Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологическое состояние лососевых рыб при использовании биотехнологий

ВАК РФ 03.02.06, Ихтиология

Автореферат диссертации по теме "Физиологическое состояние лососевых рыб при использовании биотехнологий"

На правах рукописи УДК 597-11:597.553.2

Ганжа Екатерина Викторовна

ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИОТЕХНОЛОГИЙ

Специальность 03.02.06 - ихтиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук

1 МАР Ш

Москва-2012 г.

005015678

Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП «ВНИРО»)

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор

Микодина Екатерина Викторовна ФГУП «ВНИРО»

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Шатуновский Михаил Ильич ФНБУ ИПЭЭ РАН

кандидат биологических наук Метальникова Ксения Владимировна

ФГУП «ВНИРО»

Ведущая организация: Биологический факультет Московского

государственного университета им. М.В. Ломоносова (МГУ)

Защита состоится «_16 » марта 2012 г. в 11 часов на заседании диссертационного совета Д 307.004.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП «ВНИРО») по адресу: 107140, г. Москва, ул. Верхняя Красносельская, д. 17.

Факс 8-499-264-91 -76, электронный адрес зес!оуа@vniro.ru

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института рыбного хозяйства и океанографии.

Автореферат разослан «_15_»_февраля_ 2012 г.

Учёный секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук

М.А. Седова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В ихтиологии существуют методы, позволяющие направленно изменять некоторые свойства рыб, в том числе физиологические: гибридизация и селекция (Николюкин, 1952, 1972; Бурцев, 1983; Черфас, Цой, 1984; Кирпичников, 1987), гиногенез (Черфас, Илясова, 1980; Грунина и др., 1998; Бадртдинов и др., 2008; Thorgaard, 1983; Thorgaard et al., 1981; Ihssen et al., 1990), полиплоидизация (Гомельский, Грунина, 1988; Арефьев, 1998; Васильев и др., 2005; Benfey, 1996; Piferrer, 2001; Koenig et al., 2011), инверсия пола (Гомельский, Черфас, 1982; Метальникова, 1992, 1995; Thorgaard, 1983; Chevassus et al., 1988; Piferrer, Donaldson, 1991; Piferrer et al., 1993; Krisfalusi, Cloud, 1999). Зачастую эти методы применяют в аквакультуре (Hulata, 2001) как биотехнологии для увеличения объёмов продукции рыбоводства и решения глобальной продовольственной проблемы в будущем. Трансгенез - биотехнологическое новшество, создающее генно-модифицированные (ГМ) организмы (Арефьев, 1998; Кузнецов и др., 2004; Pandian, 2001), в том числе, для применения в агропромышленном комплексе и рыбоводстве в составе комбикормов (Ганжа и др., 2011). Риски использования ГМ источников (ГМИ) в кормах связывают с возможными непредвиденными эффектами, обусловленными целенаправленным переносом искусственной генной конструкции в донорский организм (Жученко, 2003; Куликов, 2004; Cellini et al., 2001; Diao et al., 2006). Использование такого сырья в комбикормах может негативно повлиять на физиологическое состояние рыб как их потребителей (Herme et al., 2005; Sagstad et al., 2007).

Влияние традиционных и новых биотехнологий на рыб можно оценивать по биохимическим показателям, характеризующим протекающие внутриорганизменные реакции (Шатуновский, 1987; Tietz et al., 1995). Количественные и качественные изменения этих показателей, обусловленные геномными, гормональными и иными манипуляциями, характеризуют адаптивный ответ особи (Карпевич, 1998; Назаренко, Кишкун, 2000), и могут быть использованы как маркёры её физиологического состояния.

Биохимические маркёры гидробионтов уже применяют в водной токсикологии (Немова, Высоцкая, 2004; Немова, 2005; Цветков, 2009; Немова и др., 2011), детально изучены свойства многих белков крови рыб (Лукьяненко, 1971; Андреева, 1997). Биохимические показатели рыб в большинстве случаев оценивают трудоёмкими аналитическими методами, а данных, полученных экспресс-методами, ещё недостаточно для комплексной оценки их физиологического состояния, в том числе при использовании различных биотехнологий. Поиск новых достоверных маркёров функционального состояния рыб - объектов биотехнологий, и создание их референсных каталогов остаётся актуальной задачей.

Целью настоящей работы является комплексный анализ физиологического состояния лососевых рыб в связи с применением различных биотехнологий.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) оценить влияние окружающей среды на физиологическое состояние самок радужной форели ОпсогЬупскж тук'т (=Рага$а1то тук'ш) разной плоидности в высокогорных условиях тропиков;

2) определить биохимические и цитометрические показатели диплоидной и триплоидной гиногенетической радужной форели;

3) охарактеризовать по биохимическим показателям физиологическое состояние самок триплоидной радужной форели из однополого стада после гормональной инверсии пола;

4) изучить биохимические показатели производителей кижуча ОпсогЬупсЬш к'ичшск во время нерестовой миграции;

5) оценить наличие/отсутствие ГМИ в рыбных комбикормах, используемых в отечественной и зарубежной аквакультуре.

Научная новизна. Впервые проведён комплексный анализ физиологического состояния лососевых рыб по ряду биохимических маркёров. Проведено сравнение по этим показателям самок однополой диплоидной и триплоидной радужной форели при культивировании в высокогорных условиях

южного Вьетнама, её триплоидных инверсантов, а также производителей кижуча из водоёмов, отличающихся гидролого-морфологическим режимом. Впервые выявлена иммунореактивность в крови лососевых рыб к специфическим факторам гуморального иммунитета и гонадотропным гормонам человека. Впервые проанализированы комбикорма для рыб на присутствие в их составе ГМИ.

Практическое значение. Подготовлены материалы для создания унифицированной референсной базы биохимических маркёров для комплексной оценки физиологического состояния ценных видов лососевых рыб. Рекомендованы проведение импактного мониторинга ГМИ в комбикормах для рыб, их маркировка подобно пищевой продукции и разработка методов и критериев оценки их воздействия на рыб.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на II международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов» (Москва, 2008), V международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), международной конференции «Arctic marine ecosystems in an era of rapid climate change» (Tramso, 2009); III международной конференции с элементами школы для молодых учёных, аспирантов и студентов «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010), Всероссийской молодежной конференции «Вклад молодых учёных в рыбохозяйственную науку России» (Санкт-Петербург, 2010), а также III международной конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб» (Борок, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, три из них в изданиях, рекомендованных ВАК.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Гиногенез, полиплоидизация, гормональная инверсия пола и специфические условия южного Вьетнама влияют на содержание биохимических показателей в крови радужной форели, характеризующих её

физиологическое состояние.

2) Производители кижуча из разных водоёмов, во время нерестовой миграции, отличаются по содержанию ряда биохимических показателей в крови.

3) Производители комбикормов часто включают в их состав ГМИ, не указывая этого в доступной форме, что является риском для физиологического состояния рыб, потребляющих такие корма.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 506 источников, из которых 308 на иностранных языках. Работа изложена на 189 страницах текста, содержит 10 рисунков и 21 таблицу.

Благодарности. Искренне благодарю моего научного руководителя д.б.н., профессора Е.В. Микодину за всестороннюю помощь и советы при работе над диссертацией. Приношу глубокую благодарность академику Д.С. Павлову (ИПЭЭ РАН), д.б.н. В.П. Васильеву (ИПЭЭ РАН), Нгуен Ти Хуан Ту (НИИ Аквакультуры №3, Республика Вьетнам) за предоставленную возможность сбора материала; д.б.н., профессору А.О. Касумяну и д.б.н. А.Б. Бурлакову (МГУ им. М.В. Ломоносова) за ценные советы; к.б.н. Е.Д. Павлову (ИПЭЭ РАН), * Во Тхи Ха (Российско-Вьетнамский Тропический Центр) за участие в совместной экспедиции; д.с-х.н. Я. Коуржилу (VURH JU, Чешская Республика) за предоставленные образцы комбикормов; сотрудникам ФГУП «ВНИРО»: д.б.н. Н.В. Кловач, к.б.н. Б.П. Смирнову, к.б.н. А.Г. Новосадову и A.B. Новосадовой за помощь в сборе материала.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Глава 1. Обзор литературы

Рассмотрены особенности физиологии рыб при манипуляциях с геномом и при искусственной инверсии пола. Приведены данные по основным биохимическим показателям крови рыб и их функциональным значениям на разных этапах жизненного цикла. Описаны способы внедрения генных

конструкций в организм-реципиент, оценены риски манипуляций с геномом, приведена правовая нормативная база по трансгенезу.

Глава 2. Материал и методики

Объектами исследования являлись радужная форель и кижуч (табл. 1). Материал по гиногенетической диплоидной (2п) и триплоидной (Зп) форели собран в 2009-2010 гг. на базе высокогорного (1485 м над уровнем моря) рыбного хозяйства в южном Вьетнаме, куда икру импортировали из США, Финляндии и Венгрии. Изучали инверсантов триплоидной радужной форели американского происхождения, на которую в раннем онтогенезе, воздействовали метилтестостероном (МТ) в течение 3.0 мес - инверсанты I (ИГ) и 2.5 мес - инверсанты II (ИИ). Контролем (К) послужили рыбы, выращенные из той же партии икры, не подвергавшиеся гормональному вмешательству. Кроме этого, в 2010 г. изучено потомство (вьетнамская генерация), полученное от скрещивания самок финского происхождения с самцами, завезёнными из северного Вьетнама.

Таблица 1. Характеристика материала

Вид Район сбора проб Год Пол Возраст Биологический анализ Содержание глюкозы БХ маркёры Цитомет-рия

Число рыб

Радужная форель Экспериментальное рыбоводное хозяйство Клонг-Кланх, при НИИ аквакультуры № 3 (RIA 3), Республика Вьетнам 2009 9 1+ 10 10 10 -

2010 0+* 18/20** 18/20** - -/20**

0+*** 21 12 12 12(6)****

1+ К 88 53 20 34(7)****

И1 60 48 20 -

1111 75 41 14 -

2+ 12 12 12 12(6)****

Кижуч р. Б. Воровская, западное побережье п-ова Камчатка 2007 с? 2.1-3.1 11 9 9 -

¥ 16 10 10 -

оз. Большой Вилюй, юго-восток п-ова Камчатка с? 1.1-2.1 24 12 12 -

? 1.1-3.1 41 12 12 -

Примечание: «БХ маркёры» - биохимические маркёры. Жирным курсивом выделены триплоидные рыбы. «-» - измерения не проводили; * - сеголетки вьетнамской генерации, ** - до слэша - количество рыб, исследованных в возрасте 5 мес, после слэша - в возрасте 7 мес; *** - сеголетки венгерской генерации.; **** - перед скобками измерение ядер эритроцитов (5483 измерения), в скобках - измерение площади эритроцитов и расчёт ядрно-плазмеиного отношения (351 измерение).

Кижуча изучали в период нерестовой миграции в устье р. Большая Воровская - дикая популяция, и на оз. Большой Вилюй вблизи Вилюйского лососевого рыбоводного завода (ВЛРЗ) - «вшнойское» стадо.

На форелевом хозяйстве измеряли температуру воды термодатчиками ¡Button DS-19229, содержание кислорода оксиметром Hanna HI 9147, pH -Hanna pHep HI 98128. Биологический анализ рыб, расчёт коэффициента упитанности по Кларк (КУ) и гонадо-соматического индекса (ГСИ) проводили по Правдину (1966). Цитометрию эритроцитов (площадь эритроцитов, диаметр и площадь их ядер) у форели измеряли при помощи программы Image J по рекомендациям Васильева с соавторами (Васильев и др., 2005) и Власова с соавторами (Wlasow et al., 2004). Ядерно-плазматическое отношение (ЯПО) рассчитывали по Апаликовой (2008). Цитометрию осуществляли на окрашенных азур-эозином по Романовскому мазках крови под микроскопом Leica DC при ув. 10x100. Статистическая обработка материала выполнена с использованием MS Excel 2003. Достоверность различий определяли по критерию Стьюдента.

В крови рыб изучали биохимические маркёры - показатели белкового метаболизма, гуморального иммунитета, гонадотропные и половые стероидные гормоны (табл. 1). Кровь прижизненно отбирали из хвостовой вены в пробирки с ЭДТА и центрифугировали 7 минут при 3000 об/мин, плазму хранили при минус 12-18 °С. Показатели определяли в трёх повторностях, используя биохимический анализатор Biochem SA (HTI, США), фотометр Immunochem-2100, инкубатор-шейкер Immunochem-2200 и мойку Immunochem-2600 (HTI, США). Концентрацию глюкозы в цельной крови измеряли глюкометром Ascensia Entrust (Bayer).

Анализ ГМИ растительного происхождения в 17 отечественных и 16 импортных комбикормах проведён в аккредитованной лаборатории ООО «Компания Биоком» методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с применением «сухих» наборов реагентов «RT-ПЦР-ядро» в амплификаторе SMART-Cycler II. В образцах определяли маркёры ГМИ (355-промотор и NOS-

терминатор), которые идентифицировали с помощью праймеров сои линии 403-2, кукурузы линии MON 810 и GA21. Для количественного определения использовали маркёры ДНК сои и ДНК ГМО сои линии 40-3-2 (табл. 2).

Метод изучения кормов Год

2006 2007 2008 2009 2010

Выявление маркёра трансгенеза 6* 6 4 12 5

Идентификация трансгена 3 3 - 5 -

Количественное выявление трансгена 3 3 - 5 -

Примечание: * — количество образцов; идентификацию и количественное определение трансгена осуществляли только при выявлении маркёра траисгенеза.

Глава 3. Физиологическое состояние радужной форели при культивировании в условиях южного Вьетнама

3.1. Абиотические условия выращивания радужной форели

Радужную форель культивировали в прудах с каскадным типом водоснабжения и водозабором из двух горных речек, при стабильном фотопериоде (12 ч ночь: 12 ч день). Средняя температура воды с апреля по июнь составляла на водозаборе 18.0 (16.5-20.2) °С, а в последнем пруду каскада - 20.8 (17.5-26.7) °С, что приемлемо для выращивания сеголеток форели, но не для её созревания, размножения и развития в раннем онтогенезе (Голованов и др., 1992; Зеленников, 1999; Peterson, Meador, 1994; Pankhurst et al., 1996; Pornsoping et al., 2007). Более того, зарегистрированная максимальная температура воды считается критической даже для выживания данного вида (Rodgers, Griffiths, 1983). В течение суток температура в прудах изменялась на 5 °С, со значительным ассиметричным смещением суточных температур: максимум наблюдался с 15 до 16 час, минимум - утром с 6 до 8 час, по сравнению с условиями в естественном ареале вида (Голованов и др., 1992; Sutterlin, Stevens, 1992). Среднее содержание кислорода в воде утром было выше (6.6-7.1 мг/л), чем днём (7.0-8.5 мг/л). Часто содержание кислорода снижалось до 5.4 мг/л, что можно считать границей толерантности для выживания радужной форели. Средний рН варьировал около 7, соответствуя норме.

3.2. Биологические показатели и анатомические нарушения диплоидной и триплоидной радужной форели

Биологические показатели диплоидных сеголеток вьетнамской генерации достоверно увеличивались (р<0.001) с возрастом (табл. 3). КУ у рыб этих возрастных групп был близким к 0.9 % (р>0.05). Триплоидные сеголетки форели были достоверно крупнее (р<0.001), чем диплоидные в 5-ти и 7-ми месячном возрасте, КУ сеголеток разной плоидности практически не различался. Гонады у этих рыб представлены тонкими непрозрачными тяжами массой менее 0.1 г. Диплоидные двухлетки были достоверно крупнее (р<0.001), чем триплоидные особи (табл. 3). Длина и масса инверсантов форели ИП были достоверно больше, чем у Я/ и у рыб в контроле (р<0.001); КУ выше у рыб, потреблявших МТ 2.5 мес, в контроле он самый низкий. Гонады у Зп форели в возрасте 1+ в основном представлены длинными тонкими непрозрачными тяжами с массой менее 0.5 г, в контроле только у одной особи она составляла 6.1 г. У инверсантов выявлены многочисленные морфологические аномалии половых желёз: перетяжки, фрагментация, различия между правой и левой гонадами по размеру. Их форма соответствует яичникам, а текстура - как у семенников.

Таблица 3. Биологические показатели исследованной радужной форели

Ъгоидность Происхождение Возраст Длина, см Масса, г Масса гонад, г КУ, %

2п вьетнамское 5 мес 11.8±0.22 17.1±0.69 _* 0.90 ±0.025

9.8-13.3 10.0-21.7 0.57-1.07

7 мес 14.8±0.21 35.3±1.53 0.94 ± 0.009

12.3-16.4 21.1-51.8 0.87-1.00

финское 1+ (2009 г.) 39.5 ±0.48 36.7-42.5 841 ±32.6 610-990 3.6 ±0.42 2.0-6.6 1.23 ±0.028 1.09-1.36

2+ (2010 г.) 49.4 ±0.67 46.0-53.4 1521 ±55.2 1200-1870 117.7 ±18.59 10.8-208.0 1.06 ±0.018 0.95-1.15

Зп венгерское 0+ 18.2 ±0.44 66.6 ± 4.20 1.00 ± 0.016

14.7-21.5 38.3-109.5 0.81-1.10

американское 1+ К 33.4 ±0.35 390 ±10.4 0.4 ±0.14 0.93 ±0.011

24.8-53.8.0 133-622 0.1-6.1 0.29-1.10

И1 33.5 ±0.37 26.2-39.0 409 ± 16.1 156-698 0.8 ±0.14 0.1-3.7 0.95 ± 0.022 0.67-1.96

ИП 36.2 ± 0.22 527 ± 11.7 1.6 ±0.23 1.00 ± 0.015

31.2-39.2 308-724 0.1-7.3 0.82-1.79

Примечание: Здесь и далее над чертой - среднее значение показателя и его ошибка, под чертой - пределы варьирования показателя. * - рыбы с массой гонад менее 0.1г.

У 2п трёхлеток радужной форели выявлена широкая вариабельность массы гонад (10.8-208.0 г), что обусловлено частичной овуляцией или тотальной резорбцией ооцитов текущей генерации. У некоторых особей началось формирование ооцитов следующей генерации.

У некоторых особей отмечены аномалии строения тела - асимметричное расположение плавников, полиморфные плотные образования под кожей, отсутствие одного или двух глаз.

3.3. Биохимические показатели крови радужной форели

Содержание глюкозы. У всех исследованных рыб выявлена гипергликемия - высокий уровень глюкозы (Г) в крови (табл. 4). У 2п форели (1+ и 2+) и Зп сеголеток содержание Г варьирует в меньшей степени (в 2-2.3 раза), чем у 2п сеголеток вьетнамской генерации и Зп двухлеток (в 5-8 раз). Диплоидные сеголетки в возрасте 7 мес имеют несколько большее (р>0.05) содержание Г, чем в 5 мес. Наименьшее содержание Г в крови выявлено у диплоидных двухлеток (р<0.05), наибольшее - у производителей (р<0.001).

Таблица 4. Содержание глюкозы (ммоль/л) в крови радужной форели

Диплоидная Триплоидная*

вьетнамская генерация (0+)* финское происхождение венгерское происхождение, 0+ американское происхождение, 1+

5 мес 7 мес 1+** 2+* К И1 И11

7.9±0.45 8.5±0.79 6.9±0.20 9.0 ± 0.44 7.4 ±0.37 12 ± 0.27 7.8 ±0.33 7.9 ±0.33

1.7-10,5 4.3-19.2 4.8-10.8 6.2-14.1 5.1-9.5 2.0-16.1 2.2-16.9 3.8-18.1

Примечание: * - содержание глюкозы в цельной крови; ** - содержание глюкозы в плазме.

У 2п и Зп двухлеток содержание Г в крови достоверно не отличается. У Зп радужной форели отмечено повышение концентрации Г в крови двухлеток (контрольная группа) по сравнению с сеголетками. Гормональные манипуляции при инверсии пола приводят к увеличению уровня Г в крови подопытных рыб, различия достоверны уже при использовании МТ в течение 2.5 мес (р<0.1) по сравнению с рыбами не потреблявших гормон. Высокая концентрация глюкозы в крови радужной форели разной плоидности, вероятно, обусловлена нарушением обмена веществ у стада в целом в связи с применяемой

технологией кормления, является индикатором хронического стрессового состояния организма, отражающего нестандартные условия выращивания.

Показатели белкового метаболизма. Наибольшая концентрация общего белка (ОБ) и альбумина (А) в крови выявлена у двухлеток (2п) финского происхождения (рис. 1). К возрасту 2+ ОБ снижается почти в 4 раза, А - в 7 раз (р<0.01), что, вероятно, связано с аномалиями в формировании репродуктивной системы. Полученные результаты соответствуют данным литературы, указывающим на зависимость этих показателей от возраста, пола и зрелости особи (Пустовит, Пустовит, 2005; Rehulka et al., 2005). Они характеризуют адаптацию организма к воздействиям внешних факторов, в том числе использование несбалансированного корма (Palmer, Ryman, 1972; Mlay et al., 2007; Inyang et al., 2010; Kopp et al., 2011). У всех Зп рыб среднее содержание ОБ и А сходно с 2п трёхлетками.

Рис. 1. Содержание 0 - общего белка (г/л) и 0 - альбумина (г/л) в крови радужной форели разной

плоидности (2п и Зп), в возрасте 0+, 1+, 2+, и при инверсии пола («К.у> - контроль, «ИЛ» - ииверсанты I, «И. II» - ииверсанты

П).

Выявлена отрицательная зависимость между содержанием ОБ и Г, и положительная - между ОБ и КУ, что, вероятно, обусловлено глюконеогенезом (Virtanen, 1987). Процентное отношение «ОБ : А» в плазме крови 2п рыб составляет 66.5% (1+) и 34.5 % (2+), у Зп сеголеток венгерского происхождения - 62.6%, у форели американского происхождения (К) - 54.3%, и по 38.3% у особей после инверсии пола - Ш, ИП. Видна тенденция к повышению этого показателя у триплоидных самок по сравнению с инверсантами и его снижение

при созревании самок (2п 2+). У всей изученной гиногенетической Зп форели отношение «ОБ : А» ниже, чем у диплоидной, культивируемой в субтропиках, по данным литературы (79.1%) (Уошейап е1 а1., 2010). Вероятно, снижение соотношения происходит за счёт увеличения глобулиновой фракции.

У диплоидной радужной форели в возрасте 1+ и 2+ выявлены различия в содержании креатинина (КР) (табл. 5), что может быть обусловлено качеством кормов. У 2п рыб выявлена положительная связь между содержанием КР и ОБ и отрицательная с А. У Зп рыб уровень КР варьировал в меньшей степени, чем у 2п. У инверсантов отмечено достоверное повышение уровня КР (р<0.01) и сужение пределов варьирования данного показателя по сравнению с контролем.

Таблица 5. Содержание маркёров белкового обмена в крови радужной форели

Показатель Диплоидная Триплоидная

финское п роисхождение венгерский источник, 0+ американское происхождение, 1+

1+ 2+ К И1 ИII

Мочевина, мг/дл 9.0 ±0.51 3.6-14.8 7.5 ± 1.01 1.7-23.7 6.6 ±0.39 1.7-12.9 10.0±0.39 4.4-16.8 7.8±0.42 2.8-13.7

Креатинин, мкмоль/л 20.8 ±3.67 234.6 ± 17.88 108.3 ±6.80 142.9 ± 9.92 196.6±8.99 199.4± 10.32

0.9-80.9 59.3-386.4 88.2-127.1 53.7-320.4 60.7-306.1 91.0-324.9

Примечание: * - показатель не измеряли.

Концентрация мочевины (М) в крови изученных рыб выше, чем у радужной форели, культивируемой в умеренной зоне (3.2^.6 мг/дл) (Kopp et al., 2011). Вероятно, это связано с качеством и количеством потребляемого корма, а также усилением метаболизма в организме пойкилотермных животных в высокогорных условиях тропиков. У триплоидов-инверсантов содержание М достоверно больше (р<0.05), чем в контроле. У триплоидов уровень М снижается с возрастом, а у подопытных рыб определена положительная дозозависимая связь продолжительности воздействия МТ с уровнем М (табл. 5).

Гуморальные факторы иммунитета. Содержание С-реактивного белка (СРБ) в крови 2п двухлеток радужной форели достоверно выше, чем у рыб из всех исследованных групп (табл. 6), причём оно снижается с возрастом и у 2п, и у Зп особей. Стоит отметить, что содержание СРБ, неспецифического маркёра воспаления, более 2.0 мг/л предполагает наличие патологии в организме

(Ramos, Smith, 1978; Liu et al., 2004; Ganzha, Mikodina, 2009). При отсутствии видимых симптомов заболевания, у большей части изученной форели, возможно, что воспалительный процесс локализован в пищеварительном тракте и обусловлен использованием комбикормов, разработанных для культивирования радужной форели в пределах естественного ареала, а также интенсивным режимом кормления.

Таблица 6. Содержание СРБ и иммуноглобулина Е в крови радужной форели

Показатель Диплоидная Триплоидная

финское происхождение венгерский источник, 0+ американское происхождение, 1+

1+ 2+ контроль Я/ ИИ

СРБ, мг/л 5.8 ± 0.69 0.3-18.6 1.6 ±0.08 0.6-2.7 1.5 ±0.09 0.3-2.5 1.1 ±0.08 0.0-3.2 2.0 ±0.08 0.7-3.8 1.8 ±0.07 0.2-2.5

IgE, мМЕ/мл 15.6 ±2.54 0.1 ±0.04 0.1 ±0.07 0.2 ± 0.06 0.2 ± 0.06 0.2 ± 0.09

0.0-83.0 0.0-0.9 0.0-1.6 0.0-1.6 0.0-2.4 0.0-1.9

Примечание: Здесь и далее по тексту нулевое минимальное значение показателя в знаменателе отражает предел чувствительности методик, использованных для выявления соответствующего биохимического маркёра (СРБ - 1 мг/мл, Ig Е - 5 мМЕ/мл), и не свидетельствует о полном отсутствии этого показателя в крови отдельных особей.

В крови радужной форели выявлена специфическая иммунореактивность к иммуноглобулинам (Ig) А, М, G и Е человека (табл. 6, рис. 2). Это указывает на наличие Ig данных классов, либо белков функционально аналогичных им у рыб. Известно, что в крови рыб содержатся иммуноглобулины (Лукьяненко, 1971; Микряков, 1991; Кондратьева и др., 2001; Андреева, Дмитриева, 2011), которые некоторыми исследователями разделены на классы: IgM или IgM-подобный белок, IgD, IgZ/IgT, IgW/IgX и IgH (Wilson et al., 1985; Koumansvandiepen et al., 1995; Warr 1995; Bernstein et al. 1996; Hordvik et al., 1997, 1999; Danilova et al., 2005; Hansen et al., 2005; Savan et al., 2005; Vasely et al., 2006). Однако существует мнение, что Ig рыб не распределяются на классы или признаётся существование только класса М (IgM-like) (Suzuki et al., 1997; Van Muiswinkel, 2008).

У радужной форели преобладает фракция IgG (рис. 2) и его количество уменьшается с возрастом у особей разной плоидности (pO.OOl). Отмечена положительная взаимосвязь содержания IgG с ОБ и А в крови. Количественно IgA достоверно (pO.OOl) преобладал у 2п двухлеток (рис. 2), у Зп был ниже,

чем у диплоидов. У инверсантов уровень Ig А и G ниже, чем в контроле (р<0.001), т.е. воздействие стероидного гормона (МТ) в раннем онтогенезе снижает выработку антител во взрослом состоянии (Suzuki et al., 1997; Hou, 2001).

210 180 150 12 0 — 90 — 60 -30 0

ЙЯ-

IgG

■ 2п 1+, финского происхождения

■ 2п 2+, финского происхождения Я Зп 0+, венгерское происхождение

□ Зп 1+, контрольная группа (США)

□ Зп 1+, инверсанты I (США)

■ Зп 1+, инверсанты II (США)

Ш

IgA

IgM

Рис. 2. Содержание Ig (мг/мл) классов G, А, М в крови радужной форели.

Общее содержание Ig в крови рыб взаимосвязано с условиями среды, что отмечено и другими исследователями (Zapata et al., 1992; Suzuki et al., 1997). Процентное распределение Ig у всей изученной форели в целом следующее: IgA - 10-20%, IgM - 2-15%, IgG - 70-85%, за исключением 2п 2+ - IgA и М -40%, a IgG - 20%.

IgE выявлен у менее половины изученных рыб, его содержание было незначительным, за исключением 2п 1+ (табл. 6), и, вероятно, отражает их индивидуальное состояние.

Содержание гонадотропных гормонов. В крови радужной форели выявлена иммунореактивность к фолликулостимулирующему (ФСГ) и лютеинизирующему (ЛГ) гормонам человека, являющихся аналогами гонадотропных гормонов (ГТГ) I и II у рыб, соответственно (Бурлаков, 2002; Макеева, 1992; Suzuki et al., 1988 a, b; Okuzava, 2002). ГТГ детектированы не у всех изученных рыб, за исключением ФСГ у 2п двухлеток - 15.7±5.80 (1.2^13.8) мМЕ/мл. У трёхлеток форели ФСГ найден только у 50% рыб и был низким (0.4+0.19 мМЕ/мл). ЛГ у 2п рыб в возрасте 1+ составлял 7.1±4.54 (0.0-44.3) мМЕ/мл (50% рыб), в 2+ - выявлен в небольшом количестве у 17% особей.

У триплоидной радужной форели ФСГ определён только у некоторых особей, его среднее содержание было максимальным у инверсантов II (2.1 мМЕ./мл) и достоверно не отличалось от контроля и других групп. ЛГ у триплоидов выявлен в следовых концентрациях и не у всех особей, однако у Ш его количество было меньше, чем у ИП (р<0.05). У отдельных триплоидных рыб ФСГ достигал 25.6 мМЕ/мл в 0+, у двухлеток - 7.5 мМЕ/мл (К), 9.7 мМЕ/мл (ИТ) и 38.2 мМЕ/мл (ИН), т.е. гонадотропный статус у особей одного возраста различается, на что указывал ещё Фёдоров (1997).

Содержание ГТГ у диплоидной радужной форели в возрасте 1+ достоверно выше (р<0.05) и варьирует в больших пределах, чем у одновозрастных триплоидов, что соответствует гормональному статусу у других триплоидных видов культивируемых рыб (Benfey, 1999; Tiwary et al., 2001).

Известно, что уровень ЛГ в крови рыб может изменяться от недетектируемого у молоди до высокого у рыб в преднерестовом состоянии, в то время как ФСГ выявляется на всех этапах онтогенеза (Макеева, 1992; Фёдоров, 1997; Swanson et al., 1991; Tyler et al., 1991, 1997; Amano et al., 1992, 1993). Вероятно, выявленный низкий уровень ЛГ у изученных рыб, связан с отмеченными патологиями в их гонадах. У производителей овуляция икры, видимо, приводит к снижению уровня ГТГ в их крови, а его сохранение индуцирует резорбцию части ооцитов в гонадах радужной форели уже на II-III стадиях зрелости (Павлов, 2011). Таким образом, выявленная концентрация ГТГ в крови радужной форели изученных групп отражает выявленные аномалии в строении половых желёз и их функционировании как у диплоидной, так и у триплоидной радужной форели.

Содержание половых стероидных гормонов. Половые стероидные гормоны - тестостерон (Т) и эстрадиол (Э) выявлены в крови радужной форели всех изученных групп, но их содержание значительно варьировало, за исключением Ту 2п особей в возрасте 1+ (табл. 7). У диплоидных рыб средняя концентрация Т и Э в крови трёхлеток возрастает на порядок (р<0.001) по сравнению с 2п двухлетками (см. табл. 7), что обусловлено созреванием их

гонад и соответствует данным литературы (Фёдоров, 1997; Груслова, 2004; Fostier, 1983; Suzuki et al., 1988). Вариабельность стероидных гормонов отражает индивидуальное состояние репродуктивной системы у отдельных особей. Высокий уровень Т у 2п самок, вероятно, связан с тем, что он является предшественником эстрогенов (Kuo et al., 1988; Saeed et al., 2010) и повышается при увеличении Э в крови 2+ рыб.

Таблица 7. Содержание половых стероидных гормонов в крови форели

Гормон Диплоидная форель Триплоидная форель

финское происхождение Венгерский источник, 0+ американское происхождение, 1+

1+ (2009 г.) 2+ (2010 г.) К Я/ ИII

т, нг/мл 5.6 ±0.09 5.1-6.1 45.3 ±17.24 3.4-191.7 124.9 ±21.05 18.0-434.4 8.2 ±0.38 2.7-16.3 87.2 ±18.46 6.9-814.5 12.0 ±1.36 5.0-67.0

э, пг/мл 51.7 ± 10.84 5.1-113.8 686.2 ±386.98 169.8-4901.6 94.9 ±4.05 63.1-161.0 88.7 ±4.25 67.2-183.9 109.4 ±6.17 67.5-227.4

Примечание: * - показатель не измеряли.

У Зп гиногенетической радужной форели самое высокое содержание Т выявлено у сеголеток, что, вероятно, обусловлено нарушением функционирования их репродуктивной системы в связи с использованием технологии триплоидизации (Benfey, 1999), либо неполным индуцированием гиногенеза, когда часть рыб может быть представлена самцами (Dillon, 1988). Содержание Т в крови Зп двухлеток радужной форели различно во всех группах (р<0.001) и варьирует в широких пределах (см. табл. 7). У III, потреблявших МТ 3 мес, Т значительно увеличивается по сравнению с контролем, что указывает на его накопительный эффект. Концентрация Э у ИЛ достоверно выше, чем у Ш (р<0.001) и варьирует в меньшей степени, чем Т. Следует отметить высокий уровень Э у Зп 1+, представленных стерильными особями (Павлов, 2011), по сравнению с 2п фертильными самками (1+), что свидетельствует о способности гормонсекретирующих клеток в гонадах триплоидов синтезировать половые стероиды даже при отсутствии половых клеток. Выявленную особенность секреторных клеток гонад Зп радужной форели мы не объясняем воздействием МТ в раннем онтогенезе в связи с низким качеством половых желёз в контрольной группе, не подвергавшейся его влиянию. У двухлеток Зп радужной форели среднее содержание Т и Э выше

(р<0.001), чем y 2n 1+. Это не соответствует данным литературы о том, что содержание половых стероидных гормонов в крови одновозрастных рыб у Зп меньше, чем у 2п (Benfey, 1999; Tiwary et al., 2001). По нашему мнению, данные различия связаны с пониженным содержанием ГТГ в их крови и с механизмом обратной связи в гормональной регуляции.

Другими факторами, влияющими на концентрацию исследованных гормонов у радужной форели различной плоидности, могут быть специфические условия её выращивания в условиях южного Вьетнама -фотопериод и температура. Показано, что нарушение фотопериода блокирует высвобождение ГТГ в кровь, несмотря на их синтез и накопление в гипофизе (Amano, 1993; Amano et al., 1997; Billard et al., 1978), нарушается ритмичность (Чазов, Исаченков, 1974; Радченко, 1993) и возникает гормональный дисбаланс. В результате дисбаланса происходит смещение сроков размножения, десинхронизация созревания половых продуктов, индивидуальная и групповая широкая вариабельность концентрации соответствующих гормонов, у радужной форели, которая является высоко пластичным видом (Игнатьева, 1975; Busack, Gall, 1980).

3.4. Цитоиетрические показатели эритроцитов радужной форели

У Зп радужной форели разного возраста цитометрические показатели эритроцитов достоверное больше (pO.OOl), чем у 2п рыб (табл. 8), за счёт дополнительного набора хромосом (Апаликова, 2008; Лебедева, 2007; Янкова, 2006; Wlasow et al, 2004; Woznicki, Kuzminski, 2002). Диаметр ядра эритроцитов у триплоидных сеголеток в 1.3 раза больше, чем у диплоидных (0+), а площадь самого эритроцита и его ядра - в 1.9 раз. У Зп двухлеток отмечено наибольшее варьирование этого показателя, и примерно 20% рыб имеют диаметры эритроцитов, сходные с таковыми у 2п, что, вероятно, связано с их триплоидией. Сходное ядерно-плазменное отношение (ЯПО) у 2п особей и Зп сеголеток указывает на морфологическую идентичность их эритроцитов, не смотря на отличающиеся размеры этих клеток. Увеличение ЯПО у Зп 1+

характеризуется уменьшением цитоплазматического материала относительно ядерного по сравнению с диплоидными и более молодыми особями.

Таблица 8. Цитометрические показатели эритроцитов

радужной форели

Плоид-ность Происхождение Возраст Диаметр ядра эритроцита, мкм Площадь ядра эритроцита (Б,,), мкм2 Площадь эритроцита (вэ), мкм2 ЯПО(—) Бэ

2п вьетнамское 0+ 5.6 ± 0.40 4.0-9.0 46.7 ±2.7 31.4-62.8 244.5 ±8.78 188.4-301.4 0.19± 0.014 0.12-0.30

финское 2+ 6.3 ±0.02 4.0-9.0 87.4 ±3.64 65.9-100.5 453.0 ± 16.44 376.8-552.6 0.19 ±0.008 0.14-0.25

Зп венгерское 0+ 7.4 ±0.03 5.5-9.4 88.3± 2.62 75.4-109.9 467.9 ± 11.41 395.6-552.6 0.18 ±0.004 0.16-0.21

американское (контроль) 1+ 8.9 ±0.04 6.0-14.0 145.5 ±4.93 113.0-172.7 657.5 ±51.71 379.9-1121.0 0.24 ±0.018 0.15-3.55

В крови Зп рыб обнаружены специфические нарушения эритроцитов, редко встречающиеся у диплоидов (\Vlasow е1 а1., 2004) - сегментированные ядра (5.8%у 0+, 9.6% у 1+), амитоз (1.9%-у 0+, 2.1%-у 1+).

Глава 4. Биологические и физиологические показатели производителей кижуча из разных водоёмов п-ова Камчатка Биологические показатели кшкуча. Во время нерестовой миграции средняя длина и масса тела у самцов дикого кижуча больше (р<0.001), чем у самок (табл. 9), их гонады находились на Ш-1У стадии зрелости. ГСИ у самок достоверно выше (р<0.001), чем у самцов, а КУ у диких самцов достоверно больше (р<0.001), чем у «вилюйских». Производители из оз. Б. Вилюй имели гонады на IV стадии зрелости, а ГСИ и КУ самок были выше (р<0.05), чем у самцов (табл. 9). ГСИ «вилюйских» производителей достоверно выше (р < 0.05), чем у диких.

Таблица 9. Биологические показатели производителей кижуча

Водоём Пол АС, см АО, см Масса, г ГСИ, % КУ, %

р. Б.Воровская самцы 64.9 ± 1.61 58.0-74.5 60.2 ± 1.56 54.0-70.0 3625 ±237.9 2844-5432 7.70 1.32

самки 63.3 ± 0.70 59.0-68.0 59.2 ± 0.64 55.0-63.5 3298 ± 110.7 2698^)231 10.98 1.30

оз. Б.Вилюй самцы 63.1 ±1.19 51.5-71.0 58.9 ± 1.10 48.5-66.5 2952 ± 177.1 1650-4220 23.30 1.15

самки 60.1 ±0.79 52.0-69.0 56.4 ±0.80 48.0-66.5 2811 ± 122.9 1560-4600 50.81 1.28

По устному сообщению Б.П. Смирнова в оз. Б.Вилюй преобладали особи в возрасте 2.1. В р. Б.Воровской возрастная структура производителей кижуча была сходной.

Биохимические показатели крови производителей кюкуча. Выявлена отрицательная взаимосвязь по содержанию ОБ и КР у самок и самцов производителей различного происхождения. Так, у самок дикого кижуча уровень ОБ ниже в 1.8 раз (р<0.001), а КР лишь несколько выше, чем у самцов и варьирует в больших пределах, в то время как у «вилюйского» кижуча наблюдается обратная зависимость. При этом, у диких самцов содержание ОБ и КР достоверно выше (р<0.05), чем у «вилюйских», а у самок из р. Б. Воровская достоверно больше лишь содержание креатинина (р<0.05). Вероятно, это связано с особенностями функционирования осморегуляторной системы диких рыб, выловленных в устье реки, где солёность воды может изменяться в течение суток от 0 до 25 %о, по сравнению с «вилюйским» кижучем, находившимся в воде солёностью от 8 до 20 %о в зависимости от глубины (Горин, 2007, 2009, 2012).

Средняя концентрация СРБ в крови самок и самцов кижуча одинакова, но у самцов варьирует в больших пределах. Уровень СРБ у дикого кижуча выше (4.7 мг/л), чем у «вилюйского» - 3.5 мг/л (р<0.05). У производителей из оз. Б. Вилюй выявлена положительная связь между СРБ и ГСИ, коэффициент корреляция у самок - 0.84 и у самцов - 0.94. Вероятно, величина этого показателя связана со степенью их созревания и продолжительностью нерестовой миграции. Среднее содержание ^Е у самцов дикого кижуча достоверно выше (р<0.05), чем у самок и «вилюйских» самцов (рис. За). Поскольку при биологическом анализе рыб не было выявлено большого количества паразитов, с которыми связывают данный показатель, мы предполагаем, что установленное содержание ^Е в их крови является нормальным для данного вида, и необходимо для высокой иммунной защиты организма во время совершения миграции и последующего нереста.

Титр антиядерных антител (титр-АНА), характеризирующий аутоиммунные заболевания, в крови кижуча выявлен впервые. У кижуча из обоих групп данный показатель превышает 1.1 и достоверно не различается, что указывает на наличие аутоиммунного процесса в их организме и согласуется с моноцикличностью этих рыб. У самок и самцов диких и «вилюйских» рыб титр-АНА незначительно различается (р>0.05), что свидетельствует об отсутствии половой специфичности проявления апоптоза.

, □ оз. Б. Вилюй

I р. Б. Воровская

□ оз. Б. Вилюй Пр. Б. Воровская

Самки

Рис. 3. Содержание (a) IgE (МЕ/мл) и (б) ФСГ (мМЕ/мл) в крови производителей кижуча из р. Б. Воровская и оз. Б. Вилюй.

Половая специфичность по содержанию ФСГ у дикого кижуча отсутствует, а у «вилюйских» самок концентрация ФСГ в 2.5 раза меньше (р<0.05), чем у самцов (рис. 36). У самцов из дикой популяции ФСГ в 3.6 раз выше (р<0.05), чем у «вилюйских», а у самок выше в 9 раз (р<0.05). Кроме этого, у «вилюйских» рыб выявлена положительная корреляция по содержанию ФСГ и ОБ (у самок - 0.67, у самцов - 0.70), что, вероятно, обусловлено завершением созревания их половых продуктов. Полученные результаты отражают динамику гонадотропных гормонов у диких производителей по мере приближения к завершающим этапам гаметогенеза. У рыб из оз. Б. Вилюй ФСГ завершает свою функцию, его концентрация резко снижается, и начинает преобладать ЛГ, регулирующий овуляцию и спермиацию. Среднее содержание ЛГ и пределы его варьирования в крови «вилюйских» самцов кижуча несколько выше, чем у самок, что отражает более раннюю готовность к нересту самцов.

Глава 5. Изучение комбикормов на наличие/отсутствие в их составе ГМИ

Важным аспектом, оказывающим влияние на физиологическое состояние культивируемых рыб, являются корма, содержащие сырьё растительного происхождения (Гамыгин, Щербина, 2006). В связи с интенсивным внедрением трансгенных технологий в промышленное растениеводство, наличием ГМИ в пищевой продукции и комбикормах для сельскохозяйственных животных (Сергеев и др., 2007), мы предположили возможность добавления ГМ компонентов в комбикорма для рыб (Микодина, Ганжа, 2008). Перед осуществлением оценки влияния экзогенных трансгенов на рыб потребовалось установить наличие их в кормах. Для этого выполнено изучение 33-х кормов, применяемых в пресноводной аквакультуре. В 11 образцах были обнаружены нуклеотидные последовательности, характеризующие присутствие ГМИ растительного происхождения - 355-промотор и М?5-терминатор (рис. 4). Подавляющее число (более 90 %) комбикормов, содержащих ГМИ, были зарубежного производства, и только один корм — отечественный.

I $ 5 --п-гт--

4,5

Карповые корма Осетровые корма Лососевые корма

Рис. 4. Процентное содержание ГМ сои линии 40-3-2 (ГМ картофель и ГМ кукуруза в образцах не выявлены) в комбикормах разного типа.

При идентификации маркёров трансгенеза было обнаружено, что трансгенным компонентом кормов является ГМ соя линии 40-3-2 или Roundap Ready, разработанная в 1995 г. компанией «Monsanto Со» (США). Соя данной линии устойчива к большим дозам системного гербицида - глифосата, известного под торговой маркой Roundap, и способна аккумулировать его в своих тканях (Ганжа и др., 2011). Наибольшее количество трансгенной сои

обнаружено в кормах для карповых рыб (более 5%), в осетровых - оно не превышает 0.4%, наименьшее - в кормах для лососевых рыб, по количеству расценённое нами как контаминация (рис. 4).

В РФ обязательна маркировка только пищевой продукции, полученной с использованием ГМИ, если их содержание составляет 0.9 % и выше (СанПиН 2.3.2.1078-01, СанПиН 2.3.2.1842-04). На упаковках всех исследованных кормов отсутствовала маркировка о наличии/отсутствии ГМИ, поскольку комбикорма не являются пищевыми продуктами и не регулируются соответствующими нормативами независимо от выявленного количества ГМИ. Этим пользуются некоторые фирмы-производители, не приводя таких сведений (Ганжа и др., 2011). Более того, иногда комбикорма, в составе которых указана соя, в действительности не содержат этот ингредиент (Микодина, Ганжа, 2008). Это свидетельствует о недобросовестности производителей, относительно предоставления информации о составе кормов и риске их применения в рыбоводстве. Тем не менее, продукция, полученная с применением ГМИ или содержащая такие организмы, для использования в сельском хозяйстве подлежит регистрации Россельхознадзором (Приказ Минсельхоза РФ № 466 от 06.10.2009 г.; постановление Правительства РФ № 327 от 30.06.2004 г. в редакциях) с выдачей сертификата соответствия (ФЗ № 313 от 30.12.2008). На данный момент в РФ для нужд рыбоводства зарегистрированы соевый шрот из сои линии 40-3-2 (учётная серия №77/32-A3-2.8/00109, регистрационный №КГМ-АЗ-2.8/0090), и корм «Адлер Форель», содержащий сою этой же линии (учётная серия №19/208-Е1-2.8/00113, регистрационный № КГМ-Е1-2.8/0094). Таким образом, соя линии 40-3-2, выявленная в изучаемых образцах, является разрешённым ГМ сырьём, но данные корма не внесены в реестр Россельхознадзора, а последствия их применения на физиологическое состояние рыб-потребителей остаются неизвестными.

Риск наличия сои линии 40-3-2 в комбикормах для рыб заключается в изменениях её метаболических качеств за счёт модификации генома (Herme et al., 2005; Nielsen et al., 2005; Ermakova, 2006, 2007; Sagstad et al., 2007) и

негативном воздействии глифосата, накопленного в её тканях (Горовая, 2011), на физиологию организма (Жиденко, 2009, 2011; Голованова, Папченкова, 2009; Папченкова и др., 2009). Оценка физиологической реакции рыб при потреблении ГМ кормов затруднена из-за сложности приобретения трансгенных организмов и их чистых линий для грамотной постановки эксперимента. В этой ситуации важными критериями могут стать биохимические маркёры, характеризующие функциональный статус рыб и его изменение. При исследовании радужной форели и кижуча из «вилюйского» стада учитывали, что в использованных при их культивировании комбикормах ГМИ нами не выявлены. Это позволяет рекомендовать полученные нами биохимические маркёры как фоновые для импактного мониторинга последствий применения трансгенных источников в аквакультуре и разработке сертифицированной методики оценки этого предполагаемого риска.

ВЫВОДЫ

1. Гиногенеические диплоиды радужной форели (1+), выращиваемые за пределами ареала, достоверно отличаются от гиногенетических триплоидов (1+) повышенным содержанием в крови общего белка, альбумина, С-реактивного белка, иммуноглобулинов А, в, М и Е, лютеинизирующего и фолликулостимулирующего гормонов, и, напротив, пониженной концентрацией креатинина, тестостерона и эстрадиола.

2. У двухлетних гиногенетических триплоидов радужной форели после воздействия метилтестостероном в крови достоверно увеличено содержание креатинина, мочевины, С-реактивного белка и тестостерона, но понижен уровень иммуноглобулинов А и С.

3. При инверсии пола у триплоидов гиногенетической радужной форели под воздействием экзогенного метилтестостерона в течение 2.5 мес. происходит нормализация метаболических и регуляторных гормональных показателей. При аналогичном воздействии в течение 3 мес. эти процессы менее выражены.

4. Постоянный фотопериод и высокая температура воды при культивировании радужной форели независимо от её плоидности, возраста и гормональных манипуляций приводят к хроническому стрессу и гормональной дисфункции в организме.

5. Показатели белкового обмена и факторы иммунитета у кижуча из р. Большой Воровской выше, чем из оз. Большой Вилюй, что характеризует динамику нерестовой миграции, а содержание ФСГ отражает его готовность к нересту.

6. В крови исследованных групп радужной форели и кижуча выявлена иммунореактивность к специфическим факторам иммунитета и гонадотропным гормонам человека, что указывает на наличие у рыб функционально аналогичных белков.

7. В 30% рыбных комбикормов, из которых 90% произведены за рубежом, выявлена трансгенная соя линии 40-3-2, что может представлять риск для функционального состояния рыб-потребителей.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК

Микодина Е.В., Ганжа Е.В. 2008. Генетически модифицированные источники в искусственных кормах для рыб // Рыбное хозяйство. №2. С. 84-87.

Сытова М.В., Харенко E.H., Микодина Е.В., Ганжа Е.В., Дмитриева Е.А. 2009. Показатели безопасности и содержание генетически модифицированных источников овариальной жидкости осетровых рыб // Рыбпром. №1. С. 39-42.

Ганжа Е.В., Банникова М.А., Фёдорова JI.M., Микодина Е.В. 2011. Аквакультура и трансгенные технологии: области применения и проблемы безопасности (обзор) // Сельскохозяйственная биология. № 4. С 16-30.

Публикации в прочих изданиях

Ганжа Е.В. 2008. Биохимические показатели крови тихоокеанских лососей р. Большая Воровская (Западная Камчатка) // Повышение эффективности использования ВБР. М.: ВНИРО. С. 197-200.

Микодина Е.В., БурлаченкоИ.В., Волков А.А., Ганжа Е.В., Банникова М.А. 2009. К вопросу о прослеживаемости ГМИ в продукции рыбоводства // «Биотехнология состояние и перспективы развития». Ч. 2. С. 112-113.

Микодина Е.В., Ганжа Е.В., Павлов Е.Д. 2010. Некоторые биохимические показатели двухгодовиков триплоидной радужной форели в условиях южного Вьетнама // Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов. Петрозаводск: КарНЦ РАН. С. 117-119.

Ганжа Е.В., Банникова М.А. 2010. Генетически модифицированные организмы (ГМО): новый глобальный вызов для аквакультуры // Труды ВНИРО. Т. 148. С. 86-104.

Ганжа Е.В., Микодина Е.В., Во Тхи Ха. 2010. Некоторые показатели иммунитета радужной форели Oncorhynchus mykiss, выращенной при воздействии постоянно высоких температур // Тез. докл. Всерос. молодежной конф. «Вклад молодых ученых в рыбохоз. науку России». СПб. С. 35-38.

Ганжа Е.В. 2011. Некоторые показатели иммунитета триплоидной радужной форели Oncorhynchus mykiss при её культивировании в условиях южного Вьетнама // Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб. Борок-Москва. С. 90-94.

Ganzha Е., Mikodina Е. 2009. Blood Serum Proteins of Pink, Chum, Coho and Sockeye Salmons from Two South Kamchatka Water Bodies // Arctic marine ecosystems an era of rapid climate change. Tramso. P. 124.

Подписано в печать 09.02.2012 Объем 1,5 п.л. Тираж 100 экз. Заказ № 117

Издательство ФГУП «ВНИРО» 107140, Москва, В. Красносельская, 17

Текст научной работыДиссертация по биологии, кандидата биологических наук, Ганжа, Екатерина Викторовна, Москва

61 12-3/626

Федеральное агентство по рыболовству

Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии (ФГУП "ВНИРО")

На правах рукописи УДК 597-11:597.553.2

ГАНЖА ЕКАТЕРИНА ВИКТОРОВНА

ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ ЛОСОСЕВЫХ РЫБ ПРИ ИСПОЛЬЗОВАНИИ БИОТЕХНОЛОГИЙ

Специальность 03.02.06 - ихтиология

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Е.В. Микодина

МОСКВА-2012

ОГЛАВЛЕНИЕ

ВВЕДЕНИЕ.............................................................................................................4

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.....................................................................8

1.1. Гиногенез и триплоидизация рыб...................................................................8

1.2. Искусственная гормональная регуляция пола у рыб..................................11

1.3. Искусственное воспроизводство тихоокеанских лососей..........................14

1.4. Биоинженерия в аквакультуре......................................................................16

1.4.1. Биобезопасность и риски использования ГМО........................................21

1:4.2. Законодательный аспект использования ГМО........................................25

1.5. Изучение физиологического статуса рыб....................................................28

1.5.1. Основные биохимические показатели рыб...............................................31

1.5.2. Физиологическая характеристика триплоидных рыб............................39

1.5.3. Влияние наличия ГМО в кормах на физиологию гидробионтов.............41

1.5.4. Особенности физиологии трансгенных рыб............................................45

1.6. Биология радужной форели...........................................................................46

1.7. Биология кижуча.............................................................................................48

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ.........................................................52

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ..................................................................62

ГЛАВА 3 ФИЗИОЛОГИЧЕСКОЕ СОСТОЯНИЕ РАДУЖНОЙ ФОРЕЛИ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ В УСЛОВИЯХ ЮЖНОГО ВЬЕТНАМА..........................................................................................................62

3.1. Абиотические условия выращивания радужной форели...........................63

3.2. Биологические показатели и анатомические нарушения диплоидной и триплоидной радужной форели...........................................................................68

3.3. Биохимические показатели крови радужной форели.................................73

3.3.1. Содержание глюкозы..................................................................................74

3.3.2. Показатели белкового метаболизма.........................................................78

3.3.4. Гуморальные факторы иммунитета........................................................85

3.3.5. Содержание гонадотропных гормонов....................................................93

3.3.6. Содержание половых стероидных гормонов...........................................97

3.4. Цитометрические показатели эритроцитов радужной форели................105

ГЛАВА 4. БИОЛОГИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПОКАЗАТЕЛИ ПРОИЗВОДИТЕЛЕЙ КИЖУЧА ИЗ РАЗНЫХ ВОДОЁМОВ П-ОВА КАМЧАТКА................................................................110

4.1. Биологические показатели кижуча.............................................................110

4.2. Биохимические показатели крови производителей кижуча....................113

ГЛАВА 5. ИЗУЧЕНИЕ КОМБИКОРМОВ НА

НАЛИЧИЕ/ОТСУТСТВИЕ В ИХ СОСТАВЕ ГМИ...................................119

ЗАКЛЮЧЕНИЕ.................................................................................................128

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ........................................................132

ВЫВОДЫ............................................................................................................133

ЛИТЕРАТУРА....................................................................................................135

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы. В ихтиологии существуют методы, позволяющие направленно изменять некоторые свойства рыб, в том числе физиологические: гибридизация и селекция (Николюкин, 1952, 1972; Бурцев, 1983; Черфас, Цой, 1984; Кирпичников, 1987), гиногенез (Черфас, Илясова, 1980; Грунина и др., 1998; Бадртдинов и др., 2008; Thorgaard, 1983; Thorgaard et al., 1981; Ihssen et al., 1990), полиплоидизация (Гомельский, Грунина, 1988; Арефьев, 1998; Васильев и др., 2005; Benfey, 1996; Piferrer, 2001; Koenig et al, 2011), инверсия пола (Гомельский, Черфас, 1982; Метальникова, 1992, 1995; Thorgaard, 1983; Chevassus et al., 1988; Piferrer, Donaldson, 1991; Piferrer et al., 1993; Krisfalusi, Cloud, 1999). Зачастую эти методы применяют в аквакультуре (Hulata, 2001) как биотехнологии для увеличения объёмов продукции рыбоводства и решения глобальной продовольственной проблемы в будущем. Трансгенез — биотехнологическое новшество, создающее генно-модифицированные (ГМ) организмы (Арефьев, 1998; Кузнецов и др., 2004; Pandian, 2001), в том числе, для применения в агропромышленном комплексе и рыбоводстве в составе комбикормов (Ганжа и др., 2011). Риски использования ГМ источников (ГМИ) в кормах связывают с возможными непредвиденными эффектами, обусловленными целенаправленным переносом искусственной генной конструкции в донорский организм (Жученко, 2003; Куликов, 2004; Cellini et al., 2001; Diao et al., 2006). Использование такого сырья в комбикормах может негативно повлиять на физиологическое состояние рыб как их потребителей (Herme et al., 2005; Sagstad et al., 2007).

Влияние традиционных и новых биотехнологий на рыб можно оценивать по биохимическим показателям, характеризующим протекающие внутриорганизменные реакции (Шатуновский, 1987; Tietz et al., 1995). Количественные и качественные изменения этих показателей, обусловленные геномными, гормональными и иными манипуляциями, характеризуют адаптивный ответ особи (Карпевич, 1998; Назаренко,

Кишкун, 2000), и могут быть использованы как маркёры её физиологического состояния. Биохимические маркёры гидробионтов уже применяют в водной токсикологии (Немова, Высоцкая, 2004; Немова, 2005; Цветков, 2009; Немова и др., 2011), детально изучены свойства многих белков крови рыб (Лукьяненко, 1971; Андреева, 1997). Биохимические показатели рыб в большинстве случаев оценивают трудоёмкими аналитическими методами, а данных, полученных экспресс-методами, ещё недостаточно для комплексной оценки их физиологического состояния, в том числе при использовании различных биотехнологий. Поиск новых достоверных маркёров функционального состояния рыб - объектов биотехнологий, и создание их референсных каталогов остаётся актуальной задачей.

Целью настоящей работы является комплексный анализ физиологического состояния лососевых рыб в связи с применением различных биотехнологий.

Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:

1) оценить влияние окружающей среды на физиологическое состояние самок радужной форели Опсогкупскт туЫзБ (=РагаБа1то туЫзя) разной плоидности в высокогорных условиях тропиков;

2) определить биохимические и цитометрические показатели диплоидной и триплоидной гиногенетической радужной форели;

3) охарактеризовать по биохимическим показателям физиологическое состояние самок триплоидной радужной форели из однополого стада после гормональной инверсии пола;

4) изучить биохимические показатели производителей кижуча Опсогкупскт ИзШск во время нерестовой миграции;

5) оценить наличие/отсутствие ГМИ в рыбных комбикормах, используемых в отечественной и зарубежной аквакультуре.

Научная новизна. Впервые проведён комплексный анализ физиологического состояния лососевых рыб по ряду биохимических

маркёров. Проведено сравнение по этим показателям самок однополой диплоидной и триплоидной радужной форели при культивировании в высокогорных условиях южного Вьетнама, её триплоидных инверсантов, а также производителей кижуча из водоёмов, отличающихся гидролого-морфологическим режимом. Впервые выявлена иммунореактивность в крови лососевых рыб к специфическим факторам гуморального иммунитета и гонадотропным гормонам человека. Впервые проанализированы комбикорма для рыб на присутствие в их составе ГМИ.

Практическое значение. Подготовлены материалы для создания унифицированной референсной базы биохимических маркёров для комплексной оценки физиологического состояния ценных видов лососевых рыб. Рекомендованы проведение импактного мониторинга ГМИ в комбикормах для рыб, их маркировка подобно пищевой продукции и разработка методов и критериев оценки их воздействия на рыб.

Апробация работы. Основные результаты исследований представлены на II международной научно-практической конференции «Повышение эффективности использования водных биологических ресурсов» (Москва, 2008), V международном конгрессе «Биотехнология состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), международной конференции «Arctic marine ecosystems in an era of rapid climate change» (Tramso, 2009); III международной конференции с элементами школы для молодых учёных, аспирантов и студентов «Современные проблемы физиологии и биохимии водных организмов» (Петрозаводск, 2010), Всероссийской молодежной конференции «Вклад молодых учёных в рыбохозяйственную науку России» (Санкт-Петербург, 2010), а также III международной конференции «Проблемы иммунологии, патологии и охраны здоровья рыб» (Борок, 2011).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ, три из них в изданиях, рекомендованных ВАК.

Основные положения, выносимые на защиту:

1) Гиногенез, полиплоидизация, гормональная инверсия пола и специфические условия южного Вьетнама влияют на содержание биохимических показателей в крови радужной форели, характеризующих её физиологическое состояние.

2) Производители кижуча из разных водоёмов, во время нерестовой миграции, отличаются по содержанию ряда биохимических показателей в крови.

3) Производители комбикормов часто включают в их состав ГМИ, не указывая этого в доступной форме, что является риском для физиологического состояния рыб, потребляющих такие корма.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы, включающего 506 источников, из которых 308 на иностранных языках. Работа изложена на 189 страницах текста, содержит 10 рисунков и 21 таблицу.

Благодарности. Искренне благодарю моего научного руководителя д.б.н., профессора Е.В. Микодину за всестороннюю помощь и советы при работе над диссертацией. Приношу глубокую благодарность академику Д.С. Павлову (ИПЭЭ РАН), д.б.н. В.П. Васильеву (ИПЭЭ РАН), Нгуен Ти Хуан Ту (НИИ Аквакультуры №3, Республика Вьетнам) за предоставленную возможность сбора материала; д.б.н., профессору А.О. Касумяну и д.б.н. А.Б. Бурлакову (МГУ им. М.В. Ломоносова) за ценные советы; к.б.н. Е.Д. Павлову (ИПЭЭ РАН), Во Тхи Ха (Российско-Вьетнамский Тропический Центр) за участие в совместной экспедиции; д.с-х.н. Я. Коуржилу (VURH JU, Чешская Республика) за предоставленные образцы комбикормов; сотрудникам ФГУП «ВНИРО»: д.б.н. Н.В. Кловач, к.б.н. Б.П. Смирнову, к.б.н. А.Г. Новосадову и A.B. Новосадовой за помощь в сборе материала.

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Гиногенез и триплоидизация рыб

Известно существование гиногенетических популяций рыб в естественной среде (Васильев и др. 2005; Лебедева, 2007; Апаликова, 2008). В литературе описаны случаи спонтанного образования жизнеспособных триплоидных рыб в естественных популяциях радужной форели Oncorhynchus mykiss (=Parasalmo mykiss) (Cuellar, Uyeno, 1972; Thorgaard, Gall, 1979) и гольца Salvelinus fontinalis (Allen, Stanley, 1978). Их изучение и хромосомные манипуляции позволили сформировать необходимые концепции для искусственного получения гиногенетических и триплоидных рыб (Арефьев, 1998; Hulata, 2001; Thorgaard, 1983). Такие исследования в основном были сосредоточены на производстве триплоидных лососевых Salmonidae (Thorgaard, 1983; Thorgaard et al., 1981) и карповых Cyprinidae рыб (Shireman, 1984; Cassani, Catón, 1986).

Гиногенетических рыб (только самки) получают в два этапа: разрушение генетического материала спермия, который используют для активации яйцеклетки и восстановление диплоидности (рис. 1.1) (Арефьев, 1998; Thorgaard, 1983; Piferrer, 2001; Piferrer et al., 2009). Инактивация мужских гамет происходит облучением ультрафиолетовыми или гамма лучами, при этом генетический аппарат разрушается, но спермии остаются подвижными. Такие спермии способны стимулировать развитие яйцеклетки, но истинного оплодотворения не происходит, а значит, сохраняется только гаплоидный набор хромосом. Диплоидность восстанавливают мейотическим или митотическим способом. Мейоз у рыб в норме включает два отдельных этапа - мейоз I и мейоз II, в результате завершения, которых, каждая ооцит или сперматозоид содержит только один полный набор хромосом (гаплоидный или гаметический набор). Такое редукционное деление приводит к тому, что когда сперматозоид и яйцеклетка соединяются при оплодотворении, то вновь сформированный эмбрион имеет восстановленное

диплоидное число хромосом (Ченцов, 2004). В норме у рыб яйцеклетка заканчивает процесс мейоза сразу после оплодотворения, и лишний хромосомный набор удаляется в виде, так называемого, "второго направительного тельца" (Макеева, 1992). Нарушение второго этапа мейоза осуществляется путём разрушения веретена деления, разводящее хроматиды (см. ниже). В результате второе направительное тельце не редуцируется, и восстанавливается диплоидный набор материнских хромосом в яйцеклетке (ТЬо^аагс!, 1983). Таким образом, развитие зародышей идёт исключительно за счёт женского генетического материала, что приводит к возникновению диплоидного гиногенетического потомства (Арефьев, 1998; Макеева, 1992; РИеггег, 2001). При митотическом гиногенезе воздействие направлено на 1-е деление дробления, в результате чего нарушается цитокинез и все дочерние хромосомы остаются в одной, ставшей диплоидной, клетке (Арефьев, 1998).

Радиация, ультрафиолетовое излучение

Разрушение . ДНК спермин-'

. Нарушение расхождения' ¿з п «второю направительного '**....... тельца»

Оплодотворение спермием феиотипического самца, но гшетичег.кпй еямкмй

Рис. 1,1. Схема получения диплоидных и триплоидных гиногенетических рыб (по данным литературы: Арефьев, 1998; Р^еггег, 2001; Р1£еггег е! а1., 2009).

Технология получения рыб-триплоидов принципиально не отличается от создания однополых стад (см. рис. 1.1). В отличие от гиногенеза при триплоидизации оплодотворение осуществляют не инактивированными мужскими гаметами, а полученное потомство содержат один мужской и два женских набора хромосом (Hulata, 2001; Thorgaard, 1983; Piferrer, 2001; Piferrer et al., 2009). Другим методом получения триплоидов является скрещивание тетраплоидных особей с диплоидами (Арефьев, 1998; Recoubratsky et al., 1992, Malison et al., 2001).

Разрушение веретена деления осуществляется химическим или физическим воздействием на икру после проникновения в неё сперматозоида, но до отделения второго направительного тельца (Макеева, 1992; Dillon, 1988). Триплоидия успешно индуцирована у рыб с применением химических веществ - колхицином (Smith, Lemoine, 1979), цитохалазином-В (Refstie et al., 1977), диметилсульфатом или эмбихином (Макеева, 1992); а также физическими процессами - шоком высокого давления (Benfey, Sutterlin, 1984; Cassani, Catón, 1986), холодным шоком (Gervai et al., 1980; Wolters et al., 1981), тепловым шоком (Scheerer, Thorgaard, 1983; Garling, Tanner, 1985a, b), лучами Рентгена либо ультрафиолетовыми (Макеева, 1992).

Некоторые данные литературы (Refstie et al., 1982) свидетельствуют о том, что тепловой шок оплодотворённой икры является наилучшим методом получения триплоидных лососей. Длительность теплового шока имеет решающее значение, так как шок должен применяться только до отделения второго направительного тельца. Температуры и длительности воздействия должно быть достаточно для разрушения веретена деления, и, при этом, не приводить к высокой гибели икры. Данные показатели зависят и могут заметно варьировать не только от вида рыбы, но и от конкретной особи, от которой брали икру (Lincoln, Scott, 1983; Solar et al., 1984). Наиболее успешно индуцированная триплоидия, достигающая в некоторых случаях

100%, описана для радужной форели (Lincoln, Scott, 1983; Scheerer, Thorgaard, 1983; Solar et al., 1984a).

1.2. Искусственная гормональная регуляция пола у рыб

Рыбы - единственный класс позвоночных животных, среди которого такие процессы, как гермафродитизм и однополые популяции в пределах одного вида являются нормой (Reinboth, 1980). Было показано, что такие колебания при дифференцировке пола у вида зависят не только от экологических, но и от поведенческих факторов внутри популяции (Fishelson, 1970). У некоторых животных, особенно у низших позвоночных, на дифференцировку пола влияют факторы внешней среды, и в результате фенотипический пол может отличаться от генотипического (Adkins-Regan, 1987). В однополых популяциях у рыб развивается половая система либо самок, либо самцов. Тем не менее, в обоих случаях рыбы могут проходить через последовательную дифференцировку пола, начиная функционировать изначально как самки или самцы, а затем менять пол на противоположный (Reinboth, 1962, 1967).

Гормональная реверсия пола позволяет фенотипически изменять пол у рыб, без каких-либо модификаций генома. Причём механизм искусственного получения однополых особей только самок (гиногенез) или только самцов (андрогенез) принципиально не отличаются (Метальникова, 1992; Турина, Рекубратский, 2005). Одним из наиболее распространённых объектов искусственного регулирования пола является радужная форель, которая обладает мужской гетерогаметностью (ХУ - самцы, XX - самки), что даёт возможность производить самцов с новыми генотипами (XX и YY самцы), в том числе путём гормональной инверсии пола (Chevassus et al., 1988). Потомство, полученное при скрещивании таких самцов с нормальной самкой, будет или всё самц