Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Фимбриальные адезины 3 типа K. pneumoniae и разработка способа их определения

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фимбриальные адезины 3 типа K. pneumoniae и разработка способа их определения"

министерство здравоохранения россилсксл федерации ростовский государственный медицинский институт

На правах рукописи ЗЕШШИНА Людмила Натровна

шотшоьйшг аде31ны 3 типа

•ж.. рггеидагггАв и разработка

СПОСОБА Ил ОЩДЕВДИЯ

03.00.07 - микробиология 03.СО.04 - биохимия

автореферат

дассзртапдл на соискание ученой степени кандидата медицинских каук

Ростов-на-Доку 1993

рго од

- Ь ДиЛ 'и^'О

Работа выполнена в Ростовском научно-исследовательском институте микробиологии и паразитология научно-производственного объединения "Биопрепарат".

Научные руководители: доктор биологических наук,

профессор Езапчук Ю<В.;

кандидат биологических пауте, стараий научный сотрудник Мартыненко Л .Д.,

Социальные оппоненты: доктор биологических нау1с,

профессор Габрилович И.М.;

кандидат медицинских наук, доцент Ставиекий И.М.

Ведущая организаций - Ростовский научно-исследовательский Противочумный институт.

Защита состоится " " ^Р-ХяЖ^ 1993 г. в ¿Л е,° часоз на заседании специализированного совета Д 084.53.01 при Ростовской государственном медицинском институте (344700, г. Ростов-на-Дону, пер. Нахичеванский, 29).

С диссертацией могло ознакомиться а библиотеке Ростовского государственного медицинского института»

Автореферат разослан " ..{< . 1993 г.

Ученый секретарь сдацка.ллзировашюго соеата, дононг

Н.Я. Коргшов

.-1 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблем. Проблема острих китзчянх инфекций (ОКИ) до настоящего времени остается одной из актуальных. В послед-ш*.в года отметается рост этих заболеваний у дете;5 раннего возраста, обусловленной тащила условно-патогеккиг.и кшкрооргахшзг,;алги (У1Е.1) как кие (Зоявялы, протей, энтвробактер, гатробактер я др. (С.С. Гязатула-на и созвт., 1988; А.Г. Лосева и соавт., I£88; A.A. 1.!орукова, 1920; Е.И. Хубка и соавт., 1990; З.И. Кузнецов л соавт., ISSI; А.Г. Боковой, Е.И. Кпсввяч, 1892), характар:!зуэдг:::ся тяхелш.з осложнениями, вплоть до латальних исходов. 3 структуре смертности дате" раннего возраста доля ОКИ среДп инфекционных прлчг.я составляй? 50-7Q/S (В.Ф. УчаЙнан, 1991). Несмотря на яалппе ehcokcíí смертности oí килечных заболеваний, от 15 до 8 0S случаев ОХИ остается зтг. о логически нерасаифроваянизд (С.С. Гизатулана я соавт., 1888; В.5. У«ай-кан, I9SI; С.Б. Позкяк я соавг., 1932).

Одной из причин низкого пропекта раезпфрогк?. OI¿I язляется отсутствие доступных я надеалнх мзтедоэ дпффореппяагкп этиологических агентов ст про дстагд тала í: нормальной гакрот-лори кааечника.

Пра опенке этнологической ролл УШ.1 гахное значение щзэдается выявления среди кзх иггакиов, о&шдаяцах £aitTopa¡.iH патогэпности, в . том часле и адга за властью (С.Т. Удапакааов а соавт., ISS3; Ю.З. Езз-дчук, 1985; B.I.Í. Боядаранко я соавт., 1387; S.U. Яояазук я соакг., 1989; М.М. Баркус, IS30; С.С. Гизатулааа и соавт;, 1991).

3 связа с этим представляет интерес изучение' адгезивностп п адгезинов, микроорганизмов, являющаяся возбудителями ОКИ, среди которых Klebsiella pneumoniae залипает одно из ведуэтх мест «UI. Квдоткоаа, 1988; С.С. Бвлокрнеешсо, ISS0; A.B. Лсоаукаяа'а соавт., 1991; В.К. Кузнецов а ооавг., 1991),

Большинство исследователе Я главным структуршм ксгаюпбгЛ'оы,

ответственным за адге зквнуо способность грамо-гранательных микроорганизмов, считают фиш5рии ( J.P.Duguid et al. , 1955; D.Q.Evans, D.J. Evano , 1978). У кяебсивлл описаны адгазины шташов, выдела нкых при заболеваниях кочввыводявдих путай и представляющие собой фкмбрпи I а 3 тапов (D.c.oid et al., 1985). Имеются однако данные, указывающие на зависимость адгезивной способности клебси-е.хт.от локаллзэгил патологического процесса ( a.m. Uesta et al., IS85; S.И. Полащук и соавт., 1989).

До настоящего времени к.pneumoniae, изолированные- при кишеч- . них заболеваниях, остаются недостаточно изученными как в отношении биологических свойств и антигенной структуры, так и в отношении наличия адгазанов.

Для выявления адгезявяости и наличия фиыбрий гликроорганизмов сущеотвует ряд методических приемов, включающих использование эритроцитов человека а животных ( j.p.Duguid et al,, 1955), эпителиальных клеток ( ft.Puller , 1973), формаяшшзированшх эпителиальных клеток < т. Yamamoto et al. , 1990), тканезых и органных руль-тур ( К.Е.Aidridge et al, 1978), синтетических микрочастиц ( B.Weter-bund, 1991).

Вместе о теы в современней литературе имеются лишь единичные сообщения о наличия и свойотвах фимбрий клебсиелл (D.c.oid et al., 1983, IS85; G.Coear , ISSO), выделенных от больных с заболеваниями мочеполовой система, и отсутствуют сведения о сгимбриях клебсиелл, выделанных от больных ОКИ.

В связи с этим изучение фамбрий и фямбриальных адгезияов штаммов клебсиелл, выделенных от больных ОКИ, получение препаратов фиыбрай я их применение представляет не только теоретический иита-рэо для изучения патогенетической роли при кишечных инфекциях клеб-сиеллезной этиологии, но и практическое значение для разработки и

_ 3 -

конструирования тест-сис тени, которая ногда би бить использована в практической здравоохранении.

Цель и задачи исследования. Пелъв насюяцеЛ работа яяилось определение значимости (Тимбриальних адгезяков 3 типа K.pneuaoniae з адгезивном процесое, получение аитдуевов адгезии и разработка на их оонове иииуно^ериентаоя тест-системы для обнаружения адгезияоз 3 типа.

В задачи работы входуло:

1. Изучить роль клебсиелл з этиологаи ОКК.детей первого года .жизпи.

2. Изучить роль клебсиелл, иuenmix 3 жп втакбгаЛ, в этиологии ОКИ детей первого года »изни.

3. Определить адгезивные свойства клебсиелл и разработать критерии оценки адгезивнеетп.

Определить фиибрш? клебсиелл, изучить биологические свойства клебоиелл и установить возиожнуо связь чеяду тт.

5. Определить ро.гъ *иубрнй 3 типа клрбеиелл в адгезивной процессе.

6. Разработать иимунс^ериенткуп тест-систему для определений ибркй 3 типа у штампов клебсиелл.

7. Оценить эффективность использования разработанного способа для определения антигенов адгезии.

Научная новизна. Показана роль ?1шбриЛ 3 типа в адгезивном процессе, разработаны коятерии опенки адгезивных свойств клейгаелл, спа собы получения (Гимбркй и ^иибвкальяого адгезина/. дана их характеристика. разработана хшиунофериектная тест-систека для обнаружения ддгезинов клебсиелл.

Практическая значимость работа. Ланч критерии онекги аттез'.гяных свойств клебоиелл. Разработан способ получе?птя ^имбриалышх он ти-генов ( натавных фикбшя и ^яифцального адгезкка .0 3 »дпа wis'fi-

спелл. Разработана оке f.га игдауиязашп кпвотянх с цсльго получения специфгча ышх антисывороток. Впервые сконструирована тест-система на основе Емукойериензиого анализа для определения антигенов адгезии глебсивлл.

Штам.з-лродуцант фимбрай задепонирозан в Государственной коллекции под iio.v.opo;,»; 2CS. Получено авторское свидетельство 1777607 на изобретение "Штамм бактерий Klebsiella pneumoniae- 2С6, используе-шй для получения фнмбрий КуА-1" , приоритет от 30.05.91.

Утверядено рационализаторское предложение на местном уровне ß 16/90 от 26.04.SO. "Модифицированный способ определения адгезивных свойств клабсиелл".

"Инструкция по изготовление и контроле ингредиентов иммунойер-нантяой тест-систеш для определения оданбриальных адгезинов клеб-снелл" 2 "Инструкция по применении ем'лунофоркентноё тест-системы для определения фнибриельных адгезннов клебеяелл" утверждены Ученым советом Р1МИ :.и:кро биологии а паразитологии 3 октября 1992 г., протокол # о. Инфор.!ашюнно-:.:атодичесюо письмо "Определение адгезивных свойств грамотрицательшх бактерий и их оценка" утверждено заместителем председателя Госкоысанэпзднадзора России 20 января 1993 года.

Положения, выносимые ка защиту.

1. Изучение этиологической структуры ОКИ детей первого года ккзнн свидетельствует о значительной рола УПМ в качестве этиологических агентов, среди которых ведущвии.являются клебсиеллы.

2. Показана роль щимбрии 3 типа клебенелл в адгезивном пропессо и отпечена корреляционная зазисиглость мояду адгезивными и энтеро-токсиганикми свойствами у штаммов клебсиелл, имеющих 3 тип йимбрий, что может бить дополнптельши критерием опенки этиологической значимости выделенных при OKI! штаммов клабскелл.

3. Показана принципиальная возможность использования ИМ для

обнаружения фимбрии 3 типа клебсиолл. Разработана технология получения всех ингредиентов тест-системы.

Алробэндц работ. Основные иолозвкая диссертации долоте ¡ш на конференциях молодых учеиих Гост об его го противочумного института (I9S9), института им. Габричевского (Москва, 1821), лабораториях коа^аренцаях РШШШ (IS87-IS92 гг.), 71 Есэрсссийском съезде микробиологов, эпидемпологоз и паразитологов (г. Нижний Новгород,1991).

По ¡материалам диосерташш опубликовано 9 работ, из них в центральной печати - 7.

Объем и структура таосз стают,. ■ Работа пэдоазаа на 152 страницах ."машинописного текста, иллюстрирована 19 таблицам, 19 рисунками.

- Состоит из введения, обзора литературы, описания используемых мата~ риалов и методов, 3 глав собственных исследовании, закккчааля и вы, водов, а теки указателя литература, вклшаэдзге 2IG работ, из аих 107 зарубежных азго joe.

СОДЕРЖАНИЕ PAIsbjb'

-','атс риалы и у.втогк исследования. Бактериологически к с следов g-яы фекалия 1120 датам больных ОК* и 86 условно здоровых детей первого года ялзнл. Идентийякашш культур микроорганизмов проводили в соответствии с методическими рекомендациями ;у!ик здрава СССР (1934).

■ Биохимическую идентификацию выделенных культур кдзбеяелл проводили согласно II издании Определителя бактерий Берги (1984). 4

Биологаческие свойства изучены у 478 штаммов рода Klebsiella, из них 453 аташа выделены от больных OKI и 25 - от условно здоровых датой.

Наличие у клебспелл капсулы определяли методом .тушевого драпа-, ■р'ата по Бурри-Гинса. Серологическую идептиодкацию ¡слабсизлд проводили при помочи моновалсктпых агглптпнирутщах хдвбоиеяя*. зкхп{ катк оульаых сывороток, разработайте и цриготолшштзх в ЗФНИЗС -ям.

- о -

И.И. Мечникова.

Чувствительность культур к антибиотикам определяли методом серийных разведена!': антибиотиков на плотной среде.

Вирулентность наделенных культур определяла внутрибршишшм зарояскием белых пылай (A.C. Лабинская, 1978).

Способность культур к продукции терислабильного эитаротоксина определяли в тссгга отека лап белых тлей по методике Ю.П. Вартаня-ка (1978), в рагкцаа двойной двфтузии в геле с антасывороткой к хроиатогра^чески чистому териолабялькому энторотоксяну кишечной палочки а с помощьо.'агзунофершвтсой тест-системы для определения термолабллькогс энтеротокспна кишечной палочки, разработанной в лаборатории экспериментальной микробиологии Р1-ШЫП.

йимбриа клебсаелл изучали методом негативного контрастирования .<5агл'ериалышх клеток на электронном микроскопе jem-100 з(Ядония) при ускоряющем напряжении 80 ев и увеличении 18000-28000 раз. Раз-мэры §Л1.:брий расчитывали по контурным стандарта», используя негативы снимков. Гемагглютинярузщую активность шта^юв клебсиелл изучали по результатам реакции гвмагглзтанации со сваяаши необработанными эритроцитами морской свинки, барана, мыши, кролика, крысы, золотистого хомячка, петуха и формалинизироваиными эритроцитами О (X) ipymuKpoBii человека в присутствии а без 0,5% раствора маннозы.

Адгазязша свойства клебсиелл изучат по методике. В.И. Ериллс и соавт. (IS8S) в наае!; модификации.

¿яыбряальныа антигены получали по методу D.c.oid et al. (1965).

Выделение и очистку йиибрий осуществляли механической дезнн-. техрацией на дезинтеграторе "Virtus " ИРГ), фракционированием

сульфатом аммония с последующий диализом. Фи.чбриальный адгезия по-•.„-■.'лучалп обработкой йимбрий ультразвуком с последующе!' гель-^альтра-/ «аей на сефакр&ла s -200 на ароматограйачасгсои оборудовании гЕирмы

Pharrsaoia (Швация).

Антигенную активность йамбряалыюго адгезино определяли в реакции двойной даЖфузпи в гола по методу Оухтсрлонк (1953) и с реакции иммуноэлактрофораза по методу Лоролла (IS72).

Элзктро$орвтичасков разделение белков в системе полиакриламад-ного геля в присутствии додацалсульфата натрия осуществляла методом диск-электрофора за (у.К. Leecsnli , IS70).

Имцуняув сыворотку к фЕМбриям 3 тапа клебснелл и слшбри&ш'.оцу адгезину получала иммунизацией кроликов породи пяниклла. С бос гл обули новую фракцию из антисыЕсроток получали высаливанием сернокислом аммонием по Н.Б. Холчеву (1972). Для получения коньвгата перокся-дазу храна (Ыарка A.EZ - 2,7,Serva ) окисляли ыата-париЯодатсм натрия по Накана н Каваои (1974). Субстратной смесью служил 0,05£ раотвор 3,3' даамиаобаиэадин тетрагядрохдорпда.

Статястачаску» обработку долучанных результатов проводили по B.C. Баосыертному, Í.I .К. Ткачевой (IS6I);И.К.Аакарияу, A.A. Воробьеву (IS62); Ji.M. Маркову, Л.Е. Полякову (IS74); Г.Ф. Лакляу (1280).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЗДШЯ

Этиология ОКИ дотай раннего возраста за период I986-IS89 гг. уо-. тановлена на основании данных комплексного клиннко-бактариодогачв-. ского обследования 1120 датей, находившихся на стаписнараом лечении по поводу киавчшх заболеваний. На доля ззболагани:':, обусловленных УШ1 приходилось 76,6+1,3)! (табл. I), дизентерия и сальмонеллезы составляла 10,9+0,3^. В этиологической структура ОКИ, обусловленных УШп ведудаа являлись К. pneumoniae и род'Proteus , со- , ■ ставляылиа 69,4 ± 1,5% от числа заболеваний условно-патогенной эта-, ологлп и 53,1 +1от Ecaii суммы ОКИ. Роль к.pneumoniae оставались доминирующай а составила 3S,3 ± 1,6% от числа 01СИ услончо-патогенной этиологии и 30,1 ¿ 1,4,2 ог суммы кишечных икйекций.

T a 6 ¿t h ii a I

9T¡I0JI0nriEGKAH CTPilíTyPA OKH J3STB3 IEPBOIO IOJW aia&I . . ( oyi-ua OKI )

OCcjia- II a T 0 r e jj u --------- lipoma (0dyC.10E.HCH- ííí-ic y¿í?.') i 3ti:oíornha-j CKÍÍ Hcpacann^-j pCESflíIHG

Pop £0-saHo i p.Shigella j p.Salmonella ¡ B o evo:- ¡

0,00. f /" X » 1 a(5c. ¡ /> Jí j ac¡c.¡ " ±m ¡ OÓC, j i) * m j aóc.¡ % + m.

1986 317 10 3,1+0,3 21 6,7*1,3 31 9,8*1,6 230 72,6*2,5 56 17,7*2,2

1287 226 5 2,2¿0,3 19 8,3+1.8 24 .. I0.6t2,0 174 77,&t2,8 28 12,4+2,2

1938 280 7 2,5±0,3 26 9,2*1,7 33 II,8±I,9 218 77,9+2,4 29 10,1+1,8

I98S 297 5 I,7¿0,23 29 9,8+1,7 34 11,411,8 236 79,5*2,3 27 9,1*2,2

1120 27 2,4±0,I 95 8,6+0,3 122 10,9*0,3 858 76,Ó±I,3 140 I2,5±0,3

- 3 -

Анализ результатов бактериологического обследования группы условно здоровых детей показал, что частота вцдвлшшя Ж,! составила 18,6 ± 4,1/1, среди которых доминировали К,раеишоп1ае,,р,Рг<^еиз,Е.со1:1. Биохлипческое исследование 376 иташой клебсиелл дозволило 87,3 1,1% штаммов- идентифицировать как к.рпсигощае к 12,7 + 1,1% штаилов - как к.охуЬоса» ИдентлТяцированние до вида итаты клебеяелл при равно».соотношения г:сэду собой встречались как в группе условно здоровых детзл, так и з группа детей,больных остроги килеч-ныг.ш инфекциями.'

Изучение кап о ул оо бра з ован:;я у 478 атасов глебсиелд показало наличие капсулы у всех штаммов, однако степень кааоулообразопгнля бала различной.

Капсульному серотЕнированпг) подверглись 225 атажоз клебзнедд. Серологическая идентификация позволила определить К-антаген у 76,0+ 2,штаммов,, а 54 штамма не реагировали ни с одно2 из шхедпхся в нашем распоряжении мояоепецпфвчвекях сывороток. Клцяическпе птаммы характеризовались Еирокт.! диапазоном К-антпгенов п вклпчалп 66 се-роЕаров, пз них наиболее часто встречаетсь К 21 (8,8^); К 16 (6,3?5)? К 14 (5%); К 8 (4,4£) Сероварч. У условно здоровых дете!: выделеягка штаммы относились к 10 серовараы, преобладали К 3; 1С 11,21 л л 55 (по 15,4Г.') сероЕары.

Исследование биологических свойств выделенных культур клебсивдя включаю изучение факторов патогевдости. Адгезивные свойства клоб-слелл изучали при помовд методики 2.И. Брилис о соавт. (К86)В\собственной ыоди-.Т;и;:аслп, позволяющей сократзть зремонша к натеркзльнзге , затраты при проведении операций прл подготовке культур микроорганиз-. иов а эратродатов к опыту. Аналаз распределения изученных аяамаов" . клеб'аиелд по показателям индекса адг.ззлвносги миярсоргзназмоз. :(1УЛ) В данным среднего показателя эдгозаи .(СНА) позволил пряаять

- 10 -

щде критерии оценки степени адгозивности:

Отодень здгаэип !■ Даяша СПк ; Даиные ИАМ

Низкая 0-1 до 2

Средняя 1,01 - 2 1,01 - 3,

Высокая более 2 более 3

Распределение показателей имело вид кривой Гауоса, что подтвердило достоверность полученных результатов. Проведенные исследования по изучении адгезивных свойств шташов клабсвелл показали, что в 92,Ij;I,'3£ случаев пхаыш, выделенные от больных ОКИ, и в 96,0±3,9$ случаев штам:.;ы i выделенные от условно здоровых детой, характеризовались наличием средней и высокой степенями адгезивного процесса, что согласуется с данными литературы (B.i.1. Бондаренко и соавт., 1987} ИЛЬ Баркус, 1990) по адгвзивности штаммов, выделенных от боль шх 0КИ< Однако.полученные нами результаты противоречат данным вы- ■ сеуказанных авторов по определению адгезйвности шташов, изолированных от условно здоровых детей.

Вероятно, что именно штаммы клабсвелл, обладающие адгезивной активностью, к'.оглк прикрепиться и колонизовать эпителий кишечника условно здоровых детей.

Электронно-микроскопическим изучением 176 ы та шов клабсиедл определено наличие фимбрий в 87,5^2,5^ случаев, "Морфологические данные позволили отпасти внеклеточные структур«' -к 2-й типам и распределить изученные etашы следуэдм образов 59,09^3,7^ шташов в группу, иыапцую 3 тип фимбрий; 17,04±2,9^ штаммов - в группу, с I типом -риыбрий и II,36+2,4% - в группу шташов, имеющую оба типа фимбрпН па своей поверхности. В итого количество штамыов с наличием йимбрии 3 типа на своей поверхности составило 70,45±3,4$.

Частота встречаемости штаммов клебспелл, имеющих 3 тип фимбрий, в грузах условно здоровых детей и больных ОКИ одинакова, также

- II - •

распределились и данные по изучению адгезивных свойств этих штатов, выявив равное соотношение штаммов с адгезивной способностью. Вероятно; что именно штаммы, имеющие 3 тип димбрий и обладающие средней а высокой степенями адгезии, обладают большой способностью колонизовать кишечник ребенка в возраста до I года.

Установлена прямая корреляционная зависимость мезду наличием фимбрий si адгезиваостью. Результаты изучения гемогглэтиншюв и адгезивных свойств клебсиелл не установили взаимосвязи г.отду гемагглити-нирующзй актявноотьи и адгезишюсть.^ что уточняет данше .'.'.м. Бар-куо (1990) и u.Wttricer .e-t al,{1990); сопоставление не полученных результатов определения типа гакагглатиишов с данными электронной микроскопии указывает на недостаточную нормативность реакции гемаг-глотинации в качестве маркера «JaiMCJpsii штаммов клебсиелл, изолированных при киаочшх заболовашях детей первого года si они.

Исследование чувствительности изолированных штатов клебсиелл к

антибиотикам выявило их цнотаственауя лекарствеиную усто11чнвость,

ч

наблюдаемую в 85,95? случаев. Корреляционный анализ роказателеи, характеризующих антибиотикорезнотвитность и другие биологические свойства (адгсзивность, наличие ц тип йкмбриЛ, био- ила серовар) на выявил какой-либо зависимости.

Данные изучения адгезивных и энтерогоксигонных свойств, а именно продукцией терлолабильного энтаротоксина, показачи тенденцию к прямой зависимости этих свойств ( г=0,25 при и^. =0,097). Статистически достоверная прямая корреляционная зависимость метду этими' • свойствами отмечена у штаммов, ыыеввдх 3 тип п-имбрай ( г=0,42, нри Иу s=0,I39), что Ou'te раз подтверждает значимость штаммов, имеюпшх 3 -тид iTïiMopiiiî как этиологических агентов, так как эЕтаротоксин даиздег* ся определяющим фактором в патоганезо ОКИ (C.Ï. Мнанаканов, 1986; В.М. Бокдаренко а соавг., IS37; U.li. Баркус,' 1990),.

Установление значимости фшбрнй 3 тана клебсиелл в адгезивном процессе проведено экспериментальными исследованиями в условиях in vitro с использованием антлсыворотки к йимбриям 3 типа. В качества контролем специфического действия антисыворотки к фимбрида 3 типа испольаоЕали антксыворотки, не содержащие антитела к фиибриям 3 тина: антксыворотку к холарогену, антисыворотку к полному адъюван-ту ¿ре!шда а' сыворотку интактного кролика- Результаты исследований представлены на рисунка I,

Показатели СПА

4,0:. •

3,0 ■ \

2,0 • 1,0 •

К 1:20 IíI5 1:10 1:5 1:2,5 1:1 Ц Соотношение

• сыворотки и -

микроорганизмов

Рис. I. Влияние ангасывороток на адгезивные свойства клебсиелл,

Условные обозначения}

- аятисыворотка к фимбраям 3 типа;

- антисыворо'гка к адъюванту «рейнда;

- сыворотка интактного кролика;

- аятисыворотка К холерогеиу.

Как свидетельствуют данные рисунка, только антисыворотка к фимбриям оказывала пнгибирующее действие, причем отмечена корреляция они-

жения адгезивных свойста-микроорганизмов от концентрации специфических антител. Чем выше концентрация антител к фшбриям при обработке клебслелл антисывороткой, тем ниже показатель адгезии (г =0,88, при Ну = 0,05). Полученные данные свидетельствуй? о непосредственном участии фимбрий 3 типа клабоиелл в адгезавноы процессе и о значимости их в качество антигенов адгезии у штаммов клебсиелл, имеющих этот тип фимбрий.

Однако, обработка культуры клебслелл антисывороткой к фимбриям при значительном снижении адгезивной активности бактериальных кле-ток^нае<5эспочивала полное ингибирогакие адгезии, что позволяет пред-; положить об участии в адгезивном процессе кроме фимбрий и других компонентов бактериальных клеток.

Полученные нами данные по изучению фимбрий клебсиелл методом обнаружения гемагглютининов в РГА не отражают результатов,.полученных при прямом обнаружении фимбрий электронной микроскопией, несмотря на использование РТА в качества маркера фамбрий. Необходима другие метода, позволяющие непосредственно обнаруживать фимбрлальные адге-зины. Таким методом ыояет бнть метод иммуннофарментного анализа. Для конструирования тзстгслстеш на основа МА необходимы специфические антигены и антитела к ним. В связи с установлением значимости фимбрий 3 стпа в адгезивном процессе и определения их роли в структуре штаммов, являлщахся этиологическими агентами ОКИ детей первого года жизни, иама предпринята попытка использовать их в качестве антигенов при конструировании тест-системы по обнаружению фимбриатьных адгезинов. Для этого подобран штамм-продуцент фимбрий 3 типа, который задепонирован в Государственной коллекции под номером 206, получено авторское свидетельство на изобретение £ 1777607.

Проведенные эксперименты по изучению условий культивирования штамма-продуцента фимбрий на различных установках ("Зермус-Г', УВМТ

12 х 250; туттсль-аппарат роторного тина, магнитная мешалка) показали, что шташ к.pneumoniae-206 является стабильным продуцентом' фамбрий, а.наиболее технологичным оборудованием является установка* "Фермус-I", выращивание на которой создавало оптимальные уоловия для фимбркеобразовашя клею к и выхода урожайности культуры. С палью получения препарата фиыбрий подобраны условия отделения фямбрий от бактериальных клеток. Максимальный, выход целевого продукта обеспечивала механическая.дезинтеграция на "Virtui при 2OOG0Ерл в течение 5 минут, центрифугирование при lOUOg с последующим ооаздвнием при 6570$ наоыщеющ; сульфатом аммония. Полученный вышеописанным способом препарат представлял собой взвесь фамбрий, результаты электронно-микроскопического контроля которого показали наличие фимбрий, имеющих длину 343+52,3 им и диаметр 5,3±0.,& ш, при отсутствии бактериальных клеток, что свидетельствовало об однородности и чиототе получанного препарата фимбрий.

Однако непосредственное -обнаружение фимбрий методом электронной микроскопии не воагда возможно., Исследования'Цитологически чистых фракций фимбрий на ФЭК-56 при длине волны 630 нм (кювета 3) опреде- ' лили оптическую плотность равную 0,012-0,0125. При изучении иммуно-ганных свойств препарата фимбрий на кроликах порода ишшшлда установлено, что введение 0.,5 мл препарата на полном адъованте Зрейнда вызывало образование антител в титра 1:10 - 1:20 в реакция агглюта-нации на отекла. Последующие три инъекции препарата с интервалом в 7 дней обеспечивали уровень антител 1:1280 - 1:5120 со штаммом-про-душщтом фимбрий и 1:16 с препаратом фшбрай, что подтвердило оохра-нэняд ектигз/вой активности изолированными фамбриями.

Д/и извлявания растворимого фимбраального адга зина использовали ультразгуковую дьзицтеграции на установке УЗДП-А. Подобран оптимадьг ны5 рогам, обеспечивающий максимальный выход радтворкмого антигака.

Специфическая активность ультразвукового деашзтзграта фимбряй

0 антиснвороткой к цельным фимораш проявлялась в титре 1/2-1/16 в РДДГ и в титра 1/2 в РА на стекле при содержании балка в пробах

1 мг/мл. Исследование дазянтеграта фимбрпЖ.в РИЭ о антиснвороткой к фимбраяи показало наличие двух дуг преципитации в некоторых пробах, это обстоятельство продиктовало нео*бходамость проведения хро-матографнческих методов очистка.

Гель-хрсматографичоский анализ ультразвукового дозинтаграта препарата, $шбрий на колонка о сафакрал 3-200 показал наличие 3-х фракций (рис. 2). '

фракций

Рис. 2. ■фракционирование ультра звукового дезинтеграта • ' фимбрий 3 .типа на сефаярпл 3-200.

Заштрихованная часть - фракции, содержала, фимбриалышй адгезн'н.

Исследования получанных фракций в РДДГ и ИЭР с антиснвороткой

к $имбриям 3 типа установили, что только одна фракция (1-ий-ши0

реагировала с антиснвороткой, дазая линии прагошитагши. Злекгроф)-

ретический анализ этого пика показал наличие двух белковых фракций о молекулярной массой 25 п 23,5 кД, характеризующихся высокой элакт-рофоратической подвижностью. ¡кмуноэлектрофоретический анализ выявил одну линию преципитации с антисывороткой к $оыбрияи после хроматог-' рафической очистки адгезина.

«¿имбриальннй адгезии характеризовался наличном иммуногенных свойств, получена антискворотка к неыу с титром антител 1/16 - 1/32

в рда. г

Иымунорлектрофоратпческоа исслздованиа всех трах фракций ультразвукового Дезинтеграта препарата фиыбрий и получанной антисывороткой к фимбрпа^ьному адгозану показало антигенное родство только о фракциями I пика.

Результаты проведеллых исследований показали, что специфической активностью к фимбриальному адгазину обладает не только антисыворотка к фицбриальному адгазину, но и антисыворотка, получанная к препарату нативных фи»4брий. Этот факт позволяет нам использовать в качестве антигена для получения специфических антисывороток, препарат . нативных фимбрий, что сокращает временные а материальные затраты при получении антигена. Проведенные исследования позволили разработать способ получения фимбриальных антигенов, который представлен 'на схеме.

С целью получения специфических антиоывороток к препарату фимб-рай и финбриальяоыу адгазину подобраны охамы ашушзишш кроликов,^ позволившие получить антисыворотку к фимбрияы в титре 1:5120 в РА на стекле и антисыворотку к фиыбриальноыу адгезину в титра 1/161/32 в РДВГ. Наивысшее значение титров отмечено при схеме иммуниза-црц, оостоящеМ из вяугришиачного введения 0,5 мл препарата фимбрий и полного адъкванта Фрейнда в соотношении 1:1 и второй инъекции препарата в количестве 1,0 кя с интервалом в 30 дней.

Схема

культивирозакие итамма-продуцента Аимбрий

центрифугирование

ресуспен-дирование

центрифу-ла'розание

6000 йб/шш в течение 20-30 мин при 4°С

■{цв1'.трифугат}

механическая дезинтеграция

трао-ШГ-буфор рЫ 7,2 до койь 50 млрд.м.т.Ли

6000 об/шн в течение 40-45 иин при 4°С

|центри,рутат |

концентрирование сульфатом аммония

диализ против трис ньи-Оуфера рН 7.2 в точение 48 часов"

|осадок|

центрифугирование

12000-15000 об/та ■ п в течение 45 мин при 4 С

препарат фямбрдй

|дезинтеграпия ультразвуком]

центрифугирование

.'21000 об/млн в течение

45 шш при 4°С _,

_[осадок|

| центрифутат |

очистка методом гель-фильтрации

|лиомильная сушка) ¡изшбриальний адге злн|

Полученные антисыворотки были использованы для получения иммуноглобулинов и конъюгатов при конструировании тест-систеш на основе ША. " < .

Для оценки разработанного способа определения фямбряальных адге-

зпаов 3 типа клебоиелл проведено сравнительное изучение наличия фимбрий и их типа непосредственным обнаружением методом электронной микроскопии о определением ачда гемагглютининов (типа фиыбрий) в реакции гемагглютинашш и выявления фшбряй 3 типа в разработанной тест-система. Результаты полученных исследований представлены в таблице 2. '.

Таблица.2

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ ШЯВЛЕНШ ФШБРИЙ 3-Ш1А КЛЕБСМЕЖ РАЗЛИЧНЫМ СШСОЕАШ

Фи^Способы' !в рай по Х*ия исслв данным зл>\ {дова-микроскопиих^ j но j Выявлено }воо-j ИФА }го i ! Выявлено РГА ! Коэффициент • досто-, верно-j оти

г ! абс. ! 1 „.. , ------ Howiaj- - j .... | * ±»* ±'« ■

3 тип фимбрий 30 1,3 тип фицбрий 5 I тип фимбрий 12 без фшбрий 5 20 3 3 I 93,3+4,5 17 60*21,9 9 25±12.5 9 20±17,9 5 II 2 I 4 64,7±И,6 22,2±13,8 И.1±Ю,7 •60±17,9 р< 0,05

Всего: 52 35 67,3^5,5 40 Iß 45+7,8 Р<0.05

Их них, имеющие 35 3 тип фимбрий 31 88,5±5,9 26 13 50±9,8' р<0,05

Как видно яз представленных в таблице данных, процент выявления 3 типа фимбрий у штаммов клебсиелл, имеющих только этот тип фимбрий составил 93,3jt.4,5, тогда как в PIA он равен 64,7+11,6$. Процент штампов с 3 типом фимбрий от общего количества, исследованных штаммов, составил 67,3^5,5, столько sß положительных реакций зарегистрировано при постановке ВДА, аз них на долю штаммов с 3' типом öiiuöpni приходлось 59,6^6,6/2. В РГА процент положительных рвакипй зарегистрирован в 45*7,8$ случаев, из них. на долю штаммов о 3 типом фимбри! подходась 32,2^17,4^, а количество штаммов, имекглх 3 тип фимбрий на своей поверхности, составило 65+7,5/t.

Исследование 58 клинических шташов клебсиелл позволило зарога-

'страровать полоаитвльную..раакпшэ в ИФА у 70,8+5,3;*штаммов. Прова-дошюа нйми ранее элактронномикроскопическое изучение 176 штатов клобоиолл выявило фиибрии 3 типа у 70,45^3,4^ штатов, что свидетельствует о сопоставимости процента внявлонля флмбрий 3 типа методом ишуноферментного анализа с даншиди пряного обнаружения фимбрлй методом электронной микроскопии.

Таким образом, результаты оценки разработанного способа свидетельствуют о возможности использования ИМ для обнаружения фимбрий . 3 типа илвйстлл.

ВЫВОДЫ

1. В этиологической отруктура 0ICI детей первого года яизнз значительный удельный вас занимают представители УШ (76,6+1,3$?), ведущим этиологическим агентом являются клабсиеллы, на доли которых приходится 30,1+1,4% случаев от оудащ штатных заболеваний.

2. Выявлено, что среда штаммов клебсивлл, выделенных из факалий детей порвого года жизни, преобладают штаммы, имеющие 3 тип фимбрий -70,45±3,4$ (у больных OKI! у условно здоровых - 68,75%),

3. Установлено, что адгезивная ахтивнооть штаммов клебсивлл, выделенных из фекалий детей первого года гнзз'нд, достигает 92,2+1,2^. Определены критерии опенка адгазнваости клебсиалл, позволяющие рао-ценивать 'адгезивный пропесо как низкой, средней или выоокой степени.

4. Устэновлзно, что для штаммов клебсивлл, имеювдх 3. тип фимбрай, характерна умеренная степень взаимосвязи меяду адгезивным,! и энте-

. ротоксигаиными свойствами.

5. Отмечена прямая взаимосвязь мезду наличием фшбрий и адгезивными свойствами клебсивлл^ болае" выраженная у иташов, имеющих 3 тип фимбрий. В эксперименте подтверждена роль фимбрий 3 типа в адгезивном процесса.

6. Показана недостаточная информативность реакции гемагглютина-

ции в качество паркера фимбрий клебсиелл.

7. Разработай способ получения фимбрий и фимбриального адгезина 3 тша клебсиелл, получены антиснворотки к ним.

8. Показана принципиальная возможность использования спеиифичео-кого способа обнаружения фиибрий 3 типа клебсиелл, разработанного

на основе ИФА. Разработана техно чогия получения всех ингредиентов для иммуноферментяой тест-системы.

список работ, ошгбликова11шх '.

ПО Ш ДОСЕРТАЦИИ . . .

1. Определишь адгезивных овойств клебсиелл и их опенка (Л.Д. Мар-. тынеикр). - //Лаб. дело. - 1389. - Ж 10. - С. 68-70.

2. Фимбрии и биологические свойства штаммов К.раеитоа1ае Д.Д.Мар-тыненко, Э.А. Бардахчьян/. - Вестник Всес. микробиол. об-ва;

. Ростовское отделение, 1989. - № I. - С. 57-59.

3. 'Фшбрии к.рпегшоШвв и их адгезивные овойотва //Обл. научы.

. конф. молодых ученых, Эпидемиология, микробиология и иммунология бактериальных и вирусных ннфекшй: Тез. докл. - Ростов-на-' Дону, 1989. - С. 27.

4. Адгезивные свойства и фиыбркв атаымов клебсиелл, выделенных от детей первого года казна /Л.Д. Мартынвнко/. - //У1 Воеросс.

■ оъозд шкробиологов, эпидемиологов и паразитологов: Тез. докл, -. М., 1991. - ТД. - С, 82.

5. Фимбрвд и биологические овойотва штаммов клебсиелл, изолирован^. еых:от детей первого года кизни больных ОКИ /Д.Д.- Мартынеико, А.П» Батуро, ВД, Рыкова/. - //Известия СКИП,. - 1991. - ^ 4. -С. 122-125. .. ' ,

5. Элекгронко-кшкроскопяческэб изучение фпмбрш' /Л.Д, Мартыненко/. - // Обл. науч.-практич. конф.- посвященная дню радио: Тез. , докл, г. Ростов-на-Дону,' 1991. - С, 49-50.

7. Изучонло адгезивной споообноотя штаммов клебоиелл, выделенных от здоровых дотай и больных ОКИ /7 ЮТ, раздал 3. - 1991, -

.!» 4-6. - Публ. 1417, Д - 21474. .

8. Поверхностные структуры и биологически«? свойства штатов кяоб-сиелл УЛ.Д. Мартннанко, ,Г.А. Вилков, А.П. Батуро/. - /ЛЬпсроб. журн. - 1992. - 54, л 3. - С. 14-18.

9. Определение адгезивных свойств гракотр>Шательных бактерия /

Л.Л. Уартыненко, ВЖ. Синаев, Н.Э. Икнаева, ЛЛиалло /!-/УЙнфор-• *

мани о пно-к е т оди ч ее кое пиохно - ИГ.Г992." - 9 о.

Подписано к печати f&.J-f.9br.

Формат бумаги 60 х 84. I/I6; Бумага сфгетизл. Печать офсотлпл. Печ. лист -4

Заказ -i^fSif тираж -SDO Тип. iPOJOWII