Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЫСОКОЛИЗИНОВЫХ АНАЛОГОВ КУКУРУЗЫ В ПРОЦЕССЕ УЛУЧШЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА.БЕЛКОВ ЗЕРНА

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ВЫСОКОЛИЗИНОВЫХ АНАЛОГОВ КУКУРУЗЫ В ПРОЦЕССЕ УЛУЧШЕНИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА.БЕЛКОВ ЗЕРНА"

Н-гХ/25

Воронежский ордена Ленина госуваретвенный университет имени Ленинского комсомола

На правах рукописи

УДК: 633.15:631.523/631.5(9:681)

Кутовой Александр Арсентъевич>

МШОЛОГО-ВИОХИШЧЕСКИЕ ИОСШОВШИ ШООКОЙИЗИНОШХ

АНАЛОГОВ КУКУРУЗЫ В ПРОЦЕССЕ УЛУЧИЕКИЯ АМИНОКИСЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ ЗЕРНА

03.00.12 - физиология растений

Автореферат

писсертации на соискание ученой степени калдипата биологических наук

Воронеж - 1967

с.' /"

Райота выполнена в лаборатории биохимии растений и лаборатории селекции и семеноводства кукурузы ордена Трудового Красного Знамени Научно-исследовательского института сельского хозяйства Центрально -Черно земной полоса ил. В-В .Докучаева

Научный руководитель: кандидат сальскохозяЁственннх наук, ставший шаучный сотрудник Г.П .Котова

Официальные оппоненты - доктор биологических наук,

профессор А.А.Землянухин

- кандидат сельскохозяйствешшя наук, старший научный сотрудник и.Д,Гончар

Ведущая организация - Всесоюзный солекцжонно-генетическЕй институт

Защита состоится * $ " 1087 г. ю _час.

на заседании специализированного соввта:: 063. 48.05 при Воронежском государственном университете ш. Лзнииокого комсомола (394693. г. Воронеж, Университетская идощадъ, I, В17, биодого-почвенный факультет)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке университета.

Автореферат разослан

н

Ученый секретарь специализированного совет;

ОШАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА. РАБОТЫ

^кттальностт. теми. Стрешшнае улучшить качество а количество белка в эерие кукурузы при помочи селекции стало весьма, актуальным в связи с дефицитом кормового белка; впервые реальная возможность • генетико-селекционного решения дайной пройлшы "предвлилась в конце 60-х годов в связи с успешным использованием ендоспердаяышх мутантов кукурузы опаю-2 и флаури-2 по улучшения бедка.

Вскоре на пути целенаправленной селекции на комплексную кормовую ценность зерна возникни препятствия из-за ограниченности реализуемого в селеютонных прокатах потенциала тл<л * недостаточной изученности фи1эисиюгсм5иохдаических факторов, детер-ыиннруиих хозяйственно-биологические признака зерна и особенности их наследования при гибридизации. преодоление пк требовало глубокого изучения природа сложных признаков качества, о тем, чтобы позволить селекционеру осуществлять манипулирование на основе этих знаний, Одяако", определенные достижения в изучения физиологов биохимического действия, в частности, гена о^, -)се еще не давали ответа на вопрос, что является ключевым мшеато:! его нножественно-, го проявления, решение этого вопроса способствовало бы определению целей н разработке методов, а такие помогло бы надежно оценить -перспективы селекции шеоколнзиновой кукуруэн на основе «тих мутаг*' ций. •'

рель и задачи исследований! '•'

- распространить идеи физико-химической биологии на изучение признаков, имеющих селекционное значение;

- создать на основе 'екеперименташшх и литературных данных гипотезу о молекулярном механизме действия гена о^ по изменению ■ аминокислотного и белкового состава зндосперяа кукурузы; .

- оценить .количественную изменчивость и наследование грушш биохимических признаков в разной генотшшческой среде и программу селекционного улучшения белка; ' ■

- дать хозяйственно—биологическую оценку выооколиаивавш о^— и ф^-аналогам линий, сортов■и гибридов■кукурузы;

- выбрать я усовершенствовать методы серийного скрининга в селепадп высоколизвновой кукурузы.

научная рувузна работы ввключается в том, что впервые:

- выявлена' связь иезду отклонением частоты встречаемости аминокислот у о^- и ф^-ацал^ов ^^р^^д^равнении о нордаготыми.

г.тяга

Ь'

ь.- дгепи '■

о» и Я ----

- г-

в одной стороны, а вероятностями использования нуклеотидов в серии виыошащчеекшс кодонов в ЩК-ияшокиолотного кода, с другой стороны;

- использованы меченые предшественники нуклеиновых кислот и Задков дая экспериментальной проверхн предложенной гипотезы о механизме действия мутащш опак-2 на молекулярном уровне;

- вычислен отохастцческий валовый пуклеотщишй состав популяции и-ШК для разных групп белков;

.. - проведен югеядпнй анализ изменчивости шднокиелотного со- , - става (далее: ак-соетша) о^-акалогов; '

. ' — оценено накопление запасных белков в эерке иэогешшх аналогов в биоэнергетическом и эволюционном аспекте;

- предложен способ ионообменной зфоматогргфии для ускоренно-" го анализа на «держание лдэана.

ГТоедтическая денносч-ь пехоты. Данная работа представляет собой фи зиолого-биохшиче окую часть программы ВИР Дентральыо-^ерно-'" ве&шого салевде^тра по создали» вцсоколизиновой кукурузы, Установлена более высокая селекционная и биологическая ценность о^--анагогов в сравнении о фл^-аналогами. Предложены уточнения в методику создания о,,-алалогов сортов и ланий, в результате отборов на высокое содержание лизина очень вероятно получение фор.! с дефицитом белка по содержанка изолеидшт, поэтому биохимический контроль в процессе селекции на качество должен обязательно включать а тест на изолейшт.

разработан и рекомендован использовать во всех хтшко-шаг-лятических лабораториях Селекцентров, ведущих серийные анализы селекционного материала,, способ ускоренного определения лазина с выходом на ашшокислот.ете анализаторы.

^проб^ахид работу. Материалы диссертации докладывались и об-суздалзсь: на заседаниях Воронежского отделения еОГей (1973. ' 1976. 1980. 1986); на научной конференции преподавателей и аспирантов Воронежского СХИ (1074); на Всесоюзной совещание по селекции высоколизшшвой кукурузы (Краснодар, 1976). на Всесоюзном семинаре . "Белковые маркеры и их использование в решении проблем прикладной ботаники, генетики я селекции" (Ленинград, ВИР.1978); на научно-методическом совещании научно-исследовательских учреж-' денай Центрально-черноземной зоны (Белгород, 1976). Остальные семинары и:конференции, где были сделаны доклады и опубликованы их тезисы указаны в списке работ по диссертация. Кроме этого, .

диссертация рассматривалась на .заседания ученого совета НИШИ ЦЧЦ .ш, В.В .Докучаева (март, 1966) •

• ртрткгурз и объем работы. Диссертация содетдагг следупзде ■ • разделы: Бведшгае, обоснование выбора направления доследований, > окспеушгенткльная часть (6 разделов с 245 подразделам«), вывода,. предложения, список литературы (546 назв.). Ойаий объем диссертации 138 стр. и включает 56 таблиц и е рдсувков. ■■

2. ЦАТЕИШ! И МЕТОДО ИССЛЕДОВАНИЯ

Работа выполнялась в течение 1971-1905 1Т, На первоначальном атаке селекционной работы в качестве источников- гена опак-2 -использовались о^Лу/ь^А (й 275941), ^^^ ^ 257305) И а, 540 (а ¡¿75859), из которых последний является оригинальным неточна- , ком. в качестве исходного материала брались родительские фс^мн , районированных гибридов, линии и сорта зубовидной кукурузы из мировой коллекции ВНШР, а также линии селегацш лаборатории 157-' курузы НИИСХ ЦЧП лм; В .В .Докучаева. В »той *е лаборатории о2- * -аналоги создавалась методом бвккросса и отбора по типу рекуррентного родителя; Достаточная степень еходства о исходной родительской формой достигалась после 5-в скрещиваний. Создание, высоко-лизшювой кукурузы одновременно велось, но в меньшем объеме, и на основе гена флаури-2 (Ф^)» источниками которого послужили синтетик Иллионойс и синтетик До. г

В наших опытах непосредственно анализировались палые зерна и отдельные их части. После структурного анализа отбирались пробы из средней части не менее, чем из до початков в виде целых рядов, общей массой 50-100 г. Во время вегетации па исследование ойлешшх процессов отбирали пробы о 3-х оэернеыных початков в виде целых рядов ш сегментов.

Определение ак-состава проводили стандартны« методом — иово-обыенпой хроматографией с помощью анализаторов НД-1200 Б в АМ--езх. А такие' аминокислоты как три, мет и цис определяли колори-метрячеезеими методами, вследствие того, что они 'полностью или частично разрушались при кислотном гидролизе. Свободные оминокио-лотн определялись в спиртовом экстракте. Одна часть серийных анализов лязина выполнялась ферментным методом с- помощью анализатора "техникой", другая - разработанным нами ускореннш способом с использованием анализатора аминокислот. .

При ваделешш белковых фракций применили. одну из модификаций метода по схеме Т.В.Осборнао учетом характера материала а " последующего' изучения выделенных фракций,' С шло екстрагировши о проведено при температуре около о°С последовательно водой, эд f/uOf f fäffit этанолом и 0.05 н ЛЬ £ f/,~ Этв жв фракцш исследовались с помощью влектрофореза в ПААГе по цропдоям Дя.цайэелл, а зеин еще а по методу- ю.Р/бчекя и др.

Фракционирование фосфоросодержащих соединений, а т.ч. и определение нуяледиових кис.ют, выполнили по схше 13 .Г.Конареза с сотр. Активнооть рябонугаеазы определяли по методу щнейдера и Хогебума,'описанному в методическом сборнике Э.Б.Сквирской л ' (ЬПЛешшоги. Измерение фосфора выполнено колориметрическим методом с реактивом Бартона, ряд других серийнцк методов взяты из методических.сборников А.11 .Ермакова и др.« Е.Е.Плешкова и Z.H.. поченок.

Скорость синтеза белков и нуклеиновых кислот измеряли по . скорости вкяаченвд радиоактивной углеродной иетки, которая с ао-мощьп вякуум-инфшьтрошга вводилась в составе аминокислот и азотистых оснований. Активность метки измеряли о помощью газоразрядного торцового счетчика, помещенного в малофоноъую установку УМг-1500, и-пересчетного прибора Ш-Х6. Восяродзводимость нока-. закий очетчнка контролировалась по двум эталонным препаратам.; удельную' активность ■ выражали в шп/шш. на единицу белка или нуклеиновой кислоты.

Определение состояния рибонуклеояротошщого комплекса проводили на шофотошшх постоянных цитологических препаратах по методу В.Г.Козырева, измерение пяроюшофшгав проводили на од- . . нолучевом зондов ом щгтоспектро фотометре конструкции н. С. Агафонова по одноволновой методике на длине волнн 495 ммк.

Близкие ингибиторов форментных систем выполнено в культуре изолированных органов, для чего сегмента початков в фазе актив-нош накопления белков пшещшсссь для доращивания-па синтетическую питательную среду по Хеллеру.

Математическая обработка результатов анализа проведена на SSM Иир-I по нескольким программам, в которых, наряду с основны-ш статистическими показателями, вычислялись, парные коэффициента корреляции. Последа ищи» анализ корреляционной решетки проводили но плоядяому методу Е.В.Терентьева, При радиометрических измерениях соемались регистрировать такое количество шпульсов, чтобы

ошибка не превышала 3?, и в тех случаях, когда радиоактивность -препаратов Сила невысокой. Данные биохимической оценки селекционного материала выполнены, как правило, в 2-х аналитических повторениях, а все остальные эксперимента - в 4-х и долее. .

3. НАК01ШШБ СВОБОДНЫХ АМИНОКИСХОТ И тОЭЯЕИГСГГИЧЕСКИЕ СООЕРАШШ ПРИ УЛУЧШЕНИИ ЕЕЖОЭ ЭЕЕНА КШР7Ш

Одним из характерных эффектов мутации оцек-3 в процессе формирования зерновки является увеличенный пул свободных доино-кислот. зависимость медцу содержанием аминокислот в свободном а в связанном виде отсутствует. Обнаружено наибольшее содержание свободных аминокислот презде всего в тех семействах, кото£«е шлеме ключевые и о большей универсальностью метаболиты. В среднем для исследуемых генотипов (+, о^), получены достоверные'раз-» дичпя в соотношении свободных ашяокислот. четкоЯ картшш ¿асле-дованяя этого признака гибридами не получено.

При анализе взаимосвязей путей анаболизма аминокислот обратили внимание на-широкий спектр биоэнергетдвесьих затрат, презде . всего, у протеггногенпых. Вычисленные значены яях затрат имеет, высокую корреляцию с молекулярной массой в внутренней внергней сгорания, оказалось, что не замените аминокислоты требуют значительно больших затрат на свой синтез, чем заменимые, это привело нас к мысли сравнить изогенкые аналоги по биоэнергетическим тратм и па синтез тотального белка и его отдельных фракций, вычисленным по ак-ооставу. зеин является наиболее энергоемким в ' сравнении с другши фракциями (см. табл. I). отсюда ш задлючи— ли, что замещение эеина в результате селекционного использования -мутаций окак-2 и флаури-2 приводит к потере той энергии, которая должна удовлетворять потребности молодого растения, с точки. зрения кортовой ценности желательный ак-состав и биоэнергетические затраты связаны между собой негативно, т.е. более питательные ' белка требуют' и больших энергетических затрат,

Ддя оценки последствий селекционного использования на аво~ лнцш запасных белков зерна, ш определили взаимосвязи мезду. частотами встречаемости аминокислот и некоторыми их константами. В результате была обнаружена отрицательная корреляция между частотой встречаемости аминокислот и тес молокудярной массой ^ затратами ЛТ5 и стандартной свободной энергией сгорания. Прл атом ■

Таблица X

Биоэнергетические затраты на синтез белковых фракций, моль"1» 100 г АТФ

фракция белка : Генотип : Зерно ' г Эндосс

Альбумшш + 29,3 27,6

опах-2 29,4 28,8

Глобулины , + 89,1 . 28,8

опак-2 26,5 28,6

Зешш + 31.2 30,9

опак-2 ЗЫ 31,2

Глютелшш ч* 29,7 29,6

опак-2 30, э 29,5

С клородротрины +■ - 29,6

опак-г - 29,4

альбумины е глобулины тлеют наибольшую связь, несколько меньшую - глителшщ к склерэпротешш и самуп слабую - зешш. Влияние о2-генотлпа в сравнения с нормальным на величину этой связи несу. щаственное, такш образом, в процессе вволщии зеина его ак-со-стев формировался в направлении снижения удельных биоэнергетических затрат на его синтез. Высокая концентрация шшдов в зеп--не есть специфическая форда запасания максимального количества • азота с минимальными затратами продуктов фотосинтеза. Это в ходе зводщил должно иметь больное селективное преимущество, корреляционным анализом выявлено, что частота встречаемости аминокислот ъ белковых фракциях, за исключением эекиовой, хотя и слабо, но положительно взаимосвязана с массовой долей азота в молекуле соответствующей аминокислоты.

4. спщвшшия ИЗМЕНЧИВОСТЬ АШШОКЛОТНОГО СОСТАВА БЕЛКОВ ЗЕРНА КУКУРУЗЫ ПОД ВЛШШШ ЭЩЮСШМШШХ, .

ШЮВ ОПАК-2 и ФДАУРЛ-2

По ак-составу В на основе его кодинеарности с генетическим кодом мы попытшшсь охарактеризовать самые общие особенности валового нужпеоткдного состава популяции м-ПИ, как,по тотальному

белку, так в по отдельным грушам белков, постулируя при этом статистический характер использования нуклеотидов. Эту. задачу ■ мы решата с помощь» корреляционного анализа. Предварительно рассчитали вероятности использования каждого из 4-х нуклецтидов в составе серий эквивалентных кодонов, а также взяли ряд крайних случаев: пурины облшгатдах пар, пурины максимального кода, го одному кодону пуриковому или пиримидиковому. Затем между средними значениями частот встречаемости аминокислот, их отклонениями у о2~ и фл^-аналогов по отношению к нормальным формам, с одной стороны, и вероятностями использования нуклеотидов и отдельных их сочетаний в составе триплетов шк-шашокислотного кода, с другой - исследовали корреляционные связи.

Оказалось, что коэффициенты глррелящщ -с пуринами (а, г) не превысила своей ошибки, а с пиримидин ами (Ц, у) она довольно значительные; с урацдлом - отрицательные, а с цитозином - положительные, наибольшие и достоверные. Последняя факт может йыть объяснен вкладе» таких шинокислот, как; глх, гро, лей, ала, такао как н отрицательная о урацилом - соответственно: цио, три; мет. Коэффициенты корреляция между вероятностями использования преимущественно пуринов или пиршидинов не превысила своей ошибки, за исключением варианта о "минимальным пуриновым кодом" у зародыша, что также удовлетворительно согласуется, с повышенными частотами встречаемости в нем основных аминокислот (лаз, арг). Влияние мутанткых генов на эти связи очень слабое и различия не достоверные.

Затем мы рассмотрели аналогичные корреляции, но только не -о частотами встречаемости аминокислот, а с их отклонениями у изогенных аналогов по отношению к нормальной форме (табл. 2). Увеличение частоты встречаемости аминокислот у о^— и ф^— аналогов, как в тотальном белке зерна, так и в его эндосперме, положительно связано с вероятностью использования пуриновых нуклеотидов (а, Г)'и отрицательно - пиримидиновых (ц, у), полной неожиданностью было открытие достаточно высоких значений коэффициентов корреляции для белков зародыша, более того — противоположных по знаку. Самые высокие значения коэффициентов коррелят. ' цш получены для вероятностей использования пуриновых и дирими-деновцх нуклеотддов ойяигатнымп парами триплетов. Связь оч-гк (отклонение частоты - генетический код) позволяет нам постулировать для некоторых аминокислот, имеших разные ойллгатнне

Тайша 2

Коэффициенты корреляции иеяду вероятность!) кспояьзованзи цраеотвдов м-ШС-еишокислотннх кодшов а отклонением частоты встретаахости аминокислот в банках андосдетыадыш мутантов кукурузы (+

г

Вероятность яспояьзова-:_________ррщржера за^готц ВЩ^земогта §йШ2!шаго£_____

____ЭЩ£спе®1_________:___,

опак-2 : фдаури-З : сшаВт2

едя нукиесгююв в серии: _ _Зегио___

эквавалентяых кодонов ; опак-2

Дденаи + 0,29^1 0,23

Гуанин + 0,37й ± 0,23

цатозщ - 0,37*1 ± 0,23

Уршш - 0,36й ± 0,23

ПуПуЩчьах + 0,53Г±0,2Х

ЩПТШГ-тт - 0»51г ± 0,21

пущцу + 0,63г ± 0,19

пупу (х) + 0,74г ±0,17

+ 0,31й ± 0,24 + 0,22 ± 0,24 - 0,39 ± 0,25

+■ 0,41в ± 0,23 . + 0,52® ± 0,21 - 0,54а ± 0,21

- 0,47® ± 0,22 - 0,50^ ± 0,22 + 0,40 ± 0,23

- 0,34 ± 0,24 - 0,33 ±0-24 + 0,25 ±0,24 + 0,54г ± 0,21 + 0,57в ± 0,20 - 0,56а ± 0,24

- 0,б1г ± 0,20 . - 0,643 ± 0,19 + 0,25 ± 0,24 + 0,еЗг ± 0Д8 + 0,70* ± 0,18 - 0,54а ± 0,21 + 0,75г ± 0,16 .+ 0,53® ± 0,19 - 0,56а ± 0,21

к - превышение уровня значимости: а - 0,10; й - 0,05; в - 0,01; г - 0,001

дары, наиболее вероятное их использование в составе синонимических кодонов: для аргинина - АГ САГ); для серина - 7Ц (А* Г, Ц, У), т.е. аргинин преимущественно кодируется пуриновыми, а серпн — пиримидиновши облигатными парами.

Исходя из'данной связи оч-гк была выдвинута гипотеза о механизме специфического изменения соотношения белковых фращий в вндосперле и в целом в зерновка кукурузы. Постулируется, что. влияние гена о^ на белокеинтезирующую систему реализуется на стадии трансляции через избирательное воздействие на м-ИК -связывающую активность, репрессоры (а модуляторы), вырабатываемые под действием гена о^, связьгааяь с м-РИК, взаимодействуют дифференцированно (в зависимости от соотношения А+Г : Ц-»У) и в результате этого вероятность ферлентативногб разрушения этих двух типов м-ГНК разная.

Возможна и другая альтернативная цепь событий; ген - регулятор о2 модулиигет специфическую активность пзоформ НПС-аза, Мелду репрессорами и активностью различных изоформ устанавливается новое динамическое равновесие, которое и приводит к избирательному разложении м-РНК, т.е. на м-ИОС ЦГ<-типа (зеиновый тип) отрицательная модуляция, а на м-РНК АГ-типа (альбуминовый тип) - положительная, в первом постулате высокая активность РНК-азы у с^-вналогов является как бы следствием,, а во втором - причиной.

Опыт с ингибиторами белкового и нуклеинового обмена был нашей первой попыткой выявить направление поиска ключевого момента в проявлении мутации опак-2. Торложение отдельных путей метаболизма по разному сказалось на накопление аминокислот и общего белка и. приемлемо интерпретировать не удалось, хотя в целом специфичность экспрессии аллели со*Рандлась«

Дк-состав белка кукурузы анализировался и с другой точки, зрения: селещнонной. С этой целью мы исследовали изменчивость и взаимосвязь' ак-оостава белков зерна у 43 пар изогенных аналогов с помощью корреляционного анализа, общее число отрицательных связей между незаменимыми аминокислотами у о,-аналогов оказалось в 3 раза меньше, чем у норлалышх (стл. табл. 3). В результате отборов на высокое содержание лизина очень вероятно по.тучение форл с дефицитом по содержанию иэолейщпш, что может быть ограничивающим селекционным фактором.

Тайяица з

. Парные коэффициента корреляции* между. ашшошигатаиз тотального белка зерна кукуруза 'Пределы значимости: t0f05 » о^;« 0,38

я :_________HeWQMP_____.___i________ачИИМ_________

-; три мет жэ иде тир тре фея вал лей : вдс пес арг сер гла асх про ада ешс

три -10 +01 -26 -26 > -03 -Ю +12 +16 -33 +05 -03 +34 -23 -25 +04 -II +28

мет- +25 -08 -09 +19 +16 -20 -25 -41 +58 -14 -»22 +15 +22 -07 +30 +26 -03

лиз *01 -Of? +31 -34 +37 -08 +35 -05 -50 +40 +20 -26 +36 +35 +20 -02 -31

яде . -16 +11 -ОТ +30 +ГЗ +36 +20 +36 -07 +34 +14 -16 +47 +16 +30 +53 +16

тир -Й1 +49 -33 +30 +38 -53 -63 -08 +31 +22 +57 +28 +23 +29 +28 +15 +39

™ -13 +41 -02 +33 +35 +38 •-43 -13' -19 +54 +65 +12 +38 +63 +54 -22 +15

фен +38 +10 +14 +13 +34 +14 -13 +58 434 +42 +44 +56 +18 +43 +36 +10 +75

вал +05 -48 +52 -19 -65 -61 +56 +42 -20 -20 -54 -04 -08 -04 -25 +33 -02

лез +19 -15 +06 +21 -10 +04 +40 +25 -14 +09 -II +24 -18 +04 +06 +09 +59

дис -04 +28 -35 -33 +32 -19 -Of? -21 46 -32 +09 +26 +18 -19 +01 +44 +08

гис +10 +30 -03 +29 +47 +37 +22 46 +00 <¡L +64 +10 +21 +32 +50 +03 +19

арг +14 +50 -04 +22 +80 +27 -53 -19 +32 +68 +26 +36 +40 +53 -00 +24

сер +57 +30 +12 -20 +10 -24 +37 +37 +ог +34 -06 +12 +06 +30 +15 +20 «61

глл +15 +46 +09 +20 +48 +31 +31 -16 -23 +31 +36 +59 +30 +44 +47 +40 -07

асх -30 -25 +49 -10 -05 -10 +10 +44 -14 +06 -04 +09 +13 +25 +32 -01 +24

дро +20 +46 -29 -12 +28 +36 +30 -30 -16 +09 +18 +09 +26 +16 -33 +24 -00

ада +05 -07 -II +33 +12 -22 •»06 +04 -03 +08 -20 +15 +10 +02 -20 -33 +03

глх +19 -02 +10 -18 -06 -06 +16 +23 +12 +17 +08 -12 +36 +42 +12 +17 -09

0

1

к 0 целых з запятая ояувены

- и -

5. БЕЛКОШЙ И АШШИСШПШП СОСТАВ ЭЕША ВиСОКОЮШНОВЫХ АНАЛОГОВ КУКУРУЗЫ Повышенное накопление небелкового азота о^-аиалогши — вто своего рода последствия дисбаланса между "старым" приходом и "но- , вш" расходом, -репрессия синтеза зеша, точнее значительной части его субкомпонентов, приводит в конечном итоге г. новому соотношению белковых фракций с данными физико-химическими свойствами. Какая-то , часть высвободившегося фонда свободных аминокислот используется на дополнительный синтез остальных фракций. Влияние зародыша на фракционный состав белка зерна довольно существенное и, правде всего, за счет того, что в ней отсутствуют зеины. Что касается гена то в среднем для 4-х изогенных пар по его влиянию на содержание общего белка, альбуминов, глобулинов и зеинов, он занимает как бы промежуточное положение мезду обычным и о2-аналогом, равное с о2--аналогом накоплению небелкового азота, меньше содержит глютелинов и больше - склерощютеинов, но больдшнство этих различий не достоверно .

Исследовался ак-состав белковых фракций, как целого зерна, так и шщослерла с той целью, чтобы охарактеризовать не только биологическую ценность белка о^-аналогов, но и через него лучше понять биохимические особенности мутации опак-2. Самый аномальный ак-состав имеют зешш и не только по содержанию лизина, .но и по целому ряду других аминокислот. Ак-состав альбуминов и глобулинов в эндосперме очень сходный и близок к таковому вегетативных белков, глютелинов п склеропротеинов и занимает промеяуточное положение ыеаду первыми и зеинами. Различия между разными фракциями на порядок больше, чем между одноименными фракциями разных генотипов. Однако тот специфический сдвиг, та связь оч-гк, которая достоверно обнаруживается по составу тотального балка, все-таки как тенденция просматривается и на ак-составе фракций» в общем, этого а следовало оицдать так, как, во-первых, в данном случае имеем дело с меньшей выборкой,^, во-вторых, и что самое важное, сама статистическая совокупность разделена на несколько частей. Факт уменьшения тесноты связи можно интерпретировать как в пользу статистического характера связи оч-гк, так и того, что вариация внутри фракций по ак-составу значительно меньше, чем таковач,между фракциями.

Опыты с мечеными соединениями показали, что аминокислоты, . отнесенные иомн к АГ-типу, имеют более высокую интенсивность вюго-чения в белковые фракции о^аналогов в сравнении с нормальным, ■ '

- га -

а аминокислоты соответственно ЦТ-типа, наоборот - более низкую. Этот факт вполне согласуется с тем механизмом генной регуляции, который вши постулируется. Наиболее достоверно эта закономерность обнаруживается у альбуминов и глобулинов, менее надежно - у зеинов х глютелинов. Последнее, очевидно, обусловлено тс низкой удельной активностью.

При исследовании спектров в ПААГе данных белковых фракций, выявлено, что альбумины о^-аналогов в среднем имели на I компонент больше, чек аортальные формы, напротив, у зеинов они сильно редуцированы. Какой-либо специфики ЭЬ-спектров по остальным осбориов-ским фракциям не выявлено, у гибридов (+, о2) число компонентов равно, как правило, числу одного из его родительских форл, имелищх большее их число. Наряду со способе« электрофореза нативного зеина бил использован и второй способ - в денатурирувдей системе. Проведенные исследования показали, что данная система, как к ожидаюсь, дает более гетерогенные спектры, которые также специфичны, как по числу, и составу компонентов, так и по общей структуре спектра. Если ген о2 сально обедняет спектр, то гон практически его ие изменяет. Вероятно он торлозит синтез всех компонентов в одинаковой мере. В этой системе у гибридов число зеинових компонентов в. отдвльннх случаях оказалось меньше, чем в его обеих исходных родительских формах, т.е. у гибридов идет не простое совмещение ЭФ-спектрюв, а устанавливаются ноше медду ними соотношения и часть компонентов не проявляется на Э$-спектрах в результате сложных процессов межаллельных взашодействпй. вгошмо, неоднозначность экспрессии генов разных генотипов обусловлена их генной структурой Однако ати данные наход'г*зя в согласил о ношей гипотезой о работе гена Од или, по крайней мере, не противоречат ей.

6. особенности нуклеинового обмена в зерне

ношажыш и о2-аналогов КУШУШ

фосфор нуклеиновых кислот имеет небольшую дол» в общем фосфоре, однако, именно эта его часть представляла наибольший интерес. В процессе формирования зерновгаг изо генных аналогов выявлены значительные изменения В содержании нуклеиновых кислот (ДНК, ЯШ). Обнаруживается некоторое сходство по направленности изменений общего фосфора и фосфора нуклеиновых кислот, одна;:©, достаточно к исклгпений, повышенное накопление кислот ораствор иглой фракции у Од-аналога, вероятно, свидетельствует об общем характере затормо-

жеиности анаболизма. По крайней мера, это согласуется о тем, что подаалявдая часть новых мутаций вызывает нарушения в оЛсендах процессах, хорошо отлаженных длительной эволщией, что, в конечном счете, приводит к снижении общей жяэнеспособности. _

Постулированная ноли'разная м-РКК-связывапдея активность по-* слугкяа отправным мсыентом в исследовании фцзыл-химлческого состояния свободных и связанных фосфатных групп рибонуклеопротёи-дов. У о2~аяалогов уровень свободных фосфатных групп снидея по сршнешш с обычным. Последнее может обуславливать течение процессов, сопряженных с интенсификацией общего синтеза балка.

В опытах с мечеными по углероду азотистыми основаниями ставилась цель подтверщггь или* отвергнуть нашу гипотезу об избирательности по "пуриново сти или пиршэдяновостц" на уровне м-РШС- , связывание К активности. Исследования выполнены в <?азу интенсивных-синтетических процессов в зерновке* Пурины более интенсивна вкда* чаются в тотальную РНК с^таналога по сравнению о обычный. По ш-римвдинам ожидаемая нами обратная картина не бш получена. Однако, эти последние различия не выходят за предел:*, ошибок измерений. Однозначные данные получены по отношению А + Г : Ц + У, а шенио; оно во всех случаях оказалось выше у о^-аналога.

Кроме экспериментального определения отношения А+Г : ШУ, ' пали впервые была исследована популяция м-РНК с помощью расчетного метода, на основе колинеарности меяду генетическим кодом и аминокислотным составом мы рассчитали ожидаемый {» стохастический) валовый нуклеотцщшй состав для популяции м-РНК, транслирующей дотаей! тотальный белок яли отдельны© фрвиош# В осяоздо хгроЦб* дуры вычисления бил положен, предложенный наш* простой алгоритм:

Д^ - частота встречаемости - того нуклеотида, Ы% Л,- - частота встречаемости ¿' - той аминокислоты, ц$ р,^ - вероятность использования - того нуклеотвда в максимально« коде ' - той аминокислотой Самый аномальный.иуклеотпдный состав имеют ы-ЕНК эекнов. (см. табл. 4). различия между одноименными фращиями разных генотипов (+, о2) не существенны, но зато они значительные и достоверные между разными фраяшями в пределах одного генотипа, что лшш-ннй раз говорит в пользу того, что основное влияние мутаций обуславливает не столько качественные изменения, сколько количественные, т.е. их перераспределение, НаЗлвдае'Гся четкое увеличение иод

- ГУ-

действием гена Og отношения д+г : Ц»У по всем группш' белков (транслятов), за исключением зеинов и белков зародша. Когда toi допытались проверить надежность.нашей "технологии" расчетов по данным в научной литературе, где приведена первичная структура тренслята в м-ШК (Д.Герати и др., I9BI); то получили удовлетво-. рительвое совпадение опыта и расчета.

Таблица 4

Стохастический валовый нуклеотцдный состав популяции м-ИК в ендосперле кукурузы

Транслят Генотип : __цузьяеохада^ E0JC>Ji___: А + Г -

1 : А : Г : Ц : У :

Альбумины ' + 28,0 24,1 27,2 20,8 1,09

опакг^З 28,1 24,2 26,4 21,3 1,10

Глобулины , +• 27,4 24,7 27.0 20,8 1,09

опак-2 27,7 25,3 26,5 20,4 X.I3

Эевны + 24,4 17,9 33,1 24,5 0,73

опак-2 24,1 17,6 33,5 24,7 0,72

Глют едины. + 34,4 23,4 30,0 22,2 0,91

■ опак-2 27,7 22,4 28,5 21,3 1,01

С клеродротеннн + 27,0 22,8 28,4 21,7 0,99

опак-2 27,7 23,2 27,7 21,3 1,04

Тотальный белок- + 27,0 19,0 30,9 23,0' 0,85

опак-2,. 30,2 19,0 31,7 19,1 0,97

7. НАКОПЛЕНИЕ ЗАПАСНЫХ ВЩЕСТЭ ЗЕГИОВКОЙ ВЫСОКО-

лгогаошх аналогов кукурузы и их вшоппеская

ЦЕННОСТЬ

В среднем по изученным и Ф^-аналогш нами ве отмечается депрессия массы зерновки, а в ной и уменьшение доли зародыша, однако часть аналогов ее имеют. Содержание белка в зародыше в зависимости от генотипа варьирует в пределах 16.59 - 23.703*В срежем о^-генотипы содержат несколько больше белка в зародыше, чем обычные, в эндбсперле - наоборот, при атом фл^-аналоги занимают между тми, как правило, промедуточное положение. Изучение корреляций между массой зерновки, ее зародыша и эндосперла и содержанием в

- аг~

них бодка выявило высокую положительную связь мажцу белком верна и белком эндосперма (+ 0.87 ± 0.09), среднюю - между массой зерна и эндоспорла (+ 0.53 ± 0.16) я слабую - мезду массой зародыша и содержанием в нем балка (+ 0.23 ± 0.18). Одновременно.выявлена средняя отрицательная связь меаду массой зерновки й содержанием в ней белка (- 0.47 ± 0.17) и в эндосперме (- 0.67 ± 0.16) И слаг-бая - между белком зерна и белком зародыша (- 0.30 ± 0.18). Повышение относительной белковости зерна достигается ценой потери в основном такого преобладашего компонента, как крахмал. , ,

В процессе перевода сортов п дшгай на высоколазиновый уровень было замечено, что концентрация лизина в зерне создаваемы! аналогов в значительной степени детерминируется генотип см рекуррентного родителя. При атом среди отдельных семей-сортов и подшший наблюдалась значительная дифференциация по содержанию лнзяяа п триптофана в белке зерна. Опыты по изучению влияния отбора не. содер-. залпе лизина, показ ала, что после двухкратного отбора различия в содержании лизина медцу высоко- н низкодцзиноешли семьями {о^о^, фл^/^и^) - сохраляотся, т.е. наследуются. Гаи показал тенденцию повышать белковость и снижать уровень лиэша в балке создава^-' емых аналогов. Эти исследования позволили сделать уточнение в методике селекции на данный признак, заключающееся в тем, что для этих целей достаточно 2-х кратного отбора, позволяющего избежать -ошибок в выделении высоколяэиновых семей и подувший, в то время как 4-х кратный отбор не повышает уровня лизина в даннш потомстве.

Пока что селекционер и шесте с ним работавший биохимик не могут предложить такую высоколизивовую кукурузу, которая ничем •ч не отличалась бы от обычной, за исключением повышенного на 50-605? содержания лкэпна. поэтому, при оценке создаваешос гибридов мы должны, о одной стороны, рассчитать величину потерь из-за несовершенства, а с другой — выгоды, получаемые за счет дополнительного сбора 1,5 кг лизина и 0,3 кг триптофана с I т высоколизино-вой кукурузы* или же за экономию 10-15^ высокобелковых, обычно ■ дорогих корлов. Из опыта по биологической оценке вытекаот, что введекзе в рацион свиней внеоколизиновой кукурузы увеличивает прирост массы на 26,7Й, снижает затраты корлов на I кг прироста,-- . по сравнению с загаотнымп, получавшими такое же количество обыкновенной кукурузы. * .

Многолетней опыт посева выооколизеновой кукурузы в селещи— окнах.питомниках и на участках гибридизации, а также в специальных иштах по сортовой агротехнике, докрывают во модность ее

воздшшевния в Воронежской области. Даде при относительном несовершенстве нынешней высоколи эиновой кукурузы, общий экономический баланс положителен и он будет нэпрерыано возрастать tío мере ее усовераенствованид, преодоления психологических барьеров и улучшения планирования экономики сельского хозяйства.

8. ВЫВОДУ

1. Открыта специфическая корреляция гледду отклонением частот встречаемости аминокислот в белке зерна и его фракциях у Og-и фл^-аналогов в сравпении о портальными, с одной стороны, я вероятностями пспользования пурлногш: и пирямидшювых вуклеотядов синонимическими кодопши шс-шиао кислотного кода, о другой.

2. На основе этой сопряженности, теоретических расчетов, экспериментальных и литературных данных постулируется избирательное разложение РНК-азши поцудшцш м-иК у с^-фор*, которое де-тераинируется отношением в ней А+Г : Ц+У. Динамическое равновесие между образованием комплекса (рибосома ы-ИЕК) и его распадом , смещено » сторону образования этого комплекса о м-ШС пургг-кового тина.

3. Направленность изменений метаболизма азотсодержащих и фосфоросодержащих соединений под действием гена опак-2 свидетельствует о специфической заторможенности синтетических процессов. Меченые аминокислоты АГ-тлпа ималя более высокую относительную интенсивность включения в белки о^-аналогов в сравнении с портальными, а ЦУ-типа наоборот - более низкую, обнаруживаются различия

в интенсивности включения меченых азотистых оснований в общую ШК изогенкых аналогов.

■ 4. Установлена отрицательная корреляция между частотами ' встречаемости аминокислот в тотальном балке и его фракциях, с одной стороны, и затратна ¿Ti на синтез аминокислот, их свободной внутренней анергией сгорания и молекулярной «accoñ, с другой стороны. Зеиновая фракция ослабляет эту связь, а влияние на нее му-тантного генотипа незначительное. Замещение ее в результате се-лекщкигного использования нутактов опак-2 п флаурн-2 приводив к потере зерновкой энергии в азота, которые дотакы удовлетворять потребности молодого растения. Более питательные белки требуют и больших'биоенергетических затрат.

5. Введение гена опак-2 в геном |укуйгзы сокращает общее _ у-число нежелаяедьных о селекционной точки зрения корреляционных связей между частотами встречаемости незаменимых аминокислот в.' тотальном балке зерна и эндосперма, но spa этом дополнительно образуется и одна новая — между валпном и взолейцином.

9. ПВДЛМИПЙ ... . *.

X. В Центральночерноземной зоне возможно создание о^-ана-логов раннвспашх гибридов с высокой кордовой ценность»,. не уо- ■■ тупаищсс по продуктивности обнчннм форлам. Плейотропкый биохимический эффект мутации опаи-2.наследуется, может быть усилен,, депрессия масс« зерновки уменьшена путем правильного подбора генотипов, переводимых на мутантную основу. . • ' .

2. при создании о^-аналогов сортов п линий достаточно про-, . вести 2-х кратный внутрисортовой.и внутрилшейшй отбор, чтр по- ■ ■

• зволат избежать ошибок в выделении высоколиэиновых сшей и ¿од- * линий, в то время как 4-х кратный отбор не повышает уровень ли-. зина в данном потомстве, при 2-х кратном отборе в пе;рвый год опыта па основе химического анализа выделяются высок ^лизшовыэ семьи и подлип пи,* во второй год - проводится размножение выделенных -сортообразцов и повторный биохимический контроль лизина. В даль-;, иейпем семьи и подлинна, сохранившие этот признак., объединяются. ■

3. В результате отборов ва высокое содержание лизина очень

' вероятно получение форм с дефицитом белка ш содержанию изолей- ■ „ цина, поэтому биохимический контроль в процессе селекции должен обязательно включать и тест на изшгайцив. , ;

4. В связи с тем, что у эеянов выше концентрация.азота, чем у других фракций, и эта фракция сильно рудушт^ювана у с^-анало-гов, следует сделать переоценку коэффициента перевода азота на , енрой белок. Для нормальной следует взять коаффицивнт-пересчета 0,28, а дам о^-форгл - 6,14. :

5. рекомендуется для внедрения во всех хигядао-еналитичееккх ' лабораториях Селекцентров, ведущих серийные анализы селекционного материала, способ ускоренного.определения лизина с выходом на аминокислотные анализаторы. В основе его особенность еьвшокислот-ного спектра малой колонки, позволившая при детекции одного пика лнзнна ого переживание д дублирование, что со1фащает в l,g раза время при сэрийном анализе методом классической ионообменной хроматографии, :

'10. ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ ДИССЕРТАЦИИ ОПУБЖКОВАНЕ1

в ашгатащ работах:

1. Агвфонов Н.С., Куюво-Д A.A.» Гладких Л .И. Влияние ингибиторов белкового обмена.на накопление аминокислот в зерне, дозревающем в культуре ткани // тез. докл. Всесооз. семинара, Казань, ноябрь, 1972 г./фзэиол.-биохш. щюцесси, определязссшо Ееллтану и качество урожая у пшеница и др. Колосовых злаков. -Казаны Из-во 0, ig72. - с. 10(3-103.

2. КутовоЙ АЛ,, ЩгетгчкиЙ A.B., Шевченко Л.М., Гладких Я.И. Полуавтоматический анализатор лизина // физиология и биохимия - ■ ' культурных растений. - 1973. - T. S, вып. 2; - о. 207-210. .

3. Агафонов U.C., котова ГЛ., Кутовой A.A., Шевченко В.Е. Биосинтез белка у изогеташх гибридов кукурузы вуковииский 2 под влиянием гепа oneibt-2 // Вест. с.-х. наука. - 1073, - ü е. — -о. 30-33. -

4. Кутовой A.A. Ускоренное определение лизина на автоматическом анализаторе аминокислот НД-1200Е // С.-х. биология. - -

1974* - t. 9, »I. - с. 146-147.

5. Рекомендации по увеличению производства и повышению эффективности использования белка в сельсхсм хозяйстве ВДЗ/н.И. Иванов, А.И .Туровский, в. Е. Шевченко и др. в т.ч. А.А.Кутовой. *-редкая.:'В.Т.Турбин, и .в .Турбин /отв. ред./ и др../ - Тр. ВАС2ШЛ -Ц.: Колос, 1974. - 64 с.

6. Кутовой A.A., Агауонов u.c. К вопросу о механизме синте-

' эа- задасвых белков у о2-аналогов кукурузы // сб. науч.' тр. /1ШСХ ЦЧП им.. В.В .Докучаева. - Каменная отепь,1Э75. - т. 9, вып. Iî Селекция'к семеноводство,* Запита растений. - с. II-I6.

7. Кутовой A.A. К вопросу техники проведения колоночной жидкостной зршатографш! // Тт иэ. - с. 73-76.

8. Котова Г.П., Кутовой A.A. » Рябцева Ш.Т. Создание высоко-лпзиновой кукурузы // Тем же.'- с. IIS-121.

9. Кутовой A.A. Вклпчашю мечеянх шшгэшелот во фраодии белков созревающего зерна нормальной л с геном орадж-2 кукурузп // Актуальные проблемы генетики и селекции: Тез." обл. науч. кон-$ер. Воронежского отд. ВОГиС игл. H .И.Вавилова, ноябрь 1976. -Воронеж: ИЗ-во В1У, 1976*. - с. 19-20.

10. Мартынов B.II., Штапько И .П., Тутовой A.A., Лобанова Б. А. Использование шеоколкз иловой кукурузы в составе корыостлесей при виргищваз' ai ц откорао свиней /Д1ауч. тр. ЛП1НСХ ЦЧП км. В .В .Докучаева. - Каленная степь, 1977. - Т. 14, выи. 41 Производство продуктов животноводства ва прошжпекпой основе, - с. 121-129.

-

IX. Котова Г .и.. Кутовой Д. А.. ЯДенко В.В. Влияние отбора -на содержание лизина в зерне создаваемых бысокодлзинобых сортов кукурузы // науч, тр. ЛШИСЭС ВДП им. В.В.Докучаева. - каменная v степь, 1900. - Г. 17, вып. э: Геает. фиэиол. и шикунол,. основы селогаши и семеноводства нолевых культур в ЦЧЗ. - с; 82-66*

12. кутовой A.A., Ядекко В .В. Биохимическая характеристика новых сортов Централшо-Черюзшлного Селевдентра // Науч. тр.,,

/ 1ШСХ ЦЧП им. В.В.Докучаева: Селекция полевых и кодовых культур в 1(43. - Каменная степь, 1982* - С. 144-148. ' ,

13. Кутовой A.A. О взаимосвязи НОС - аминокислотного кода

и проявлением мутации овак-2, у-кукурузы /Дез, 5 реоп. /Res. ССР/ конф. /Физиологические основы повышения продуктивности и ytrofl-' чивости зерновых культур. - Целиноград, I9&4, - с. 57-68.

14« Кутовой A.A. Электрофоротаческие спектры зеина высоко- ' лизлношх аналогов кукурузы //Йауч.'тр. / 1ЩСХ ЦЧП им. В .В. До. кучаева: Науч. основы селекции о.-х. культ, в 1ПЗ. - Каменная степь, 1985. - С, 74-S0.

15. Кутовой ¿.А.,, Котова Г.П. изменчивость аминокислотного■ состава белков зерна кукуруза в процессе его гон этического ♦улучшения //физиология и биохимия культ. раотениЗ, 1987. -Т. 19. вш. 4. - С, ЗУ^-З*?.

Формат 60x90 1/16. Офсетная лаборатория В1У.