Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Филогенетический анализ изолятов вируса классической чумы свиней и вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, циркулирующих на территории России и Белоруссии

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Филогенетический анализ изолятов вируса классической чумы свиней и вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, циркулирующих на территории России и Белоруссии"



На правах рукописи

Власова Анастасия Николаевна

Филогенетический анализ изолятов вируса классической чумы свиней и вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, циркулирующих на территории России и Белоруссии

03.00.03 —молекулярная биологи*

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва-2003

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН.

Научный руководитель:

Официальные оппоненты:

Доктор биологических наук Непоюзонов Евгений Анатольевич

Профессор, доктор ветеринарных наук Белоусова Раиса Васильевна

Профессор, доктор биологических наук Гараев Мансур Мухамедовяч

Ведущая организация:

Институт вирусных препаратов им. О.Г. Анджапаридзе РАМН.

Защита состоится « {9 » января 2004г. на заседании диссертационного совета Д 001.020.0] в Научно-исследовательском институте вирусологии имени Д.И. Ивановского РАМН по адресу: 123098 Москва, ул. Гамалеи, д. 16 в Iчас. 00 мин.

С диссертаций '■еке Научно-

исследовательского иьт1. гого РАМН.

Автореферат разчк..¡!

Ученый секретарь Диссертационного совета

доктор медицинских наук КосясоваН. П.

I. Общая характеристика работы.

Актуальность работы. В настоящее время классическая чума свиней и репродуктивно-респираторный синдром свиней - заболевания, часто регистрируемые на территории России (и ряда других стран) и приносящие серьезный экономический ущерб промышленному свиноводству. Проблема контроля распространения данных вирусов актуальна как для стран, свободных от этих болезней, так и для стран, где по-прежнему регистрируются вспышки данных заболеваний. Разработка надежных современных средств диагностики и профилактики - важная задача на пути борьбы с распространением возбудителей данных заболеваний и понимания механизмов их эволюционного развития.

Вирус классической чумы свиней (КЧС) вызывает заболевание, приносящее значительные экономические потери свиноводческой промышленности. Характерными признаками заболевания являются лихорадка, нервные нарушения, геморрагические явления, высокий уровень смертности. Этиологический агент, вызывающий КЧС, наряду с вирусами диарея крупного рогатого скота и пограничной болезни овец принадлежит к роду РезгМгиэ семейства РкптгЫае,

Поголовная вакцинация живой вакциной против КЧС практикуется в ряде стран (в том числе и в России). В этих условиях затруднительно выявление инфицированных животных серологическими методами, т.к. большинство животных серопозитивны. Различные варианты оолимеразаой ценной реакции (ПЦР) для обнаружения пестивирусов в целом и для специфичного определения вируса КЧС не обеспечивают возможности дискриминации между вирулентными изолятами и вакцинными штаммами (КС и ЛК-ВНИИВВиМ), применяемыми на территории России.

В соответствии с эпизоотологической важностью и затруднениями в диагностике КЧС возникла потребность в разработке новейших методов быстрой детекции,, идентификации и классификации вирусных нзолятов.

Филогенетический анализ Ценить сі епень эволюционного родства

между различными штаммами вируса КЧС, выяснять происхождение вспышек и изучать эволюцию вирусов.

Большая коллекция изолятов вируса КЧС со всего мира, и особенно из Европы, собрана в Ганновере в Референтной Европейской Лаборатории по КЧС. Используя материалы данной коллекции, мы получили возможность дать наиболее полную филогенетическую характеристику изолятам с территории России и определить эволюционную дистанцию между ними и известными референтными штаммами, а также оценить возможность причастности российских полевых изолятов к обширным эпизоотиям КЧС в 1997 году на территории стран Евросоюза.

Репродуктивно-респираторныЙ синдром свиней (РРСС) - вирусная болезнь, характеризующаяся наличием двух клинических форм: репродуктивных нарушений у взрослых свиней и пневмонии с высоким уровнем смертности у молодых поросят. Репродуктивные проблемы у свиноматок проявляются в наличии поздних абортов, преждевременных опоросов, рождении слабых, недоразвитых и мертворожденных поросят. Респираторная составляющая РРСС характеризуется наличием ярко выраженных дыхательных затруднений, лихорадки и интерстициальной пневмонии у новорожденных поросят.

Возбудитель болезни — вирус, который в настоящее время отнесен к роду АпегМгш семейства А^егтШае в порядке МШоу1га1ез, Впервые этиологическую роль его в возникновении РРСС доказали в 1991 голландские ученые из Центрального ветеринарного института г. Лелистада. РРСС был впервые обнаружен в 1986-1987 годах в племенных хозяйствах США и Канады, а в 90-е годы его появление зафиксировали во многих странах Европы, Южной Америки я Азии, а также в России. Быстрое распространение РРСС нанесло (и продолжает наносить) огромные убытки свиноводству разных стран, и экономический ущерб от него занял одно из первых мест по сравнению с ущербом от других болезней.

В настоящее время выделяют два генетических типа вируса РРСС: американский и европейский, отличающихся по первичной структуре генома и

вирусных белков. Из-за высокой степени структурных отличий полного антигенного перекреста в серологических реакциях между ними не существует.

Диагностика болезни основывается на эпизоотологичееких, клинических и патол ого анатомических данных и результатах лабораторных исследований по выделению и идентификации возбудителя, а также по выявлению специфических антител в сыворотке крови. Идентификация возбудителя РРСС осуществляется при помощи культивирования в первичной культуре альвеолярных макрофагов поросенка с последующим иммунохимическим окрашиванием зараженных клеток мечеными моноклональными антителами, что занимает много времени и является трудоемким методом. По литературным данным ПЦР является надежным и высокоспецифичным методом прямого обнаружения генома возбудителя РРСС и выявления случаев носительства. В России до сих пор не были широко доступны средства для рутинной диагностики и эпизоотического мониторинга РРСС, а данные о характеристиках вирусных изолятов недостаточны, хотя и свидетельствуют о циркуляции вируса РРСС преимущественно европейского типа. Для понимания современной ситуации необходимо при помощи молекулярных методов провести исследование распространенности вируса РРСС и молекулярное типирование изолятов, полученных из различных краев и областей России и Белоруссии.

Данная работа объединяет разработку современных методов для быстрого обнаружения, идентификации и классификации возбудителей двух наиболее экономически и эпизоотологически значимых заболеваний свиней: вируса классической чумы и вируса репродуктивного и респираторного синдрома.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: Разработка и применение средств для проведения эпизоотологического мониторинга и молекулярного типирования изолятов вируса классической чумы свиней и вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, циркулирующих на территории России и СНГ.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. разработать способ дифференциации вакцинных штаммов КС и ЛК-ВНЙИВВиМ от полевых изолятов вируса КЧС при помощи рестрикционного анализа и применить его на практике

2. провести филогенетический анализ изолятов вируса КЧС, циркулирующих на территории России

3. разработать метод выявления генома вируса РРСС при помощи ПЦР

4. изучить распространение вируса РРСС на территории России методом ПЦР

5. провести филогенетический анализ изолятов вируса РРСС, циркулирующих на территории России и Белоруссии.

Научная новизна и практическая значимость работы.

Был разработан метод для дифференциации вакцинных штаммов КС и ЛК-ВНИИВВиМ и вирулентных изолятов вируса КЧС, в настоящее время он применяется на практике для проведения рутинных исследований.

Проведенный филогенетический анализ показал, что все проверенные полевые изоляты вируса КЧС принадлежат к подгруппе 1.1 с основным референтным штаммом А1&П 187, ни один из проверенных изолятов не попал во 2 группу, в которую входят изоляты, вызвавшие эпизоотии КЧС на территории стран Евросоюза в 1997 г.

Проведенный филогенетический анализ полевых изолятов вируса КЧС доказал генетическую стабильность и безопасность вакцин (против КЧС) КС и ЛК-ВНИИВВиМ, применяемых на территории РФ.

Разработанный метод для обнаружения вируса РРСС методом ПЦР в настоящее время применяется на практике. На его основе создана и утверждена диагностическая тест-система для обнаружения вируса ре продуктивно-

респираторного синдрома свиней (РРСС) методом полкмеразной цепной реакции (ПЦР) НПО НАРВАК.

Проведенный филогенетический анализ полевых изолятов вируса РРСС позволяет дать практическую рекомендацию для разработки диагностической системы ИФА на основе рекомбннантных антигенов европейского типа.

Внедрение результатов в практику.

На основе проведенных исследований разработана диагностическая тест-система для обнаружения вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Данная диагностическая тест-система выпускается ЗАО НПО НАРВАК на основании ТУ 9384-020-42418073-00. Тест-система успешно прошла комиссионные испытания в 2000 году и в настоящее время используется диагностическими лабораториями для обнаружения вируса РРСС в образцах, полученных от животных.

Принципы и методы, представленные в данной работе, могут использоваться в вирусологии и эпизоотологии для решения актуальных задач, связанных с выявлением, необходимостью классификации и мониторингу различных возбудителей опасных инфекционных заболеваний.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. Разработанный способ рестрихционного анализа может быть использован для дифференциации вакцинных штаммов КС и ЛК-ВНЙИВВнМ и полевых вирулентных изолятов вируса КЧС.

2. При помощи филогенетического анализа установлено, что полевые изоляты вируса КЧС, циркулирующие на территории России, принадлежат к подгруппе 1,1.

3. Разработана тест-система на основе метода ПЦР для выявления генома вируса РРСС американского и европейского типов и показана возможность ее использования в лабораторной практике.

4. Изучение распространения вируса РРСС в хозяйствах РФ и Белоруссии методом ПЦР показало наличие изолятов только европейского типа.

5. При помощи филогенетического анализа установлено, что полевые шоляты вируса РРСС, циркулирующие на территории России, принадлежат к европейскому типу, образуя тесный кластер с испанскими нзолятами.

Апробация работы. Результаты исследований доложены и обсуждены на международной конференции «Interlaboratoiy CSFV comparison teste (Румыния, Бухарест, 2000г.), на международной конференции "Veterinaiy Virology in the New Millenium" - 5th International Congress of the European Society for Veterinary Virology (Италия, Брешия, 2000г.), II Международной научной конференции «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии» (Москва, 2000).

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 статьи. Также опубликованы тезисы 3 докладов в материалах российских и международных конференций и симпозиумов.

Структура и объем диссертации. .Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной часта и обсуждения результатов, заключения и выводов. Объем работы составляет 120 страницы машинописного текста. Работа иллюстрирована 11 таблицами и 15 рисунками. Список литературы включает в себя 136 источников.

II. Содержание работы. 1. Материалы и методы.

В работе были использованы исторически« изоляты вируса КЧС, полученные из коллекции ВНИИВВиМ 1994-1999гт. (таблица 1):

Таблица 1. Полевые изоляты вируса КЧС, исследованные в данной работе

Изолят Месяц/Год выделения Место выделения

238Н* 07/84 Надым, Яыало-ненедасий округ

613 09/94 Красноярский край, Западная Сибирь

638 02/95 Красноярский краб. Западная Сибирь

639 02/95 Красноярский край. Западная Сибирь

640 02/95 Красноярский край, Западная Сибирь

641 03/95 Тюменская область. Западная Сибирь

651 04/95 Нижегородская область

653 03/95 Рязанская область

654 05/95 Ленинградская область

661 04/95 Черкизово, Московская область

664 05/95 Белгородский район

665 05/95 Башкортостан

671 06/95 Пермская область, Урал

672 07/95 Тюменская область. Западная Сибирь

673 08/95 Челябинская область

674 08/95 Башкортостан

682 09/95 Воронежская область

684** 10/95 Паалово-Посад, Московская область

694 01/96 Оренбургская область

695 01/96 Оренбургская область

703 09/96 Башкортостан

712 07/96 Пермская область, Урал

713 07/96 Липецкая область

714 07/96 Липецкая область

716 09/96 Новосибирская область, Сибирь

719** 11/96 Самарская область

720 11/96 Самарская область

721 11/96 Пермская область

735 12/97 Рязанская область

742 12/97 Башкортостан

745 06/98 Волгоградская область

752 п m Самарская область

759 10/99 Рязанская область

762 11/99 Башкортостан

782 03/99 Волгоградская область

* - изолят 238Н - умеренно-вирулентный

** - изоляты, выделенные от ыевакцинированных животных.

Также в работе были использованы следующие референтные штаммы вируса КЧС: вакцинный штамм КС, любезно предоставленный проф. Сергеевым В.А.; вакцинный штамм ЛК-ВНЙИВВиМ (РС-УЮТУХЛМ) и вирулентный штамм Ши-Мынь (ЗЬнпеп), полученные из коллекции ВНИИВВиМ; вирулентный штамм А1ГоП187, полученный из коллекции Референтной Европейской Лаборатории по КЧС (Ганновер).

В работе были использованы следующие референтные штаммы вируса РРСС: Ье1у$1а<1 (европейский тип) и КАГ)С-8 (американский тип), любезно предоставленные Б. Менгелингом (ЫАОС, Айова, США). Также были использованы полевые вирулентные изодяты вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней (таблица 2):

Таблица 2. Полевые изодяты вируса РРСС, исследованные в данной работе

Место выделения Год/месяц выделения

45\Воронеж, Центральная Россия 1992

Приморский Край, Дальний Восток 1986

Заволжское, Тверская область 05/2001

Барнаул, Алтайский край 05/2001

Ирмень, Восточная Сибирь 05/2001

Кудряшовскиб, Восточная Сибирь 06/2001

Заднепровский, Беларусь 06/2001

Белгород, Юг России 06/2001

Белая Дача, Москва 06/2001

Нарцнэово, Беларусь 06/2001

Багратионовский, Беларусь 06/2001

Дражно, Беларусь 06/2001

В работе были использованы современные и исторические изоляты вируса РРСС, а также референтные дпаммы вируса РРСС американского и европейского типов.

Выделение РНК и ОТ-ПЦР проводили согласно стандартным методикам. Набор специфических олигонуклеотндов для проведения рестриктного анализа вируса КЧС был разработан в лаборатории молекулярной диагностики ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН (2аЬегегЬпу е! а1., 1999). Набор специфических олигонуклеотндов для проведения филогенетического анализа вируса КЧС был синтезирован согласно рекомендациям I. (Зшзет-МУШсе (У1азоуа е1 а1., 2003). Набор специфических олигонуклеотидов для обнаружения

и проведения филогенетического анализа вируса РРСС был разработан в нашей лаборатории прн помощи прграмм Amplify 1.0, Oligo 4.0-s/Macintosh/ (Власова с соавт., 2003; Гребенннкова с соавт., 2003). Очистка целевых ПЦР-фрашентов проводилась при помощи метода гель-электрофореза.

Для секвенирования по двум цепям использовали те же праймеры, что и для проведения ПЦР.

Первичные структуры геномов референтных штаммов, использованные в работе, были получены из Генбанка. Номера доступа были следующие: МЗ1768 (Brescia); Z46258 (Chinese); PI9712 (Alfort Tübingen); L49347 (P97); U45477 (Riems); U45478 (Glentorf); D49S32 (ALD); D49533 (GPE-); X96S50 (CAP); ZA6258 (C-strain); X87939 (Alfort 187); AF094475 (VR-2332); M96262 (Lelystad virus).

Анализ нуклеотидных последовательностей вирусных изолятов проводился с использованием пакета программ CLUSTAL W software (Thompson et al., 1994). Филогенетические деревья были построены при помощи пакета компьютерных программ PHYL1P, для определения степени филогенетического родства был выбран метод NEIGHBOR-JOINING (Felsenstein, 1989).

2. Результаты исследований и их обсуждение.

Разработка и применение на практике метода дифференциации вакцинных штаммов КС и ЛК-ВНИИВВиМ и вирулентных (полевых) изолятов вируса КЧС

Дифференцирующий метод основан на сравнении нуклеотидных последовательностей геномов различных штаммов и различиях в их рестрикцнонных картах. Ранее в лаборатории молекулярной диагностики ГУ НИИ Вирусологии им. Д.И. Ивановского РАМН геном вакцинного штамма КС был секвенирован и был проведен сравнительный рестрикционный анализ с геномами референтных штаммов вируса КЧС из генбанка (Гребенникова с соавт., 1998,1999).

Результаты сравнительного рестрикционного картирования генома вакцинного штамма КС.

Сравнительное рестршсционное картирование показало, что в 18 случаях геном вируса КС имеет маркерные сайты рестрикции. В 16 случаях штамм КС имеет уникальные рестрнкционные характеристики, позволяющие отличить его от любого из известных референтных штаммов вируса КЧС (как вакцинных, так и вирулентных). Ввиду генетической стабильности вируса КЧС 16 маркерных сайтов, найденных в геноме штамма КС, гарантируют его идентификацию среди представителей всех известных генетических групп.

Чтобы идентифицировать вакцинный штамм КС, мы разработали метод, основанный на амплификации определенных участков генома, содержащих маркерные сайты рестрикции, при помощи метода ОТ-ПЦР с последующей обработкой продуктов ПЦР соответствующими рестриктазами.

Идентификация вакцинного штамма КС и его дифференциация от референтных штаммов и полевых изолятов.

Из 16 обнаруженных уникальных сайтов рестрикции всего 3 было использовано для проверки метода идентификации вакцинного штамма КС

(Zaberezhny et яі. і W), Гри отдельных ОТ-ПЦР/ресїрикіаіш,:> і (используя маркерные сайты рестрикції он ных эндонуклеаз Psti, Kpnl п Bglllt были проведены для 25 полевых изолятов (из таблицы 1) и 4 референтных штаммов (КС, ДК-ВНИВВиМ, Щи-Мынь и Alfort 187). Для этого при помощи набора специфических праймеров были полнены амплифккационные фрагменты ДНК, содержащие данные сайты. Очищенные фрагменты ДНК были обработаны соответствующими рестриктазами и проанализированы методом электрофореза в агарозном геле. Принципиальная возможность дифференцировать вакцинный штамм КС от вирулентного, используя маркерные сайты рестрикции, была показана на примере штаммов КС и Alfort 187. Рисунок 1 демонстрирует ожидаемые результаты, полученные при рестрикционном анализе фрагментов амплификации вакцинного (КС) и вирулентного (Alfort 187) штаммов.

t г j 4 а є 7

Рис. I. Рестрикції о нный ана.ііп продуктов амплификации генома штаммов КС м Alfort IST: Обработка Kpnl фрагмента размером 388 п.о. IIj штаммов КС (дорожка 2)и Affort 187 (дорожка 3) ^^^^^^^^^ННЯННВ Обработка Pst] фрагмента ра ruf ром 350 п.о. Н і ^^^НШЩ^^Зш^^ХшЛ штаммов КС (дорожка 4) u Alfort 187 (дорожка 5)

Обработка Bglf фрапчента размером 289 п.о. Иг штаммов КС (дорожка 6) и Alfort 187 (дорожка 7) Маркеры молекулярной PUC19

НВЯНН^И^НН^^НІ обработки ДЛ/;/(дорожка 1).

Подобные электрофореграммы служат критериями для анализа полевых изолятов, В настоящее время данные дискриминирующие тесты успешно применяются при проверке полевых образцов.

Для проверки дифферент! рующе го теста были использованы исторические полевые изоляты из коллекции ВНИИВВиМ (таблица 1). Данные изоляты были выделены во время вспышек КЧС в период 1994-1999и\. поэтому предполагалось, что онн должны быть вирулентными, а не вакцинными. Они действительно отличались от вакцинного штамма КС по всем 3 маркерным сайтам рестрикции (Kpnl, Psti, Bglt), Ни один из полевых изолятов не давал картины, сходной с вакцинным штаммом. Также были

проанализированы сыворотки от недавно вакцинированных свиней из хозяйств, в которых не было вспышек КЧС. Они давали положительные результаты при диагностике методом ПЦР. Рестрикционный анализ после проведения реакции ПЦР показал, что эти сыворотки содержат вакцинный вирус. Эти данные подтверждают наблюдения о персистенции вакцинного вируса в сыворотках вакцинированных животных.

