Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Физико-химическая характеристика гамма-цистатионазы печени крыс

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Лупу, Емилия Ивановна

ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

Глава I. МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ И ОСОБЕННОСТИ ФУНКЦИОНИРОВАНИЯ ft - ЦИСТАТИОНАШ.

1. Пересульфирование - основа метаболизма серу-содержащих аминокислот

2. Цистатионаза из различных источников.

3. Методы выделения и очистки ^-цис та тиона зы из печени крыс

4. Спектральные свойства препаратов, их молекулярная масса и содержание пиридоксальфосфата

5. Макромолекулярная структура

6. Ферментативные реакции, катализируемые у-циста тионазой.

Механизм десульфирования ь-цистеина и расщепления ^ -замещенных L-аминокислот.

7. Строение активного центра ^ -цистатионазы . 32 ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Глава П. МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И МАТЕРИАЛЫ.

Глава Ш. ПОЛУЧЕНИЕ ШС0К00ЧИЩЕНН0Г0 ПРЕПАРАТА ^ -ЦИСТАТИОНАШ ПЕЧЕНИ КРЫС И НЕКОТОРЫЕ ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ФЕРМЕНТА

1. Выделение и очистка ^ -цистатионазы

2. Кристаллизация фермента

3. Характеристика препаратов фермента

Глава ЗУ. ИССЛЕДОВАНИЕ ВТОРИЧНОЙ И ТРЕТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ $ -ЦИСТАТИОБАЗЫ.

1. Вторичная структура фермента.

2. Влияние додецилсульфата натрия на конформа-ционные изменения молекулы фермента.

Глава У. ИССЛЕДОВАНИЕ ЧЕТВЕРТИЧНОЙ СТРУКТУРЫ ^-ЦИС

ТАТИОНАЗЫ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Физико-химическая характеристика гамма-цистатионазы печени крыс"

В Институте молекулярной биологии в лаборатории химических основ биокатализа, руководимой академиком А. Е. Браунштейном, в течение длительного времени проводятся работы по изучению ключевых реакций азотистого обмена, в том числе обмена серусодержащих аминокислот, - реакций, катализируемых различными пиридоксаль-фосфат-вависящими лиазами. Эти работы привели А. Е. Браунштейна и его учеников к выявлению и истолкованию обширного круга биохимических превращений и к раскрытию общих закономерностей ферментативного катализа, в частности, - пиридоксалевого катализа. Практическое значение указанных исследований состояло в объяснении существенных для клиники нарушений азотистого обмена, включая обмен серусодержащих аминокислот в патологически измененном организме, возникающих как следствие экзогенных или эндогенных причин, а также к научному обоснованию разработки сбалансированного питания.

В ходе проведения этих исследований стала очевидной необходимость получения высокоочищенннх препаратов изучаемых ферментов. Эта задача была решена для большого количества лиаз, что позволило более детально исследовать каталитические свойства пиридок-сальфосфат-содержащих ферментов, осуществляющих реакции замещения аминокислот при ^-углеродном атоме. По мере исследования деталей механизма пиридоксалевого катализа выяснилось, что большую роль в проявлении биологической активности ферментов играет структурная организация молекулы и динамика ее изменения в процессе катализа. Следует отметить, что до последнего времени остаются недостаточно изученными лиазы, катализирующие реакции по типу оС ,р и , у -элиминирования (аллииназа, ^-цистатионаза и др.). Вследствие указанных обстоятельств объектом настоящего исследования была j^-цистатионаза печени крыс, катализирующая реакции расщепления ь -цистатионина, l-гомосерина, дженколовой

Полифункциональность этого фермента и небольшое число субъединиц, составляющих его молекулу, делает исследование свойств и структурных особенностей у-цистатионазы, взаимосвязи между ними особенно актуальным, т.к. позволяет надеяться на возможность выявить некоторые структурно обусловленные закономерности механизма действия ^-цистатионазы, имеющие значение для всего класса лиаз этого типа. Исследование fl-цистатионазы представляет также специальный интерес, поскольку этот фермент обеспечивает в метаболизме серусодержащих аминокислот у человека и животных заменимость l -цистеина в результате его образования из l -метионина.

Цель работы. Основными задачами данной работы являлись:

1) разработка препаративного метода очистки ^-цистатионазы печени крыс;

2) исследование основных физико-химических свойств фермента;

3) исследование структурной организации фермента;

4) выяснение роли пиридоксальфосфата (ПЛФ) в стабилизации структуры фермента и создании его биологически активной конфор-мации.

Научная новизна работы. Разработан метод очистки у-циста-тионазы печени крыс, отличительной особенностью которого является совмещение на одном из этапов очистки процесса высаливания белка сульфатом аммония с фракционированным осаждением этанолом. Разработанный метод позволяет получать препараты фермента с удельной активностью 600 мкмоль'ч^'мг"1 белка и с общим выходом активности порядка 40 что практически в два раза превышает кислоты и лантионина, десульфгидрирование l -цистеина также расщепления ы , в -диаминопропионовой кислоты данные опубликованные в литературе. На гомогенном препарате фермента были исследованы основные свойства белка, такие как его молекулярная масса и изоэлектрическая точка, условия его хранения, стабильность фермента по отношению к изменениям рН, нагреванию и охлаждению, константа седиментации, определен аминокислотный состав. Разработаны условия кристаллизации и впервые получены кристаллы фермента из растворов полиэтиленгликоля (ПЭГ).

С использованием метода кругового дихроизма (ЙД) получены приоритетные данные о вторичной и третичной структурах ^ -циста-тионазы из печени крыс.

Методом электронной микроскопии с одновременной гель-фильтрацией изучена четвертичная структура фермента, влияние на нее различных реагентов. Установлено, что у -цистатионаза печени крыс является олигомерным ферментом, состоит из 4 идентичных субъединиц с молекулярной массой 45 кД. Электронно-микроскопио ческое исследование показало, что субъединицы диаметром 40-50 А упакованы в структуру типа изологического квадрата со стороной 80-90 А.

Практическая ценность работы. Разработанный метод очистки у -цистатионазы характеризуется простотой, доступностью, относительно малой трудоемкостью и хорошей воспроизводимостью; поэтому он может быть рекомендован для использования в лабораториях научно-исследовательских институтов и кафедр, занимающихся изучением данного фермента. Разработка условий кристаллизации позволила наметить пути к получению крупных кристаллов, пригодных для рентгеноструктурного анализа фермента.

Исследование роли кофактора, его спектроскопических характеристик открывает путь к созданию детальной молекулярно-кинети-ческой модели действия ^-цистатионазы и объяснению механизма олигомеризации фермента.

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Лупу, Емилия Ивановна

ВЫВОДЫ

1. Разработан препаративный метод очистки у-цистатионазы печени крыс. Получены гомогенные препараты фермента с удельной активностью 600 мкмоль.ч^-мг""1 белка при выходе общей активности до 40 %.

2. Исследованы некоторые физико-химические свойства ^-цис-татионазы. Установлено, что изоэлектрическая точка фермента находится при рН 8,56, молекулярная масса равна 180 £10 кД, константа седиментации 8,24s . Определен аминокислотный состав фермента.

3. Разработаны условия кристаллизации и впервые из раствора полиэтиленгликоля получены кристаллы -цистатионазы.

4. Методом кругового дихроизма исследована вторичная структура ^-цистатионазы. Установлено, что холофермент содержит 22 % U -спиралей, 14 % j3 -структур, 14 % р -изгибов и 50 % молекулы находится в неупорядоченной конформации.

5. При помощи метода электронной микроскопии установлено, что нативный фермент состоит из четырех идентичных по форме о субъединиц (диаметром 40-50 А), упакованных в структуру типа о изологического квадрата со стороной 80-90 А.

6. Наблюдаемые нами значительные изменения спектров БД (в ароматической области), а также данные электронной микроскопии указывают на роль ПЛФ в формировании макромолекулы ^-цистатио-назы.

За научное руководство, постоянный интерес, плодотворные обсуждения и указания сердечно благодарю доктора биологических наук Елизавету Васильевну Горяченкову.

Приношу искреннюю благодарность академику Александру Евсеевичу Браунштейну за неизменное внимание, доброжелательность, поддержку, за интерес к работе и ценные критические замечания.

За помощь в оформлении благодарю Габибова Александра Габибовича.

Благодарю сотрудников Института за дружескую помощь и поддержку.

100.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

-Цистатионаза - пиридоксальфосфат-зависимая лиаза, является одним из основных ферментов обмена серусодержащих аминокислот. Этот фермент обеспечивает заменимость в питании человека и животных l -цистеина, катализируя его образование из ь -метионина.

Для всестороннего энзимологического исследования макромоле-кулярной структуры фермента, его механизма действия, для его кристаллизации необходимо располагать значительными количествами гомогенной ^ -цистатионазы. Поэтому нашей первостепенной задачей была разработка метода очистки ^-цистатионазы. Предлагаемый метод существенно отличается от ранее опубликованных [ 89, 93, 103, Из] . Он характеризуется простотой, хорошей воспроизводимостью и быстротой выполнения. Метод позволяет получить препараты фермента с удельной активностью до 600 мкмоль^ч"1 на мг белка при общем выходе активности порядка 40 Гомогенность полученных препаратов была установлена по совокупности критериев, таких как: ферментативная активность, спектральные характеристики, данные аналитического ультрацентрифугирования и электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия. Приведенные в литературе максимальные величины удельной активности ^-цистатионазы составляют 300-350 мкмоль*ч""* на мг белка (см. табл. 2 в литературном обзоре) при общем выходе активности до 20 По этим показателям полученные нами препараты фермента примерно в два раза превышают литературные данные.

За счет подбора оптимальных условий осаждения фермента этанолом процедура очистки была существенно ускорена. При отработке соответствующей стадий важно было экспериментально подобрать оптимальную концентрацию сульфата аммония. Было найдено, что при концентрации белка порядка 20 мг/мл перед началом осаждения фермента этанолом концентрация сульфата аммония в растворе должна составлять 176 мг/мл (28 % насыщения). При более высокой или более низкой, чем оптимальная, концентрации сульфата аммония результаты значительно хуже. Уже на стадии осаждения этанолом получали препараты фермента с удельной активностью 358 мкмоль-ч""1 на мг белка и с общим выходом активности порядка 46 %. При подборе последней стадии очистки ^-цистатионазы мы воспользовались результатами определения значения изоэлектрической точки фермента. Молекулы -цистатионазы при нейтральных значениях рН заряжены положительно. Это позволило применить хроматографию фермента на ДЭАЭ-сефацеле. При этой операции белковые примеси адсорбируются ионообмеником, а ^-цистатионаза элюируется исходным буфером.

Различные критерии, использованные для характеристики полученных препаратов, позволили установить ряд физико-химических признаков фермента, частью подтверждая данные о свойствах фермента, имеющиеся в литературе, а во многом и дополняя их.

По мере исследования деталей механизма пиридоксалевого катализа стало ясным, что большую роль в проявлении биологической активности ПЛФ-зависимых ферментов играет структурная организация молекулы фермента и динамика ее изменений в процессе катализа. Структурная организация молекулы может быть детально изучена при наличии кристаллов фермента. В литературе описано получение кристаллов % -цистатионазы из растворов, содержащих определенные концентрации сульфата аммония ^89, 93 ]. Авторы использовали кристаллизацию на последних стадиях очистки фермента. Полученные ими кристаллы были очень мелки, а весь процесс кристаллизации трудно воспроизводим, как отметила в своих исследованиях Браун с сотр. [ 36 J . В связи с этим для получения кристаллов jf -циста-тионазы нами был положен в основу метод с использованием полиэтиленгликоля, разработанный для других белков Макферсоном [96а]. Полученные нами кристаллы имели вид игл длиной 0,12 мм, что намного крупнее кристаллов, полученных из растворов сернокислого аммония. Разработка условий кристаллизации (рН буфера, концентрация белка и полиэтиленгликоля, t° ) позволяет наметить пути к получению более крупных кристаллов, пригодных для рентгенострук-турного анализа. На достигнутом пока уровне исследования ^-цис-татионазы, получить данные о трехмерной структуре фермента едва ли возможно.

Ввиду этого, было интересно исследовать вторичную структуру фермента, его конформационную подвижность, факторы, влияющие на нее, методом КД. В результате исследований фермента методом КД установлено, что ^-цистатионаза имеет достаточно стабильную вторичную структуру и содержит 22 % о<-спиралей, 14 % J3-структур» 14 % р -изгибов; остальная часть молекулы находится в неупорядоченной конформации. Иная картина наблюдается в отношении спектров КД^полученных в ароматической области 250-320 нм. Из всех изученных факторов (тепловая обработка в процессе очистки, действие необратимого ингибитора dl -пропаргилглицина) наиболее сильное влияние на характер спектров в этом случае оказывает ко-фермент - пиридоксальфосфат. При его отщеплении от молекулы фермента отрицательные полосы КД с максимумами при 295, 285 и 262 нм почти исчезают и появляется новая положительная полоса при 290 нм. Изменения спектра КД, связанные с потерей ПЛФ, носят полностью обратимый характер.

В литературе, к началу настоящей работы, сведения о четвертичной структуре исследуемого фермента были малочисленны и во многом противоречивы (см. литературный обзор). Единичные работы, посвященные выяснению олигомерной структуры ^-цистатионазы были выполнены с помощью методов электрофореза в ПААГ в присутствии додецилсульфата натрия и ультрацентрифугирования.

Для адекватного описания четвертичной структуры мы обратились к прямому методу ее регистрации - к электронной микроскопии высокого разрешения. Этот метод позволяет использовать при исследовании низкие концентрации белка и дает возможность судить о четвертичной структуре молекулы фермента, не нарушая ее цельности.

С помощью данного метода установлено, что нативный фермент состоо ит из четырех идентичных субъединиц диаметром 40-50 А, упаковано ных в структуру типа изологического квадрата со стороной 80-90 А. При исследовании четвертичной структуры ^-цистатионазы наибольший интерес, тесно связанный с особенностями структурной организации молекулы фермента, представляет выявление роли пиридоксаль-фосфата в создании и стабилизации конформационного состояния фермента.

Изменения конформации у-цистатионазы при отщеплении ПЛФ, обнаруживаемые методом КД, менее компактная четвертичная структура апофермента, различная устойчивость холо- и апоформ, а также восстановленных На-боргидридом холоформ к воздействию 6 М мочевины - все эти данные говорят в пользу того, что ПЛФ играет определенную роль в поддержании четвертичной структуры и необходим для создания биологически активной конформации фермента. Об этом же свидетельствуют и известные из литературы результаты. Так, еще Мондови и сотр. [98] отметили, что инактивация диализированной % -цистатионазы в отсутствие избытка ПЛФ может быть обусловлена большей лабильностью молекулы при потере ПЛФ. Как считают Шатанье и сотр., ПЛФ в концентрации М защищает фермент от денатурации при нагревании (до 50°) и при обработке 2,5 М мочевиной [ 45 J . Более того, ПЛФ добавленный перед инкубацией ^-цистатио-назы с протеолитическими ферментами, частично защищает ^-циста-тионазу от инактивации [ 47 J . Известно, что апоформа фермента чувствительна к действию сериновой протеазы, в то время как холо-форма не чувствительна [ 22 ] . По-видимому во всех этих явлениях существенную роль играет вся сумма ковалентных связей кофактора с протомерами. Возможно, с одной стороны, что ПЛФ при связывании с апобелком -цистатионазы меняет его конформацию, а с другой стороны, конформация и тем самым функциональная специфичность протомеров изменяется также в процессе образования олигомера.

Представленные нами литературные и экспериментальные данные суммируют итоги определенного этапа исследования ^-цистатионазы печени крыс. В ходе нашей работы разработан препаративный метод очистки ft -цистатионазы, получены важные сведения о свойствах фермента, его макромолекулярной структуре и заложена основа для дальнейшего изучения этого фермента. В частности, выявление роли ПЛФ в формировании макромолекулы ^-цистатионазы ставит ряд вопросов, требующих дальнейших исследований. При наличии в холо-формах ^-цистатионазы одной молекулы ПЛФ на каждую субъединицу не удается обнаружить более двух активных центров (см. литературный обзор).

Этот факт в сочетании с известными данными о различных константах связывания двух пар кофакторов при одновременно обнаруженной Билером и Черчичем [ 23 J неодинаковой реакционноспособ-ности ПЛФ в одной из этих пар, а также с привлечением других кинетических данных [ 52, 104 ] делает вполне допустимым предположение о различной роли двух пар коферментов в функционировании ^ -цистатионазы, а именно одна из них является преимущественно структурообразующей, то есть вызывающей конформационные изменения, тогда как вторая пара выступает, в основном, в качестве простетической группы. При этом возникает также вопрос о равноценности всех протомеров фермента, как в отношении их функциональной роли, так и в отношении их структурных особенностей.

Например, имеются определенные основания считать протомеры квазиэквивалентными, поскольку они имеют одинаковую молекулярную массу, но, видимо, отличаются конформацией полипептидной цепи, по крайней мере, вдоль поверхности связывания в тетрамер.

Данная работа может быть положена в основу попытки создания детальной молекулярно-кинетической модели действия ^"-цистатио-назы и объяснения механизма олигомеризации фермента.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Лупу, Емилия Ивановна, Москва

1. Авилова Т.В., Егоров A.M. Методы выделения и очистки ферментов. - В кн.: Введение в прикладную энзимологиго. МГУ: Изд-во, 1982, с. 13-26.

2. Березин И.В., Мартинек К. Строение и важнейшие свойства ферментов и их активных центров. В кн.: Основы физической химии ферментативного катализа. М.: Высшая школа, 1977, с. 7-34.

3. Болотина И.А., Чехов В.О., Лугаускас В.Ю., Птицын О.Б. Определение вторичной структуры белков из спектров кругового дихроизма. П. Учет вкладов р -изгибов. Молекуляр. биология, 1980, Т. 14, Ш 4, с. 902-909.

4. Браунштейн А.Е. Биохимия аминокислотного обмена. М.: Изд-во АМН СССР, 1949, С. 194-233.

5. Браунштейн А.Е., Горяченкова Е.В. Участие витамина Вб в образовании цистеина путем энзиматического переноса серы. -Докл. АН СССР, 1950, т. 74, № 3, с. 529-532.

6. Браунштейн А.Е., Азарх P.M. Роль фосфопиридоксаля в анаэробном дезаминировании гомосерина и серина. Докл. АН СССР, 1952, т. 85, № 2, с. 385-388.101.

7. Браунштейн A.E., Шемякин M.M. Теория процессов аминокислотного обмена, катализируемых пиридоксалевыми энзимами. Биохимия, 1953, вып. 4, т. 18, с. 393-410.

8. Горяченкова Е.В. Роль фосфопиридоксаля в энзиматическом образовании и расщеплении цистатионина при пересульфировании.- Докл. АН СССР, 1952, т. 85, Ш 3, с. 603-606.

9. Горяченкова Е.В., Воловник Б.Я., Зайдельман Ф.Р. Влияние недостаточности витамина Вб на образование меркаптуровой кислоты и на пересульфирование в организме крыс. Докл. АН СССР, 1953, т. 93, № I, с. III-II4.

10. Горяченкова Е.В. Активность ферментной системы пересульфирования в различных органах крыс в норме и при Bg-авитаминозе.- Докл. АН СССР, 1953, Т. 93, № 2, с. 319-320.

11. Горяченкова Е.В. О путях ферментативного образования сероводорода из L-цистеина в печени. Биохимия, 1961, т. 26,3, с. 541-548.

12. Горяченкова Е.В. Ферментативные системы биосинтеза и десуль-фирования ь-цистеина в организме. Успехи биол. химии, 1969, т. 10, с. 64-68.

13. Кочетов Г.А. В кн.; Практическое руководство по энзимоло-гии. М.: Высшая школа, 1980, с. 47.

14. Торчинский Ю.М. Сера в белках. М.: Наука, 1977.

15. Фрайфелдер Д. Физическая биохимия. М.: Мир, 1980.

16. Abe К., Ressler Ch. jj' thiocyanoaminobutric acid, a cystathionase substrate. - Biochem. Pharmacol., 1975, v.24, No23, p.2167-2170.

17. Abeles R.H., Walsh Christopher T. Acetylenic enzyme inacti-vators. Inactivation of ^-Cystathionase, in vitro and in vivo, by propargylglycine. J. Amer. Chem. Soc., 1973, v.95, No 18, p.6124-6125.

18. Andrews P. The gel-filtration behaviour of proteins related to their molecular weights over a wide range. Biochem. J., 1965, v.96, No3, p.595-606.

19. Banno Y., Kominami E., Katunuma N. Modes of proteolysis of cystathionase and ornitine eminotransferase by serine protease from the rat small intestine. J. Nutr, Sci. and Vita-minol., 1978, v.24, No5, p.491-503.

20. Beeler Т., Churchich J.E. Reactivity of the phosphopyrido-xal groups of cystathionase. J. Biol. Chem,, 1976, v.251, No 17, p.5267-5271.

21. Bikel J., Thales N.P., Livingston D.M. Purification and subu-nit structure of mouse liver cystathionase. Arch. Biochem. and Biophys., 1975, v.186, No1, p.168-174.

22. Billy G., Muller P., Chatagner P. New insights into the active center of rat liver cystathionase. Biochim. et biophys. acta (E0), 1975, v.397, No1, p.231-247.

23. Binkley P., Anslow W.P., Vigneaud du V. The formation of cysteine from 11-S- ( ft -amino- ft-carboxyethyl) homocysteine by liver tissue. J.Biol.Chem., 1942, v.143, No2,p.559-560.

24. Binkley P., Wood G.L., Vigneaud da V. A study of the acety-lation in vivo of certain -amino acides. J.Biol.Chem., 1944, v.153, Wo2, p.495-500.

25. Binkley F. A note on the specificity of the enzymatic cleavage of thioethers. J.Biol.Chem., 1951, v.192, No1, p.209-211.

26. Binkley P., Christensen G.M., Jensen W.U. Pyridoxine and the transfer of sulfur. J.Biol.Chem., 1952, v.194, No1, p.109-113.

27. Boyer P.D. Spectrophotometric study of the reaction of protein sulfhydryl groups with organic mercurials. Amer. J. Chem.Soc., 1954, v.76, Ho17, p.4331-4337.

28. Braunstein A.E., Goryachenkova E.V. The pyridoxal-phosphate-dependent enzymes exclusively catalyzing reactions of |3 -replacement. Biochimie, 1976, v.58, No1, p.5-17.

29. Braunstein A.E., Goryachenkova E.V. The replacement-specific pyridoxal P- dependent lyases. - Adv. Enzymol. and Related Areas Mol.biol., 1984, v.56, p.1-89. Ed by Mei-ster A.

30. Brown P.O., De Poor M.G. ^ Cystathionase of rat liver. The role of sulfhudryl groups in the catalytic function. -Eur. J. Biochem., 1974, v.46, No2, p.317-322.

31. Brown P.G. ^ Cystathionase of rat liver: Effects of py-riodoxal phosphate and other compounds on reaction rate. -Arch. Biochem. and Biophys., 1975, v.171, No2, p.378-384.

32. Bruggemann J., Schlossmann K., Merkenschlager M., Waldschmidt M. Zur Prage des Vorkommens der Serinsulfhydrase. Biochem. Z., 1962, Bd 335, No4, s.392-399.

33. Bruggemann J., Waldschmidt M. Die Serinsulfhydrase aus Huh-nerleber: Ruckreaktion und Vergleich mit der Cysteindesul-fhydrase. Biochem. Z., 1962 , Bd.335, Uo4, S.408-422.

34. Cavallini D., De Marco C., Mondovi B. Cleavage of cystine by a pyridoxal model. Arch. Biochem. and Biophys., 1960, v.87, No2, p.281-288.

35. Cavallini D., De Marco C., Mondovi В., Scioscia-Santoro A. Inhibitory effect of mercaptoethanol and hypotayrine on the desulfhydration of cysteine by cystathionase. Arch. Biochem. and Biophys., 1962, v.96, Ho2, p.456-457.

36. Chang C.T., Wu C-S. C., Yang J.T. Circular dichroic analysis of protein conformation: inclusion of the turns. -Anal. Biochem., 1978, v.91, No1, p.13-31.

37. Chatagner P., Durieu-Trautmann 0. Effects of Pyridoxine Deficiency on the Adaptation of Rat liver Cystathionase to DL-Ethionine and to Thyroidectomy. Nature, 1965, v.207, No5004, p.1390-1391.

38. Chatagner P., Tixier M., Portemer Christiane. Biosynthesis of cystathionine from homoserine and cysteine by rat liver cystathionase. PEBS Lett., 1969, v.4, No3, p.231-233.

39. Chatagner P., Gicquel Y., Portemer C., Tixier M. Inactiva-tion of Cystathionase and of Cysteine Sulfinic Acid Decarboxylase by proteolytic Enzymes: Effect of Pyridoxal Phosphate. Experientia, 1970, v.26, No6, p.602-604.

40. Chatagner P., Pierre Y. Functional arginine in the active center of rat liver cystathionase. PEBS Lett., 1977, v.81, No2, p.335-338.

41. CJien Y.H., Yang J.Т., Martinez H.M. Determination of thesecondary structures of proteins by circular dichroism and optical rotatory dispersion. Biochemistry, 1972, v.11, No22, p.4120-4131.

42. Chen Y.H., Yang J.Т., Chau K.H. Determination of the helix and |3 form of proteins in aqueous solution by circular di-chroism. Biochemistry, 1974, v.13, N0I6, p.3350-3359.

43. Churchich J.E. The interaction of cycloserine with glutaiaate aspartate transaminase as measured by fluorescence spectroscopy. J.Biol.Chem., 1967, v.242, Uo19, p.4414-4417.

44. Churchich J., Beeler T. Reactivity of pyridoxal 5-phosphate residues of cystathionase, Biochim. et biophys. acta,1971, v.229, No3, p.813-822.

45. Churchich J.E., Interactions between Cystathionase and aspartate aminotransferase. J.Biol.Chem., 1972, v.247, No13, p.4192-4196.

46. Churchich J.E., Dupourque D. Dissociation of cystathionase.-Biochem. and Biophys. Res. Communs., 1972, v.46, No2, p.524-530.

47. Churchich J., Beeler Т., Oh K. Ja. Bonequivalent binding sites in cystathionase. Nano.second and steady fluorescence studies. J.Biol.Chem., 1975, v.250, No19, p.7722-7727.

48. Delavier-Klutchko C., Plavin M. Enzymatic synthesis and cleavage of Cystathionine in Pungi and Bacteria. J. Biol. Chem., 1965, v.240, ж06, p.2537-2549.

49. Delavier-Klutchko C., Flavin M. Role of a bacterial cystathionine p cleavage enzyme in disulfide decomposition. -Biochim. et biophys. acta, 1965, v.99, No2, p.375-377.

50. Deme D., Billy G., Chatagner P. Effect of sodium dodecyl sulfate on rat liver homoserine dehydratase. Biochimie, 1972, t.54, No11, p.1089-Ю92.

51. Deme D., Chatagner P. Etude du centre actif de 1'homoserine dehydratase du foie de rat. Biochim. et biophys. acta, 1972, v.258, Ko2, p.643-654.

52. Du Vigneaud V., Brown G.B., Chendler J.P. The synthesis ofp -amino-ft-carboxyethyl) homocysteine and the replacement by it of cysteine in the diet. J. Biol. Ghem., 1942, v.143, Uo1, p.59-64.

53. Vigneaud du V., Kilmer G.W., Rachele Y.R., Gohn M. On the mechanism of the conversion in vivo of methionine to cystine-J, Biol. Cherri., 1944, v.155, No2, p.645-651.

54. Durieu-Trautmann 0., Rain Marie-Christine, Chatagner P. Ef-fets d'injections de fortes doses de pyridoxine sur l'activi-te de certaines enzymes a phosphate de pyridoxal du foie du rat. C.r.Acad.Sci., 1964, t.259, Ho15, p.2547-2550.

55. Ellman G.L. Tissue sulfhydryl groups. Arch.Biochem.Biophys., 1959, v.82, Uo1, p.70-77.

56. Pearon C.W., Rodkey J.A., Abeles R.H. Identification of the active-site residue of ^-cystathionase labeled by the suicide inactivator trifluoroalanine. Biochemistry, 1982, v.21, N016, p.3790-3794.

57. Finkelstein J.D. Methionine metabolism in mammals. Effects of age, diet and hormones on three enzymes of the pathway in rat tissues. Arch. Biochem. and Biophys., 1967, v.122, Ho3, p.583-590.

58. Fischer G.A. The cleavage and synthesis of cystathionine in wild type and mutant strains of Heurospora crassa. Biochim. et biophys. acta, 1957, v.25, No1, p.50-55.

59. Flavin M., Slaughter C. Cystathionine cleavage enzyme (s) from Neurospora. Federat. Proc., 1962, v.21, p.245.

60. Flavin M. Microbial transsulfuration: the mechanism of an enzymatic disulfide elimination reaction. J. Biol. Chem., 1962, v.237, ЫоЗ, p.768-777.

61. Flavin M., Slaughter G. Cystathionine cleavage enzymes of IT euro spora. J.Biol.Chem., 1964, v.239, No7, p.2212-2219.

62. Flavin M., Segal A. Purification and properties of the cystathionine ^-cleavage enzyme of Neurospora. J.Biol.Chem. 1 964, v.239, No7, p.2220-2227.

63. Flavin M., Delavier-Klutchko C., Slaughter C. Succinc Ester and 'Amide of Homoserine: some spontaneous and Enzymatic Reactions. Science, 1964, v.143, H036OI, p.50-52.

64. Flavin M., Slaughter C. The derepression and function of enzymes of reverse trans-sulfuration in Neurospora. Biochim. et biophys.,acta, 1967, v.132, No2, p.406-411.

65. Flavin M., Slaughter C.J. Enzymic reaction of enamines with H-ethylmaleimide. J.Biol. Chem., 1969, v.244, n06, p.1434-1444.

66. Garcia-Peregrin E., Chatagner F. Studies on the inactivati-on of rat liver cystathionase. Enzyme, 1974, v.18, Ko5,p.262-270.

67. Gaull G.E., Wada У., Schneidman K., Rassin D.K., Tallan H.H., Sturman J.A. Homocystinuria: Observations on the biosynthesis of cystathionine and homolanthionine. Prdiat. Res., 1971, v.5, No5, p.265-273.

68. Gerald G., Sturman J. Development of mamalian sulfur metabolism: absence of cystathionase in human fetal tissues. -Pediat. Res., 1972, v.6, No6, p.538-547.

69. Giovanelli J., Mudd H.S. Enzymatic synthesis of cystathionine by extracts of spinach, requiring O-acetylhomoserine or 0-suсcinylhomoserine. Biochem. and biophys. Res, Com-muns., 1966, v.25, No3, p.366-371.

70. Giovanelli J., Mudd S.H. Transsulfuration in higher plants. Partial purification and properties of p -cystathionase of spinach. Biochim. et Biophys. acta, 1971, v.227, No3, p.654-670.

71. Giovanelli J., Owens L.D., Mudd H.S. Mechanism of inhibition of spinach p -cystathionase by rhizobitoxine. Biochim. et Biophys. acta, 1971, v.227, N03, p.671-684.

72. Giovanelli J., Mudd S.H. J3 -Cystathionase; In vivo inacti-vation by rhisobitoxine and role of the enzyme in methionine biosinthesis in corn seedling. Plant Phisiol., 1973, v.51, No3, p.492-503.

73. Goryachenkova E.V., Polyakova L.A., Yefremova L.L., Floren-tiev V.L. Interaction of pyriodoxal phosphate analogues with apoensymes of -cystathionase and serine sulphhydrase.-Biochem.Biophys. Res.Communs.,1973, v.55, Ho3, p.1021-1028.

74. Greenberg D.M., Mastalerz P., Nagabhushanam A. Mechanismof djenkolic acid decomposition by cystathionase. Biochim. et Biophys. acta, 1964, v.81, No1 , p.158-164.

75. Kaplan M.M., Flavin M. Enzymatic synthesis of L-cystathio-nine from the succinic ester of L-homoserine. Biochim. et biophys.acta, 1965, v.104, No2, p.390-396.

76. Kaplan M.M., Flavin M. Cystathionine ^-synthetase of Salmonella. Catalytic properties of a new enzyme in bacterial methionine biosynthesis. J.Biol.Chem., 1966, v.241, No19, p.4463-4471.

77. Kase H., Nakayama K. The regulation of L-Methionine synthesis and the properties of Cystathionine Synthase and

78. Ji-Cystathionase in Cornebacterinum glytamicum. Agr. and Biol.Chem.,1974, v.38, No11, p.2235-2242.

79. Khomutov R.M., Karpeisky M.Ya., Severin E.S. The predetermined synthesis of inhibitors for pyridoxalic enzymes. In Chemical and Biological aspects of pyridoxal catalysis, Oxford, London, New York, Pergamon Press, 1963, p.313-321.

80. Loiselet J., Chatagner P. Purification et etude de quelques proprietes de la cysteine desulfurase "soluble" (cystathio-nase) du foie de rat. Bull. Soc. Chim. Biol., 19&5, v.47, No1, p.33-46.

81. Lowry O.H., Rosebrough N.J., Parr A.L., Landall R.J, Protein measurement v/ith Polin phenol reagent. J. Biol. Chem., 1951, v.193, No1, p.265-275.

82. Matsuo Y., Greenberg D. A crystalline enzyme that cleaves homoserine and cystathionine. I. Isolation procedure and some physiсоchemical properties. J.Biol.Chem., 1958, v.230, No2, p.545-559.

83. Matsuo Y., Greenberg D. A crystalline enzyme that cleaves homoserine and cystathionine. II. Prosthetic group. J.Biol. Chem., 1958, v.230, No1, p.561-571.

84. Matsuo Y., Greenberg D. A crystalline enzyme that cleaves homoserine and Cystathionine. J.Biol.Chem., 1959, v.234, No3, p.507-515.

85. Meister A. Biochemistry of the amino acids, 2ed, New York, London, Academic Press, 1965, v.1, v.2.

86. Mondovi В., Turini P., Scioscia-Santoro A. Inactivation of cystathionase preparation submitted to dialysis. Ital. J. Biochem., 1962, v.11, n06, p.384-388.

87. Mondovi В., Scioscia-Santoro A., Costa M.T. Distribution of some enzymes concerned with cleavage of cysteine in animal organs. Enzymologia, 1963, v.25, No3, p.167-172.

88. Mondovi В., Turini P., Scioscia-Santoro A., Giarniery D. The chromatographic heterogeneity of cystathionase. Arch. Biochem. and Biophys., 1966, v.113, No2, p.496-498.

89. Moore S. On the determination of Cystine as Cysteic Acid.-J.Biol.Chem., 1963, v.238, No1, p.235-237.

90. Morino Y., Snell E.E. The subunit structure of tryptophana-se. I. The effect of pyridoxal phosphate on the subunit structure and physical properties of tryptophanase. J. Biol.Chem., 1967, v.242, No23, p.5591-5601.

91. Mushahwar J.K., Koeppe R.E. Rat liver L-diaminopropionate ammonia lyase. Identification as cystathionase. J.Biol. Chem., 1973, v.248, НоЮ, p.7407-7411.

92. Oh K., Churchich J.E. Binding of pyridoxal 5-phosphate to cystathionase. J.Biol.Chem., 1973, v.248, Ho21, p.7370-7375.

93. Oh K., Churchich J.E. Reaction of cystathionase with the fluorescent probe bis (dansil cystine). J.Biol.Chem.,1974, v.249, No15, p.47-37-4741.

94. Pan Poo, Chin Sing-Pie, Pai Shou-Hsiung. Dietary vitamin Bg and enzymes of methionine metabolisme in rat liver. J.Chin. Chem.Soc., 1970, v.17, No1, p.46-53.

95. Pascal T.A., Tallan H.H., Gillam B.M. Hepatic cystathionase: immunochemical and electroforetic studies of the human and rat liver. Biochira. et Biophys. Acta, 1972, v.285, No1,p.48-59.

96. Pascal T.A., Beratis N.G., Tallan H.H., Gall G. Cystathionase deficiency: the effeJ/' of со factor on the stability of normal and anormal enzyme from lymphoid cell linnes. Enzyme, 1979, v.24, No4, p.265-268.

97. Paszewski A., Grabski J. Studies on ^-cystathionase and O-Acetylhomoserine sulfhydrylase as the enzymes of alternative methionine biosynthetic pathways in Aspergillus Nidu-lans. Acta Biochim.pol., 1973, v.20, No2, p.159-168.

98. Pfeffer M., Ressler Ch. p-CN-alanine, an inhibitor of rat liver cystathionase. Biochem. Pharmacol., 1967, v.16, No2, p.2299-2508.

99. Portemer C., Ives P., Claude Z., Chatagner P. Number of argi-nine residues in the substrate binding sites of rat liver cystathionase. PEBS Lett., 1979, v.108, No2, p.419-421.

100. Rachele J.R., Reed L.J., Kidwai A.R., Perger M.P., Vigneaud du V. Conversion of cystathionine labeled with S-^ to cystine in vivo. J.Biol.Chem., 1950, v.185, No2, p.817-826.

101. Roisin M.P., Chatagner P. Purification et etude de quelques proprietes de L'Homocysteine Desulfhydrase du foie de rat. Identification a la cystathionase. Bull.Soc.Chim.Biol.,1969, v.51, No3, p.481-493.

102. Saxena V.P., Wetlaufer D.B. A new basis for interpretingthe circular dichroic spectra of proteins. Proc.Bat.Acad. Sci., USA, 1971, v.68, No5, p.969-972.

103. Schlossmann K., Lynen P. Biosynthese des Cysteine aus Serin und Schwefelwasserstoff. Biochem.Z., 1957, Bd.328, No7, s.591-594.

104. Silverman R.B., Abeles R.H. Inactivation of pyridoxal phosphate dependent enzymes by mono and polyhaloalanines. Biochemistry, 1976, v.15, No21, p.4718-4723.

105. Simpson R.J., Neuberger m.R., Liu T.Y. Complete amino acid analysis of proteins from a single Hydrolysate. J.Biol. Chem., 1976, v.251, No7, p.1936-1940.

106. Spackman D.H., Stein W.H., Moore S. Automatic Recording Apparatus for use in the Chromatography of Amino Acids. Anal. Chem., 1958, v.30, No7, p.1190-1206.

107. Stetten W.Jr. The fate of dietary serine in the body of the rat. J.Biol.Chem., 1942, v.144, No2, p.501 - 507.

108. Sturman J.A., Conen P.A., Gaull G.E. Effects of Deficiency of vitamin Bg on Transsulfuration. Biochem. Med., 1969, v.3, No3, p.244-251.

109. Sturman J.A., Rassin D.K., Gaull G.E. Distribution of trans-sulphuration enzymes in various organs and species. Int.J. Biochem., 1970, v.1, Ho1, p.251-253.

110. Tabachnick M., Tarver H. The conversion of Methionine-S-^^ to35 35cystathionine -S-^ and Taurine in the Rat. - Arch.Biochem. and Biophys., 1955, v.56, No1, p.115-122.

111. Tallan H.H., Pascal T.A., Schneidman K., Gillan B.M., Gaull G.E. Homolanthionine synthesis by human liver cystathionase.

112. Biochem. and Biophys. Res. Communs., 1971, v.43» No2, p. 303-309.

113. Wada H., Snell E.E. The enzymatic oxidation of pyridoxine and pyridoxamine phosphates. J.Biol.Chem., 1961, v.236, No7, p.2089-2095.

114. Washtien W., Cooper A., Abeles r.H. Substrate proton echanv•16, No3, p.460-463.

115. Washtien W., Abeles R. Mechanism of inactivation of .f-cy-stathionase by the acetylenic substrate analogue propargyl-glicine. Biochemistry, 1977, v.16, Ko11,p.2485-2491.

116. Weber K., Osborn M. The reliability of molecular weight determinations by dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis. J.Biol.Chem., 1969, v.244, n0i6, p.4406-4412.

117. Wong P.W.K., Schwarz V., Komrower G.M. The biosynthesis of cystathionine in patients with homocystinuria. Pediatr. Res., 1968, v.2, ПоЗ, p.149-160.

118. Wood W.A., Gunsalus J.C., Umbreit W.W. Function of pyridoxal phosphate: resolution and purification of the trypto-phanase enzyme of Escherichia coli. J.Biol.Chem., 1947, v.170, No1, p.313-322.

119. Yao K. Effects of several unusual sulfur-containing amino acids on rat liver cystathionine - lyase. - Physiol.ge catalyzed by1. Biochemistry, 1977,

120. Chem.Physics, 1975, v.7, No4, p.401-408.

121. Yao K., Kinuta M., Akagi R. Cat liver cystathionase. -Physiol. Chem. Physics, 1979, v.11, No3, p.257-260.

122. Young L., Maw G.A. The Metabolism of Sulphur Compounds. London, New York, 1958.

123. Yphantis D.A. Equilibrium ultracentrifugation of dilute solutions. Biochemistry, 1964, v.3, No3, p.297-317.