Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции

Исаев, Николай Джучиевич

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции"

ИСАЕВ Николай Джучиевич

□03058652

ФЕНОТИПИЧЕСКИЙ И ГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ИЗОГЕННЫХ ВАРИАНТОВ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА С АЛЬТЕРНАТИВНЫМ УРОВНЕМ ЭКСПРЕССИИ ФАКТОРОВ ПАТОГЕННОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ

03 00 07 - микробиология 03 00 04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов - 2007

003058652

Работа выполнена в ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Научные руководители:

доктор биологических наук, профессор

кандидат биологических наук

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

доктор медицинских наук, профессор

Смирнова Нина Ивановна Заднова Светлана Петровна

Тараненко Татьяна Михайловна Швиденко Инна Григорьевна

Ведущая организация: ФГУЗ «Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт» Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека

Защита состоится «22.» Мс.А 2007 г в Ю часов на заседании диссертационного совета Д 208 078 01 по присуждению ученой степени доктора (кандидата) наук при ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб» (410005, г Саратов, ул Университетская, 46)

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»

Автореферат разослан «ib » {•■nju.ij^ 2007 г

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, старший научный сотрудник

Слудский А А

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Холера - опасное эпидемическое заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Vibrio cholerae. В процессе эволюции в пределах вида возникло три эпидемически опасных варианта с разными диагностическими свойствами- холерные вибрионы OI серогруппы классического и эльтор биоваров, а также холерные вибрионы 0139 серогруппы Характерной особенностью возбудителя холеры является постоянная смена места обитания чередование пребывания в инфицированном макроорганизме (в тонком кишечнике) с последующим существованием в природных экосистемах Смена бактериальной клеткой экологической ниши должна сопровождаться появлением у них новых биологических свойств, облегчающих их адаптацию к измененным условиям существования В этой связи одним из наиболее актуальных направлений современной микробиологии холеры являются исследования генетических систем возбудителя холеры, позволяющих им координировано перестраивать работу клетки для адаптации к меняющимся условиям окружающей среды В результате дифференциальной активности генов в бактериальных клетках может происходить изменение их фенотипа, обусловленное одновременным изменением продукции нескольких биологически активных веществ При этом два альтернативных уровня экспрессии генов могут определять два разных фенотипа клеток

Несмотря на множество публикаций о диапазоне изменчивости возбудителя холеры [Жуков-Вережников и др, 1966, Гончарова, Карасева, 1970, Адамов и др , 1971, Бароян, 1971, Урюпина и др , 1971, Воронежская и др , 1973, Вейде и др , 1975, Марамович и др , 1975, Дрожевкина и др , 1978, Сомова и др, 1978, Милютин и др, 1981, Адамов, Наумшина, 1984, Беляков, 1986, Гри-жебовский, 1997, Савельев, 1998, Подосинникова, 1993], интерес к этому вопросу значительно возрос в последние годы, поскольку появились новые подходы к более глубокому анализу фенотипической гетерогенности популяции, основанные на использовании геномных и протеомных технологий [Kan el al, 2004, Yildiz et al, 2004, Бухарин и др , 2005] Изменение под воздействием факторов окружающей среды состава популяции по продукции ключевых факторов патогенности может привести к понижению или повышению ее вирулентности, что имеет важное значение для изучения механизма развития эпидемического процесса при холере, одной из характерных особенностей которого является периодическая цикличность Весьма важным является также вопрос о выявлении сигналов внешней среды, определяющих смену доминирующего фенотипа популяции, обусловленную изменением метаболизма бактериальных клеток. Такие знания могут быть полезны как для более глубокого понимания эпидемиологической ситуации, так и для ее прогнозирования

MOB, Наумшина, 1984, Грижебовский, 1997, Wai et al, 1998, Yildiz et al, 1999, Yildiz et al, 2001, All et al, 2002] Наиболее значителен диапазон морфологической изменчивости холерных вибрионов биовара эльтор В посевах наряду с типичными прозрачными колониями (S форма) нередко встречаются шероховатые (R формы), а также складчатые или ругозные колонии Описана также и сцепленность ряда признаков, хотя имеющаяся информация по этому вопросу явно не достаточна Так, известно, что у шероховатых (R) форм, как правило, снижена чувствительность к диагностическим фагам, но повышена гемолитическая активность [Милютин и др, 1981]. Незадолго до начала нашей работы появились данные о том, что одним из значимых компонентов ругозных вариантов эльтор вибрионов является экзополисахарид или EPS (от англ exopolysacchande), расположенный на поверхности бактериальных клеток и обеспечивающий высокий уровень их устойчивости к различным повреждающим воздействиям окружающей среды [Yildiz et al, 2001, All et al, 2002] При этом клоны, продуцирующие экзополисахарид, менее подвижны по сравнению с гладкими или S вариантами [Yildiz et al., 2004] И совсем недавно [Yildiz et al, 2004, Beyhan et al, 2006] стало известно, что переключение синтеза экзопо-лисахарида в клетках холерных вибрионов эльтор обеспечивается регулятор-ными системами, которые контролируют активность различных генов, связанных с патогенностью и(или) персистентностью. В связи с этим встает вопрос о том, какова взаимосвязь между синтезом факторов вирулентности и персистен-ции7 Как изменяется метаболизм холерного вибриона при смене клеткой фенотипа7 Какие сигналы окружающей среды могут активировать этот процесс7 Влияет ли доминирующий фенотип популяции на ее вирулентность7

Для решения поставленных вопросов в качестве модельного объекта были взяты холерные вибрионы классического биовара, так как до настоящего времени не были предприняты попытки выявления причин фенотипической гетерогенности популяции этого возбудителя с использованием современных методов исследования Между тем изучение механизмов адаптации этого патогена к меняющимся условиям окружающей среды остается актуальным, поскольку классические вибрионы до сих пор сохранились в эндемичных по холере районах - Индии и Бангладеш [Nair et al, 2002, Safa et al, 2005] Несмотря на утрату ими в настоящее время пандемического потенциала, штаммы этого возбудителя являются одним из природных резервуаров генов вирулентности Об этом свидетельствует выделение в 1991-1994 гг в Бангладеш клинических штаммов холерного вибриона биовара эльтор, которые в результате горизонтального переноса генетической информации приобрели ряд генов возбудителя азиатской холеры - ген tcpA из острова патогенности VPI-1 и ген rstR из профага СТХ [Nair et al, 2002] Кроме того, высокий уровень продукции холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и других факторов вирулентности у холерных классических вибрионов по сравнению с вибрионами эльтор делают их наиболее удобным модельным объектом для исследования многих вопросов регуляции генной активности in vitro

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: выявление и изучение морфологических, биохимических и генетических особенностей изогенных клонов V cholerae классического биовара с альтернативным и одновременным изменением уровня продукции факторов патогенности и персистенции

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1 Изучить популяционный состав природных штаммов V cholerae классического биовара для выявления клонов с одновременным изменением нескольких свойств, определяющих вирулентность и (или) персистентность холерного вибриона

2 Провести сравнительный анализ морфологических, биохимических и генетических свойств двух фенотипически разных клонов модельного штамма V cholerae Дакка 35 с различным уровнем продукции экзополисахарида (EPS), холерного токсина (Тох), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар), а также подвижности (Mot)

3 Выделить, очистить и изучить моносахаридный состав экзополисаха-ридного слоя, обнаруженного на поверхности клеток EPS+ Тох" Нар+ Mot+ модельного штамма V cholerae Дакка 35

4. Получить белковые «портреты» двух фенотипически разных изогенных вариантов штамма V cholerae Дакка 35 (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS" Тох+ Нар" Mot"), провести их сравнительный анализ и выяснить роль отдельных белков в адаптации клеток к меняющимся условиям внешней среды

5 Выявить сигналы внешней среды, вызывающие смену фенотипа клеток в популяции V cholerae классического биовара

6 При экспериментальной инфекции определить вирулентность двух фенотипически разных (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS" Тох+ Нар" Mot") субпопуляций V cholerae

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

При изучении популяционного состава 76 штаммов холерного вибриона классического биовара впервые выявлены штаммы с координированным альтернативным уровнем экспрессии четырех факторов патогенности и персистенции

Впервые на поверхности клеток классических холерных вибрионов обнаружен экзополисахаридный (EPS) слой в клетках, определяющий мутность колоний Установлена его функциональная роль, которая состоит в защите клеток от воздействия стрессовых факторов внешней среды

Впервые установлено, что при повышении рН среды до 9,0 происходит альтернативное изменение уровня экспрессии генов, определяющих продукцию экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности в популяции клеток EPS" Тох+ Нар" Mot"

Впервые проведен сравнительный протеомный анализ двух изогенных фенотипически разных вариантов (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS" Тох+ Нар" Mot") модельного штамма V cholerae Дакка 35 и показана дифференциальная про-

дукция около 60 белков Установлено, что координированное изменение клеточного метаболизма, адекватное условиям внешней среды, определяет степень вирулентности бактериальной популяции

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

По результатам работы составлены методические рекомендации «Получение штаммов холерного вибриона классического биовара с координированным изменением экспрессии факторов патогенности и персистенции», которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 7 от 27 июня 2006 г ) и утверждены директором института 29 июня 2006 г. Предложенный методический прием позволяет использовать один и тот же штамм холерного вибриона классического биовара для получения различных биологически активных веществ, изменяя условия его культивирования

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" 8 штаммов холерного вибриона классического биовара с альтернативным уровнем экспрессии трех генов, связанных с вирулентностью, и 2 штамма V cholerae Дакка 35, утративших способность продуцировать холерный токсин за счет внедрения транспозона TnphoA (KmR) в участок хромосомы, определяющий синтез этого фактора патогенности Указанные штаммы могут быть использованы в фундаментальных исследованиях, направленных на изучение механизмов регуляции генов вирулентности

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ IIA ЗАЩИТУ

1 Популяция ряда природных штаммов V cholerae классического биовара содержит клоны двух типов, различающихся по морфологии колоний (прозрачные или Т от англ translucent и мутные или О от англ opaque), продукции холерного токсина (Тох+ и Тох"), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар+ и Нар") и подвижности (Mot+ и Mot") Одновременное и альтернативное изменение фенотипических свойств двух типов клонов не связано с различиями в составе изученных структурных и регуляторных генов

2 На поверхности клеток О Тох" Нар+ Mot+ модельного штамма V cholerae Дакка 35 присутствует экзополисахаридный слой, определяющий морфологию колоний и состоящий из рамнозы, глюкозы, галактозы и гексоза-мина Продукция экзополисахарида (EPS) в клетках возбудителя холеры повышает их устойчивость к действию осмотического и оксидативного стресса

3 По данным протеомного анализа фенотипически различные клетки, присутствующие в популяции V cholerae Дакка 35, различаются по экспрессии около 60 разных белков Клетки с фенотипом EPS+ Тох" Нар+ Mot+ продуцируют значительно больше мембранных и цитоплазматических белков, защищающих их от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды

4 рН является сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистенции у холерных классических вибрионов При повышении рН среды до 9,0 в популяции клеток EPS" Тох+ Нар" Mot" происходит одновременное изменение уровня экспрессии

генов, определяющих продукцию экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности

5 Фенотипическая структура популяции штамма влияет на уровень вирулентности возбудителя для кроликов-сосунков

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2004, 2005 гг), на третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004 г), на Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004 г)

ПУБЛИКАЦИИ: По теме диссертации опубликовано 10 научных работ

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использованных источников, включающего 222 цитируемые работы, из них 187 зарубежных и 35 отечественных. Общий объем диссертации составляет 149 страниц Текст иллюстрирован 12 таблицами и 29 рисунками

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы. В работе использовали 78 штаммов V cholerae классического биовара, выделенных на разных территориях и хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий «Микроб» Применяли традиционные и современные микробиологические, биохимические, генетические, молекулярно-биологические и электронно-микроскопические методы Культивирование бактерий, определение морфологии колоний, подвижности и продукции растворимой гемагглютинин/протеазы проводили общепринятыми методами Продукцию холерного токсина определяли с помощью радиального пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) на плотной среде [Bramucei, Holmes, 1978, Шагинян, Маракуша, 1983] и иммуноферментным методом GM] ELISA [Svennerholm, Wiklung, 1983] В качестве положительного контроля использовали очищенный препарат холерного токсина, полученный из штамма V cholerae 569В Биологическая активность холерного токсина была определена в кожной пробе [Creig, 1965] Вирулентность исследуемых штаммов определяли соответственно путем внутрикишечного заражения крольчат-сосунков по методу N К Dutta и М К Habbu(1955)

Выделение геномной ДНК, рестрикцию ДНК нуклеазами, электрофорез нативных молекул ДНК и ДНК-ДНК гибридизацию осуществляли в соответствии с описанными рекомендациями [Маниатис и др, 1984] Полимеразную цепную реакцию (ПЦР) с использованием специфических праймеров ставили

по D V. Singh et al (2001) Секвенирование ДНК проводили на приборе «ABI RPISM® 3100 Genetic Analyzer» (США), с использованием программ Data Collection V 1 1 и DNA Sequencing Analyser v 3 7 Компьютерный анализ нук-леотидных последовательностей осуществляли в программе MEGA v 3 1 Электрофорез белков проводили по методу U К Laemmli et al (1970) Присутствие полисахаридов выявляли окрашиванием ионами серебра ПААГ гелей после окончания электрофореза Выделение экзополисахаридного материала с поверхности клеток осуществляли по модифицированной методике, описанной у L R Evans, A Linker (1973) Наличие токсин-корегулируемых пилей адгезии выявляли, используя иммуноблоттинг, по методике H Towbin et al (1979)

Содержание углеводов определяли с 0,25% раствором тимола в концентрированной серной кислоте Калибровочную кривую строили, используя раствор глюкозы с интервалом концентраций 10 мкг/мл (от 10 до 100 мкг/мл) Измерения осуществляли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 509 им Изучение поверхностных структур клеток проводили методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии [Mudd, Anderson, 1942] Тонкослойную хроматографию (ТСХ) проводили по стандартной методике [Захарова, Косенко, 1982] на пластинах Kieselgel-бО (MERCK)

Двумерный форез проводили по методу OTarrell (1975) с модификациями Масс-спектры получали на MALDI-TOF-масс-спектрометре Reflex III (Bruker, США) Идентификацию белков по наборам значений масс пептидов после трипсинолиза проводили с использованием опции Peptide Fingerprint программы Mascot (Matrix Science, США) При поиске привлекали базы данных NCBI (http //www nebí nlm nih gov) Анализ различий в двумерных гелях, масс-спектры и идентификацию белков по наборам значений масс пептидов после трипсинолиза проводили совместно с сотрудниками Центра протеомных исследований ГУ НИИ БМХ РАМН (г Москва)

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 1. Выявление в природных популяциях V. cholerae клонов с различной экспрессией нескольких факторов вирулентности. В гетерогенной популяции холерных вибрионов большой интерес представляют клоны, отличающиеся от типичных вариантов по нескольким свойствам Появление таких клонов может быть связано с согласованным изменением экспрессии ряда генов, что является одним из важных механизмов адаптации этого патогена к меняющимся условиям среды обитания В этой связи на первом этапе работы был изучен популяционный состав 76 природных штаммов V cholerae классического биовара относительно морфологии колоний, поскольку имелись данные о том, что морфологические изменения могут быть сцеплены с другими феноти-пическими свойствами В результате фенотипического анализа популяций было выявлено две группы штаммов В первую вошли 65 штаммов (или 86 %), характеризующихся однородным популяционным составом и состоящих из типичных гладких прозрачных колоний Вторая группа была представлена 11

штаммами {14 %), в популяции которых были обнаружены как прозрачные, так и мутные колонии, находящиеся в S форме В отличие от раннее описанных гладких (S) и шероховатых (R) форм холерного вибриона биовара эльтор прозрачные колонки классических вибрионов были обозначены как Т (от англ translucent), а мутные как О (от англ opaque) Выявленные изменения в морфологии колоний могут сопровождаться изменениями и других признаков, включая свойства опредепяющие вирулентность популяции В этой связи Т- и О-колонии 11 штаммов были проверены на продукцию ими ключевых и дополнительных факторов патогенности холерного токсина (СТ), токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP), растворимой гемагглютишш'протеазы (Нар), а также на подвижность (Mot) В результате было выявлено семь штаммов (Дакка 35, 9361, В1307, 104/63, 26, 2 Огава, 34), у которых вариабельность морфологии котонин сопровождалась изменением продукции ряда факторов патогенности (табл 1) Поскольку О-влрианты имели более высокий уровень продукции растворимой гемагглютннин/протеазы и большую подвижность, их фенотип был обозначен как О Нар МоГ, а фенотип Т-вариантов обозначили как Т Нар~ Mot' Наибольший интерес представляли популяции штаммов Дакка 35, 9361 и В1307, содержащие колонии двух типов, которые отличались друг от друга не только по морфологии продукции растворимой гемагглготи-нин/протеазы подвижности, но и по уровню синтеза холерного токсина По данным реакции пассивного иммунного гемолиза (РПИГ) Т колонии указанных штаммов продуцировали холерный токсич (Тох* фенотип) тогда как О клоны не синтезировали этот белок (Тох~ фенотип) Поскольку различия между колониями по четырем свойствам были наиболее выражены у штамма Дакка 35, то именно этот штамм был выбран в качестве модельного для последующих экспериментов Использование более чувствительного по сравнению с РПИГ им-муноферменгного метода GM| ELISA подтвердило выявленное различие в продукции СТ между Т и О вариантами штамма Дакка 35 и показало, что Т Тох' Нар" МоГ клоны продуцировали 13 0 мм/мл СТ В то же время оказалось, что в культуральном супернатанте клонов О То\ Пар" Mot* также содержится СТ хотя и в не значительном количестве - 0,03 мкг/мл Анализ биологической активности токсина Т Тох+ Нар Mot" клонов Дакка 35 в кожной пробе по Крейгу показал что максимальное разведение супернатанта, давшее положительную реакцию, составляет 1 4000 тогда как у взятого в качестве положительного контроля высокотоксигенного штамма I iholerae 569В этот показатель был 1 3200 Из этих данных следует, что энтеротокенн штамма Дакка 35 обладает типичной для холерного токсина биологической активностью

Таким образом, обнаруженные в популяции штамма Дакка 35 два типа колоний действительно различаются одновременным (или координированным) изменением четырех фенотипичесих свойств морфологии колонии продукции холерного токсина и растворимой геманлютинин/нротеазы, а также подвижности При этом Т Тох* Пар Mot клоны Дакка 35 продуцировали токсина больше чем известный высокотоксшенный иламм I choleiae 569В

Вследствие того, что у многих штаммов происходит координированное изменение синтеза CT и токсин-корегулируемых пилей адгезии (TCP) за счет участия в этом процессе общих регуляторных генов toxR и toxT, можно было ожидать, что для Т Тох+ Нар" МоГ клонов штамма Дакка 35 будет характерна и повышенная продукция TCP Однако, оказалось, что по данным иммуноблот-тинга и реакции самоагглютинации клоны Т Тох+ Нар" МоГ и О Тох Нар+ Mot+ не имеют существенных различий в экспрессии TCP, несмотря на четкие различия в продукции СТ.

Таблица 1

Фенотипические свойства двух типов колоний различных штаммов холерного вибриона классического биовара

Штамм ФЕНОТИП

Продукция токсина по данным РПИГ (в мм)* Подвижность (в мм)** Продукция Нар (в мм)*** Морфология колоний

Дакка 35 5 3 2 Т

0 10 4 О

9361 3 5 1 Т

0 15 5 О

В-1307 1 3 6 т

0 10 3 о

104/63 2 12 1 г

0 12 4 о

26 0 7 4 т

2 7 4 о

2 Огава 0 10 1 т

0 5 15 о

34 0 3 1 т

0 6 4 О

4 0 10 5 т

0 0 5 о

76(1-2) 0 3 0 т

0 3 3 о

107/63 0 15 1 т

0 10 1 о

Дакка 33 0 0 10 т

0 7 10 о

Примечание *- ширина зоны иммунного гемолиза, **- радиус ореола вокруг макроколоний на 0,3 % ЬВ-агаре, ***- величина зоны просветления вокруг макроколоний на агаре, содержащем 10 % обезжиренного молока, Т- прозрачные, О-мутные колонии

Поскольку СТ является одним из ключевых факторов вирулентности холерных вибрионов, большой интерес представляет изучение механизма, определяющего различный уровень продукции этого белка у Т и О клонов В этой связи вначале методом ПЦР было определено наличие в хромосоме Т Тох4 Нар" Mot и О Тох" Нар4 Mot+ клонов девяти известных генов, кодирующих и контролирующих СТ Оказалось, что сравниваемые варианты не отличаются друг от друга по набору генов, расположенных как на мобильных генетических элементах (ctxA, zot, асе - профаг СТХф, toxl, tcpP, lepH - остров патогенности VPI-I), так и в эволюционно древней части хромосомы (loxR, hapR, luxO) Последующее определение числа копий структурных (ctxAB) и регуляторных (toxR) генов, участвующих в синтезе СТ, с помощью ДНК-ДНК гибридизации показало, что в хромосомах Т Тох+ Нар" МоГ и О Тох" Нар4" Mot* клонов штамма Дакка 35, также как и в хромосоме у V choletae 569В присутствует по две копии оперона ctxAB и по одной копии гена loxR Следовательно, высокая продукция СТ у Т-клонов штамма V cholerae Дакка 35 по сравнению с О-клонами не связана с увеличением числа копий генов, участвующих в его биосинтезе

Поскольку возможной причиной различной экспрессии СТ изогенными вариантами могли быть изменения в структурном гене ctxA либо в его промоторе, то на следующем этапе работы было проведено их секвенирование Результаты секвенирования гена ctxA и его промотора показали их идентичную структуру у Т Тох+ Нар" Mot" и О Тох" Нар+ Mot+ клонов Однако при анализе секвенированного промотора гена ctxA были получены новые и важные сведения о числе тандемных повторов TTTTGAT Поскольку активация транскрипции оперона ctxAB происходит за счет связывания регуляторного белка ToxR или ТохТ [Miller, Mekalanos, 1988, Prouty et al, 2005] с указанными тандемны-ми повторами, то уровень транскрипции указанных генов находится в прямой зависимости от их копийности Оказалось, что в отличие от многих природных штаммов, имеющих 1-3 копии последовательности TTTTGAT, в промоторной области штамма Дакка 35, независимо от его фенотипа, содержится шесть таких повторов Эти данные представляют значительный интерес, поскольку объясняют необычно высокую экспрессию генов ctxAB у токсигенных клонов штамма Дакка 35, сопоставимую с таковой у известного штамма 569В, содержащего в промоторной области оперона ctxAB восемь копий названной последовательности [Miller, Mekalanos, 1984] Таким образом, отсутствие различий в составе изученных генов между изогенными клонами Т Тох+ Нар" Mot" и О Тох* Нар' Mot4 модельного штамма позволяет полагать, что популяционная вариабельность экспрессии структурных генов ctxAB могла возникнуть в рез>ль-тате изменения регуляторного механизма транскрипции этого белка

2 Выявление у V cholerae классического биовара экзополисахарид-ного слоя и его биохимический анализ. Для установления причины изменения морфологии колоний V cholerae Дакка 35 на первом этапе было проведено электронно-микроскопическое изучение поверхности Т Тох4 Нар Mot" и О Тох" Нар4 Mot4 клонов Было обнаружено, что О Тох" Нар4 Mot4 клетки окружены рыхлым слоем, который отсутствует у Т То\+ Нар" Mot" клонов (рис 1)

Одной из возможных причин появления дополнительно слоя может быть продукция клетками этого типа белков внешней мембраны и (или) экзополнеа-харида. В этой связи был проведен сравнительный анализ I и (5 клонов не только модельного ипа.мма Дакка 35, но я пяти других - 26, 2 Огава, В-53-5, В i307, 104/63 ]л 9361. li результате было выяснено, что вклад белков внешней мембраны в изменение морфологии колоний либо незначителен, либо эти поверхностные структуры не участвуют н указанном событии.

Для проверки полисах аридной природы рыхлого слоя, обнаруженного из поверхности клеток О 'Гох Нар' Mol* штамма Дакка 35 с помощью электронной микроскопии, были получены цельноклеточные лизать) Г Гох I !ар Mot и О Тох Нар Mot бактерий, обработанные протеиназой К. которая расщепляет белки, но не разрушает липополнеахарид. При проведении гель-электрофореза и последующем окрашивании нонами серебра гелевых пластин на поверхности О колоний всех семи исследуемых штаммов Г chokrae впервые было обнаружено присутствие четко выраженного экзополисахарнлиого слоя, который образовывал мощную зону в нижней части электрофоре граммы (рис, 2).

рис I. электронно-микроскопическое изучение поверхности t тох hap mot (а) п о тох li ар то! ¡о) клеток штамма v cholerae дакка 35. стрел кой показан дополнительный слой, присутствующий на внешней поверхности о тох hap mot* кл^ок клона, увеличение кЗО ООО (негативное контрастирование),

1 2 3 А Ь 6 7 е 9 10 11 12 13 14

Рис. 2, Выявлениеэкзопояисахарида в прозрачных СП и мутных (О) клонах различных штаммов Г choleniç классического 5повара при окраске пластины селя после электрофореза ионами серебра: ! - Дакка 35 (Т). 2 - Дакка 35 (О); 3 -9361 (Т). 4 - 9361 (О); 5. 6 - 104<63 {О}, 7 - В-1307 (Т). 8 - H1307 (О); 9, 10 ■ В-53-5 (О). И -26 (О). 12-26 (Т); 13-2 Огава (Т), 14 - 2 Огава (О).

Проведение сравнительного анализа моносахарид но го состава экзопояисахарида О Тох Пар' Mot клонов методом ТСХ при сравнении со стандартными углеводными метчиками показало присутствие в нем рамнозы, глюкозы, галактозы, гекеозамнна. В то же время н аналогичном препарате, полученном из клеток Т Тох Нар Mot , указанные сахара присутствовали лишь в следовых количествах {рис. 3). Сопоставление выявленного нами состава экзопояисахарида у классических вибрионов с таковым вибрионов эльтор указывает на некоторые различия между ними. Согласно данным F.H. Yildiz. G. K.Sclioolnik (V999) в составе FPS руг от hi.ix колоний Г choteraе биовара эльтор. помимо глюкозы и гадактслы входят глю козами н и манноза, отсутствующие в EPS классических вибрионов.

Выявление нами экзополисах аридно го слоя у О колоний нескольких штаммов Г cháleme классического бповара послужило основанием для определения наличия в их хромосоме генов vps. кодирующих биосинтез этого полисахарида. В результате ГЩР-апализа было обнаружено, что в бактериальном геноме как О. так и Г клоп он содержится участок ДНК. идентичный фрагменту с груктурного гена vps О [Ali ét ai. 2000] входящего в состав vps области эльтор вибрионов. Присутствие структурного гена vpsO в хромосоме обоих типов клонов как модельного, так и других изученных штаммов позволяет говорить, что различия п их морфологии обусловлены или отсутствием или слабой экспрессией vps генов у Т-кюнов. Па основе полученных нами данных о выраженной продукции экзополисахйрида мутными колониями Г choierag классического б повара фенотип О-клоиов был обозначен как EPS . а Т-клонов как EPS .

I 2. 3

Рис. 3. Моносахаридный состав экзополисахаридного материала, выделенного с поверхности Т Тох' Нар" Mot" и О Тох Нар' Mot* клонов V. cholerae Дакка 35: I- метчики моносахаридов (сверху вниз - рамноза, ксилоза, рибоза, манноза, глюкоза, галактоза). 2- Т Тох* Нар Mot клон, 3-О Тох" Нар* Mot* клон.

Для выяснения функциональной роли EPS мы провели сравнительный анализ резистентности EPS' Тох" Нар* Mot* и EPS Тох* Нар Mot клонов модельного штамма Дакка 35 к действию неблагоприятных условий внешней среды, взяв в качестве стрессовых факторов высокие концентрации NaCl (2,5 M), а также перекись водорода (20 мМ). В результате было обнаружено, что EPS' Тох Нар* Mot+ клоны действительно более устойчивы к действию высоких концентраций соли и перекиси водорода по сравнению с EPS Тох* Нар" МоГ вариантами (рис. 4). Эти сведения позволяют говорить о том, что продукция экзополисахарида холерными вибрионами классического биовара происходит, видимо, в результате их адаптации к неблагоприятным воздействиям окружающей среды,

юооо

О мин

5 мт 7 mvh

время «оэлеистаин

15 МИН

Рис 4. Устойчивость изогенных вариантов Г cholerae Дакка 35 EPS Тох' I lap Mot и EPS* Тох I lap Mot* к действию 20 мМ перекиси водорода.

3. Протеомньш анализ двух изогенных вариантов V cholerae классического биовара с альтернативной экспрессией генов вирулентности и персистентности и выявление сигналов внешней среды, определяющих координированное изменение их экспрессии. Поскольку у холерных вибрионов координированная экспрессия факторов вирулентности и персистенции контролируется несколькими глобальными регуляторными системами, которые в зависимости от условий окружающей среды «включают» или «выключают» биосинтез различных белков, то изменение активности генов вирулентности может сопровождаться изменением уровня экспрессии генов, кодирующих белки с другими функциями В этой связи мы провели протеомный анализ клеток EPS" Тох+ Нар" Mot" и EPS+ Тох" Нар+ Mot+ V cholerae Дакка 35 При компьютерном анализе протеомных карт, полученных в Центре протеомных исследований ГУ НИИ БМХ РАМН (г Москва), было выявлено, что смена фенотипа колоний сопровождается изменением экспрессии 60 генов, кодирующих белки с различными функциями, из которых 13 было идентифицировано (табл 2) Установлено, что в клетках EPS1 Тох" Нар+ Mot+ репрессируется синтез 28 белков и индуцируется синтез 32 белков, тогда как в клетках EPS" Тох+ Нар" Mot" наблюдается обратная картина репрессируемый в EPS+ клетках синтез 28 белков индуцируется, а индуцируемый синтез 32 белков репрессируется (рис. 5)

Среди белков, синтез которых индуцируется в клетках EPS+ Тох" Нар+ Mot+, большой интерес представляют мембранные (OmpU и ТоЮ) и цитоплаз-матические (с метилтрансферазной активностью или с антиоксидантными функциями) белки, которые обеспечивают защиту клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды

Таким образом, данные, полученные с помощью протеомного анализа, свидетельствуют о глобальном изменении клеточного метаболизма при изменении фенотипа изучаемых клонов V cholerae

Следующий этап работы был посвящен выявлению сигналов внешней среды, вызывающих комплексные изменения в экспрессии факторов вирулентности и персистенции В результате было установлено, что при повышении рН среды до 9,0 в популяции клеток EPS" Тох+ Mot" Нар" происходит альтернативное изменение уровня экспрессии генов, определяющих продукцию экзопо-лисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности, что приводит к смене их фенотипа (табл 3) Из этого следует, что рН окружающей среды является одним из сигналов, вызывающих переключение активности генов, кодирующих экзополисахарид, холерный токсин, растворимую гемаггшотинин/протеазу, а также подвижность Биологическая функция выявленного одновременного изменения нескольких свойств холерного вибриона заключается, по-видимому, в том, что благодаря работе переключающего механизма популяция вибрионов получает возможность сохраняться при изменении окружающих ее условий

Рис, 5. Двумерный электрофорез в полиакрил амид ном геле EPS Тох Mol 1 i ар (Л) и LPS Тох Mot4 Нар" (К) клонов 1' choleras Дакка 35: 62.63,65 - NADH-оксидаза; 125,127,130 - фосфоенШпируваткарбокЙкиназа; 273 - белок внешней мембраны ToiC; 280,288 - ал анин дегидрогеназа; 500,541,566 - OmpU: 5 13-, 51 7 иммуногенный белок; 5 I 8 порино-подобный белок внешней мембраны OmpT; 658 к и ело ро до-нечу вст в ите л ьная NAD(P)I I нитрор еду ¡стаза; 709 ан-тиоксидант, семейства AhjiOTsat; 709 метилтрансфераза.

Смена популяционного состава штамма должна, видимо, привести к изменению уровня его вирулентности Для проверки этого предположения были проведены эксперименты по внутрикишечному заражению кроликов-сосунков клетками модельного штамма с разным фенотипом При введении 107 клеток V cholerae Дакка 35 EPS" Тох+ Нар" Mot" в кишечник кроликов все инфицированные животные погибали через 24-48 ч При вскрытии во всех случаях наблюдалась выраженная типичная холерогенная реакция - перерастяжение толстого кишечника прозрачной бесцветной или опалесцирующей жидкостью Параллельно отмечалось растяжение тонкого кишечника полупрозрачным содержимым Все это свидетельствовало о развитии типичной экспериментальной холерной инфекции и указывало на вирулентность клона EPS" Тох+ Нар" Mot"

Таблица 2

Интенсивность белковых пятен идентифицированных белков в EPS" Тох+ Нар" Mot" и EPS+ Тох" Нар+ Mot+ клонах штамма V cholerae Дакка 35

Обозначение белка в базе данных NCBI Название белка Расчетная масса, Да Соотношение интенсивности белковых пятен EPS" клон / EPS+ клон

125 Фосфоенолпируват карбоксикиназа 59806 7,540

127 9,619

130 14,644

280 Аланиндегидроге-наза 39814 11,424

288 5,538

513 Иммуногенный белок 35233 10,968

518 Порино-подобный белок внешней мембраны ОтрТ 37145 4,882

62 ИАЛН-оксидаза 61874 0,175

63 0,113

65 0,033

256 Белок внешней мембраны То1С 47722 0,310

500 Белок внешней мембраны Отри 36624 0,076

541 0,152

566 0,355

658 Кислородо-нечувствительная 1ч!АБ(Р)Н нитротре-дуктаза 24063 0,155

791 Фрагмент Отри 36624 0,287

841 Неизвестный консервативный белок 13127 0,244

517 Иммуногенный белок 35233 0,150/0

709 Антиоксидант, семейства АПрСЛ^а 22847 0/0,113

Метилтрансфераза 23322

Таблица 3

Фенотипические свойства EPS" Тох+ Mot" Нар" клонов различных штаммов V cholerae классического биовара после культивирования их на средах с рН 9,0

Штаммы V cholerae Свойства

Продукция токсина по данным РПИГ (в мм)* Подвижность (в мм)**> Продукция протеазы (в мм)*** Наличие экзополисах аридного слоя

Дакка 35 EPS-исходный 5 5 2 -

Дакка 35 EPS" (рН9) 1 12 4 +

Дакка 35 EPS+ исходный 0 12 4 +

2 Огава EPS" исходный H 0 2 1 -

2 Огава EPS" (РН9) 11 О 5 3 +

2 Огава EPS+ исходный H О 5 3 +

9361 EPS" исходный H О 12 1 -

9361 EPS" (РН9) II О 16 4 +

9361 EPS+ исходный H О 16 4 +

В1307 EPS-исходный H О 15 1 -

В1307 EPS" (РН9) II43 20 3 +

В1307 EPS+ исходный II О 20 4 +

Примечание *- ширина зоны иммунного гемолиза, **- радиус ореола вокруг макроколоний на 0,3 % ЬВ-агаре, *** -величина зоны просветления вокруг макроколоний на агаре содержащем 10 % обезжиренного молока, н о — не определяли

Иная картина инфекционного процесса у кроликов отмечалась при их заражении клетками ЕР8+ Тох" Нар+ Мо1+ Ни в одном случае не наблюдали развития холерогенного синдрома У животных толстый и тонкий кишечник был незначительно растянут мутной жидкостью (иногда с кровью), что характерно для слабовирулентных штаммов, вызывающих развитие энтеропатогенного синдрома, связанного с реализацией у нетоксигенных штаммов других факторов патогенности Тем не менее, среди изолированных колоний, полученных

после рассева содержимого кишечника на плотные среды, фенотип 6,0 % (от общего числа проверенных колоний) был очень сходен с таковым клонов EPS" Тох+ Нар" Mot"

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые показано, что морфологические различия между двумя типами клонов, присутствующих в популяции модельного штамма V cholerae, обусловлены разным уровнем продукции клетками впервые обнаруженного экзополисахарида (EPS), состоящего из рамнозы, глюкозы, галактозы и гексозамина Повышение продукции клетками экзополисахарида, определяющего мутность формирующих ими колоний, сопровождается одновременным изменением у них трех свойств - репрессией синтеза холерного токсина, усилением продукции растворимой гемаггтотинин/протеазы и увеличением подвижности Снижение в клетках продукции экзополисахарида ведет к формированию типичных (прозрачных) по морфологии колоний, у которых происходит одновременное и альтернативное изменение указанных свойств Проведенный сравнительный протеомный анализ двух фенотипически разных изогенных вариантов холерного вибриона показал дифференциальную экспрессию около 60 разных белков При этом установлено, что синтез экзополисахарида в клетках сопровождается продукцией мембранных и цитоплазматических белков, обеспечивающих, как и EPS, защиту клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды Смена фенотипа клеток в популяции холерного вибриона приводит к изменению ее вирулентности Популяция клеток EPS" Тох+ Нар" Mot" - вирулентна, а популяция клеток EPS+ Тох" Нар+ Mot+ — слабовирулентна Главная роль в регулировании вирулентности популяции может принадлежать трансмембранному сенсорному белку (белкам), который улавливает изменения в окружающей среде и передает эту информацию генам, от активности которых зависит синтез либо факторов патогенности, либо факторов персистенции Выявление механизма и факторов, индуцирующих альтернативный уровень экспрессии генов вирулентности, является одним из перспективных направлений дальнейших исследований в этом направлении Получение таких сведений позволит прогнозировать развитие эпидемической ситуации Кроме того, обнаружение в популяции природных штаммов фенотипически разных клонов, характеризующихся альтернативным уровнем продукции указанных белков и полисахарида, создает основу для разработки системы управления структурой популяции, что позволяет использовать один и тот же штамм для получения различных биологически активных веществ, меняя условия его выращивания

выводы

1. В результате комплексного фенотипического анализа 76 клинических штаммов V cholerae классического биовара впервые выявлены штаммы, гетерогенность популяции которых проявляется в присутствии двух типов клеток (Т Тох+ Нар" Mot" и О Тох" Нар+ Mot+), отличающихся между собой по морфологии, продукции холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности

2. Согласно данным ПЦР-анапиза и ДНК-ДНК-гибридизации между двумя фенотипически разными вариантами модельного штамма V cholerae Дакка 35 (Т Тох+ Нар" Mot" и О Тох" Нар+ Mot+) отсутствуют различия в составе изученных генов, кодирующих (ctxA, zot, асе, hapA, vpsO) и контролирующих (toxR, toxT, tcpP, tcpH, hapR, luxO) синтез экзополисахарида, холерного токсина и растворимой гемагглютинин/протеазы Нуклеотидные последовательности гена ctxA, кодирующего синтез холерного токсина, и его промотора были идентичны у изогенпых клонов Дакка 35

3 С помощью биохимического анализа поверхностных структур клеток двух фенотипически разных вариантов холерного вибриона классического биовара у О Тох" Нар+ Mot+ клонов впервые выявлено присутствие значительного количества экзополисахаридного слоя, определяющего морфологию колоний Экзополисахарид V cholerae классического биовара повышает устойчивость клеток к действию осмотического и оксидативного стресса.

4 Впервые проведен сравнительный протеомный анализ двух фенотипически разных вариантов модельного штамма V cholerae Дакка 35, показавший дифференциальную экспрессию около 60 различных белков Установлено, что, в отличие от клонов EPS" Тох+ Нар" Mot", в вариантах EPS+ Тох" Нар+ Mot+ репрессируется синтез 28 белков и индуцируется синтез 32 белков

5 У EPS+ Тох" Mot+ Нар+ вариантов бактериальной популяции V cholerae Дакка 35 установлена повышенная экспрессия генов, связанных с синтезом мембранных (OmpU и ToIC) и цитоплазматических (белки с метилтрансфераз-ной активностью или с антиоксидантными функциями) белков, обеспечивающих защиту клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды

6 Показано, что pH является сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистенции у холерных классических вибрионов При повышении pH среды до 9,0 в популяции клеток EPS" Тох+ Mot" Нар" происходит альтернативное изменение уровня экспрессии экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности

7 Смена фенотипа клеток в популяции модельного штамма холерного вибриона классического биовара приводит к изменению его вирулентности При экспериментальном моделировании инфекционного процесса показано, что популяция клеток EPS" Тох+ Нар" Mot" вирулентна, тогда как популяция клеток EPS+ Тох" Нар+ Mot+ - слабовирулентна

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1 Исаев Н Д, Заднова С П, Смирнова Н И Фазовые вариации у возбудителя холеры // Тез докл IX Всерос научно-практ конф «Молодые ученые в медицине» Казань, 2004 С 128-129

2 Заднова С П , Топорков А В , Исаев Н Д Фенотипический анализ штамма Vibrio cholerae Дакка 35 Огава, имеющего гетерогенную популяцию // Жури микробиол -2004 -№3-С 86-88

3 Заднова С П Исаев Н Д, Коннов Н П Захарова Т Л Смирнова Н И Биохимический анализ двух фенотипически различных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка 35 OI // Проблемы особо опасных инфекций Саратов, 2004-Вып 1(87) -С 42-45

4 Заднова С П Исаев Н Д, Смирнова Н И Вариабельность биохимических и генетических свойств штамма Vibrio cholerae Дакка 35 // Сбтез III съезда Вавиловского об-ва генетиков и селекционеров России «Генетика в XXI веке современное состояние и перспективы развития» - М - 2004 -Т 1 -С 381

5 Заднова С П Исаев Н Д , Смирнова Н И Сравнительное изучение белкового состава у токсигенных и нетоксигенных клонов штамма Vibrio cholerae Дакка 35 //Сб тезисов I Междунар Конференц "Молекулярная медицина и биобезопасность" 26-28 октября 2004 г Москва, С 80-81

6 Исаев Н Д, Лозовский Ю В , Заднова С П , Смирнова Н И Популяцион-ная неоднородность природных штаммов Vibrio cholerae классического биовара координированное изменение морфологии колоний, подвижности, токсигенности и ферментативных свойств // Проблемы особо опасных инфекций Саратов, 2005 -Вып 1(89) -С 43-46

7 Кузнецов О С , Заднова С П , Исаев Н Д, Смирнова Н И , Коннов Н П Изучение морфологии колоний Vibrio cholerae Дакка 35 методами растровой и трансмиссионной электронной микроскопии // Тез Докладов XIV Российского симпозиума по растровой-электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел РЭМ' 2005 Черноголовка (30 мая-3 июня 2005), С 261

8 Заднова С П , Исаев Н Д , Смирнова Н И Экзополисахаридный слой холерных вибрионов классического биовара обнаружение биохимический анализ и функциональная значимость // Сб материалов проблемной комиссии "Холера и патогенные для человека вибрионы" Ростов-на-Дону, 2005 Выпуск 18 С 92-94

9 Заднова С П, Исаев Н Д, Кутейкин-Тепляков К Б , Тихонова О В , Торо-пыгин И Ю , Арчаков А И , Смирнова Н И Протеомный анализ двух изо-генных вариантов Vibrio cholerae классического биовара с альтернативной экспрессией генов вирулентности // Журн микробиол — 2006 — №3 -С 11-16

10 Исаев Н.Д, Заднова С П , Смирнова Н И Влияние условий среды на координированное переключение генов патогенности и персистенции у холерного вибриона // Сб матер проблемной комиссии «Холера и патогенные для человека вибрионы». — 2006 — Вып 19 — С 69-71

ИСАЕВ Николай Джучиевич

03 00 07 - микробиология 03 0 0 04 - биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Подписано в печать 28 03 2007 Печать офсетная Бумага офсетная Гарнитура Тайме Формат 60x84 1/16 Уст-печ л 1 Уч-изд л 1 _Тираж 105 экз Заказ 287_

«Темпус»

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Исаев, Николай Джучиевич

СПИСОК ПРИНЯТЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ И СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. ОСНОВНЫЕ ФАКТОРЫ ПАТОГЕННОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ У ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ.

1.1.1. Основные факторы патогенности V. cholerae.

1.1.2. Факторы перснстенцнн.

1.2. УЧАСТИЕ РАЗЛИЧНЫХ ГЛОБАЛЬНЫХ РЕГУЛЯТОРНЫХ СИСТЕМ В ГЕНЕТИЧЕСКОМ КОНТРОЛЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПАТОГЕННОСТИ И ПЕРСИСТЕНЦИИ У ВОЗБУДИТЕЛЯ ХОЛЕРЫ.

1.2.1 Регуляторная система quorum sensing.

1.2.2. Негативная регуляция продукции факторов патогенности.

1.2.3. Регуляторный механизм координированного переключения генов, кодирующих факторы вирулентности и перснстенцнн.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Бактериальные штаммы.

2.2. Питательные среды и реактивы.

2.3. Методы.

2.3.1. Культивирование штаммов.

2.3.2. Определение продукции холерного токсина.

2.3.3. Определение продукции ферментов: растворимой гемагглютннин/протеазы и фосфолнпазы.

2.3.4. Определение подвижности.

2.3.5. Элсктрофоретнческий анализ.

2.3.6. Выявление присутствии полисахаридов.

2.3.7. Иммуноблоттннг.

2.3.8. Двумерный электрофорез и определение массы полученных пептидов

2.3.9. Выделение экзополисахарида.

2.3.10. Количественное определение углеводов.

2.3.11. Тонкослойная хроматография и высоэффектнвпая жидкостная хроматография.

2.3.12. Выделение хромосомной ДНК.

2.3.13. Электронно-микроскопический анализ холерных вибрионов.

2.3.14. Блот-гибридизация.

2.3.15. ПЦР-тестирование.

2.3.16. Определение вирулентности и холерогенности изучаемых штаммов

2.3.17. Секвенирование.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

ГЛАВА 3. ВЫЯВЛЕНИЕ В ПРИРОДНЫХ ПОПУЛЯЦИЯХ V. CHOLERAE КЛОНОВ С РАЗЛИЧНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ НЕСКОЛЬКИХ ФАКТОРОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ.

3.1. Исследование популяционного состава природных штаммов V. cholerae классического биовара.

3.2. Культуральпые и биохимические свойства морфологически разных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35.

3.3. Изучение генетических свойств двух фепотипичсскн разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35.

ГЛАВА 4. ВЫЯВЛЕНИЕ У V. CHOLERAE КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА ЭКЗОПОЛИСАХАРИДНОГО СЛОЯ И ЕГО БИОХИМИЧЕСКИЙ АНАЛИ

4.1. Сравнительное электронно-микроскопическое изучение поверхности Т Тох+ Нар" Mot" и О Тох" Нар+ Mot+ клопов V. cholerae Дакка 35.

4.2. Определение углеводного состава экзополисахаридного слоя и изучение его функциональной роли у модельного штамма Дакка 35.

ГЛАВА 5. ПРОТЕОМНЫЙ АНАЛИЗ ДВУХ ИЗОГЕННЫХ ВАРИАНТОВ К CHOLERAE КЛАССИЧЕСКОГО БИОВАРА С АЛЬТЕРНАТИВНОЙ ЭКСПРЕССИЕЙ ГЕНОВ ВИРУЛЕНТНОСТИ И ПЕРСИСТЕНТНОСТИ И

ВЫЯВЛЕНИЕ СИГНАЛОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ, ОПРЕДЕЛЯЮЩИХ КООРДИНИРОВАННОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ИХ ЭКСПРЕССИИ.

5.1. Протеомный анализ изогенных EPS" Тох+ Нар" МоГ и EPS+ Тох~ Нар+ Mot+ вариантов штамма V. cholerae Дакка 35.

5.2. Выявление сигналов внешней среды, вызывающих координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистентности.

5.3. Популяционная изменчивость изогенных вариантов штамма Дакка 35 в условиях in vitro и in vivo.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции"

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Холера - опасное эпидемическое заболевание, вызываемое токсигенными штаммами Vibrio cholerae. В процессе эволюции в пределах вида возникло три эпидемически опасных варианта с разными диагностическими свойствами: холерные вибрионы 01 серогруппы классического и эль-тор биоваров, а также холерные вибрионы 0139 серогруппы. Характерной особенностью возбудителя холеры является постоянная смена места обитания: чередование пребывания в инфицированном макроорганизме (в тонком кишечнике) с последующим существованием в природных экосистемах. Смена бактериальной клеткой экологической ниши должна сопровождаться появлением у них новых биологических свойств, облегчающих их адаптацию к измененным условиям существования. В этой связи одним из наиболее актуальных направлений современной микробиологии холеры являются исследования генетических систем возбудителя холеры, позволяющих им координировано перестраивать работу клетки для адаптации к меняющимся условиям окружающей среды. В результате дифференциальной активности генов в бактериальных клетках может происходить изменение их фенотипа, обусловленное одновременным изменением продукции нескольких биологически активных веществ. При этом два альтернативных уровня экспрессии генов могут определять два разных фенотипа клеток.

Несмотря на множество публикаций о диапазоне изменчивости возбудителя холеры [Жуков-Вережпиков Н.Н. с соавт., 1966; Гончарова Н.С., Карасева З.Н., 1970; Адамов А.К. с соавт., 1971; Бароян О.В., 1971; Урюпипа Н.В. с соавт., 1971; Воронежская Л.Г. с соавт., 1973; Вейде А.А. с соавт., 1975; Марамович А.С. с соавт., 1975; Дрожевкина М.С. с соавт., 1978; Сомова А.Г. с соавт., 1978; Милютин

В.Н. с соавт., 1981; Адамов А.К., Наумшипа М.С., 1984; Беляков В.Д., 1986; Гри-жебовский Г.М., 1997; Савельев В.Н., 1998; Подосинникова Л.С., 1993], интерес к этому вопросу значительно возрос в последние годы, поскольку появились новые подходы к более глубокому анализу фенотипической гетерогенности популяции, основанные на использовании геномных и протеомных технологий [Кап В. et al., 2004; Yildiz F.H. et al., 2004; Бухарин O.B. с соавт., 2005]. Изменение под воздействием факторов окружающей среды состава популяции по продукции ключевых факторов патогенности может привести к понижению или повышению ее вирулентности, что имеет важное значение для изучения механизма развития эпидемического процесса при холере, одной из характерных особенностей которого является периодическая цикличность. Весьма важным является также вопрос о выявлении сигналов внешней среды, определяющих смену доминирующего фенотипа популяции, обусловленную изменением метаболизма бактериальных клеток. Такие знания могут быть полезны как для более глубокого понимания эпидемиологической ситуации, так и для ее прогнозирования.

К настоящему времени накоплены многочисленные данные, свидетельствующие о присутствии в природной популяции холерных вибрионов клонов, отличающихся от типичной формы возбудителя холеры по какому-либо одному признаку [Урюпииа Н.В. с соавт., 1971; Сомова А.Г. с соавт., 1978; Адамов А.К., Наумшипа М.С., 1984; Грижебовский Г.М., 1997; Wai S.N. et al., 1998; Yildiz F.H. et al., 1999; Yildiz F.H. et al., 2001; Ali A. et al., 2002]. Наиболее значителен диапазон морфологической изменчивости холерных вибрионов биовара эльтор. В посевах наряду с типичными прозрачными колониями (S форма) нередко встречаются шероховатые (R формы), а также складчатые или ругозные колонии (р). Описана также и сцепленность ряда признаков, хотя имеющаяся информация по этому вопросу явно не достаточна. Так, известно, что у шероховатых (R) форм, как правило, снижена чувствительность к диагностическим фагам, но повышена гемолитическая активность [Милютин В.Н. с соавт., 1981]. Незадолго до начала нашей работы появились данные о том, что одним из значимых компонентов ругозных вариантов эль-тор вибрионов является экзополисахарид или EPS (от англ. exopolysaccharide), расположенный на поверхности бактериальных клеток и обеспечивающий высокий уровень их устойчивости к различным повреждающим воздействиям окружающей среды [Yildiz F.H. etal., 2001; Ali A. et al., 2002]. При этом клоны, продуцирующие экзополисахарид, менее подвижны по сравнению с гладкими или S вариантами [Yildiz F.H. et al, 2004]. И совсем недавно [Yildiz F.H. et al., 2004; Beyhan S. et al, 2006] стало известно, что переключение синтеза экзополисахарида в клетках холерных вибрионов эльтор обеспечивается регуляторными системами, которые контролируют активность различных генов, связанных с патогенностью и (или) перси-стентностью. В связи с этим встает вопрос о том, какова взаимосвязь между синтезом факторов вирулентности и персистенции? Как изменяется метаболизм холерного вибриона при смене клеткой фенотипа? Какие сигналы окружающей среды могут активировать этот процесс? Влияет ли доминирующий фенотип популяции па ее вирулентность?

Для решения поставленных вопросов в качестве модельного объекта были взяты холерные вибрионы классического биовара, так как до настоящего времени не были предприняты попытки выявления причин фенотипической гетерогенности популяции этого возбудителя с использованием современных методов исследования. Между тем изучение механизмов адаптации этого патогена к меняющимся условиям окружающей среды остается актуальным, поскольку классические вибрионы до сих пор сохранились в эндемичных по холере районах - Индии и Бангладеш [Nair G.B. et al., 2002; Safa A. et al., 2005]. Несмотря на утрату ими в настоящее время пандемического потенциала, штаммы этого возбудителя являются одним из природных резервуаров генов вирулентности. Об этом свидетельствует выделение в 1991-1994 гг. в Бангладеш клинических штаммов холерного вибриона биовара эльтор, которые в результате горизонтального переноса генетической информации приобрели ряд генов возбудителя азиатской холеры - ген tcpA из острова патоген-ности VPI-1 и ген rstR из профага СТХ [Nair G.B. et al., 2002]. Кроме того, высокий уровень продукции холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии и других факторов вирулентности у холерных классических вибрионов по сравнению с вибрионами эльтор делают их наиболее удобным модельным объектом для исследования многих вопросов регуляции генной активности in vitro.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ: выявление и изучение морфологических, биохимических и генетических особенностей изогенных клонов V. cholerae классического биовара с альтернативным и одновременным изменением уровня продукции факторов па-тогенности и персистенции.

ОСНОВНЫЕ ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

1. Изучить популяционный состав природных штаммов V. cholerae классического биовара для выявления клонов с одновременным изменением нескольких свойств, определяющих вирулентность и(или) персистентность холерного вибриона.

2. Провести сравнительный анализ морфологических, биохимических и генетических свойств двух фенотипически разных клонов модельного штамма V. cholerae Дакка 35 с различным уровнем продукции экзополисахарида (EPS), холерного токсина (Тох), растворимой гемагглютинин/протеазы (Нар), а также подвижности (Mot).

3. Выделить, очистить и изучить моносахаридный состав экзополисахарид-ного слоя, обнаруженного на поверхности клеток EPS+ Тох" Нар+ Mot+ модельного штамма V. cholerae Дакка 35.

4. Получить белковые «портреты» двух фенотипически разных изогенных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS- Тох+ Нар-Mot"), провести их сравнительный анализ и выяснить роль отдельных белков в адаптации клеток к меняющимся условиям внешней среды.

5. Выявить сигналы внешней среды, вызывающие смену фенотипа клеток в популяции V. cholerae классического биовара.

6. При экспериментальной инфекции определить вирулентность двух фенотипически разных (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS" Тох+ Нар" Mot") субпопуляций V. cholerae.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА РАБОТЫ

Впервые на поверхности клеток классических холерных вибрионов обнаруX жен экзополисахаридный (EPS) слой в клетках, определяющий мутность колоний.

Установлена его функциональная роль, которая состоит в защите клеток от воздействия стрессовых факторов внешней среды.

Впервые проведен сравнительный протеомный анализ двух изогенных фено-типически разных вариантов (EPS+ Тох" Нар+ Mot+ и EPS- Тох+ Нар" Mot") модельного штамма V. cholerae Дакка 35 и показана дифференциальная продукция около 60 белков. Установлено, что координированное изменение клеточного метаболизма, адекватное условиям внешней среды, определяет степень вирулентности бактериальной популяции.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ

По результатам работы составлены методические рекомендации «Получение штаммов холерного вибриона классического биовара с координированным изменением экспрессии факторов патогенности и персистенции», которые одобрены Ученым Советом РосНИПЧИ «Микроб» (протокол № 7 от 27 июня 2006 г.) и утверждены директором института 29 июня 2006 г. Предложенный методический прием позволяет использовать один и тот же штамм холерного вибриона классического биовара для получения различных биологически активных веществ, изменяя условия его культивирования.

Депонированы в Государственной коллекции патогенных бактерий "Микроб" 8 штаммов холерного вибриона классического биовара с альтернативным уровнем экспрессии трех генов, связанных с вирулентностью, и 2 штамма V. cholerae Дакка 35, утративших способность продуцировать холерный токсин за счет внедрения транспозона TnphoA (KmR) в участок хромосомы, определяющий синтез этого фактора патогенности. Указанные штаммы могут быть использованы в фундаментальных исследованиях, направленных на изучение механизмов регуляции генов вирулентности.

ОСНОВНЫЕ ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ

1. Популяция ряда природных штаммов V. cholerae классического биовара содержит клоны двух типов, различающихся по морфологии колоний (прозрачные или Т от англ. translucent и мутные или О от англ. opaque), продукции холерного токсина (Тох+ и Тох ), растворимой гемагглютипин/протеазы (Нар+ и Нар") и подвижности (Mot+ и Mot"). Одновременное и альтернативное изменение фенотипиче-ских свойств двух типов клонов не связано с различиями в составе изученных структурных и регуляторных генов.

2. На поверхности клеток О Тох- Нар+ Mot+ модельного штамма V. cholerae Дакка 35 присутствует экзополисахаридный слой, определяющий морфологию колоний и состоящий из рамнозы, глюкозы, галактозы и гексозамина. Продукция эк-зополисахарида (EPS) в клетках возбудителя холеры повышает их устойчивость к действию осмотического и оксидативного стресса.

3. По данным протеомного анализа фенотипически различные клетки, присутствующие в популяции V. cholerae Дакка 35, различаются по экспрессии около 60 разных белков. Клетки с фенотипом EPS+ Тох" Нар+ Mot+ продуцируют значительно больше мембранных и цитоплазматических белков, защищающих их от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды.

4. рН является сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистенции у холерных классических вибрионов. При повышении рН среды до 9,0 в популяции клеток EPS- Тох+ Нар" МоГ происходит одновременное изменение уровня экспрессии генов, определяющих продукцию экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглю-тинин/протеазы, а также подвижности.

5. Фенотипическая структура популяции штамма влияет на уровень вирулентности возбудителя для кроликов-сосунков.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ

Материалы диссертации доложены и представлены на научно-практических конференциях РосНИПЧИ «Микроб» «Итоги и перспективы фундаментальных и прикладных исследований в институте «Микроб» (Саратов, 2004, 2005 гг.), на третьем съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров "Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития" (Москва, 2004 г.), на Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004 г.).

ПУБЛИКАЦИИ: По теме диссертации опубликовано 10 научных работ.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ ДИССЕРТАЦИИ

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, трех глав собственных исследований, заключения, выводов и списка использован

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Исаев, Николай Джучиевич

ВЫВОДЫ

1. В результате комплексного фенотипнческого анализа 76 клинических штаммов V. cholerae классического биовара впервые выявлены штаммы, гетерогенность популяции которых проявляется в присутствии двух типов клеток (Т Тох+ Нар- МоГ и О Тох" Нар+ Mot+), отличающихся между собой по морфологии, продукции холерного токсина, растворимой гемагглютипии/протеазы, а также подвижности.

2. Согласно данным ПЦР-анализа и ДНК-ДНК-гибридизации между двумя фенотипически разными вариантами модельного штамма V. cholerae Дакка 35 (Т Тох+ Нар" МоГ и О Тох" Нар+ Mot"1} отсутствуют различия в составе изученных генов, кодирующих (ctxA, zot, асе, hapA, vpsO) и контролирующих (toxR, toxT, tcpP, tcpH, hapR, luxO) синтез экзополисахарида, холерного токсина и растворимой ге-магглютинин/протеазы. Нуклеотидпые последовательности гена ctxA, кодирующего синтез холерного токсина, и его промотора были идентичны у изогенных клонов Дакка 35.

3. С помощью биохимического анализа поверхностных структур клеток двух фенотипически разных вариантов холерного вибриона классического биовара у О Тох- Нар+ Mot+ клонов впервые выявлено присутствие значительного количества экзополисахаридного слоя, определяющего морфологию колоний. Экзополисаха-рид V. cholerae классического биовара повышает устойчивость клеток к действию осмотического и оксидативного стресса.

4. Впервые проведен сравнительный протеомный анализ двух фенотипически разных вариантов модельного штамма V. cholerae Дакка 35, показавший дифференциальную экспрессию около 60 различных белков. Установлено, что, в отличие от клонов EPS- Тох+ Нар- МоГ, в вариантах EPS+ Тох- Нар+ Mot+ репрессируется синтез 28 белков и индуцируется синтез 32 белков.

5. У EPS+ Тох" Mot+ Нар+ вариантов бактериальной популяции V. cholerae Дакка 35 установлена повышенная экспрессия генов, связанных с синтезом мембранных (OmpU и TolC) и цитоплазматических (белки с метилтрансферазной активностью или с антиоксидантными функциями) белков, обеспечивающих защиту клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды.

6. Показано, что рН является сигналом внешней среды, вызывающим координированное переключение синтеза факторов патогенности и персистенции у холерных классических вибрионов. При повышении рН среды до 9,0 в популяции клеток EPS" Тох+ Mot" Нар- происходит альтернативное изменение уровня экспрессии экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности.

7. Смена фенотипа клеток в популяции модельного штамма холерного вибриона классического биовара приводит к изменению его вирулентности. При экспериментальном моделировании инфекционного процесса показано, что популяция клеток EPS" Тох+ Нар" Mot" вирулентна, тогда как популяция клеток EPS+ Тох" Нар+ Mot+ - слабовирулентна.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Vibrio cholerae - возбудитель опасного эпидемического заболевания является удобной моделью для изучения механизмов адаптации патогенных бактерий к меняющимся условиям внешней среды, так как данный микроорганизм приспособлен к существованию в двух разных экологических нишах - в поверхностных водоемах и кишечнике человека. Очевидно, что из-за существенных различий комплекса условий внешней среды и организма хозяина, холерные вибрионы должны реализо-вывать разные генетические программы, осуществляющие инфекционный процесс или выживание во внешней среде.

Интенсивные исследования, проведенные в последнее время, показали существование механизмов координированной экспрессии генов, определяющих продукцию факторов вирулентности и персистенции в зависимости от условий внешней среды. Интересным, но все еще недостаточно изученным механизмом адаптации популяции к меняющимся условиям внешней среды являются фазовые изменения фенотипа, которые являются одним из источников популяционной неоднородности. Фазовые изменения следует отличать от классической схемы регуляции генной активности, поскольку, с одной стороны, фазовые вариации это наследуемые изменения, определяемые генетическими механизмами, с другой стороны, фазовые изменения транскрипции генов должны быть обратимы и частота появления ревертантов должна превышать частоту случайного мутагенеза. Переключение между двумя фазами это вероятностное (случайное) событие и внешние условия лишь изменяют частоту фазовых переходов [van der Woude M.W., Baumer A.J., 2004].

К настоящему времени установлено, что популяция холерных вибрионов, выделенных от больных холерой, вибрионосителей или из внешней среды, является гетерогенной по многим свойствам, включая и морфологические [Finkelstein R.A. et al., 1997; Милютин В.Н. с соавт., 1981; Адамов А.К., Наумшина М.С., 1984]. Среди типичных гладких прозрачных колоний можно обнаружить атипичные мутные колонии. При этом изменение в ряде случаев морфологии колоний коррелировало с изменением продукции таких факторов вирулентности как гемолизин и холерный токсин [Finkelstein R.A et al., 1997: Holmes R.K. et al, 1975]. Эти фазовые вариации, выражающиеся в формировании двух морфологически разных типов колоний, способствуют, видимо, адаптации холерных вибрионов к меняющимся условиям внешней среды [Fong J.C.N, et al., 2006].

Отмеченное раннее одновременное изменение морфологии колоний и продукции СТ у холерных эльтор вибрионов позволило высказать предположение, что разный фенотип колоний может указывать на разный уровень экспрессии в клетках многих белков и полисахаридов. Для подтверждения этой гипотезы нами были проведены исследования на модельных штаммах V. cholerae классического биовара. Был изучен популяционный состав 76 штаммов V. cholerae классического биовара, выделенных на территории Пакистана и Индии в 1942-1969 гг. и хранящихся в Государственной коллекции патогенных бактерий института «Микроб». У исследуемых штаммов была определена морфология колоний, а также изучена подвижность, ферментативные и токсигенные свойства.

В результате фенотипического анализа популяции было обнаружено две группы штаммов. В первую входило 86 % изученных штаммов, популяция которых состояла из типичных прозрачных колоний (S-форма). Вторая группа была представлена 11 штаммами (14 %), в популяции которых были обнаружены как прозрачные, так и мутные колонии, которые также находились в S-форме. Прозрачные колонии были обозначены как Т-колонии (от англ. translucent), мутные колонии -как О-колонии (от англ. opaque). Поскольку изменение морфологии может быть связано с изменением продукции различных белков, в том числе и белков, связанных с вирулентностью [Finkelstein R.A. et al., 1992; Finkelstein R.A et al., 1997; Ali A. et al., 2000a; Yildiz F.H. et al., 2004; van der Woude M.W., Baumer A.J. 2004], T и О колонии 11 штаммов были проверены на продукцию ими ключевых и дополнительных факторов патогенности: холерного токсина, токсин-корегулируемых пилей адгезии, растворимой гемагглютинин/протеазы, а также подвижности. Сравнительный анализ Т и О клонов позволил выявить семь штаммов (9361, В1307,2 Огава, 26, Дакка 35, 104/63, 34), у которых вариабельность морфологии колоний сопровождалась изменением продукции ряда факторов патогенности. Так как О колонии были подвижны и имели высокий уровень продукции Нар, их фенотип был обозначен как О Нар+ Mot+. Для Т клонов была характерна альтернативная экспрессия указанных факторов патогенности - незначительное количество Нар и невысокая подвижность, поэтому их фенотип был обозначен как Т Нар- Mot".

Наибольший интерес, на наш взгляд, представляют штаммы V. cholerae 9361, Дакка 35 и В1307, которые четко отличались друг от друга по четырем свойствам: морфологии колоний, продукции Нар, подвижности и продукции холерного токсина. Для последующего изучения в качестве модельного был взят штамм V. cholerae Дакка 35, два типа колоний которого значительно отличались по продукции СТ при изучении методом РПИГ и имели фенотип Т Тох+ Нар" Mot" и О Тох" Нар+ Mot+. При количественно определении синтеза СТ было выявлено, что Т Тох+ Нар"

МоГ клонами синтезируют 13,0 мкг/мл, в тоже время у О Тох- Нар+ Mot+ клонов было обнаружено его присутствие, но в очень незначительном количестве - 0,03 мкг/мл. Анализ биологической активности токсина Т Тох+ Нар" МоГ клонов в кожной пробе по Крейгу показал, что энтеротоксип штамма Дакка 35 обладал типичной для холерного токсина биологической активностью. Несмотря на четкие различия в продукции СТ, различные клоны этого штамма не имеют существенных различий в экспрессии TCP. Проведенный анализ культуральных свойств показал, что Т Тох+ Нар" Mot" и О Тох" Нар+ Mot+ клоны Дакка 35 обладают типичными свойствами, характерными для классических холерных вибрионов.

При изучении генетических свойств двух фенотипически разных вариантов штамма V. cholerae Дакка 35 было установлено, что сравниваемые варианты не отличаются друг от друга по набору генов, расположенных как на мобильных генетических элементах (ctxA, zot, асе- профаг СТХф, toxT, tcpP, tcpH- ОП VPI-I), так и в эволюционно древней части хромосомы (toxR, hapR, luxO). Также не было обнаружено отличий от других классических штаммов холерного вибриона по ко-пийности глобального регуляторного гена toxR и по количеству структурных генов ctxAB, оба варианта штамма Дакка 35 имеют две копии оперона ctxAB и одну копию регуляторного гена toxR величина фрагмента которого была идентична таковой классическим штаммам. В тоже время при секвенировании промотора гена ctxA было обнаружено, что в отличие от многих природных штаммов, имеющих 1-3 копии последовательности TTTTGAT, с которой происходит связывание регуляторного белка ToxR при активация транскрипции оперона ctxAB, в штамме Дакка 35 присутствует 6 копий таких тандемных повторов, что может объяснить необычно эффективную экспрессию генов ctxAB у токсигепных клонов штамма Дакка 35.

Для установления причины изменения морфологии колоний в штамме V. cholerae Дакка 35 было проведено электронно-микроскопическое изучение поверхности двух клонов. В результате было обнаружено, что О Тох- Нар+ Mot+ клетки окружены рыхлым слоем, который отсутствует у Т Тох+ Нар" МоГ клонов.

Одной из возможных причин появления атипичных по морфологии колоний в популяции штамма Дакка 35 может быть продукция ими белков внешней мембраны и (или) экзополисахаридного слоя. При проведении сравнительного изучения белков было обнаружено, что Т Тох+ Нар- МоГ клоны штамма Дакка 35 синтезируют белок внешней мембраны OmpT (Мг 40 кДа), тогда как в О Тох- Нар+ Mot+ клонов штамма Дакка 35 помимо белка OmpT присутствует дополнительный белок OmpU (Мг 38 кДа). Однако у большинства других проверенных штаммов классического биовара О и Т клоны имели идентичный белковый профиль, что указывает на то, что вклад белков внешней мембраны у холерных вибрионов классического биовара либо незначителен либо эти поверхностные структуры не участвуют в изменении морфологии колоний. В тоже время в клетках О клонов было обнаружено наличие значительного количества полисахаридов. Полученные сведения позволяют говорить о том, что морфология О-колоний у штамма Дакка 35, а также других штаммов холерного вибриона классического биовара определялась присутствием на поверхности бактериальных клеток дополнительного слоя полисахаридной природы.

Полисахаридной слой был выделен с поверхности штамма V. cholerae Дакка 35, при этом было обнаружено, что в препарате, выделенным из О Тох- Нар+ Mot+ клонов, содержание экзополисахарида составило 70 мкг/мл, а из Т Тох+ Нар- МоГ клона - 40 мкг/мл. При проведении сравнительного анализа мопосахаридного состава, выделенного с поверхности полисахаридного слоя, у О Тох" Нар+ Mot+ клонов при сравнении со стандартными углеводными метчиками, в значительном количестве выявлены рамноза, глюкоза, галактоза, гексозамин. В то же время в аналогичном препарате токсигенного клона указанные сахара присутствовали в следовых количествах.

Выявление нами экзополисахаридного слоя у О Тох- Нар+ Mot+ колоний штамма Дакка 35 послужило основанием для определения наличия в их хромосоме генов vps, кодирующих биосинтез экзополисахарида. При этом было установлено, что в бактериальном геноме изученных штаммов содержится участок ДНК, идентичный фрагменту структурного гена биосинтеза экзополисахарида vpsO, входящего в состав vps региона эльтор вибрионов, что позволяюет заключить, что различия в морфологии колоний двух клонов обусловлены или отсутствием или слабой экспрессией vps генов у Т-клонов. На основе полученных нами данных о выраженной продукции экзополисахарида О-вариантами разных штаммов холерного вибриона классического биовара фенотип О-клонов был обозначен как EPS+, а Т-клонов как EPS

Исходя из литературных данных о том, что дополнительный экзополисаха-ридный слой, присутствующий на поверхности штаммов эльтор вибрионов, способствует устойчивости клеток к действию осмотического и оксидативного стресса [Wai S.M. et al., 1998] была изучена устойчивости двух вариантов штамма Дакка 35 к действию высокой концентрации соли и перекиси водорода. При этом было установлено, что EPS+ Тох" Нар+ Mot+ клоны действительно более устойчивы к действию осмотического и оксидативному стрессам по сравнению с EPS" Тох+ Нар- Mot-клонами, что позволяют говорить о том, что продукция экзополисахарида холерными вибрионами классического биовара происходит, видимо, в результате их адаптации к неблагоприятным воздействиям окружающей среды.

Поскольку у холерных вибрионов координированная экспрессия факторов вирулентности и персистенции, в зависимости от условий окружающей среды контролируются несколькими глобальными регуляторными системами, которые «включают» или «выключают» биосинтез различных белков, то изменение активности генов вирулентности может сопровождаться изменением уровня экспрессии генов, кодирующих белки с другими функциями, который может быть выявлен при протеомном анализе. При проведении двумерного электрофореза с последующей идентификацией отличающихся белков методом MALDI-TOF спектрометрии изо-генных клонов штамма Дакка 35, различающихся продукцией основных факторов вирулентности и персистенции, было обнаружено, что, в отличие от EPS" Тох+ МоГ Нар" клонов, в EPS+ Tox" Mot+ Нар+ вариантах синтез 28 белков репрессируется, а синтез 32 белков индуцируется. При этом установлена повышенная экспрессия генов, связанных с синтезом мембранных (OmpU и TolC) и цитоплазматиче-ских (белки с метилтрансферазной активностью и с антиоксидантными функциями) белков, обеспечивающих защиту клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды, в EPS" Тох+ Mot" Нар" вариантах бактериальной популяции V. cholerae Дакка 35. Таким образом, данные, полученные с помощью протеомного анализа показали, что смена доминирующего фенотипа популяции сопровождается дифференциальной экспрессией у возбудителя холеры различных белков, в том числе и факторов персистенции.

На следующем этапе работы для выявления сигналов внешней среды, вызывающих комплексные изменения в экспрессии генов персистенции и вирулентности, было изучено влияние желчи (холат натрия), повышенной осмолярности, отсутствие питательных веществ, изменение рН среды выращивания на этот процесс. При этом было обнаружено, что под действием холата натрия заметно снижался уровень продукции холерного токсина и токсин-корегулируемых пилей адгезии, понижалась подвижность, повышалась транскрипция гена ompU, определяющего синтез защитного белка OmpU, однако уровень синтеза экзополисахарида не изменялся. Эти данные говорят о том, что холат натрия не является сигналом внешней среды, вызывающим наблюдаемые одновременные изменения в экспрессии генов экзополисахарида, холерного токсина, растворимой гемагглютинин/протеазы и подвижности. В то же время, одним из внешних сигналов, вызывающих одновременное и альтернативное переключение активности генов, кодирующих продукцию СТ, Нар, экзополисахарида и подвижности, оказался рН среды. При культивировании на средах с рН 9,0 клоны EPS" Нар" МоГ штаммов Дакка 35, 9361, 2 Огава и В1307 изменяли фенотип на EPS+Нар+Mot+. При этом у EPS" Нар" Mot" клонов штамма Дакка 35 исчезала и продукция холерного токсина.

Биологическая функция выявленного одновременного изменения нескольких свойств холерного вибриона заключается, по-видимому, в том, что благодаря работе переключающего механизма популяция вибрионов получает возможность сохраняться при изменении окружающих ее условий. Поскольку клетки EPS+ Тох" Нар+ Mot+ штамма Дакка 35 продуцируют такие факторы персистенции как экзополисахарид и белок OmpU, именно это тип клонов должен, по-видимому, появиться в популяции EPS" Тох+ Нар" Mot" вариантов при попадании их во внешнюю среду. В организме чувствительного животного селективное преимущество будут иметь клетки, продуцирующие факторы вирулентности, т.е. имеющие фенотип EPS" Тох+ Нар" МоГ.

Действительно, изучение популяционного состава EPS" Тох+ Нар- МоГ клона, находившегося в течение 6-и суток в физиологическом растворе при комнатной температуре, показало, что у 56,3 % клонов одновременно снизился синтез СТ, но возросла продукция Нар и экзополисахарида, а также увеличилась подвижность. В то же время при пребывании клеток EPS+ Тох" Нар+ Mot+ в организме модельного животного у 6,0 % клеток изменялся фенотип на EPS" Тох+ Нар" Mot".

Кроме того, в опытах на модельных животных было показано, что вирулентность штамма, популяция которого фенотипически гетерогенна, зависит от соотношения в ней клеток, продуцирующих и не продуцирующих ключевые факторы вирулентности.

Таким образом, в результате проведенных исследований впервые показано, что морфологические различия между двумя типами клонов, присутствующих в популяции модельного штамма V. cholerae, обусловлены разным уровнем продукции клетками впервые обнаруженного экзополисахарида (EPS), состоящего из рам-нозы, глюкозы, галактозы и гексозамина. Повышение продукции клетками экзополисахарида, определяющего мутность формирующих ими колоний, сопровождается одновременным изменением у них трех свойств - репрессией синтеза холерного токсина, усилением продукции растворимой гемагглютинин/протеазы и увеличением подвижности. Снижение в клетках продукции экзополисахарида ведет к формированию типичных (прозрачных) по морфологии колоний, у которых происходит одновременное и альтернативное изменение указанных свойств. Проведенный сравнительный протеомный анализ двух фенотипически разных изогенных вариантов холерного вибриона показал дифференциальную экспрессию около 60 разных белков. При этом установлено, что синтез экзополисахарида в клетках сопровождается продукцией мембранных и цитоплазматических белков, обеспечивающих, как и EPS, защиту клетки от воздействия неблагоприятных факторов внешней среды. Смена фенотипа клеток в популяции холерного вибриона приводит к изменению ее вирулентности. Популяция клеток EPS- Тох+ Нар- Mot- - вирулентна, а популяция клеток EPS+ Тох- Нар+ Mot+ - слабовирулентна. Главная роль в регулировании вирулентности популяции может принадлежать трансмембранному сенсорному белку (белкам), который улавливает изменения в окружающей среде и передает эту информацию генам, от активности которых зависит синтез либо факторов патогенности, либо факторов персистенции. Выявление механизма и факторов, индуцирующих альтернативный уровень экспрессии генов вирулентности, является одним из перспективных направлений дальнейших исследований в этом направлении. Получение таких сведений позволит прогнозировать развитие эпидемической ситуации. Кроме того, обнаружение в популяции природных штаммов фенотипически разных клонов, характеризующихся альтернативным уровнем продукции указанных белков и полисахарида, создает основу для разработки системы управления структурой популяции, что позволяет использовать один и тот же штамм для получения различных биологически активных веществ, меняя условия его выращивания.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Исаев, Николай Джучиевич, Саратов

1. Адамов А.К., Быстрый Н.Ф., Шмеркевич Д.Л., Середин В.Г. Методика дифференцирования патогенных и апатогеиных вибрионов Эль Тор. // Пробл. особо опасных инф. 1971.-Вып.1(17). - С. 116-123.

2. Адамов А.К., Иванов В.А., Шмеркевич Д.Л. с соавт. Выживаемость Эльтор в различных стоках, методика и тактика исследования сточных вод // Профилактика ООИ. Саратов, 1977. - Вып. 4. - С.9-14.

3. Адамов А.К., Наумшина М.С. Холерные вибрионы. Саратов., 1984. - 328 с.

4. Бароян О.В. Холера Эль-Тор. М.: «Медицина», 1971,254 с.

5. Бауэр Г., Энгельгард Б.Г., Хеншен А. с соавт. Высокоэффективная жидкостная хроматография в биохимии / Под ред. А. Хеншен. М.: «Мир»., 687 с.

6. Беляков В.Д., Марамович А.С., Каминский Г.Д. Гетерогенность и изменчивость популяций Vibrio cholerae eltor и их роль в развитии эпидемического процесса // Журн. микробиол. 1986. - №2. - С 91-97.

7. Бухарин О.В., Гинцбург А.Л., Романова Ю.М., Эль-Регистан Г.И. Механизмы выживания бактерий. - М.: Медицина., 2005. - 367 с.

8. Вейде А.А., Марамович А.С., Ганин B.C. с соавт Характеристика холерных вибрионов, выделенных в Астраханской области в 1970 г. // Пробл. особо опасных инф. 1975. - Вып.2(45). - С.81-85.

9. Воронежская Л.Г., Подосинникова Л.С., Курырева И.В. с соавт. Характеристика популяции вибрионов Эль Тор 711 по основным родовым и видовым признакам // Пробл. особо опасных инф. 1973. - Вып. 1(29). - С. 138-142.

10. Гончарова Н.С., Карасева З.Н. Особенности бактериоциногении у холерного вибриона//Пробл. особо опасных инф. 1970.-Вып.2(12).-С.24-26.

11. Грижебовский Г.М. Холера на Кавказе (теоретические и прикладные вопросы эпидемиологии): Автореф. дисс. в форме науч. докл. . докт. мед. наук. -Ставрополь, 1997. 78 с.

12. Дрожевкина М.С., Либинзон А.Е., Харитонова Т.Н. с соавт. Применение комплексного метода для определения вирулентности вибрионов Эль-Тор // Пробл. особо опасных инф. 1978. - Вып.4(62). - С. 39-42.

13. Жуков-Вережников Н.Н., Мусабаев И.К., Завьялов Н.К. Клиника, лечение и профилактика холеры. Ташкент: Медицина, 1966. -435с.

14. Захарова И .Я., Косенко Л.В. Методы изучения микробных полисахаридов // Киев, «Наукова Думка». 1982. - С.188.

15. Ильина Т.С., Романова Ю.М., Гипцбург А.Л. Системы коммуникации у бактерий и их роль в патогенности // Мол. генетика, микробиология, вирусология. -2006.- №3.- С. 22-29.

16. Литвин В.Ю., Гинцбург А.Л., Пушкарева. В.И. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. М., 1998.-С. 187-189.

17. Лобанов В. В., Марченков В.И. Современное состояние проблем изменчивости Vibrio cholerae II Журн. микробиол. 1999. - №4. - С. 103-106.

18. Ломов Ю.М. Пандемии холеры и эволюция возбудителя // Холера. Материалы VIII Российской научно-практической конференции по проблеме «ХОЛЕРА». Ростов-на-Дону, 2003. - С. 13-23

19. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Дж. Молекулярное клонирование. М., 1984. -480 с.

20. Марамович А.С., Вейде А.А., Урбанович Л.Я., Ганин B.C. Холерогенность вибрионов Эль Тор, выделенных в очаге холеры // Журн. микробиол. 1975. -№ 7. -С.134-135.

21. Мецлер Д. Биохимия. 3 т. - Москва, 1980.

22. Милютин В.Н., с соавт. Механизмы и диапазон изменчивости холерных вибрионов. Ростов, 1981.- 176 с.

23. Онищенко Г.Г., Ломов Ю.М., Покровский В.И. Актуальные проблемы холеры / Под. ред. В.И. Покровского и Онищенко Г.Г. М., 2000. - 384 с.

24. Подосинникова Л.С. Холерные вибрионы, выделенные на территории СССР в период седьмой пандемии: Автреф. дис. док. мед. наук. Саратов, 1993. -44 с.

25. Романова Ю. М., Гинцбург А. Л. Участие мобильных элементов в формировании свойств патогенных бактерий // Молекул, генетика. М., 1999. - № 2. -С. 22-29.

26. Савельев В.Н. Холера эльтор (эпидемические и микробиологические аспекты): Автореф. дисс. док. мед. наук. Ставрополь, 1998. -48 с.

27. Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Эволюция генома возбудителя холеры // Моле-кул.генетика 2004, - №4, - С.3-13.

28. Сомова А.Г., Лобанова Л.Н., Бадалова И.М. Изучение состава популяции вибрионов Эль Тор по агглютинабельности типоспецифическими сыворотками //Журн. микробиол. 1978. -№ 10. -С.82-85.

29. Урюпина Н.В., Щуркина И.И., Петрова Л.С. с соавт. Исследование антигенного комплекса вибрионов Эль Тор водного происхождения // Пробл. особо опасных инф. 1971. - Вып.4(20). - С. 121-127.

30. Хесин Р.Б. Непостоянство генома. М., «Наука», - 1985. - 472 с.

31. Шагинян Б.М., Маракуша Б.И. Модификация метода пассивного иммунного гемолиза на плотной среде для выявления продукции термостабильных энте-ротоксинов штаммами холерных вибрионов и кишечной палочки // Журн. микробиол. 1983. - № 7. - С. 92-96.

32. Ali A., Mahmud Z.H., Morris J.G. Sozhamannan S., Johnson J.A. Sequence analysis of TnphoA insertion sites in Vibrio cholerae mutants defective in rugose polysaccharide production // Infect. Immun. 2000b. - V. 68, N 12. - P. 6857-6864

33. Ali A., Rashid M.H., Karaolis D.K.R. High-frequency rugose exopolysaccharide production by Vibrio cholerae // Appl. and Environmental Microbiol. 2002. -V.68., N.l 1. - P.5773-5778.

34. D'Argenio D.A., Miller S.I. Cyclic di-GMP as a bacterial second messenger // Microbiol. 2004. - V.150. - P.2497-2502.

35. Atlung Т., Ingmer H. H-NS: a modulator of environmentally regulated gene expression // Mol. Microbiol. 1997. - V.24. - P.7-17.

36. Attridge S.R., Manning P.A., Holmgren J., Jonson G. Relative significance of mannose-sensitive hemagglutinin and toxin-coregulated pili in colonization by Vibrio cholerae 01 El Tor // Infect. Immun. 1996. - V. 64. - P. 3369-3373.

37. Attridge S.R., Voss E., Manning P.A. The role of toxin-coregulated pili in the pathogenesis of Vibrio cholerae 01 El Tor // Microb. Pathog. 1993. - V. 15. - P. 421-431.

38. Веек N.A., Krukonis E.S., DiRita V. TcpH influences virulence gene expression in Vibrio cholerae by inhibition degradation of the transcriptional activator TcpP // J. Bacterid. 2004. - V. 186. - P. 8309-8316.

39. Behari J., Stagon L., Calderwood S.B. pepA, a gene mediating pH regulation of virulence genes in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2001. - V.183. - P. 178-188.

40. Benitez J.A., Silva A.J., Finkelstein R.A. Environmental signals controlling production of hemagglutinin/protease in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2001. -V.69, N10. - P.6549-6553.

41. Beyhan S., Yildiz F.H. Smooth to rugose phase variation in Vibrio cholerae can be mediated by a single nucleotide change that targets c-di-GMP signalling pathway // Mol. Microbiol. 2007. - V. 63. - P. 995-1007.

42. Beyhan S., Tischler A.D., Camilli A., Yildiz F.H. Transcriptome and phenotypic responses of Vibrio cholerae to increased cyclic di-GMP level // J. Bacteriol. -2006. V.188.,N 10.-P.3600-3613.

43. Bina J.E., Mekalanos J.J. Vibrio cholerae tolC is required for bile resistance and colonization // Infect. Immun. 2001. - V.69., N.7. - P. 4681-4685.

44. Bomchil N., Watnick P., Kolter R. Identification and characterization of a Vibrio cholerae gene, mbaA, involved in maintenance of biofilm architecture // J. Bacteriol. 2003. - V. 185 - P. 1384-1390.

45. Bramucci M.G., Holmes R.K. Radial passive immune hemolysis assay for detection of heat labile enterotoxin produced by individual colonies of E. coli or V. choleraeII J. Clin. Microbiol. 1978. -V.2, N 2. - P.252-255.

46. Brandner J.P., Kroos L. Identification of the W 4400 regulatory region, a developmental promoter of Myxococcus xanthus // J. Bacteriol. 1998. - V.180, N 8. - P. 1995-2002

47. Burdman S., Jurkevitch E., Schwartsburd В., Hampel M., Okon Y. Aggregation in Azospirillum brasilense: effects of chemical and physical factors and involvement of extracellular components // Microbiology 1998 - V.144. - P. 1989-1999.

48. Carroll P.C., Tashima K.T., Rogers M.B., DiRita V.J., Calderwood S.B. Phase variation in tcpH modulates expression of the ToxR regulon in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1997. - V.25, N 6. - P. 1099-1 111.

49. Chakrabarti S.R., Chaudhuri K., Seen K., Das J. Porins of Vibrio cholerae: purification and characterization of OmpU // J. Bacteriol. 1996. - V.178, N 2. - P.524-530.

50. Chakrabarty S.N., Sengupta S.N., Chowdhury R. Role of DnaK in in vitro and in vivo expression of virulence factors of Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1999. -V.67.-P. 1025-1033.

51. Champion G.A., Neely M.N., Brennan M.A., DiRita V.J. A branch in the regulatory cascade of Vibrio cholerae revealed by characterization of toxT mutant strains //Mol. Microbiol.- 1997. V.23. -P.322-331.

52. Chiavelli D.A., Marsh J.W., Taylor R.K. The mannose-sensitive hemagglutinin of Vibrio cholerae promotes adherence to zooplankton // Appl. Environ. Microbiol. -2001. V.67, N 7. - P.3220-3225.

53. Colwell R.R., Huq A. Vibrios in the environment: viable but nonculturable // Ann. N.Y. Acad. Sci. -1994. V.170. - P.44-54.

54. Colwell R.R., Spira W.M. The ecology of Vibrio cholerae II In D. Barua and W. B. I. Greenough (ed.), Cholera. Plenum, New York, N.Y. 1992. - P. 107-127.

55. Costerton J.W., Lewandowski Z., Caldwell D.E., Korber D.R., Lappin-Scott H.M. Microbial bioflms // Annu. Rev. Microbiol. 1995. - V.49. - 711-745.

56. Cotter P.A., DiRita V.J. Bacterial virulence gene regulation: an evolutionary perspective // Annu. Rev. Microbiol. 2000. - V. 54. - P. 519-565.

57. Crawford J.A., Kaper J.B., DiRita V.J. Analysis of ToxR-dependent transcription activation of ompU, the gene envelope protein in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 1998. - V. 29. - P. 235-246.

58. Crawford J.A., Krukonis E.S., DiRita V.J. Membrane localization of the ToxR winged-helix domain is required for TcpP-mediated virulence gene activation in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2003. - V.47. - P. 1459-1473.

59. Creig J.P. A permeability factor (toxin) found in cholera stools and culture filtrates and its neutralization by convalescent cholera sera // Nature. 1965. - V.207. -P.614-616

60. Danese P.N., Pratt L.A., Kolter R. Exopolysaccharide production is required for development of Escherichia coli K-12 biofilm architecture // J. Bacteriol. 2000. -V. 182.-P. 3593-3596.

61. Davey M.E., O'Toole G.A. Microbial biofilms: from ecology to molecular genetics // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2000. - V.64. - P.847-867.

62. Davis B.M., Lawson E.H., Sandkvist M., Ali A., Sozhamannan S., Waldor M.K. Convergence of the secretory pathways for cholera toxin and the filamentous phage, СТХФ // Science. 2000. - V. 288. - P. 333-335.

63. Davis B.M., Waldor M.K. Filamentous phage linked to virulence of Vibrio cholerae II Current Opinion. 2003. - V.6. - P.35-42.

64. De S.N., Chatteijee D.N. Experimental study of mechanism of action of Vibrio cholerae on intestional mucous membrane // J. Path. Bacteriol. 1953. - V.66. -P.559-562.

65. Dibrov P. The Sodium Cycle in Vibrio cholerae: Riddles in the Dark // Biochemistry 2005. - V.70, N 2. - P.150-153.

66. DiRita V.J., Parsot C., Jander G. Mekalanos J.J. Regulatory cascade controls virulence in Vibrio cholerae // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1991. - V.88. - P. 5403-5407.

67. Dominguez P., Velasco G., Barros F. et al. Intestinal brush border membranes contain regulatory subunits of adenylyl cyclase I I Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84, N 20. - P. 6965-6969.

68. Donlan R.M. Biofilms: microbial of surfaces // Emerging Infect. Dis. 2002. - V.8 -P. 881-890.

69. Donnenberg M.S., Giron J.A., Nataro J.P., Kaper J.B. A plasmid-encoded type IV fimbrial gene of enteropathogenic Escherichia coli associated with localized adherence // Mol. Microbiol. 1992. - V.6. - P. 3427-3437.

70. Dutta N.K., Habbu M.K. Experimental cholera in infant rabbits: a method for che-motherapeutic investigation // Brit. J. Pharmacol. 1955 - V. 256, N 23. - P. 12252-12256.

71. Dzieman M., Kolmar H., Fritz H., Mekalanos J.J. ToxR co-operative interactions are not modulated by environmental condition or periplasmic domain conformation // Mol. Biol. 1999. - V.31. - P.305-317.

72. Everiss, K.D., Hughes K.J., Kovach M.E., Peterson K.M., The Vibrio cholerae acfB colonization determinant encodes an inner membrane protein that is related to a family of signal-transducing proteins // Infect. Immun. 1994. - V.62. - P.3289-3298.

73. Faruque S. M., Albert M., Mekalanos J.J. Epidemiology, genetics and ecology of toxigenic Vibrio cholerae //Microbiol, and Molecul. Rev. 1998. - V.62. -P.l 301-1314.

74. Fields P. I., Popovic Т., Wachsmuth K., Olsvik 0. Use of polymerase chain reaction for detection of toxigenic Vibrio cholerae 01 strains from the Latin American cholera epidemic // J. Clin. Microbiol. 1992. - V. 30. - P. 2118-2121.

75. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Chang Y., Hase C. Vibrio cholerae hemagglutinin/protease, colonial variation, virulence and detachment // Infect. Immun. 1992. - V. 60. - P. 472-478.

76. Finkelstein R.A., Boesman-Finkelstein M., Sengupta D.K., Page W.J., Stanley C.M., Phillips Т.Е. Colonial opacity variations among the choleragenic vibrios // Microbiol. 1997. -V. 143. - P.23-34.

77. Fong J.C.N., Karplus K., Schoolnik G.K., Yildiz F. Required for the development of rugose colony morphology and biofilm structure in Vibrio cholerae II J. Bacte-riol. -2006. V. 188., N 3. - P. 1049-1059.

78. Freeman J.A., Bassler B.L. A genetic analysis of the function of LuxO, a two-component response regulator involved in quorum sensing in Vibrio harveyi // Mol. Microbiol. 1999 - V. 31. - P. 665-677

79. Fullner K.J., Mekalanos J.J. Genetic characterization of a new type IV-a pilus gene cluster found in both classical and El Tor biotypes of Vibrio cholerae // Infect. Immun. 1999. -V. 67, N 3. - P.1393-1404.

80. Fuqua C., Parsek M. R., Greenberg E. P. Regulation of gene expression by cell-to-cell communication // Annu. Rev. Genet. 2001. - V.35. - P. 439-68.

81. Gardel C.L., Mekalanos J.J. Alterations in Vibrio cholerae motility phenotypes correlate with changes in virulence factor expression 11 Infec. Immun. 1996. -V.64, N 6. - P.2246-2255.

82. Gardel C.L., Mekalanos J.J. Regulation of cholera toxin by temperature, pH and osmolarity // Methods Enzymol. 1994. - V.235. - P.517-526.

83. Ghost A., Paul K., Chowdhury R. Role of the histone-like nucleoid structuring protein in colonization, motility, and bile-dependent repression of virulence gene expression in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2006. - V.74., N 5. - P.3060-3064.

84. Gill D.M. The arrangement of subunits in cholera toxin // Infect. Immun. 1976. -V. 52.-P. 1242-1248.

85. Giron J.A., Ho A.S., Schoolnik G.K. An inducible bundle-forming pilus of en-teropathogenic Escherichia colill Science. 1991. -V. 254. - P. 710-713.

86. Gosink K.K., Hase C.C. Requirement for conversion of the Na+-driven flagellar motor of Vibrio cholerae to the H+-driven motor of Escherichia coli II J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P.4234-4240.

87. Gupta S., Chowdhury R. Bile affects production of virulence factors and motility Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1997. - V.65, N 3. - PI 131-1134.

88. Hammer B.K., Bassler B.L. Quorum sensing controls biofilm formation in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2003. - V. 50. - P. 101 -104.

89. Hang L., John M., Asaduzzaman M., et al. Use of in vivo-induced antigen technology (IVIAT) to identify genes uniquely expressed during human infection with Vibrio cholerae//Vtoc. Natl. Acad. Sci. USA.-2003.-V.14,N 14.-P. 8508-8513.

90. Hanne L.P., Finkelstein R.A. Characterization and distribution of the hemagglutinins production by Vibrio cholerae II Infect. Immun. 1982. - V. 36. - P. 209-214.

91. Hase C.C. Analysis of the role of flagellar activity in virulence gene expression in Vibrio cholerae II Microbiol. 2001. - V.147. - P.831-837.

92. Hase C.C., Mekalanos J.J. TcpP protein is a positive regulator of virulence factor expression in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V. 95. -P.730-734.

93. Hase C.C., Mekalanos J.J. Effects of changes in membrane sodium flux on virulence gene expression in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999. -V. 96. -P.3183-3187.

94. Hase C.C., Mekalanos J.J. Role of sodium bioenergetics in Vibrio cholerae II Bio-chimica et biophysica acta. 2001. - V. 1505. - P. 169-178.

95. Haugo A.J., Watnick P.I. Vibrio cholerae CytR is a repressor of biofilm development // Mol. Microbiol. 2002. - V.45. - P.471- 483.

96. Heidelberg J.F., Eisen J.A., Nelson W.C. et al. DNA sequence of both chromosomes of the cholera pathogen Vibrio cholerae // Nature. 2000. - V. 406. - P. All- 483.

97. Heithoff D.M., Mahan M.M. Vibrio cholerae biofilms: stuck between a rock and a hard place // J. Bacterid. 2004. - V. 186, N 15. - P.4835-4837.

98. Hengge-Aronis R. Signal transduction and regulatory mechanism involved in control of the a (RpoS) subunit of RNA polymerase // Microbiol. Molecular. 2002.- V.66.-P.373-395.

99. Herrington D.A., Hall R.H., Losonsky G., Mekalanos J.J., Taylor R.K., Levine M.M. Toxin, toxin-coregulated pili, and the toxR regulon are essential for Vibrio cholerae pathogenesis in humans // J. Exp. Med. 1988. - V.168. - P. 1487-1492.

100. Higgins D.E., DiRita V.J. Genetic analysis of the interaction between Vibrio cholerae transcription activator ToxR and toxT promoter DNA // J. Bacteriol. 1996. -V.178, N4.-P. 1080-1087.

101. Higgins D.E., DiRita V.J. Transcriptional control of toxT, a regulatory gene in the ToxR regulon of Vibrio cholerae И Mol. Microbiol. 1994. - V. 14. - P.17-29.

102. Higgins D.E., Nazareno E., DiRita V.J. The virulence gene activator ToxT from Vibrio cholerae is a member of AraC family of transcriptional activator I I J. Bacteriol. 1992. - V.174. -P.6974-6980.

103. Hitchcock P.J., Brown T.M. Morphological heterogeneity among Salmonella lipopolysaccharide chemotypes in silver-stained polyacrylamide gels // J.Bacteriol.- 1983. -V. 154, N 1.- P. 269-277

104. Holmgren J. Action of cholera toxin and prevention and treatment of cholera // Nature. 1981. - V. 292, N 5822. - P. 413-417.

105. Holmgren J., Lonnroth I., Svennerholm L. Tissue receptor for cholera exotoxin: postulated structure from studies with GMj ganglioside and related glycolipids // Infect. Immun. 1973. - V.8, N 2. - P. 2669-2678.

106. Hung D.T., Mekalanos J.J. Bile acids induce cholera toxin expression in Vibrio cholerae in a ToxT-independent manner // PNAS 2005. - V.102. - P.3028-3033.

107. Hung D.T., Zhu J., Stertevant D., Mekalanos J.J. Bile acids stimulates biofilm formation in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2006. - V. 59. - P. 193-201.

108. Imae Y., Atsumi T. Na -driven bacterial flagellar motors // J. Bioenerg. Biomembr. 1989.- V.21. - P.705-716.

109. Iredell J.R., Manning P.A. Biotype-specific tcpA genes in Vibrio cholerae // FEMS Microbiol. Lett. -1994. V. 121. - P. 47-54.

110. Jackson D.W., Simecka J.W., Romeo T. Catabolit repression of Escherichia coli biofilm formation // J. Bacteriol. 2002. - V. 184, N 12. - P.3406-3410.

111. Jermyn W.S., E.F. Boyd Characterization of novel Vibrio pathogenicity island (VPI-2) encoding neuraminidase (nanH) among toxigenic Vibrio cholerae isolates // Microbiology. 2002. - V. 148. - P. 3681-3693.

112. Jobling M.G., Holmes R.K. Characterization of HapR, a positive regulator of the Vibrio cholerae HA/protease gene hap, and its identification as a functional homo-logue of the Vibrio harveyi luxR gene // Mol. Microbiol. 1997. - V.26, N.5. -P.1023-1034

113. Jobling M.G., Holmes R.K. Mutational analysis of ganglioside GM(l)-binding ability, pentamer formation, and epitopes of cholera toxin В (CTB) subunits and CTB/heat-labile enterotoxin В subunit chimeras // Infect. Immun. 2002. - V.70, N 3.-P.1260-1271.

114. Jonson G., Lebens M., Holmgren J. Cloning and sequencing of Vibrio cholerae mannose-sensitive haemagglutinin pilin gene: localization of mshA within a cluster of type 4 pilin genes // Mol. Microbiol. 1994. - V.13. - P. 109-118.

115. Kan В., Habibi H., Schmid M. et al. Proteome comparison of Vibrio cholerae cultured in aerobic and anaerobic conditions // Proteomics. 2004. - V.10. - P. 30613067.

116. Kaper J.B., Morris J.G., Levin M.M. Cholera. // Clin. Microbiol. Rev. 1995. - V. 8. - P.48-89.

117. Karaolis D.K.R., Johnson J.A., Bailey C.C. et al. A Vibrio cholerae pathogenicity island associated with epidemic and pandemic strains // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95, N 6. - P. 3134-3139.

118. Keasler S. P., Hall R.N. Detecting and biotyping V. cholerae 01 with multiplex polimerase chain reaction // Lancet. 1993 - V. 341. - P. 1661.

119. Kierek K., Watnic P.I. Vibrio cholerae 0139 O-antigen polysaccharide is essential for Ca2+-dependent biofilm development in sea water // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2003. V.100, N 24. - P. 14357-14362 (6).

120. Kierek К., Watnick P.I. Environmental determinants of Vibrio cholerae biofilm development. // Appl. Environ. Microbiol. 2003. - V.69. -P. 5079-5088.

121. Kirn T.J., Lafferty M.J., Sandoe C.M.P., Taylor R.K. Delineation of pilin domains required for bacterial association into microcolonies and intestinal colonization by Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2000. - V. 35, N 4. - P. 67-84.

122. Klose K.E., Mekalanos J.J. Distinct roles of an alternative sigma factor during both free-swimming and colonizing phases of the Vibrio cholerae pathogenic cycle // Mol. Microbiol. 1998. - V.28. - P. 501-520.

123. Kojima S.K., Kawagishi Y.I., Homma M. The polar flagellar motor of Vibrio cholerae is driven by a Na+ motive force // J. Bacteriol. 1999. - V. 181. - P. 19271930. *v

124. Kovacikova G., Skorupski K. A. Vibrio cholerae LysR homolog, AphB, cooperates with AphA at the tcpPH promoter to activate expression of the ToxR virulence cascade// J. Bacteriol. 1999. -V. 181, N 14. - P. 4250-4256.

125. Kovacikova G., Skorupski K. Differential activation of tcpPH promoter by AphB determines biotype specificity of virulence gene expression in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2000. - V.182. - P. 3228-3238.

126. Kovacikova G., Skorupski K. A. Overlapping binding sites for the virulence gene regulators AphA, AphB and cAMP-CRP at the Vibrio cholerae tcpPH promotor. // Mol. Microbiol. 2001. - V.41, N 2. - P.393-407.

127. Kovacikova G., Skorupski K. A. Binding site requirements of the virulence gene regulator AphA: differential affinities for the Vibrio cholerae classical and El Tor /фРЯpromotor // Mol. Microbiol. 2002a. - V.44. - P. 533-547.

128. Kovacikova G., Skorupski K. Regulation of virulence gene expression in Vibrio cholerae by quorum sensing: HapR functions at the aphA promoter // Mol. Microbiol. 2002b. - V. 46. - P. 1135-1147.

129. Krishnan H.H., Ghost A., Paul K., Chowdhury R. Effect of anaerobiosis on expression of virulence factors in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2004. - V.72. -P.3961-3967.

130. Krukonis E.S., DiRita V.J. From motility to virulence: sensing and responding to environmental signals in Vibrio cholerae II Current Opinion in Microbiology.2003. V.6. - P. 186-190.

131. Krukonis E.S., Yu R.R., DiRita J.J. The Vibrio cholerae ToxR/TcpP/ToxT virulence cascade: distinct roles for two membrane-localized transcriptional activators on a single promoter // Mol. Microbiol. 2000. - V.38. - P.67-84.

132. Laemmli U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T //Nature. 1970. - V. 227. - P. 680-685.

133. Lauriano C.M., Ghost C., Correa N.E., Klose K.E. The sodium-driven flagellar motor controls exopolysaccharide expression in Vibrio cholerae II J. Bacteriol.2004. V. 186, N 15. - P.4864-4874.

134. Lee S.H., Butler S.M., Camilli A. Selection for in vivo regulators of bacterial virulence // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. - V.98. - P.6889-6894.

135. Lenz D.H., Miller M.B., Zhu J., Kulkarni R.V., Bassler B.L. CsrA and three redundant small RNAs regulate quorum sensing in Vibrio cholerae II Mol. Microbiol. 2005. - V.58. - P. 1186-1202.

136. Lenz D.H., Мок K.C., Lilley B.N., Kulkarni R.V., Wingreen N.S., Bassler B.L. The small RNA chaperone Hfq and multiple small RNAs control quorum sensing in Vibrio harveyi and Vibrio cholerae II Cell. 2004. - V. 118, N 1. - P. 69-82.

137. Li C.C., Crawford J.A., DiRita V.J., Kaper J.B. Molecular cloning and transcriptional regulation of ompT, a ToxR-repressed gene in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol. 2000. - V. 35.-P. 189-203.

138. Li C.C., Merrell D.S, Camilli A., Kaper J.B. ToxR interferes with CRP-dependent transcriptional activation of ompT in Vibrio cholerae // Mol. Microbiol.- 2002. -V.43. -P.1577-1589.

139. Lilley B.N., Bassler B.L. Regulation of quorum sensing in Vibrio harveyi by LuxO and sigma-54 // Mol. Microbiol. 2000. - V.36. - P.940-954.

140. Lim В., Beyhan S., Yildiz F.H. Regulation of Vibrio Polysaccharide Synthesis and Virulence Factor Production by CdgC, a GGDEF-EAL Domain Protein, in Vibrio cholerae // J. Bacterid. 2007. - V. 189, N 3. - P.717-729.

141. Lipp E.K., Huq A., Colwell R.R. Effects of global climate on infectious disease: the cholera model // Clin. Microbiol. Rev. 2002. - V.15, N4. - P. 757-770.

142. Losick R, Kaiser D. Why and how bacteria communicate // Sci. Amer. 1997. -February. - P.68-73

143. Mahillon J., Chandler M. Insertion sequences // Microbiol, and Molecular Biol. Rev. 1998. - V.62, N 3. - P.725-774.

144. Marsh J.W., Taylor R.K. Physical linkade of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin secretory and structural subunit gene loci: identification of the mshG coding sequence // Infect. Immun. 1996. - V.64, N 2. - P.460-465.

145. Marsh J.W., Taylor R.K. Genetic and transcriptional analyses of the Vibrio cholerae mannose-sensitive hemagglutinin type 4 pilus gene locus // J. Bacteriol.-1999.-V. 181, N4. -P.l 110-1117.

146. McCarter L.L. Polar flagellar motility of the Vibrionaceae // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2001. - V.65, N 3 - P.445-462

147. McLeod S.M., Kimsey H.H., Davis B.M., Waldor M.K. СТХф and Vibrio cholerae: exploring a newly recognized type of phage-host cell relationship // Mol. Microbiol. 2005. - V.57. - P.347-356.

148. Medrano A.I., DiRita V., Castillo G., Sanchez J. Transient transcriptional activator of the Vibrio cholerae El Tor virulence regulator ToxR in response to culture conditions // Infect. Immun. 1999. - V. 67. - P.2178-2183.

149. Merrel D.S., Bailey C., Kaper J.B., Camilli A. The ToxR-Mediated organic acid tolerance response of Vibrio cholerae requires OmpU. // J. Bacteriol. 2001. - V. 183, N9.-P. 2746-2754.

150. Miller M. В., Bassler B. L. Quorum sensing in bacteria // Annu. Rev. Microbiol. -2001.-V. 54.-P. 165-99

151. Miller M.B., Skorupski K. et al. Parallel quorum sensing systems converge to regulate virulence in Vibrio cholerae II Cell 2002. - V. 110 - P. 303-314.

152. Miller V.L., Mekalanos J.J. Synthesis of cholera toxin is positively regulated at the transcriptional level by toxR И Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1984. - V. 81. - P. 3471-3475.

153. Moorthy S., Watnick P. Genetic evidence that the Vibrio cholerae monolayer is a distinct stage in biofilm development // Mol. Microbiol. 2004. - V. 52, N 2. - P. 571-587.

154. Mudd S., Anderson T.F. Selective "staining" for electron microscopy. The effect of heavy metal salts on individual bacterial cells // Exp. Med. 1942. - V.76. - P. 103-107.

155. Murley Y.M., Carroll P.A., Skorupski K. et al. Differential transcription of the tcpPH operon confers biotype-specific control of the Vibrio cholerae ToxR virulence regulon // Infect. Immun. 1999. - V.67, N 10. - P.5117-5123.

156. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A. et al. New variants of Vibrio cholerae 01 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrea in Bangladesh // J.Clin.Microbiol. 2002. - V.40, N 9. -P.3296-3299.

157. Nielsen A.T., Dolganov N.A., Otto G. et al. RpoS controls the Vibrio cholerae mucosal escape response // PLoS Pathogen 2006. - V.2. - P.933-948.

158. Nye M.B., Pfau J.D., Skorupski K., Taylor, R.K. Vibrio cholerae H-NS silences virulence gene expression at multiple steps in the ToxR regulatory cascade // J. Bacteriol. 2000. - V. 182. - P. 4295-4303.

159. Nye M.B., Taylor R.K. Vibrio cholerae H-NS domain structure and function with respect to transcriptional repression of ToxR regulon genes reveals differences among H-NS family members // Mol. Microbiol. 2003. - V.50. - P.427-444.

160. OFarrell P.H. High resolution two-dimenaional electrophoresis of proteins // J. Biol. Chem. 1975. - V. 250 - P. 4007-4021.

161. Paula I. Watnick and Roberto Kolter. Steps in the development of a Vibrio cholerae biofilm //Mol Microbiol. 1999. - V.34. - P. 586-595

162. Pfau J.D., Taylor R.K. Mutations in toxR and toxS that separate transcriptional activation from DNA binding at the cholera toxin gene promoter // J. Bacteriol. -1998.-V. 180,N17.-P. 4724-4733.

163. Prouty M.G., Nidia E.C., Klose K.E. The novel s54- and s28-dependent flagellar gene transcription hierarchy of Vibrio cholerae II Mol. Microbiology. 2001. -V.39, N6.-P. 1595-1609.

164. Prouty M.G., Osorio C.R., Klose K.E. Characterization of functional domains of the Vibrio cholerae virulence regulator ToxT // Mol. Microbiol. 2005. - V. 58. -P.l 143-1156.

165. Provensano D., Schumacher D.A., Barker J.L., Klose K.E. The virulence regulatory protein ToxR mediates enhanced bile resistance in Vibrio cholerae and other pathogenic Vibrio speicies // Infect. Immun. 2000a. - V.68, N 3. - P. 1491-1497.

166. Provenzano D., Klose K.E. Altered expression of the ToxR-regulated porins OmpU and OmpT diminishes Vibrio cholerae bile resistance, virulence factor expression, and intestinal colonization // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000b. -V.97.-P. 10220-10224.

167. Raufman J.P. Cholera //Am J. Med. 1997.- V.104.-P.386-394.

168. Rau J., Stolz A. Oxygen-insensitive nitroreductases NfsA and NfsB of Escherichia coli function unger anaerobic congitions as lawsone-dependent azo reductases // Appl. Environ. Microdiol. 2003. - V.69, N 6. - P.3448-3455.

169. Rashid M.H., Rajanna C., Ali A., Karaolis D.K.R. Identification of genes involved in the switch between the smooth and rugose phenotypes of Vibrio cholerae II FEMS Microbiol. Lett. 2003. - V.227. - P. 113-119.

170. Reidl J., Klose K. Vibrio cholerae and cholerae: out of the water and into the host // FEMS Microbiol. Rev. 2002. - V.26 - P. 125-139

171. Reidl J., Klose K.E. Vibrio cholerae and cholera: out of the water and into the host // FEMS Microbiol. Rev. 2002. - V.26. - P.125-139.

172. Safa A., Bhuiyan N.A , Alam M. et al. Genomic relatedness of the new Matlab variants of Vibrio cholerae 01 to the classical and El Tor biotypes as determined by pulsed-field gel electrophoresis // Clin. Microbiol. 2005. - V.43. - P. 14011404.

173. Salles C. A., Momen H., Vicente A. C. P., Coelho A. Vibrio cholerae in South America: polymerase chain reaction and zymovar analysis // Trans R. Soc. Trop. Med. Hyg. 1993. - V. 87. - P. 272.

174. Sandkvist M. Biology of type II secretion // Mol. Microbiol. 2001. - V.40, N 2. -P.271-283.

175. Sandkvist M., Michel L.O., Hough L.P. et al. General secretion pathway (eps) genes required for toxin secretion and outer membrane biogenesis in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1997. - V.179. - P. 6994-7003.

176. Schumacher D.A., Klose K.E. Environmental signals modulate ToxT-dependent virulence factor expression in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1999. V.181. -РЛ 508-1514.

177. Showalter R.E., Martin M.O., Silverman M.R. Cloning and nucleotide sequence of luxR, a regulatory gene controlling bioluminescence in Vibrio harveyi. II J. Bacteriol. 1990. - V.172, N 6. - P.2946-2954.

178. Silva A.J., Benitez J.A. Transcriptional regulation of Vibrio cholerae hemaggluti-nin/protease by the cyclic AMP receptor protein and Rpos // J. Bacteriol. 2004. -V.186, N 19. -P.6374-6382.

179. Silva A.J., Leitch G.J., Camilli A., Benitez J.A. Contribution of hemaggluti-nin/protease and motility to pathogenesis of Eltor biotype cholera // Infect. Immune. 2006. - V.74, N 4. - P. 2072-2079.

180. Skorupski K., Taylor R.K. Cyclic AMP and its receptor protein negatively regulate the coordinate expression of colera toxin and toxin-coregulated pilus in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P.265-270.

181. Skorupski К., Taylor R.K. A new level in the Vibrio cholerae ToxR virulence cascade: AphA is required for transcriptional activation of the tcpPH operon // Mol. Microbiol. 1999. - V.31, N.3. - P.763-771.

182. Sperandio V., Bailey C., Giron J.A. et al. Cloning and characterization of the gene encoding the OmpU outer membrane protein of Vibrio cholerae II Infect. Immun. -1996. V.64, N 12. - P.5406-5409.

183. Sun D., Mekalanos J.J., Taylor R.K. Antibodies directed against the toxin-coregulated pilus isolated from Vibrio cholerae provide protection in the infant mouse experimental cholera model // J. Infect. Dis. 1990. - V. 161. - P. 12311236.

184. Svennerholm A.-M., Wiklund G. Rapid GMrenzyme-linked immunosorbent assay with visual reading for identification of Escherichia coli heat-labile enterotoxin // J. Clin. Microbiol. 1983. - V.17. - P.262-270.

185. Tan N.H., Tan L.S. Acidimetric assay of phospholipase A using egg yolk suspension as substrate // Anal. Biochem. 1988. - V. 170. - P. 282-288.

186. Taylor R.K., Miller V.L., Furlong D.B., Mekalanos J.J. Use of phoA gene fusions to identify a pilus colonization factor coordinately regulated with cholera toxin // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1987. - V.84, N 9. - P. 2833-2837.

187. Tendeng С., Badaut С., Krin E. et al. Isolation and Characterization of vicH, encoding a new pleiotropic regulator in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 2000. -V.182.-P. 2026-2032.

188. Terashima H., Fakuoka H., Yakushi T. et al. The Vibrio motor protein, MotX and MotY, are associated with the basal body of Na+-driven flagella and required for stator formation // Mol. Microbiol. 2006. - V.62. - P. 1170-1181.

189. Tischer A.D., Camilli A. Cyclyc diguanylate (c-di-GMP) regulates Vibrio cholerae biofilm formation // Mol. Microbiol. 2004. - V. 53. - P.857-869.

190. Tischler A.D., Lee S.H, Camilli A. The Vibrio cholerae vieSAB locus encodes a pathway contributing to cholera toxin production // J. Bacteriol. 2002. - V.184., N 15.-P.4104-4113.

191. Towbin H, Staehelin Т., Gordon J. Electrophoretic transfer of proteins from poly-acrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1979. - V. 76. - P. 4350-4354.

192. Trucksis M., Galen J.E., Mishalski J. et al. Accessory cholera enterotoxin (Ace), the third toxin of a Vibrio cholerae virulence cassette // Proc. Notl. Acad. Sci. USA. 1993. - V. 90. - P. 5267-5271.

193. Vance R.E., Zhu J., Mekalanos J.J. A constitutively active variant of the quorum-sensing regulator LuxO affects protease production and biofilm formation in Vibrio cholerae II Infect. Immun. 2003. - V. 71. - P. 2571-2576

194. Vimont S., Berche P. NhaA, an Na+/H+ antiporter involved in environmental survival of Vibrio cholera // J. Bacteriol. 2000. - V.182, N.10. - P.2937-2944.

195. Waldor M.K., Mekalanos J.J. ToxR regulates virulence gene expression in non-01 strains of Vibrio cholerae that cause epidemic cholera. // Infect. Immun. 1994. -V. 62, N 1. - P.2853-2856.

196. Waldor M.K., Mekalanos J.J. Lisogenic conversion by a filamentous bacteriofage encoding cholera toxin // Science. -1996. V. 272. - P. 1910-1914.

197. Watnick P.I., Fullner K.J., Kolter R. A role for the mannose-sensitive hemagglutinin in biofilm formation by Vibrio cholerae El Tor// J. Bacteriol. 1999. - V. 181. -P. 3606-3609

198. Watnick P.I., Lauriano C.M., Klose K.E., et al. The absence of a flagellum leads to altered colony morphology, biofilm development and virulence in Vibrio cholerae 0139 //Mol Microbiol. 2001. -V. 39. - P. 223-235.

199. Wibbenmeyer J.A., Provensano D., Landry C.F., et al. Vibrio cholerae OmpU and OmpT porins are differentially affected by bile // Infect. Immun. 2002. - V.70, N 1. -P.121-126.

200. Withey J.H., DiRita V.J. Activation of both acfA and acfD transcription by Vibrio cholerae ToxT requires binding to two centrally located DNA sites in an inverted repeat conformation // Mol. Microbiol. 2005. - V.4. - P. 1062-1077.

201. Yildiz F.H., Lie X.S., Heydorn A., Schoolnik G. K. Molecular analysis of rugosity in a Vibrio cholerae 01 El Tor phase variant // Mol. Microbiol. 2004. - V.53, N.2.-P. 497-515.

202. Yu R.R., DiRita V.J. Regulation of gene expression in Vibrio cholerae by ToxT involves both antirepression and RNA polymerase stimulation // Mol. Microbiol. -2002.-V.43.-P.119-134.

203. Yu R.R., DiRita V.J. Analysis autoregulatory loop controlling ToxT, cholera toxin, and toxin-coregulated pilus production in Vibrio cholerae II J. Bacteriol. 1999. -V. 181,N8.-P. 2584-2592.

204. Zhu J., Mekalanos J.J. Quorum sensing dependent biofilms enhance colonization in Vibrio cholerae II Dev. Cell. 2003. - V.5. - P. 647-656.

205. Zhu J., Miller M.B., Vance R.E., Dziejman M., Bassler B.L., Mekalanos J.J. Quorum-sensing regulators control virulence gene expression in Vibrio cholerae II Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2002 V.99. - P. 3129-3134.

Информация о работе

Исаев, Николай Джучиевич
кандидата биологических наук
Саратов, 2007
ВАК 03.00.07

Диссертация

Фенотипический и генетический анализ изогенных вариантов холерного вибриона с альтернативным уровнем экспрессии факторов патогенности и персистенции - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы