Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

ФИЗИОЛ0ГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОЛИГОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "ФИЗИОЛ0ГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ОЛИГОТРОФНЫХ БАКТЕРИЙ"



АКАДЕМИЯ НАУК СССР

институт г.мкгошолопш

На правах рукописи•

сгишювнч

ТАТЬЯНА ВИКТОРОВНА

удк 579,22

$ изиолсях) -шош.ягшо юш особенности ожготрофшх-

бшввй* v

( микробиология - оз.оо,о7 )

АВТОР&6ЕРАТ диссертации на соискание ученой степе [ш кандидата биологических наук

МОСКВА. - 1985 -

Работа выполнена в отделе почвенных микроорганизмов Института микробиологии АН СССР

Научный руководитель гакадемикАН СССР Е.Н.Нгаустин

Официальнне оппоненты: доктор биологических наук

Е,П.Фео<$идова •

кандидат биологичес ккх наук, допент А.И.Нетрусов

Ведущее учреждение: Институт биохимии км. А.Н.Баха АН СССР

Защита диссертации состоится "ДГ» 1985 г.

в часов на заседании Специализированного Совета

Д 002,64,01 по защите диссертаций на соискание ученой отепенидоктора наук при Институте микробиологии АН СССР (117312,Москва, Проспект 60-^летия Октября, д.7, кор.2),

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института

' втореферат рааосяан»>&7 «' <2¿¡Т^/Ы^/З 1935 г.

чьл^Й секретарь Специализированного 1

Совета« кандидат биологических -наук

{¿С^'с—чЛ.Н.Москалепко

Актуальность 'проблемы. Олцготра|нне бактерия представляют со-' <5oil сборную в таксонслшческом отношения группу микроорганизмов, экологическая роль которых в природе связана с использованием, рассеянных источников углерода л энергии. Олиготрофы широко распространены в морских водоемах ( Akagl et оА. , 1977 ; Yemaelta et al. , 1978), озерной воде ( Iehida «tel. , I960), почвах ( Hat-tori , 1976 ; 1980) и других наземных местообитаниях: { Obta, Hat-tori , 1980). В литературе есть сообщения о морфологической адаптация олиготрофных бактерий к низким концентрациям питательных веществ, способах их выделения из природных субстратов, а также некоторых особенностях кинетики роста. Однако конкретные материалы, касалщиеся метаболизма »тих бактерий, весьма немногочисленны. Это связано в первую очередь с трудностям культивидованшг этих медленнорастущих микроорганизмов.

Цдя%„И. "Д71Т--»яптгтгааЛ работы состояла в

изучении особенностей физиологии и биохимии: олиготрофншс бактерий. Конвретные'задачи исследования бшш-следунцие: v

1. Получить сведения о динамике прироста биомассы пра длительном ' культивировании бактерий в.условиях полного обеспечения их роста источниками углерода к энергии и юшерадьншя компонентами. i

2. Исследовать аминокислотный'обиея ч*х£гогрофных бактерий, а именно, качественный и количественный состав пула свободных Внутриклеточных амшюкислот и активность отдельна* ферментов, участвующих . в биосинтезе аминокислот.'. '■■ ■ '.'-*- v. ' ' ■

3. Изучить динашку'содержания в биомассе нуклеиновых кислот при длительном культивировании бактерий. .

4. Получить даннне по авдогенному и субстратному дцханпэ олиготрофных бактерий аз разных таксономических" груш. v .

5; основании свеценгй'о динамике.эндогенного дшсагаш и содержания белка в биомассе бактерий оценить'-жизнеспособность олиготрсф-ных микроорганизмов в условиях 'длительВогоголодания.

Научная новизна пабо'тц. Изучена дпцашка прироста бкоиассы олнготрс^ннх бактерий,при периодическом культивировании на примере нескольких штаммов тшгачноЯ оляготрофоой хультуры ЦурЬоа1сго-Ыиго vulgare.. Получещше* данные свидетельствуют о медленном развитии это*1. бактерии даае'на оотимадьной для роста среде,',

Кнарьче исследовйш отдельные с торопи аминокислотного обмена бяктераР, в;частности,' -состав пула ■свободных Sityrpe— tc.ero4Ht.-K аи;111окислат^актдан^^®па^а?^12:аз11-(<«рлента, уча; . ■ .. 1 С: i. i.WaASi^-"- ''■'.-■.'■ ; * > К. Л-.: - '

ствушего в биосинтезе аминокислот семейства аспартата) и особенно-ста ее регуляции, а также пути'образования аспартата у данной группы микроорганизмов. Показано, чю в пуле свободных аминокислот у олиготрофных бактерий из нескольких-таксонов преобладают глутами-новая кислота, аланин, аепарагивовая.кислота.и глицин, Однако у штаммов типично-олмготрофной' бактерии * Hyphomlorobium vulgare наблюдается значительное увеличение процентного содержания лизина в пуле при длительном культивировании» Данное явление наряду с высокой аспартаткиназной ахтивностьп свидет ельствует о том, что в обмене этой олиготрофвой'бактерии.важноеместо занимает превращение аспартата с образованием лиэина..

Впервые были получены данные по динамике содержания нуклеиновых кислот в биомассе олиготрофных культур uethylob&oterium orga-nophilum , Hyphomicröblum vulgar*; в Hyphomonae oligotrophy при длительном культивировании.

Исследовано эндогенное дыхание у олиготрофных бактерий из раз-них. таксоноыических груш и показана способность этих микроорганизмов использовать широкий спектр веществ в качестве субстратов для дыхания.

При изучении динамики-эндогенного дыхания и содержания белка В биомасс8 7 культур Uethtf. obaot«rlum organophllum И Hjphonicго-bium vulgare в условиях голодания получены дополнительные данные о сохранении высокой жизнеспособности олиготрофных бактерий в течение длительного времени в данных условиях.

Практическая данность исследования. Полученные экспериментальные данные расширяв* представления об особенностях метаболизма оли готрофннх бйктерий, которыв до настоящего времени оставались весьма ыадоиэученндаи.

Сведения о. значительном увеличения процентного содержания лизина в пуле свободных аминокислот при:длительном культивировании, а также о высокой аспартаткиназной активности у олиготрофных штампов Hjphoalcrobtua ти1вах» дат основание полагать,. что изученные вами итамиы могут служить возможный объектом для генетических исследований, о цельв получениямутантных- шташов,. продуцируших лиева.

АпРОбмпщ раДогц. Материал« то^йртяним^ платяни ня 15-оЙ

KOiifepwauM молодых учета Биологического факультета ИГУ "Молодые ученио и основное направления развития современной биологии" и Гсс-юлзной кои^реншш иододнх ученых "Современные ироблемнбно-Х&яжж £мж1«>-д»огчеоков биадопга, яосвяненной 50-летию 1Ц1Н1!АЛ

СССР им. А.И.Баха.

Иу^цккаготи. материал» диссертации опубликованы в 3-х печат-них работах.

и структура очботн. /Диссертация состоит из введения» 4-х глав, заключения, выводов и списка ллтературн. Материалы из-ло-iRHW на 132 страницах малинописнога текста» вклшая 7 таблиц в 8 рисунков. Список литератур» содержит 64 отечестьегпшт и 209 нност>у_шт!х наименованаЯ работ.

оежсщ u

ОДьектн исследования. Обьектмзз исследования служили представители 3-х родов лочкуюпшгя бактерей - H^rphooleroMum , Hypho- . mwnas w Blaatobacter . Среди пгос была тштчно-олкготрофные штш.з.ш НурЬопаогоЫшв Tuigar« „ растущие только на мотаноде (gio и MP-160 ) или моиоыетляаг.яяе С в»г) в качестве источника углерода и я1{ерги11;,^и1ультат1гояо-ачиготрофянй штамм НурЬооюпав oll£o-tropha МР-85+ . растущий на обогашеннше органических средах; ев-тр<?1иш' >вташ Blaatobaeter ?d , способный к росту на

ряде орган 1гчееких субстратов (спгртн, сахара, органические кисло тн).* Кроме того, изучались '^^льтатнвво-олЕХОтрсЛние бактерии' из других таксономических групп; Seliberla etellota , Tuberotdo-baoter mutana U-2 , Mftthjlobacterium organophilura NP-220 . Эти культуры также способны расти на |>азнкг органических субстратах, а оташ m.organoptitlue вр-гго пвппется ^вжультатитш метилотро-'¡■ом.

условия культивпроь-цги^ оаитррш!. штамм» Hyphomiorobiuffl б^ге и Me thy1оbaot eriun organoph i 1 шж вкрпшивалйСЬ на жидкой иля агаризогашюИ мишрольной ерме * 337 (ltir*cfa , Centt , 1934) о 1% (об/ой) метанола (для штаммов H.TOlgeure кр-160 a gto и м.ог-gauopiiliuffl wp-гго ) или 0,75!i (в/об) монометиламша (для штамма Н, vulgar в g12 ). Для культивирована* Byphomoaae ollgotropha нр-854 использовалась органическая среда слацуппего состава (г/л) глтжоэа - I, прптон - I, дро.тквво!1 экстракт - I, водопроводная вода; ffli 7,2. Енраудаванае Sellberla stellate , Xuberoidobaoter nutans У-2 )i Blaetobacter vlееовца 7Л производилось ita картофельной среде. Культ пил poonirae бактерий проводили при 20 °С.

Птуч^п'с дгиаивки прироста биомасс» бактерий к вцполвч^я ^ima 1- кулг-туральнур "t'1;кость. Объектами исследования бити штам-ин Tir.ii'.'itioii одигитро-^юЯ Аавтеряи Hyphomloroblum Tulgnr» «Ю,

gta и НР-tfiO , которые культивировались «а качалке (150 оО/тт) в условиях дробного внесения метанола или одноразового внесения монометил амша. Начальная концентрация метанола составляла 1% (od/od), далее через 3 суток вносили по 0,5 мл метанола на 100 m сраны. Начальная концентрация монометвдамина составляла 0,75#(в/с*1).

Калячестгешюе определение лизина проводили по способу, являющемуся комйшшщей метода хроматографии па буг.iare, ирозлодетюго Успенской л Кретовпчем (1362) к его модификации (Kapa-í-typsa с со-авт., 1280). Предварительная очистка культуральлоА яцдкости поводилась с помощью ионообменной смоли Dowe* 50*х4 по методу, apemoxemtOLty Кретотчем с соавторами (I98IJ для определения ео-деряиляя аспарагшовоН кислот».

Анализ cpööoTpniz внутриклеточных аминокислот. После предварительного выращивания на соответствующих средах в течет!е 6, 12 « IS суток и поел еду чакего двухкратного отмяпашш фи о иологи ч ее ким раствором биомассу б ut торий доводили до абсолютно сухого веса, и затем свободные внутриклеточные аминокислоты экстрагировали 80^ раствором этанола. После 24-часовой экстракции в темноте экстракты центрифугировали, упаривали, сухой остаток растворяли в 2 ми ацетатного буфера с pH 2,2 (фирма ЬКВ ), и далее состав амиио-кпелот анализировали на автомата ее ком анализаторе аминокислот марки LKB-41-01 (Швеция).

Исследование, отдельных (Ъешентов аминокислотного .обмена у бактерий.. Получение ферментных препаратов и определение активности аспартаткиназн проводили по модифтшровашгому методу Блока (Кара-Мурза с соавт., 1970). При изучении регуляции аспартаткв-назной активности использовали как отдельные аминокислоты аскара-гшового ряда, так и различные napirae их сочетания в концентрациях С,5 , 5, 10 и 20

Реакции переамшшровандя с участием оксалоацетата изучались на гомогенатах разрушенных клеток. Для получения гомогенатов био- • массу бактерий после 6-суточного выращивания на агаризовстшшх средах дважды отмывали 0,1 И (фосфатным ■ буфером С pli 7,0), суспендировали в 0,1 M фосфатном буфере (píl 3,2) в соотношении 1:2 и далее разрушала ультразвуком в течение 10 мшгут с перерывам;! п ультра-1 звуковом дезинтеграторе иэв (Англия), мощность 20 кгп, пмплнту-да 8 мкм. Получайте гомогенаты доводили до pH 7,5 о помощью 15-20 МГ ífafíCOj • В эксперименте учитывали 3 юркачта, н с ос T.m реакционней см ее* дли кавдого иэ них Лги сл^цучтиН : (I ) 0,8 m

т.югената +■ 0,4 ыл води (контроль); (2) 0,8 tut гоьюгената + , 0,4 ил 0,03 M оксалоацетата аммония; (3) 0,8 мл гоиогената + 0,4 мл 0,03 M оксалоацетата калия. Инкубацию проводило при 37°С в течение 1,5 часа, после чего реакшш останавливали добавлением 7,0 га 9656 этанола. После стояния в течение ночи при 4°С осадок отдаляли центрифугированием, а надосадочную жидкость использовали для анализа аминокислот на автоматическом анализаторе аминокислот.

Аспартаэную активность (актирующую) определяли по образовании аспарагиноцой кислоты из фумарата аммония в гомогенатах раз-рушенних клеток ( Kretovioh et al., 1981).

Определена содержании нуклеиновых кислот в биомассе бактерий. Для получения биомасси, необходимой для анализа нуклеиновых кислот, культуры выращивали в течение G, 9, 12, 15 и 18 суток на минеральной среде £ 337 с метанолом или глюкоэо-пентоюю-дрожгевой среде. Для определения били взята навески биомассн (по 0,5 г), предварительно триддн отмытой от компонентов среды физиологнчес-шш раствором. Определение содержашя нуклеиновых кислот проводили но методу Cmtpima (1950) с предварительным выделением и фракционированием кислотонерастворимнх фосфорних соедкнеюй по методу Шмидта и Таннхаузера в модификации Белозерской (1972).

0пг|едвле1п1в эндогенного и субстратного пихания бавтешгй. Измерение интенсивности дыхшшя проводили па полярографо lp 7« (Чехословакия) с платиновым электродом Кларка, относящимся к типу кислородных электродов (Уильяме, Уилсон, 1970). Для измерения эндогенного дихашш использовали бактериальную суспензию, полученную поело трехкратного отмывания биомассц от компонентов среды и последующего ее ресуспендирования в 0,1 U фосфатном буфере (fil 7,0). Субстратное днхание определяли путем добавления к суспензии бактерий различных субстратов. Среди н:гх были натриевое соли органических кислот - ацетат, -Гумарат, су кишат; амию кис латы - аспар-тат, лизин; мжомо-пи«и.тн, пептон и дрояжевой экстракт. Конечная концентрация субстратов н ячейке налярогpaja составляла от 0,05 до IÍ.

Для изучешш динамки эндогенного Д1кгид:я а содир^шая белка В бвошеей в условиях голодания культуры 6aj:Tej'::ií пруль.'-рнтьгъно Еырдаиьалл в течение 7 суток на с роде jf 337 с ш.тьпьлг.н ( коициитршшя IÍ). Дат ее по ю ш iuqthq:: бпкт^гх-.ь.Р.' ■rja.w.im переносили в кал Ли Ht; ЙиО цд со 100 üi O.í 'Л {ос^га^г, Суицл (fil 7,0), cor.orïKïwco 4ХГ0*4 ü X¿:J04 . исол« :*Г0Г'; .-у.|'-г>'й' -VÍTJ-

-б -

¿провали в течение 30 суток на качалке (150 об/млн) с проведением промежуточных измерений интенсивности дыхания и содержания, белка в биомассе.

Содержание белка определяли по методу Лоури ( Lowry et al. 1951).

РЕЗУЛЬТАТЫ и огогаливш

I; Динамика прироста биомассы бактерий ffa ролной минеральной среде с источником углерода. Своеобразие олиготрофнцх бактерий, составляющих часть, "микрофлоры рассеяния" (Заварзнн, 1Э74), определяется прежде всего кинетикой роста; Такие показатели, как константа субстратного насыщения, минимальная скорость роста и ростовой урожаи у олнготрофных культур значительно отличаются от соот-ветствунвдих показателей евтрофных бактерий (Jannasch , 196? ; HlMch , 1977 . lio ale d J , 1978 ; Iahida, Kadata , 1981 ). Многие исследователи отмечали, в частности,, низкие урожаи биомассы и скорости роста бактерий рода llyphonicгоЫша ( Kaffka , I960; Ба-

uld, Uarsha.ll , 1971),*

В связи с этим представляло шггерес исследовать динамику прироста биомассы при периодическом культивировании для нескольких штаммов ТИПИЧНОЙ сишготрофной культуры Hyphomiorobium vulgare Культивирование штаммов н.vulgare проводилось на среде £> 337 с метанолом ( &Ю и HP-160 > и моншетиламином ( gi2 ). Полученные нами данные свидетельствуют о весьма замедленном развитии культур» для которых даже в условиях оптимального обеспечения питательными веществами максимальный прирост биомассы наблюдался на 6-0-е сутки и пе превышал 140 иг/100 мл:среды (повесу сухой биомассы). Такое ростовые характеристика изученных штаммов Hyphomiorobium vul-согласуются о литературными даншдш ( Izvmi et al.*, I9Q2 ;. Кдплшлгц «t al, 1982).

g. Особенности аминокислотного обмена алигот горних бактерц^. Имессшеся к настоящему времени сведения о биохимии олиготрофных бактерий немногочисленны, а данные об их аминокислотном обмене ир&ктическ* отсутствуют. В связи о зтиы била поставлена задача каучить некоторые аспекты аминокислотного обмена шшготрофных бактерий us нескольких таксономических груш. I> Сьоболиые внутриклеточные аминокислоты, ¡'.зучйпие в дкнзмике сатана пула свободных аминокислот прово-

лилось для представителей нескольких Таксонов олиготрофннх бакте-fwit, П именно, ДЛЯ Hyphomicrobluca , Ну phono пае , S el Iberia , Tuberoidobacter , Methylobaot«rium а евтрофной бактерии щ aet life etote г . В пуле свободных аминокислот у исследуемых микрооргаднэ-шг> на С-о сутки культиыцэовазтя преобладали глутаминовая кислота, алгшнн, асларагияошя кислота и глицин (данные для отдельных представителей из изученной групп» культур представлены в таблице I). Это согласуется с литературными данными о составе пула сво-волкнх внутриклеточных аминокислот у Гр(-) бактерий (Беэбородов, 1374 Tempeat et «j. , lD?f>>. Однако п^и увеличении срока культл-Е«[ювш1ия до 12-18 суток у штаммов типичной аднготрофноЯ культур НзгрпощЮгоЫи» Tuigdre бнда отмечена тенденция к увеличение со-дгр-казтя лизина до 30-50^ от размеров-пула' (рис. I),

I

SO -

Vi.

fj 0 g 50 -

te 0

a 40 -

Cl (a D 30 -

c? n 20 "

ф

<B CT 0 c,> 10 -

v ' 12 18

Рис. I, Динамика содержания лизина в нуле свободных аминокислот.

t-tVypho«l<iTObl«m vulRere glO 4-Seltberla etellat«.

____________« "—.—n S12 5-llyphoaonee oligotrophy МУ-854

■j^.i__________„* __„« нг-160 6-Tuber4ji4ob«eter nut*ae U-2

7-Bleetobecter rieooeu» 7d

Таблица I* Пул свободных внутриклеточных аминокислот и бащгссе

бактерий (нМ/мг сухой биомассы) и пшцентмоо седур>ла~

1ше в нем отдельных аминокислот.

---1-----

1 Культуры бактерий и сроки инкубации, сутки •

Аминокислот 1 НурПот1огоЫшп | Ме№у1о'Ьа<^ег1ит'

I Уц1еаге ДР-160 I оувапорЫ1ша 1ТР-220

1 ! 6 12 1В ! 6 12 18

аспарагиновая кислота И, 06 23,68 . 6,74 1.41 5,72 СЛ

тр^ония 2,51 0,91 ' 5,18 3,43 0,99 1.98

серии , 1,26 0,78 3,11 . 0,77 0.Е6 1,00

г^таминовая кислота 48,88 39(47. 7*25 .67,60. 70,30 20,95

еэолнн ■ '■ - -

ГЛКДИН 7,42 5,95 9,33 2,43 3,00 16,74

вдшшн 8,34 6,60 18,65 . * ¿,34. . 1,57 20,90

цистин 6,86' , - -

В8ЛИН ' сл . сл сл сл СЛ б.се

метионин сл ,ся ■'■ . СЛ . -сл ■ - 1,35

иэолейшн 0,57 . 0,65 ,1.55 0,89 0,68 2,30

Л«ЙЦИН 1,71 1,68 3,11 2,31 1,28 7,59

тирозин 4,68 2,59 5,18 3,79 5,54 6,06

. фонадплаяин 1,49 1,55 2,59 2,66 1,37 2,14

диэин 8,57 7,38 31,60 11,05 6,31 5,55

гиствдиа 1.37 1,29 2,07 сл сд. 0,70

аргинин - 2,17 0,65 3,63 1,34 2,20 6,71

ствола амжно-каслот(1Й/мГ" сухой биомассы 8.76 7,73 1,93 6,10 6,95 5,69

Примечание: сд — следы; означает, что аминокислота не была обнаружена.

Такая закономерность не наблюдалась длл факультативно-олиготроф-шсс и siiTpoíHoíi бактерий. В их числа не только культуры, раступдв на органических средах (картофельная и глюкоэо-поптонно-дрожжевая), но и растущий на метаноле Methylobaoterium org&aaphilum , Таким образом, тевдешшя к увеличению содержания лизина в нуле аминокислот при длительном культивировании,. наблюдаемая для. Hjtfionloro-bium vulgare, связана именно с особенностями данной культуры, а ве о составом среди.

2) Выделение лизина в культуралыгую жидкость.

С учетом выявленной нами закономерности, касающейся содержания лизина в нуле свободных аминокислот у Hyphomiorobiue TOlgar* , било предпринято изучение способности этих бактерий выделять лизин в культуральную жидкость.

Как показали результаты эксперимента, в целом выделение лизана ьо внешнюю среду было незначительным. Так, для метшютрофных штздмов Hyphonierobiwm vulgar« gio И' НР-160 содержание л из ива в культу рал bíiott жидкости не превышало 20 и 30 мкг/100 ш соответственно и практически не изменялось в течение периода с 3 по 17 сутки(рио. 2). Для itTRMMaglz , растущего на моноыетиламине, ха-

200-

150

- 100-

50-

~3-6 Ь й-£-Брьмя.сутки.

2. Дпшжика содержания лизана в культуральной квдкостжНлАа ralcrobíма «адат»: 1 - glOj 2 - у - ВР-160.

рактерно flanee значительное выделение лизина, который постепенно накапливается на протяжении всего времени аксиорииемт;) и достигает па 17-е сутки концентрации 180 мкг/100 мл.

В целом результаты эксперимента подтверждают положение о том, что выделение аминокислот во внешнюю среду носит специфический характер, и наибольшая концентрация какой-либо аминокислоты в метке не всегда сопровождается наибольшим выделением ее во внешнюю среду (Рубан с соавт., 1968), Кроме того, эти данные являются подтверждением экономности метаболизма олиготрсфшх бактерий, для которых характерна затрата энергии преимущественно на поддержите поглощения и невысокая в целом биосинтетическая активность < Jllrech , 1979).

3) Активность аспартаткиназы и особенности ее регуляции.

В литературе имеются сведения о значительном содержании лизина в белке штамма Hyphoaierobium ( Izumi *t al.» 1082). На основании этих введений и полученных нами данных по содержанию лизина в пуле свободных аминокислот представляло интерес определить активность аспартаткиназы (К& 2,7.2.4) - первого фермента на пути биосинтеза аминокислот аспарагинового семейства (лизина, метионана, треонина, изолейдана) из аспарагиновоП кислоты у исследуемых 1суль-тур.

Для всех культур отмечалось уменьшение активности аспартаткиназы в увеличением срока культивирования; максимум активности приходился па 6-е сутки (табл. 2), Была установлена корреляция между

Таблица 2. Динамика активности аспартатккиази (н!<1 аспартилгидро-ксаыовой кислоты/мин/ыг белка).

Культуры бактерий

Активность аспартаткиназы

Сроки иикубащш, сутки 6 12 ТВ

Kyphoaloroblun vulgar®

S«lit>*rU »4«U*ta~ Tub«ral4ob*at«r witttu) UTPtwKw>iuu oligotrophy Sl»*t»tM«t«r Tlaeoau« lUthjlot^oterlua cr-1 Мвтадол: «H^opíiiiua sp-кгго .{ KapT.arep,

4,2 7,2 6*4 o 2»7 2.9 3.6 4»в

з.г

шсокш уровнем аспартатютазноЯ активности и отмеченной ранее теццеюдаей к увеличению процентного содержания лизина в пуле аминокислот у представителей HyphomlcTobitun vulgar* .Остальные культуры ойпаД£1ЛИ значительно более низким уровнем ферментативной активности; промежуточное положение занимала Seliberi» stellate*

Так как аспартаткиназа является алдост ерическим ферментом, я ее активность регулируется аминокислотами аспарагинового сеыейот-ва, представляло интерес изучить особенности такой регуляции дня нескольких олиготрофных культур. Результата исследования, прове-дегагого для факультативно-олиготрофного штамма M*thylobaoteriua orcanophllura HP-22Q: и тшшчно-олиготрофных штампов Hyphomlorobi-um vulgar« gio и NP-160 , приведены в таблице Эг

Таблица з. Влияние аминокислот аспарагинового семейства на активность аспартаткиназы бактериальных культур

Относительная активность аспартаткиназы, £*от исходной *

Сочетания аминокислот

Hyphomiorobium vulgar«

Т

gto

hp-160

lletbylobao-terlu» or— ganoplillum ЯР-220

лиэнн + треошш, эквимо-лярнне концентрации О

лизин на фоне 0,5 MU тре-1 онина О

треонин на фоне 0,5 Ш лизина О

треонин -к метяонав, эк-ввыадярные концентрации. О

метиошш на фоне 0,5 vfi треонина О

треонин на фоне 0;5 Ш метионина О

22-30

! 19-33

26-30

26-37

59-66

О О О О О О:

* значения активности даны для концентраций амивокиолот 20 и 5 »41.

У штампов М Hetfaylobaetevla»

gaiiophil ип яр-гаопешюе подавление активности асоартатюшазы эывало совместное действие лпэквд я треонава, а также треонина и

- 1Z -

метионпна при всех исследованных котюптрашшх. Отдельно ьалтш аминокислоты не вызывали полного подавления активности Фермента, за исключением треонина,:который подавляя активность у штамма почти полностью (на 92%).

7 штамма Hyphomlcroblum vulgare HP-1 ¿о полное подавле!ше активности фермента вызывало действие треонина на фоне 0,5 Ш мети-онина. Подавление активности на 80£ вызывало совместное действие лизина и треонина в эквималярных концентрациях, а также лизин на фоне 0,5 Ш треонина. Отдельно взятые аминокислоты, а также другие их сочетания обладали меньшим ингибирующпм действием.

Проварка других возможных:парных сочетаний аминокислот семейства аспартата в отношении регуляции активности фермента показала, что полного подавления активности в остальных случаях не наблюдалось, и ингибирующее воздействие: этих сочетаний на фермент не превышало ингибировати, вызываемого отдельно взятыми аминокислотами (т.е. не было аддитивного действия аминокислот).

Проведенное исследование дает основание полагать,,что аснар-таткиназа исследованных- метилотрофних культур является поливалентный ферментом, который регулируется согласованию« действие).! 2-х пар аминокислотi: лизин + треонин и треонип + метиошш, т.е. по ти-nyPeeudomonaailuoreeoene ( Dung&a, Datt« , 1973). Поскольку изучаемые вами культуры не являются мутантами о нарушенной регуляцией аопартаткинази^ сверхпродунирующшш лиэш^ то, как и следовало ожидать, отдельные аминокислоты аспарагияового ряда и, в особенности, вышеуказанные их сочетания оказывали :ингибирующее воздействие на фермент.

4) Реакции,перваминировакия с участием щавелевоуксусной кислоты иасяартазная активность, Тевдендаяк увеличению процентного содержания лизина в пуле свободных аминокислот при длительном культивировании и высокая активность асаартаткиназы (фермента, участвующего в биосинтезе лизина из аспароптовой кислоты) у штаммов тилично-алиготрофноВ бактерии Hypho«lorobiue vulgare свидетельствуют о том, что значительное место в обмене этой культуры занимает превращение аспартата, катализируемое аспиртаткияазой, с образованием лизина. D связи с зтам была поставлена задача изучить пути образования асларагино-»oi киалоты как предшественника лизина у представитатей HypLsmi-ergblue vulgär* в ер1ннеши1 с другими тнксопа-и олиготро^шх du-теркй.

Кш: гзвестно, одшш из путей образования аспарагиновой кис-->i.)Tii янпяетсл нереамгт^ювание тавелевоуксусной кислот и о отдель-fîittiH аминокислотами, патализяру er.юе ашнотрансЗ-еразаш (КФ 2.6.1h Изучение реагсшиЧ п^регидаштрования аминокислот гоыогената с окса-лоачетптом калия и ¡илшния для представителей Hyphomiorobium » '¡¿•piicmonae и Не ti ty lo bac ter iura показало различие меяду культура как в отношении конечных продуктов, так и интенсивности про-TftKíimm реакций (табл. 4). Интенсивное образование аспарагиновой к:: слот» п обоих вариантах опита наблюдалось только у иггамков üypHomicrObiura vulgare g10 и HP-160- культур, в обмене которых, ¡■ля fí'tno показано ранео, важное место принадлежит лизину. У бак-Tepiiií Methylobacterium orgenophilvua NP-220 и Hypbomonae «ligo—

î:p-854 асплрагиновая кислота интенсивно тратилась в реак-1;.";ггх героашнирования с образованием глутамнновой кислоты и:ала-ту.;*;), У штш.иа HyphomieroDlum.vulgar« g12 в варианте опыта С ок-cvio^jiûTaioM аммония про походило образование небольшого колкчест-I" "vi'tpari'iwaoit кислоты, а в варианте с оксалоацетатом калия — ¡э гнггштолмюе уменьшение ее содержания. Такое различие трс.антами мо:яю объяснить тем, что в отсутствие экзогенного а;.? int i г но го-азота аспарагиповая кислота расходуется в реакциях iitipea'i г. ¡кропания с кетокислотами гомогената, являясь донором; ■-■•raiorpynn. Такт образом, по балансу аспарагиновой кислоты дан-пия культура зашелает проще уточное положение в изучаемой груше бактерг.Г.. * ■ ' ■ 1 ■

Другим изученным нами путем биосинтеза аспарагиновой кислоты íiuia реакция прямого аминировштя аммонием фуг,tapo вой кислоты, катализируемая ферментом аспартазой (Ki 4.3.I.I)..Было показано, . что у ша'.»в Hyphemia го Mua vulgare glO , g12 : и HP-léO , a TOR-* же llyphomoaae ollgotropha NP-854 аспартаза отсутствует. У штамма . Me 11\у 1 obeo t erium organophiluu HP-220 удельная активность GC-партаэи, выратлеиая скоростьп образования аспарагиновой кислоты,' составляла 0,14 ВМ/мин/иг белка.

Обнаружение аепартазной активности у быстрорастущего фажуль-тлти ш го-ол пготрофного итамма itethylobaoterlum orgaaophilua NF—22о , опадающего более интенсивным метаболкэмои (в частности, значительно более высоким уровнем эндогенного днхания), согласуется с лктературинми данными о наличии высокой активности аепар-таэн имршю у быстрорастущих микроорганизмов ( Virtaaeo, T«rruuiea, 1232);.

ТаЛдаа 4. Сантез шдаоетсло? s реакциях переашгарования с участием оксалоапетата (нМ/шн/ыг áacta).

Культуры бактерий и варианта опыта

Ашнокаслоты - ! НурЬоа±вРоЪ1ит vulgare [ ¡tothylobftct»- 1riun огтаао- gtO H?-160 g12 (рШиа №-220 Hyphoeonae oligotro-pba ífP-054

■ i 1 i i I nil' II ! I II i I II i и

аспграгшовая -кгиота ллзин трескго метиоанн гэолейлин - глута-дшовая ■ кислота- +0,309 +0,480 -0,354 . -0,356 ■ i +0,274 +0,392! +0,058 . -0,379! -0,139 -0,139 i +0,033 i +0,020 r t ! +0,026 !.+0,019 i 1 j +0,084 +0,0473 t 'l i +0,030 +Ö.0C5! г t i i -0,338 -0,331! +0,763 +0,612! +0,592 +0,345; -0,630 -0,663 -0,164 -0,025

ишан

! +0,053 +0,051

. i

+0,062 +0,064! +1,836 +0,539! -0,079 -0,174! +1,626 +1,338

сараант I - язя

f п _ fi

с оксалоацетатрц аммонал ' ---—" калия

- расходование аминокислот

3.- Динамика содержания нуклекновшс кислот в биомассе бактерий. Существенный моментом, дополняющим картину фазиолого-биохимичее— ких особенностей олиготрофных бактерий,, является .динамика содержания нуклеиновых кислот в биомассе бактерий при длительном культивировании»

Изменение содержания нуклеиновых кислот в биомассе при длительном культивировании изучали у культур, различавшихся по питательный потребностям: метшготрофкых культур Hyphomlcroblum vulgare glO и Methylobacterium оrganopUUuo 1ГР-220 , а также растущей на глюкозо-педтонш-дрожжевой с реле Hyphomonaa ollgotropha МР-654.

Установлено, что в условиях длительного культивирования у фа-культативно-олиготрофного штамма Hyphomonae ollgotropha НР-В54 содержание ДПС в биомассе уменьшается в 3 раза (табл. 5).

Таблица 5. Динамика содержания нуклеиновых кислот в биомассе бактерий.

Т

Время, , HiKt „p/r cpcofl биомассы !

сутки I ■ ..... ■■ р ■ ■■■ — ■ !

| gto | HP-22О | мг-В54 j

т

т

! 37,40 I 17,65

! 29,47 ! I I

j 37,54 I 18,19 j 21,43

¡37,70 j 18,59 I 19,95

6 9 12

15 | 32,15 I 20.10 } 11,84 {{

18 j 26,45 j 21.18 ( 9,98 ||

JJfEt, ыг/r сухой биомасса t—

T

£10 . 1ГР-220 HP-Q54

3,33 2,63 0,26

4,32 2,83 0,16

5,35 3,05 0,10

5,69 3,4В 0,10

6,26 3,65 0,13

Убыль в содержании НОС, .хотя я не столь значительная (в 1,4 раза), отмечена также для шташа ЧурЬ»*1вгвМм* vulgar* g10. в то se время у шташа Itethylebaotertun orgMMfhUwi НР-220 набладалось увеличение содераашш ШК в биомассе.

Содержите ДНК у факультаттшно-алиготрофиоЗ бактерии SP-вЗ* ( способной к росту на обогащенных средах, уменьшается на 18-е сутки в 2 раза по сравнении с содержанием на 6-е сутки.

С другой стороны, для штам.юв gio и íP-220 позгаэано ували-чешю содержания Д!Ж при длительном культсвгрсьаяяи {для стаюа «ю- в 2 раза, для иташа ир-гго - я 1,5 раза).

Отличное от других культур поведение штамма НурЬошопаа о11ео-¿горЬа НР-854 можно, по-видимому, объяснить возможной деградацией макралолекулярниг компонентов,, наблвдаюиейся у ряда бактерий и условиях длительного питательного истощения (воу!еп, Ш1ка , 1978). По-видимому, у данной бактерии-это являние тлеет место уже при длительном культивировании. Оно может бить связано с более высокими энергетическими тратами указанного микроорганизма, растущего на обогащенных средах, по сравнению с олиготрофными бактериями, растущими на минеральной среде с метанолом.

Тот факт,.что в отдельных случаях наблюдается небольшое увеличение содержания в биомассе нуклеиновых кислот, можно, вероятно, объяснить не столько их синтезом, сколько уменьшением содержания в клетках других компонентов (в частности, запасных веществ).

4. Эндогенное и субстратное .имущие бактерий. Потребление кислорода интактнши клетками микроорганизмов как в отсутствие субстратов для дыхания, так и при наличии их может служить ценным показателем напряженности энергетических процессов и интенсивности метаболизма.

Из изученной нами группы культур наиболее высоким уровней эндогенного дыхания (98 нг-ат 02/мш|/(Л' белка) обладала бнстрорасту-щая факультативно-олиготрофная бактерия Иагьуюьа^епит огеапо-рЬ11ит НР-220 ( несколько более низким (60 нг-от 02А1ин/цг белка)-евтрофтй игами В1аа1оЪас*ег у1яооаиэ 7<1 . Осталыше культуры характеризовались эцдогешшм дыханием в 2-6 раз менее интенсивным (рис. Э). В эту группу попали типичио-олиготрофныо бактерии рода 11ур1юш1сгоЫиа ( а также медленнорастущие факультативно-олиго-трофиие бактерии родов Зв11Ьвг1а , ЦурЬотопаэ и ТиЬего1|1оЪао1ег.

При изучении субстратного дыхания было показано, что стимуляции дыхания вызывают практически осе субстраты, причем размеры »той стимуляции в ряде случаев превышают 300* от первоначального уровня эндогенного дыхания (табл. 6). Лишь в отдельных случаях некоторые субстраты ингибировааи дыхание культур. Так, у и?рЬоп1агоМод ти1£аг* ¿12 набдвдапось ингибировоние дыхания глюкозой, Л113Ш1СМ и ПШТОНОМ; У ЯеНЬвПа , ТцЬего1аоЪас1ег и В1ав-Л«ъ««1«г - ^ума^тсм.

НузхиЯ уровень эндогенного дыхания типмчяо-олиготрофной и мед-лешюрютуцих »1 акуль тпт и вн о-ал и гот ро 'н их культур подтверждает аэ-Еестиов в литаратуро полеченно об экономности метаболизма иииго-Т£ч>)ти ил к |ч.х> р гго' изиов ( ЩгасЬ , 1?73). Даянно но еуость о-ному

Рис, Э. Уляогоююв дыхание бактериальных культур.

1 - Hjpbomleroblum vulgare g10 5 - Seliberla atellotu

г - "----------" "-----и gl г & - Tub его ido Ьао t er atrteas 0-2

у - "----------" ••--HP-160 7 - Blaitobaoter vleooeue 7d

4 - Ilyphamorma ollRotropha NP-95i 8 - ltethylobaaterlwn organo-

phllnra KP-220 ,

днханюо nnopnue демонстрируют миксотрофизм изученной группы бактерий в отношении источников энергии, хотя, как известно, для конструктивного метаболизма представителей рода Byphoniicrobiu* необходимы одноуглеродтю соединения С Hordel Attwood , 1978);

5t- „Эндогенное дшеанне и динамика. с одер-канн я белка в биомассу бактерий в ус лото пт гатодаш^. Известно, что способность к длительному выживанию в условиях голодания является одной из.характерных черт алиготро^т-'Х бактерия С Fe>lnäext*r , I9SI); В литературе К нас-тошему ррвмс'гп ипчотся пттло сведений, касапцлхся способности к плиттыюму ргжитшэт я голодных условиях ноколчий { Robertson, imtt , IP73) и кщчнн^'Ормнмх бпктерпЙ ( Scher «г, Boyl«n , 1977 j

Ноу I еп , Ми 1 h n , i ;>?(! ),

Та&акса 6* Су^тратное дыхание цулмур (в % от эндогенного).

Субстраты

Культура бактерий 2 концентрации субстратов, %

| ВурЬол1егоЪ1пп ти1еага ЖР-160 !

М«Ицг1оЬав* вг!иа «гввпорШша 5Р-220

Г [ 0,05 0.1" 0,5 Г

апетат [ 400 375 300 " 275

£угзрат ! 275 [ 250 200 175

суташат ! 450 450 500 200

аояартат ! 225 1 225 400 ' 400

ЛЕЗИН ! 260 ; 255 275 275

кономегаггон 1 - -

звитоя ! 300 300 300 340

дротевой экстракт ! 350 I 325 335 350

275 240 300 300

| 0,05

0,1

!

- ! 300

I

I 325

I

310

255 310 350 338 200 '313 330 325

250 150 188 313 288 180 445 200 263

225 132 175 288 225 140 413 163 263

- не определяй

Преимущество в выживании организму дает как наличие ■ резервных . материалов, деградирующих предпочтительно (ran Haute, Jansen f 1962 ; Sierra, Qibbons , 1970), так и низкая интенсивность зндо- ■ генного метаболизма (Boylea, Bnaign » 1970 j D*w«a , 1976)..

Нами била поставлена задача изучить поведение в условиях голодания двух культур, -значительно различающихся по физиологии i ти— пкчно-олиготрофного штамма Hyphomiorobinn -mlgare *P-1f>0 и быстро-растуцего факультатишо-ол и го тройного штамма luthylobeoteriun ог-ganophilunt ЫР-220 . Б результате проведенного исследования, включавшего изучение динамики эндогенного дыхания и содержания балла в биомассе, выявлены существенные различия между отими'бактерлялх;

Уровень эндогенного дыхания обеих культур наиболее резко снижался в течение первых 6 суток гслоланюга составлял по окончании этого периода для шташов Н.vulgare HP-ißo и U. organophlliwi. мр-220 соответственно 25% и 22% от первоначального уровня(рис.4),'

1100 --

. so -

Ереил, сутки

tuü. 4, Яннамика эндогенного дыхания культур в условиях голодания.

1 -Hyphontlorobiu» vulgär« »P-160(,2 - Mathrlobaoterlu» nophiiue жр-гго.

— tu —

■Далее у штамма {{.vulgare МР-160 наблддадась стабилизация эндогенного дыхания на данном низком уровне на 12-е и 18-е сутки, и jnmff. к концу эксперимента (30-е сутки) уровень эндогенного дыхания снижался до 13% от первоначального. В то же время у штамма M.organopbllum НР-220 происходило постепенное уменьшение интенсивности дыхания вплоть до нулевого значения на 30-е сутки.

В отношении динамики содержания белка.в биомассе при голодании культуры также различались.

Для штЕаама H.vuleare .Hi-l60 ' содержание белка в биомассе на протяжении 18 суток голодания изменялось незначительно и линь к 30-м суткам снижалос&;на2%%\а у штамма iLorganophilum NP-220 довольно значительное уменьшение содержания белка обнаруживалось на каждом из этапов измерения в течение длительного (30 суток) промежутка времени и составляло, в среднем, за каздие б суток около 1%, а в сумме - 4,8£{табл._7).

Полученные данные свидетельствуют в пользу более экономного . метаболизма тюшчно-олнготрофяого штамма Изпйюв1о го Ыша vulgare ИР-160 , который, в результате, обнаруживает способность к более длительному выживанию в условиях голодания. Различие меаду штаммами в изменении содержания белка в биомассе объясняется, по-видимому, более выраженной способностью штамма н.vulgär» ИР-160 к накоплению и последующей реутилизации резервных веществ, по сравнению со штаммом H.organophlluiD ЯР-220 . Наличие резервных материалов дает возможность клетке в меньшей степени расходовать при голодании балок в качестве энергетического субстрата ( Poindeiter, 198Г).

Таблина 7. Динамика содержания белка в биомассе бактерий в условиях голодания (в % от веса сухой биомассы).

Вреия, ¡Культуры бактерий и содержание белка в биомассе, %

суткя | • Н.vulgär« HF-160 . U.organophilum НР-220

0 } . ■ : 34;82 ' '; ' / , * 15,92

6 ]; " 34,45 : 14,84

12 { 34,20 13,75

18 | 33,79 12,43

30 ■ : 32,85 11,12

ШБОДЦ

\

I.. Согласно литературная даняш, а/шготрофшм шшроорганиэмаы свойственно медленное развитие. Проверка данного явления в опытах о несколькими культурами Hyphomlcrobium на оптимальных ■для этих культур средах позволяет подтвердить данное положение,, которое объясняется их специфической физиологией,

2. Изучение состава пула свободных аминокислот у ряда одиго— трофных культур выявило преобладание глутанкновоЗ кислоты, аланл— на, асоарагииовой кислоты и глюоша. У штаммов Hypbomlorobiun-vulgare при длительном культиваровашы наблюдается значительное увеличение содержания в пуле лизина (до 30-50SC),

3. Бьсокая аспартаткиназ ная активность олиготрофнъсг бактерий Hyphomlcrobium vulgare и интенсивноеобраэование асварагиновой кислоты в реакции переашмирования с океан оацетатом свидетельствуют о том, что характерной особенностью аминокислотного обмена этих культур является превращение аспартата о образованием лизина.

4. Аспартаткиназа метплотрофных культур HyphoalcroMim vulgare и Uethylobacterlum огвапорЬИип является пестивалентюаа ферментом, который регулируется согласованию! действием двух пар аминокислот: лиэин+треошга и треошш+метионив. ■

5. Аспартаза, катализирующая реакцию прямого ашпшрования фу-марата, отсутствует у олиготрсфшх бактерий HjphonlorabluiB rulga-ге и Hyphomooas oligatropba и обнаружена у быстрорастущей, фа-культативно-олиготрофной бактерии Mathylobaoteriua organophlluH.

6. В условиях длительного зддьтп&ированая у олиготрофнж культур наблвдается незначительное изменение содержания нуклеиновых кислот. Исключением является культура Hyphomonae ollgotropha , имеющая более вне о кие энергетические траты по сравнению с олиго-трефшми бактериями, {кастушвга на метанол е.В биомассе данного микроорганизма имеет- место* значительное уменьшение содержания РНК и ДИК. '

7. Олпготрофным-бактериям S«llb«la, HypbOKLerobluii, Hypbo-юопав и Tubaraldobaot'er . свойственна более низкая интенсивность эндогенного дыхания,(10-30 нг-ат Оь/ют/мг белка) по сравнению о евтрофной культурой Blaatobaotar <60 нг-ат 02/мин/мг балка) и бис трорас туш eil ¡¡акультятивно-олаготрофной бактерией Methjlobaota-Пшп {98 нг-ат СЦ/мин/мг белка). - . - -v

8. Установлена го^молность днхаяия олиготрофнюс бактерий из•

разных таксономических групп на широком спектра субстратов. Представители Hyphomicrobium vulgare способ!Ш использовать в качестве источников энергии ряд соединений, не поддерживающих обычно их роот (сахара, аминокислоты, органические кислоты).

* 9, Олиготрофным бактериям свойственна длительная выживаемость в условиях голодного существования. При длительном (до 30 суток) голодании у бактерии Hyphomlerobl«m vulgare отмечена стабилизация эндогенного дыхания на низком уровне, составляющем 13-25Я от первоначального,« лишь незначительное снижение содержания белка в биомассе (на 2%)*

Список работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Степанович Т.В., Никитин Д.И. Свободные внутриклеточные аминокислоты олиготрофннх бактерий. - Микробиология, 1984, т. 53, * 2, с.223-227.

2, Степанович Т;В. Особенности метаболизма олиготрофных бактерий. - В кн.: Молодые ученыеи основные направления развития современной биологии. Труды 15 Конференции молодых ученых Биологического факультета МГУ. - М,, 1984, ч.1, с.7-XI.(Рукопись деп. в ВИНИТИ 27 августа 1904 г.,* 6014-84).

3; Степанович Т.В., Никитин Д^И, Влияние аминокислот семейства аспартата на активность аспартокинаэы олиготрофных бактерий. -Микробиология, 1985, Т.54, Л I, е.162-163.

Подписано в печать[{tjSf. 5 . Тира* Jif. Заказ Бумага типогра^квя » 2. Ротапринт. Бесплатно.