Фенотип и дифференцировка стволовых клеток амниотической жидкости человека in vitro

Давыдова, Дарья Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Фенотип и дифференцировка стволовых клеток амниотической жидкости человека in vitro
ВАК РФ 03.03.05, Биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации по теме "Фенотип и дифференцировка стволовых клеток амниотической жидкости человека in vitro"

005006964

ДАВЫДОВА ДАРЬЯ АЛЕКСАНДРОВНА

ФЕНОТИП И ДИФФЕРЕНЦИРОВКА СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК АМНИОТИЧЕСКОЙ ЖИДКОСТИ ЧЕЛОВЕКА JN VITRO

Специальность 03.03.05 - биология развития, эмбриология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

1 2 ЯН6 ¿012

Москва 2012

005006964

Работа выполнена в лаборатории проблем клеточной пролиферации Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Научный руководитель:

доктор биологических наук Васильев Андрей Валентинович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук Григорян Элеонора Норайровна

доктор биологических наук Мелехова Ольга Петровна

Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт цитологии РАН

Защита состоится 1 февраля 2012 г. в 14 часов на заседании Диссертационного

совета Д002.238.01 при Учреждении Российской академии наук Институте

биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу: 119334, г. Москва, ул.

Вавилова, д.26

Сайт: http://idbras.comcor.ru

e-mail: idbras@bk.ru

С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН

Автореферат разослан 23 декабря 2011 г.

Ученый секретарь . /'

Диссертационного совета, ¡V; ,/'

кандидат биологических наук ¡¿^ >? Е.Б. Абрамова

ele0806@yandex.ru ^

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Всестороннее исследование биологии стволовых клеток (СК) представляет большой интерес как для решения фундаментальных проблем биологии развития, таких как детерминация и дифференцировка, так и в связи с перспективами применения СК в регенеративной медицине.

В настоящее время СК выделены практически из всех тканей взрослого организма, из эмбрионов и плодов, а также из внезародышевых тканей (Guillot et al., 2006; Mosna et al., 2010). К последним относятся и СК из амниотической жидкости (АЖ). Эти клетки способны к длительной пролиферации in vitro и дифференцировке в производные трех зародышевых листков. В отличие от других клеток из экстраэмбриональных структур, например, плаценты или пуповины, которые становятся доступны только после родов, СК АЖ получают в середине беременности (16-23 нед) в ходе амниоцентеза, проводимого для пренатальной диагностики. Эта процедура безопасна для матери и плода. Таким образом, исследование выделенных из АЖ клеток не сопряжено с этическими проблемами, которые неизбежно возникают при работе с эмбриональными СК (ЭСК) человека. При этом попадают СК в АЖ на самых ранних стадиях эмбриогенеза, т.е. эти клетки могут обладать более примитивным статусом, чем СК из плаценты, пуповины, пуповинной крови или дифференцированных тканей взрослого организма.

Обнаружены СК АЖ были недавно и сейчас активно изучаются (In't Anker et al., 2003; De Coppi et al., 2007a). В настоящее время получено множество данных относительно иммунофенотипа и потенций этих клеток к дифференцировке. Тем не менее, многие из этих данных противоречивы и однозначного определения, к какому типу клеток относить СК АЖ, пока нет.

Целью исследования было изучение фенотипических свойств и дифференцировки стволовых клеток амниотической жидкости человека в условиях in vitro.

В связи с этим были поставлены следующие задачи:

1. Получить культуры стволовых клеток из амниотической жидкости человека второго триместра беременности;

2. Охарактеризовать профиль экспрессии маркеров мезенхимных, нейрапьных и эпителиальных клеток, а также маркеров плюрипотентности в выделенных клетках;

3. Провести клональный анализ и определить степень гетерогенности популяции клеток из амниотической жидкости;

4. Оценить потенции стволовых клеток амниотической жидкости к дифференцировке в разные типы специализированных клеток;

5. Изучить поведение стволовых клеток амниотической жидкости в трехмерном матриксе и оценить их морфогенетический потенциал. Научная новизна и практическая значимость. Впервые выявлено, что СК

АЖ характеризуются коэкспрессией маркеров мезенхимного и эпителиального типов дифференцировки, что отличает их от мезенхимных СК (МСК) из тканей взрослого организма. В условиях культуры эти клетки способны спонтанно и обратимо изменять свою морфологию с мезенхимной на эпителиоподобную.

Впервые показано, что актиновые микрофиламенты формируют в цитоплазме СК АЖ не только типичные для МСК стресс-фибриллы, но и характерный для эпителиальных клеток кольцевой пучок под плазматической мембраной. Таким образом, особенности цитоскелета этих клеток позволяют характеризовать их как клетки смешанного фенотипа.

Впервые получены данные о морфогенетических потенциях СК АЖ, проявляющихся при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки способны образовывать в геле эпителиоподобные структуры - трубочки и цисты. Между СК АЖ выявляются характерные для эпителиальных клеток адгезивные соединения, и одновременно с этим в них сохраняется экспрессия маркеров мезенхимного типа дифференцировки. В совокупности полученные результаты позволили заключить, что выделенные клетки не являются истинно мезенхимными, они проявляют также свойства эпителиальных клеток, т.е. обладают переходным эпителио-мезенхимным фенотипом.

Впервые в культурах СК АЖ выявлены особые межклеточные соединения -нанотрубочки. Через них могут передаваться крупные белковые молекулы и даже целые органеллы.

Полученные данные относительно фенотипических свойств и пластичности СК АЖ свидетельствуют о возможности и перспективности использования этих клеток в клеточных технологиях, в том числе и при лечении некоторых заболеваний т Шего или сразу после рождения. Кроме того, СК АЖ могут быть трансфицированы с целью дальнейшего применения в генной терапии.

Результаты настоящего исследования могут быть использованы в курсе лекций по биологии развития и клеточной биологии.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на Конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (Москва, 2008, 2009); Всероссийском симпозиуме по биологии клетки в культуре «Культивируемые клетки как основа клеточных

технологий» (Санкт-Петербург, 2009); VII Международной конференции «Молекулярная генетика соматических клеток» (Звенигород, 2009); VI Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2009); XVII и XVIII Международных научных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» (Москва, 2010, 2011); III Конференции «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», посвященной памяти академика Н.Г. Хрущева (Москва, 2011).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано И печатных работ. Из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК - 3, тезисов докладов и материалов конференций - 8.

Личное участие автора. Работа выполнена непосредственно автором. Выводы сделаны на основании собственных оригинальных результатов.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 133 страницах, содержит 21 рисунок, 8 таблиц и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения, заключения, выводов и списка литературы, включающего 215 источников.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Культивирование клеток из АЖ. Образцы АЖ (2,5 - 10 мл) от-12 доноров были любезно предоставлены клиникой акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирёва Первого МГМУ им. И.М. Сеченова (Москва) и Центром планирования семьи и репродукции (Москва). АЖ получали в ходе амниоцентеза, проведенного на 16-23 нед беременности для кариотипирования плода. Клетки выделяли центрифугированием (10 мин, 220g) и культивировали в среде а-МЕМ с добавлением 15% ES-FBS (HyClone, США), 2мМ глутамина, 18% Chang В и 2% Chang С (Irvine Scientific, США), 1% пенициллина/стрептомицина при 37°С в атмосфере, содержащей 5% С02. Первый раз смену среды проводили на 5-7 сут, после чего клетки пассировали 1:2, когда они достигали субконфлюэнтного слоя. В дальнейшем пассирование проводили 1:3 на 2-3 сут, когда клетки формировали монослой.

Электронная микроскопия. Клетки АЖ фиксировали в 2,5% растворе глутарового альдегида на 0,1М какодилатном буфере при +4°С в течение 2 ч, дофиксировали 1% раствором осмиевой кислоты и дегидратировали в градиенте этанола и ацетоне (Миронов и др., 1994). Далее для сканирующей электронной микроскопии материал высушивали в критической точке возгонки

углекислоты, проводили напыление сплавом золота и палладия и получали микрографии при помощи сканирующего электронного микроскопа CamScan S-2 (Великобритания) при ускоряющем напряжении 20кВ. Для трансмиссионной электронной микроскопии материал заливали в эпон, получали ультратонкие срезы, докрашивали их водным раствором уранилацетата и цитратом свинца и просматривали в электронном микроскопе Н700 Hitachi (Япония).

Проточная цитофлуориметрия. Экспрессию антигенов в клетках АЖ оценивали на проточном цитофлуориметре Becton Dickinson FACSCalibur (США). Клетки трипсинизировали и окрашивали в течение 30 мин при +4°С связанными с FITC или РЕ антителами против CD13, CD29, CD44, CD106, CD73, CD54, CD45, CD34, CD146, CD90, CD105, CD71, а также антителами против кератина 19 со вторыми антителами, конъюгированными с FITC.

Иммуноцитохимия. Для иммуноцитохимического анализа клетки фиксировали 4% ПФА 30 мин и инкубировали с первыми антителами против маркеров разных типов дифференцировки, разведенными в блокирующем растворе (PBS, 5% бычьего сывороточного альбумина, 0,1% Triton Х-100, 0,1% Tween 20) в течение ночи при +4°С. После этого клетки отмывали PBS и инкубировали со вторыми антителами Alexa Fluor 488 или Alexa Fluor 546 при комнатной температуре в течение 1 ч. Ядра клеток докрашивали DAPI.

Для визуализации актиновых микрофиламентов использовали конъюгированный с флуорохромом фаллоидин (Alexa Fluor 488 Phalloidin, Invitrogen, США). Фиксацию и окраску проводили в соответствии с рекомендациями производителя.

ОТ-ПЦР. Выделение тотальной РНК производилось с помощью TRI® Reagent (Sigma, США) согласно протоколу производителя. мРНК получали с использованием магнитных частиц (Силекс, Россия). Первая цепь кДНК синтезировалась на мРНК с помощью фермента M-MLV обратной транскриптазы. Библиотеки кДНК нормировали по гену домашнего хозяйства, кодирующему рибосомальный белок RPL19. ПЦР со специфическими праймерами проводили с использованием ColoredTaq-полимеразы на амплификаторе Mastercycler (Eppendorf, Германия). ПЦР-фрагменты разделяли электрофоретически в 1% агарозном геле и оценивали уровень экспрессии на УФ-анализаторе гелей (®BIO RAD, США).

Клонирование CK АЖ осуществляли методом серийных разведений. По 100 мкл суспензии клеток (концентрация 1 клетка/мл) вносили в лунку 96-луночного планшета. Через 16-20 ч просматривали планшет и отмечали лунки, содержащие по одной клетке. При достижении в них конфлюэнтного слоя

проводили пассирование сначала в лунку 24-луночного планшета, а затем в чашку Петри 35 мм2.

Индукцию остеогенеза, адипогенеза и миогенеза проводили по стандартной методике (Киселева и др., 2009; Délo et al., 2006).

Для дифференцировки в гепатоциты СК АЖ были посажены на коллаген I типа. Когда клетки достигли субконфлюэнтного слоя, среда культивирования была заменена на бессывороточную среду: Iscove's modified Dulbecco medium (IMDM) с добавлением 20 нг/мл EGF и 10 нг/мл bFGF. Через 2 сут ее сменили на среду следующего состава: 1MDM, 20 нг/мл HGF, 10 нг/мл bFGF, 0,1% ДМСО, в которой клетки культивировали в течение 7 сут. После этого в течение 2 нед клетки культивировали в среде 1MDM с добавлением 1цМ дексаметазона, ITS (1:100), 20нг/мл HGF. Фиксацию осуществляли 4% ПФА и иммуноцитохимически определяли экспрессию маркеров гепатоцитарной дифференцировки: HNF4a, a-фетопротеина, альбумина и c-met.

Дифференцировка в эпидермальные клетки. СК АЖ культивировали в среде для кератиноцитов: ДМЕМ/Р12 с добавлением 10% FBS, 2мМ L-глутамина, 10 нг/мл EGF, 5мкг/мл инсулина, 10"6 М изопротеренола. Смену среды проводили раз в три дня. Через 4 нед клетки фиксировали 4% ПФА и окрашивали антителами к кератину 14 (маркер базальных кератиноцитов).

Культивирование СК АЖ в трехмерном коллагеновом геле. Коллагеновый гель готовили с использованием коллагена I типа, к которому последовательно добавляли смесь бикарбоната натрия и 0,34N NaOH (1:2), L-глутамина и концентрированной (*10) среды М199 (1:25), HEPES и ES-FBS (1:5). В лунку 12-луночного планшета вносили по 1 мл коллагенового геля, содержащего 100 тыс. СК АЖ (пассаж 10). После полимеризации на гель наслаивали 1 мл культуральной среды. Смену среды проводили раз в три дня. Пролиферацию клеток выявляли по включению в ДНК BrdU.

Трансплантация СК АЖ иммунодефицитным животным. Для изучения способности СК АЖ формировать тератомы использовали мышей линии Nude (Питомник лабораторных животных «Пущино»). Экспериментальным животным подкожно вводили по ЗхЮ6 клеток в 100 мкл бессывороточной среды а-МЕМ. Контрольным животным вводили 100 мкл суспензии МСК из жировой ткани человека (45х106 клеток/мл) (отрицательный контроль) или 100 мкл суспензии ЭСК мыши (20х106 клеток/мл) (положительный контроль). В каждой группе было по 3 животных. Животных выводили из эксперимента по мере формирования опухолей (положительный контроль) или через 11 нед после инъекции (экспериментальная группа и отрицательный контроль).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

I. Культура клеток из амниотической жидкости. В работе были использованы 12 образцов АЖ от 12 доноров. По данным цитогенетического анализа, проведенного в лаборатории пренатальной диагностики, у 11 плодов кариотипы были нормальными (46, XX; 46, ХУ), у одного плода был выявлен синдром Дауна (47, ХУ, +21). В результате центрифугирования АЖ получали гетерогенную популяцию клеток, большую часть которой представляли клетки плоского эпителия, которые не прикреплялись к пластику и после первой смены среды на 5-7 сут элиминировались из культуры. Мелкие округлые клетки, напротив, прикреплялись и формировали колонии фибробластоподобных (рис. 1а) и эпителиоподобных (рис. 16) клеток. После первой смены среды фибробластоподобные клетки, в отличие от эпителиоподобных, начинали активно пролиферировать. В течение 4-6 сут они достигали субконфлюэнтного слоя и были пассированы, после чего образования колоний не происходило. Клетки равномерно распределялись по дну лунки и в течение 2-3 сут формировали монослой. После 2-3 пассирований получали морфологически гомогенную популяцию, представленную фибробластоподобными клетками (рис. 1в).

Рис. 1. Клетки АЖ в культуре, (а) первичная колония фибробластоподобных клеток на 9 сут культивирования; (б) первичная колоиия эпителиоподобных клеток на 9 сут культивирования; (в) монослой клеток 8 пассажа. Фазовый контраст, прижизненные фото. Величина шкалы - 200 мкм.

Электронно-микроскопический анализ показал, что клетки в культуре соединялись многочисленными нанотрубочками (рис. 2а), толщина которых составляла 0,02-0,1 мкм. В части нанотрубочек обнаруживались везикулярные расширения - «гондолы» (рис. 26), являющиеся зонами межклеточного транспорта (Уегашс й а/., 2008). Через них могут передаваться как белковые молекулы, так и целые органеллы. Мы впервые выявили такой тип соединений в культурах клеток АЖ.

Рис. 2. Сканирующая электронная микроскопия, (а) СК АЖ соединяются в культуре многочисленными нанотрубочками (н); (б) везикулярные расширения (в.р.) могут быть признаком межклеточного транспорта. Величина шкалы - (а) - 10 мкм; (б) - 3 мкм.

Таким образом, клетки были выделены из всех образцов АЖ (АЖ 1 - АЖ 12). Четыре культуры к настоящему времени прошли 18-24 пассажа, остальные были криоконсервированы на 5-6 пассаже.

II. Характеристика фенотипа по экспрессии молекулярных маркеров.

11.1. Иммуноцитохимический анализ показал, что клетки АЖ (пассаж 2-3) экспрессировали маркеры МСК (СБ 105, СБ73, 8Т1Ю-1, СБ49с1), а также нейральные ((Зз-тубулин, нестин, ОТ, Рахб) и эпителиальные (кератин 19, кератин 18, кератин 7, транскрипционный фактор рбЗ) маркеры (рис. 3). Кератин 14, являющийся маркером ороговевающего эпидермиса, в амниотических клетках не был обнаружен. Кроме того, была выявлена экспрессия маркера СК с-кк и эндотелиального маркера С031, тогда как маркер гематопоэтических СК СБ34 не выявлен.

Рис. 3. Экспрессия маркеров разных типов дифференцировки в культивированных клетках АЖ. Иммуноцитохимия. Ядра клеток докрашены ЭАР! (синий). Величина шкалы - 100 мкм.

11.2. По результатам проточной цитофлуориметрии клетки АЖ (пассаж 6-7) экспрессировали маркеры МСК: СЭ90 (ТЬу-1), СБ73, СБ105, СБ13, СВ29, СБ44, СБ 146, СБ54, СБ71 и не экспрессировали СБ 106 и маркеры

гематопоэтических стволовых/прогениторных клеток CD34, CD45 (рис. 4), что совпадает с имеющимися данными по экспрессии этих антигенов в МСК и CK АЖ (In Ч Anker et al., 2003; Sessarego et al., 2008).

CD73

¡ДА -/W

- ........IT"™'!,' ........... ° i'' iMíf>......i ......¡re

10u 101 10¿ 10J 10 10u 101 10¿ ioJ

FL2-H FL2-H

CD90

10° 10 10u 10'

Рис. 4. Экспрессия маркеров в культивированных клетках АЖ. Проточная цитофлуориметрия.

Из эпителиальных маркеров с помощью проточной цитофлуориметрии был выявлен кератин 19. Следует отметить, что его экспрессировали более 70% клеток и одновременно с этим более 80% экспрессировали маркер МСК СБ 105, и более 95% клеток - СЭ73 (рис. 5). Это свидетельствовало о том, что значительная часть популяции может одновременно экспрессировать два маркера - мезенхимный и эпителиальный.

АЖ 11

АЖ 5

АЖ 7

■ СЭ73 СБ 105 ■ Кератин 19

Рис. 5. Соотношение клеток, экспрессирующих маркеры

мезенхимных и эпителиальных СК, в культурах от разных доноров.

П.З. Чтобы это проверить, мы провели двойное иммуноцитохимическое окрашивание (рис. 6), результаты которого подтвердили наше предположение.

м 1 1 J Я» * * И, 1 I 4 i

V Л/1 ■ . W» W Г 6 ( " A4

» V * • ч * * í t r N

Кератин 19 CD105 DA PI Совмещенное фото

Кератин 19 СИ73 ОАР1 Совмещенное фото

Рис. 6. Двойное иммуноцитохимическое окрашивание маркеров мезенхимных и эпителиальных СК. Величина шкалы - 100 мкм.

Одновременная экспрессия кератина 19 и CD73 наблюдалась в 60,6-93,7% культивированных клеток, коэкспрессия кератина 19 и CD 105 выявлялась в 67,8-100% клеток АЖ.

П.4. Данные ОТ-ПЦР показали экспрессию в клетках АЖ (пассаж 5-6) генов, характерных для мезенхимного (THY-1), нейрального (TUBB3, NES, NS, РАХ6) и эпителиального (KRT19, Р63) типов дифференцировки (рис. 7). Кроме того, с помощью ОТ-ПЦР в этих клетках были выявлены поверхностный маркер C-KIT, гомеобоксный ген PITX2 и некоторые маркеры плюрипотентности - ОСТ4, NANOG, REX1. В то же время экспрессия таких маркеров плюрипотентности, как SOX2 и STELLA, в клетках из АЖ не наблюдалась.

Рис. 7. Экспрессия маркеров дифференцировки и маркеров СК по данным ОТ-ПЦР.

Таким образом, полученные нами клетки АЖ характеризовались экспрессией широкого спектра маркеров. Иммуноцитохимический анализ и проточная цитофлуориметрия выявили высокую степень сходства между культурами от разных доноров. В том числе и культура клеток с аномальным кариотипом (47, ХУ, +21) по морфологическим и иммунофенотипическим характеристикам не отличалась от остальных. В клетках АЖ были обнаружены маркеры мезенхимных и эпителиальных СК, а также маркеры плюрипотентности. Наши результаты во многом совпадают с данными других исследователей об экспрессии маркеров в СК из АЖ. Учитывая это, а также то, что использованный нами способ выделения клеток был основан на ранее описанных методах выделения СК (Ое Сорр1 е/ а/., 2007а; 11оиЬе1ак1з е/ а/., 2007) с модификациями, мы, как и другие исследователи, будем называть полученные клетки СК АЖ. В то же время необходимо добавить, что мы получили дополнительные данные по экспрессии маркеров в СК АЖ, в том числе эпителиальных, а также их коэкспрессии с мезенхимными маркерами. Это может свидетельствовать о том, что статус СК АЖ является более примитивным, чем считалось ранее.

III. Трансплантация стволовых клеток амниотической жидкости иммунодефицитным животным. Поскольку по результатам ОТ-ПЦР анализа в СК АЖ была выявлена экспрессия маркеров плюрипотентности ОСТ4 и

NANOG, мы проверили, способны ли эти клетки формировать тератомы при трансплантации in vivo. Культивированные до 5 пассажа СК АЖ подкожно вводили 2 мес. мышам линии Nude. Через 11 нед после инъекции тератомы не были обнаружены ни у одного животного из экспериментальной группы, а также из группы отрицательного контроля (клетки стромы жировой ткани человека). В то же время при введении ЭСК мыши наблюдалось образование тератом уже через 3-4 нед. Эти результаты согласуются с имеющимися в литературе данными, согласно которым при трансплантации СК АЖ in vivo тератомы не формируются (De Coppi et al, 2007a; Trounson, 2007).

IV. Клонирование стволовых клеток амниотической жидкости.

IV. 1. Морфологическая характеристика клонированных клеток. Поскольку значительная часть клеток популяции экспрессирует 2 типа маркеров, мы провели клональный анализ, для доказательства того, что потомки одной клетки могут экспрессировать маркеры мезенхимы и эпителия. Несмотря на то, что культуры СК АЖ были морфологически гомогенны уже к 2-3 пассажу и в основном были представлены фибробластоподобными клетками, мы выяснили, что эпителиоподобные клетки полностью не исчезали из культуры. При клонировании клеток 7-10 пассажей были получены клоны, различающиеся по морфологии клеток и пролиферативному потенциалу. Часть клонов состояла из крупных распластанных клеток (рис. 8а), которые, по всей видимости, соответствуют эпителиоподобному типу (Hoehn et al., 1974). Скорость пролиферации у таких клеток была низкой, максимальное количество пройденных пассажей составило 5. Другие клоны были представлены фибробластоподобными клетками с большим числом вытянутых отростков (рис. 86); такие клетки активно пролиферироваци и при формировании монослоя приобретали полигональную форму (рис. 8в). Характер роста этих клеток отличался от типичного для эпителиальных, в то же время в монослое они морфологически отличались от фибробластов. Скорее всего, такие клоны представлены специфическими клетками АЖ. Это согласуется с данными других авторов (Hoehn et al., 1974), согласно которым подобные клоны превалируют над остальными и обладают высоким пролиферативным потенциалом. К настоящему времени клетки с описанной морфологией прошли 13 пассажей.

Эффективность клонирования составила 7,4%. Способность клеток к клональному росту служит показателем самоподдержания в культуре и еще раз подтверждает, что выделенные клетки являются стволовыми.

Рис. 8. Клоны СК АЖ. (а) эпителиоподобные клетки; (б) специфические клетки АЖ на 3-4 сут культивирования; (в) монослой специфических клеток АЖ. Фазовый контраст, прижизненные фото. Величина шкалы - 200 мкм.

Отдельно следует отметить явление изменения морфологии клонированных клеток, которое неоднократно наблюдалось в процессе культивирования. Специфические клетки становились сильно распластанными и замедляли скорость пролиферации, т.е. напоминали эпителиоподобные клетки. В течение 7-10 сут они пребывали в таком состоянии и не были пассированы. Затем часть клеток снова вытягивалась, образовывала многочисленные выросты и начинала активно пролиферировать. В течение 2-3 сут такие клетки формировали монослой и далее продолжали делиться с высокой скоростью.

1У.2. Иммуноцитохимический анализ клонированных клеток.

Полученные нами клонированные клетки различались по экспрессии маркеров (таблица). Так в клетках клона 1 была выявлена экспрессия трех типов маркеров - мезенхимных, эпителиальных, нейральных. В противоположность этому в клетках клона 3 выявлялась экспрессия только некоторых из маркеров МСК (СОЮ5, БТ110-1), экспрессии же СБ73 в них не было, так же как экспрессии маркеров эпителиальных и нейральных клеток. Следует отметить, что профиль экспрессии не зависел от морфологических характеристик клонированных СК АЖ.

Таблица. Экспрессия маркеров в клонированных СК АЖ по данным иммуноцитохимии

Маркер Клон 1 Клон 2 Клон 3 Клон 4

Морфология клеток специфические эпителиоподобные специфические специфические

С073 + + - +

СО 105 + + + +

С 029 + + н/о н/о

С044 + + н/о +

8ТКО-1 - - ± н/о

Нестин ± - - н/о

Кератин 19 + + - +

Кератин 7 + н/о н/о н/о

«+» - имеется экспрессия маркера, «-» - экспрессии маркера нет; н/о - не определяли

1У.З. Дифференцировка клонированных клеток. Мы показали, что в исходной неклонированной культуре СК АЖ способны дифференцироваться в типичные для МСК производные - остеоциты и адипоциты, но не в эпидермальные клетки. В следующей части своей работы мы сравнили дифференцировочные потенции двух клонов, максимально различавшихся по экспрессии маркеров - клона 1 и клона 3. Клетки культивировали в индукционных средах для реализации остеогенной и миогенной дифференцировок (производные мезодермы), а также в среде для дифференцировки в гепатоциты (производные энтодермы). Индукцию в эпидермальном направлении (производные эктодермы) мы не проводили, поскольку в исходной неклонированной культуре эта дифференцировка не реализовывалась.

1У.3.1. Остеогенную дифференцировку проводили в течение 3 нед. В результате в культуре клеток клона 1 образовывались кальцификаты, окрашивающиеся красителем ализариновым красным (рис. 9а) и иммуноцитохимически выявлялась экспрессия белка внеклеточного матрикса остеопонтина (рис. 96). В то же время образования кальцификатов в клетках клона 3 не происходило, хотя в них возрастала активность фермента щелочной фосфатазы, являющегося ранним маркером остеогенной дифференцировки (рис. 9в). Возможно, третий клон обладает меньшим остеогенным потенциалом, и для его терминальной дифференцировки требуется больше времени или иные индукторы.

1У.3.2. Миогенез индуцировали добавлением в культуральную среду 5-азацитидина на 24 ч, после чего в культурах обоих клонов наблюдалось образование многоядерных клеток. На 7 сут после индукции в клетках выявлялся транскрипционный фактор МуМ, экспрессирующийся на ранних этапах миогенеза.

IV.3.3. Дифференцировку СК АЖ в гепатоциты проводили в течение 3 нед. В результате в клетках обоих клонов резко возрастала экспрессия а-фетопротеина (рис. 10а), тогда как в контроле этот маркер выявлялся только в отдельных клетках. В то же время маркеры поздних стадий дифференцировки Н№4а и альбумин выявлялись только в клетках клона 1 (рис. 10б-г). Экспрессия рецептора с-ше1 возрастала также только в клетках клона 1, тогда как в клетках клона 3 слабая экспрессия, которая наблюдалась в контроле, после индукции никак не изменялась. Возможно, сниженный уровень

экспрессии с-те! (рецептор НОР) в недифференцированных клетках приводит к тому, что клетки клона 3 в меньшей степени подвергаются индукции.

Рис. 9. Дифференцировка клонированных СК АЖ в остеогенном направлении, (а) выявление кальцификатов, окрашивающихся красителем ализариновым красным; (б) окраска антителами против белка внеклеточного матрикса остеопонтина (красный), ядра докрашены БАР1 (синий); (в) выявление активности щелочной фосфатазы. Величина шкалы - (а, б) - 200 мкм; (в) - 500 мкм.

Рис. 10. Дифференцировка клонированных СК АЖ в гепатоцитарном направлении. Иммуноцитохимия. Окраска антителами против (а) а-фетопротеина (зеленый); (б) альбумина (зеленый); (в) ШМР4а (красный); (г) то же поле зрения, ядра докрашены ОАР1 (синий). Величина шкалы - (а) 200 мкм; (б - г) 100 мкм.

Несмотря на морфологические, иммунофенотипические различия, а также различия в степени дифференцировок, клонированные СК АЖ могут быть индуцированы в остеогенном, миогенном и гепатоцитарном направлениях. При этом клетки, характеризующиеся экспрессией широкого спектра маркеров (мезенхимных, эпителиальных и нейральных), обладают более выраженными потенциями, в то время как клонированные клетки, экспрессирующие только маркеры МСК, обладают меньшими потенциями. В последнем случае мы наблюдали только начальные этапы дифференцировки в разных направлениях, которые проявлялись в экспрессии ранних дифференцировочных маркеров. По всей видимости, таким клеткам необходима более длительная индукция или, возможно, модифицированные протоколы дифференцировки.

Вопрос о происхождении СК АЖ в настоящее время остается открытым. Экспрессия широкого спектра маркеров МСК, фибробластоподобная морфология и спектр возможных дифференцировок этих клеток позволяют предположить, что по своей природе СК АЖ являются мезенхимными. В то же время, этому противоречит экспрессия в них маркеров эпителиальных клеток. Дополнительные сведения, позволяющие уточнить тканевую принадлежность СК АЖ, представляют исследования цитоскелета, а также изучение поведения клеток в 30 условиях.

V. Актиновые микрофиламенты в стволовых клетках амниотической жидкости. Одним из основных компонентов цитоскелета всех эукариотических клеток являются актиновые микрофиламенты. Известно, что они организуют разные структуры в разных типах клеток (Васильев, 2001): в эпителиальных клетках они формируют кольцевой пучок в цитоплазме под плазматической мембраной, в то время как в мезенхимных клетках, в том числе и фибробластах, выявляются стресс-фибриллы актина. В СК АЖ были обнаружены не только стресс-фибриллы, но и кольцевой пучок микрофиламентов (рис. 11).

Фибробласты СК АЖ Кератиноциты

Рис. 11. Организация цитоскелета разных типов клеток. Выявление актиновых микрофиламентов с использованием конъюгированного с флуорохромом Alexa Fluor 488 фаллоидина (зеленый). Ядра клеток докрашены DAPI (синий). Величина шкалы -100 мкм.

Таким образом, особенности организации цитоскелета характеризуют СК АЖ как клетки промежуточного эпителио-мезенхимного фенотипа.

VI. Культивирование стволовых клеток амниотической жидкости в трехмерном коллагеновом матриксе. Известно, что клетки разного происхождения по-разному ведут себя в коллагеновом геле (Brinkmann et al., 1995; Sköld et al., 2000), поэтому мы решили изучить поведение СК АЖ в трехмерном матриксе и оценить их морфогенетический потенциал.

В течение первых суток культивирования в коллагеновом геле клетки располагались поодиночке и сохраняли округлую форму. На 3-4 сут часть клеток вытягивалась, после чего (на 4-6 сут или 9-14 сут) внутри геля происходило образование тубулярных структур, в составе которых обнаруживались как вытянутые, так и округлые клетки (рис. 12а, б). Кроме того, СК АЖ образовывали в геле цисты (рис. 12в). Тубулярные структуры постепенно усложнялись. Активная пролиферация клеток внутри геля подтверждалась включением в ДНК ВгсШ.

в зоне контактов, соединены с пучками микрофиламентов {мф)\ плазматические мембраны соседних клеток формируют пальцевидные инвагинации (и), (а - в) фазовый контраст, прижизненные фото; величина шкалы - 200 мкм; (г) трансмиссионная электронная микроскопия.

Параллельно с процессом тубулогенеза наблюдалась контракция (сокращение диаметра) коллагенового геля, которая завершалась к 15-20 сут. Известно, что фибробласты в коллагеновом геле прекращают пролиферировать и контрактируют его уже к 3-5 сут (Руднева и др., 1990). СК АЖ контрастируют гель позднее, таким образом, динамика процесса в данном случае более сходна с поведением в трехмерном матриксе эпителиальных клеток. На возможную эпителиальную природу СК АЖ также указывает формирование трубчатых структур и цист.

Электронно-микроскопическое исследование выявило базоапикальную поляризацию клеток; на апикальной стороне между СК АЖ формировались типичные для эпителиев адгезивные соединения (adherent junction) (рис. 12г).

Рис. 12. СК АЖ в

трехмерном коллагеновом матриксе.

(а) тубулярные структуры, образующиеся в

коллагеновом геле на 8-9 сут культивирования. В их составе обнаруживаются округлые и вытянутые клетки; (б) поздняя стадия тубулогенеза - 15-18 сут культивирования; (в) циста, сформировавшаяся на 8 сут культивирования; (г) ленточный адгезивный контакт; плотные зоны (пз), прилегающие к

плазматической мембране

При этом по данным иммуноцитохимии при культивировании в геле в клетках сохранялась и экспрессия маркеров мезенхимного типа дифференцировки.

Таким образом, по поведению в трехмерном матриксе, степени и скорости контракции коллагенового геля, выраженному морфогенетическому потенциалу мы можем заключить, что СК АЖ не являются истинно мезенхимными: эти клетки обладают особым эпителио-мезенхимным фенотипом.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Долгое время культивирование клеток АЖ использовалось только для пренатальной генетической диагностики. И лишь недавно было показано, что в АЖ присутствуют СК, которые экспрессируют многие маркеры мезенхимных клеток, обладают адгезией к пластику и способны дифференцироваться в разных направлениях, включая остеогенное, адипогенное и хондрогенное. В связи с этим многие исследователи относят СК АЖ к МСК (Тза1 е/ а!., 2004; Sessarego е( а1, 2008).

Проведенное нами исследование показало, что СК АЖ по многим характеристикам действительно сходны с МСК, однако одновременно с этим и принципиально отличаются от них. В этих клетках выявляются маркеры не только мезенхимного, но и эпителиального типов дифференцировки, что не характерно для МСК, выделенных из тканей взрослого организма. Причем по результатам проточной цитофлуориметрии и иммуноцитохимии коэкспрессия двух типов маркеров наблюдается не в единичных клетках, а в значительной части популяции (вплоть до 100% клеток). Проведенный нами клональный анализ подтвердил эти данные: в потомках одной клетки были выявлены маркеры разных типов дифференцировки. Клонированные СК АЖ способны дифференцироваться в остеогенном, миогенном и гепатоцитарном направлениях.

Мы впервые получили данные о морфогенетических потенциях СК АЖ, проявляющихся при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки сохраняют в геле пролиферативную активность и способны формировать многоклеточные цисты и тубулоподобные структуры - это свойственно эпителиальным клеткам. Кроме того между СК АЖ выявляются типичные для эпителиев адгезивные соединения. При этом в трехмерном

матриксе сохраняется экспрессия маркеров МСК и происходит значительная контракция (сокращение диаметра) коллагенового геля.

Мы также провели исследование особенностей цитоскелета СК АЖ и выявили в них как характерные для мезехимных клеток стресс-фибриллы актина, так и типичный для эпителиальных клеток кольцевой пучок микрофиламентов под плазматической мембраной. Впервые было показано, что СК АЖ в культуре соединяются нанотрубочками, которые обеспечивают тесную взаимосвязь клеток в условиях in vitro.

При проведении клонального анализа мы наблюдали явление изменения морфологических характеристик СК АЖ. Клетки с многочисленными отростками (мезенхимной морфологии) в ходе культивирования становились эпителиоподобными, что сопровождалось резким снижением их пролиферативной активности. В течение нескольких суток они пребывали в таком состоянии, после чего вновь меняли свою морфологию и начинали активно делиться. Таким образом, наблюдаемый нами процесс был обратимым. При этом клонированные клетки разной морфологии экспрессировали маркеры как мезенхимного, так и эпителиального типов дифференцировки. Предположительно СК АЖ могут находиться в состоянии эпителио-мезенхимного перехода, который активно протекает в эмбриогенезе.

Полученные нами результаты в целом опровергают существующее мнение о том, что СК АЖ являются МСК. Эти клетки проявляют многие свойства мезенхимных клеток, в том числе экспрессируют специфические маркеры и способны дифференцироваться в соответствующих направлениях. Однако СК АЖ демонстрируют и свойства эпителиальных клеток. В них выявляются маркеры эпителиального типа дифференцировки, адгезивные соединения, они проявляют морфогенетические потенции эпителиальных клеток в 3D условиях. Кроме того, мы обнаружили, что в условиях культуры СК АЖ способны изменять свою морфологию. Таким образом, выделенные нами клетки обладают особым эпителио-мезенхимным фенотипом и не могут быть отнесены к одному из типов тканей. По всей видимости, эти клетки возникают на самых ранних этапах эмбриогенеза, могут сохраняться в АЖ и в условиях культуры проявлять свою двойственную природу.

выводы

1. Получены культуры клеток из амниотической жидкости человека второго триместра беременности. Выделенные клетки соответствуют критериям стволовых: способны к самоподдержанию, экспрессируют маркеры СК, дифференцируются в разные типы клеток.

2. В условиях in vitro стволовые клетки амниотической жидкости человека экспрессируют маркеры мезенхимного, нейрального и эпителиального типов дифференцировки, а также маркеры плюрипотентности. В культуре доминируют клетки (от 60,6% до 100%), одновременно экспрессирующие маркеры мезенхимной и эпителиальной дифференцировки.

3. Клонированные клетки сохраняют способность к коэкспрессии двух типов маркеров - мезенхимных и эпителиальных. Актиновые микрофиламенты формируют в цитоплазме структуры, характерные как для мезенхимных, так и для эпителиальных клеток. Стволовые клетки амниотической жидкости обладают промежуточным эпителио-мезенхимным фенотипом.

4. Клонированные клетки способны дифференцироваться в остеогенном, миогенном и гепатоцитарном направлениях.

5. Стволовые клетки амниотической жидкости обладают морфогенетическими потенциями, которые проявляются при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки пролиферируют в геле и формируют в нем многоклеточные цисты и тубулоподобные структуры.

6. В культуре стволовые клетки амниотической жидкости контактируют с помощью особых межклеточных соединений - нанотрубочек. Обнаруженные в них везикулярные расширения могут быть признаком межклеточного транспорта.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

Статьи:

1. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Смирнова Ю.А., Зиновьева Р.Д., Романов Ю.А., Кабаева Н.В., Терских В.В., Васильев A.B. Характеристика фенотипа клеток из амниотической жидкости человека // Acta Naturae. 2009. № 2. С. 112-119.

2. Давыдова Д.А. Стволовые клетки в амниотической жидкости человека // Известия РАН. Сер. биол. 2010. № 5. С. 517-526.

3. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Брагина Е.Е., Терских В.В., Васильев A.B. Культивирование стволовых клеток амниотической жидкости человека в трехмерном коллагеновом матриксе // Цитология. 2011. Т. 53. №4. С. 325-331.

Тезисы конференций:

1. Давыдова Д.А. Характеристика клеток из амниотической жидкости человека// Онтогенез. 2009. Т. 40, № 4. с. 310-311.

2. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Смирнова Ю.А., Романов Ю.А., Васильев A.B., Терских В.В. Амниотическая жидкость - перспективный источник клеток для клеточной терапии // Цитология. 2009. Т. 51, № 9. С. 760.

3. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Васильев A.B., Терских В.В. Клетки из амниотической жидкости в разных системах культивирования // VII Международная конференция «Молекулярная генетика соматических клеток». Звенигород, 2009. Сборник тезисов конференции. С. 70.

4. Давыдова Д.А., Воротеляк Е.А., Смирнова Ю.А., Романов Ю.А., Васильев A.B., Терских В.В. Клетки амниотической жидкости человека: профиль экспрессии генов и поведение в трехмерном матриксе // VI Международная конференция «Молекулярная медицина и биобезопасность». Москва, 2009. Сборник тезисов конференции. С. 75-76.

5. Давыдова Д.А. Дифференцировочный потенциал клеток из амниотической жидкости человека // Онтогенез. 2010. Т. 41, № 6. С. 468.

6. Давыдова Д.А. Тубулогенез клеток амниотической жидкости в коллагеновом геле // XVII Международная научная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2010». Москва, 2010. Сборник тезисов конференции. С. 298.

7. Давыдова Д.А. Типы межклеточных контактов в культуре стволовых клеток амниотической жидкости: нанотрубочки и адгезивные соединения // XVIII Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2011». Москва, 2011. Сборник тезисов конференции. С. 287.

8. Васильев A.B., Роговая О.С., Петракова О.С., Давыдова Д.А., Киселева Е.В., Гвазава И.Г., Дашинимаев Э.Б. Пластичность стволовых клеток -границы и возможности // III Конференция «Биология стволовых клеток: фундаментальные аспекты», посвященная памяти академика Н.Г. Хрущева. Москва, 2011. Сборник тезисов конференции. С.26-28.

Работа выполнена на оборудовании Центра коллективного пользования «По биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов» на базе Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.

Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 09-04-12132-офи-м) и Минобрнауки России (государственный договор№13.G25.il.0080 от 22 октября 2010).

Заказ № 76-АЛ2/2011 Подписано в печать 21.12.2011 Тираж 100 экз. Усл. пл. 1.0

, ООО "Цифровичок", тел. (495) 649-83-30

\ V)) \vw\v. ф ги ; е-таИ:гак@ф. ги

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Давыдова, Дарья Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Амниотическая жидкость: происхождение, функции, состав.

1.2. Общая характеристика клеток амниотической жидкости.

1.3. Стволовые клетки из амниотической жидкости.

1.4. Потенции стволовых клеток амниотической жидкости к дифференцировке in vitro.

1.4.1. Остеогенная дифференцировка.

1.4.2. Адипогенная дифференцировка.

1.4.3. Хондрогенная дифференцировка.

1.4.4. Миогенная дифференцировка.

1.4.5. Дифференцировка в кардиомиоциты.

1.4.6. Дифференцировка в эндотелиальные клетки.

1.4.7. Кроветворные клетки.

1.4.8. Дифференцировка в гепатоциты.

1.4.9. Дифференцировка в р-клетки поджелудочной железы.

1.4.10. Нейральная дифференцировка.

1.5. Трансплантация стволовых клеток амниотической жидкости без предварительной дифференцировки in vitro.

1.5.1. Мечение клеток перед трансплантацией.

1.5.2. Интеграция клеток в ткани почки.

1.5.3. Интеграция и дифференцировка в клетки эпителия легкого.

1.5.4. Интеграция СК АЖ в ткани кишечника.

1.5.5. Интеграция СК АЖ в ткани печени.

1.5.6. Трансплантация СК АЖ при инфаркте миокарда.

1.5.7. Трансплантация СК АЖ и мионекроз.

1.5.8. Трансплантация СК АЖ при повреждении периферических нервов.

I.6. Получение индуцированных пторипотентных клеток из стволовых клеток амниотической жидкости.

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

II.1. Культивирование клеток,из амниотической жидкости.

11.2. Сканирующая-электронная микроскопия.

11.3. Проточная цитофлуориметрия.

11.4. Иммуноцитохимия.

11.5. ОТ-ПЦР.

11.6. Клонирование стволовых клеток амниотической жидкости.

II;7. Индукция дифференцировок стволовых клеток амниотической жидкости.

11.7.1. Индукция остеогенеза.

11.7.2. Индукция адипогенеза.

11.7.3. Индукция миогенеза.47

11.7.4. Дифференцировка в гепатоциты.

И.7.5. Дифференцировка в эпидермальные клетки.

11.8. Культивирование стволовых клеток амниотической жидкости в трехмерном коллагеновом матриксе.

II.8.1. Выделение коллагена изхвостов крыс.

II.8.2 Приготовление коллагенового геля.

II.8.3. Включение BrdU.

II.8.4: Электронно-микроскопическое исследование СК АЖ, культивированных в коллагеновом геле.

11.9. Индукция экспрессии в стволовых клетках амниотической жидкости молекул главного комплекса гистосовместимости интерфероном-у.

II. 10. Трансплантация стволовых клеток амниотической жидкости иммунодефицитным животным.

III. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

III. 1. Культивирование клеток из амниотической жидкости.

111.2. Сканирующая электронная микроскопия.

111.3. Характеристика фенотипа по экспрессии молекулярных маркеров.

III.3.1. Иммуноцитохимический анализ.

Ш.3.2. Проточная цитофлуориметрия.

Ш.З.З. Двойное иммуноцитохимическое окрашивание.

Ш.3.4. ОТ-ПЦР.

Ш.4. Дифференцировка стволовых клеток амниотической жидкости.

111.4.1. Остеогенная дифференцировка.

Ш.4.2. Адипогенная дифференцировка.

П1.4.3. Эпидермальная дифференцировка.

III. 5. Трансплантация стволовых клеток амниотической жидкости иммунодефицитным животным.

Ш.6. Клонирование стволовых клеток амниотической жидкости.

Ш.6.1. Морфологическая характеристика клонированных клеток.

Ш.6.2. Иммуноцитохимический анализ клонированных клеток.

Ш.6.3. Дифференцировка клонированных клеток.

Ш.6.3.1 Остеогенная дифференцировка.

III.6.3.2. Миогенез.

Ш.6.3.3. Дифференцировка в гепатоциты.

Ш.7. Стволовые клетки амниотической жидкости в трехмерном коллагеновом матриксе.!.

Ш.7.1. Культивирование СК АЖ в коллагеновом геле.

Ш.7.2. Электронно-микроскопическое исследование СК АЖ, культивированных в геле.

Ш.7.3. Иммуноцитохимический анализ СК АЖ, культивированных в геле.

III.8. Актиновые микрофиламенты в стволовых клетках амниотической жидкости.

Ш.9. Индукция интерфероном-у.

IV. ОБСУЖДЕНИЕ.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Фенотип и дифференцировка стволовых клеток амниотической жидкости человека in vitro"

Стволовые клетки (СК) привлекают внимание биологов многих специальностей. Это - связано с тем, что всестороннее исследование их биологии представляет большой интерес не; только, для решения таких фундаментальных проблем биологии; развития как детерминация? и дифференцировка, но и в связи с перспективами применения СК в регенеративной медицине.

В иерархии СК, построенной на основе способности дифференцироваться; в разные типы, клеток: и уровня пролиферативной активности, первое место занимают эмбриональные стволовые клетки (ЭСК), выделяемые: из ; внутренней: клеточной, массы бластоцисты. ЭСК являются; шпорипотентными, т.е. способны дифференцироваться во все типы клеток взрослого организма; включая половые. В условиях in vitro они способны к неограниченно длительной? пролиферации; сохраняют недифференцированный статус,, клоногенность и длину теломерных фрагментов} (Thomson et al., 1998; Huang et al:,. 2007): Эти< клетки: являются удобным модельным объектом, однако исследование ЭСК человека, сопряжено с рядом проблем; в том числе этических, связанных- с использованием; эмбрионов человека.

СК выделены из многих тканей* плода (фетальные СК): печени, костного мозга, селезенки, крови;, почки, и легкого- (Sessarego et al., 2008; Gucciardb et al., 2009; Pozzobon et al., 2010). Они; обладают достаточно высокой способностью к пролиферации и пластичностью. Однако исследование- фетальных СК человека встречает те же препятствия, что; и изучение ЭСК.

Фетальные СК обнаруженные в> экстраэмбриональных тканях: плаценте (Yen e/ al., 2005), амниотической мембране (Toda eí а/., 2007), амниотической жидкости (АЖ) (De Coppi et al., 2007a), пуповине (Romanov et al., 2003) и пуповинной крови (Marcus, Woodbury, 2008). Эти клетки пролиферируют активнее, чем CK тканей взрослого организма и способны дифференцироваться в производные разных зародышевых листков. Способ получения? этих клеток исключает все возможные этические проблемы: клетки; АЖ получают в ходе процедуры амниоцентеза (второй триместр беременности); либо во время кесарева сечения (третий триместр). Амниотическая мембрана, плацента, пуповина и пуповинная кровь становятся доступны сразу после родов.

CK были выделены также из многих дифференцированных тканей: взрослого организма, в том числе из костного- мозга (Bianco et al., 2001; Mosna et al., 2010), скелетных мышц (Williams et al., 1999), жировой ткани (Киселева, Васильев, 2009); периферической крови (Zvaiflëretral., 2000); синовиальной" мембраны (De Bari- et al., 2001), надкостницы. (Ringe et al.,

2008), пульпы зуба (Ballini et al., 2007); Эти клетки обладают более ограниченной способностью к пролиферации и дифференцировке, чем ЭСК и фетальные CK. Кроме того, в организме взрослого человека CK мало (в костном мозге.они составляют всего 0,001%-0,01% от общего числа клеток) и их число уменьшается; с возрастом (Sessarego et al., 2008). Br некоторых случаях (например; при выделении клеток из костного мозга) процедура получения.материала сложна и травматична.

Несколько лет назад была разработана технология, получения плюрипотентных клеток из дифференцированных клеток взрослого организма путем генетической модификации (Takahashi, Yamanaka, 2006; Shi

2009); Такие клетки получили название клеток с индуцированной плюрипотентностью (iPS cells); Они экспрессируют спектр маркеров ЭСК и дифференцируются in vitro в производные трех зародышевых листков. Получение iPS клеток не вызывает этических споров, т.к. при; этом не происходит уничтожение эмбрионов, человека, однако, возможность их использования в клеточных технологиях, по всей видимости, ограничивается туморогенностью.

Таким* образом, клетки из экстраэмбриональных тканей являются одними из наиболее перспективных кандидатов для. использования в клеточной терапии. Тем более что в таком случае появляется возможность использования аутологичных клеток. Однако в настоящее время именно1 эти клетки, пожалуй, наименее изучены из всех типов СК. В особенности это касается клеток АЖ. Связано это с тем, что в АЖ присутствуют самые разные клетки: от терминально дифференцированных до СК. Кроме того, на протяжении беременности состав АЖ (ее клеточный компонент) может меняться. В основном в настоящее время данные получены на клетках, выделенных из образцов второго триместра беременности (16-20 нед), поскольку в это время проводится процедура пренатальной диагностики (амниоцентез) и получение АЖ является, безопасным, для матери и плода (De Coppi et al., 2007a). Данных по клеткам третьего триместра пока мало, но достоверно известно, что СК присутствуют в АЖ и на поздних сроках (You et al., 2008). Показано, что по своим свойствам такие клетки схожи с, СК АЖ второго триместра беременности. Тем не менее, природа, и дифференцировочный потенциал СК АЖ плюрипотентность/мультипотентность) в настоящее - время точно- не установлены.

Задачи исследования: Получить культуры стволовых клеток из амниотической жидкости человека второго триместра беременности:

Охарактеризовать профиль экспрессии маркеров мезенхимных, нейральных и эпителиальных клеток, а также маркеров плюрипотентности в выделенных клетках.

Провести клональный анализ и определить степень гетерогенности популяции клеток из амниотической жидкости.

Оценить потенции стволовых клеток амниотической жидкости к дифференцировке в разные типы специализированных клеток. Изучить поведение стволовых клеток амниотической жидкости в трехмерном матриксе и оценить их морфогенетический потенциал.

I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Заключение Диссертация по теме "Биология развития, эмбриология", Давыдова, Дарья Александровна

ВЫВОДЫ

2. В условиях in vitro стволовые клетки амниотической жидкости человека экспрессируют маркеры мезенхимного, нейрального и эпителиального типов дифференцировки, а также маркеры плюрипотентности. В культуре 4 доминируют клетки (от 60,6% до 100%), одновременно экспрессирующие маркеры мезенхимной и эпителиальной дифференцировки.

3. Клонированные клетки сохраняют способность к коэкспрессии двух типов маркеров — мезенхимных и эпителиальных. Актиновые микрофиламенты формируют в цитоплазме структуры, характерные как для мезенхимных, так и для эпителиальных клеток. Стволовые клетки амниотической жидкости обладают промежуточным эпителио-мезенхимным фенотипом.

5. Стволовые клетки амниотической жидкости обладают морфогенетическими потенциями, ' которые проявляются при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки пролиферируют в геле и формируют в нем многоклеточные цисты и тубулоподобные структуры.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Культивирование клеток АЖ в настоящее время широко используется как для пренатальной диагностики различных генетических заболеваний, так и для фундаментальных исследований (Siddiqui, Atala, 2004; Баранов, Кузнецова, 2007). Было показано, что в АЖ присутствуют СК, которые экспрессируют многие маркеры мезенхимных клеток, обладают адгезией к пластику и способны дифференцироваться в разных направлениях, включая остеогенное, адипогенное и хондрогенное. В связи с этим многие исследователи относят СК АЖ к МСК. Однако происхождение этих клеток точно неизвестно, а их - дифференцировочный статус (плюрипотентность/мультипотентность) в настоящее время обсуждается. Целью нашей работы было изучение фенотипических свойств и дифференцировки СК АЖ человека.

Проведенное нами исследование показало, что СК АЖ по многим характеристикам действительно сходны с МСК, однако одновременно с этим и принципиально отличаются от них. Кроме мезенхимных эти клетки экспрессируют нейральные маркеры, что не противоречит их классификации как МСК. Однако в СК АЖ выявляются также маркеры эпителиальных ч клеток, что не характерно для МСК, выделенных из дифференцированных тканей взрослого организма. Причем по • данным проточной г цитофлуориметрии и двойного имуноцитохимического окрашивания коэкспрессия двух типов маркеров наблюдается не в единичных клетках, а в значительной части популяции (вплоть до 100% клеток). Клональный анализ подтвердил эти данные: в потомках одной клетки выявлены маркеры разных типов дифференцировки. Клонированные СК АЖ' способны дифференцироваться в производные, по меньшей мере, двух зародышевых листков - мезодермы и энтодермы.

По результатам ОТ-ПЦР анализа в СК АЖ обнаружены не только маркеры мезенхимных (77/7-7), нейральных (TUBB3, NESTIN, NS, РАХб) и эпителиальных клеток (KRT19, Р63), но и некоторые из маркеров плюрипотентности (ОСТ4, NANOG, REX1). При этом в отличие от ЭСК, СК АЖ не формируют тератомы при трансплантации in vivo.

Мы впервые получили данные о морфогенетических потенциях СК АЖ, проявляющихся при культивировании в трехмерном коллагеновом матриксе. Клетки сохраняют в геле пролиферативную активность и способны формировать многоклеточные цисто- и тубулоподобные структуры — это свойственно эпителиальным клеткам. Кроме того между СК АЖ выявляются типичные для эпителиев адгезивные соединения. При этом в трехмерном матриксе сохраняется экспрессия маркеров мезенхимных клеток и происходит значительная контракция (сокращение диаметра) коллагенового геля.

При проведении клонального анализа мы наблюдали интересное явление изменения морфологических характеристик СК АЖ. Клетки с многочисленными отростками (мезенхимной морфологии) в ходе культивирования становились эпителиоподобными, что сопровождалось резким снижением их пролиферативной активности. В течение нескольких суток они пребывали в таком состоянии, после чего вновь меняли свою морфологию и начинали активно делиться. Таким образом, наблюдаемый нами процесс был обратимым. При этом клонированные клетки разной морфологии экспрессировали маркеры как мезенхимного, так и эпителиального типов дифференцировки. Предположительно СК АЖ могут находиться в состоянии ЭМП, который активно протекает в эмбриогенезе.

Полученные нами результаты в целом противоречат существующему мнению о том, что СК АЖ являются МСК. Эти клетки проявляют многие свойства мезенхимных клеток, в том числе экспрессируют специфические маркеры и способны дифференцироваться в соответствующих направлениях. Однако СК АЖ демонстрируют и свойства эпителиальных клеток. В них выявляются маркеры эпителиального типа дифференцировки, адгезивные соединения, они проявляют морфогенетические потенции эпителиальных клеток в 3D условиях. Кроме того, мы обнаружили, что в условиях культуры СК АЖ способны изменять свою морфологию. Таким образом, выделенные нами клетки обладают особым переходным эпителио-мезенхимным фенотипом и не могут быть отнесены к одному из типов тканей: По всей видимости, эти клетки возникают на самых ранних этапах эмбриогенеза, могут сохраняться в АЖ и в условиях культуры проявлять свою двойственную природу. В свете полученных данных интересным представляется изучение возможной физиологической роли этих клеток, например, в поддержании иммунотолерантности и обеспечении нормального течения беременности.

Клетки, способные к длительной пролиферации in vitro и обладающие широкими дифференцировочными потенциями, являются перспективными для исследований в области клеточных технологий. Высокая эффективность трансфекции свидетельствует о возможности использования СК АЖ для генной терапии. Получение клеток в середине беременности открывает перспективы лечения некоторых заболеваний in utero или сразу после рождения, что предотвращает развитие вторичных повреждений. Таким образом, исследования СК, выделенных из АЖ, важны, не только для решения фундаментальных вопросов биологии развития, таких как детерминация и дифференцировка, они имеют и прикладное значение.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Давыдова, Дарья Александровна, Москва

1. Анфиногенов В.А., Мымрина H.A., Терских В.В. Взаимодействие эпидермальных кератиноцитов и фибробластов в процессе формирования живого эквивалента кожи // Цитология. 1992. Т. 34. № 11/12. С. 60-65.

2. Баранов B.C., Кузнецова Т.В. Цитогенетика эмбрионального развития человека. С.-Петербург: H.-JL, 2007. 639 с.

3. Васильев Ю.М. Клетка как чудо архитектуры. Ч. 5: Клетка перестраивает архитектуру // Соросовский образовательный журнал. 2001. Т. 7. № 11. С.2-6.

4. Васильев Ю.М. Перестройки молекулярной морфологии эпителиальных и соединительно-тканных клеток в нормальных морфогенезах и при канцерогенезе // Биохимия. 2008. Т. 73. № 5. С. 656-660.

5. Воротеляк Е.А., Чермных Э.С., Васильев A.B., Терских В.В: Экспрессия Кератина 19 в культуре эпидермальных кератиноцитов человека // Доклады Акад. Наук. 2006. Т. 408. № 6. С. 835-837.

6. Киселева Е.В., Васильев A.B. Биология стволовых клеток и клеточные технологии // Мультипотентные клетки стромы жировой ткани/ Москва: издательство "Медицина", 2009. Т. 2. С. 124-162.

7. Миронов A.A., Комиссарчик Я.Ю., Миронов В.А. Методы электронной микроскопии в биологии и медицине: методическое руководство. С.Петербург: Наука, 1994. 400 с.

8. Роговая О.С., Васильев А.В., Киселев И.В., Терских В.В. Использование фибробластов человека, выращенных на микроносителях, для формирования эквивалентов соединительной ткани // Онтогенез. 2004. Т. 35. №2. С. 105-109.

9. П.Руднева С.В., Голубков С.П., Гаряев А.А., Терских В.В., Дудкин С.М. Контракция коллагенового геля фибробластами эмбриона человека: влияние факторов роста // Биол. мембраны. 1990. Т. 7. № 12. С. 12831288.

10. Abdulrazzak H., Moschidou D., Jones G., Guillot P.V. Biological characteristics of stem cells from foetal, cord blood and extraembryonic tissues // J. R. Soc. Interface. 2010. V. 7. Suppl 6. P. 689-706.

11. Antonucci I., Pantalone A., De Amicis D., D'Onofrio S., Stuppia L., Palka G., Salini V. Human amniotic fluid stem cells culture onto titanium screws: a new perspective for bone engineering // J. Biol. Regul. Homeost. Agents. 2009b. V.23.№4. P. 277-279.

12. Arnhold S., Post C., Gliier S., Hoopmann M., Wenisch S., Volpers C., Addicks K. Neuronal characteristics of amniotic fluid derived cells after adenoviral transformation// Cell Biol. Int. 2008. V. 32. № 12. P. 1559-1566.

13. Augello A., Kurth T.B., De Bari C. Mesenchymal stem cells: a perspective from in vitro cultures to in vivo migration and niches // Eur. Cell. Mater. 2010. V. 20. P. 121-133.

14. Baghaban Eslaminejad M., Jahangir S., Aghdami N. Mesenchymal stem cells from murine amniotic fluid as a model for preclinical investigation // Arch. Iran. Med. 2011. V. 14. № 2. P. 96-103.

15. Benson P.F. Antenatal detection of genetic enzyme defects // Proc. R. Soc. Med. 1971. V. 64. № 11. P. 1137-1139.

16. Bertani N., Matatesta P., Volpi G., Sonego P., Perris R. Neurogenic potential of human mesenchymal stem cells revisited: analysis by immunostaining, timelapse video and microarray // J. Cell Sci. 2005. V. 118. P. 3925-3936.

17. Bianco P., Riminucci M., Gronthos S., Robey P.G. Bone marrow stromal stem cells: nature, biology, and potential applications // Stem Cells. 2001. V. 19. № 3.P. 180-192.

18. Bobrow M., Evans C.J., Noble J., Patel C. Cellular content of amniotic fluid as predictor of central nervous system malformations // J. Med. Genet. 1978. V. 15. №2. P. 97-100.

19. Brinkmann V., Foroutan H., Sachs M., Weidner K.M., Birchmeier W. Hepatocyte growth factor/scatter factor induces a variety of tissue-specific morphogenic programs in epithelial cells. J. Cell Biol. 1995. V. 131. № 6 (Pt 1). P. 1573-1586.

20. Chamberlain G., Fox J., Ashton B., .Middleton J. Concise review: mesenchymal stem cells: their phenotype, differentiation capacity,immunological features, and potential for homing // Stem Cells. 2007. Y. 25. № 11. P. 2739-2749.

21. Chang F. Desmoplastic small round cell tumors: cytologic, histologic, and immunohistochemical features // Arch. Pathol. Lab. Med. 2006. V. 130. № 5. P. 728-732.

22. Chang C.-J., Yen M.-L., Chen Y.-C., Chien C.-C., Huang H.-I., Bai C.-H., Yen

23. B.L. Placenta-derived multipotent cells exhibit immunosuppressive properties that are enhanced in the presence of interferon-y // Stem Cells. 2006. V. 24. P. 2466-2477.

24. Chen F.H., Tuan R.S. Mesenchymal stem cells in arthritic diseases // Arthritis Res. Ther. 2008. V. 10. № 5. P. 223.

25. Chen J., Lu Z., Cheng D., Peng S., Wang H. Isolation and characterization of porcine amniotic fluid-derived multipotent stem cells // PLoS One. 2011. V. 6. №5. P. 19964-19973.

26. Chen M.-L., Lee K.-D., Huang H.-C., Tsai Y.-L., Wu Y.-C., Kuo T.-M., Hu

27. C.-P., Chang C. HNF-4a determines hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells from bone marrow // World J. Gastroenterol. 2010a. V. 16. №40. P. 5092-5103.

28. Chen Q., Xiao P., Chen J.N., Cai J.Y., Cai X.F., Ding H., Pan Y.L. AFM studies of cellular mechanics during osteogenic differentiation of human amniotic fluid-derived stem cells // Anal. Sci. 2010b. V. 26. № 10. P. 10331037.

29. Chen W.Q., Siegel N., Li L., Pollak A., Hengstschlager M., Lubec G. Variations of protein levels in human amniotic fluid stem cells CD 117/2 over passages 5-25 //J. Proteome Res. 2009. V. 8. № 11. P. 5285-5295.

30. Cremonesi F., Corradetti B., Lange Consiglio A. Fetal adnexa derived stem cells from domestic animal: progress and perspectives // Theriogenology. 2011. V. 75. №8. P: 1400-1415.

31. Crouch E., Balian G., Holbrook K., Duksin D., Bornstein P. Amniotic fluid fibronectin. Characterization and synthesis by cells in culture // J. Cell Biol. 1978. V. 78. №3. P. 701-715.

32. Dahlstrand1 J., Zimmerman L.B., McKay R.D., Lendahl U. Characterization of the human nestin gene reveals a close evolutionary relationship to neurofilaments // J. Cell Sci. 1992. V. 103 (Pt 2). P .589-597.

33. Dai W., Kloner R.A. Myocardial regeneration by human amniotic fluid stem cells: Challenges to be overcome // J. Mol. Cell. Cardiol. 2007. V. 42., P. 730732.

34. De Ban C., DellAccio F., Tylzanowski P., Luyten F.P. Multipotent mesenchymal stem cells from adult human synovial membrane // Arthritis Rheum. 2001. V. 44. № 8. P. 1928-1942.

35. De Coppi P., Soker S., Atala A. Stem cells derived from amniotic fluid and placenta // In: Principles of Regenerative Medicine. Burlington, Elsevier Academic press. 2008. P. 226-237.

36. Dejana E. Endothelial cell-cell junctions: happy together // Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 2004. V. 5. № 4. P. 261-270.

37. Dejana E., Corada M., Lampugnani M.G. Endothelial cell-to-cell junctions // FASEB J. 1995. V. 9. № 10. P. 910-918.

38. Delo D.M., De Coppi P., Bartsch G., Jr, Atala A. Amniotic fluid and placental stem cells // In: Methods in Enzymology. Burlington, Elsevier Academic press. 2006. V. 419. P. 426-438.

39. Delo D.M., Guan X., Wang Z., Groban L., Callahan M., Smith T., Sane D.C., Payne R.M., Atala A., Soker S. Calcification» after myocardial' infarction is independent of amniotic fluid stem cell injection // Cardiovasc. Pathol. 2011. V. 20. № 2. P. 69-78.

40. Delo D.M., Olson J., Baptista P.M., D'Agostino R.B. Jr., Atala A., Zhu J.M., Soker S. Non-invasive longitudinal tracking of human amniotic fluid stem cells in the mouse heart// Stem Cells Dev. 2008. V. 17. № 6. P. 1185-1194.

41. Donaldson A.E, Cai J., Yang M., Iacovitti L. Human amniotic fluid stem cells do not differentiate into dopamine neurons in vitro or after transplantation invivo // Stem Cells Dev. 2009. V. 18. № 7. p. 1003-1012.

42. Ferdaos N., Nathan S., Nordin N. Prospective full-term-derived pluripotent amniotic fluid stem (AFS) cells // Med. J. Malaysia. 2008. V. 63. Suppl A. P. 75-76.

43. Gallagher K.L., Benfey P.N. Not just another hole in the wall: understanding intercellular protein trafficking // Genes Dev. 2005. V. 19. № 2. P. 189-195.

44. Gekas J., Walther G., Skuk D., Bujold E., Harvey I., Bertrand O.F. In vitro and in vivo study of human amniotic fluid-derived stem cell differentiation into myogenic lineage // Clin. Exp. Med. 2010. V. 10. № 1. P. 1-6.

45. Ghionzoli M., Cananzi M., Zani A., Rossi C.A., Leon F.F., Pierro A., Eaton S., De Coppi P. Amniotic fluid stem cell migration after intraperitoneal injection in pup rats: implication for therapy // Pediatr. Surg. Int. 2010. V. 26. № 1. P. 79-84.

46. Gosden C.M. Amniotic fluid cell types and culture // Br. Med. Bull. 1983. V. 39. № 4. P. 348-354.

47. Guan X., Delo D.M., Atala A.,, Soker S. In vitro cardiomyogenic potential of human amniotic fluid'stem cells // J. Tissue Eng. Regen. Med. 2011. V. 5: № 3. P. 220-228.

48. Gucciardo E., EoriesR., Ochsenbein-Kolble N., Done E., Zwijsen. A., Deprest J. Fetal mesenchymal stem cells: isolation, properties and potential use in perinatology and regenerative medicine// BJOG. 2009. V. 116: №-2. P. 166: 172. '

49. I Iauser P.V., De Fazio R:, Bruno S., Sdei S., Grange C., Bussolati B., Benedetto C., Camussi G. Stem' cells derived1 from human, amniotic fluid contribute to acute kidney injury recovery // Am. J. Pathol. 2010. V. 177. № 4. P. 2011-2021.

50. He X.-Y., Zheng Y.-M., Qiu S., Qi Y.-P:, Zhang Y. Adipogenic differentiation and EGFP gene transfection of amniotic fluid-derived; stem, cells from: goat fetus at terminal gestational age // Cell Biol. Int. 2011. V. 35. № 8. P; 789-792.

51. Higuchi A., Shen P.Y., Zhao J.K., Chen C.W., Ling Q.D., Chen H:, Wang H.C., Bing J.T., Hsu S.T. Osteoblast differentiation of amniotic fluid-derived stem cells- irradiated with visible light // Tissue Eng. Part A. 2011. V. 17. № 21-22. P: 2593-2602.

52. Hipp J.A., Hipp J.D., Atala A., Soker S. Ethanol alters the osteogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem, cells // Alcohol: Clin:. Exp. Res. 2010. V. 34. № 10. P. 1714-1722.

53. Hoehn H., Bryant E.M., Karp L.E., Martin G.M. Cultivated cells from diagnostic amniocentesis in second trimester pregnancies. I. Clonal morphology and growth potential // Pediat. Res. 1974. V. 8. P. 746-754.

54. Hsiao Y.-H., Su Y.A., Tsai. H.-D., Mason J.T., Chou M.-C., Man Y.-G. Increased invasiveness and aggressiveness in breast epithelia with cytoplasmic p63 expression // Int. J. Biol. Sci: 2010. V. 6. № 5. P. 428-442.

55. Jezierski A., Gruslin A., Tremblay R., Ly D., Smith C., Turksen K., Sikorska M:5 Bani-Yaghoub M. Probing sternness and neural commitment in human amniotic fluid cells // Stem Cell'Rev. 2010.' V. 6. № 2. P. 199-214.

56. Jiang T.M., Yang Z.J., Kong C.Z., Zhang H.T. Schwann-like cells can be induction from human nestin-positive amniotic fluid mesenchymal stem cells // In Vitro Cell. Dev. Biol. Anim. 2010. V. 46. № 9. P. 793-800.

57. Kalluri R. EMT: when epithelial cells decide to become mesenchymal-like cells//J. Clin. Invest. 2009. V. 119. № 6. P. 1417-1419.

58. Kalluri R., Weinberg R.A. The basics of epithelial-mesenchymal transition // J. Clin. Invest. 2009. V. 119. № 6. P. 1420-1428.

59. Kim Y.W., Kim H.J., Bae S.M., Kim Y.J., Shin J.C., Chun H.J., Rhie J.W., Kim J., Kim H., Ahn W.S. Time-course Transcriptional Profiling of Human Amniotic Fluid-derived Stem Cells Using Microarray // Cancer Res. Treat. 2010. V. 42. №2. P. 82-94. ' :

60. Klein J.D., Turner C.G., Ahmed A., Steigman S.A., Zurakowski D., Fauza D.O. Chest wall repair with engineered fetal bone grafts: an efficacy analysis inan autologous leporine model // J. Pediatr. Surg. 2010. V. 45. № 6. P. 13541360.

61. Klein J.D., Turner C.G., Steigman S.A., Ahmed A., Zurakowski D., Eriksson E., Fauza D.O. Amniotic mesenchymal stem cells enhance normal fetal wound healing // Stem Cells Dev. 2011. V. 20. № 6. P. 969-976.

62. Klemmt P.A., Vafaizadeh V., Groner B. Murine amniotic fluid stem cells contribute mesenchymal but not epithelial components to reconstituted mammary ducts // Stem Cell Res. Ther. 2010. V. 1. № 3. P. 20.

63. Kolambkar Y.M., Peister A., Ekaputra A.K., Hutmacher D.W., Guldberg R.E. Colonization and osteogenic differentiation of different stem cell sources on electrospun nanofiber meshes // Tissue Eng. Part A. 2010. V. 16. № 10. P. 3219-3230.

64. Kolambkar Y.M., Peister A., Soker S., Atala A., Guldberg R.E. Chondrogenic differentiation of amniotic fluid-derived stem cells // J. Mol. Histol. 2007. V. 38. № 5. P. 405-413.

65. Kunisaki S.M., Armant M., Kao G.S., Stevenson K., Kim H., Fauza D.O. Tissue engineering from human mesenchymal amniocytes: a prelude to clinical trials // J. Pediatr. Surg. 2007a. V. 42. № 6. P. 974-979.

66. Kunisaki S.M., Freedman D.A., Fauza D.O. Fetal tracheal reconstruction with cartilaginous grafts engineered from mesenchymal amniocytes // J. Pediatr. Surg. 2006a. V. 41. P. 675-682.

67. Kunisaki S.M., Fuchs J.R., Steigman S.A., Fauza D.O. A comparative analysis of cartilage engineered from different perinatal mesenchymal progenitor cells // Tissue Eng. 2007b. V. 13. № 11. P. 2633-2644.

68. Kunisaki S.M., Jennings R.W., Fauza D.O. Fetal cartilage engineering from amniotic mesenchymal progenitor cells // Stem Cells Dev. 2006c. V. 15. P. 245-253.

69. Lanfranchi A., Porta F., Chirico G. Stem cells and the frontiers of neonatology // Early Hum. Dev. 2009. V. 85. № 10. Suppl. P. 15-18.

70. Lee J.M., Dedhar S., Kalluri R., Thompson E.W. The epithelial-mesenchymal transition: new insights in signaling, development, and disease // J. Cell. Biol. 2006. V. 172. № 7. P. 973-981.

71. Lee K.D., Kuo T.-K., Whang-Peng J., Chung Y.-F., Lin C.-T., Chou S.-H., Chen J.-R., Chen Y.-P., Lee O.K. In vitro hepatic differentiation of human mesenchymal stem cells //Hepatology. 2004. V. 40. № 6. P. 1275-1284.

72. Levinson H., Peled Z., Liu W., Longaker M.T., Allison G.M., Ehrlich H.P.i

73. Fetal rat amniotic fluid: transforming growth factor beta and fibroblast collagen lattice contraction // J. Surg. Res. 2001. V. 100. № 2. P. 205-210.

74. Li C., Zhou J., Shi G., Ma Y., Yang Y., Gu J., Yu H., Jin S., Wei Z., Chen F., Jin Y. Pluripotency can be rapidly and efficiently induced in human amniotic fluid-derived cells //Hum. Mol. Genet. 2009. V. 18. № 22. P. 4340-4349.

75. Liu Z.S., Xu Y.F., Feng S.W., Li Y. Yao X.L., Lu X.L., Zhang C. Baculovirus-transduced mouse amniotic fluid-derived' stem cells maintain differentiation potential // Ann. Hematol. 2009. V. 88. № 6. P. 565-572.

76. Lovati A.B., Corradetti B., Lange Consiglio A., Recordad C., Bonacina E., Bizzaro D., Cremonesi F. Comparison of equine bone marrow-, umbilical cord matrix and amniotic fluid-derived progenitor cells // Vet. Res. Commun. 2011. V. 35. №2. P. 103-121.

77. Marcus A.J., Woodbury D. Fetal stem cells from extra-embryonic tissues: do not discard // J. Cell. Mol. Med. 2008. V. 12. № 3. P. 730-742.

78. Mauro A., Turriani M., Ioannoni A., Russo V., Martelli A., Di Giacinto O., Nardinocchi D., Berardinelli P. Isolation, characterization, and in vitro differentiation of ovine amniotic stem cells // Vet. Res. Commun. 2010. V. 34. Suppl l.P. 25-28.

79. Mazzucchelli I., Avanzini M.A., Ciardelli L., Pagani S., Greco R., Belloni C., Castellazzi A., Marconi M., Rondini G., Polatti F. Human amniotic fluid cells are able to produce IL-6 and IL-8 // Am. J. Reprod. Immunol. 2004. V. 51. №3. P. 198-203.

80. Megaw J.M., Priest J.H., Priest R.E., Johnson L.D. Differentiation in human amniotic fluid cell cultures: II: Secretion of an epithelial basement membrane glycoprotein//J. Med. Genet. 1977. V. 14. № 3. P. 163-167.

81. Mihu C.M., Mihu D., Costin N., Rus Ciuca D., Su§man S., Ciortea R. Isolation and characterization of stem cells from the placenta and the umbilical cord // Rom. J. Morphol. Embryol. 2008. V. 49. № 4. P. 441-446.

82. Miki T., Lehmann T., Cai H., Stolz D.B., Strom S.C. Stem cell characteristics of amniotic epithelial cells // Stem Cells. 2005. V. 23. № 10. P. 1549-1559.

83. Mirebella T, Poggi A, Scaranari M, Mogni M, Lituania M, Baldo C, Cancedda R, Gentili C. Recruitment of host's progenitor cells to sites of human amniotic fluid stem cells implantation // Biomaterials. 2011. V. 32. № 18. P. 4218-4227.

84. Moore K.L., Persaud T.V.N. Before we are born: essentials of embryology and birth defects. Philadelphia, Saunders Elsevier. 2008. P. 84-86.

85. Moorefield E.C., McKee E.E., Solchaga L., Orlando G., Yoo J.J., Walker S., Furth M.E., Bishop C.E. Cloned, CD117 selected human amniotic fluid stemcells are capable of modulating the immune response // PLoS One. 2011. V. 6. * № 10. P. e26535.

86. Mosna F., Sensebé L., Krampera M. Human bone marrow and adipose tissue mesenchymal stem cells: a user's guide // Stem Cells Dev. 2010. V. 19. № 10. P. 1449-1470.

87. Nadri S., Soleimani M. Comparative analysis of mesenchymal stromal cells from murine bone marrow and amniotic fluid // Cytotherapy. 2007. V. 9. № 8. P. 729-737.

88. Natalwala A., Spychal R., Tselepis C. Epithelial-mesenchymal transition mediated- tumourigenesis in the gastrointestinal tract // World J. Gastroenterol. 2008. V. 14. № 24. P. 3792-3797.

89. Pan H.-C., Yang D.-Y., Chiu Y.-T., Lai S.-Z., Wang Y.-C., Chang M.-H., Cheng F.-C. Enhanced regeneration in injured sciatic nerve by human amniotic mesenchymal stem cell // J. Clin. Neurosci. 2006. V. 13. P. 570-575.

90. Pappa K.I., Anagnou N.P. Novel sources of fetal stem cells: where do they fit on the developmental continuum? // Regen. Med. 2009. V. 4. № 3. P. 423433.

91. Park S.-B., Seo M.-S., Kang J.-G., Chae J.-S., Kang K.-S. Isolation and characterization of equine amniotic fluid-derived multipotent stem cells // Cytotherapy. 2011b. V. 13. № 3. P. 341-349.

92. Peister A., Deutsch E.R., Kolambkar Y., Hutmacher D.W., Guldberg R.E. Amniotic fluid stem cells produce robust mineral deposits on biodegradable scaffolds // Tissue Eng. Part A. 2009. V. 15. № 10. P. 3129-3138.

93. Perm L., Giuliani S., Sedrakyan S., Da Sacco S., De Filippo R.E. Stem cell and regenerative science applications in the development of bioengineering of renal tissue 11 Pediat. Res. 2008a. V. 63. № 5. p. 467-471.

94. Perin L., Sedrakyan S., Da Sacco S., De Filippo R. Characterization of human amniotic fluid stem cells and their pluripotential capability // In: Methods in Cell Biology. Burlington, Elsevier Academic Press. 2008b. V. 86. P. 85-99.

95. Phermthai T., Odglun Y., Julavijitphong S., Titapant V., Chuenwattana P., Vantanasiri C., Pattanapanyasat K. A novel method to derive amniotic fluid stem cells for therapeutic purposes // BMC Cell Biol. 2010. V. 11. P. 79.

96. Polgar K., Adany R., Abel G., Kappelmayer J., Muszbek L., Papp Z.

97. Characterization of rapidly adhering amniotic fluid cells by combined immunofluorescence and phagocytosis assays // Am. J. Hum. Genet. 1989. V. 45. № 5\ P. 786-792.

98. Pozzobon M., Ghionzoli M., De Coppi P. ES, iPS, MSC, and AFS cells. Stem cells exploitation for Pediatric Surgery: current research and perspective //Pediatr. Surg. Int. 2010. V. 26. № 1. P. 3-10.

99. Priest R.E., Marimuthu K.M., Priest J.H. Origin of cells in human amniotic fluid cultures: ultrastructural features // Lab. Invest. 1978. V. 39. № 2. P. 106109.

100. Priest R.E., Priest J.H., Moinuddin J.F., Keyser A.J. Differentiation in human* amniotic fluid cell cultures: I: Collagen production // J. Med. Genet. 1977. V. 14. №3. P. 157-162.

101. Prusa A.-R., HengstschlDger M. Amniotic fluid cells and human stem cell research a new connection // Med. Sci. Monit. 2002. V. 8. № 11. P. 253-257.

102. Reima I. Maintenance of compaction and adherent-type junctions in mouse morula-stage embryos // Cell Differ. Dev. 1990. V. 29. № 2. P. 143-153.

103. Reynolds E.S. The use of lead citrate at high pH as an electron-opaque stain in electron microscopy // J. Cell Biol. 1963. V. 17. P. 208-212.

104. Rittenberg T., Longaker M.T., Adzick N.S., Ehrlich H.P. Sheep amniotic fluid has a protein factor which stimulates human fibroblast populated collagen lattice contraction // J. Cell. Physiol. 1991. V. 149. № 3. P. 444-450.

105. Romanov Y.A., Svintsitskaya V.A., Smirnov V.N. Searching for alternative sources of postnatal human mesenchymal stem cells: candidate MSC-like cells from umbilical cord // Stem Cells. 2003. V. 21. P. 105-110.

106. Rustom A., Saffrich R., Markovic I., Walther P., Gerdes H.-H. Nanotubular highways for intercellular organelle transport // Science. 2004. V. 303. P. 10071010.

107. Savtchenko E.S., Schiff T.A., Jiang C.K., Freedberg I.M., Blumenberg M. Embryonic expression of the human 40-kD keratin: evidence from a processed pseudogene sequence // Am. J. Hum. Genet. 1988. V. 43. № 5. P. 630-637.

108. Schmelz M., Franke W.W. Complexus adhaerentes, a new group of desmoplakin-containing junctions in ' endothelial, cells: the syndesmos connecting retothelial cells of lymph nodes // Eur. J. CellBiol. 1993. V. 61. № 2. P. 274-289.

109. Seo J.M., Sohn M.Y., Suh J.S., Atala A., Yoo J.J., Shon Y.H. Cryopreservation of amniotic fluid-derived stem cells using' natural cryoprotectants and low concentrations of dimethylsulfoxide // Cryobiology. 2011. V. 62. №3. P. 167-173.

110. Sessarego N., Parodi A., Podesta M., Benvenuto F., Mogni M., Raviolo V., Lituania M., Kunkl A., Ferlazzo G., Bricarelli F.D., Uccelli A., Frassoni F.

111. Multipotent mesenchymal stromal cells from amniotic fluid: solid perspectives for clinical application // Haematologica. 2008. V. 93. № 3. P. 339-346.

112. Sherer N.M., Mothes W. Cytonemes and tunneling nanotubules in cell-cell communication and viral-pathogenesis // Trends Cell Biol. 2008. V. 18. № 9. P. 414-420.

113. Shi Y. Induced pluripotent stem cells, new tools for drug discovery and new hope for stem cell therapies // Curr. Mol. Pharmacol. 2009. V. 2. № 1. P. 1518.

114. Siddiqui M.M., Atala A. 2004. Amniotic fluid-derived pluripotential* cells // In: Handbook of Stem Cells. Burlington, Elsevier Academic press. V. 2. P. 175-179.

115. Siegel N., Valli A., Fuchs C., Rosner M., Hengstschlàger M. Induction of mesenchymal/epithelial marker expression in human amniotic fluid stem cells // Reprod. Biomed. Online. 2009. V. 19. № 6. P. 838-846.

116. Simionescu-Ml, Simionescu N. Endothelial transport'of macromolecules: transcytosis and endocytosis. A look from cell biology // Cell Biol. Rev. 1991. V. 25. № i.p. 1-78.

117. Stadtfeld M., Nagaya M., Utikal J., Weir G., Hochedlinger K. Induced pluripotent stem cells generated without viral integration // Science. 2008. V. 322. № 5903. P. 945-949.

118. Steigman S.A., Ahmed A., Shanti R.M., Tuan R.S., Valim C., Fauza D.O. Sternal repair with bone grafts engineered from amniotic mesenchymal stem cells // J. Pediatr. Surg. 2009. V. 44. P. 1120-1126.

119. Steigman S.A., Armant M., Bayer-Zwirello L., Kao G.S., Silberstein L., Ritz J., Fauza D.O. Preclinical regulatory validation of a 3-stage amniotic mesenchymal stem cell manufacturing protocol // J. Pediatr. Surg. 2008. V. 43. №6, P. 1164-1169.

120. Sun H., Feng K., Hu J., Soker S., Atala A., Ma P.X. Osteogenic differentiation of human amniotic fluid-derived stem cells induced by bone morphogenetic protein-7 and' enhanced by nanofibrous scaffolds // Biomaterials. 2010. V. 31. № 6. P. 1133-1139.

121. Syed S., Haque A.K., Hawkins H.K., Sorensen P.H., Cowan D.F. s Desmoplastic small round cell tumor of the lung // Arch. Pathol. Lab. Med. 2002. V. 126. № 10. P. 1226-1228.

122. Takahashi K., Yamanaka S. Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors // Cell. 2006. V. 126. № 4. P. 663-676.

123. Thomson J.A., Itskovitz-Eldor J., Shapiro S.S., Waknitz M.A., Swiergiel J.J., Marshall V.S., Jones J.M. Embryonic stem cell lines derived from human blastocysts // Science. 1998. V. 282. P. 1145-1147.

124. Toda A., Okabe M., Yoshida T., Nikaido T. The potential of amniotic membrane/amnion-derived cells for regeneration of various tissues // J. Pharmacol. Sci. 2007. V. 105. P. 215-228.

125. Trounson A. A fluid means of stem cell generation // Nat. Biotechnol. 2007. V. 25. № l.p. 62-63.

126. Tsai M.-S., Hwang S.-M., Tsai Y.-L., Cheng F.-C., Lee J.-L., Chang Y.-J. Clonal amniotic fluid-derived stem cells express characteristics of both mesenchymal and neural stem cells // Biol. Reprod. 2006. V. 74. P. 545-551.

127. Tsai M.-S., Lee J.-L., Chang Y.-J., Hwang S.-M. Isolation of human multipotent mesenchymal stem cells from second-trimester amniotic fluidusing a novel two-stage culture protocol // Hum. Reprod. 2004. V. 19. № 6. P. 1450-1456.

128. Valli A., Rosner M., Fuchs C., Siegel N., Bishop C.E.", Dolznig H., Mädel U., Feichtinger W., Atala A., Hengstschläger M. Embryoid body formation of human amniotic fluid stem cells depends on mTOR // Oncogene. 2010. V. 29. № 7. P. 966-977.

129. Veranic P., Lokar M., Schütz G J., Weghuber J., Wieser S., Hägerstrand H., Kralj-Iglic Y., Iglic A. Different types of cell-to-cell connections mediated by nanotubular structures // Biophys. J. 2008. V. 95. № 9. P. 4416-4425.

130. Walther G., Gekas J., Bertrand O.F. Amniotic stem cells for cellular cardiomyoplasty: promises and premises // Catheter. Cardiovasc. Interv. 2009. V. 73. P. 917-924.

131. Wang H., Ghen S., Cheng X:, Dou Z., Wang H. Differentiation of human amniotic fluid stem cells into cardiomyocytes through embryonic body formation. Chinese journal of biotechnology. 2008. V. 24. № 9. P: 1582-1587.

132. Watkins S.C., Salter R.D. Functional connectivity between immune cells mediated by tunneling nanotubules // Immunity. 2005. V. 23. № 3. P. 309-318.

133. Williams J.T., Southerland S.S., Souza J:, Calcutt A.F., Cartledge R.G. Cells isolated from adult human skeletal muscle capable of differentiating into multiple mesodermal phenotypes // Am. Surg. 1999. V. 65. № 1. P. 22-26.

134. Wislet-Gendebien S., Bruyère F., Hans G., Leprince P., Moonen G., Rogister B. Nestin-positive mesenchymal stem cells favour the astroglial lineage in neural progenitors and stem cells by releasing active BMP4 // BMC Neuroscience. 2004. V. 5. P. 33.

135. Wu I-I.-W., Lin X.-Z., Hwang S.-M., Lee G.-B. The culture and differentiation of amniotic stem cells using a microfluidic system // Biomed. Microdevices. 2009. V. 11. № 4. P. 869-881.

136. Xu R., Wu C, Tao Y., Yi J., Yang Y., Zhang X., Liu R. Nestin-positive cells in the spinal cord: a potential source of neural, stem cells // Int. J. Dev. Neurosci. 2008. V. 26. № 7 P: 813.-820:

137. Yadav P., Mann A., Singh V., Y ash veer S., Sharma R., Singh I. Expression of pluripotency genes in buffalo (Bubalus bubalis) amniotic fluid cells // Reprod. Domest.Anim. 2011. V. 46. № 4. P. 705-711.

138. Yager J.S., Hugo N;E., Ehrlich HP; Inhibition of iibroblast-populated collagen lattice contraction by an albumin-bound lipid fraction in human amniotic fluid //Plast. Reconstr. Surg: 1998í V. 1 OK №4. P; 6-m.

139. Yan W.H., Lin A., Chen X.J., Dai M.Z., Xu H.H., Chen B.G., Gan L.H., Shi W.W. Immunological aspects of human amniotic fluid cells: implication for. normal pregnancy // CettBiol. Int. 2008. V. 32. № 1. P. 93-99.

140. Ye L., Chang J.C., Lin C., Qi Z., Yu J., Kan Y.W. Generation of induced plüripotent stem- cells using site-specific, integration with phage1 integrase // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010. V. 107. № 45. P. 19467-19472.

141. You Q., Cai L., Zheng J., Tong X., Zhang D., Zhang Y. Isolation of human mesenchymal stem cells from third-trimester amniotic fluid // Int. J. Gynecol. Obstet. 2008. V. 103. № 2. P. 149-152.

142. You Q., Tong X., Guan Y., Zhang D., Huang M., Zhang Y., Zheng J. The biological characteristics of human third trimester amniotic fluid stem cells // J. Int. Med. Res. 2009. V. 37. P. 105-112.

143. Zani A., Cananzi M., Eaton S., Pierro A., De Coppi P. Stem cells as a potential treatment of necrotizing enterocolitis // J. Pediatr. Surg. 2009. V. 44. № 3. P. 659-660.

144. Zeisberg M., Neilson E.G. Biomarkers for epithelial-mesenchymal transitions // J. Clin. Invest. 2009. V. 119. № 6. P. 1429-1437.

145. Zhang L., Zhang X.H., Liang M.Y., Ren M.H. Prenatal cytogenetic diagnosis study of 2782 cases of high-risk pregnant women // Chin. Med. J. (Engl). 2010a. V. 123. № 4. P. 423-430.

146. Zhang P., Baxter J., Vinod K., Tulenko T.N., Dimuzio P. Endothelial differentiation of amniotic fluid-derived stem cells: synergism of biochemical and shear force stimuli // Stem Cells Dev. 2009. V. 18. № 9. P. 1299-1308.

147. Zhang S., Geng H., Xie H., Wu Q., Ma X., Zhou J., Chen F. The heterogeneity of cell subtypes from a primary culture of human amniotic fluid // Cell. Mol. Biol. Lett. 2010b. V. 15. №-3. P. 424-439.

148. Zheng Y.-M., Zheng Y.-L., He X.Y., He X.-N., Zhao X., Sai W.-J. Multipotent differentiation of the EGFP gene transgenic stem cells derived from amniotic fluid of goat at terminal gestational age // Cell Biol. Int. 2011b. V. 35. № 12. P. 1243-1246.

149. Zvaifler N.J., Marinova-Mutafchieva L., Adams G., Edwards C.J., Moss J., Burger J.A., Maini R.N. Mesenchymal precursor cells in the blood of normal individuals // Arthritis Res. 2000. V. 2. № 6. P. 477-488.1. БЛАГОДАРНОСТИ

150. Отдельно хочется поблагодарить Смирнову Юлию Анатольевну (ИБР РАН,г *3

151. Отдельную признательность автор выражает оппонентам и рецензентам данной работы.n

152. Искреннюю благодарность автор выражает свои родным и друзьям запонимание и поддержку, оказанные при выполнении этой работы.

Информация о работе

Давыдова, Дарья Александровна
кандидата биологических наук
Москва, 2012
ВАК 03.03.05

Диссертация

Фенотип и дифференцировка стволовых клеток амниотической жидкости человека in vitro - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы