Фибриллогенез бета-2-микроглобулина и иммунологические изменения при гемодиализном амилоидозе

Поляков, Дмитрий Степанович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фибриллогенез бета-2-микроглобулина и иммунологические изменения при гемодиализном амилоидозе
ВАК РФ 03.01.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Фибриллогенез бета-2-микроглобулина и иммунологические изменения при гемодиализном амилоидозе"

ПОЛЯКОВ Дмитрий Степанович

ФИБРИЛЛОГЕНЕЗ БЕТА2-МИКРОГЛОБУЛИНА И ИММУНОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПРИ ГЕМОДИАЛИЗНОМ АМИЛОИДОЗЕ

03.01.04 - Биохимия

14.03.09 - Клиническая иммунология, аллергология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Санкт-Петербург 2011 г.

1 2 МАЙ 2011

4846252

Работа выполнена в Отделе молекулярной генетики учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт экспериментальной медицины Северо-Западного отделения Российской академии медицинских наук и в Научно-методическом центре по молекулярной медицине Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования "Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П. Павлова" Росздрава.

Научные руководители:

Д.м.н., проф. Михаил Михайлович Шавловский

Д.м.н., проф. Арег Артемович Тотолян

Официальные оппоненты:

Академик РАМН, д.м.н., проф. Олег Иванович Киселев

Д.м.н., проф. Андрей Семенович Симбирцев

Ведущее научное учреждение:

Санкт-Петербургский государственный университет.

Защита состоится 26 мая 2011 года в 11 часов на заседании Диссертационного совета Д 001.022.03 по защите докторских и кандидатских диссертаций при НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: Санкг-Перербург, 197376, Каменноостровский проспект, дом 69/71.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН по адресу: Санкт-Перербург, 197376, ул. Академика Павлова, 12.

Автореферат разослан «11 » 04 _2011 года.

Ученый секретарь Диссертационного совета

Доктор биологических наук, проф. Л.В. Пучкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования

Во второй половине 20 века в связи с разработкой новых технологий появилась возможность продления жизни больным, страдающим тяжелыми заболеваниями почек. Введение в практику процедур очистки крови при помощи диализа позволяет больным, которые прежде неизбежно погибали, относительно комфортно жить в течение десятилетий. Однако вскоре после введения в практику гемодиализного лечения было обнаружено, что у части больных развивается особая форма амилоидоза, так называемый гемодиализный амилоидоз, или р2-микроглобулиновый амилоидоз (Ар2М). Он носит вторичный характер и его условием служит повышение концентрации в плазме крови особого белка - р2-микроглобулина (р2М). Нарушение почечного катаболизма р2М является причиной многократного возрастания содержания белка в плазме крови. Клинически АР2М сопровождается снижением качества жизни больных, и для купирования симптомов амилоидоза приходится прибегать даже к хирургическому лечению. Диагностика АД2М затруднена, терапия мало эффективна. До сих пор остаются недостаточно исследованными молекулярные основы патогенеза Ар2М.

Гемодиализ - пример инвазивной терапии. Так как эта процедура проводится у больных с почечной недостаточностью, то необходимо четко представлять вклад основного заболевания и проводимых лечебных мероприятий в развитие ответных реакций в первую очередь со стороны иммунной системы.

Несмотря на многочисленные исследования, до сих пор не решены многие фундаментальные проблемы развития амилоидозов вообще и АР2М в частности. В основе патогенеза амилоидозов лежит аномальный фибриллогенез конкретного белка, который обусловлен действием совокупности внешних и внутренних факторов. Выяснение роли этих факторов и их относительного вклада позволит не только понять причины патологии, но и будет способствовать разработке эффективных способов лечения этих достаточно тяжелых заболеваний. Цель исследования

Целью настоящего исследования являлось выяснение особенностей фибриллогенеза Р2М и молекулярных основ гемодиализного амилоидоза, а также роли иммунных факторов в патогенезе этого заболевания Задачи исследования

1. Получить в очищенном состоянии природный р2М человека и политональные антитела к этому белку.

2. Создать генетическую конструкцию для синтеза нативного рекомбинантного Р2М человека в бактериальной системе.

3. Создать генетическую конструкцию для синтеза в бактериальной культуре рекомбинантного белка слияния, состоящего из р2М и зеленого флуоресцентного белка.

4. Создать генетические конструкции для синтеза укороченных рекомбинантных Р2М, накапливающихся в клетках в виде телец включения.

5. Получить в очищенном состоянии и изучить свойства, в том числе фибриллогенность, рекомбинантных бета-2микроглобулинов и белка слияния.

6. Изучить имунногенность фибрилл, образованных из Р2М человека.

7. Определить содержание цитокинов в плазме крови больных, получающих процедуры гемодиализа на протяжении различных сроков.

Научная новизна полученных результатов

Предложен новый способ препаративного выделения р2М из диализата плазмы крови больных, получаемого во время лечебной процедуры гемодиафильтрации.

Создана экспрессионная генетическая конструкция, содержащая ген полноразмерного Р2М человека. Введенная в структуру гена полинуклеотидная последовательность, которая кодирует лидерный пептид, направляющий синтезируемый белок в периплазму, позволяет получать нативный Р2М без образования телец включения. Таким образом, исключаются стадии денатурации и ренатурации, необходимые для извлечения белка из телец включения. Благодаря введенной последовательности из пяти гистидинов на С-конце, синтезируемый в Е.соН Р2М может быть эффективно и просто очищен на никель-хелатном-агарозном сорбенте. Впервые показано, что полученный таким образом белок способен образовывать амилоидные фибриллы, сходные с амилоидными фибриллами, полученными из природного Р2М.

Получены генетические конструкции, кодирующие укороченные с Оконца варианты Р2М. Показана фибриллогенность и склонность к образованию олигомеров укороченных на 6 и 10 аминокислотных остатков рекомбинантных Р2М. Рекомбинантный вариант без 10 аминокислотных остатков получен и охарактеризован впервые.

Впервые создана экспрессионная генетическая конструкция для синтеза в Е.соН белка слияния р2М человека с зеленым флуоресцентным белком. Показано, что получаемый белок слияния Р2М8Р, с одной стороны, обладает зеленой флуоресценцией, свойственной нативному ОБР, с другой стороны, р2МЭР способен образовывать фибриллы, не теряя при этом своих флуоресцентных свойств.

Впервые продемонстрировано, что фибриллы Р2М, сформированные как при рН 2,0, так и при рН 7,4, прикрепляются к нитроцеллюлозному фильтру и не деполимеризуются во время стандартной процедуры ОоиВЬОТ (то есть при слабощелочных рН). При помощи таких фильтров показано, что кролика неспецифически связываются с фибриллами р2М.

Показано, что при гемодиализе у пациентов по мере увеличения сроков терапии возрастает содержание 1Ь-2, ТЬ-4,1Ь-6,1Ь-8,1Ь-10, ОМ-СЭР, №N-7 и ТЖ-а в плазме крови. В то же время содержание 1Ь-10 на начальных этапах гемодиализа возрастает, и далее снижается, достигая нормальных значений.

Научно-практическое значение полученных результатов.

Результаты исследования имеют теоретическое значение, так как вносят вклад в понимание молекулярных и иммунологических механизмов патогенеза гемодиализного амилоидоза, а также других амилоидозов.

Для изучения фибриллогенеза и поиска веществ, ингибирующих данный процесс или способствующих ему, необходимо иметь десятки миллиграммов очищенного Р2М. Созданные нами экспрессионные генетические конструкции синтезируют рекомбинантные Р2М человека, как полноразмерный, так и его укороченные формы, встречающиеся у больных Ар2М. Благодаря введенным полигистидиновым последовательностям, созданные рекомбинантные р2М можно получить в необходимых количествах и относительно быстро и эффективно очищать. Для всех полученных белков показана способность к образованию амилоидных

фибрилл, что позволяет предложить эти белки в качестве удобных моделей для изучения фибриллогенеза 02М.

Обнаружение факта неспецифического связывания фибрилл р2М человека с кролика, на наш взгляд, имеет научно-практическую значимость, так как этот эффект следует учитывать при дальнейшем изучении гуморального иммунного ответа на фибриллы Р2М. Если существует такое же связывание 1§0 человека с амилоидными фиблиллами Р2М, то это может иметь важное значение в понимании патогенеза А02М, а также в подходах к малоинвазивной диагностике данного заболевания. Кроме того, данный факт следует иметь в виду и при разработке таких иммунологических методов диагностики Ар2М, в которых фибриллы Р2М будут использоваться в качестве антигена.

Созданный нами рекомбинантный белок слияния Р2М и зеленого флуоресцентного белка может быть использован для визуализации промежуточных стадий фибриллогенеза, а также для исследования внутриклеточной локализации как зрелых фибрилл, так и префибриллярных структур.

Результаты, полученные при изучении содержания цитокинов в плазме крови больных на хроническом гемодиализе, позволяют утверждать, что 1Ь-10 и 1Ь-6 могут служить маркерами клинического течения р2-микроглобулинового амилоидоза.

Представленные данные могут быть использованы для образовательных целей на кафедрах высших учебных заведений в курсах лекций по биохимии, молекулярной биологии и иммунологии.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложен эффективный способ препаративного выделения Р2М из гемодиафильтрационного диализата плазмы крови больных, который позволяет получать очищенный р2М человека в нативном состоянии.

2. Показано, что созданные экспрессионные генетические конструкции для синтеза в бактериальной культуре позволяют получать нативный полноразмерный рекомбинантный р2М человека, рекомбинантный белок слияния (состоящий из Р2М и зеленого флуоресцентного белка), а также укороченные варианты р2М (без шести и десяти И-концевых аминокислот).

3. Установлено, что все полученные рекомбинантные белки обладают способностью к фибриллогенезу. Для укороченных вариантов Р2М, кроме того, показана склонность к олигомеризации.

4. Показано, что белок слияния р2М8Б обладает зеленой флуоресценцией, свойственной нативному ОБР, но при этом способен образовывать фибриллы в условиях фибриллогенеза, описанных для Р2М.

4. Выявлено, что иммуноглобулины класса й кролика неспецифически связываются с фибриллами, сформированными из Р2М человека.

5. Показано, что с увеличением срока, в течение которого больные подвергались процедуре хронического диализа, уровни 1Ь-2, 1Ь-4,1Ь-6,1Ь-8, ОМ-СЭР, П-Т^-у и ЮТа в плазме крови увеличивались. При этом содержание 1Ь-10 понижалось после трех лет диализа до уровня, статистически не различающегося с нормой.

Апробация работы

XXI века» (Пущино, 19-23 апреля 2010 года), 7 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010», 15-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 18-22 апреля 2011 года).

Внедрение результатов работы Научные результаты и практические рекомендации могут быть внедрены в научный и учебный процессы отдела молекулярной генетики ГУ Научно-исследовательского института экспериментальной медицины РАМН (Россия, 197376, Санкт-Петербург, ул.Ак.Павлова, 12); кафедры медицинской биологии и генетики ГОУ ВПО «Санкт-Петербургский государственный медицинский Университет имени академика И.П.Павлова Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (Россия, 197089, Санкт-Петербург, ул. Льва Толстого, 6/8).

Личный вклад автора в проведение исследования Лично соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях; создание и проверка экспрессионных генетических конструкций, выделение и очистка белков, используемых в работе, получение фибрилл; приготовление препаратов для флуоресцентного анализа, MALDI-TOF и ДНК-секвенировния также были выполнены соискателем. Кроме того, соискатель подготавливал образцы плазмы крови больных на гемодиализе и принимал участие в определении в них содержания цитокинов (совместно со старшим научным сотрудником НМЦММ на базе СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова, к.м.н. К.А.Сысоевым), проводил статистическую обработку полученных результатов. Электронная микроскопия и исследование оптических свойств Р2М и его производных, в частности фибриллярных форм, проводились совместно с сотрудниками Лаборатории структурной динамики, стабильности и фолдинга белков НИИ цитологии РАН.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 09-0400788), программы "Ведущие научные школы РФ" (НШ-1961.2008.4) и Минобрнауки (ГК от 09.03.2010 №_02_740_11_ 5141).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех птав и списка литературы, в котором приведено 217 источника, в том числе 7 работ на русском языке и 210 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 23 рисунками.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ Получение (!2М из ультрафильтрата плазмы больных, находящихся на хроническом гемодиализе. Концентрацию диализата осуществляли при помощи ультрафильтрации, используя мембраны с порами, проницаемыми для соединений с молекулярной массой <5 кДа (Hollow fiber cartridge, "Amicon"). Далее концентрат подвергали ультрафильтрации на мембране, проницаемой для белков с молекулярной массой <30 кДа. При необходимости, дальнейшую концентрацию с одновременной заменой буфера осуществляли на центрифужном фильтре с порами, проницаемыми для белков с молекулярной массой <5 кДа (Lot.: 2173558, "Sigma"). Электрофоретическое разделение белков в полиакриламидном геле осуществляли в 12% полиакриламидном геле (ПААГ) (Laemmli et al. 1970) 9x9 см при градиенте напряжения 20 В/см.

Идентификация выделенного белка методом MALDI-TOF. Выделенный из диализата больного ß2M подвергали электрофорезу и исследовали методом MALDI-TOF. Идентификацию белков по «пептидному фингерпринту» осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com).

Получение поликлональных антител кролика к ß2M человека. Иммунизацию кроликов осуществляли фрагментом ПААГ, содержащим 100 мкг нативного ß2M, по стандартной схеме (Харбоу и др. 1977). Забор крови осуществляли на 10-ый день после последней иммунизации. Фракцию IgG получали методом высаливания сульфатом аммония (Брок и др. 1987). Аналогично проводили иммунизацию кроликов фибриллами ß2M, но вводили внутрикожно не фрагмент ПААГ, a PBS, содержащий 100 мкг фибрилл ß2M.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) проводилась в реакционной смеси конечным объемом 30 мкл. В состав реакционной смеси входили праймеры (по 10 пМоль), буфер для Taq-полимерэзы xl, 6 нМ dNTPs (dATP, dTTP, dGTP, dCTP), 50 нМ MgCl2, 1 единица Taq-полимеразы. ПЦР проводилась в пробирках объемом 0.6 мл на аппарате «Терцик» (Россия) с набором программ, определяющих температурный режим ПЦР. Температурный профиль ПЦР: 5 минут 95°С - 1 цикл; 1 минута 95°С, 1 минута 56°С, 1 минута 72°С - 30 циклов, 10 минут 72°С - 1 цикл. Электрофоретическое разделение продуктов амплификации в 8% ПААГ, электрофоретическое разделение ДНК в агарозном геле, окрашивание ПААГ бромистым этндием, окрашивание ПААГ нитратом серебра проводились по стандартным методикам.

Выделение ДНК из агарозного геля осуществляли с помощью набора WizardSV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, США) согласно инструкции производителя. Получение компетентных клеток Е. coli. Бактерии E.coli выращивали в LB среде в стерильном флаконе, содержащем LB-среду, при 37°С при постоянном покачивании до OD6oo=0.3-0.4. Клетки осаждали центрифугированием, и осадок ресуспендировали в 0,1 М СаС12, после чего инкубировали во льду в течение 20 минут. Полученные компетентные клетки Е. coli использовали сразу или оставили на 1-3 дня во льду для дальнейшей трансформации.

Лигирование. Вставка ПЦР-продуктов в плазмиды осуществлялась при помощи лигазной реакции. Для лигирования использовали лигазу фирмы «Fermentas» (Литва). Лигирование проводили в течение 1-16 часов при температуре +4°С. Количество ПЦР-продукта для лигирования определялось из формулы: ПЦР-продукт (нг) = a*b*c/d, где а - количество плазмиды (нг), b - размер ПЦР-продукта (п.н.), с -молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта, d — размер плазмиды (п.н.). Молярное соотношение плазмиды и ПЦР-продукта брали 1/20. На 1 реакцию брали 40 нг плазмиды.

Для трансформации компетентных клеток Е. coli штамма DH5(a) или BL21(DE3), к компетентным клеткам добавили лигазную смесь или плазмидную ДНК и инкубировали во льду 15 мин. Для осуществления теплового шока суспензию клеток инкубировали при 42°С 5 мин. и во льду 2 мин. Затем добавили среду LB и инкубировали 1 час при 37°С при постоянном покачивании, после чего высевали на чашки Петри, содержащие агаризованную LB-среду с ампицилином. Чашки инкубировали в течение ночи при 37°С. Трансформанты, устойчивые к ампициллину, отбирались для последующих исследований.

Выделение плазмидной ДНК из клеток E.coli. Культуру клеток E.coli культивировали ночь при 37°С в LB среде с ампициллином. Клетки осаждали

центрифугированием, к осадку добавляли 50 мМ глюкозу, 25 мМ TrisHCl рН 8.0, 10 мМ EDTA рН 8.0, затем ресуспендировали. Добавляли 0.2Н NaOH, 1% SDS, перемешивали в течение 5 минут. Добавляли 5М СН3СООК, 11.5% СН3СООН, несколько раз переворачивали пробирку. Затем инкубировали во льду 5 минут и центрифугировали. К супернатанту добавляли изопропиловый спирт, инкубировали при -20°С. После центрифугирования сливали спирт и растворяли осадок в воде. Добавляли РНКазу и нкубировали пробу на водяной бане при 37°С. Дальнейшее выделение ДНК представляло собой стандартную фенол-хлороформную экстракцию. Качество и примерную концентрацию выделенной плазмидной ДНК проверяли электрофоретическим разделением в 0.8% агарозном геле.

При создании экспрессионной генетической конструкции рЕТЬ2т6.8

использовались праймеры 5'ctgtggccatccagcgtactccaa3'. 5 'gtcaagcttatcagtgatggtga tggtgcatgtctcgatcccactt3'; эндонуклеазы рестрикции MscI, HindIII; плазмида pET22b(+) (Novagen). РНК человека из лейкоцитов здорового добровольца выделяли с помощью TRIzol® Reagent по прилагающимся инструкциям фирмы «Invitrogen» (США). Реакцию обратной транскрипции осуществляли с помощью MLV-обратной транскриптазы «АмплиСенс» (Россия) по прилагающимся протоколам. Реакцию рестрикции проводили по стандартной методике с использованием эндонуклеаз рестрикции и по прилагающимся инструкциям фирмы «Fermentas» (Литва). При создании экспрессионных генетических конструкций pETb2ml,l, рЕТЬ2ш2.1. в качестве матрицы для ПЦР использовалась плазмида рЕТЪ2ш6.8. В случае pETb2ml.l, прямой праймер 5' catatgattcaggtttactcacgt 3' во фланкирующей части (выделена жирным шрифтом) содержал сайт узнавания эндонуклеазы рестрикции Ndel (подчеркнут). Для вектора рЕТЪ2т2.1 прямой праймер имел следующее строение: 5' ctgcatatgtcacgtcatccagcaga 3'.

При создании экспрессионной генетической конструкции pTRCb2msf были подобраны праймеры 5'-cagggtaccatccagcgtactccaa-3', 5'-cagggatcccatgtctcgatcccac-3' и эндонуклеазы рестрикции Kpnl, BamHI.

Выделение и очистка рекомбинантных р2М осуществлялась из клеток E.coli штамма BL21(DE3), трансформированных соответствующими экспрессионными конструкциями. Клетки E.coli росли в среде LB, содержащей ампициллин, синтез Р2М индуцировали добавлением изопропил-р-0-1-тиогалактопиранозида (IPTG). Периплазматическую фракцию получали методом «осмотического шока» (Ausubel 1989). Для получения растворимой и нерастворимой внутриклеточной фракции бактериальные клетки отделяли от среды культивирования путем центрифугирования, к отмытому клеточному осадку добавляли PBS, 1 мМ PMSF, ЮмМ имидазол и 5 мМ Р2-меркаптоэтанол. Клетки разрушали ультразвуком, затем суспензию центрифугировали и супернатант отделяли от осадка. Супернатант содержал растворимую внутриклеточную фракцию белков, а осадок - нерастворимую, в том числе тельца включения.

Р2М были аффинно очищены на металл-хелатном никель-агарозном сорбенте (Invitrogen) (объем колонки 1.5 мл). Для этого к полученному содержимому бактерий добавляли фенилметилсульфонилфторид и имидазол (конечная концентрация 1 мМ и 10 мМ соответственно). (В случае выделения Р2М из телец включения, они растворялись в 8 М мочевине.) Раствор фильтровали через металл-хелатный сорбент. Балластные белки отмывали, а целевой белок элюировали раствором, содержащим 200 мМ имидазол. Содержащие Р2М фракции анализировали при помощи электрофоретического разделения в 12 % ПААГ. Концентрацию Р2М определяли

спектрофотометрически, используя для полноразмерного ß2M значение коэффициента экстинкции е280 = 1,63 мл*мг"1см~'.

Формирование фибрилл ß2M. Для получения фибрилл природный и рекомбинантные ß2M с конечной концентрацией 30 цМ инкубировали в 150 или 200 мМ шицин-HCl буфере (рН=2,0) в течение 7 или 14 суток при 37°С при постоянном перемешивании (500 грт) на термошейкере TS-100 (Biosan). Для получения фибрилл в физиологическом pH, был применен модифицированный метод Кихара и соавторов (Kihara et al., 2005). В качестве «затравки» фибриллогенеза добавляли 1/100 объёма готовых фибрилл той же концентрации, выращенных при рН=2,0 и стабилизированных 0,5 мМ SDS. Кроме того, фибриллы из ß2MA6 в физиологическом pH получали без стабилизации 0,5 мМ SDS.

Измерение флуоресценции комплексов тмофлавнна Т с фибриллами проводили по модифицированному методу (LeVine et al., 1993): 10 мкл раствора фибрилл добавляли к 310 мкл буфера, содержащего 0,15 M NaCl, 25 мМ Na-фосфат, 6 цM Тиофлавин Т (ThT), рН=7,4. Пробу тщательно перемешивали, затем инкубировали 5 минут при комнатной температуре и переносили в кювету. Регистрацию спектров флуоресценции проводили с помощью спектрофлуориметра AVANTES AvaSpec-2048 (Источник света AvaLight-LED, 460 нм). Для исключения сигнала, поступающего на регистрирующее устройство спектрофлуориметра вследствие рассеяния излучения, применяли фильтр, отсекающий часть спектра с длиной волны менее 460 нм. В качестве нулевой пробы использовали мономер ß2M в той же концентрации. Полусухой Western-BLOT белков проводили по стандартной методике (Anderson et al., 1982). «Перенос» осуществлялся 1 час при постоянном токе 100 тА. «Окраску» нитроцеллюлозного фильтра (НЦФ) или PVDF-мембраны осуществляли кроличьими поликлональными антителами к GFP, ß2M или фибриллам ß2M. Вторыми антителами являлись конъюгированные с пероксидазой хрена IgG козы против IgG кролика («ICN», США).

Dot-BLOT. На НЦФ наносили по 1 мкл антигена. «Окраску» НЦФ осуществляли как при Western-BLOT.

Исследование содержания цитокинов в плазме крови больных на хроническом гемодиализе. В исследование было включено 86 пациентов с терминальной стадией ХПН, получающих постоянное лечение в отделении диализа ГОУДПО СПбМАПО. Все больные получали гемодиализ или гемодиафильтрацию на высокопоточных либо высокоэффективных диализаторах с синтетической мембраной полисульфон. Процедура диализа осуществлялась трижды в неделю (два раза через день и один раз через два дня). Образцы венозной крови брали у всех больных не ранее, чем через двое суток после последней процедуры гемодиализа. Взятие крови осуществлялось в стерильную пробирку с K3-EDTA, центрифугировали 10 минут при 5000 g, полученную плазму хранили при -20°С до проведения анализов. Контрольную группу составили практически здоровые лица (п=13). Во всех образцах определяли IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, GM-CSF, IFN-y, TNF-a при помощи Х-МАР-технологии методом мультиплексного анализа белков на анализаторе BioPlex-100 (Bio-Rad, США) с использованием коммерческой тест-системы. Статистическое исследование проводили методами непараметрической статистики с помощью критерия Манна-Уитни для независимых признаков (сравнение групп между собой) и критерия Спирмана для выявления корреляции между различными признаками с применением компьютерных программ Statistica и MS Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Получение (?2М из диализата больных на хроническом гемодиализе.

Для моделирования фибриллогенеза необходимы значительные количества очищенного Р2М. Поэтому нами разработан способ препаративного получения р2М из диализата плазмы крови больных, получаемого во время процедуры on-line гемодиафильтрации. В плазме крови таких больных концентрация р2М существенно выше нормы. При фильтрации крови через гемодиализные мембраны некоторые количества Р2М поступают в фильтрат. В фильтрате содержание балластных белков гораздо меньше, чем в плазме крови, поэтому диализат может служить источником получения Р2М. Для получения Р2М диализная жидкость подвергалась ультрафильтрации через мембрану, проницаемую для веществ с молекулярной массой <5 кДа. При этом убирался большой объем воды и низкомолекулярные примеси. По данным электрофореза в 12% ПААГ с SDS в растворе после концентрирования присутствуют белки с молекулярной массой Р2М, а также более крупные белки, в частности, альбумин (см. рис. 1А). Для идентификации зоны, соответствующей по молекулярной массе Р2М, был осуществлен анализ методом MALDI-TOF. В результате было показано, что эта зона состоит из Р2М. Стрелкой на рисунке 1А обозначен участок геля, вырезанный для анализа методом MALDI-TOF. Идентификацию белков по «пептидному фингерпршпу» осуществляли при помощи программы Mascot (www.matrixscience.com). Аминокислотная последовательность Р2М человека:

IQRTPKIQVYSRHPAENGKSNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLKNGERIEKVEHSDLSF SKDWSFYLLYYTEFTPTEKDEYACRVNHVTLSQPKTVKWDRDM

Жирным шрифтом выделены пептиды, идентифицированные при помощи масс-спектрометрии в препаратах белка, подвергнутых трипсинолизу: K-IQVYSR-H, К-SNFLNCYVSGFHPSDIEVDLLK-N, R.IEKVEHSDLSFSK.D, K.VEHSDLSFSK .D, R.VNHVTLSQPK.I, K.IVKWDR.D, K.IVKWDRDM., K.WDRDM, SNFLNCY VSGFHPSDIEVDLLK + DEYACR. Кроме того, нами было высчитано «в ручную» соответствие пика с молекулярной массой 3250.4207Да двум пептидам: NFLNCYVSGFHPSDTEVDLLK (24%.1922Да) и DEYACR (755.2908Да). В нативном Р2М имеется дисульфидная связь между остатками цистеина 25 и 80. Мы предположили, что данная дисульфидная связь останется стабильной после трипсинолиза. Для определения ожидаемой массы этих двух пептидов, объединенных дисульфидной связью, мы от суммы масс пептидов вычли массу двух атомов водорода. Полученная таким образом масса 3249.4903Да соответствует одному из пиков пептидного фингерпринта р2М.

Таким образом, масс-спектрометрический анализ показал, что быстро мигрирующий компонент с кажущейся молекулярной массой около 12 кДа представляет собой р2М. Для дополнительной очистки концентрат после первой ультрафильтрации дополнительно фильтровали через мембрану, проницаемую для белков с молекулярной массой <30 кДа. На электрофореграмме (рисунок 1А) видно, что полученный Р2М мигрирует в виде одной зоны (12 кДа). Выход белка зависит от исходного содержания в диализате, в среднем из 1 литра диализной жидкости можно получить до 1 мг р2М. Так как в ходе выделения каких-либо денатурирующих воздействий не применялось, мы предположили, что нами получен Р2М в той конформации, в которой он присутствовал в плазме крови пациентов во время диализа.

Полноразмерный Д2М сам по себе не образует фибрилл в водном растворе при

физиологических рН. Было показано, что Р2М при рН=7,0 даже в концентрациях, превышающих сывороточное содержание Р2М у диализных пациентов в тысячи раз (McParland et al., 2000), не образует фибрилл. При закислении среды можно добиться спонтанного (т.е. без затравки) фибриллогенеза. Благодаря удобству и воспроизводимости, этот метод применяется наиболее часто для получения амилоидных фибрилл in vitro (McParland et al., 2000, Radford et al., 2005, Stoppini et al., 2005). Для формирования фибрилл необходимо появление ненативных конформеров Р2М (Radford et al., 2005).

На рисунке 2А представлены данные электронной микроскопии фибрилл из полученного нами р2М. Видны характерные фибриллярные структуры. Наличие фибрилл в таких препаратах подтверждается и данными анализа флуоресценции ThT в комплексе с Р2М. ThT применяется для количественной и качественной детекции амилоидных фибрилл (LeVine et al., 1993, McParland et al., 2000, Radford et al., 2005). В образцах, содержащих фибриллы, мы наблюдали резкое возрастание флуоресценции по сравнению с контролем - раствором мономера р2М, содержащего ту же концентрацию ThT (рисунок 4). Природный р2М использовался для получения антител, для изучения фибриллогенеза, а также в качестве реперного белка при создании генетических конструкций для синтеза рекомбинантных р2М. Получение рекомбинантного полноразмерного р2М человека.

Получение достаточных количеств природного Р2М требует много времени. Работа с биологическими жидкостями сопряжена с возможностью инфицирования персонала. Поэтому для дальнейшей работы было решено создать экспрессионную генетическую конструкцию для получения рекомбинантного Р2М человека. Рекомбинантные аналоги природных белков могут быть получены в больших количествах. Кроме того, генная инженерия позволяет вносить любые модификации в целевой белок с последующим анализом влияния этих модификаций на его свойства. Мы получили кДНК Р2М человека, и на основе кДНК создали серию плазмид с различными модификациями кДНК.

Рекомбинантные р2М обычно формируют тела включения (Chiba et al., 2003, Esposito et al., 2000, Kihara et al., 2005, и др.). Извлечение белка из телец включения требует применения сильных детергентов и последующей стадии рефолдинга. Однако ренатурация происходит не всегда, и не может быть уверенности, что в дальнейшей работе используется белок в нативной конформации (Ventura et al., 2006).

Для получения растворимого рекомбинантного полноразмерного р2М нами была создана конструкция рЕТЬ2т6.8 на основе коммерческой плазмиды рЕТ22Ь(+). кДНК Р2М человека получали из тотальной РНК лейкоцитов при помощи обратной транскрипции. Далее осуществляли ПЦР с праймерами, позволяющими встроить продукт ПЦР в соответствующую плазмиду. Таким образом, был получен ПЦР-продукт, содержащий сайт рестрикции MscI на 5' конце, последовательность, кодирующую полноразмерный Р2М человека, а также полигистидиновую последовательность, стоп-кодон и сайт рестрикции Hindlll на 3' конце. Полученный ПЦР-продукт был вставлен в плазмиду. Плазмидная ДНК отобранных клонов была просеквенирована. Одна из плазмид содержала последовательность, кодирующую PelB «лидерный пептид», последовательность Р2М, а также полигистидиновую последовательность. Все указанные последовательности находились в одной рамке считывания. Эту плазмиду мы обозначили как «рЕТЬ2ш6.8».

Рекомбинантный Р2М получали из клеток E.coli штамма BL21(DE3), трансформированных созданной нами плазмидой рЕТЬ2т6.8. Мы сконструировали

вектор таким образом, чтобы р2М синтезировался вместе с бактериальным Ре1В «лидерным пептидом», транспортирующим белок в периплазматическое пространство бактерии, и впоследствии отщепляющимся под воздействием бактериальной протеазы. Это позволяет получить р2М, не содержащий дополнительного метионина на Оконце и начинающийся сразу с изолейцина, первой аминокислоты Р2М человека. Как и ожидалось, в периплазме был обнаружен растворимый р2М. Включение в вектор полигистидиновой последовательности на С-конце дает возможность весьма эффективно и быстро очистить белок на никель-агарозном сорбенте. Экстракция периплазматической фракции позволяет получить раствор, содержащий целевой белок и до 30% балластных белковых примесей. Аффинная хроматография приводит к полной очистке р2М (Рис. 1Б).

По данным электронной микроскопии, рекомбинантный Р2М в соответствующих условиях (см. материалы и методы) образует фибриллярные структуры. Наличие амилоидных фибрилл подтверждается и данными анализа флуоресценции ТИТ в комплексе с Р2М (рисунок 4). Создание генетических конструкций для синтеза укороченных р2М.

В литературе разными группами авторов описано, что в амилоидных отложениях всех исследованных больных АР2М встречаются укороченные на первые 6 и 10 аминокислотных остатков варианты Р2М. Авторы оценивают процентное содержание интактного р2М примерно в 70%, а содержание р2М с усеченным Ы-концом - в 30%. У здоровых людей, а также в биологических жидкостях больных Ар2М укороченных форм р2М не встречается. Это может свидетельствовать о возможном вовлечении данных вариантов Р2М в патогенез Ар2М. Поэтому для дальнейшего моделирования фибриллогенеза мы решили использовать не только полноразмерный р2М, но и Р2М без первых шести и десяти аминокислотных остатков. С этой целью мы создали соответствующие экспрессионные генетические конструкции: рЕТЬ2т1.1 для получения рекомбинантного Р2М человека без первых шести аминокислот (Р2МД6-1) и рЕТЬ2т2.1 для получения рекомбинантного Р2М человека без первых десяти аминокислот (Р2МД10-2).

Перед нуклеотидной последовательностью, кодирующей Р2МД6, в плазмиде рЕТЬ2ш1.1 нами был вставлен не бактериальный Ре1В лидерный пептид, а старт-кодон АТС. В результате белок, синтезируемый полученной экспрессионной генетической конструкцией, имел дополнительный метионин на Ы-конце. В обоих случаях синтезируемый белок формировал тельца включения. В растворимой фракции Р2М не обнаруживался.

Очищенные белки в обоих случаях получали из телец включения, которые растворялись 8М мочевиной в присутствии Р-меркаптоэтанола, и подвергались хроматографической очистке на металл-хелатном никелевом сорбенте. Выход белка составлял 30-40 мг из 1 л бактериальной культуры. По данным электрофореза образцы содержали мономеры (11 кДа), димеры (23 кДа) и тримеры (34 кДа) Р2МД6. Кроме того, наблюдалась дополнительная зона, соответствующая молекулярной массе около 25 кДа. Диметры и тримеры образованы из мономеров за счет Э-Э связей. Комплекс, соответствующий дополнительной зоне, устойчив к восстановлению Б-Э связей при помощи Р-меркаптоэтанола (рисунок 1В, 1Г). Это может свидетельствовать о наличии не дисульфидных ковалентных взаимодействий, участвующих в образовании данного комплекса.

Как и полноразмерные Р2М, полученные укороченные Р2МД6-1 и Р2МД10-2 в тех же условиях фибриллогенеза образуют амилоидные фибриллы. Наличие

амилоидных фибрилл подтверждается и данными анализа флуоресценции ТЬТ (рисунок 4). В образцах, содержащих амилоидные фибриллы, мы наблюдали возрастание флуоресценции по сравнению с контролем.

Оптические свойства исходных мономера р2М и фибриллярных форм белка.

Спектры поглощения растворов природного и рекомбинантного Р2М, а также их фибрилл характеризуется максимумом при 278 нм и не различаются по форме.

Фибриллы, сформированные из полноразмерных Р2М, обладают наименьшей интенсивностью собственной триптофановой флуоресценции, фибриллы, сформированные из Р2М Д6-1, — наивысшей. Спектры флуоресценции фибрилл полноразмерных Р2М имеют максимумы при 337 нм (как и мономерный р2М). Спектры флуоресценции фибрилл, сформированных из Р2МД6-1 Р2МД10-2, - при 342 и 348 нм соответственно. Эти отличия объясняются в первую очередь конформационными особенностями упаковки белка в фибриллах, а также аминокислотными отличиями. В любом случае можно говорить о некоторых отличиях вторичной структуры фибрилл, образующихся из рекомбинантных производных р2М.

Эти предположения подтверждаются результатами анализа при помощи КД-спекгроскопии в области поглощения пептидных связей. Как и следует из литературных данных, мономерный Р2М не содержит альфа-спиралей, бета-структурировашше участки составляют 40%. В то же время в препаратах фибрилл четко прослеживается изменение соотношения бета-структур и альфа-спиральности (рис. 2). В отличие от исходного белка фибриллы содержат от 12 до 35% альфа-спиральных участков. Фибриллы, сформированные из Р2МД6-1 и Р2МД10-2, а также фибриллы, сформированные из Р2М, выделенного из плазмы крови больных, содержат ~20% р-структуры. Фибриллы, сформированные из рекомбинантного полноразмерного Р2М, содержат -13% Р-структуры. Эти результаты, прежде всего, указывают на частичное преобразование бета-структур в альфа-спирали. Мы, к сожалению, не можем утверждать, что все молекулы р2М и его производных участвуют в образовании фибрилл. Однако изменение вторичной структуры в препаратах указывает на то, что, по крайней мере, олигомерные формы в условиях фибриллогенеза содержат ощутимые количества альфа-спиралей.

Связывание ТЬТ с фибриллами, сформированными разными белками, сопровождается резким возрастанием квантового выхода флуоресценции (Ъеуте 1993). При связывании ТЬТ с фибриллами регистрировался сдвиг максимума с 412 нм (свободный ТЬТ) до 430 на (связавшийся краситель) и возрастал коэффициент молярной экстинкции. Полученные результаты указывают на существенные изменения конформации красителя при его включении с структуру фибрилл. В то же время по уровню возрастания флуоресценции ТЬТ фибриллы ¡ММ сходны с таковыми транстирета. В обоих случаях возрастание флуоресценции при связывании красителя не превышает 13 - 30 раз по сравнению с мономерными формами белков (для фибрилл инсулина эта величина составляет 670 раз). Для исследования причин относительно слабого эффекта возрастания флуоресценции красителя при связывании с фибриллами этих белков были получены спектры возбуждения и спектры эмиссии для разных препаратов Р2М и их фибриллярных форм.

Встраивание ТЬТ в фибриллы сопровождается небольшим сдвигом спектра флуоресценции в длинноволновую область. Наиболее длинноволновым является спектр раствора ТЬТ + фибриллы, сформированные из рекомбинантного полноразмерного Р2М Дт„=485 нм). Полученные спектры флуоресценции существенно различаются по интенсивности. Оказалось, что интенсивность

флуоресценции раствора ThT + р2М ~ в 20 раз превышает интенсивность флуоресценции свободного красителя в буферном растворе. Можно предположить, что это связывание происходит благодаря высокому содержанию в молекуле (32М ¡5-структур (~40%). Интенсивность флуоресценции ThT + фибриллы, сформированные из Р2М Д6-1 (наиболее интенсивно флуоресцирующего раствора) ~ в 150 раз превышает интенсивность флуоресценции свободного красителя в буферном растворе.

Таким образом, наши исследования подтверждают относительно слабое возрастание флуоресценции при связывании красителя с фибриллами. При этом видно, что укороченные формы различаются по способности фиксировать ThT в структуре фибрилл с усилением его флуоресцентных свойств. Не исключено, что это каким-то образом связано с равновесием между фибриллами и низкомолекулярными формами производных Р2М.

Получение рекомбинантного белка слияния p2MSF.

Для изучения фибриллогенеза в основном применяются такие биофизические методы как флуоресцентная спектроскопия (взаимодействие фибрилл с различными флуоресцентными красителями), динамическое светорассеяние, электронная и атомно-силовая микроскопия. Эти методы позволяют детально охарактеризовать строение фибрилл, сорбированных на «подложках», или детектировать наличие и определять размер фибрилл в растворе, однако они трудноприменимы для изучения кинетики реакции фибриллогенеза (образование промежуточных префибриллярных форм) и процесса формирования фибрилл in vivo. Поэтому в дополнение к вышеперечисленным методам представляется актуальным использовать конфокальную микроскопию для визуализации промежуточных стадий фибриллогенеза, а также для исследования внутриклеточной локализации как зрелых фибрилл, так и префибриллярных структур. Для этих целей могут быть использованы белки слияния исследуемого белка с superfolder GFP. В частности, нам представляется, что созданный нами модельный белок слияния P2MSF позволит в перспективе более детально изучить процесс фибриллогенеза.

Мы использовали плазмиду pTRC-99a, содержащую ген sfGFP, в качестве исходной, и осуществили вставку гена Р2М между промотором и нуклеотидной последовательностью гена superfolder GFP. В результате нами была получена генетическая конструкция на основе плазмиды pTRC99a_P7, содержащая кДНК белка слияния P2MSF с гистидиновым «хвостом» (6-His-tag) из шести гистидинов. Для этого нами были подобраны праймеры (см. материалы и методы): прямой включал cag (для препятствования образования праймерами димеров и лучшего «залипания») и начало последовательности Р2М, содержащая сайт рестрикции Kpnl (подчеркнут). Обратный праймер включал cag, сайт для эндонуклеазы рестрикции BamHI ggatcc (подчеркнут) и конец последовательности р2М. Сайты выбирались с учетом рамки считывания плазмиды.

Продукт ПЦР был вставлен в плазмиду pTRC99a-P7 содержащую кДНК sfGFP. Компетентные клетки Е.соН BL21(DE3) были трансформированы целевой плазмидой и нанесены на агарозную среду, содержащую ампициллин и IPTG. Таким образом после культивирования мы добились индукции синтеза белка слияния прямо на чашках Петри. Для определения колоний (т.е. клонов), синтезирующих белок слияния P2MSF, мы наносили выращенные этим способом клетки на предметное стекло и с помощью лазерной сканирующей конфокальной микроскопии определяли в них флуоресценцию, свойственную GFP.

На рисунке 5А представлены результаты нативного электрофореза в Р2МБР. Также как и контрольный белок бГСРР, и флуоресцирующий в проходящем УФ свете, белок Р2МБР обладает флуоресцентными свойствами. По данным БОБ-электрофореза, полученный белок слияния Р2М5Р (после восстановления меркаптоэтанолом и прогревания на кипящей водяной бане) имеет молекулярную массу около 40 кДа. При помощи и^егп-ВЬОТ иммунологически показано наличие как Р2М так и вЮРР в составе белка слияния Р2М8Р, и тем самым доказана правильность экспрессии гена и синтеза белка слияния в бактериальной системе.

Для получения фибриллярных структур белка слияния Р2МЭР был использован метод, описанный в работе (КлЬага е1 а1., 2005), с некоторыми модификациями. К раствору белка слияния Р2МБР в исходной концентрации 2 мг/мл (рН 7.0, 150мМ фосфатный буферный раствор), в качестве «затравки» реакции фибриллогенеза, была добавлена 1/100 часть объема заранее приготовленных зрелых фибрилл рекомбинантного р2М. В результате этого эксперимента в растворе методом атомно-силовой и электронной микроскопии были зарегистрированы фибриллярные структуры (Рис. 2Б).

Для экспериментов с применением конфокальной микроскопии использовали те же препараты фибрилл р2МЙР, что и для экспериментов по атомно-силовой микроскопии. Нами было замечено, что в растворах с значением рН меньше 5.0 вГОРР и белки слияния созданные на его основе теряют способность флуоресцировать. Поэтому фибриллярные структуры Р2МБР мы получали при рН 7.0, с использованием «затравки» (необходимое условие фибриллогенеза р2М в таких условиях). При помощи лазерной сканирующей микроскопии нами были зарегистрированы флуоресцирующие структуры, представленные на рисунке 5Б. Разрешающей способности лазерной сканирующей микроскопии, по-видимому, не достаточно для регистрации отдельных фибрилл, поэтому, на наш взгляд, приведённые на микрофотографиях сетевидные флуоресцирующие структуры, это скопления фибрилл (и, возможно, агрегатов), так называемые «надфибриллярные» структуры.

Введение в белок слияния БирегГоМег вРР позволяет, как указано в других исследованиях, исключить формирование телец включения и получать целевые белки в нативной конформации. В отделе молекулярной генетики НИИЭМ СЗО РАМН ранее проводились эксперименты по получению рекомбинантного белка слияния транстиретина и ЕСРР. Такая экспрессионная генетическая конструкция позволяла получить белок слияния транстиретина и ЕвРР, который полностью локализовался в тельцах включения и не обладал флуоресцентными свойствами, по-видимому, из-за нарушений фолдинга. В литературе (Pedelacq е1 а1., 2006) описано получение белков слияния с вирегАэЫег ОРР, причем отмечается, что, из-за повышенной скорости сворачивания и улучшенных характеристик фолдинга виреНЪИег вРР белки слияния, полученные на его основе, как правило, при синтезе в бактериальной системе не образуют телец включения. При этом аналогичные белки слияния с ЕвРР образуют нерастворимые тельца включения. Мы предполагали, что зирегРэИег йРР будет препятствовать формированию телец включения белка слимяния.

Таким образом, продемонстрирована возможность получения фибриллогенного белка слияния р2МБР. Белок синтезируются внутриклеточно в бактериальной системе, выделяется в растворимом виде и не образует телец включения. Р2МЗР, с одной стороны, обладает флуоресцентными свойствами, как и нативный зирегйэШег йРР. С другой стороны, Р2МЭР способен образовывать фибриллы (по крайней мере, в описанных для Р2М условиях фибриллогенеза при нейтральном рН), не теряя при

этом своих флуоресцентных свойств. Гуморальный иммунный ответ на фибриллы Р2М.

Мы иммунизировали кроликов фибриллами, полученными из рекомбинантного Р2М человека. Нас интересовал вопрос, содержат ли фибриллы р2М антигенные детерминанты, не свойственные мономерному р2М. Способ малоинвазивной лабораторной диагностики Ар2М, основанный на детекции таких антител, быть востребован. Кроме того, с фундаментальной точки зрения, не до конца ясна роль иммунных реакций в патогенезе как АР2М, так и других амилоидозов.

Из сыворотки крови иммунизированных кроликов были выделены иммуноглобулины й Фракция иммуноглобулинов была аффинно очищена от антител к мономерному Р2М. Оставшиеся антитела использовались в дальнейших экспериментах, в частности, была проверена их аффинность к фибриллам р2М. Как и ожидалось, полученные иммуноглобулины специфически реагировали с фибриллами р2М, но не реагировали с мономерным Р2М. Для решения вопроса об аффинности полученных нами анти-фр2М антител к фибриллам, сформированными из других белков или пептидов, мы провели следующий эксперимент. На один НЦФ наносили одинаковое количество (по массе) фибрилл, сформированных из Р2М при кислом и физиологическом рН, фибрилл другого происхождения, мономера р2М, мономера лизоцима, а также пятикратный избыток мономера р2М. Затем осуществляли стандартную процедуру БоИЗЬОТ с использованием очищенных анти-фр2М антител. В результате окрасились только те зоны НЦФ, на которые были нанесены фибриллы, сформированные из Р2М при кислом и физиологическом рН. Это свидетельствует об отсутствии специфического реагирования с фибриллами другого происхождения. А тот факт, что места нанесения мономера Р2М и его пятикратного избытка не окрасились, свидетельствует о достаточно полной «очистке» исходной кроличьей сыворотки от антител к нативному Р2М.

Аналогично подготовленный НЦФ обрабатывали антителами к мономеру Р2М. В результате окрасились те зоны НЦФ, на которые были нанесены фибриллы, сформированные из р2М при кислом и физиологическом рН, а также сам мономер Р2М. К нашему удивлению, фибриллы р2М окрашивались заметно интенсивнее мономера той же концентрации и примерно с одинаковой интенсивностью с пятикратным избытком мономера. Такой результат повторялся и при кратных разведениях обоих антигенов.

Мы сочли нужным провести контрольный эксперимент дня оценки возможности неспецифического взаимодействия фибрилл р2М с иммуноглобулинами класса О На НЦФ нанесли различные разведения фибрилл рекомбинантного р2М и мономеров Р2М, лизоцима, альбумина. Провели Бо^БШТ. В качестве первых антител использовались разведения сывороток кроликов, не иммунизированных р2М или фибриллами. В результате окрасились области НЦФ, на которые были нанесены фибриллы Р2М. Эти результаты воспроизводились в нашей лаборатории неоднократно. Скорее всего, их можно объяснить неспецифическим связыванием кроличьих ГцС с амилоидными фибриллами Р2М. То же явление наблюдалось, если использовались в качестве первых антител ^О неиммунизированных кроликов или очищенные ^О против лактоферрина человека.

Таким образом мы обнаружили и, как нам кажется, доказали факт неспецифического связывания фибрилл (52М человека с кролика. Это следует учитывать при дальнейшем изучении гуморального иммунного ответа на фибриллы Р2М. К сожалению, нами к настоящему времени не исследован вопрос, есть ли

аналогичный эффект с человека. Если существует такое же связывание человека с амилоидными фиблиллами Р2М, то это может иметь важное значение в понимании патогенеза Ар2М, а также в подходах к малоинвазивной диагностике данного заболевания. Кроме того, данный факт следует иметь в виду и при разработке таких иммунологических методов диагностики АР2М, в которых фибриллы р2М будут использоваться в качестве антигена.

Содержание цитокинов в плазме крови больных, находящихся на хроническом гемодиализе.

Так как диагностировать Ар2М достаточно сложно, способ малоинвазивной лабораторной диагностики этого заболевания может быть весьма востребован. Одним из направлений нашей работы по поиску такого способа является попытка обнаружить цитокиновые маркеры АР2М. Кроме того, теоретически не до конца ясна роль иммунных реакций в патогенезе как Ар2М, так и других амилоидозов. Поэтому было решено определить содержания цитокинов в плазме крови пациентов на различных сроках хронического гемодиализа.

Содержание всех исследованных цитокинов в плазме крови больных находившихся на хроническом гемодиализе было достоверно повышено по сравнению с контрольной группой (р<0,03 для 11.-10 и р<0,01 для 11,-2, 11.-4, 11.-6, ТЬ-8, вМ-СвР, ]ТМ-у, ТОТ-а) (Таблица 1).

Первоначально мы оценили корреляции между уровнем 11.-2, 11.-4, [[.-6, 11.-8, 1Ь-10, СМ-СЗИ, ГПЧ-у, ТОТ-а и длительностью хронического гемодиализа. В результате была обнаружена статистически значимая (р<0,03) обратная корреляция между уровнем II.-10 и продолжительностью диализа. При этом для остальных цитокинов подобной зависимости выявлено не было.

На следующем этапе мы разделили больных на группы в зависимости от длительности диализа. При разделении больных на группы «до 3 лет диализа» и «более 3 лет диализа», было обнаружено статистически значимое различие этих групп по уровню 1Ь-10 в крови (р=0,04). По содержанию всех исследованных цитокинов группа «до 3 лет диализа» статистически значимо отличалось от контрольной группы (р<0,03 для 11.-10 и р<0,01 для П.-2, ГТ.-4, 11-6, 11.-8, ОМ-СЭР, ПЧЧ-у, ЮТ-а). Аналогичная ситуация наблюдалась при сравнении группы «более 3 лет диализа» и группы здоровых доноров для всех исследованных цитокинов, кроме 11.-10. Достоверных различий по 11.-10 в последних двух группах не обнаружено: р>0,14.

Таким образом, у обследованных больных на гемодиализе уровень цитокинов существенно превышал норму. При этом с увеличением срока, в течение которого больные подвергались процедуре хронического диализа, уровень 11.-2,11.-4,11.-6,11.-8, вМ-ОБР, №N-7, ЮТ-а увеличивался. Содержание же 1И0 снижалось после трех лет диализа до уровня, статистически не различающегося с нормой

Среди обследованных пациентов около половины получает гемодиализ, а остальные - процедуру гемодиафильтрации. Мы решили выяснить, существуют ли различия между этими группами по уровню исследованных цитокинов. Группа больных на гемодиализе отличалась от группы на гемодиафильтрации только по уровню ОМ-СЗИ (р<0,04) (таблица 2). По всем остальным цитокинам статистически значимых различий между группами не было выявлено. Кроме того, не выявлено различий и по такому параметру, как длительность диализа. Эти результаты сами по себе интересны, так как исследования по сравнению цитокинового статуса у больных на гемодиализе и гемодиафильтрации малочисленны.

При дальнейшем разделении больных, получающих процедуру

гемодиафильтрации, на группы «до 3 лет диализа» (п=23) и «более 3 лег диализа» (п=25), было обнаружено различие между этими группами по уровню 11.-6 в плазме крови (р=0,02). По содержанию всех исследованных цитокинов группа «до 3 лет гемодиафильтрации» статистически значимо отличалось от контрольной группы (р=0,05 для 11.-10 и р<0,005 для 11.-2,11.-4,П.-6, 11.-8, ОМ-СБР, ПТ^-у, ТОБ-а). Группа «после 3 лет гемодиафильтрации» значимо отличалось от группы практически здоровых по содержанию в плазме крови 11.-2, 11,-4, П.-8, ОМ-СЭР, №N-7, ЮТ-а (р<0,005). При этом статистически достоверно эти две группы не различались по 1Ь-6 (р=0,3) и II.-10 (р=0,16).

Заболеваемость АР2М коррелирует с длительностью хронического диализа (от единичных случаев на первом году гемодиализа до 90-100% через 5-13 лет хронического диализа). Нами обнаружены корреляции между содержанием П.-10 в плазме крови и длительностью диализа у больных, как на гемодиализе, так и на гемодиафильтрации. Обнаружена корреляция между содержанием 11.-6 в плазме крови и длительностью диализа у больных на гемодиафильтрации. Показано, что при разделении пациентов на группы «до 3 лет диализа» и «более 3 лет диализа», такие группы будут различаться по содержанию 11.-10 и 11.-6 в плазме крови. Эти результаты, на наш взгляд, позволяют предложить 11.-10 и П.-6 (но 11.-6 только у больных на гемодиафильтрации) для дальнейших исследований в качестве потенциальных маркеров-кандидатов Ар2М.

ВЫВОДЫ

1. Разработан эффективный способ получения очищенного Р2М человека.

2. Создана генетическая контрукция для синтеза полноразмерного Р2М человека с полигистидиновым фрагментом и пептидом, направляющим белок в периплазматическое пространство бактерий, что исключает формирование телец включения. Получен рекомбинантный нативный Р2М с исключением стадий денатурации и ренатурации.

3. Созданы экспрессионные генетические конструкции, позволяющие получать в очищенном состоянии укороченные варианты Р2М человека.

4. Показано, что исходный природный Р2М, рекомбинантный Р2М и укороченные производные обладают фибриллогенной активностью.

5. По спектральным характеристикам фибриллы разных вариантов Р2М имеют некоторые различия, указывающие на их различную способность связывать тиофлавин Т. Выявлено, что фибриллогенез Р2М и его производных происходит с возрастанием количества альфа-спиральных структур.

6. С целью визуализации стадий фибриллогенеза на клеточных культурах получена генетическая конструкция и рекомбинантный белок слияния Р2М - зеленый флуоресцентный белок. Показано, что очищенный рекомбинантный белок слияния формирует видимые в микроскоп фибриллярные структуры.

7. Обнаружено, что фибриллы Р2М обладают способностью неспецифически сорбировать иммуноглобулины в кролика.

8. Показано, что в плазме крови больных, получающих процедуру хронического гемодиализа, повышена концентрация 11.-2,11.-4, 11.-6, П.-8, П.-10, ОМ-СЭР, ПТ^-у, ЮТ-а.

9. Установлено, что содержание П.-10 в плазме крови больных на хроническом гемодиализе возрастает в первые 3 года терапии и далее снижается до нормальных значений.

*тт

Щпр-.

к V 2.1 . 1

А Б В Г

Рисунок 1. Электрофоретическое разделение белков в 12% ПААГ. А, Б, В - окраска Кумасси R-250. 1 - маркер молекулярного веса (Fermentas). Снизу вверх: 11 кДа, 17 кДа, 28 кДа, 36 кДа, 55 кДа, 72 кДа, 95 кДа, 130 кДа. А: 2 - (32М, выделенный из диализата больных на гемодиализе. 3-концентрат диализата больного, длительное время находящегося на гемодиализе. Б: 2 - рекомбинангный (32М. 3 - (32М выделенный из ультра-фильтрата плазмы больных на гемодиализе. В: Р2МА6-1 после очистки на никель-агарозной колонке. Г: «перенос» на НЦФ методом Western-BLOT. Дорожка 3: Р2МА6-1 после прогревания в додецилсульфате, не содержащем р~меркаптоэтанола. Дорожка 3: р2МД6-1 после прогревания в SDS, содержащем 2% Р-меркаптоэтанола.

SímL .

Рисунок 2. А: электронная микроскопия фибрилл р2М. Б: электронная микроскопия фибрилл Р2М8Б. Шкала в правом нижнем углу = 100 нм.

г о

Рисунок 3. Спектры кругового дихроизма в дальнем УФ (на 1 а.к. остаток). На оси абсцисс длина волны в нм.

1- мономер р2М;

2 - фибриллы из Р2МЛ10-2;

3 - фибриллы из Р2М А6-1;

4 - фибриллы из Р2М, выделенного из плазмы крови больных на хроническом гемодиализе;

5 - фибриллы рекомбинантного полноразмерного Р2М.

Рисунок 4. Спектры эмиссии комплексов тиофлавина Т с препаратами Р2М. Возбуждение при двух длинах волн: А - 435 нм, Б - 340 нм. На оси абсцисс длина волны в нм, на оси ординат относительная флуоресценция. 1 - фибриллы из р2М А6-1; 2 - фибриллы из Р2М, выделенного из плазмы крови больных на хроническом гемодиализе; 3 - фибриллы из рекомбинантного полноразмерного Р2М; 4 - фибриллы Р2МД10-2; 5 - мономер Р2М.

5 6

А Б В

Рисунок 5. А, Б: электрофорез в неденатурирующих условиях. А: ПААГ без окраски. Б: Окраска Кумасси 11-250. 2, 3, 5, 6 - белок слияния Р2М8Б. 1,4 — контрольный белок вГОБР. В: конфокальная лазерная сканирующая микроскопия

препарата Р2МБР, содержащего фибриллярные структуры.

Цитокины Содержание цитокинов в плазме крови: медиана (первый квартиль - третий квартиль) Достоверность различий больных и контрольной группы (р)

Больные на хроническом гемодиализе, п=86 Контрольная группа (практически здоровые), п=13

11.-2, ра/тЬ 3,075 (2,4-3,6) 0 (0-0) 0,000 *

1Ь-4, pg/mL 0,46 (0,4-0,48) 0,04 (0-0,28) 0,001 *

1Ь-6, pg/mL 0,26(1-1,9) 0 (0-0) 0,002 *

1Ь-8, Рй/тЬ 1,98(1,11-3,82) 1,003 (0,146-1,35) 0,001 *

1Ь-10, рк/тЬ 0,19 (0,06-0,39) 0,013 (0-0,207) 0,034 *

вМ-СБР, рй/тЬ 9,39(8,04-10,385) 0 (0-0) 0,000 *

1Ш-у ря/тЬ 20,52(18,24-23,94) 0 (0-0) 0,000 *

ТОТ-а рй/тЪ 9,9 (8,8-11,55) 0,09 (0-0,3) 0,000 *

* достоверность различий между сравниваемыми группами р<0,05 Таблица 1. Сравнение содержания цитокинов в плазме крови больных, получавших процедуру хронического гемодиализа, и практически здоровых.

Больные на стандартном гемодиализе (п=31) Больные на гемодиафильтрации (п=49)

11-2, pg/mL 2,775 (2,175-3,3) 3,075 (2,475-3,6) 0,153

1Ь-4, р£/тЬ 0,44 (0,4-0,48) 0,46 (0,44-0,48) 0,159

1Ь-6, рр/гпЬ 0,34 (0-1,905) 0,11 (0-1,15) 0,335

1Ь-8, pg/mL 1,98(1,16-3,715) 1,88 (0,84-3,82) 0,659

1Ь-10, р.ц/тЬ 0,21 (0,05-0,375) 0,17(0,08-0,39) 0,953

вМ-СБ^ рй/тЬ 9,045 (7,37-9,548) 10,05 (8,04-11,39) 0,039 *

ГШ-у Рй/тЬ 20,52(18,24-22,8) 20,52 (18,24-23,94) 0,420

ЮТ-а ра/гпЬ 9,9 (8,8-11,275) 9,9 (8,8-11,55) 0,977

* достоверность различий между сравниваемыми группами р<0,05 Таблица 2. Сравнение содержания цитокинов в плазме крови больных, получавших процедуру стандартного гемодиализа и гемодиафильтрации.

цитокины Бреагпшп Я ((N-2) Р

1 1-2 1 -0,011115 -0,09817 0,922050

1Ь-4 -0,068657 -0,60779 0,545089

1Ъ-6 -0,176199 -1,58088 0,117951

1Ь-8 -0,112412 -0,99913 0,320823

; 11,-10 1 -0,263575 -2,41316 0,01816*

ОМ-С5Р -0,088059 -0,78075 0,437313

1 1Ш- у 1 -0,060920 -0,53903 0,591400

ТМР- а '0,093940 0,83334 0,407196

* достоверность р<0,05

Таблица 3. Корреляции между содержанием цитокинов в плазме крови и длительностью хронического гемодиализа.

: цитокины ; Бреагшап Я Т(Ы-2) Р

1 1Ь-2 ; -0,070724 -0,48608 0,629169

! 1Ь-4 -0,207708 -1,45572 ; 0,152117

И.-6 -0,350419 -2,56499 ^ 0,013571*

П.-8 ! -0,058819 -0,40394 0,688087

11,-10 -0,250010 -1,77020 : 0,083180

ОМ-СБР -0,104820 -0,72259 0,473511

П^-у -0,086459 -0,59496 0,554723

ТОТ-а 1 0,070909 0,48735 1 0,628274

* достоверность р<0,05

Таблица 4. Корреляции между содержанием цитокинов в плазме крови и длительностью хронического диализа у больных, получающих процедуру гемодиафильтрации.

ОСНОВНЫЕ ПУБЛИКАЦИИ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ Статьи в рецензируемых журналах:

1. Поляков Д.С.. Грудинина H.A., Соловьёв К.В., Егоров В.В., Сироткии А.К., Алейникова Т.Д., Тотолян Арег А., Шавловский М.М. Бета-2-микроглобулиновый амилоидоз: фибриллогенез природного и рекомбинантных бета-2-микроглобулинов человека // Медицинский академический журнал. - 2010. - Том 10. - № 2. - С. 40-49.

2. Поляков Д.С.. Тотолян Арег А., Шавловский М.М. Получение природного бета2-микроглобулина человека // Молекулярная медицина. - 2010. - № 6. - С. 39-43.

3. Поляков Д.С.. Грудинина H.A., Соловьёв К.В., Егоров В.В., Сироткин А.К., Алейникова Т.Д., Тотолян Арег А., Шавловский М.М. Получение рекомбинантного Р2-микрогаобупина человека и его фибриллогенез при низких и нейтральных значениях pH // Молекулярная медицина. -2011,- №2. - С. 36-39.

4. Поляков Д.С.. Домашенко О.М., Белобородое П.В., Сысоев К.А., Шавловский М.М., Тотолян Арег А. Содержание цитокинов в плазме крови больных, находящихся на хроническом гемодиализе // медицинская иммунология. - 2011, - №2-3, С.211-218. Тезисы докладов:

1. Поляков Д.С.. Алейникова Т.Д., Шавловский М.М. Гуморальный ответ на фибриллы бета2-микроптобулина человека. Биология — наука XXI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пущино, 19-23 апреля 2010 года). Сборник тезисов // 2010, Том 2, 166-167.

2. Поляков Д.С.. Алейникова Т.Д., Шавловский М.М. Получение и свойства кроличьих антител к фибриллам бета2-микроглобулина человека. Биология — наука XXI века: 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых (Пущино, 19 -23 апреля 2010 года). Сборник тезисов //2010, Том 2, 172-173.

3. Поляков Д.С.. Соловьев К.В., Грудинина H.A. «Получение белка слияния бета-2-микроглобулина с зеленым флуоресцентным белком», тезисы 3 международного молодежного медицинского конгресса "Санкт-петербургские научные чтения-2009", Санкт-Петербург, 2009, стр 116.

4. Поляков Д.С.. Грудинина H.A., Соловьёв К.В., Шавловский М.М. «Создание экспрессионной генетической конструкции для получения бета-2-микроглобулина человека в бактериальной системе», тезисы 13 международной Пущинской школы-конференции «Биология - наука 21 века» 28 сентября - 2 октября, 2009, Пущино, стр. 37.

5. Поляков Д.С.. Шавловский М.М. Взаимодействие амилоидных фибрилл бета2-микроглобулина с иммуноглобулинами в условиях иммугоблоттинга. 7 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010». Сборник трудов // 2010, Том 4, 341- 344.

Подписано в печать 22.04.11 Формат 60x84'/i6 Цифровая Печ. л. 1.5 Уч.-изд.л. 1.5 Тираж 100 Заказ 07/04 печать

Отпечатано в типографии «Фалкон Принт» (197101, г. Санкт-Петербург, ул. Большая Пушкарская, д. 54, офис 8)

Содержание диссертации, кандидата медицинских наук, Поляков, Дмитрий Степанович

Введение.

1. Обзор литературы.,.

1.1. Общая характеристика и классификация амилоид'озов.

1.2. Молекулярно-биологические основы амилоидозов.

1.3. Гемодиализный амилоидоз и бета2-микроглобулин.

1.4. Структура бета2-микроглобулина и его функции в иммунной системе.

1.4.1 .Структура бета2-микроглобулина.

1.4.2. Молекула класса I главного комплекса гистосовместимости

1.4.3. Неклассические молекулы главного комплекса гистосовместимости.

1.5. Клинические проявления бета2-микроглобулинового амилоидоза

1.5.1. Синдром запястного канала.

1.5.2. Амилоидная артропатия.

1.5.3. Контрактуры сгибателей пальцев (атрофический тендосиновит).

1.5.4. Деструктивная спондилоартропатия.

1.5.5. Костные кисты.

1.5.6. Системные (висцеральные) амилоидные отложения.

1.6. Диагностика бета2-микроглобулинового амилоидоза.

1.7. Состав амилоидных отложений при бета2-микроглобулиновом амилоидозе.

1.7.1. Бета2-микроглобулин — основной компонент амилоидных отложений при бета2-микроглобулиновом амилоидозе.

1.7.2. Гликирование.

1.7.3. Бета2-микроглобулин с усеченными аминокислотными последовательностями.

1.7.4. Другие компоненты амилоидных отложений.

1.8. Зеленые флуоресцентные белки в качестве маркеров фибриллогенеза.

1.9. Особенности содержания цитокинов в плазме крови больных с хронической почечной недостаточностью.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фибриллогенез бета-2-микроглобулина и иммунологические изменения при гемодиализном амилоидозе"

Актуальность исследования

Впервые заболевание, связанное с накоплением особого вещества в паренхиматозных органах, было описано в 1842 году венским патологоанатом К. Рокитанским. Именно он обратил внимание на характерные морфологические особенности пораженных органов и назвал явление «сальной болезнью» (Rokitansky 1842). Более подробное описание этой патологии принадлежит патологу Р. Вирхову (Virchow 1854 а, б). Он обнаружил в тканях больных вещество, названное им амилоидом по способности окрашиваться йодом, аналогично полисахаридам. В последствие было выявлено, что амилоид специфично окрашивается также Конго красным и другими красителями. Классический вирховский амилоидоз с точки зрения современных представлений является вторичным осложнением хронических инфекционных заболеваний. В связи с прогрессом терапии воспалительных заболеваний классический амилоидоз в настоящее время встречается редко. В то же время оказалось, что заболевания со сходными патологоанатомическими и гистологическими проявлениями являются достаточно распространенными. Обычно грубых изменений органов, свойственных классическому амилоидозу, обнаружить не удается. Только гистохимические исследования позволяют поставить диагноз амилоидоза. В то же время многие амилоидозы являются достаточно грозными заболеваниями, часто с фатальными исходами. Амилоидозы являются или самостоятельными заболеваниями, или серьезными осложнениями определенных видов патологии или терапевтических вмешательств. Весьма часто причиной развития амилоидозов служат наследственные факторы. В связи с общностью патогенеза амилоидозов, в основе которого лежат изменения третичной структуры (конформации) белковых молекул, эти заболевания относятся к «конформационным».

Группа амилоидозов представлена заболеваниями с различными клиническими проявлениями. В эту группу болезней попадают такие как болезнь Альцгеймера, болезнь Гентингтона, прионовые болезни, системные амилоидозы, вторичные амилоидозы и др. Всего к настоящему времени описано 27 амилоидозов, вызываемых изменениями структуры соответствующих белков. По клиническому течению эти заболевания существенно различаются, но многие характеризуются крайне неблагоприятным прогнозом. Прогноз усугубляется практически полным отсутствием патогенетической терапии. В ряде случаев единственным действенным мероприятием представляется пересадка органов. Нейродегенеративные амилоидозы приводят к маразму, главной опасностью системных амилоидозов является вовлечение в процесс сердечной мышцы. С учетом относительной распространенности и тяжести течения многих амилоидозов, а также отсутствия эффективной терапии, проблема этой группы заболеваний представляется весьма актуальной как с точки зрения диагностических мероприятий для раннего выявления патологии, так и в плане разработки адекватной терапии. Необходимо также отметить, что фундаментальные исследования проблемы амилоидозов не могут рассчитывать на успех без привлечения знаний других дисциплин, в частности таких как химия белка и молекулярная биология. Дело в том, что фундаментальная проблема — проблема фолдинга (формирования пространственной организации) белковых молекул имеет прямое отношение к патогенезу амилоидозов.

Среди вторичных амилоидозов особое место занимают такие, которые не связаны напрямую с основным заболеванием, а являются осложнениями лечебных мероприятий. К этому виду патологии относятся инсулиновый амилоидоз и так называемый гемодиализный амилоидоз.

Терминальная стадия хронической почечной недостаточности -тяжелое, угрожающее жизни состояние, требующее замещения утраченной почечной функции. Актуальность проблемы замещения функции почек у таких больных с терминальной стадией хронической почечной недостаточности обусловлена значительным увеличением числа больных во всем мире, которые нуждаются в методах заместительной терапии — гемодиализе, перитонеальном диализе, трансплантации почки.

Во второй половине 20 века в связи с разработкой новых технологий, основанных на достижениях химии и электроники, появилась возможность продления жизни больным, страдающим тяжелыми заболеваниями почек. Введение в практику процедур очистки крови при помощи диализа позволяет больным, которые прежде неизбежно погибали, относительно комфортно жить в течение десятилетий. Однако решение задачи терапии тяжелых поражений почек создало новые проблемы. Вскоре после введения в практику гемодиализного лечения было обнаружено, что у части больных развивается особая форма амилоидоза, так называемый гемодиализный амилоидоз. Естественно этот амилоидоз носит вторичный характер и, как оказалось, его причиной служит повышение концентрации в плазме крови особого белка - (32М. Нарушение почечного катаболизма (32М является причиной многократного возрастания содержания белка в плазме крови. По-видимому, именно превышение некоторого порога концентрации (32М лежит в основе данного амилоидоза. Клинически гемодиализный амилоидоз протекает сравнительно доброкачественно. Однако в ряде случаев существенно снижается качество жизни больных, и для купирования симптомов амилоидоза приходится прибегать даже к хирургическому лечению. Хотя не у всех больных на гемодиализе развивается клиническая картина амилоидоза, число больных, требующих гемодиализной терапии, растет. Таким образом, проблема гемодиализного амилоидоза с точки зрения клинической практики представляется актуальной. Кроме того, патогенез этого осложнения и закономерности формирования амилоидных фибрилл Р2М in vitro, а также факторы, способствующие началу амилоидогенеза, до конца не изучены.

Любые инвазивные способы терапии в той или иной степени сопряжены с ответной реакцией организма, которая имеет много общего с обычным воспалительным процессом. Так как при воспалении задействована система цитокинов, которые либо усиливают, либо ослабляют течение процесса, то изучение цитокинового ответа при инвазивной терапии может способствовать выбору правильной тактики лечебных мероприятий. Гемодиализ — пример инвазивной терапии. Так как эта процедура проводится у больных с почечной недостаточностью, то необходимо четко представлять вклад основного заболевания и проводимых лечебных мероприятий в развитие ответных реакций со стороны цитокинов. Для нас наибольший интерес представляют условия развития гемодиализного амилоидоза, и на этот процесс могут существенно влиять отдельные цитокины. Поэтому весьма актуально было выяснить картину изменения некоторых провоспалительных и противовоспалительных цитокинов у больных с почечной недостаточностью и влияние гемодиализа на эти показатели.

Все это заставило нас приступить к изучению некоторых молекулярно-биологических и иммунологических особенностей гемодиализного амилоидоза.

Целью настоящего исследования являлось выяснение особенностей фибриллогенеза (32М и молекулярных основ гемодиализного амилоидоза, а также роли иммунных факторов в патогенезе этого заболевания Задачи исследования

1. Получить в очищенном состоянии природный (32М человека и поликлональные антитела к этому белку.

2. Создать генетическую конструкцию для синтеза нативного рекомбинантного 02М человека в бактериальной системе.

3. Создать генетическую конструкцию для синтеза в бактериальной культуре рекомбинантного белка слияния, состоящего из (32М и зеленого флуоресцентного белка.

4. Создать генетические конструкции для синтеза укороченных рекомбинантных (32М, накапливающихся в клетках в виде телец включения.

6. Изучить имунногенность фибрилл, образованных из |32М человека.

7. Определить содержание цитокинов в плазме крови больных, получающих процедуры гемодиализа на протяжении различных сроков. Научная новизна полученных результатов

Предложен новый способ препаративного выделения Р2М из диализата плазмы крови больных, получаемого во время лечебной процедуры гемодиафильтрации.

Создана экспрессионная генетическая конструкция, содержащая ген полноразмерного Р2М , человека. Введенная в структуру гена полинуклеотидная последовательность, которая кодирует лидерный пептид, направляющий синтезируемый белок в периплазму, позволяет получать нативный Р2М без образования телец включения. Таким образом, исключаются стадии денатурации и ренатурации, необходимые для извлечения белка из телец включения. Благодаря введенной последовательности из пяти гистидинов на С-конце, синтезируемый в Е.соН Р2М может быть эффективно и просто очищен на никель-хелатном-агарозном сорбенте. Впервые показано, что полученный таким образом белок способен образовывать амилоидные фибриллы, сходные с амилоидными фибриллами, полученными из природного (32М.

Получены генетические конструкции, кодирующие укороченные с 14конца варианты (32М. Показана фибриллогенность и склонность к образованию олигомеров укороченных на 6 и 10 аминокислотных остатков рекомбинантных Р2М. Рекомбинантный вариант без 10 аминокислотных остатков получен и охарактеризован впервые.

Впервые создана экспрессионная генетическая конструкция для синтеза в Е.соН белка слияния р2М человека с зеленым флуоресцентным белком. Показано, что получаемый белок слияния р2М8Р, с одной стороны, обладает зеленой флуоресценцией, свойственной нативному ОБР, с другой стороны, Р2М8Р способен образовывать фибриллы, не теряя при этом своих флуоресцентных свойств.

Впервые продемонстрировано, что фибриллы р2М, сформированные как при рН 2,0, так и при рН 7,4, прикрепляются к нитроцеллюлозному фильтру и не деполимеризуются во время стандартной процедуры Во^ВЬОТ (то есть при слабощелочных рН). При помощи таких фильтров показано, что кролика неспецифически связываются с фибриллами Р2М.

Показано, что при гемодиализе у пациентов по мере увеличения сроков терапии возрастает содержание 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-10, ОМ-С8Р, Шч[-у и ТЫР-а в плазме крови. В то же время содержание 1Ь-10 на начальных этапах гемодиализа возрастает, и далее снижается, достигая нормальных значений.

Научно-практическое значение полученных результатов.

Для изучения фибриллогенеза и поиска веществ, ингибирующих данный процесс или способствующих ему, необходимо иметь десятки миллиграммов очищенного Р2М. Созданные нами экспрессионные генетические конструкции синтезируют рекомбинантные Р2М человека, как полноразмерный, так и его укороченные формы, встречающиеся у больных АР2М. Благодаря введенным полигистидиновым последовательностям, созданные рекомбинантные ß2M можно получить в необходимых количествах и относительно быстро и эффективно очищать. Для всех полученных белков показана способность к образованию амилоидных фибрилл, что позволяет предложить эти белки в качестве удобных моделей для изучения фибриллогенеза ß2M.

Обнаружение факта неспецифического связывания фибрилл ß2M человека с IgG кролика, на наш взгляд, имеет научно-практическую значимость, так как этот эффект следует учитывагь при дальнейшем изучении гуморального иммунного ответа на фибриллы ß2M. Если существует такое же связывание IgG человека с амилоидными фиблиллами ß2M, то это может иметь важное значение в понимании патогенеза Aß2M, а также в подходах к малоинвазивной диагностике данного заболевания. Кроме того, данный факт следует иметь в виду и при разработке таких иммунологических методов диагностики Aß2M, в которых фибриллы ß2M будут использоваться в качестве антигена.

Созданный нами рекомбинантный белок слияния ß2M и зеленого флуоресцентного белка может быть использован для визуализации промежуточных стадий фибриллогенеза, а также для исследования внутриклеточной локализации как зрелых фибрилл, так и префибриллярных структур.

Результаты, полученные при изучении содержания цитокинов в плазме крови больных на хроническом гемодиализе, позволяют утверждать, что ILIO и IL-6 могут служить маркерами клинического течения ß2-микроглобулинового амилоидоза.

Основные положения, выносимые на защиту

1. Предложен эффективный способ препаративного выделения ß2M из гемодиафильтрационного диализата плазмы крови больных, который позволяет получать очищенный ß2M человека в нативном состоянии.

2. Показано, что созданные экспрессионные генетические конструкции для синтеза в бактериальной культуре позволяют получать нативный полноразмерный рекомбинантный ß2M человека, рекомбинантный белок слияния (состоящий из ß2M и зеленого флуоресцентного белка), а также укороченные варианты ß2M (без шести и десяти N-концевых аминокислот).

3. Установлено, что все полученные рекомбинантные белки обладают способностью к фибриллогенезу. Для укороченных вариантов ß2M, кроме того, показана склонность к олигомеризации.

4. Показано, что белок слияния ß2MSF обладает зеленой флуоресценцией, свойственной нативному GFP, но при этом способен образовывать фибриллы в условиях фибриллогенеза, описанных для ß2M.

4. Выявлено, что иммуноглобулины класса G кролика неспецифически связываются с фибриллами, сформированными из ß2M человека.

5. Показано, что с увеличением срока, в течение которого больные подвергались процедуре хронического диализа, уровни IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, GM-CSF, IFN-y и TNF-a в плазме крови увеличивались. При этом содержание IL-10 понижалось после трех лет диализа до уровня, статистически не различающегося с нормой.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на следующих конференциях: III международный молодежный медицинский конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения - 2009», 13 международная Пущинская школа-конференция «Биология - наука 21 века» (28 сентября - 2 октября, 2009, Пущин о), 14-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 19 — 23 апреля 2010 года), 7 Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Молекулярная диагностика — 2010», 15-я Пущинская международная школа-конференция молодых ученых «Биология — наука XXI века» (Пущино, 18 — 22 апреля 2011 года).

Личный вклад автора в проведение исследования Лично соискателем были проведены: анализ литературы по теме исследования, планирование экспериментов, получение основной части результатов, написание статей и подготовка докладов на конференциях; создание и проверка экспрессионных генетических конструкций, выделение и очистка белков, используемых в работе, получение фибрилл; приготовление препаратов для флуоресцентного анализа, МА1Л}1-ТОГ и ДНК-секвенировния также были выполнены соискателем. Кроме того, соискатель подготавливал образцы плазмы крови больных на гемодиализе и принимал участие в определении в них содержания цитокинов (совместно со старшим научным сотрудником НМЦММ на базе СПбГМУ им.акад.И.П.Павлова, к.м.н. К.А.Сысоевым), проводил статистическую обработку полученных результатов. Электронная микроскопия и исследование оптических свойств Р2М и его производных, в частности фибриллярных форм, проводились совместно с сотрудниками Лаборатории структурной динамики, стабильности и фолдинга белков НИИ цитологии РАН.

Финансовая поддержка работы. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 0904-00788), программы "Ведущие научные школы РФ" (НШ-1961.2008.4) и Минобрнауки (ГК от 09.03.2010 №0274011 5141).

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 172 страницах машинописного текста, состоит из введения, четырех глав и списка литературы, в котором приведено 213 источника, в том числе 7 работ на русском языке и 206 на иностранных языках. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 22 рисунками.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Поляков, Дмитрий Степанович

4. Выводы

1. Разработан эффективный способ получения очищенного Р2М человека.

4. Показано, что исходный природный р2М, рекомбинантный Р2М и укороченные производные обладают фибриллогенной активностью.

6. С целью визуализации стадий фибриллогенеза на клеточных культурах получена генетическая конструкция и рекомбинантный белок слияния Р2М — зеленый флуоресцентный белок. Показано, что очищенный рекомбинантный белок слияния формирует видимые в микроскоп фибриллярные структуры.

7. Обнаружено, что фибриллы Р2М обладают способностью неспецифически сорбировать иммуноглобулины О кролика.

8. Показано, что в плазме крови больных, получающих процедуру хронического гемодиализа, повышена концентрация 1Ь-2, 1Ь-4, 1Ь-6, 1Ь-8, 1Ь-10, СМ-СББ, Шч[-у, таБ-а.

9. Установлено, что содержание 1Ь-10 в плазме крови больных на хроническом гемодиализе возрастает в первые 3 года терапии и далее снижается до нормальных значений.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата медицинских наук, Поляков, Дмитрий Степанович, Санкт-Петербург

1. Брок Й. Получение препаратов иммуноглобулинов. Иммунологические методы / Г. Фримель. М.: Медицина, 1987. С. 390.

2. Ермоленко В.М. Хроническая почечная недостаточность. Нефрология: Руководство для врачей /Под ред. И.Е. Тареевой. М.: Медицина, 2000. С. 633-634.

3. Покровский В.И., Киселев О.И., Черкасский Б.Л. Прионы и прионные болезни. М.: Издательство РАМН, 2004. С. 21-67.

4. Харбоу Н., Ингильд А. Иммунизация, выделение иммуноглобулинов, определение титра антител. Руководство по клиническому электрофорезу/М.: Мир, 1977. С. 200-205.

5. Хаитов P.M., Игнатьева Г.А., Сидорович И.Г. Иммунология / М.: Медицина, 2000. С. 126-131.

6. Шавловский М.М. Молекулярные и генетические основы этиопатогенеза амилоидозов. Медицинский академический журнал. 2010. Том 10. №4. С. 63-81.

7. Шило В., Денисов А. Позднее осложнение программного гемодиализа: бета 2-микроглобулиновый амилоид оз. Врач: Ежемесячный научно-практический и публицистический журнал. № 6. 2002. С. 7-12.

8. Akemann W., Dinesh Raj С., Knopfel Т. Functional Characterization of Permuted Enhanced Green Fluorescent Proteins Comprising Varying Linker Peptides. Photochem. Photo-biol. № 2. 2001. 356-363.

9. Allard J.C., Artze M.E., Porter G., Ghandur-Mnaymneh L., de Velasco R., Pe'rez G.O. Fatal destructive cervical spondyloarthropathy in two patients on long-term dialysis. Am. J. Kidney Dis. № 19. 1992. 81-85.

10. Ancsin J.B. Amyloido,genesis: historical and modern observations point to heparan sulfate proteoglycans as a major culprit. Amyloid. № 10. 2003. 6779.

11. Anderson B.F., Nance S.L., Pearson T.W., Anderson N.G. Specific antiserum staining of two-dimensional electrophoresis patterns of human plasma proteins immobilized on nitrocellulose. Electrophoresis. 1982. V.3. P. 135-142.

12. Andrews.B.T., Schoenfish A.R., Roy M., Waldo G., Jennings P.A. The rough energy landscape of superfolder GFP is linked to the chromophore. J Mol Biol. № 2. 2007. 476^190.

13. Anfinsen C., Scheraga H. Experimental and theoretical aspects of protein folding. Adv. Prot. Chem. 1975. № 29. 205-300.

14. Argiles A., Garcia-Garcia M., Derancourt J., Mourad G., Demaille J.G. Beta 2 microglobulin isoforms in healthy individuals and in amyloid deposits. Kidney Int. № 48. 1995. 397-^405.

15. Assenat H., Calemard E., Charra B., Laurent G., Terrat J.C., Vanel T., Hemodialyse, syndrome du canal carpien et substance amyloid. Nouv. Presse. Med. №24. 1980. 1715.

16. Ausubel F.M., Brent R., Kingston R.E., Moore D.D., Seidman J.G., Smith J.A., Struhl K. Current Protocols in Molecular Biology. 1989. John Wiley & Sons, New York.

17. Balant E., Marshall C.F., Sprague S.M. Role of interleukin-6 in b2-microglobulin-induced bone mineral dissolution. Kidney International. Vol. 57.2000.1599-1607.i

18. Bardin T., Vasseur M., de Vernejoul M.C., Raymond P., Lafforgue B., Judith C., Zingraff J., Kuntz D. Prospective study of articular involvement in patients on hemodialysis for 10 years. Rev. Rhum. Mai. Osteo-artic. № 55. 1988. 131-133.

19. Bardin T., Zingraff J., Shirahama T., Noe'l L.H., Droz D., Voisin M.C., Drueke T., Dryll A., Skinner M., Cohen A.S. Hemodialysis-associated amyloidosis and b2-microglobulin. Clinical and immnohistochemical study. Am. J. Med. № 83. 1987. 419-424.

20. Bastiaens P.I., Pepperkok R. Observing proteins in their natural habitat: the living cell. Trends Biochem. Sci. № 12. 2000. 631-637.

21. Bellotti Y., Chiti F. Amyloidogenesis in its biological environment: challenging a fundamental issue in protein misfolding diseases. Current Opinion in Structural Biology. № 18. 2008. 771-779.

22. Bellotti V., Stoppini M., Mangione P., Sunde M., Robinson C., Asti L., Brancaccio D., Ferri G., Beta2-microglobulin can be refolded into a native state from ex vivo amyloid fibrils. Eur. J. Biochem. № 258. 1998. 61— 67.

23. Benz R.L., Siegfried J.W., Teehan B.P. Carpal tunnel syndrome in dialysis patients: Comparison between continuous ambulatory peritoneal dialysis and hemodialysis populations. Am J Kidney Dis. № 11. 1988. 473-476.

24. Berggard I., Beam A.G. Isolation and properties of a low molecular weight B2-globulin occurring in human biological fluids. J. Biol. Chem. № 243. 1968.4095-4103.

25. Bertolini D.R., Nedwin G.E., Bringman T.S., Smith D.D., Mundy G.R. Stimulation of bone resorption and inhibition of bone formation in vitro by human tumor necrosis factors. Nature. № 319. 1986. 516—518.

26. Bindi P., Chanard J., Destructive spondyloarthlopaty in dialysis patients: an overview. Nephron. № 55. 1990. 104- 109.

27. Biondi R.M., Baehler P.J., Reymond C.D., Veron M. Random insertion of GFP into the cAMP-dependent protein kinase regulatory subunit from Dictyostelium discoideum. Nucleic Acids Res. № 21. 1998. 4946-4952.

28. Bjorkman P.J., Saper M.A., Samraoui B., Bennett W.S., Strominger J.L., Wiley D.C. Structure of the-human class-I histocompatibility antigen, HLA-A2. Nature. 1987. № 329. P. 506-512.

29. Brancaccio D., Gallieni M., Niwa T., Braidotti P., Coggi G. Ultrastructural localization of advanced glycation end products and beta2-microglobulin in dialysis amyloidosis. J Nephrol. № 13. 2000. 129-136.

30. Buxbaum J. N. Animal models of human amyloidoses: Are transgenic mice worth the time and trouble? FEBS Letters 2009. Vol. 583. P. 2663-2673.

31. Campistol J.M., Sole M., Munoz-Gomez J., Lopez-Pedret J., Revert L. Systemic involvement of dialysis-amyloidosis. Am J Nephrol. 1990. №10. P. 389-396.

32. Canet D., Sunde M., Last A.M., Miranker A., Spencer A., Robinson C.V., Dobson C.M. Mechanistic studies of the folding of human lysozyme and the origin of amyloidogenic behavior in its diseaserelated variants. Biochemistry. 1999. 38. 6419-6427.

33. Cavaillon J.M., Poignet J.L., Fitting C., Delons S. Serum interleukin-6 in long-term hemodialyzed patients. Nephron. 1992. 60. P. 307-313.

34. Cerini C., Peyrot V., Gamier C., Duplan L., Veesler S., Le Caer J.P.,

35. Bernard J.P., Bouteille H., Michel R., Vazi A. Biophysical characterization of lithostathine. J. Biol. Chem. 1999. 274. 22266-22274;

36. Chalfie M., Tu Y., Euskirchen G., Ward W.W. GFP as a Marker for Gene Expression. Science. 1994. 263. 802-805.

37. Chanard J., Bindi P., Lavaud S., Toupance O., Maheut IT., Lacour F. Carpal tunnel syndrome and type of dialysis membrane. Br. Med. J. 1989. 298. 867- 868.

38. Charra B., Calemard E., Uzan M., Terrat J.C., Vanel T., Laurent G. Carpal tunnel syndrome, shoulder pain and amyloid deposits in longterm hemodialysis patients. Proc. Eur. Dial. Transpl. Assoc. 1984. 21. 291-295.

39. Charra B., Calemard E., Laurent G. Chronic renal failure treatment duration and mode: their relevance to the late dialysis periarticular syndrome. Blood Purif. 1988. 6. 117- 124.

40. Chaudhury, C., Mehnaz, S., Robinson, J. M., Hayton, W. L., Pearl, D. K., Roopenian, D. C. Anderson, C. L. The major histocompatibility complex-related Fc receptor forlgG (FcRn) binds albumin and prolongs its lifespan. J. Exp. Med. 2003. 197. 315-322.

41. Chiti F., Webster P., Taddei N., Clark A., Stefani M., Ramponi G., Dobson C.M. Designing conditions for in vitro formation of amyloid protofilaments and fibrils. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1999, 96: 3590-3594;

42. Comenzo R.L. Amyloidosis. Curr Treat Options Oncol 2006.; 7 (3): 225236.

43. Conway K.A., Harper J.D., Lansbury P.T. Accelerated in vitro fibril formation by a mutant alfa-synuclein linked to early-onset Parkinson disease. Nat. Med. 1998. 4:1318-1320;

44. Comelis E, Bardin T., Faller B. et al: Rheumatic syndromes and beta 2-microglobulin amyloidosis in patients receiving long-term peritoneal dialysis. Arthritis Rheum. 1989. № 32. P. 785-788.

45. Cuatrecasas P., Wilchek M., Anfinsen C.B. Selective enzyme purufication by affinity chromatography. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1968. V. 61. P. 636643.

46. Cunningham B.A., Berggard I. Partial amino acid sequence of rabbit beta2-microglobulin. Science. 1975. 187. 1079-1080.

47. Damaschun G., Damaschun H., Gast K., Zirwer D. Proteins can adopttotally different folded conformations. J. Mol. Biol. 1999. 291. 715-725.

48. Danesh F.R., Klinkmann J., Yokoo H., Ivanovich P. Fatal cervical spondyloarthropathy in a hemodialysis patient with systemic deposition of b2-microglobulin amyloid. Am. J. Kidney Dis. 1999. 33. 563- 566.

49. Davison A.M. B2-microglobulin and amyloidosis: who is at risk? Nephrol. Dial. Transplant. 10 (Suppl. 10). 1995. S48-S51.

50. Di Raimondo C.R., Casey T.T., Di Raimondo C.V., Stone W.J. Pathologic fractures associated with idiopathic amyloidosis of bone in chronic hemodialysis patients. Nephron. 1986. 43. 22- 27.

51. De Smet R., Van Kaer J., van Vlem B. Toxicity of free p-cresol: a prospective and cross-sectional analysis. Clin Chem. 2003. 49. 470^478.

52. Drakesmith H., Townsend A. The structure and function of HFE. Bioessays. 2000. 22. 595-598.

53. Eanes E.D., Glenner G.G. X-ray diffraction studies on amyloid filaments. J. Histochem. Cytochem. 1968. 16. 673-677.

54. Fandrich M., Forge V., Buder K., Kittler M., Dobson C.M. Diekmann S. Myoglobin forms amyloid fibrils by association of unfolded polypeptide segments. Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 2003. 100. 15463-15468.

55. Fisher A.C., DeLisa M.P. Laboratory Evolution of Fast-Folding GFP using Secretory Pathway Quality Control. PLoSONE. 3. 2008.

56. Friedhoff P., von Bergen M., Mandelkow E.M., Davies P., Mandelkow E.A. Nucleated assembly mechanism of Alzheimer paired helical filaments. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95. 15712-15717.

57. Fukunishi S., Yoh K., Kamae S., Yoshiya S. Beta 2-microglobulin amyloid deposit in HLA-B27 transgenic rats. Mod Rheumatol. 2007. 17. 380-384.

58. Garbar C., Jadoul M., Noel H., van Ypersele de Strihou C. Histological characteristics of sternoclavicular b2-microglobulin amyloidosis and clues for its histogenesis. Kidney Int. 55. 1999. 1983-1990.

59. Garcia-Garcia M., Mourad G., Durfort M., Garcia-Valero J., Argiles A. Vascular involvement and cell damage in experimental AA and clinical beta(2)-microglobulin amyloidosis. Nephrol Dial Transplant. 2002. 8. 14501456.

60. Gates F.T. Ill, Coligan J.E., Kindt T.J. Complete amino acid sequence of rabbit beta 2-microglobulin. Biochemistry 1979. 18. 2267-2272.

61. Gejyo F., Homma N., Suzuki Y., Arakawa M. Serum levels of b2-microglobulin as a new form of amyloid protein in patients undergoing long-term haemodialysis. N. Engl. J. Med. 314. 1986. 585- 586.

62. Gejyo F., Narita I. Current clinical and pathogenetic understanding of b2-m amyloidosis in long-term haemodialysis patients. Nephrology. 8. 2003. S45-S49.

63. Gejyo F., Odani S., Yamada T., HonmaN., Saito H., Suzuki Y., Nakagawa Y., Kobayashi H., Maruyama Y., Hirasawa Y., Beta 2-microglobulin: a new form of amyloid protein associated with chronic hemodialysis. Kidney Int. 1986. Sep.30 (3). 385-390.

64. Ghetie V., Hubbard J. G., Kim J. K., Tsen M. F., Lee Y., Ward E. S. Abnormally short serum half-lives of IgG in beta 2-microglobulin-deficient mice. Eur. J. Immunol. 1996. 26. 690-696.

65. Goldsby R.A., Kindt T.J., Osborne B.A. Major histocompatibility complex. Kuby Immunology / Freeman W.H. 2007. P. 166-178.

66. Gorevic P.D., Casey T.T., Stone W.J., DiRaimondo C.R., Prelli F.C., Frangione B. Beta-2 microglobulin is an amyloidogenic protein in man. J. Clin. Invest. 76. 1985. 2425-2429.

67. Gowen M., Wood D.D., Ihrie E.J., McGuire K.B., Russell G.G. An interleukin-1 like factor stimulates bone resorption in vitro. Nature. 1983. 306. 378-380.

68. Hall P.W., Ricanati E.S., Vacca C.V. Characterization of human beta2-microglobulin by isoelectric focusing. Clin. Chim. Acta. 1977. 77. 37-42.

69. Harper J.D., Lansbury P.T. Jr. Models of amyloid seeding in Alzheimer's disease and scrapie: mechanistic truths and physiological consequences ofthe time-dependent solubility of amyloid proteins. Annu. Rev. Biochem. 1997. 66. 385—407.

70. Heim R., Cubitt A.B., Tsien R.Y. Improvement of green fluorescent protein by site-directed mutations. Nature. 1995. 373. 663-664.

71. Herbelin A., Urena P., Nguyen A.T., Zingraff J., Descamps-Latscha B. Elevated circulating levels of interleukin-6 in patients with chronic renal failure. Kidney Int. 1991. 39. P. 954-960.

72. Horwich A. Protein aggregation in disease: role for folding intermediates forming specific multimeric interactions. The J. of Clinical Investigations, 110(9):1221-1232, 2002.

73. Horowitz M.C. Cytokines and estrogen in bone. Anti-osteoporotic effects. Science. 1993. 260. 626-627.

74. Hudson A. W., Ploegh H.L. The cell biology of antigen presentation. Exp Cell Res. 2002. 272. P. 1-7.

75. Hughes R.D. Review of methods to remove protein-bound substances in liver failure. Int J Artif Org. 2002. 25. 911-917.

76. Inoue S., Kuroiwa M., Kisilevsky R. Basement membranes, microfibrils and beta amyloid fibrillogenesis in Alzheimer's disease: high resolution ultrastructural findings. Brain Res Brain Res Rev 1999. 29. 218-231.

77. Inoue S., Kuroiwa M., Ohashi K., Hara M., Kisilevsky R. Ultrastructural organization of hemodialysis-associated beta 2-microglobulin amyloid fibrils. Kidney Int. 1997. 52. 1543-1549.

78. Inoue S., Kuroiwa M., Tan R., Kisilevsky R. A high resolution ultrastructural comparison of isolated and in situ murine AA amyloid fibrils. Amyloid 1998. 5. 99-110.

79. Inoue S., Kuroiwa M., Saraiva M.J., Guimaraes A., Kisilevsky R. Ultrastructure of familial amyloid polyneuropathy amyloid fibrils: examination with high-resolution electron microscopy. J Struct Biol. 1998. 124. 1-12.

80. Israel E.J., Wilsker D.E, Hayes K.C., Schoenfeld D., Simister,N.E.1.creased clearance of IgG in mice that lack beta 2-microglobulin: possibleprotective role ofFcRn. Immunology. 1996. 89. 573-578.i

81. Ishimi Y., Miyaura C., Jin C.H., Akatsu T., Abe E., Nakamura Y., Yamaguchi A., Yoshiki S., Matsuda T., Hirano T., Kishimoto T., Suda T. IL-6 is produced by osteoblasts and induces bone resorption. J Immunol. 1990. 145. 3297-3303

82. Jacobs R, Glorieux G., Vanholder R. Interleukin/cytokine profiles in haemodialysis and in continuous peritoneal dialysis. Nephrol. Dial. Transplant. 2004. 19 Suppl 5. v41-v45.

83. Jain V.K., Cestero R.V., Baum J. Carpal tunnel syndrome in patients undergoing maintenance HD. JAMA. 1979. 242. 2868 2869.

84. Junghans R.P, Anderson C.L. The protection receptor for IgG catabolism is the beta2-microglobulin-containing neonatal intestinal transport receptor. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1996. 93. 5512-5516.

85. Kad N.M., Thomson N.H., Smith D.P., Smith D.A., Radford S.E. Beta(2)-microglobulin and its deamidated variant, N17D form amyloid fibrils with a range of morphologies in vitro. J. Mol. Biol. 2001. № 313. P. 559-571.

86. Kane J.F., Harley D.L. Formation of recombinant protein inclusion bodies in E. coli. Trends Biotech. 1988. 14. 95-101.

87. Kaizu Y., Kimura M., Yoneyama T. Interleukin-6 may mediate malnutrition in chronic hemodialysis patients. Am J Kidney Dis. 1998. 31. P. 93-100.

88. Kayed R., Bernhagen J., Greenfield N., Sweimeh K., Brunner H., Voelter W., Kapurniotu A. Conformational transitions of islet amyloid polypeptide (IAPP) in amyloid formation in vitro. J. Mol. Biol. 1999. 287. 781-796.

89. Kayed R.K., Glabe C.G. Conformation-Dependent Anti-Amyloid Oligomer Antibodies. Methods in enzymology. 2006. Vol. 413. P. 326-344.

90. Kelly J.W. The alternative conformations of amyloidogenic proteins and their multi-step assembly pathways. Curr. Opin. Struct. Biol. 1998. 8. 101-106.

91. Kelly J. W., Lunsbury P.T. A chemical approach to elucidate the mechanism of transthyretin 'and P-protein amyloid fibril formation. Amyloid. 1994. 1. 186-205.

92. Kenzora J.E. Dialysis carpal tunnel syndrome. Orthopedics. 1978. 1. 195-203.

93. Ketteler M., Koch K.M., Floege J. Imaging techniques in the diagnosis of dialysis-related amyloidosis. SeminDial. 2001. 14(2). P. 90-93.

94. Kihara M.5 Chatani E., Sakai M., Hasegawa K., Naiki H., Goto Y. Seeding-dependent maturation of p2-microglobulin amyloid fibrils at neutral pH. J. Biol. Chem. 2005. № 280. P. 12012-12018.

95. Kimmel P.L., Phillips T.M., Simmens S.J. Immunologic function and survival in hemodialysis patients. Kidney Int. 1998. 54. P. 236-244.

96. Kisilevsky R., Ancsip J.B., Szarek W.A., Petanceska S. Heparan sulfate as a therapeutic target in amyloidogenesis: prospects and possible complications. Amyloid. 2007. 14. 21-32.

97. Korenaga T., Yan J., Sawashita J., Matsushita T., Naiki H., Hosokawa M., Mori M., Higuchi K., Fu X. Transmission of Amyloidosis in Offspring of Mice with AApoAII Amyloidosis. American Journal of Pathology. 2006. Vol. 168. №3. 898-906.

98. Kuntz D., Naveau B., Bardin T., Drueke T., Treves R., Dryll A., Destmctive spondylarthlopaty in hemodialyzed patients. Anew syndrome. Arthritis Rheum. 1984. 27. 369- 375.

99. Kurihara N., Bertolini D., Suda T., Akiyama Y., Roodman D. IL-6 stimulated osteoclast-like multinucleated cell formation in long term human marrow cultures by inducing IL-1 release. J Immunol. 1990. 144. 4226— 4230,

100. Kusumoto Y., Lomakin A., Teplow D.B., Benedek G.B. Temperature dependence of amyloid beta-protein fibrillization. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. 95. 12277-12282.

101. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 1970. 227. 680-685.

102. Lansbury P.T. Jr., Kosik K.S. Neurodegeneration: new clues on inclusions. Chem Biol. 2000. 7(1). R9-R12.

103. Lansbury P.T. Jr. Structural neurology: are seeds at the root of neuronal degeneration? Neuron. 1997. 19. 1151-1154.

104. Leitner K., Ellinger A., Zimmer K.P., Ellinger I., Fuchs R. Localization of b2-microglobulin in the term villous syncytiotrophoblast. Histochem Cell Biol. 2002. 117. 187-193.

105. Levine H. III. Thioflavine T interaction with synthetic Alzheimer's disease b-amyloid peptides: detection amyloid aggregation in solution. Prot. Sci. 1993. № 2. Vol.3. P. 404-410.

106. Libetta C., De Nicola L., Rampino T., De Simone W., Memoli B. Inflammatory effects of peritoneal dialysis: evidence of systemic monocyte activation. Kidney Int. 1996. 49. P. 506-511.

107. Lieber C.M., Harper J.D., Lansbury P.T. Jr. Atomic force microscopic imaging of seeded fibril formation and fibril branching by the Alzheimer's disease amyloid-beta-protein.' Chem. Biol. 1997. 4. 951-959.

108. Linke R.P., Hampl H., Bartel-Schwarze S., Eulitz M., Beta 2-microglobulin, different fragments and polymers thereof in synovial amyloid in long-term haemodialysis. Biol. Chem. 1987. 368. 137- 144.

109. Linke R.P., Hampl H., Lobeck H., Ritz E., Bommer J., Waldherr R., Eulitz M. Lysine-specific cleavage of beta 2-microglobulin in amyloid deposits associated with haemodialysis. Kidney Int. 1989. 36. 675-681.

110. Linke R.P., Schâeffer J., Gielow P., Lindner P., Lottspeich F., Pluckthun A., Weiss E.H. Production of recombinant human beta2-microglobulin for scintigraphic diagnosis of amyloidosis in uremia and hemodialysis. Eur J Biochem. 2000. 267(3). 627-33.

111. Lippincott-Schwartz J., Snapp E., Kenworthy A. Studying protein dynamics in living cells. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2001. 2. 444-456.

112. Loughrey C.M., Young I.S., Lightbody J.H., McMaster D., McNamee P.T., Trimble E.R. Oxidative stress in haemodialysis. QJM87. 1994. P. 679683.

113. Madine J., Middleton D.A. Comparison of aggregation enhancement and inhibition as strategies for reducing the cytotoxicity of the aortic amyloid polypeptide medin. Eur Biophys J. 2010. 39(9). 1281-1288.

114. Maher E.R., Dutoit S.H., Baillod R.A., Sweny P., Moorhead J.F. Gastrointestinal complications of dialysis related amyloidosis. Br. Med. J. 1988. 297. 265-266.

115. Maruyama H., Gejyo F., Arakawa M. Clinical studies of destructive spondyloarthropathy in long-term hemodialysis patients. Nephron. 1992. № 61. P. 37^14.

116. Matsuo K., Nakamoto M., Yasunaga C., Goya T., Sugimachi K. Dialysis related amyloidosis of the tongue in long-term homodialysis patients. Kidney Int. 1997. 52. 832- 838.

117. Massry S.G., Coburn J.W. Guideline 10. p2-microglobulin amyloidosis. Clinical Practice Guidelines for Bone Metabolism and Disease in Chronic Kidney Disease .American Journal of Kidney Diseases. 2003. Vol. 42, Supplement 3. P. 1-202.

118. McGrath L.T., Douglas A.F., McClean E., Brown J.H., Doherty C.C., Johnston G.D., Archbold G.P. Oxidative stress and erythrocyte membrane fluidity in patients undergoing regular dialysis. Clin Chim Acta. 1995. 235. 179-188.

119. McParland V.J., Kad N.M., Kalverda A.P., Brown A., Kirwin-Jones P., Hunter M.G., Sunde M., Radford S.E. Partially unfolded states of p2-microglobulin and amyloid formation in vitro. Biochemistry. 2000. 39. 8735-8746.

120. Menaa C., Esser E., Sprague S.M. B2-Microglobulin stimulates osteoclast formation. Kidney International. 2008. 73. 1275-1281.

121. Merlini G., Bellotti V. Molecular mechanisms of Amyloidosis. N. Engl. J. Med. 2003. 349. 58'3-596.

122. Misteli T., Spector D.L. Applications of the green fluorescent protein in cell biology and biotechnology. Nat. Biotechnol. 1997. 15. 961-964.

123. Miyata T., Kawai R., Taketomi S., Sprague S.M. Possible involvement of advanced glycation end-products in bone resorption. Nephrol Dial Transplant. 1996. ll(Suppl 5). 54-57.

124. Miyata T., Sprague S.M. Advanced glycation of b2-microglobulin in the pathogenesis of bone lesions in dialysis-associated amyloidosis. Nephrol Dial Transplant 1996. 11. 86-90.

125. Miyata T., van Ypersele de Strihou C., Kurokawa K., Baynes J.W. Alterations in nonenzymatic biochemistry in uremia: origin and significance of "carbonyl stress" in long-term uremic complications. Kidney Int. 1999. 55. 389-399.

126. Moe S.M., Barrett S.A., Sprague S.M. b2-microglobulin stimulates osteoclastic mediated bone mineral dissolution from neonatal mouse calvariae. Calcium Reg Horm BoneMetab. 1992. 11. 302-306.

127. Moe S.M., Sprague S.M. b2-microglobulin induces calcium efflux from cultured neonatal mouse calvariae. Am J Physiol. 1992. 263. F540-F545.

128. Moody D.B., Besra G.S. Glycolipid targets of CD 1-mediated T-cell responses. Immunology. 2001. 104. 243-251.

129. Myers S.L., Jones S., Jahn T.R., Morten I.J., Tennent G.A., Hewitt E.W., Radford S.E. A systematic study of the effect of physiological factors on beta2-microglobulin amyloid formation at neutral pH. Biochemistry. 2006. №45. P.2311-2321.

130. Naugle K., Darby M.L., Bauman D.B., Lineberger L.T., Powers R. The oral health status of individuals on renal dialysis. Ann Periodontol. 1998. №3.P.197-205.

131. Niwa T., Miyazaki S., Katsuzaki T., Tatemichi N., Takei Y., Miyazaki T., Morita T., Hirasawa Y. Immunohistochemical detection of advanced glycation end products in dialysis-related amyloidosis. Kidney Int. 1995. 48. 771-778.

132. Niwa T., Sato M., Katsuzaki T., Tomoo T., Miyazaki T., Tatemichi N., Takei Y., Kondo T. Amyloid beta 2-microglobulin is modified with N epsilon-(carboxymethyl)lysine in dialysis-related amyloidosis. Kidney Int. 1996. 50. 1303-1309.,

133. Noel L.H., Zingraff J„ Bardin T., Atienza C., Kuntz D., Drueke T., Tissue distribution of dialysis amyloidosis. Clin. Nephrol. 1987. 27. 175— 178.

134. O'Callaghan C.A., Bell J.I. Structure and function of the human MHC class lb molecules HLA-E, HLA-F and HLA-G. Immunol Rev. 1998. 163. 129-138.

135. Odetti P., Cosso L., Pronzato M.A., Dapino D., Gurreri G. Plasma advanced glycosylation end-products in maintenance haemodialysis patients. Nephrol Dial Transplant. 1995. 10(11). P. 2110-2113.

136. Ohashi K., Hara M., Kawai R., Ogura Y., Honda K., Nihei H., Mimura N. Cervical discs are most susceptible to beta 2-microglobulin amyloid deposition in the vertebral column. Kidney Int. 1992. №41. R 1646-1652.

137. Ohashi K, Kawai R, Hara M, Okada Y, Tachibana S, Ogura Y: Increased matrix metalloproteinases as possible cause of osseoarticular tissue destruction in long-term haemodialysis and beta 2-microglobulin amyloidosis. Virchows Arch. 1996. 428. 37-46.

138. Ormo M., Cubitt A.B., Kallio K., Grosen L.A., Tsien R.Y., Remington J. Ciystal structure of the Aequorea victoria green fluorescent protein. Science. 1996. 273. 1392-1395.

139. Palestro C.J., Vega A., Kim C.K., Vallabhajosula S., Goldsmith S.J. Indium-Ill-labeled leukocyte scintigraphy in hemodialysis access-site infection. J NuclMed. 1990. № 31. P. 319-324.

140. Parkkila S., Parkkila A.K., Waheed A. Cell surface expression of HFE protein in epithelial cells, macrophages, and monocytes. Haematologica. 2000. 85. 340-345.

141. Pedelacq J.-D., Cabantous S., Tran T., Terwilliger T., Waldo G. Engineering and characterization of a superfolder green fluorescent protein. Nat. Biotech. 2006. 1. 79-88.

142. Pepys M.B., Booth D.R., Hutchinson W.L.: Amyloid P component: a critical review. Amyloid. 1997. 4. 274-295.

143. Pereira B.J., Shapiro L., King A.J., Falagas M.E., Strom J.A., Dinarello C.A. Plasma levels of IL-1 beta, TNF-a and their specific inhibitors in undialyzed chronic renal failure, CAPD and hemodialysis patients. Kidney Int. 1994. № 45. P. 890-896.

144. Pereira B.J., Snodgrass B.R., Hogan P.J., King A.J. Diffusive and convective transfer of cytokine-inducing bacterial products across hemodialysis membranes. Kidney Int. 1995. 47. P. 603-610.

145. Piazza R., Pierno M., Iacopini S., Mangione P., Esposito G., Bellotti V. Micro-heterogeneity and aggregation in beta2-microglobulin solutions: effects of temperature, pH, and conformational variant addition. Eur Biophys J. 2006. 5. 439-445.

146. Picken M. M. Amyloidosis—Where Are We Now and Where Are We Heading? Arch. Pathol. Lab. Med. 2010. Vol. 134. P. 545-551.

147. Prescott M., Nowakowski S., Nagley P., Devendish R.J. The length of polypeptide linker affects the stability of green fluorescent protein fusion proteins. Anal. Biochem. 1999. 2. 305-307.

148. Radford S.E., Gosal W.S., Piatt G.W. Towards an understanding of the structural molecular mechanism of (^-microglobulin amyloid formation in vitro. Biochim Biophys Acta. 2005. № 1753. P. 51 63.

149. Rochet J.C., Lanbury RT. Amyloid fibrillogenesis: themes and variations. Curr. Opinion in Struct. Biol. 2000. 10. 60-68.

150. Rokitansky C. Die speckige Leber. In Handbuch der speciellen pathologischen Anatomie. Ed. C. Rokitansky. Wien. Braumuller und Seidel. 1842.

151. Rysava R., Merta M., Tesar V., Lachmanovä J., Sulkovä S., Bläha J. Mediators of amyloidogenesis and cytokines in dialysis-related amyloidosis. Cas Lek Cesk. 2002. 26. 244-247.

152. Santos M., Clevers H., de Sousa M., Marx J.J. Adaptive response of iron absorption to anemia, increased erythropoiesis, iron deficiency, and iron loading in B2-microglobulin knockout mice. Blood. 1998. 91. 3059-3065.

153. Sanchez R., Praga M., Salas J.J.R., Araque A., Mazuecos A., Andres A., Rodicio J.L. Compressive myelopathy due to dialysis-associated amyloidosis. Nephron. 1993. 65. 463-465.

154. Selkoe D.J. Translating cell biology into therapeutic advances in Alzheimer's disease. Nature. 1999. 399. 23-31.

155. Sheikh-Hamad D., Ayus J.C. The patient with a clotted PTFE graft developing fever. Nephrol Dial Transplant. 1998. № 13. P. 2392-2393.

156. Shinoda T., Komatsu M., Aizawa T., Shirota T., Yamada T., Ehara T., Mizukami E. Intestinal pseudo-obstruction due to dialysis amyloidosis. Clin. Nephrol. 1989. 32. 284-289.

157. Sipe J.D., Cohen A.S.' History of the amyloid fibril. J. Struct. Biol. 2000. 130. 88-98.

158. Sprague S.M., Moe S.M. Clinical manifestations and pathogenesis of dialysis-related amyloidosis. SeminDial. 1996. 9. 360-369.

159. Stoppini M., Arcidiaco P., Mangione P., Giorgetti S., Brancaccio D., Bellotti V. Detection of fragments of beta2-microglobulin in amyloid fibrils. Kidney Int. 2000. 57. 349-350.

160. Stoppini M., Mangione P., Monti M., Giorgetti S., Marchese L., Arcidiaco P., Verga L., Segagni S., Pucci P., Merlini G., Bellotti V. Proteomics of beta2-microglobulin amyloid fibrils. Biochim Biophys Acta. 2005. 1753.23-33.

161. Sunde M., Blake C. The structure of amyloid fibrils by electron microscopy and X-ray diffraction. Adv. Protein Chem. 1997. 50. 123-159.

162. Takayama F., Miyazaki S., Morita T., Hirasawa Y., Niwa T. Dialysisrelated amyloidosis of the heart in long-term hemodialysis patients. Kidney Int. 2001. 59 (Suppl. 78). SI72- SI76.

163. Tennent G.A., Lovat L.B., Pepys M.B. Serum amyloid P component prevents proteolysis of the amyloid fibrils of Alzheimer disease and systemic amyloidosis. Proc Natl Acad Sci USA. 1995. 92. 4299-4303.

164. Teplow D.B. Structural and kinetic features of amyloid protein fibrillogenesis. Amyloid: Int. J. Exp. Clin. Invest. 1998. 5. 121-142.

165. Tysoe-Calnon V.A., Grundy J.E., Perkins S J. Molecular comparisons of the (3 2-microglobulin-binding site in class I major-histocompatibility-complex a -chains and proteins of related sequences. Biochem J. 1991. 277. 359-369.

166. Vanholder R., De Smet R., Lameire N. Protein-bound uremic solutes: the forgotten toxins. Kidney Int. 2001. 59 Suppl 78. S266-S270.

167. Varela M.P., Kimmel P.L., Phillips T.M. Biocompatibility of hemodialysis membranes: interrelations between plasma complement and cytokine levels. Blood Purif. 2001. 19. 370-379.

168. Ventura S., Villaverde A. Protein quality in bacterial inclusion bodies. Trends Biotechnol. 2006. 24. 179-185.

169. Vidal R., Frangione B., Rostagno A., Mead S., Revesz T., Plant G., Ghiso J. A stop-codon mutation in the BRI gene associated with familial British dementia. Nature. 1999. 399. 776-781.

170. Virchow R. Uber den Gang der amyloiden Degeneration. Archiv Path. Anat. Phisiol. Klin. Med. 1854. 8. 364-368.

171. Virchow R. Uber eine im Gehirn und Ruckenmark des Menschen aufgefundene Substanz mit der chemichen Reaction der Cellulose. Archiv Path. Anat. Phisiol. Klin. Med. 1854. 6. 135-138.

172. Waheed A., Grubb J.H., Zhou X.Y. Regulation of transferrin-mediated iron uptake by FIFE, the protein defective in hereditary hemochromatosis. Proc Natl Acad Sei U S A. 2002. 99. 3117-3122.

173. Wainwright S.D., Biro P.A., Holmes C.H. HLA-F is a predominantly empty, intracellular, TAP-associated MHC class lb protein with a restricted expression pattern. J.Immunol. 2000. 1. 319-328.

174. Wang C.R., Chen G.H., Newkirk M., Capra J.D., Mandy W.J. Biochemical properties of a novel rabbit thymocyte specific class I-like antigen. Mol. Immunol. 1988. 25. 945-952.

175. Ward W.W., Bokman S.H. Reversible denaturation of Aequorea green-fluorescent protein: physical separation and characterization of the renatured protein. Biochem. 1982. 21. 4535^1540.

176. Warren D.J., Otieno L.S. Carpal tunnel syndrome in patients on intermittent haemodialysis. Postgrad. Med. J. 1975. 51. 450-452.

177. Weinreb PH., Zhen W., Poon A.W., Conway K.A., Lansbury P.T. Jr. NACP, a protein implicated-in Alzheimer's disease and learning, is natively unfolded. Biochemistry. 1996. 35. 13709-13715.

178. Westermark P., Benson M.D., Buxbaum J.N. A primer of amyloid nomenclature. Amyloid 2007. 3. 179-183.

179. Wetzel R. Domain stability in immunoglobulin light chain deposition disorders. Adv. Protein. Chem. 1997. 50. 183-242.

180. Wood S.J., Wypych J., Steavenson S., Louis J.C., Citron M., Biere A.L. Alfa-Synuclein fibrillogenesis is nucleation-dependent. J. Biol. Chem., 1999. 274. 19509-19512.

181. Wyatt A., Yerbury J., Poon S., Dabbs R., Wilson M. The Chaperone Action of Clusterin and Its Putative Role in Quality Control of Extracellular Protein Folding. Adv. in Cane. Res. 2009. 104. 89-114.

182. Yamaguchi I., Hasegawa K., Takahashi N., Gejyo F., Naiki H. Apolipoprotein E inhibits the depolymerization of beta 2-microglobulin-related amyloid fibrils at a neutral pH. Biochemistry. 2001. 40. 8499-8507.

183. Yamamoto S., Gejyo F. Historical background and clinical treatment of dialysis-related amyloidosis. Biochimica et Biophysica Acta. 2005. 1753. 4-10.

184. Yamamoto S., Yamaguchi I., Hasegawa K., Tsutsumi S., Goto Y., Gejyo F., Naiki H. Glycosaminoglycans enhance the trifluoroethanol-induced extension of beta 2-microglobulinrelated amyloid fibrils at a neutral pH. J Am Soc Nephrol. 2004. 15. 126-133.

185. Zekanowski C., Religa D., GraffC., Filipek S., Kuznicki J. Genetic aspects of Alzheimer's disease. Acta Neurobiol Exp. 2004. 64. 19-31.

186. Zhang B., Une Y., Fu X., Yan J., Ge F.X., Yao J., Sawashita J., Mori M., Tomozawa H., Kametani F., Higuchi K. Fecal transmission of AA amyloidosis in the cheetah contributes to high incidence of disease. PNAS. 2008. 20. 7263-7268.

187. Zingraff J .J., Noel L.H., Bardin T., Atienza C., Zins B., Drueke T.B., Kuntz D. Beta 2-microglobulin amyloidosis in chronic renal failure. N Engl J Med. 1990. 323. 1070-1071.

Информация о работе

Поляков, Дмитрий Степанович
кандидата медицинских наук
Санкт-Петербург, 2011
ВАК 03.01.04

Диссертация

Фибриллогенез бета-2-микроглобулина и иммунологические изменения при гемодиализном амилоидозе - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы