl. Biomat. -2006. V. 81. - P. 261-268.

240. Paloniemi, H. Layer-by-layer electrostatic self-assembly of single-wall carbon nanotube poly electrolytes / H. Paloniemi, M. Lukkarinen, T. Aaritalo, S. Areva, J. Leiro, M. Heinonen, K. Haapakka, J.Lukkari // Langmuir 2006. - V. 22:-P. 74-83.

241. Pampaloni, F. The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue / F. Pampaloni, E.G. Reynaud, E.H. Stelzer // Nat. Rev. Mol. Cell Bio. -2007. -V. 8. P. 839-845.

242. Pandard, P. Comparison of twotypes of sensors using eukaryotic algae to monitor pollution of aquatic systems / P. Pandard, P. Vasseur, D.M. Rawson // Water Res. 1993. - V. 27. - P. 427-431.

243. Panhuis, M. Assembling carbon nanotubosomes using an* emulsioninversion technique / M. Panhuis, V.N. Paunov // Chem. Commun. 2005. - V. 13.-P. 1726-1728.

244. Park, J.-H. Biodegradable luminescent porous silicon nanoparticles for in vivo applications / J.-H. Park, L. Gu, G. Maltzahn, E. Ruoslahti, S. N. Bhatia, M. J. Sailor // Nat. Mater. 2009. - V. 8. - 331-336.

245. Park, M.K. Sustained release control via photo-cross-linking of polyelectrolyte layer-by-layer hollow capsules / M.K. Park, S. Deng, R.C. Advincula // Langmuir 2005. - V. 21(12). - P. 5272-5277.

246. Paquet, C. Nanostructured polymers for photonics / C. Paquet, E. Kumacheva // Materials Today 2008. - V. 11. - P. 48-56.

247. Pasztaleniec, A. Pediastrum species (Hydrodictyaceae, Sphaeropleales) in phytoplankton of Sumin Lake (L^czna-Wlodawa Lakeland) / A. Pasztaleniec, M. Poniewozik // Act. Soc. Bot. Pol. 2004. - V. 73. - P. 39-46.

248. Paunov, V. N. Fabrication of carbon nanotube-based microcapsules by colloid templating technique / V. N. Paunov, M. Panhuis // Nanotechnology -2005.-V. 16. -P.1522-1525.

249. Pei, R. Assembly of alternating polycation and DNA multilayer films by electrostatic layer-by-layer adsorption / R. Pei, X. Cui, X. Yang, E. Wang // Biomacromolecules 2001. - V.2. - P.463-468.

250. Peinado, R. Yeast biocapsules: a new immobilization method and their applications / R. Peinado, J. Moreno, J. Villalba, J. Gonzalez-Reyes, J. Ortega, J. Mauricio // Enzyme Microb. Tech. 2006. - V. 40. - P. 79-84.

251. Pellinen, T. Detection of traces of tetracyclines from fish with a bioluminescentsensor strain incorporating bacterial luciferase reporter genes / T. Pellinen, G. Bylund, M. Virta, A. Niemi, M. Karp // J. Agr. Food Chem. 2002. -V. 50.-P. 4812-4815.

252. Pissuwan, D. Functionalised gold nanoparticles for controlling pathogenic bacteria / D. Pissuwan, C.H. Cortie, S.M. Valenzuela, M.B. Cortie // Trends Biotechnol. 2010. - V. 28. - P. 207-213.

253. Plomp, M. Mapping of proteomic composition on- the- surfaces of Bacillus spores by atomic force microscopy-based immunolabeling / M. Plomp, A.J. Malkin // Langmuir 2009. - V. 25. - P. 403-409.

254. Podola, B. Selective real-time herbicide monitoring by an array chip biosensor employing diverse microalgae / B. Podola, M. Melkonian // J. Appl. Phyc.-2005. —V. 17. -P.261-271.

255. Podola, B. The use of multiple-strain algal sensor chips for the detection and identification of volatile organic compounds / B. Podola, E.C.M. Nowack, M. Melkonian // Biosens. Bioelectron. 2003. - V. 19. - P. 1253-1260.

256. Premasiri, W. R. Characterization of the surface enhanced raman scattering (SERS) of bacteria / W. R. Premasiri, D.T. Moir, M.S. Klempner, N. Krieger, G. Jones, L.D. Ziegler // J. Phys. Chem. 2005. - V. 109. - P.312-320.

257. Premkumar, J.R. Antibody-based immobilization of bioluminescent bacterial sensor cells / J.R. Premkumar, O. Lev, R.S. Marks, B. Polyak, R. Rosen, S. Belkin // Talanta P. 2001. -V. 55. - P. 1029-1038.

258. Puppels, G. J. Studying single living cells and chromosomes by confocal Raman microspectroscopy / G. J. Puppels, F. F. De Mul, C. Otto, J. Greve, M. Robert-Nicoud, D. J Arndt-Jovin // Nature 1990. - V. 347. - P. 301303.

259. Quist, A.P. Recent advances in microcontact printing / A.P. Quist, E. Pavlovic, S. Oscarsson // Anal. Bioanal. Chem. 2005. - V. 381. - P. 591-600.

260. Rao, C.N. Synthesis of inorganic nanomaterials / C.N. Rao, S.R.C. Vivekchand, K. Biswas, A. Govindaraj // Dalton. T. 2007. - P. 3728-3749.

261. Rautaray, D. Biosynthesis of CaC03 crystals of complex morphology using a fungus and an Actinomycete / D. Rautaray, A. Ahmad, M. Sastry // J. Am. Chem. Soc.-2003.-Y. 125.-P. 14656-14657.

262. Rautaray, D. Biological synthesis of strontium carbonate crystals using the fungus Fusarium oxysporum / D. Rautaray, A. Sanyal, S.D. Adyanthaya, A. Ahmad, M. Sastry // Langmuir 2004. - V. 20. - P. 6827-6833.

263. Regot, S. Distributed biological computation with multicellular engineered networks / S. Regot, J. Macia, N. Conde, K. Furukawa, J. Kjellen, T. Peeters, S. Hohmann, E. de Nadal, F. Posas, R. Sole // Nature 2011 - V. 469. - P. 207-211.

264. Rhee, S.W. Patterned cell culture inside microfuidic channels / S.W. Rhee, A.M. Taylor, C.H. Tu, D.H. Cribbs, C.W.Cotman, N.L. Jeon // Lab. Chip -2004.-V. 5.-P. 102-107.

265. Ricardo, R. Counting and determining the viability of cultered cells / R. Ricardo, K. Phelan // J. Vis. Exp. 2008. - P. 752-758.

266. Ro, D.K. Production of the antimalarial drug precursor artemisinic acid in engineered yeast / D. K. Ro, E. M. Paradise, M. Ouellet, K. J. Fisher, K. L Newman, J. M. Ndungu // Nature 2006. - V. 440 - P. 940-943.

267. Roda, A. Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence / A. Roda, P. Pasini, M. Mirasoli, E. Michelini, M. Guardigli // Trends Biotechnol. 2004. -V. 22. - P. 295-303.

268. Rodriguez, M. Biosensors for rapid monitoring of primaiy-source drinking water using naturally occurring photosynthesis / M. Rodriguez, C.A. Sanders* E. Greenbaum // Biosens. Bioelectron. 2002. - V. 17. - P. 843-849.

269. Rosen, R. Microbial sensors of ultraviolet radiation based on recAj.:lux fusions / R. Rozen, Y. Davidov, R.A. LaRossa, S. Belkin // Appl. Biochem. Biotech.-2000. V. 89.- P. 151- 160.

270. Rouse, J. H. Sol-gel processing of ordered multilayers to produce composite, films of controlled thickness / Rouse, J. H., Macneill, B. A., Ferguson, G. S. // Chem. Mater. 20001 - V. 12. - P. 2502-2507.

271. Rowan, B; Patterning bacteria within hyperbranched polymer film templates / B. Rowan, M.A. Wheeler, R.M. Crooks // Langmuir 2002. -V. 18. -P. 9914-9917.

272. Sano, M. Formation of ultrathin polymer layers on solid substrates by means of polymerizationinduced epitaxy and alternate adsorption / M. Sano, Y. Lvov, T. Kunitake // Annu. Rev. Mar. Sci. 1996. - V. 26. - P. 153-187.

273. Safarik, I. Magnetically modified microbial cells: A new type of magnetic adsorbents / I. Safarik, M. Safarikova // China Part. 2007. - V. 5: - P. 19-25.

274. Safarikova, M. Dye adsorbtion on magnetically modified Chlorella vulgaris cells / M.Safarikova, B.M.R. Ропа, E. Mosiniewicz-Szablewska, F. Weyda, I. Safarik // Fresen. Environ. Bull. -2008. V. 17 (4). - P.486-492.

275. Santhanam, V. Microcontact printing of uniform nanoparticle arrays / V. Santhanam, R.P. Andres // Nano Lett. 2004. - V. 4. - P. 41-44.

276. Schmid, G. Metal clusters and colloids / G. Schmid, L.F. Chi //Adv. Mater. 1998. - V.10. - P.515-526.

277. Selhuber-Unkel, C. Tracking cell-nanoparticle interactions / C. Selhuber-Unkel // J. Biomed. Nanotechnol. 2009. - V. 5. - P. 634-640.

278. Sengupta, A. Detection of bacteria by surface-enhanced Raman spectroscopy / A. Sengupta, M. Mujacic, E. Davis // Anal. BioanaL Chem 2006. -V. 386.-1379-1388.

279. Serizawa, T. A novel-approach for fabricating ultrathin polymer-films by the repetition of the adsorption drying processes / T. Serizawa, M. Akashi // J. Polym. Sci. 1998.-V. 37.-P. 1903-1906.

280. Serizawa, T. Alternating bioactivity of polymeric layer-by-layer assemblies: anticoagulation vs procoagulation of human blood / T. Serizawa, M. Yamaguchi, M. Akashi // Biomacromolecules 2002. - V. 3. - P. 724-731.

281. Shaw, D.R. Comparison of chlorofil II fluorescence and fresh weight as herbicide bioassay techniques / D.R. Shaw, T.F. Peeper, D.L. Nofzinger // Weed Sci. 1985. -V. 33. - P. 29-33.

282. Shimazaki, Y. Molecular-weight dependence of alternate adsorption through charge-transfer interaction / Y. Shimazaki, R. Nakamura, S. Ito, M. Yamamoto // Langmuir 2001. - V. 17. - P. 953-956.

283. Shitanda, I. Amperometric biosensing systems based on motility and gravitaxis of flagellate algae for aquatic risk assessment / I. Shitanda, K. Takada, Y. Sakai, T. Tatsuma // Anal. Chem. 2005. - V. 77. - P. 6715-6718.

284. Shitanda, I. Amperometric screen-printed algal biosensor with flow injection analysis system for- detection of environmental toxic compounds / I. Shitanda, S. Takamatsu, K. Watanabe, M. Itagaki // Electrochim. Acta. 2009. -V. 54.-P. 4933-4936.

285. Silva-Rocha, R. Mining logic gates in prokaryotic transcriptional regulation networks / R. Silva-Rocha, V. de Lorenzo // FEBS Lett. 2008. - V. 582-P. 1237-1244.

286. Small W. R. Fabrication of novel sensors from nanomaterials I W.R. Small I I PhD Thesis submitted at University of Hull, 2008.

287. Song, J. M. A compact CMOS biochip immunosensor towards the detection of a single bacteria / J. M. Song, M. Culha, P. M. Kasili, G. D. Griffin, T. Vo-Dinh // Biosens. Bioelectron. 2005. - V. 20 - P. 2203-2209.

288. S0rensen, S.J. Making bio-sense of toxicity: new developments in whole-cell biosensors / S.J. Sorensen, M. Burm0lle, L.H. Hansen // Curr. Opin. Biotech. 2006. - V. 17. - P. 11-16.

289. Stoodley, P. Biofilms as complex differentiated communities / P. Stoodley, K. Sauer, D. G. Davies, J. W. Costerton // Annu. Rev. Microbiol. 2002. -V. 56.-P. 187-209.

290. Stormo, K. E. Preparation of encapsulated microbial cells for environmental applications / K. E. Stormo, R. L. Crawford // Appl. Environ. Microb. 1992. -V. 58. - P. 727-730.

291. Stroeve, P. Transfer in supported films made by molecular self-assembly of ionic polymers / P. Stroeve, V. Vasques, M.A. Coelho, N. Rabolt // Thin Solid Films. 1996. -V. 284/285. - P. 708-712.

292. Su, L. Microbial biosensors: A review / L. Su, W. Jia, C. Hou^ Y. Lei // Biosens. Bioelectron.-2011. -V. 26. P. 1788-1799.

293. Sugunan, A. Nutrition-driven assembly of colloidal nanoparticles: growing fungi assemble gold nanoparticles as micro wires /A. Sugunan, P. Melin, J. Schnurer, J. G. Hilborn, J. Dutta // Adv. Mater. 2007. - V. 19. - P. 77-81.

294. Sukhorukov, G.B. Layer-by-layer self assembly of polyelectrolytes on colloidal particles / G.B. Sukhorukov, E. Donath, H. Lichtenfeld , E. Knippel, M. Knippel, A. Budde, H. Mohwald // Colloid Surface A. 1998. - V. 137 (1-3). - P. 253-266.

295. Sukhorukov, G. Layer-by-layer assembly of DNA and polynucleotides films by means of alternate adsorption with polycations / G. Sukhorukov, H. Mohwald, G. Decher, Y. Lvov // Thin Solid Films. 1996. - V. 284. - P. 220-223.

296. Suo, Z. Efficient immobilization and patterning of live bacterial cells / Z. Suo, R. Avci, X. Yang, D.W. Pascual // Langmuir 2008. - V. 24. - P. 41614167.

297. Suo, Z. Antibody selection for immobilizing living bacteria / Z. Suo, X. Yang, R. Avci, M. Deliorman, P. Rugheimer, D.W. Pascual, Y. Idzerda // Anal. Chem. 2009. - V. 81. - P. 7571-7578.

298. Sutherland, R.M. Cell and environment interactions in tumor microregions: the multicellular spheroid model / R.M. Sutherland // Science -1988.-V. 240.-P. 177-184.

299. Tang, H.W. Probing intrinsic and extrinsic components in single osteosarcoma cells by near-infrared surface-enhanced raman scattering / H.W. Tang, X.B. Yang, J. Kirkham, D.A. Smith // Anal. Chem. 2007. - V. 79. - P. 3646-3653.

300. Tatsuma, T. Algal biosensor array on a single electrode / T. Tatsuma, Y. Yoshida, I. Shitanda, H. Notsu // Analyst 2009. - V. 134. - P. 223-225.

301. Trevors, J.T. Use of alginate and-other carriers for encapsulation of microbial cells for use im soil / J.T. Trevors, J.D; Elsas, H. Lee, L.S. Overbeek // Microb. Releases. -1992. V. 1. - P; 61-69.

302. Trevors, J.T. Survival of alginateencapsulated Pseudomonas fluoresceins^cells^Tn soil / J.T. Trevors, J.D. Elsas, H. Lee, A.C. Wolters // Appl. Microbiol. Biot. 1993.- V. 39.-P. 637-643.

303. Trubetskoy, V. S. Layer-by-layer deposition of oppositely charged polyelectrolytes on the surface of condensed DNA particles / V. S: Trubetskoy, A. Loomis, J. E. Hagstrom, V. G Budker, J. A.,Wolff // Nucleic Acids Res. 1999. -V. 27.-P. 3090-3095.

304. Vakarelski, I.U. Penetration of living cell membranes with fortified carbon nanotube tips / I.U. Vakarelski, S.C. Brown, K. Higashitani, B.M Moudgil // Langmuir 2007. - V. 23. - P. 10893-10896.

305. Van Der Meer, J.R. Where microbiology meets microengineering: design and applications of reporter bacteria / J.R*. Van Der Meer, S. Belkin // Nat. Rev. Microbiol. 2010. - V. 8. - V. 511-522.

306. Van Der Meer, J.R. Illuminating the detection chain of bacterial bioreporters / J.R. Van Der Meer, D. Tropel, M. Jaspers // Environ. Microbiol. -2004.-V. 6.-1005-1020.

307. Van Dyk, T.K. LuxArray, a high-density, genomewide transcription analysis of Escherichia coli using, bioluminescent reporter strains / T.K. Van Dyk, E.J. DeRose, G.E. Gonye // J. Bacteriol. 2001. - V. 183. - P. 5496-5505.

308. Vanduffel, B. Fuzzy assembly and 2nd-harmonic generation of clay/polymer/dye monolayer films / B. Vanduffel, T. Verbiest, S. Vanelshocht, A. Persoons, F. Deschryver, R1. A. C.Schoonheydt // Langmuir 2001. - V. 17. - P. 1243-1249.

309. Védrine, C. Optical whole-cell biosensor using Chlorella vulgaris designed for monitoring herbicides / C. Védrine, J.C. Leclerc, C. Durrieu, C. Tran-Minh // Biosens. Bioelectron. 2003. - V. 18. - P. 457-463.

310. Veerabadran, N.G. Nanoencapsulation of stem sells within polyelectrolyte multilayer shells / N. G. Veerabadran, P.L. Goli, S.S. Stewart-Clark, Y.M. Lvov, D.M. Mills // Macromol. Biosci. 2007. - V. 7. - P. 877-882.

311. Velev, O.D. On-chip micromanipulation and assembly of colloidal particles by electric fields / O.D. Velev, K.H. Bhatt // Soft Matter 2006. - V. 2. -P. 738-750.

312. Velev, O.D. Assembly of latex particles by using emulsion droplets as templates 1. Microstructured hollow spheres / O. D. Velev, K. Furusawa, K. Nagayama // Langmuir 1996. - V. 12. - P. 2374-2380.

313. Velev, O.D. Assembly of Latex Particles by Using Emulsion Droplets 3. Reverse (Water in Oil) Systems / O. D. Velev, K. Nagayama / Langmuir 1997. -V. 13.-P. 1856-1864.

314. Velev, O. D. Materials fabricated by micro and nanoparticle assembly -The challenging path from science to engineering / O. D. Velev, S. Gupta // Adv. Mater. -2009.-V. 21.-P. 1897-1905.

315. Wan, C.A.A. Nanomaterials for in situ cell delivery and tissue regeneration / C.A.A. Wan, J. Y. Ying // Adv. Drug Deliver. Rev. 2010. - V. 62. -P. 731-740.

316. Wang, B. Yeast cells with an, artificial mineral shell: protection and modification of living cells by biomimetic mineralization / B.Wang, P. Liu, W. Jiang, H. Pan, X. Xu, R. Tang // Angew. Chem. Int. Edit. 2008. - V. 120. - P. 3616-3620.

317. Wang, F. Layer-by-layer assembly of aqueous dispersible, highly conductive poly(aniline-co-o-anisidine)/poly(sodium 4-styrenesulfonate)/MWNTs core-shell nanocomposites / F.Wang, G. Wang, S. Yang, C. Li // Langmuir -2008.-V. 24.-P. 5825-5831.

318. Wang, L. Preparation of uniform needle-like aragonite particles by homogeneous precipitation / L. Wang, I. Sondi, E. Matijevic // J. Colloid Interf. Sci. 1999. - V. 218. - P. 545-553.

319. Wang, Q. Enhanced surface plasmon resonance for detection of DNA hybridization based on layer-by-layer assembly films / Q. Wang, X. Yang, K. Wang // Sensor Actuat. B- Chem. 2007. - V.l23. - P. 227-232.

320. Wang, T. Soft polymer and nano-clay supracolloidal particles in adhesives: synergistic effects on, mechanical properties / T. Wang, P.J. Colver, S.A.F. Bon, J.L. Keddie // Soft Matter 2009: - V. 5, - P. 3842-3849.

321. Weibel, D.B. Microfabrication meets microbiology / D.B. Weibel, W.R. Diluzio, G.M. Whitesides // Nat. Rev. Microbiol: 2007. - V. 5. - P. 209218.

322. Winterton, L. US Patent Appl. № 20010048975 / L. Winterton, J. Lally, M. Rubner, Y.Qui// US Patent Appl. 2001.

323. Xing, Q. Cellulose fiber-enzyme composites fabricated through layer-by-layer nanoassembly / Q. Xing, S. R. Eadula, Y. M. Lvov // Biomacromolecules 2007. - V. 8. - P. 1987-1991.

324. Xu, L. Microcontact printing of living bacteria arrays with cellular resolution / L. Xu, L. Robert, Q. Ouyang, F. Taddei, Y. Chen, A.B. Lindner, D. Baigl // Nano Lett. 2007. - V. 7. - P. 2068-2072.

325. Yang, C. Measurement of the zeta potential of gas bubbles in aqueous solutions by microelectrophoresis method / C. Yang, T. Dabros, D. Li, J. Czarnecki, J.H. Masliyah // J. Colloid Interf. Sci. 2001. - V. 243. - P. 128-135.

326. Yang, P. The chemistry of nanostructured materials / P. Yang. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. - 2003.

327. Yang, S.H. Biomimetic encapsulation of individual cells with silica / S.H. Yang, K.B. Lee, B. Kong, J.H. Kim, H.S. Kim, I.S. Choi // Angew. Chem. Int. Edit. -2009. -V. 48. P. 9160 -9163.

328. Yang, Z.Z. Templated synthesis of inorganic hollow spheres with a tunable cavity size onto core-shell gel Particles / Z.Z. Yang; Z.W. Niu, Y.F. Lu, Z.B. Hu, C.C. Han // Angew. Chem. Int. Edit. 2003. - V.42. - P: 1943- 1945.

329. Yoon, H:C. Multilayered assembly of dendrimers with enzymes on gold thickness-controlled biosensing interface / H.C. Yoon, H.S Kim // Anal. Chem. - 2000. - V. 72. - P: 922-926.

330. Zhang, J. Layer-by-layer fabrication and direct electrochemistry of glucose oxidase on single wall carbon nanotubes / J. Zhang, M. Feng, H. Tachikawa // Biosens. Bioelectron. 2007. - V. 22. - P. 3036-3041.

331. Zhang, K. Fabrication of a sensitive impedance biosensor of DNA hybridization based on gold nanoparticles modified gold electrode / K. Zhang, H. Ma, L. Zhang, Y. Zhang // Electroanal. 2008. - V.20. - P. 2127-2133.

332. Zhang, Y. Fabrication of stable hollow capsules by covalent layer-by-layer self-assembly / Y. Zhang, S. Yang, Y. Guan, W. Cao, J. Xu // Macromolecules 2003. - V. 36(11). - P. 4238-4240.

333. Zhao, B. A bone mimic based on the self-assembly of hydroxyapatite on chemically functionalized single-walled carbon nanotubes / B. Zhao, H. Hu, S. K. Mandal, R. C. Haddon // Chem. Mater. 2005. - V. 17. - 3235-3241.

334. Zhao, L. Assembly of layer-by-layer films of heme proteins and singlewalled carbon nanotubes: electrochemistry and electrocatalysis / L. Zhao, H. Liu, N. Hu // Anal. Bioanal. Chem. 2006. - V. 384. - P. 414-422.

335. Zheng, S. Self-assembly and characterization of polypyrrole and polyallylamine multilayer films and hollow shells / S. Zheng, C. Tao, Q. He, H. Zhu and J. Li // Chem. Mater. 2004 - V. 16(19). - P. 3677-3681.

336. Zhi, Z.-L Polysaccharide multilayer nanoencapsulation of insulin-producing /?-cells grown as pseudoislets for potential cellular delivery of insulin / Z.-L Zhi, B. Liu, P. M Jones, J. C Pickup // Biomacromolecules 2010. - V. 11.-P. 610-616.

337. Zhong, Z.Y. Preparation of mesoscale hollow spheres of Ti02 and Sn02 by templating against crystalline arrays of polystyrene beads / Z.Y. Zhong, Y.D. Yin, B. Gates, Y.N. Xia // Adv. Mater. 2000. - V. 12. - P. 206-209.

338. Zhou, H. Hydrothermal synthesis of ZnO hollow spheres using spherobacterium as biotemplates / H. Zhou, T. Fan, D. Zhang // Micropor. Mesopor. Mat. 20107. -V. 100. - P. 322-327.

339. Zhou, W. How rigid rods self-sssemble at curved surfaces / W. Zhou, J. Cao, W. Liu, S. Stoyanov // Angew. Chem. Int. Edit. 2009. - V. 48. - P. 378 -381.

340. Zhu, L. DNA damage induced by multiwalled carbon nanotubes in mouse embryonic stem cells / L. Zhu, D. W. Chang, L. Dai, Y. Hong // Nano Lett. 2007. - V.7 (12). - P.3592-3597.

Информация о работе

Фахруллин, Равиль Фаридович
доктора биологических наук
Казань, 2011
ВАК 03.02.03

Диссертация

Функционализация клеток микроорганизмов с использованием полиэлектролитов и наночастиц - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы