Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физиологические принципы формирования биотехнологического цикла в системе гриб-ряска

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Физиологические принципы формирования биотехнологического цикла в системе гриб-ряска"

МОСКОВСКИ;? ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им.О.ЛОМОНОСОВА

^ ^ БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

- > 1

На правах рукописи

ХУССЕЙН НАРВАН ИШ

УДК 581.I

, - /

ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ПРИНЦИПЫ ФОРМИРОВАНИЯ БИОТЕХНОЛОГИЧЕСКОГО ЦИКЛА В СИСТЕМЕ ГРИБ-РЯСКА

(03.00.12- Физиология растений)

Автор

диссертаций на степени кандидата

е ф е р а т

соискание учёной биологических наук

Москва- 1934

Работа выполнена в Институте Физиологии Растении имени К.А.Тимирязева РАН и на кафедре ботаники и физиологии растений Российского Университета Дружбы Народов.

Научные руководители - доктор биологических наук

профессор В.И.ШЕЛИ кандидат биологичесуих наук Р. 3.МАКАРОВА

Консультант - кандидат биологических наук

:О.§ИЛИ;,!0Н0ва

Официальные оппоненты

Ведущая организация

доктор биологических наук В. В.МАЗИН

доктор биологических наук профессор Н.И.ЯКУШШ1А

Ярославский Государственный Университет

Защита диссертации состоится"/^" фе/Г^л^ 1994 г. в часов на заседании специализированного совета по

присуждению учёной степени кандидата биологических наук К 053.05.14 при Московском Государственном Университете им.¡.1.В, Ломоносова по адресу: П9899. г. 1.! о с к в а, Ленинские горы, Московский Государственный Университет им. ¡1.В.Ломоносова.

С диссертацией можно ознокомиться в библиотеке биологического факультета МГУ.

Автореферат разослан "_"_

Учёный секретарь Специализированного совета

1994 г.

0.Г.ПОЛЕССКАЯ

Актуальность работы. Физиология растений как наука о функциональной активности растительных организмов представляет основу для развития биотехнологии. Одна из основных задач последней состоит в получении полезных целевых продуктов с помощью биоагентов (Бутенко, 1964; 1987; Фаулер, 1987). К их числу относятся целые растения, изолированные клетки и их компоненты, продукты жизнедеятельности грибов и микроорганизмов. На извлечении гормонов, витаминов, ферментов и других продуктов раститетлъного и микробного метаболизма из простых и технологичных объектов базируются новей-пие разработки (Семененко, 1975; Бутенко и др., 1937; !,!уромцев и др., 1990; иевелуха, 1993). Несомненно значение степени разработанности физиологических основ создания двух- (или более) компонентных биотехнологических циклов.

Особая роль отводится подбору оптимального состава питательной среды, обеспечивающей синтез и накопление продукта. Зитогормо-и витамины, необходимые нормальным растительным тканям для регуляции метаболических процессов, существенно удорожают технологи-4есяий процесс. Поэтому актуален поиск простых объектов из числа шсиих растений и микроорганизмов» которые могли бы обмениваться 1родуктами метаболизма (при совместном выращивании). Несмотря на 'спехи, обусловленные теоретическими и методическими достижениями шзиологии растений, физиологические принципы формирования подоб-шх систем разработаны недостаточно.

В то же время известны единичные примеры удачного использо-1аеил природных систем, в частности, Azolla-Anabaena (Игуен Тхыо хок, 1988). Кроме того, все большее значение приобретают фитогор-,они грибного и микробного синтеза (Иишке, 1900; Муромцев и др., 990). Благодаря естественному происхождению они быстро метаболи-

зируются в выспей растении, оказывал на него мягкое рсгуляторное действие. Интерес к ним повыаается и в связи с постоянно ужесточавшийся экологическими требованиями. Наконец, до сих пор актуален отбор методически несложных и корректных биотестов, пригодных для оценки активности и экологической чистоты физиологически активных веществ различной природы.

Цель работы. 13 связи с изложенным предполагалось, во-первых, изучить высшее водное растение спироделу и гриб-патоген рода бот-ритис в качестве возможных компонентов единой технологической системы. Во-вторых, основываясь на физиологии роста и развития спи-роделы, использовать ее как Оиопробу для тестирования цитокинин-подобных веществ, экскретируемих грибом.

Исходя из этого, били поставлены следующие осоновные задачи.

1. изучить особенности развития культуры спироделы Splrodela polyrrhiza.

2. Изучить влияние экзогенных регуляторов роста цятокининоа (БАИ), абсциэовой кислоты (ЛБК1, гиббереллина (ГК) и 2,4-Д на рост и развитие спироделы (вегетативное размножение, антоцианирование).

3. Выделить цитокинин-содержащув фракцию из культуральной среды Botrytis cinerea.

4. Оценить цитокининовув активность культуральной жидкости гриба с помоцьп рясковой биопробы.

Пацчная новизна. Впервые проведено комплексное изучение штамма Яитопатогеяиого гриба - источника цитокиников и аксеничной культуры спироделы с точки зрения возможного использования цитокини-нов в биотехнологической системе гриб-ряска. Показана возможность использования грубо очищенных цитокинин-подобных веществ из культуральной жидкости гриба при культивировании спироделы. Установ-

лена перспективность биотестированнл цитокиииноз грибного происхождения с покоцьи спиродели.

Практическая значимость. Выполненная работа развивает прсд-ставлеппл о физиологических принципах создания о'иотехнологичес-кой системп, состоящей из Зр1го^1а и 13о1гуЪ1э. Впервые показано, что вибраиние аодельние объект« могут снабяать друг друга продукта»!« собственного петабодизиа, что позволяет исоичить синтетические добавки к питательна;.! среда:«. Виервпе установлена воз-лояноегь длительного сохранения культури спиродели в обпчних условиях на безглакозной среде.

Апробация работ;«. Латериали диссертации неоднократно обсуя-дались на расширенных заседаниях ка'едрн ботаники и физиологии растений Российского Университета друхбн народов (.'.осква, 1УУ1, 19УЗ), лаборатории природных и синтетических регуляторов П5>Р РАН (Москва, 1У92. 19УЗ); на (I конференции "Регулятор«« роста и развития растений" [:;осква, ТСХЛ, 19УЗ), на Международном симпозиуме "Физиология абс!1И30В0а кислотн" (Пущнно, IУ33}.

Публикации. Материал«« диссертации излоленн в 5 печатннх работах.

Объеи и структура работы. Диссертация изложена на страницах машшоинсного текста и состоит из введения, обзора ли-гературн, описания объектов и методов исследования, изложения и обсуждения экспериментальных данних, заклачения и выводов; содержит 3 таблиц и ^^ рисунков. Список литературы вклгачает В наименований, из них #I/ иностранних источников.

ОБЪЕКТ:! И :!ЕТОД!! исследования

В качестве объектов исследования использовали культуру ряски Sр1 rodela polyrrhJza (Германия, йенский университет) и культуру гриба-Дитопатогена ^Botrytis cinerea (Москва. Главный ботанический сад РАН), Культуру ряски стерильно выращивали на питательной среде, содержащей необходимые минеральные соли и 1% глюкозы, в

9

камере фитотрона ИФР РАН при постоянной освецении 8,8 Вт.м , температуре +25+1°С. Продолжительность субкультуры 10-14 дней (жидкая среда), 30 дней (твердая среда, коллекция). Инокулюм 5 листе-цов ряски помещали в 100-мл колбочку с 50 мл среды. Кроые среды полного состава (основная среда, контроль) использовали среду без глпкозы; основную среду, дополненную одним из синтетических аналогов фитогормонов: БАИ, или АБК, или 2,4-Д, или PK. Диапазон изучаемых концентраций от 0,001 до 100 мг в расчете на I л среды в завиеиыости от задач »ксперимента и биологической активности регулятора, В среду фитогормоны вводили до автоклавирования. В специальной серии опытов в основную среду поискали кусочки хрома-тог.раим, тестируемых на биологическую активность экстрактов куль-туральной жидкости гриба. Гриб ботритис выращивали на жидкой среде Чапека в тех же условиях, в полной теыноте.

Ряска. Динамику роста спироделн изучали в течение одного 28-дневного пассажа на основной среде (контроль), БАП-среде н без-гликозной среде. Б последней случае субкультивирование длилось 60 дней и более. Рост культуры спироделы оценивали во всех вариантах по числу листецов, сырой и сухой массе, содержанию антоциа-нов. В некоторых опытах подсчитывали покоящиеся почки - тури они (Рис,I}.

Антоцианы определяли по методу Llebert (1980) после 24-часо-

а он экстракции на холоду кислим метанолом из свехесобранных лис-тецов спироделы (G мл на 200 мг). Спсктройотометрически (Specol 221, ГДР) измеряли экстинкцив образцов при длине полни 530 ни.

Рнс.1. Схема эксперимента с культурой спироделы.

Анатомические исследования проводили на срезах свежих листе-

ч

цов спироделн в возрасте 7 и 22 дней; использовали окуляр Юх, объективы х8, х40 (малое и большое увеличение, соответственно); схемы получали на рисовальной аппарате РА-7.

Гриб. После 2, 3, ...6 и 8 недель выращивания определяли сырую и сухуя иассу иицелия. Фильтрат культуральной хкдкости (250 ил) подщелачивали до р!1 7.8 н.бутанолоы и трижды экстрагировал» цитокннии-подобные вещества (Кислин, Кефели, 1985; Филимонова, Иазин, 1986), биологическую активность которых определяли би-отестированиеи после тонкослойного хроматографирования на пласти-

нках Sllufol-UV в системе растворителей хлорофори-$7дш1 8: I. Из биопроб использовали амарантус-тсст, основанный на стимуляции образования /-цианина в присутствии I -тирозина в семядолях проростков цирицн Aaaranthus caudatus ЬЧазин и др., 1976; Van Staden et al., 1932), каллусную ткань (прирост сирой массы), культуру спироделы (рост биомассы, накопление антоцианов как паркеров старения) (Skoog, Miller, 1966; Llebert, 19Б0).Хроматограммы делили на 8-ГО зон, каждую тестировали.

Все опыты проводили в разное время не менее 5 раз с 3-5 ана-литичрскини повторностями (рост ряски и гриба) и не ыснее 8 раз. (содержание антоцианов). Результаты обрабатывали статистически; (Урбах, 1964),

РЕЗУЛЬТАТ!! И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Физиологические особенности культуры спироделы. Spirodela polyrrhlza Schleid., или ыногокоренник обыкновенный относится к семейству рясковых Lennaceae; самые маленькие, просто устроенные цветковые водные растения, плавающие на поверхности воды и никогда не прикрепляющиеся к субстрату, распространены практически повсеместно. Округлые зеленые листочки и несколько нитевидных корней образуют фронд, или листец. Специфической особенностью спироделы является образование антоцианов, их накопление в ходе развития на нихней (адаксиалыюй) поверхности ( ßeissoan, 1955Ц7Вазнно-яается преииуцествеино вегетативно, число и масса растеньиц удваивается за 2-4 суток, при низких температурах и неблагоприятных условиях образует зимующие, или покояциеся, крахмалоносные почки -ei:y$)ioHn" (Ростовцев, 1905; Таубаев, Абдиев, 1973; Иузафаров, . 1984; Рахимова, 1987; Augsten, 1984; Engler, 1989; Уаэзеиг, Aars-

- Э -

son, 1992). Високопитатслышй корн для всех видов животных (Экзе-рцева, 1969; Таран и др., 1990; Edwards et al.. 1992).

Вегетирувцая культура спироделы интенсивно росла на основной среде: исключение глюкозы из состава среды изменяло характер и темпы роста (Рис.21. Существенно, что глпкозиое голодание, хотя сильно тормозило рост, но не вызывало гибель листецов длительное время. Перенос листецов на полнув среду после продолжительного роста без глюкозы (60 и более дней) быстро зозврацал культуру к нормальной жизнедеятельности. Недостаток глпкозн наруаал ход метаболических процессов, прекращался синтез антоцианов (Рис.3),

Влияние синтетических ^итогормонов на рост спироделы. Растущая In vitro спиродела не нуждается в гормональных добавках. Однако она, как и другие ряски, используется для тестирования физиологически активных веществ, гербицидов, ионов тяжелых металлов и других загрязнителей (Дёрфлинг, 1985; Troglsh,I98S; Гебхард и др., 1990; Grossnan et al., 1992).

Действие разных доз БАЛ на рост спироделы и накопление антоцианов изображено на рис.4. Реакция спироделы на БАП четко зависела от его концентрации в среде. Наблюдали стимуляторннй, инги-о'иторный и токсический эффекты. Максимальный прирост биомассы соответствовал дозе I мг.л~*. С то же время активиругщие рост концентрации БАП наиболее сильно подавляли образование антоцианов. Анатомический анализ листецов спироделы показал, что на седьмые сутки выращивания примерно половина пигментных клеток в контроле была заполнена антоцианом, тогда как на БАЛ-среде они появились в единичных клетках на двадцать вторые сутки.

ГК (Рис.4,П) стимулировал рост спироделы в концентрации 10 иг.л"*, в более низких почти не влиял на размножение, но при-

Пасса, иг 1200

800

400 -

I

1 т

юо у

80

60 20 !-

80

60 40

20

16

28

(Б)

Штук 400

300

200

100

100

^ 7 16 28 60 Продолжительность культивирования, сут. Рис.2. Рост спироделы на полной (А) среде и без глюкозы (Б): число листецов (I), сырая (2) и сухая (3) масса. Ноль времени - начало пассажа.

0

1.8

1,4 -

1.0 -

0.6 -

о

7 16 28

Продолжительность роста, сут.

Рис.3. Динамика накопления антоцианов листецаыи спироделы в процессе выращивания на

основной { '-' ) и безглюкозиой ( )

средах.

рост биомассы все яе усиливал с повышением дозы ГК. 11а этом фоне отмечали торможение образования антоцианов и тем сильнее, чем вы-ае концентрация ГК, Таким образом, наибольпал ростовая активность сопровождалась наименызим содержанием антоцианов. Есть информация о подавлении образования антоцианов ГК в период освещения культуры H.gracllls {Gregor, 1974). Кроне того, мы заметили, что в вариантах с ГК листецы всегда были светлее контрольных,

2,4-Д (Рис.4, П), известный аналог ауксина, часто используемый в культуре тканей и микроклональном размножении, в диапазоне 0,01-0,1 ыг.д"^ слабо стимулировала рост и почти не влияла на образование антоцианов; 10 мг в первые же часы обработки действовали па спироделу токсически. В присутствии 2,4-Д отмечали раннее появление турионов, которые после отмывки в стерильной воде и пересадки в жидкув среду основного состава прорастали. Дальнейших наблюдений за развитием из турионов листецов не проводили.

Результаты влияния АБК на развитие спироделы сведены в таблицу I.

Таблица 1. Влияние АБК на рост 7-дневной культуры спироделы

АБК, Показатели

иг.л~* сырая пасса, число ET

530

Мг листецов, шт.

О (контроль) 840 140 0,866

0,001 195 44 1,112

0,01 397 98 1,811

0,1 и выше полная гибель

Примечание: стандартная ошибка не превышала

АБК - очень сильный ингибитор ростовых процессов, Хороао ра-

ся о

о о

го

о о

со о о

•S»

о

А

•

СО a сз

t»

1 -О s

1 ш

о 3=¡ г

'С s

X t» (В

а о

а> X en

о s-

ёХ XI £3

И

о я .—-

о «<

sa и •—

• tr •

-i

.с» 2

•a

1 о

—. рч

о о сз

о а w о

к

га •та s

•о о

ж rs> с

о о

X 1а о

s 1

CD tes =

ti »—«

X СО

1

О

•С •с X ta

s s e

so о —

X ь •a

о о о s

ta о

• Ь» ч Si

•

п s

-J

а о

sz о •ч

о •

ш о ь

- t

» »—

ао sa

i (5

Г»

В>

'

О rî

О

— S

О Р

п м

о О

в> сз

1—»—I—I—Г

ел г

о -I

о

Т- ~

CJ

СО

о

С-> О

ГО

о о

о сл

ГО

о

Г'-

- CI -

стуцие б нормальных условиях питания листецы спироделп отвечали на введение ADK сильным подавлением роста вплоть до гибели, что согласуется с литературными данными (Abraras, MlIIboron, 1УУI; Appenroth et ai.. 1УУ0). ,

Еще в 60-е годы на лемне малой была доказана способность ци-токининов блокировать эффект АБК ( Van Overbeek et al., 1У6У). При изучении раздельного и кооперативного действия ЛБК и БАП на рост и метаболизм лемны налой выяснили, что добавление к среде БАИ стимулировало, а ЛБК подавляло скорость роста. При совместном введении БАИ и ЛБК БАИ снимал тормозящее действие АБК ( Albane 1 et al.. 1У05). Показано, что под действием высоких доз кинетина и БАЛ изменялась морАологил и пигментация листецов спироделы интермедиата {¡Ulch et al., ISöV). ilu также наблюдали в присутствии БАИ торможение роста корепков, осветление окраски листецов и изменение их формы.*

Рост культуры Botrytis cinerea и содержание цитокинин-подоб-ннх веществ. Как видно из таблицы 2, для выбранного нами атанма гриба ботритис характерен интенсивный рост. Через две недели серые пуиистые колонии гриба распространились по всей поверхности куль-туральиой жидкости в виде тонкой Пленки, которая чуть позже заняла всю поверхность среды. На четвертой неделе субкультуры появлялись споры, еще через две-три недели споронопение становилось обильным, и через восемь недель от начала выращивания инокулпма завершалось, В это же время прекращался прирост мицелиальной массы и начинался лизис мицелия. Период активного роста ботритис продолжался со второй по шестую Неделю, Наибольшая доля сухого вещества мицелия при-□лась на пяти-иести-недельнуп культуру гриба (154-167Я прироста по сравнению с началом периода активного роста).

Содержание цитокининовых веществ определяли на разных стадиях

Таблица 2. Динамика роста культуры гриба ботритис

Показатели роста

Возраст культуры, недели

2

3

4

8

сырая масса, г

индекс роста *

сухая масса, г

с' /■>

отношение сухой массы ницелия к сырой

8,71+0,32 10,72+0,13 II.75+0.05 12.95+0.05 13.35*0.12 12.31+0,04

17,4 21.4 23,0 25.9 26,7 25,6

100 123 135 149 153 147

0,45+0,06 0.56+0,02 0.67+0,02 1,14+0,03 1,21+0,01 1,03+0,01 1

100

0,05

124

0,05

151

0,06

254

0,09

267

0.09

240

0,ОС

ся

Примечание: мицелиалышй ннокулюм 0,5+0,05 г ыа I колбу емкостью 250 мл; масса мицелия гриба приведена в расчете на I колСу той хе емкости;

индекс роста: отношение сырой масси мицелия поело 2, 3, ... недель вырацкванил к массе ииокулвма.

роста грио'а. Ранее при исследовании гормонального статуса Botrytis cinerea методами 1ШХ и Г)дХ били выявлены и охарактеризованц высокоактивные цитокинины в зоне зеатина (Rj. 0,2). зеатин-рибозида (Rj. 0,3), изопентениладенина (Rj. 0,'J). Эти соединения легко отделялись друг от друга в подобранной селективной снеси растворителей (Филимонова. Мазин, 1986; Филимонова, 1987). Авторы отмстили два ванных момента: концентрация цитокининов в среде зависела от возраста гриба; практически все цитокинины накапливались в культура-льной жидкости четырехнедельной культуры гриба, но не в мицелии. Кроме того, содержание цитокининов намного превышало уровень других гормонов (ПУК., ГК, АБК), измеренный адекватными методами у культуры этого возраста, тогда как в закончивией рост восьминедельной культуре гриба в значительных количествах появлялась АБК. На этом основании было предложено использовать четырехнедельнун культуру Botrytis cinerea в качестве продуцента цитокининов.

В нашей работе был проведен анализ гистограмм, построенных по результатам оценки с помощь» амарантус-теста зон хроматограмм экстрактов культуральной жидкости гриба на протяжении нести недель выращивания. Полученные данные представлены на рисунке 5. Наибольшую цитокинимовув активность (210$ к контролю) наблюдали в четырехнедельной культуре гриба. Она была локализована в зоне хромато-граммы со значением flj. 0,50-0,62. Предположительно она могла соответствовать активности зеатин-рибозида. Кроме того, выявили еще одну, хотя и менее активную, зону (140£ к контролю); ее Rj. 0,1250,25.

Обе активные зоны вырезали из хроматограмыы, помечали в колбочки с основной средой и инкубировали в этих условиях спироделу в течение 7 дней, после чего определяли уровень антоцианов (Рис.6).

220 *

IÜU -

140 -

100

Li

U U,25 u.bü U, 'ib I Я

Ркс.Ь. ииояогпчосная активность цитокинин-содержацей фракции культуральной хидкасти 4-неделыюго ß.cinerea в анарактус-тссто.

U 0,50 I Í5f

e.G. Нлилние цитокинин-подобннх

вецеств из наиболее активных зон хропатогранмы В,cinerea на образование антоцианов в листецах спиродели.

Вещества, адсорбированные на участке * (Рис.5) и показавиие наибольшую активность в амарантус-тссте, в основу которого положен принцип цитокинин-аависимой стимуляции синтеза бетациаикнов в семядолях проростка амарантуса, в больиеГ; степени снижали уровень антоцианов в растущих листецах спиродели. В таблице 3 также представлены данные о влиянии цитокинин-подобных веществ В, cinerea на рост спиродели.

Таблица 3. Влияние цитокинин-подобных веществ из культураль-ной жидкости 4-иедельного 3.cinerea на рост спиродели

Rf зоны

показатели 0 0,25 0,50 0.75 I

число листе-

цов, от. 67 72 69 92 63

сырая масса, мг 231,4 286,2 259,6 367,5 220,1

сухая масса, мг 17,1 17,9 17,5 24,5 15,8

содержание анто-

цианов, Е, л 530 1,314 1,021 1,153 0,697 1,235

Из литературы известны факты, когда лемма малая служила биотестом при оценке фитотоксичности водорастворимых метаболитов, извлеченных не РигагШа. Зуионизин ¡51 сильнее других подавлял рост ряски и синтез хлорофилла {на 53?! и соответственно) (Уезоп<1ег е1 а!.. 1992).

- 19 -ЗЛШЧЕИИК

Итак, мм довольно подробно остановились на физиологических особенностях двух представителей растительного царства - висисго водного растения и гриба-фитопатогена, Каждый из них в отдельности известен своими специфическими свойствами, которые сделали возиоя-ним их использование в биотехнологии. Однако впервые физиологические особенности ряски Splrodela polyrrhlza и гриба Botrytis cinerea пояохенн в основу формирования двукомпонентной системы. Предполагается, что гриб ö.cinerea, экскретирувщий на разных этапах развития цитокининн или ЛЕИ, и богатая углеводами и белками S.poly, rrhlza могут служить источниками этих вецеств для культуры тканей,

Спиродела, известная как биопроба на самые различные биологически активные вещества, в то» числе цитокинины и АБК, служит в этой системе для оценки биологической активности цитокининов грибного происхождения. Изучение роста культуры спироделы, ее реакции на регуляторы роста - аналоги различных классов -фитогорнонов - цитокининов {БАП), ауксинов (2,4-Д), гиббередлинов {ГК) и АБК - убедило нас в том, насколько уникальна S.polyrrhlza для изучения фи-

N

зиологии развития » каким многоплановым может быть использование этого кроаечного внсаего растения, исходя из его особенностей для репения прикладных задач физиологии и биохимии растений, экологии и т.п. Спиродела проявила четкую специфическую зависимость в реакции на фитогормоны дэух классов {цитокининов и АБК): по вегетативному росту и связанному с возрастом листецов уровню антоцианов. БАП в низких концентрациях способствовал активному размножению и замедлял процессы старения ряски в фотомиксотрофной культуре. Под действие» высоких, ингибирувщих доз БАП изменялась морфология спи-

роделы (укороченные корпи, утолценные пластинки листьев). Лнатоми-чески» анализ лнетецов спироделы выявил снижение доли антоциан-со-держацих клеток в результате предобработки 1Ш1 (0,1 мг.л"*): лииь на двадцать вторые сутки появились единичные, заполненные пигментом клетки. Наконец, в присутствии БЛ11 в 1,5 раза возрастало число устьиц по сравнении с контрольным вариантом, Дейстоие других регуляторов роста (АБК, 2,4-Д, ГК) на рост спироделы и образование ан-тоцианов неспецигЬично и не имеет яркой выраженности.

Том не менее, обращает внимание тот факт, что 141 последовательно в зависимости от концентрации снижал уровень аитоцианов. Влияние 2.4-Л в дозах, которые часто применяются в культуре клеток и тканой растений,оказывала большой стимуляторный з^скт, но уде 1и нг.л"^ действовали на ряску токсически.

Культура спироделы, лишенная углеводной части питательной среды, имела отличительные особенности роста а развития, носящие, однако, обратимый характер. Реакция спироделы на углеводный дефицит выражалась в замедлении темпов размножения и последупцей полной его остановке, прекращении синтеза аитоцианов и образования турионов. Однако длительное {до нескольких месяцев) выращивание спироделы без Сахаров не приводил^ к гибели растений. Последующее субкультивирование листецов в условиях сбалансированного литания нормализовнвало процессы жизнедеятельности спироделы.

Выявленные физиологические особенности стерильно растуцой культуры спироделы позволили использовать ее в качестве биотеста на вецества грибного происхождения, иыепцие цитокининовув активность. Последние синтезировались мицелием гриба, окскретировались в куль-туральнув жидкость и накапливались в ней в течение четвертой недели субкультуры, предиествувцей периоду максимального роста. Испытание извлеченных из среды гриба цитокинин-подобных веществ с по-

)

.чощыэ спироделн показало, что се реакция о атом случае оказалась адекватном реакции на синтетический ПАП.

В И В О Д ц

1. Стерильно растуцая культура спироделн использована в качестве биотеста на вещества с цитокининовой активности).

2. В условиях сбалансированного питания культура спироделн отличалась быстрыми темпами роста (30-кратное увеличение биомасс») на протяжении 16 суток субкудьтивированнл. Позднее начиналось старение культуры, которое проявлялось в активном синтезе антоцианов

и образовании туриоков.

3. Исключение из питательной среды сахара (глюкозы) подавляло вегетативное раэкиозсние спироделн, синтез антоцианов, по не приводило к гибели. Звсдение глпкозн норнализовнвало процессы роста и восстанавливало развитие культуры спиродслн.

4. БАЛ в дозах, стимулирующих рост листецов (0,01-0,1 иг.л"*), ипгибировал синтез антоцианов; и, наоборот, более высокие дози ПАП (I и 10 мг.л-*) тормозили рост и повышали содержание антоцианов,

5. АБК ингибпровала рост спироделн, а з концентрации 0,1 иг вызывала полную гибель культуры, ^ормояение роста биоиассн спироделн при иаимоньаей концентрации (0,001 мг.л"*) сопровождалось интенсивным образованней антоцианов.

ГК в выбранном диапазоне концентраций от 0,001 до 10 иг.л* стимулировала, хотя и слабо, накопление биомассы спироделн. Синхронно с повышением концентрации ГК снижалось содержание антоцианов.

У. 2,4-Д в дозах от 0,01 до I мг оказывала слабый стимулятор-ный эффект на рост спироделн и почти не влияла на синтез антоциа-

- 22 -

нов. При 10 иг 2,4-.'; дистецп полиостьп «огибали.

3, 3 бутанольной фракции кувьтуральной яадкости Сотрите 4-недельного возраста обнаружены вецсства с цитоккниновой активность» (Rf 0,15-0,25 и 0,5-0,75).

У. Установлено, что цптоккнтш, выделенные из среди ботритис, после грубой очистки оказывали действие, подобное синтетическому аналогу - БАЛ, на развитие культуры спироделн.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

I. .Макарова P.и., Хуссейки К,и», Голосова Д.а» действие бен-зиладенина на рост изолированной культуры ряски/Экологические аспекты регуляции роста и продуктивности растений. Ярославль, 1991. С. 237-240.

2. Макарова Р.Б., Хуссейки и.£/, Ияияние экзогенных фитогормонов на всгетатявное размножение спиродела / Тез.докл. 11 кон$."Регуляторы роста и развития растений". П.: ТСХА, 19УЗ, ЧЛ. С. 44,

3. Хуссейки М.П. Цитокининовая активность культуральной среды гриба-йитопатогена Botrytls clnerea / Там яе, с. 72.

4..Sakarova R., Ilussejkl !.!arvan i., Kefell V, The abscislc acid effect on grontb of greater ducfcoeed (Splrodela polyrrhlza) / Abst. Int. Synp. Physiology of Abscislc Acid. Pushchlno, October 25-23, 1993. P. 32.

8..'Jarvan Yqusef Husselkl, R. V.iiakarova, a.V.Fl 1 laonova. Prospects of the use of higher »ater plants Lennaceae and pathogenic fungi Botrytls in biotechnology / Lebanon (In press).