Все протестированные полевые изоляты давали ожидаемые картины рестрикции. Таким образом, проведенные исследования показали, что ранние вспышки заболевания не были вызваны реверсией вакцинного штамма.

Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса КЧС, циркулирующих на территории России, и сравнение их со штаммом КС

Для вируса КЧС была разработана система молекулярного типирования и распределения изолятов по 3 основным филогенетическим группам на основании частичного секвенировання 3 фрагментов генома и сравнения полученных результатов с данными о наиболее хорошо изученных референтных штаммах вируса КЧС. Сравнительное секвенированне проводят по 3 фрагментам генома из 5' нетракслируемоЙ области (NTR) (Hofmann et al., 1994; Greiser-Wilke et aL, 1998; Becher et al., 1999), 5'вариабельной области гена поверхностного гликолротеина Е2 (lowings et aj., 1996; Vilcek et al., 1996; Becher et al., 1999; Parchariyanon et al., 2000) и неструктурного гена NS5B (Björklund et al., 1999).

Филогенетическая характеристика российских полевых изолятов вируса

КЧС.

Фрагменте 190 нуклеотидных пар, соответствующий вариабельному 5 -концевому участку гена Е2 был амплифицнрован у 32 полевых изолятов, фрагмент размером 200 нуклеотидных пар из 5*-нетранслнруемой области был амшгафицироваи для 29 полевых изолятов, фрагмент в 327 нуклеотидных пар последовательности гена NSSB был амплифицирован для 17 полевых изолятов.

Соответствующие фрагменты генома были амплифицированы также и для 3 аттенуированных штаммов вируса КЧС (КС, Ж-ВНИИВВиМ и 238Н). В исследование также был включен выооковируленетный штамм Ши-Мынь, который был выделен в Китае в 1945 году и использовался в течение длительного времени в России для проверки поствакцинального иммунитета.

Все полученные ПНР-продукты были очищены методом гель-электрофореза, секвеннрованы, и на основании анализа полученных данных и сравнения их с данными для ряда референтных штаммов были построены 3 филогенетических дерева. В результате проведенного филогенетического анализа установлено, что по европейской классификации (Lowings et al., 1996) все проверенные полевые изодяты попадают в группу 1, подгруппу 1.1, представителями которой являются референтные штаммы Alfort 187, ALD, Glentorf. Штамм Ши-Мынь также относится к подгруппе 1.1 и, вероятно, внес свой вклад в распространение вируса КЧС на территории России, В то же время ни один полевой изолят не попал а подгруппу 1.2 (где основным референтным штаммом является Brescia), которой принадлежат вакцинные штаммы КС и ЛК-ВНИВВиМ.

Согласно ранее проведенным молекулярно-эпвдемиологическим исследованиям Vilcek et al. (1996) вакцинный штамм ЛК-ВНИИВВиМ также принадлежит к группе 1, подгруппе 1.2. Эта результаты были получены на основании секвенирования фрагментов из 254 и 207 нуклеотидных пар, принадлежащих вариабельным областям гена £2 и гена полимеразы соответственно.

Использование полноразмерных геномов для проведения филогенетического анализа, также показало, что штамм КС по европейской классификации принадлежит к группе 1 и попадает в ту же самую подгруппу (1.2), что и референтный штамм Brescia (Гребенникова с сотр., 1999).

Результаты сравнительного секвенирования области гена Е2 полевых изолятов и референтных штаммов вируса КЧС (рис. 2) свидетельствуют о том, что проанализированные полевые изоляты принадлежат к подгруппе 1.1, образуя 2 кластера: Ши-Мынь (25 изолятов) и Alfort 187 (6 изолятов).

п

ГІ

з

-{к:

9-9.

Є40-Е2 6ІЗ-Е2 664-ЕІ 66 5-Е І «72-Ё2 703-Ё2 7<2-Е2 714-Е2 7П-Е2 72(-Е2 696-Е2 720-Е2 673-Е2 673-Ё2

673-Е2

674-ЕІ 233Н-Є2 М1-€2 639-Є2 661-Е2 М2-Е2 694-Е2

7М.Е2 745-62 742-Е2 684-Е2 7Ів-Є2 Т19-Е2 А1Х>-Ё2 (13-Е2 М8-Е2 Є71-Е2 735-Е2 Тв2-Ег

А«оК 167

СМпм*

ГЪет*

БРЁ"

75&-Е2

СЛР

Сіепібгі

С5

Вгмсй

ЛИоп ТиЬ*і9«і> Р97

Рис. 2. Дендрограмма, показывающая степень филогенетического родства между российскими полевыми шолятамн и референтными штаммами вируса КЧС, основанная на яналязе нукладтндной ііос.ісдовяте."іі>и<>сти гена поверхностного глнкопротеина £2.

Результаты сравнительного с еквенирования 5'-нетранслируемой области генома и области гена №5В показали те же результаты: все полевые изоляты вируса КЧС принадлежат к подгруппе 1.1, а российские вакцинные штаммы - к подгруппе 1.2.

Несмотря на широкий географический разброс, проверенные полевые изоляты демонстрируют тесное филогенетическое родство. Изоляты, проанализированные в настоящей работе, выделены примерно в 1994-1999 тт., когда в России отмечалось повышенное количество вспышек КЧС. Из филогенетической картины, представленной на рисунке 2, видно, что эти вспышки были вызваны, хотя н близкородственными, но разными штаммами. Только изоляты 712 и 714, выделенные в Пермской и Липецкой областях, по-

14

видимому, идентичны. Вероятно, одна из этих вспышек привела к другой в результате заноса вирусного возбудителя.

Ни результаты, полученные в настоящих исследованиях, ни результаты отечественных исследователей {ВегЬопх1оуа е1 а1., 1999) не выявили ни одного изолята, эволкщионно близкого к вакцинным штаммам КС и ЛК-ВНИИВВиМ (УЫоуа е! а1., 2003). Таким образом, несмотря на то, что данные вакцины применялись в Российской Федерации на протяжении более чем 30 лет, не обнаружено признаков их реверсии к дикому типу. Это еще раз доказывает их безопасность и обоснованность применения на территории нашей страны. В России пока невозможно полностью отказаться от применения вакцин, ввиду обширных территорий, сложностях при контроле природных очагов инфекции и невозможности полной замены свннопоголовья свободными от специфического патогена животными. Возможно, в дальнейшем больше внимания будет уделено применению маркированных вакцин в сочетании с усиленными методами молекулярно-эпизоотологическопо надзора, регулярными проверками серологического статуса свиней и строгими карантинными мерами.

Ранее возникали многочисленные вопросы о возможности заноса вируса КЧС из России на территорию европейских стран. В странах Евросоюза проводится глобальная политика по недопущению заноса вируса КЧС путем сочетания невакцинирования, массового убоя выявляемых инфицированных животных, строгого молекулярно-эпидемиоло гичсекого надзора и контроля иммунологического статуса поголовья. Следует отметить, что все изо ля ты, выделенные во время недавних эпизоотий КЧС в странах Евросоюза, принадлежат к группе 2, хотя и попадают в разные подгруппы (81аскдек « а1., 1997; РгНгете1ег е1 а1., 2000; Сге1Бег^1ке й а!., 2000), ни один из проверенных российских полевых изолятов не попал во 2 группу. Таким образом, можно исключить возможность общности происхождения этих эпизоотий и вспышек КЧС в Российской Федерации.

Результатом проведенных исследований является наличие чувствительной и надежной системы для быстрого обнаружения, дифференциации и молекулярного тнпирования различных штаммов вируса КЧС, которая является

необходимым инструментом при наблюдении за циркуляцией и эволюцией вируса КЧС.

Разработка метода выявления генома вируса РРСС

Набор специфических праймеров был разработан на основе сравнения опубликованных первичных структур геномов референтных штаммов VR-2332 и Lelystad. Праймеры были подобраны для области открытой рамки считывания 7 (ОРС7), т.к. она является наиболее консервативной в геноме вируса РРСС. При помощи компьютерных программ данные праймеры были проверены »а специфичность и универсальность работы со всеми известными референтными штаммами вируса РРСС американского и европейского типа, геномные последовательности которых были получены из Генбанка. Для повышения чувствительности была разработана «гнездовая» система, с двумя парши внутренних праймеров. Ввиду того, что уровень гомологии между геномами двух типов вируса составляет всего 50-80%, мы решили подобрать типоспецифнчные праймеры. Две пары внутренних праймеров, специфичных к американскому и европейскому типам, обеспечивают возможность дифференциации между типами вируса РРСС, и позволяют выявлять широкий спектр нзолятов внутри каждого типа (Власова с со авт., 2003).

Суммарная РНК, выделенная из клеток MARC-145, зараженных штаммами NADC-8 (американского типа) и Lelystad (европейского типа), была использована в качестве матрицы в реакции ОТ-ПЦР. В ходе оптимизации условий ОТ-ПЦР с референтными штаммами была выбрана оптимальная температура отжига t=54°C. Было показано, что разработанные праймеры работают специфически в реакционной смеси со стандартной концентрацией MgCI2 (1.5гаМ). После проведения двухстадийной ПЦР (по 25 циклов) получались фрагменты ожидаемого размера: 388 п.н.- для американского типа вируса и 403 п.н. для европейского. Чтобы подтвердить специфичность конечных продуктов, они были секвенированы,

Чувствительность проверяли следующим образом: была сделана серия последовательных тшведений стандартных препаратов вируса РРСС, штаммов

и ЫАОС-8. Стандартные препараты вируса получали путем культивирования данных штаммов на культуре клеток МАТ1С-145, свободных от контаминации другими патогенами. Для определения чувствительности метода, была сделана серия десятикратных разведений стандартного препарата вируса (от 105 до 101 ИД») и проводили выделение РНК согласно наставлению по применению тест-системы ПНР для обнаружения вируса РРСС. Чувствительность системы детекции РНК

вируса РРСС методом ОТ-ПЦР

составляла Ю'-К^ИД».

Специфичность разработанной тест-системы проверяли с использованием панели контрольных образцов (таблица 3). Суммарная РНК и ДНК была выделена на неорганическом носителе (НПО НАРВАК, г. Москва) из всех образцов, имеющихся в панели, и использована в качестве матрицы в реакции ОТ-ПЦР с разработанной системой праймеров. Результаты проверки, представленные в таблице 3, свидетельствуют о специфичности работы тест-системы.

Таблица 3. Панель контрольных образцов для проверки специфичности

метода ПЦР при диагностике РРСС

№ Описание образца Результат ПЦР Комментарии

1 Культура клеток MARC-145, инфицированная европейским референтным штаммом "Lelvstad" + Наличие РНК вируса РРСС

2 Неинфицировакная культура клеток MARC-145 - Отсутствие РНК вируса РРСС

3 Культура альвеолярных макрофагов, инфицированная европейским референтным штаммом "Lelystad" + Наличие РНК вируса РРСС

4 Культура неияфицярованяых альвеолярных макрофагов - Отсутствие РНК вируса РРСС

5 Культура клеток MARC-145, инфицированная американским референтным штаммом "VR-2332" + Наличие РНК вируса РРСС

6 Культура альвеолярных макрофагов, инфицированная американским референтным штаммом "VR-2332" + Наличие РНК вируса РРСС

7 Культура клеток, инфицированная вирусом чумы ПЛОТОЯДНЫХ - Отсутствие РНК вируса РРСС

8 Культура клеток РК-15, инфицированная вирусом диареи - Отсутствие РНК вируса РРСС

9 Кровь свиньи, инфицированной вирусом РРСС + Наличие РНК вируса РРСС

,']і:\«фзіі!,и.,ск,ііс уч.ім сбкііьи. инфицированной вирусом РРСС •г ¡Ь.иы1^ вйрусд РРСС

Легкие спнньи. инфицированной вирусом РРСС + Наличие РНК вируса РРСС

12 Сердце свиньи, инфицированной вирусом КЧС - Отсутствие РНК вируса РРСС

П Кровь неинфиинро ванной свиньи - Отсутствие РНК вируса РРСС

14 Легкие иеинфииированной свішьн - Отсутствие РНК вируса РРСС

15 Лимфоузлы ней нфиаиро ванной свиньи - Отсутствие РНК вируса РРСС

16 Лимфоузлы свиньи. инфицированной вирусом КЧС - Отсутствие РНК вируса РРСС

17 Кровь животного, ин филированного внрусом диареи - Отсутствие РНК вируса РРСС

IS Культура вакцинного штамма М Bovis BCG - Отсутствие РНК виру са РРСС

19 _ Стерильный физиологический раствор j Отсутствие РНК вируса I РРСС

Таким образом, было показано, что разработанная тест-система позволяет

надежно и воспроизводимо дифференцировать РНК вируса РРСС от других вирусов и патогенов бактериачьной природы,

В ходе экспериментов с полевыми образками была подтверждена высокая чувствительность данной системы, позволяющая обнаруживать вирус как в момент острой виремии и яркого проявления клинических признаков, так и во время его бессимптомной циркуляции в поголовье свиней. Было обнаружено, что наиболее удачными образцами для обнаружения вируса являются сыворотки крови и пробы легких и лимфоузлов от поросят. Были исследованы более 300 образцов спермы племенных животных, полученных из различных хозяйств России и Белоруссии. Преимуществом метода ПЦР является возможность обнаружения возбудителя РРСС в сперме животных, что затруднительно при помощи иммунологических методов из-за низкой концентрации вируса и наличия биологических ингибиторов.

В результате оптимизации условий проведения ОТ-ПЦРдля обнаружения РНК вируса РРСС, была создана чувствительная и специфичная тест-система для детекции и дифференциации РНК американского и европейского типов вируса РРСС в инфицированных культурах клеток и различных биологических образцах, полученных от животных, позволяющая получить результаты в

течение нескольких часов. Тест-система была опробована на широкой выборке полевых образцов. Были проведены государственные испытания тест-системы и разработана постоянная документация. В настоящее время данная тест-система успешно применяется для проведения рутинных диагностических исследований в лаборатории молекулярной диагностики ГУ НИИ вирусологии им. ДЛ. Ивановского, а также в раде диагностических ветеринарных лабораторий нашей страны.

Изучение распространения вируса РРСС на территории России и Белоруссии с использованием метода ОТ-ПЦР

Одной из основных задач данных исследований было изучение настоящей ситуации с распространением вируса РРСС на территории России и Белоруссии при помощи метода ОТ-ПЦР. Серологические исследования, проведенные ранее при помощи иммуноферментного набора «HerdChek ELISA» (ГОЕХХ, США), показали, что специфические антитела к вирусу РРСС широко распространены в хозяйствах указанных государств, серопозитивны были образцы из 37 хозяйств, при общем количестве обследованных - 51. Наличие антител к вирусу РРСС свидетельствует о его персистенции в хозяйстве. Тем не менее, у многих серо-положительных свиней вирус в крови не обнаруживается, вероятно, ввиду недостаточной концентрации. Известно, что серологический статус больных животных не отличается от статуса носителей; а при помощи метода ПЦР носителей можно выявлять путем проверки носоглоточных смывов.

Для проверки полевых образцов проводилась так называемая «множественная ПЦР» (т.е. на второй стадии использовалось две пары праймеров, специфичных к американскому и европейскому типам вируса РРСС). При помощи разработанной тест-системы было проверено свыше 1000 различных полевых образцов: сывороток крови, образцов спермы от хряков-производителей, проб лимфоузлов и легких от новорожденных поросят, а также проб различных паренхиматозных органов от свиней различного возраста. Были проверены образцы патматериала из 12 областей и других административных единиц России и Белоруссии, Согласно полученным данным, вирус РРСС

распространен практически повсеместно на территории России и Белоруссии. Это соответствует литературным данным о чрезвычайно широкой персистенции вируса РРСС в поголовье свиней.

Проведенные исследования показали наличие на территории России и Белоруссии изолятов вируса РРСС только европейского типа. Не было ни одного случая обнаружения вируса РРСС при помощи праймеров, специфичных к американскому типу.

Параллельно с проверкой данных образцов на наличие РНК вируса РРСС методом ОТ-ПЦР, предпринимались попытки выделить вирус на культуре альвеолярных макрофагов свиней. Выделить вирус из образцов, положительных по ПЦР, удавалось не более чем в 10% случаев. Таким образом, наши исследования подтверждают литературные данные о том, что гнездовая модификация ОТ-ПЦР является наиболее чувствительным методом определения вируса РРСС в полевых образцах.

Филогенетическая характеристика полевых изолятов вируса РРСС, циркулирующих на территории России и Белоруссии

На основании существенных генотипических и антигенных различий сейчас признается существование двух типов вируса РРСС - европейского, представленного изолятамн из стран Европы и СНГ, и американского, представленного изолятами из США и Канады. Для вируса РРСС еще не разработано четкой системы деления изолятов на определенные филогенетические группы а подгруппы. Частичное геномное секвенирование для вируса РРСС проводят по ОРСЗ, ОРС5 и ОРС7. Так как ОРС5 и ОРСЗ являются высоковариабельной и гипервариабельной областями, было решено проводить филогенетический анализ по области ОРС7, чтобы при помощи одной системы праймеров обеспечить возможность исследования максимального количества изолятов.

Дня проведения филогенетического анализа был выбран фрагмент размером 403 п.н., соответствующий области ОРС7. .Данная область была амплифяцирована при помощи гнездовой системы праймеров, специфичных к

европейскому типу вируса, для референтного штамма Ье1у$1ас], 10 полевых изолятов, полученных из различных регионов России и Белоруссии в 2001 году и 2 исторических изолятов 45-+ Воронеж и Приморский край, выделенных в 1992 и 1986гг., соответственно.

Ген ОРС7 из штамма КАОС-8 (американский тип вируса) был амплифнцирован при помощи гнездовой системы праймеров, специфичных к американскому типу вируса н включен в исследование. Все полученные ПЦР-продукты были очшцены при помощи гель-электрофореза, секвенированы, и на основании анализа полученных данных и аналогичных данных для ряда референтных штаммов (данные были взяты из Генбаика) было построено филогенетическое дерево.

Данные о филогенетическом родстве штаммов РРСС, выделенных в России и Белоруссии, и штаммов, выделенных на территории Америки н России, представлены на рисунке 3. Все полевые изоляты, проверенные в настоящей работе, относятся к европейскому типу вируса и попадают в одну группу с изолятами из Испании, Англии и Дании. Изолятов американского типа не было обнаружено. Несмотря на широкий географический разброс изолятов вируса РРСС, использованных в работе, эти изоляты демонстрируют тесное генетическое родство.

Согласно данным филогенетического анализа все европейские штаммы вируса РРСС делятся на две большие подгруппы. В одну подгруппу входят штаммы вируса РРСС, выделенные в Германии, Франции, Великобритании, Голландии и Польше. В эту же подгруппу входит испанский вакцинный штамм. Другую подгруппу составляют полевые изоляты вируса РРСС, выделенные в Испании, России и Белоруссии. Итак, первичная структура гена, кодирующего белок вуклеокапсида российских и белорусских полевых изолятов, ближе всего к первичной структуре ОРС7 испанских изолятов вируса РРСС.

Проведенные исследования позволили выявить наиболее распространенную структуру гена нуклеокапсидного белка среди изолятов, встречающихся на территории России и Белоруссии. При разработке диагностического набора на основе ИФА очень важен выбор наиболее

подходящего источника антигена, и наши результаты позволили рекомендовать изо ляг 45+ Воронеж для получения рекомбинантного нуклеокалсидного белка и использования его в качестве специфического компонента диагностической тест-системы.

FfBW* M V 1. ]X UK MOI

Nt, BokHvJO UK HYl UK НЛІ

IHYSTAP VIR) Witufc-. ?4 07. Ï DniMitt ІІШ UK BEI UK LEI

Spain VAOCRJE Frutee |5Г,ЗМ Poind M-OT PoIpíkHÍH UK NY) UKU 1ЖШ FrvKe292 Spain Î710 CL

Spain ІІШ.1Ш Spain 4M* SpmPOÎÎ. )»» Spain 3211 Spain 21» Spain A Vil «V»5! Spain ТОЇ Sp«NL3-ï _ Spain Sd. Spainfe

Бинті, Mwin,0] ГГрнжчкщнА араИ, is БарапуіцОЇ

I

ф)«,01 ÜftpUXHBüv 1

Быгат, Юг Решто]

БагратмиоасккО, I

HpMCHh в«Т СебіфцОІ

ЭыннфОКЯЧЯ, Ьмар>чл,0&

КудряикмстЙ, Ьосг.СгІбирцО І

4Ї+, Ворсисж, 92

US 1L1

US IA«

Chtal*

US ОТ, ISUl

US KYI

US MOI

US SOI

UïJAl

CaiuditOTM, gut

Canada lAf EXP China MD01 USMVl Thailand Pl.l

us им

US KS I

UStSUSJ,lSUI US1«K(SU2 DKJI4Í1 NADO Drau* 350 OK Si SU

usjsim

CkiiuSI US Niki Canada PAt

USNE1 USVRÍ33I

Рис. З Девдршрамма, южмшшщм стеаевь филогенетического родства между российскими палевыми нзалятями а референтными штаммами вирус» РРСС, осиомннія на анализе нуклеогндной последовательности гена яуклеокапсада.

выводы

1. В результате филогенетического анализа 3 участков генома 34 изолятов вируса классической чумы свиней (КЧС) из 18 областей РФ установлена их принадлежность к подгруппе 1,1. Штаммов, эволюцнонно близких к вакцинным штаммам КС и Ж-ВНИИВВ иМ, не обнаружено. Среди проанализированных полевых изолятов вируса КЧС не обнаружено представителей второй группы, которые были причиной эпизоотии КЧС на территории Западной Европы в1997 году.

2. На основании выявленных сайтов рестрикции в геноме вируса КЧС, отличающих вакцинный штамм КС от полевых изолятов, разработан тест для идентификации вакцинного штамма КС на основе ОТ-ПЦР и рестриктного анализа.

3. В результате проведенного анализа гомологии различных участков генома американского и европейского типов вируса ре продуктивно-респираторного синдрома свиней (РРСС) были выявлены специфичные для каждого типа нуклеотидные последовательности, что позволило разработать дифференцирующий тест на основе ПЦР.

4. Разработана тест-система для детекции генома американского и европейского типов вируса РРСС методом ОТ-ПЦР. Тест-система утверждена н выпускается на основании ТУ 9384-020-42418073-00

5. Использование метода ОТ-ПЦР для выявления вируса РРСС в более чем 1000 биологических образцов из 60 хозяйств России и Белоруссии показало наличие изолятов только европейского типа, изолятов с американским генотипом обнаружено не было.

6. На основании филогенетического анализа 12 полевых изолятов вируса РРСС из 12 областей РФ и Белоруссии было показано, что все они относятся к европейскому типу, образуя тесный кластер с изолятами из Испании.

Публикации по теме диссертации

1. Vlasova, А., Т. Grebennikova, A. Zaberezhny, I. Greiser-Wilke, G. Floegel-Niesmann, V. Kurirmov, T. Aliper, E. Nepoklonov. 2003. Molecular epidemiology of classical swine fever in the Russian Federation. J. Vet. Med., 50:363-367.

2. Гребенникова, T.B., АЛ Забережный, АЛ. Власова, MJí. Мусиенко, МЛ. Соколов, В.В. Грабовецкий, B.C. Богданова, Б.Г. Орлянкин, ТЛ. Алипер, Е.А. Непоклонов. 2003. Генетическая вариабельность белка нуклеокапсида вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней (РРСС). Принято в печать Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.

3. Власова А.Н., Гребенникова Т.В., Алипер Т.И., Непоклонов ЕЛ., Забережный А.Д. 2003. Разработка и применение тест-системы на основе ПЦР дня детекции и дифференциации Европейского и Американского типов вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней. Труды международной научно-практической конференции, посвященной 45-летию института. Ветеринарные и медицинские аспекты зооантропонозов. ГНУ ВНИИВВиМ и РАСХН. Сентябрь: 405-М

4. Vlasova А., Т. Grebennikova, A. Zaberezhny, I. Greiser-Wilke, G. Floegel, V. Kurinnov, S. Tsybanov, Т. Aliper, Б. Nepoklonov. 2000. Molecular epidemiological study of Classical Swine Fever Virus field isolates from Russian Federation. Veterinary Virology in the New Millenium. - Brescia, Italy August 27-30,2000., p. 431.

5. Власова А. П., Гребенникова Т. В., Забережный А. Д., Куриннов В. В., Вишняков И. Ф., Алипер Т. И., Непоклопов Е. А. 2000. Филогенетический анализ российских полевых изолятов вируса классической чумы свиней. II Международная научная конференция « Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии». Москва 18-19 октября; 243.

6. Забережный А.Д., Гребенникова Т.В., Власова А.Н., Куриннов В.В., Вишняков И.Ф., Алипер ТЛ., Непоклонов ЕЛ. 2000. Дифференциация вакцинного штамма и вирулентных (полевых) штаммов вируса классической

чумы свиней. II Международная научная конференция «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеринарии», Москва 18-19 октября; 214.

Принято к исполнению 17/12/2003 Исполнено 18/¡2/2003

Заказ №466 Тяраж:60 экз.

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Власова, Анастасия Николаевна

ВВЕДЕНИЕ ЦЕЛЬ РАБОТЫ I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Характеристика вируса классической чумы свиней 1.1 Морфология и физические свойства

1.1.2 Классификация

1.1.3 Патогенез и патология

1.1.4 Культивирование

1.1.5 Эпизоотология

1.1.6 Иммунитет и вакцинация

1.1.7 Меры борьбы и профилактики

1.1.8 Диагностика

1.2 Характеристика вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней

1.2.1 Морфология и физические свойства

1.2.2 Классификация

1.2.3 Патогенез и патология

1.2.4 Культивирование

1.2.5 Эпизоотология

1.2.6 Иммунитет

1.2.7 Меры борьбы и профилактики

1.2.8 Диагностика . (

1.3 Филогенетический анализ

1.3.1 Генетическая вариабельность и классификация изолятов вируса КЧС

1.3.2 Генетическая вариабельность и классификация изолятов вируса РРСС

Введение Диссертация по биологии, на тему "Филогенетический анализ изолятов вируса классической чумы свиней и вируса репродуктивно-респираторного синдрома свиней, циркулирующих на территории России и Белоруссии"

В настоящее время классическая чума свиней и репродуктивно-респираторный синдром свиней - заболевания, часто регистрируемые на территории России (и ряда других ( стран) и приносящие серьезный экономический ущерб промышленному свиноводству. Проблема контроля распространения данных вирусов актуальна как для стран, свободных от этих болезней, так и для стран, где по-прежнему регистрируются вспышки данных заболеваний. Разработка надежных современных средств диагностики и профилактики - важная задача на пути борьбы с распространением возбудителей данных заболеваний и понимания механизмов их эволюционного развития.

Вирус классической чумы свиней (КЧС) вызывает заболевание, приносящее значительные экономические потери свиноводческой промышленности. Характерными признаками заболевания являются лихорадка, нервные нарушения, геморрагические явления, высокий уровень смертности. Этиологический агент, вызывающий КЧС, наряду с вирусами диареи крупного рогатого скота и пограничной болезни овец принадлежит к роду Pestivirus семейства Flaviviridae.

Поголовная вакцинация живой вакциной против КЧС практикуется в ряде стран (в том числе и в России). Это осложняет выявление инфицированных животных серологическими методами, т.к. большинство животных серопозитивны. Различные; варианты полимеразной цепной реакции (ПЦР) для обнаружения пестивирусов в целом и для специфичного определения вируса КЧС не обеспечивают возможности дискриминации между вирулентными изолятами и вакцинными штаммами КС и JIK-ВНИИВВиМ, применяемыми на территории России.

В соответствии с эпизоотологической важностью и затруднениями в диагностике КЧС возникла потребность в разработке новейших методов быстрой детекции, идентификации и классификации вирусов.

Филогенетический анализ позволяет оценить степень эволюционного родства между различными штаммами вируса КЧС, выяснять происхождение вспышек и изучать эволюцию вирусов.

Большая коллекция изолятов вируса КЧС со всего мира собрана в Ганновере в Референтной Европейской Лаборатории по КЧС. Используя материалы данной коллекции, мы получили возможность дать наиболее полную филогенетическую характеристику изолятам с территории России и I определить эволюционную дистанцию между ними и известными референтными штаммами, а также оценить возможность того, что российские полевые изоляты могли служить причиной обширных эпизоотий

КЧС 1997 на территории стран Евросоюза.

Репродуктивный и респираторный синдром свиней (РРСС) - вирусная болезнь, характеризующаяся наличием двух клинических форм: репродуктивных нарушений, у взрослых свиней и пневмонии с высоким уровнем смертности у молодых поросят. Репродуктивные проблемы у свиноматок проявляются в наличии поздних абортов, преждевременных опоросов, рождении слабых^ недоразвитых и мертворожденных поросят.

Респираторные симптомы представлены выраженными дыхательными затруднениями, лихорадкой и интерстициальной пневмонией у новорожденных поросят.

Возбудитель болезни - вирус, который в настоящее время отнесен к роду Arterivirus семейства Arteriviridae в порядке Nidovirales. Впервые этиологическую роль его • в возникновении РРСС доказали в 1991 голландские ученые из Центрального ветеринарного института г. Лелистада.

РРСС был впервые обнаружен в 1986-1987 годах в племенных хозяйствах I

США и Канады, а в 90-е годы его появление зафиксировали во многих странах Европы, Южной Америки и Азии и в России. Быстрое распространение РРСС нанесло (и продолжает наносить) огромные убытки свиноводству разных стран, и экономический ущерб от него занял одно из первых мест по сравнению с другими болезнями.

В настоящее время выделяют д^а генетических типа вируса РРСС: американский и европейский, отличающихся нуклеотидной и аминокислотной последовательностями. Из-за высокой генетической изменчивости полного антигенного перекреста в серологических реакциях между ними не существует.

Диагностика болезни основывается на эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных и результатах лабораторных исследований по изоляции и идентификации возбудителя, а также по выявлению специфических антител в сыворотке крови. Идентификация возбудителя РРСС осуществляется (при помощи культивирования в первичной культуре альвеолярных макрофагов поросенка с последующим иммунохимическим окрашиванием зараженных клеток мечеными моноклональными антителами, что занимает много времени и является трудоемким методом. По литературным данным ПЦР является надежным и высокоспецифичным методом прямого обнаружения генома возбудителя РРСС и выявления случаев носительства. В России до сих пор отсутствовали средства для диагностики и эпизоотического мониторинга РРСС, а данные о характеристиках вирусных изолятов недостаточны, хотя и свидетельствуют о циркуляции вируса РРСС ; преимущественно европейского типа. Для понимания современной ситуации необходимо при помощи молекулярных методов провести исследование распространенности вируса РРСС и создать систему типирования изолятов с использованием молекулярных методов, полученных из различных краев и областей РФ и Белоруссии.

Таким образом, очевидна актуальность разработки комплекса мер для выявления вируса РРСС, циркулирующего на территории России, определения его принадлежности к тому или иному генетическому типу, выяснения путей его попадания в хозяйства и предотвращения его дальнейшего распространения. I

Данная работа объединяет разработку современных методов для быстрого обнаружения, идентификации и классификации возбудителей двух наиболее экономически и эпизоотологинески значимых заболеваний свиней: вируса классической чумы и вируса репродуктивного и респираторного синдрома.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ.

Разработка средств для проведения эпизоотологического мониторинга и молекулярного типирования изолятов вируса классической чумы свиней и вируса репродуктивного и респираторного синдрома свиней, циркулирующих на территории России и СНГ. • I

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:

1. разработать способ дифференциации вакцинных штаммов КС и JIK-ВНИИВВиМ и полевых изолятов вируса КЧС при помощи ПЦР-ПДРФ анализа и применить его на практике

2. провести филогенетический анализ изолятов вируса КЧС, циркулирующих на территории РФ

3. разработать метод выявления генома вируса РРСС при помощи ПЦР

4. изучить распространение вируса!РРСС на территории РФ методом

ПЦР

5. провести филогенетический анализ изолятов вируса РРСС, циркулирующих на территории России и Белоруссии I 0

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Молекулярная биология", Власова, Анастасия Николаевна

V. выводы I

1. В результате филогенетического анализа 3 участков генома 34 изолятов вируса КЧС из 18 областей РФ установлена их принадлежность к подгруппе 1.1 Штаммов, эволюционно близких к вакцинным штаммам КС и i

JIK-ВНИИВВиМ, не обнаружено. Среди проанализированных полевых изолятов вируса КЧС не обнаружено изолятов, относящихся ко второй группе, которые циркулируют на территории Западной Европы.

I •* *

2. На основании выявленных рестриктных сайтов в геноме вируса КЧС, отличающих вакцинный штамм КС от полевых изолятов, разработан тест для идентификации вакцинного Штамма КС на основе ОТ-ПЦР и рестриктного анализа.

3. В результате проведенного анализа гомологии различных участков генома американского и европейского типов вируса РРСС были выявлены специфичные для каждого типа нуклеотидные последовательности, что позволило разработать дифференцирующий тест на основе ПЦР.

4. Разработана тест-система для детекции генома американского и европейского типов вируса РРСС методом ОТ-ПЦР. Тест-система утверждена и выпускается на основании'ТУ 9384-020-42418073-00

5. Использование метода ОТ-ПЦР для анализа более 1000 биологических образцов из 60 хозяйств России и Белоруссии показало наличие изолятов только европейского типа, изолятов с американским генотипом обнаружено не было.

6. На основании филогенетического анализа 12 полевых изолятов вируса РРСС из 12 областей РФ и Белоруссии было показано, что все они относятся к европейскому типу, образуя тесный кластер с изолятами из Испании.

Практическая значимость.

Проведенный филогенетический анализ полевых изолятов вируса КЧС доказал генетическую стабильность и безопасность вакцин (против КЧС) КС и JIK-ВНИИВВиМ, применяемых на территории РФ.

Разработанный нами метод по дифференциации вакцинных штаммов КС и JIK-ВНИИВВиМ и вирулентных штаммов вируса КЧС в настоящее время применяется на практике. • I

Разработанный нами метод по идентификации европейского типа вируса РРСС методом полимеразной цепной реакции в настоящее время применяется на практике.! На его основе создана и утверждена диагностическая тест-система НПО НАРВАК.

Проведенный филогенетический анализ полевых изолятов вируса РРСС позволяет дать практическую рекомендацию для разработки диагностической системы ИФА на основе рекомбинантных антигенов европейского типа.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Власова, Анастасия Николаевна, Москва

1. Albina, Е., F. Madee, R. Cariolet, J. Torrison. 1994. Immune response and persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected pigs and farm units. Vet. Rec. 134:567-573.

2. Andreyev, V.G., A.G. Scherbakov, V.A. Pylnov, A.A. Gusev. 1999. Genetic heterogeneity of PRRSV in Russia. Proceeding of the International Symposium on PRRS and Aujeszky's Disease, Ploufragan, France, June 2124:211-212.

3. Barlic-Maganja, D., J. Grom. 2001. Highly sensitive one-tube RT-PCR and microplate hybridisation assay for the detection and for the discrimination of classical swine fever virus from othe'r pestiviruses. J. Virol. Methods., 95(1-2):101-10.

4. Bautista E.M., S.M. Goyal and J.E. Collins. 1993. Serologic survey for Lelystad and VR-2332 strains of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in US swine herds. Journal of veterinary Diagnostic Investigation, 5:163-5.

5. Becher, P., M. Orlich, A. Shannon, G. Horner, M. Konig, H.-J. Thiel. 1997. Phylogenetic analysis of pestiviruse: from domestic and wild ruminants. J. Gen. Virol., 78:1357-1366.

6. Becher, P., M. Orlich, A. Kpsmid^u, M. Konig, M. Baroth, H.-J. Thiel. 1999. Genetic diversity of pestiviruses: identification of novel groups and implication for classification. Virology, 262:64-71.

7. Belak, S. and P. Thoren. 2001. Molecular diagnosis of animal diseases: some experience of the past decade. Expert Rev. Mol. Diagn. l(4):89-98.

8. Bezborodova, S.V., V.G. Andreyev, V.V. Drygin, A.A. Gusev. 1999. Genetic features of CSFV in Russsia. Eleventh International Congress of Virology, Sydney, Australia, pp.329.'

9. Bilodeau, R., D. Archambault, S.A. Vezina, R. Sauvageau, M. Fournier, S. Dea. 1994. Persistence of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in a swine operation. Can. J. Vet. Res., 58(4):291-298.

10. Bjorklund, H., P. Lowings, T. Stadejek, S. Vilcek, I. Greiser-Wilke, D. Paton, S. Belak. 1999. ' Phylogenetic comparison and molecular epidemiology of classical swine fever virus. Virus Genes, 19:189-195.

11. Blaha, T. 2000. The "colorful" epidemiology of PRRS. Vet. Res., 31:77-83.

12. Bother, A., J. Nielsen, V. Bille-Hansen. 1994. Isolation of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a Danish swine herd and experimental infection of pregnant gilts with the virus. Vet. Microbiol., 40:351-360.

13. Carbrey, E.A. 1988. Diagnostic procedures// Classical swine fever and related viral infections. Boston, pp. 99-114.

14. Carman, S., S.E. Sanford, S. Dea. 1995. Assestment of seropositivety to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in swine herds in Ontario, 1978-1982. Can. Vet. J. 36:776-777.

15. Cavanagh, D. 1997. Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae. Arch. Virol., 142:629-633.

16. Chang, C.-C., K.-J. Yoon, J. J. Zimmerman, К. M. Harmon, P. M. Dixon, C. M. T. Dvorak, M. P. Murtaugh. 2002. Evolution of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus during Sequential Passages in Pigs. J. Virol., 76 (10): 4750-4763.

17. Choi, C., C.Chae. 2003. Detection of classical swine fever virus in boar semen by reverse transcription-polymerase chain reaction. J. Vet. Diagn. Invest., 15(1):35-41.

18. Collett M. S., R. Larson, C. Gold, D. Strick, D. Anderson, A.F. Purchio. 1988. Molecular cloning and nucleotide sequence of the pestivirus bovine viral diarrhea virus. Virology, 165:191-199.

19. Dewey, C., G. Charbonneau, S. Karman, L. Hamel, G. Nayar, R. Friendship, K. Eernisse, S. Svenson. 2000. Lelystad-like strain of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) identified in Canadian swine. Can. Vet. J. 41:493-494.

20. Done, S.H., DJ. Paton and M.E.C. <White. 1996. Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS): a review, with emphasis on pathological, virological and diagnostic aspects. British Veterinary Journal, 152: 153-174.

21. Drew, T.W., J.P. Lowings, F. Yapp. 1997. Variation in open reading frames 3, 4 and 7 among porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolates in the UK. Veterinary Microbiology, 55:209-221.

22. Edwards, S., J.J. Sands. 1990. Antigenic comparison of hog cholera virus isolates from Europe, America and Asia using monoclonal antibodies. Dtsch. Tierartzl. Wochenschr., 97:79-81.

23. Egli, С., B. Thiir, L. Liu; M.A. Hofhiann. 2001. Quantitative TaqMan RT-PCR for the detection and differentiation of European and North American strains of reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of virological methods, 98:63-75.

24. Ehrensperger, F. 1988. Immunological aspects of the infection// Classical swine fever and related viral infection. Boston, pp. 143-163.

25. Faaberg, K.S., P.G. Plagemann. 1997. ORF3 of lactate dehydrogenase-elevating virus encodes a soluble, nonstructural, highly glycosilated, and antigenic protein. Virology, 227:245-251.

26. Felsenstein, J., 1989. Phylip:'phylo£eny inference package (version 3.5c). Cladistics, 5:164-166.

27. Fritzemeier, J., J. Teuffert, I. Greiser-Wilke, C. Staubach, H. Schluter, V. Moennig. 2000. Epidemiology of classical swine fever in Germany in the nineties. Vet. Microbiol., 77:29-41.

28. Galina, L., C. Piljoan, M. Sitjar, W.T. Christianson, K. Rossow, J.E. Collins. 1994. Interaction between Streptococcus suis serotype-2 and reproductive and respiratory syndrome in specific pathogen-free piglets. Veterinary records, 134:60-64.

29. Gordon, S.C. 1992. Effects 6f blue^eared pigs disease on a breeding and fattening unit. Vet. Rec., 130:513-514.

30. Goldberg, T.L., E.C. Halm,' R.M.' Weigel, G. Scherba. 2000. Genetic, geographical and temporal variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in Illinois. J. Gen. Vipl., 81:171-179.

31. Greiser-Wilke, I., K. Depner, J. Fritzemeier, L. Haas, V. Moennig. 1998. Application of a computer programm for genetic typing of classical swine fever virus isolates from Germany. J. Virol. Meth., 75:141-150.

32. Greiser-Wilke, I., B. Zimmerman, J. Fritzemeier, G. Floegel, V. Moeenig. 2000. Structure and presentation of a World Wide Web database of CSF virus isolates held at the EU Reference Laboratory. Vet. Microbiol., 73:131136.

33. Hofmann, M.A., K. Brechtbuchl, N. Stauber. 1994. Rapid characterization of new Pestivirus strain by direct sequencing of PCR-amplified cDNA from 5' noncoding region. Arch. Virol., 139:217-229.

34. Hopper, S.A., M E.C. White, N. Twiddy. 1992. An outbreak of blue-eared pig disease (Porcine reproductive and respiratory syndrome) in four pig herds in Great Britain. Vet. Rec., 131:140-144.

35. Horter, D.C., R.M. Pogranichniy, C.C. Chang, R.B. Evans, K.-J. Yoon, J.J. Zimmerman. Characterization of the carrier state in porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection. Vet. Microbiol., 86:213-228.

36. Kim, H.S., J. Kwang, I.J. Yoon, H.S.' Joo, M.L. Frey. 1993. Enhanced replication of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in a homogeneous subpopulation of MA-104 cell line. Arch. Virol., 133:477-483. ' '

37. Kono, Y., T. Kanno, M. Shimizu, S. Yamada, S. Ohashi, M. Nakamine, J. Shirai. 1996. Nested PCR for detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in pigs. J. Vet. Met. Sci., 58(10):941-946.

38. Kurinnov, V.V. 1999. Epidemiological, clinical, and diagnostic studies of classical swine fever. Doklady Rosselkhozakademii (Proc. Rus. Acad. Agricult. Sci.), 1:42-45.

39. Leforban, J., S. Edwards, G. Ibata, P. Vannier. 1990a. A blocking ELISA to differentiate hog cholera virus antibodies in pig sera from those due to other pestiviruses. Ann. Rech. Vet., 21:119-129.

40. Leforban, J. 1990b. Profits epitopiques compares de 18 souches de peste porcine classique: Comparison des souches isolees de formes chroniques et des autres souches. Rec. Med. Vet., 166(5):455-461.

41. Le Gall, A., E. Albina, R. Magar, J.P. Gauthier. 1997. Antigenic variability of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus isolates. Influence of virus passage in pig. Vet Res., 28(3):247-57.

42. Le Gall A., O. Legeay, H. Bourhy, C. Arnauld, E. Albina, A. Jestin. 1998. Molecular variation in the nucleoprotein gene (ORF7) of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV). Virus Res., 54(1):9-21.

43. Liess, B. 1984. Persistent infection^ of hog cholera. A review. Prev. Vet. Met., 2(1/4): 109-113.

44. Liess, B. 1989. Serology// Classical swine fever and related viral infections. Boston, 115-142.

45. Liess, B. 1988. Classical swine fever and related viral infections. Boston, 115-142, p. 298.

46. Lowings, J.P., D.J. Paton, J.J. Sands, G.M. De Mia, D. Rutili. 1994. Classical swine fever: genetic detection and analysis of differences between virus isolates. J. Gen. Virol., 75:3461-3468.

47. Lowings, P., G. Ibata, J. Needham,ID. Paton. 1996. Classical swine fever virus diversity and evolution. J. Gen. Virol., 77:1311-1321.

48. Medina, M.R. 1991. Peste suina classica. II. Estudo sobre um vims amostra chinesa, adaptado ao cultivo cellular (amostra Porto Alegre). Arg. Bras. Med. Vet. Zootechn., 43(4):301-314.

49. Meng, X.J., P.S. Paul, P.G. Halbur, I. Morozov. 1995. Sequence comparison of open reading frames '2 to 5 of 'low and high virulence United States isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen Virol., 76 (Pt 12):3181-8.

50. Meng, X.J. 2000. Heterogeneity of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: implication for current vaccine efficacy and future vaccine development. Veterinary microbiology, 74:309-329.

51. Mengeling, W. L., A.C Vorwald, K.M. Lager, S.L. Brockmeier. 1996. Comparison among strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus for their ability to cause reproductive failure. Am. J. Vet. Res. 57:834839. ; ' 1

52. Mengeling, W.L., K.M.: Lager, A.C. Vorwald and D.F. Clouser. 2003. Comparative safety and efficacy of attenuated single-strain and multi-strain vaccines for porcine reproductive and respiratory syndrome. Veterinary Microbiology, 93:25-38. ■

53. Meulenberg J.J., E.J. de Meijer, R.J. Moormann. 1993b. Subgenomic RNAs of Lelystad virus contain a conserved leader-body junction sequence. J. gen. Virol., 74:1697-1701. .

54. Moenning, V. 1988. Characteristics of the virus. In: Liess B. (Ed.) Classical swine fever and related • infections. Martinus Nijhoff Publishing, Djston Dordrecht Lancaster, h. 55-80. '

55. Moening, V., G. Schageman, J. Dahle, I. Greiser-Wilke, L. Leder. 1990. A new approach for the diagnosis of hog cholera. Dtsch. Tieratztl.,Wsch., 97:91-93i

56. Moennig, V., G. Floegel-KIiesmann, I. Greiser-Wilke. 2003. Clinical signsi ' Iand epidemiology of classical swine fever: a review of new knowledge. Vet J., 165(1): 11-20. :

57. Morozov, I., P.S. Paul, X.J. Meng. 1996. Characterization of leader-bodythjunction sites in subgenomic mRNAs of a U.S. PRRSV isolate. 15 Annual Meeting of the AM. Soc. For. Virol. London, Ontario, Canada, pp.150.

58. Nelsen, C.J., M.P. Murtaugh and K.S. Faaberg. 1999. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus Comparison: Divergent Evolution on Two Continents. Journal of Virology, 73,1: 270-280.

59. Nielsen, H.S., M.B. Oleksiewicz, R. Forsberg, T. Stadejek, A. Bother, T.• • I

60. Storgaard. 2001. Reversion of a live porcine reproductive and respiratory syndrome virus vaccine investigated by parallel mutations. J. Jen. Virol., 82:1263-1272.

61. Oblinger, V., F. Weiland, E. Weiland, T. Mettenleiter, B. Haas, N. Visser, Ahl, R. 1992. Some aspects of the virus causing PRRS in Germany. Am. Assoc. Swine Pract. Newsl. 4:16.

62. Oleksiewicz, M.B., A. Bother, K.G. Madsen, T. Storgaard. 1998. Sensetive detection and typing of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by RT-PCR amplification of whole viral genes. Vet. Microbiol., 64:7-22.

63. Paton, D.J. 1995. Pestivirus diversity. J. Сотр. Path., 112:215-236.

64. Paton, D.J., U. Carlsson, J.P. Lowings, J.J. Sands, S. Vilcek, S. Alenius. 1995a. Identification of herd-specific bovine viral diarrhoea virus isolates from infected cattle and sheep. Veterinary microbiology, 43:283-294.

65. Paton, D.J., J.J. Sands, J.P. .Lowings, J.E. Smith, G. Ibata, S. Edwards. 1995b. A proposed division of the pestivirus genus using monoclonal antibodies, supported by cross-neutralization assay and genetic sequencing. Veterinary research, 26:92-109.

66. Paton, D. 2000. The reappearance of classical swine fever in England in 2000. In: Morilla, A., P.Hernandez, J.K. Yoon, J. Zimmerman (eds), Trends in Emerging Viral Infections of Swine, pp. 153-158. Iowa State Press, Ames Iowa. ISBN 0-8138-0383-7. '

67. Paton, D.J., A. McGoldrick, I. Greiser-Wilke, S. Parchariyanon, J.-Y. Song, P.P. Liou, T. Stadejek, J.P. Lpwings, H. Bjorklund, S. Belak. 2000. Genetic typing of classical swine fever virus. Vet. Microbiol., 73:137-157.

68. Paton, D.J., I. Greiser-Wilke. 2003. Classical swine fever an update. Res VetSci., 75(3): 169-178.

69. Pirzadeh В., S. Dea. 1998. Immune response in pigs vaccinated with plasmid DNA encoding ORF5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of general virology, 79:989-999.

70. Porcine reproductive and respiratory syndrome. 1996. Iin OIE manual, chapter X. 12:694-700. ;

71. Plagemann, P.G.W. 2003. Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus: Origin Hypothesis. Emerging infectious disease, 9(8):903-908.

72. Risatti, G.R., J.D. Callahan, W.M. Nelson, M.V. Borca. 2003. Rapid detection of classical swine fever virus by a portable real-time reverse transcriptase PCR assay. Journal of clinical microbiology, 41(l):500-505.

73. Rossow, K.D., J.E. Collins, S.M. Goyal, E.A. Nelson, J. Christopher-Hennings, D.A. Benfield. 1995. Pathogenesis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in gnotobiotic pigs. Vet. Pathol., 32(4):361-373.

74. Rumenapf, Т., G. Meyers, R. Stark, H. Thiel. 1991. Molecular characterization of hog cholera virus. Arch. Virol., suppl. N 3, p. 7-18.

75. Shin-Tung, L., et al. 1991.Rapid detection of hog cholera virus in tissues by tht polymerase chain reaction. J. Virol. Meth., 35(2):227-236.

76. Snijder, E.J., J.J.M. Meulenberg. 1998. The molecular biology of arteriviruses. Journal of general virology, 79:961-979.

77. Snijder, E. J., H. van Tol,, K.W. Pedersen,, M.J.B. Raamsman, and A.A.F. de Vries. 1999. Identification of a novel structural protein of Arteriviruses. J. Virol. 73:6335-6345. • I

78. Stadejek, Т., S. Vilcek, J.P. Lowings, A. Ballagi-Pordany, D.J. Paton, S. Belak. 1997. Genetic heterogeneity of classical swine fever in Central Europe. Virus Res., 52:195-204.

79. Stadejek, Т., J. Warg, J.F. Ridpath.l 1996. Comparative analysis of the 5' noncoding region of classical swine fever virus strains frpm Europe, Asia, and America. Arch. Virol., 141:771-777.

80. Stark, R., T. Rumenapf, G. Meyers, H.-J. Thiel. 1990. Cenomic localization of hog cholera virus glycoproteins. Virology, 174:286-289.

81. Stevenson, G.W., W.G. Van Alstine, C.L. Kanitz, K.K. Keffaber. 1993. Endemic porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of nursery pigs in two swine herds without current reproductive failure. J. Vet. Diagn. Invest., 5:432-434.

82. Suarez, P., R. Zardoya, C. Prieto, A. Solana, E. Tabares, J.M. Bautista, J.M. Castro. 1994. Direct detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus by reverse-polymerase chain reaction (RT-PCR). Arch. Virol., 135:89-99.

83. Terpstra, C. 1988. Epizootology of hog cholera// Classical swine fever and related viral infections. Boston, 3(3):201-216.

84. Terpstra, C., G. Wensvoort. 1988. The protective value of vaccine-induced neutralizing antibody titers in swine fever. Vet. Microbiol. 16:123-128

85. Terpstra, C. 1991. Hog cholera: an update of present knowledge. Br. Vet. J., 147:397-406

86. Terpsta, C., G. Wensvoort, J.M.A. Pol. 1991a. Experimental reproduction of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (mystery swine disease) by infection with Lelystad virus: Koch's postulates fulfilled. Vet. Q., 13:131-136.' I

87. Terpsta, C. 1997. Swine plague: symptoms, epizootiology and diagnosis. Tijdschr Diergeneeskd., 122(7): 198-200.

88. Terpstra, C., and A.J. de Smit. 2000. The 1997/1998 epizootic of swine fever in the Netherlands. Vet. Microbiol., 73:183-196.

89. Thiel, H.J., R. Stark, E. Weiland, T. Rumenapf, G. Meyer. 1991. Hog Cholera Virus: Molecular Composition of virions from a pestivirus. J. of Virology, 65(9):4705-4712.

90. Umthun, A.N. and W.L. Mengeling. 1999. Restriction fragment length polymorphism analysis of strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus by use of a nested-set reverse transcriptase-polymerase chain reaction. AJVR, 60, 7: 802-806.

91. Van Alstine. 1992. Isolation of SIRS virus from nursery pigs of two herds without current reproductive failure. Proc. Annu. Meet. Livest. Confer. Inst. 1:253-259.

92. Vannier, P., M. Colcanop, R. Carnero et al. 1986. Study of the origin of an epizootic of classical swine fever. J. Vet. Med., 33(4): 294-302.

93. Van Oirshot, J.T. 1989. Description of the virus infection. In Liess, B. (Ed.), Classical swine fever and. related viral infections, Martinus Nijhoff, Boston, pp. 1-25. • '

94. Van Oirschot, J.T., C. Terpstra. 1989. Hog cholera virus // Virus infections of porcines. Amsterdam.pp.l 13-130.

95. Vilcek, S., A. Stadejek,,.A. Ballagi-Pordany, J.P. Lowings, D. Paton, S. Belak. 1996. Genetic variability of'classical swine fever virus. Vir. Res., 43:137-143.

96. Vilcek, S., S. Belak. 1998. Classical swine fever virus: discrimination between vaccine strains and European field viruses by restriction endonuclease cleavage of PCR amplicons. Acta Vet. Scand., 39(3):395-400.

97. Vlasova, A., T. Grebennikova, A. Zaberezhny, I. Greiser-Wilke, G. Floegel-Niesmann, V. Kurinnov, T. Aliper, E. Nepoklonov. 2003. Molecularepidemiology of classical swine fever in the Russian Federation. J. Vet.I1. Med., 50:363-367.

98. Weiland, E., R. Stark, B. Hass, T. Rumenapf, G. Meyers, H.J. Thiel. 1990.

99. Pestivirus glycoprotein which induces neutralizing antibodies forms part of aidisulfide-linked heterodimer. J. Virol., 64(8):3563-3569.

100. Wensvoort, G., C. Terpstra, J.M. Pol, E.A. Ter Laak, M. Bloemrand, E.P. de Kluyver, C. Kragten, I. van Buiten, A. den Besten, F. Wagenuar. 1991. Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of Lelystad virus. Vet. Q., 13:121-130.

101. Wensvoort, G., C. Terpstra, E.P. de Kluijver, C. Kragten, J.C. Warnaar. 1989. Antigenic differentiation of Pestivirus strains with monoclonal antibodies against hig cholera virus. Vet. Microbiol., 21:9-20.

102. Wills, R. W., J. J. Zimmerman, K.J. Yoon, S.L. Svenson, M.J. McGinley, HI

103. T. Hill, K.B. Piatt, J. Christopher-Hennings, E.A. Nelson. 1997. Porcine reproductive and respiratory syndrome virus: a persistent infection. Vet. Microbiol. 55:231-240.

104. Yoon, I.J., H.S. Joo, W.T. Christianson, H.S. Kim, J.E. Collins, R.B.I

105. Morrison, G.D. Dial. 1992. An indirect fluorescent antibody test for thedetection of antibody to swine infertility and respiratory syndrome virus in swine sera. J. Vet. Diagn. Invest., 4:144-147.

106. Yoon, K.J., L.L. Wu, J.J. Zimmerman, H.T. Hill, K.B. Piatt. 1996. Antibody-dependent enhancement !(ADE) of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection in pigs. Viral. Immunol. 9:51-63.

107. Zimmerman, J., S.L. Swenson, R.W. Wills, E.C. Pirtli, K.J. Yoon, H.T. Hill, M.J. McGinley. 1993. Transmission! of PRRS virus. In Proceedings of the Allen D Leman swine conference, university of Minnesota, MN, USA, 5152.

108. Байбиков, Г.З., А.А. Гусев, H.A. Яременко, H.C. Дудникова, В.JI. Гаврилова, С.А. Кукушкин, И.Я. Курман, В.Ф. Ковалишин, A.M. Рахманов.2001. Репродуктивно-респираторный синдром свиней. В етеринария, 3:18-24.

109. Вишняков, И.Ф., В.В. Куриннов, А.Т. Яшин и др. 1984. Иммунофлуоресцентное выявление разных штаммов вируса чумы свиней. Ветеринария, 3:34-36.

110. Вишняков, И.Ф., В.В. Куриннов, ,А.Т. Яшин. 1985. Некоторые особенности КЧС, затрудняющие ее диагностику: Обзор литературы РФ. Ветеринария, 9:29-3.1.

111. Вишняков, И.Ф., Н.И. Митин, Г.М. Карпов и др. 1991. Диагностика и дифференциальная диагностика африканской и классической чумы свиней. Ветеринария, 4:28-31.

112. Жестерев, В.И., А.Н. Курносов, В.А. Мищанин. 1992. Возможность экспресс-защиты свиней от заболевания классической чумы свиней. Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. научн. конф. ВНИИВВиМ, Покров, 4.1, с. 104.

113. Куриннов, В.В., И.Ф. Вишняков, И.Ю. Хухоров. Современные эпизоотологические, патогенетические и диагностические особенности классической чумы свиней. Вопр. вет. вирусол., микробиол., эпизоотол.: Мат. научн. конф. ВНИИВВиМ, Покров, ч.1, сс. 75-86.

114. Малярец, П.В., Е.В. Гусева, Т.А. Ануфриева. 1995. Классическая чума свиней (Обзор литературы). ВНИИЗЖ, Владимир.

115. Орлянкин Б.Г., Е.А. Непоклонов, Т.Н. Алипер, А.Д. Забережный, М.И. Мусиенко. 2000. Диагностика и специфическая профилактика РРСС. Ветеринария, 10: 16-19.

116. Семенихин, В.И., А.Т. Дузырев, С.Ф. Орешкова, А.С. Донченко, В.М. Чекишев, А.А. Ильичев. 1999. Выявление вируса классической чумы свиней с помощью полимеразной цепной реакции. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 1:27-30.

117. Сюрин, В.Н., Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. 1991. Диагностика вирусных болезней животных: Справочник. Издательство Москва: 916.