Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность инъекционной формы азитромицина

Тягнибедина, Наталья Игоревна

Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему
Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность инъекционной формы азитромицина
ВАК РФ 06.02.03, Звероводство и охотоведение

Автореферат диссертации по теме "Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность инъекционной формы азитромицина"

На правах рукописи

Тягнибедина Наталья Игоревна

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИНЪЕКЦИОННОЙ ФОРМЫ АЗИТРОМИЦИНА

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

г 8 НОЯ 2013

Москва - 2013

005539719

Работа выполнена в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств для животных Федерального государственного бюджетного учреждения «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ»)

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук,

старший научный сотрудник Виолин Борис Викторович

Официальные оппоненты: Уразаев Дмитрий Николаевич

доктор ветеринарных наук, профессор кафедры фармакологии и токсикологии ФГБОУ ВПО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии им. К.И. Скрябина» Новик Тамара Самуиловна доктор биологических наук, профессор, ведущий научный сотрудник Государственного научного учреждения Всероссийского научно-исследовательского института гельминтологии им. К.И.Скрябина

Ведущая организация - «Федеральный Центр токсикологической, радиационной и биологической безопасности» ФГБУ «ФЦТРБ-ВНИВИ»

Защита состоится «19» декабря 2013 года в II00 часов на заседании диссертационного совета Д. 220.011.01 в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Всероссийский государственный Центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» (ФГБУ «ВГНКИ») по адресу: Россия, 123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, д.5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «ВГНКИ».

Автореферат разослан « 11 » ноября 2013 г.

Ученый секретарь У

диссертационного совета, -——"

доктор биологических наук, профессор /г Букова Н.К.

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы.

Одной из важных задач современной ветеринарной фармацевтической науки является разработка и внедрение в практику эффективных и безопасных лекарственных средств, в том числе и для лечения заболеваний респираторного тракта животных. Данные ветеринарной статистики и многочисленные литературные источники указывают на то, что респираторные болезни занимают одно из ведущих мест в структуре заболеваемости молодняка (Шевцов A.A., Русале-ев B.C., Ширяев Ф.А., Потехин A.B., 2008; Мищенко В.А., Павлов Д.К., Думова В.В., 2008; Чугунова Е.О, 2004; Done S.H., 2002).

Уровень заболеваемости респираторными болезнями в России находиться в зависимости от региона, сопутствующих климатических условий, технологии содержания, кормления животных и составляет от 30 до 70%, при этом летальность может достигать 9,7-30,6% (Мищенко В.А., Думова В.В., Черных О.Ю., 2011).

Нарушение условий содержания, температурных режимов, влажности, воздухообмена, качества кормов приводят к стрессу, и, как следствие, к снижению иммунитета, нарушению обмена веществ, повышению восприимчивости организма к различным патогенам, циркулирующим в окружающей среде, н первую очередь к вирусам и микоплазмам, вызывающих заболевания верхних и нижних дыхательных путей (Martelli P., Balarini G., 2002; Топурия Л.Ю., 2006). Респираторные болезни животных, как правило, имеют полиэтилогический характер, т.к. на фоне первичного патогена всегда развивается вторичная бактериальная микрофлора, вызывающая серьезные деструктивные изменения в бронхах и альвеолах. Поэтому для лечения респираторной патологии у животных используют антибиотики широкого спектра действия, обладающие высокой активностью в отношении основных возбудителей бактериальных инфекций, а также хламидий и микоплазм (Мищенко В.А., Рахманов A.M., Русалеев B.C., 2003; Куриленко А.Н., Крупальник В.Н., Пименов Н.В., 2006; Орлянкин Б.Г., Мишин A.M., Алипер Т.Н., 2010).

Для лечения бронхопневмоний у животных в последнее время широко используются препараты на основе тиамулина, тилозина, энрофлоксацина и доксициклина (Орлянкин Б.Г., Мишин A.M., Алипер Т.Н., 2010; Godinho К. S., Wolf R. М., Sherington J., Rowan Т. G., Sunderland S. J., Evans N. A., 2005). Нарушение схемы применения, использование антибиотиков в заниженных дозах приводит к появлению устойчивых к антибиотикам форм микроорганизмов (Ковалев В.Ф., Волков И.Б., Виолин Б.В. и др., 1988; Брандер Дж.К., 1981). Учитывая, что некоторые микроорганизмы характеризуются мультирезистентно-стыо, только выбор наиболее активного противомикробного препарата определяет рациональную тактику лечения и успешный результат, позволяющий сохранить не только здоровье животного, но и его продуктивность.

В последние годы в медицине для лечения заболеваний дыхательных путей широкое применение нашел антибиотик из группы макролидов — азитроми-цин, обладающий не только высокой антимикробной активностью, но и противовоспалительным и иммуномодулирующим действием, а также низкой ток-

сичностыо (Retsema J., Fu W., 2001; Shinkai M., Henke M.O., Rubin B.K., 2008; Vrancic M., Banjanac M., Nujic K., Bosnar M., Murati T., Munie У., 2012).

Основу химической структуры азитромицина (являющегося единственным представителем группы азалидов) составляет 15-ти членное макроцикли-ческое лактонное кольцо (Жаркова Н.Е., 2010). Антибиотик активен в отношении большинства аэробных грамположительных и грамотрицательных бактерий, в том числе внутриклеточных микроорганизмов, таких как микоплазмы и хламидии (Яковлева C.B., 2003; Peters D.H., Friedel H.A., McTavish D., 1992; Odenholt-Tornqvist I., Lowdin E., Cars O., 1995, Rubinstein E., 1996; Swainston H.T., Keam S.J.,2007). Если в ветеринарной практике имеются только отдельные сообщения о применении азитромицина, то в медицинской практике этот антибиотик широко используется в форме таблеток и суспензий для энтерального применения. Имеются сообщения о внутривенном применении азитромицина в форме порошка для приготовления раствора для инъекций.

Учитывая, что до настоящего времени в зарубежной и отечественной ветеринарной практике лекарственная форма - раствор азитромицина для инъекций не использовалась, представлялось актуальным изучить фармако-токсикологические свойства Азитромицин раствор для инъекций 10% и его эффективность применения для лечения респираторных заболеваний животных смешанной этиологии.

Для внедрения препарата в ветеринарную практику и доказательства безопасности и эффективности предложенной лекарственной формы был проведен ряд исследований, направленных на изучение антибактериальной активности, острой и субхронической токсичности на лабораторных животных, фар-макокинетики в организме разных видов животных и терапевтической эффективности.

Цели и задачи исследования.

Изучить фармако-токсикологические свойства и терапевтическую эффективность новой оригинальной инъекционной лекарственной формы пролонгированного антибактериального препарата на основе азитромицина.

В задачи исследования входило:

- изучить антибактериальную активность азитромицина в опытах in vitro в сравнении с широко применяемыми в ветеринарии антибактериальными соединениями разных фармакологических групп;

- определить параметры острой и субхронической токсичности Азитромицина раствор для инъекций 10%, изучить влияние препарата на гуморальный и клеточный звенья иммунитета в опытах на лабораторных животных;

- изучить фармакокинетику азитромицина в организме поросят, телят и щенков собак после применения Азитромицина раствора для инъекций 10% и определить его фармакокинетические параметры;

- провести клинические испытания Азитромицина раствора для инъекций 10% для подтверждения его терапевтической эффективности при респираторных инфекциях смешанной этиологии животных.

Научная новизна.

Впервые на основе результатов экспериментальных исследований установлена антибактериальная активность азитромицина в отношении выделенных от больных животных возбудителей респираторных заболеваний, дана фармако - токсикологическая характеристика и обоснована возможность применения в ветеринарной практике азитромицина в форме раствора для инъекций.

Практическая значимость работы.

Доказана возможность безопасного и эффективного использования в ветеринарной практике Азитромицина раствора для инъекций 10% и обоснована схема его применения один раз в 72-96 часов в дозе 1 мл на 20 кг массы тела (5 мг/кг по действующему веществу) телятам и поросятам и в дозе 1 мл на 10 кг массы тела (10 мг/кг по действующему веществу) собакам при лечении респираторных инфекций смешанной этиологии.

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

- результаты изучения антибактериальной активности азитромицина;

- характеристика фармако-токсикологических и фармакокинетических свойств антибактериального препарата на основе азитромицина в форме раствора для ипъекций по результатам доклинических исследований;

- результаты клинического испытания эффективности и безопасности Азитромицина раствора для инъекций 10% для лечения респираторных инфекций смешанной этиологии у крупного рогатого скота, свиней и собак;

- практические предложения по применению Азитромицина раствора для инъекций 10% в ветеринарии.

Публикации.

По теме диссертации опубликовано 5 научных работ, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК России.

Апробация работы. Основные положения диссертационной работы доложены на:

- Московском Международном Ветеринарном Конгрессе по болезням мелких домашних животных в 2011 г.;

-Заседании ученого совета ФГБУ ««Всероссийский государственный центр качества и стандартизации лекарственных средств для животных и кормов» в 2013 г.

Структура и объем диссертации.

Диссертация изложена на 123 листах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение, выводы, практические предложения, список литературы, приложение. Работа иллюстрирована 30 таблицами, 1 рисунком, 3 графиками. Список литературы содержит 270 источников, в том числе 173 зарубежных авторов.

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы и методы исследований

Работа выполнена в течение 2009-2013 г.г. в отделе качества и стандартизации фармакологических лекарственных средств ФГБУ «ВГНКИ», в виварии ГНУ ВИГИС, в животноводческих хозяйствах Саратовской области: «ФКУ «ИК-2 УФСИН России по Саратовской области», в ОПХ «ВолжНИИГиМ»-филиал ФГБНУ «ВолжНИИГиМ» и СПК «Заря» Краснопартизанского района.

В опытах было использовано 100 беспородных белых мышей, 150 крыс, 6 поросят, 3 теленка, 5 щенков. Клиническое испытание препарата в производственных условиях проведено на 58 телятах, 45 поросятах, 13 собаках.

Препарат Азитромицин раствор для инъекций 10% серии 010710 (содержащий в качестве действующего вещества азитромицин 100 мг/мл, а в качестве вспомогательных веществ органические растворители и воду для инъекций), для исследований был любезно предоставлен фирмой ООО «АЛВИС» (Россия).

Определение антибактериальной активности.

Изучение антибактериальной активности и определение минимальных подавляющих концентраций (МГПС) азитромицина в отношении стафилококков (п=17), стрептококков (п=7), пастерелл (п=4) и клебсиелл (п=4), выделенных от телят больных бронхопневмонией и свиней с энзоотической пневмоний, проводили на мясо-пептонном агаре (МПА) методом серийных разведений в плотной питательной среде (Навашин С.М., Фомина И.П., 1982) в сравнении с макро-лидными антибиотиками (тилозин, тилмикозин, толутромицин, тиамулин) и антибактериальными соединениями других групп, широко используемыми в ветеринарной практике (амоксициллин, гентамицин, доксициклин, тетрациклин, энрофлоксацин, флорфеникол, цефтиофур).

За МПК антибиотика принимали наименьшую концентрацию, дающую полную задержку роста культуры на поверхности агара.

Изучение фармако-токсикологичесих свойств.

Острую токсичность Азитромицин раствор для инъекций 10% определяли при внутрижелудочном и парентеральном путях введения на 50 беспородных белых мышах обоего пола массой 18-20 г., и 96 крысах массой 180-200 г. Каждую дозу препарата испытывали на 10 мышах и 6 крысах.

Препарат вводили животным однократно внутрижелудочно в дозах: крысам - 6 000, 7 000, 8 000, 8 500, 9 000 и 10 000 мг на 1 кг массы; мышам - в дозах 5 000, 6 000,7 000,8 000 и 10 000 мг на 1 кг массы.

При парентеральном введении Азитромицин раствор для инъекций 10% вводили крысам однократно: внутримышечно в бедренную мышцу в дозах 2 000,2 500, 3 000, 3 500 и 4 000 мг на 1 кг массы и подкожно в области спины в дозах 2 500,3 000, 3 500,4 000 и 4 500 мг на 1 кг массы.

В течение 14 суток после введения препарата проводили ежедневное наблюдение за общим состоянием крыс и мышей; отмечали особенности поведения, приема корма и воды; учитывали состояния шерстного покрова и слизистых, проявление симптомов интоксикации, а также время и количество погибших животных.

Субхроническую токсичность Азитромицин раствор для инъекций 10% изучали на 40 белых крысах обоего пола, массой 180-200 г. Подопытных животных по принципу аналогов разделили на 4 группы по 10 крыс.

Препарат вводили внутримышечно в бедренную мышцу крыс в течение 10 суток в следующих дозах: 1 группа - 1/5otLD50 (595 мг/кг/сутки) установленной в остром опыте; 2 группа - 1/10 от LD50 (298 мг/кг/сутки); 3 группа -1/20 от LDS0 (149 мг/кг/сутки). Крысам 4 группы вводили воду для инъекций производства ОАО «Биохимик» в объме 0,15 мл.

В течение всего периода исследований определяли количество потребляемого корма и воды, наблюдали за физиологическим состоянием животных. Крыс взвешивали на 0,1,3,5, 7, 10 сутки от начала введения препарата.

Токсическое действие препарата па организм крыс оценивали по клиническим признакам интоксикации, по биохимическим, гематологическим показателям и массовым коэффициентам органов (на 10 крысах из каждой группы); диурезу и клиническому анализа мочи (па 3 крысах из каждой группы); функциональному состоянию ЦНС (на 4 крысах из каждой группы).

Функциональное состояние печени оценивали на основании активности ферментов - (алашшаминотрасферазы (AJIT), аспартатаминострасферазы (АСТ), щелочной фосфатазы (ЩФ), общего билирубина в сыворотке крови, функциональное состояние почек оценивали по концентрации мочевины и креатинина в крови, общему клиническому анализу мочи.

Макро- и микроскопическое исследование органов (печени, легких, почек, сердца, селезенки, головного мозга, брыжеечных лимфатических узлов, ткани из места введения препарата) проводили на образцах, полученных от 5 крыс из каждой группы.

Иммунотоксические свойства азитромицина определяли на мышах по уровню агглютининов и реакции гиперчувствителыюсти замедленного типа.

Каждая опытная группа мышей состояла из 6 животных массой 18-20 г. Испытуемый антибиотик мышам вводили одновременно с внутрибрюшинной иммунизацией 3% взвесью эритроцитов барана (ЭБ). Влияние препарата на ан-тителообразование оценивали в прямой реакции гемагтлютинации. В опыте определяли изменение титров антител (в log2) в сыворотке крови мышей в ответ на введение препарата («Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005).

Влияние на Т-клеточный иммунитет /и vivo оценивали в опытах на мышах по реакции гиперчувствительности замедленного типа к эритроцитам барана. На 5 сутки вводили разрешающую дозу ЭБ — 10% взвесь в объеме 0,02 мл в подушечки правых лап, в коллатеральную лапу вводили 0,9% раствор NaCl в таком же объеме. По изменению массы лап через 24 часа определяли сдвиг индекса воспаления.

Фармакокинетику азитромицина в организме телят, собак и поросят после введения инъекционной формы антибиотика изучали при однократном внутримышечном введении.

Фармакокинетику азитромицина исследовали на 3-х телятах 1,5-2-х месячного возраста и 5-ти собаках 5-7 месячного возраста. Перед введением ле-

карственного средства каждое животное взвешивали и рассчитывали индивидуальную дозу препарата. Азитромицин раствор для инъекций 10% вводили однократно внутримышечно телятам в дозе 5 мг/кг массы (1 мл препарата на 20 кг веса животного) и щенкам в дозе 10 мг/кг массы (1 мл препарата на 10 кг веса животного). Перед началом исследования каждому теленку ставили катетер в яремную вену. Кровь для анализа брали у телят до введения препарата (контрольные пробы) и через 3, 6,12, 18, 24, 36, 48 и 72 часов после введения препарата, у собак до введения препарата (контрольные пробы) и через 0,5,1,3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 36, 48, 96 часов после введения препарата в пробирки с гепарином, из цельной крови получали плазму крови. До анализа пробы плазмы крови хранили при минус 18°С.

Фармакокинетику азитромицина в исследовали на 6 поросятах-откормочников породы финишер массой 40-45 кг. Азитромицин раствор для инъекций 10% в дозе 5 мг/кг (1 мл препарата на 20 кг веса животного) массы вводили животным однократно внутримышечно в область шеи. Кровь у животных отбирали до начала опыта и через 1,3, 6, 9,12,18,24, 36,48, 60, 72, 84 и 96 часов после введения препарата из ушной вены в пробирки с гепарином, из цельной крови получали плазму крови. До анализа пробы плазмы крови хранили при минус 18°С.

Определение азитромицина в плазме крови телят и щенков проводили с использованием микробиологического метода диффузии в агар с тест-культурой Micrococcus luteus АТСС 9341. Предел количественного определения - 0,005 мкг/мл. Концентрацию азитромицина в плазме крови поросят определяли методом ВЭЖХ с использованием флуоресцентного детектора. Предел количественного определения - 0,01 мкг/мл.

Терапевтическую эффективность препарата изучали в производственных условиях в сравнении с препаратами аналогичного назначения на телятах (п= 58), поросятах (п= 45) и собаках ( п=13) при респираторных заболеваниях бактериальной этиологии в хозяйствах Саратовской области. Диагноз заболевания ставили на основании данных эпизоотологических, клинических, патологоана-томических и лабораторных исследований. Оценку эффективности Азитромицин раствор для инъекций 10% проводили в сравнении с препаратами Тилозин 50 и 200, Байтрил 5%, Нитокс 200, которые применяли в соответствии с инструкциями, утвержденными Россельхознадзором РФ. Животные с учетом диагноза, массы тела, длительности болезни и тяжести ее течения были разделены на опытные (получавшие азитромицин) и контрольные (получавшие препараты сравнения) группы.

Статистическую обработку результатов исследований проводили методом вариационной статистики, используя руководство Ю.С. Малеты и В.В. Тарасова (1982).

Автор выражает благодарность сотрудникам ГНУ ВИГИС за содействие в организации проведения исследований на лабораторных животных.

2.2. Результаты исследований

2.2.1. Антибактериальная активность азитромицина

Результаты исследований антибактериальной активности азитромицина, проведенные in vitro свидетельствуют о его высокой активности в отношении возбудителей бактериальных инфекций респираторного тракта животных в сравнении с макролидными антибиотиками (тилозин, тилмикозин, тулатроми-цин, тиамулин), а также с антибиотиками других групп, наиболее широко используемых в ветеринарии (амоксициллин, гентамицин, доксициклин, тетрациклин, энрофлоксацин, флорфеникол, цефтиофур).

Изученные изоляты стафилококков, стрептококков, клебсиел и пастерелл были высокочувствительны к азитромицину (МПК0,1-2,5 мкг/мл), при этом только 11 % из них оказались устойчивы к действию антибиотика (МПК>5 мкг/мл).

За исключением одного изолята, все изученные изоляты стафилококков были чувствительны к азитромицину (МПК<1 мкг/мл), из них 33% изолятов были более чувствительны к азитромицину, чем к другим антибиотикам группы макро-лидов. МПК азитромицина в отношении большинства чувствительных изолятов была на уровне тилмикозина и толутромицина (0,1-0,5 мкг/мл), в то время как тилозин и тиамулин оказались менее активными (0,25-1,0 мкг/мл). Чувствительность одного изолята к азитромицину была умеренной (МПК=2,5 мкг/мл), однако она была в 2 раза выше, чем у тилозина, и соответствовала чувствительности к тилмикозину, толутромицину и тиамулину. Резистентный к азитромицину микроорганизм был также устойчив и к другим макролидам, при этом уровень устойчивости к тилозину и тиамулину был выше в 2 раза.

Из антибиотиков других групп сопоставимую с азитромицином микробиологическую активность проявил представитель аминогликозидов - гентамицин, который оказался наиболее эффективным в отношении стафилококков: в большинстве случаев его МПК была такой же или немного ниже МПК амок-сициллина, цефтиофура, доксициклина и энрофлоксацина, и в 2-5 раз ниже МПК тетрациклина и флорфеникола. Изоляты, устойчивые к флорфениколу (МПК>5 мкг/мл), оставались чувствительными к гентамицину (МПК 0,250,5 мкг/мл) и азитромицину (МПК<1 мкг/мл). Только 5 изолятов были более чувствительны к доксициклину, чем к гентамицну (МПК 0,1 и 0,5 мкг/мл соответственно), оставаясь высоко чувствительными к азитромицину (МПК 0,10,25 мкг/мл). Один изолят оказался более чувствителен к амоксициллину и цефтиофуру, чем к гентамицину (МПК 1,0 мкг/мл) и азитромицину (МПК 1,0 мкг/мл); при этом к флорфениколу, доксициклину и тетрациклину этот изолят был малочувствителен (МПК 5-10 мкг/мл).

Все изученные изоляты стрептококков были чувствительны к азитромицину (МПК<1 мкг/мл), что соотносится с результатами, полученными Будановым C.B. (2000) в отношении микроорганизмов, выделенных от человека (МПК 0,06-0,12 мкг/мл). Стрептококки были более устойчивы к действию изученных антибактериальных соединений, чем стафилококки. Все изоляты были чувствительны только к энрофлоксацину, 16% изолятов устойчивы к амоксициллину,

цефтиофуру и тетрациклинам (МПК=50 мкг/мл), 28%изолятов устойчивы к гентамицину (МПК> 10 мкг/мл), 71%изолятов устойчивы к тетрациклину (МПК>5 мкг/мл).

Грамотрицательные микроорганизмы, выделенные от больных животных, оказались менее чувствительны к азитромицину, чем стафилококки и стрептококки, что соответствует данным Яковлева C.B., 2003; Swainston Н.Т., Кеаш S.J., 2007, о чувствительности изолятов, полученных от человека. В отношении 18% изолятов грамотрицательных микроорганизмов МПК азитромицина была в 2,5-5 раз ниже, чем МПК тилмикозина, тилозина, толутромицина и тиамулина. В 33% случаев грамотрицательные микроорганизмы показывали к азитромицину незначительно большую или равнозначную чувствительность по сравнению с другими антибиотиками макролидной группы. 50% пастерелл и клебсиелл оказались умеренно чувствительными к азитромицину (МПК 0,5-2,5 мкг/мл), в 50% случаев к азитромицину и другим антибиотикам макролидной группы они были устойчивы (МПК=5 мкг/мл). МПК азитромицина в отношении умеренно-чувствительных изолятов Pasteurella multocida была в 2-4 раза ниже, чем МПК тилозина и тиамулина.

Среди антибиотиков других групп наибольшую активность в отношении пастерелл и клебсиелл показал гентамицин: только 12% изолятов были к нему устойчивы (МПК>5 мкг/мл). К энрофлоксацину и цефтиофуру были резистентны 37,5% изолятов (МПК>5 мкг/мл); к амоксициллину и доксициклину 50% пастерелл и 25% клебсиелл проявляли умеренную чувствительность. Пас-тереллы и клебсиеллы оказались устойчивы к действию тетрациклина. Неактивным в отношении клебсиелл и пастерелл оказался также флорфеникол.

Высокая активность гентамицина в отношении изученных изолятов, видимо, связана со снижением частоты применения аминогликозидов в ветеринарной практике из-за высокого риска развития побочных эффектов.

Проведенные нами исследования показали, что азитромицин обладает наибольшей антимикробной активностью среди макролидных антибиотиков сопоставимой по своему действию с гентамицином. При этом по безопасности, фармакокинетическим параметрам и удобству применения он намного превосходит не только аминогликозидные антибиотики, но и антибактериальные соединения многих других групп (Lorian V., 2005).

2.2.2. Изучение острой и субхронической токсичности на лабораторных животных. Для подтверждения безопасности применения Азитромицин раствор для инъекций 10% нами была проведена работа по изучению острой токсичности препарата на крысах и мышах при разных путях его введения.

При изучении острой токсичности было установлена LD50 Азитромицина раствор для инъекций 10% при пероральном введении для крыс и мышей, которая составила 8 115 и 6 183 мг/кг соответственно (см.Табл.У), что позволило отнести азитромицин к 4 классу опасности (согласно ГОСТ 12.1.007-76).

Токсичность азитромицина при парентеральном введении крысам из-за более высокой биодоступности была в 2,4-2,7 раза выше по сравнению с перо-ральным введением. При подкожном введении за счет липофильных свойств азитромицина создается депо в подкожной клетчатке с более медленным вы-

свобождением антибиотика, за счет чего уровень ЬП50 3357 мг/кг достигает более высоких значений, чем при внутримышечном введении - 2975 мг/кг.

Нашими исследованиями установлена видовая чувствительность животных к азитромицину: мыши были более чувствительны к токсическому действию Азитромицина раствора для инъекций 10% по сравнению с крысами (см. Табл. I).

Таблица 1. Токсикологические параметры Азитромицин раствор для инъекций 10% для лабораторных животных._

Доза (мг/кг)

1£>0 из« 1Л)50 П)84 ІЛ)іоо

крысы-самцы (внутрижелудочно)

6032 7149 8115(7407-8733) 9211 10915

мыши-самцы (внутрижелудочно)

3483 4838 6183 (5335+6865) 7901 10974

крысы-самцы (внутримышечно)

1983 2501 2975(2588+3352) 3538 4463

крысы-самцы подкожно

2047 2717 3357 (2869+3826) 4147 5505

Картина интоксикации у крыс и мышей существенно не отличалась и выражалась преимущественно диареей и угнетением, которое впоследствии сменялось атаксией и гибелью. Выраженность симптомов напрямую зависела от величины дозы. Падеж крыс начинался со 2 суток и достигал максимума на 3 сутки. Для мышей, в связи с видовой чувствительностью к азитромицину, характерно более быстрое начало развития токсического действия: падеж мышей отмечали в первые сутки, наибольшее количество животных погибло на вторые сутки.

Для определения органов и тканей, наиболее чувствительных к действию антибиотика (органы-мишени), была изучена субхроническая токсичность Азитромицин раствор для инъекций 10% на крысах путем введения препарата в течение 10 суток в дозах 595 мг/кг, 298 мг/кг и 149 мг/кг, что соответствует 1/5, 1/10 и 1/20 от ЛД 50, установленной в остром опыте.

В течение всего опытного периода во всех испытанных дозах изменения общего состояния животных, признаков интоксикации и гибели крыс не отмечали. При этом максимальная доза препарата (1/5 ЛД 50) приводила к замедлению прироста массы тела и повышению массового коэффициента сердца, печени, почек и уменьшению массового коэффициента тимуса у крыс. Увеличение массового коэффициента печени и почек отмечали также после введения препарата в средней дозе (1/10 ЛД50) (см.Табл.2).

Тем не менее, несмотря на изменение массовых коэффициентов органов, патологические изменения на микроскопических препаратах отсутствовали. Это свидетельствует о том, что изменение массы внутренних органов носит только адаптационный характер и вызвано высокой дозой азитромицина.

Длительное десятидневное введение Азитромицина раствор для инъекций 10% лабораторным животным показало, что применение препарата в дозе, в 15 раз превышающей терапевтическую (149мг/кг массы), не вызывает функциональных изменений в организме крыс.

Орган Группы

1/5 ЛД50 1/10 ДД50 1/20 ЛД50 контроль

Сердце 3,52±0,04* 3,39±0,09 здз±о,оз 3,08±0,11

Легкие б,75±0,17 6,64±0,51 5,95±ЗД1 6,32±0,38

Печень 44,71±0,70" 40,98±0,72" 37,20±0,59 35,71±0,61

Почки 7,66±0ДЗ* 6,93±0,18' 6,39±0Д9 6,18±0,05

Селезенка 2,95±0,21 2,95±0Д7 3,62±0,16 3,46±0Д9

Головной мозг 6,33±0,13 6,73±0,12 6,73±0,13 6,53±0,07

Семенники 11,40±0,38 11,46±0,34 10,41±0,47 10,41±0,40

Поджелудочная железа 3,97±0Д9 3,48±0,22 3,45±0,20 3,98±0,17

Тимус 1,29±0,06' 1,64±0,06 1,71±0Д 1 1,91±0Д2

ной группами (р < 0,05).

Таблица 3. Гематологические показатели крыс после внутримышечного введе-

Показатели 7 Ґ Группы

1/5 ЛД50 1/10 ЛД50 1/20 ЛД50 контроль

Гематокрит, % 38,11±0,91 37Д7±0,70 40,14±0,46 37,26±0,90

Гемоглобин, г/л 116,10^,99 118,90±4,21 122Д0±2,99 125,60±0,94

Эритроциты, 10'7л 6,47±0,13 6,44±0,22 6,67±0,18 6,78±0Д7

Среднее содержание гемоглобина в эритроците, пг 19,52±0,51 20,00±0,58 20,31 ±0,68 20,69±0,53

Средняя концентрация гемоглобина в эритроците, % 293,63±3,13 295,27±ЗД4 294,83±2,44 298,48±2,96

Средний объем эритроцита, мкм3 62,95±0,59* 62,55±1,27* 52,23±1,08 55,35±1Д7

Показатель анизоцигоза эритроцитов, % 25,46±0,47* 25,19±0,80* 34,43±1,05 32,49±0,84

Тромбоциты, 10 /л 773,60±32,98 817.0М48Д8 784,30±50,36 788,50±46,76

Лейкоциты, 107л 7,22±0,51 7,41±0,50 6,85±0,43 7,36±0,49

Палочкоя-дерные ней-трофилы 0,60±0,27 0,50±0,17 1,00*0,37 0,80±0,36

Лейкоцитарная фор- Сегментоя-дерные ней-трофилы 18,70±1Д5* 17,60±1,35* 10,40±0,88 9,80±1,05

мула, % Моноциты 0,80±0,29 0,90±0,29 0,90±0,28 0,50±0,22

Эозинофилы 0,90±0,46 1,00±0,5 0,90±0,31 0,95±0,31

Базофилы 0,70±0,33 0,50±0,27 1Д0±0,28 0,70±0,26

Лимфоциты 78,30±1,35" 78,90±1,46" 85,70±1,67 87,30±1,56

ной группами (р < 0,05).

Длительное применение азитромицина оказывало негативное влияние на состояние крови у животных только в дозах 595 и 298 мг/кг, вызывая снижение показателя анизоцитоза эритроцитов и повышение среднего объема эритроцитов (см.Табл.3), что, как правило, развивается на фоне ухудшения функционального состояния печени (Мейер Д. и Харви Дж., 2007).

В этих же дозах наблюдалось повышение относительного количества сегментоядерных иейтрофилов и снижение доли лимфоцитов (см.Табл.3). Подобная реакция крови характерна для воспалительного процесса (или интоксикации), что может быть связано с местно-раздражающим действием больших объемов инъекционной формы в месте введения (Ganz Т., 2003).

Наряду с изменениями гематологических показателей установлено влияние азитромицина на ряд важных биохимических показателей сыворотки крови (12 показателей) у крыс, позволяющих оценить функциональное состояние организма (см. Табл. 4)

При десятидневном введении Азитромицина раствор для инъекций 10% крысам в максимальной дозе 595 мг/кг наблюдалось увеличение содержания прямого билирубина, активности ферментов ACT и АЛТ. Эти изменения характеризуют повышенную нагрузку на гепатобилиарную систему, ослабление экскреторной функции печени и могут являться маркерами нарушения проницаемости мембран гепатоцитов, вызванных метаболическими изменениями, что соотносится с достоверно установленными (р<0.05) увеличениями массового коэффициента печени.

Таблица 4. Биохимические показатели крови крыс после внутримышечного введения Азитромицин раствор для инъекций 10% в различных дозах в течение 10 суток (п=10).________

Показатели Группы

1/5 ЛД50 1/10 ЛД?0 1/20 ЛД50 КОНТРОЛЬ

Билирубин общий, мкмоль/л 0,92±0,25 0,89±0,21 0,83±0,06

Билирубин прямой, мкмоль/л 0,69±0,03* 0,58±0,10* 0,48±0,08

ACT, Ед/л 396,80±14,45* 370,10±33,24" 302,30±19,74 264,00±12,08

АЛТ, Ед/л 97,00±7,20" 73,90±5,86 68,30±3,53 60,40±2,35

Коэффициент Рити-са 4,32±0,37 5,10±0,46 4,42±0Д5 4,45±0,30

Мочевина, ммоль/л 6,53±0,25 6,44±0,41 6,69±0,45 6,28±0,26

Креатинин, мкмоль/л 65,80±2,ll" 69,90±2,62' 63,10±1,92 59,40±1,06

Общий белок, г/л 66,60±1,69 66,20±1,16 68,30±1,73 67,70±1,54

Щелочная фосфота-за, Ед/л 478,10±18,30 501,20± 20,94 467,10±19,64 552,30±33,61

Альфа-амилаза, Ед/л 2282,50±46,71' 2196,50±92,5" 2613,10±141,1 2810,60±50,б

Глюкоза, моль/л 8,14±0,35 7,62±0,12 7,52±0,09 7,52±0,12

ЛДГ, Ед/л 6478,80±271,2' 6396,90±539,2" 5221,60±314,1 4733,90±183,7

' - Различие по данному показателю статистически достоверно между опытной и контрольной группами (р < 0,05).

Повышение уровня креатинина в крови наблюдалось у крыс при введении Азитромицина раствор для инъеций 10% в течение 10 суток в максимальных дозах 1/5 и 1/10 ЛД50, что позволяет предположить нарушения, вызывающие снижение скорости клубочковой фильтрации и возможные повреждения паренхимы почек.

В общем клиническом анализе мочи у крыс, получавших Азитромицин раствор для инъеций 10% в максимальной дозе, отмечали: повышение уровня белка, появление конъюгированного билирубина, в осадке мочи увеличение количества лейкоцитов. Все эти изменения служат показателем начальной стадии повреждения почек, воспаления мочевых путей, которые могут развиваться на фоне лекарственного воздействия (Albasan Н., Lulich J.P., Osborne С.А.,2003; Мейер Д. и Харви Дж., 2007).

Многократное применение препарата животным во всех испытанных дозах практически не отразилось на диурезе у опытных крыс после водной нагрузки, что позволяет предположить, что почечная фильтрация, несмотря на изменение общего анализа мочи, даже при применении высоких доз антибиотика, остается неизменной.

Все изменения в организме крыс носили функциональный характер и не приводили к структурным изменениям ткани органов, что было подтверждено гистологическими исследованиями.

С учетом полученных данных в проекте инструкции по применению Азитромицина раствор для инъекций 10% предусмотрено ограничение применения препарата животным с тяжелой патологией печени и почек.

Известны данные, что макролидные антибиотики вызывают неврологические расстройства (Abouesh A., Stone С., Hobbs W.R.,2002; Neff N.E., Kuo G., 2002; Ortiz-Dominguez A., Berlanga C., Gutierrez-Mora D., 2004; Brooks J.O. 3rd, Hoblyn J.C.,2005; Baranowski W.J., 2010). Поэтому было оценено влияние Азит-ромииина раствор для инъекций 10% на состояние ЦНС. которое по результатам изучения поведенческих реакций (стойка без опоры, стойка с опорой, короткий и продолжительный груминг, число пересеченных квадратов, норковый эффект, выход в центр и дефекация) не выявило отклонений от контроля во всех опытных группах животных.

Учитывая, что Азитромицин раствор для инъекций 10% применяют внутримышечно, было оценено местнораздражаюшее действие препарата на ткани. У крыс отмечалась выраженная местная реакция после внутримышечного и подкожного введения больших объемов препарата (0,8-1,0 мл), необходимых при изучении острого токсического действия. При этом, при изучении субхронической токсичности уменьшение дозы препарата до 0,15-0,7 мл не вызывало клинических симптомов местной реакции. Выявленные изменения при гистологическом исследовании показали, что клеточная реакция имела локальное распространение и носила ограниченный характер, не вызывая системных эффектов. С учетом этого обстоятельства можно сделать вывод, что при необходимости введения Азитромицин раствор для инъекций 10% в большом объеме предпочтительнее его вводить в 2 разные точки.

Отличительной особенностью макролидов от других групп антибиотиков является наличие противовоспалительного и иммунорегулирующего эффектов (Ianaro A., Ialenti A., Maffia P., Sautebin L„ Rombola L., Carnuccio R.,2000; Munie V., Banjanac M., Kostrun S., Nujic K., Bosnar M., Marjanovic N., 2011). Поэтому одним из аспектов наших исследований было изучение влияния азитромицина раствор для инъекций на гуморальный и клеточный иммунитет при введении в терапевтической (100 мг/кг) и десятикратной терапевтической (1000 мг/кг) дозах в пересчете на площадь тела. Результатов, подтверждающих противовоспалительные и иммунорегулирующие эффекты, в наших исследованиях получено не было, но было показано отсутствие иммунотоксического действия на гуморальное и клеточное звенья иммунитета по оценке лимфокинсекретирующей функции и влияния на титр продуцированных антител у мышей при введении азитромицина. При этом следует отметить, что в дозе 100 мг/кг наблюдалась тенденция к стимуляции выработки антител у мышей по сравнению с контролем (р>0.05).

Таким образом, на основании результатов изучения токсичности Азитромицина раствор для инъекций 10% при ежедневном внутримышечном введении в субхроническом экспиременте можно заключить, что доза препарата 595 мг/кг/сутки является токсической, доза 298 мг/кг/сутки - пороговой и доза 149 мг/кг/сутки - недействующей.

2.2.6. Фармакокинетика азитромицина в организме поросят, телят и щенков.

Для разработки рациональных схем терапии и подбора оптимальной дозы после однократной внутримышечной инъекции нами были проведены исследования по изучению фармакокинетики антибиотика в организме животных после введения Азитромицин раствор для инъекций 10%.

В результате изучения фармакокинетики азитромицина в организме телят, поросят и щенков собак после однократного внутримышечного введения препарата было установлено, что антибиотик хорошо всасывается из места инъекции и быстро достигает высоких концентраций в плазме крови.

Усредненные фармакокинетические профили азитромицина в плазме крови телят, щенков и поросят после однократного внутримышечного применения азитромицина (см. графики I, 2 и 3) имели сходную структуру: в первые часы после введения антибиотика наблюдается резкий рост уровня плазменной концентрации, в интервале от 6 до 24 часов отмечаются стабильные концентрации азитромицина с незначительным снижением, в интервале с 24 до 96 часов концентрации антибиотика продолжают снижаться до уровней, близких к пределу нижней границы МПК для большинства респираторных патогенов. Такая фармакокинетика антибиотика позволяет сделать вывод, что однократное введение Азитромицин раствор для инъекций 10% дает возможность поддерживать терапевтические концентрации антибиотика (0,01-0,5 мкг/мл) в плазме крови в течение 72-96 часов.

Следует обратить внимание, что среди макролидов, по данным Jain R., Danziger L.H.(2004), Mattoes H.M., Nightingale С.H. (2002), Страчунского Л.С., Козлова С.Н.(2000), азитромицин создает самую высокую тканевую концентрацию и имеет самый длительный период полувыведения за счет связи с органел-лами клеток. Уровень азитромицина в воспаленной ткани легких, альвеолярных

макрофагах, мокроте может достигать значений в 10-100 раз выше, чем в сыворотке крови.

График 1 . Усредненный фармакокинетический профиль азитромицина в плазме крови телят

0.14 -т-------------------------------------

0.6

0.5

| 0.4 г

| О.З

е-% 0.2

^ 0.1 О

График 3. Усредненный фармакокинетический профиль азитромицина в плазме крови поросят

18 21 24 36 48 96 время, прошедшее после иньекции. ч

0.16

0.14

§0.12

1 0.1

§0,08 со

£0.06

х 0.04

¡с

0.02 0

6 9 12 18 24 36 48 60 72 84 96 время, прошедшее после иньекции. ч

График 2. Усредненный фармакокинетический профиль азитромицина в плазме крови собак

Учитывая, что содержание азитромицина в органах и тканях респираторного тракта значительно превышает сывороточные концентрации, можно предположить, что концентрация в патологическом очаге будет составлять не менее 1,3-15,0 мкг/мл. Принимая во внимание данные по микробиологической активности антибиотика, можно допустить, что в легких будет поддерживаться терапевтическая концентрация около 4-х суток. Поэтому целесообразно назначать Азитромицин раствор для инъекций 10% однократно, с повтором инъекции, при необходимости, через 96 часов.

Для определения практической зависимости между дозой препарата и его эффективностью необходимо в совокупности с фармакодинамическими (ФД) свойствами (антимикробная активность) препарата учитывать и его фармако-кинетические (ФК) характеристики.

Азитромицин относится к концентрация-зависимым антимикробным препаратам, поэтому главная цель при определении режима дозирования заключается в достижении максимальной концентрации и создании продолжительного времени нахождения антибиотика в патологическом очаге.

Характеристикой терапевтического эффекта для концентрация-зависимых антибиотиков является значение площади под фармакокинетиче-ской кривой (ПФК) «концентрация-время» к минимальной подавляющей концентрации (МПК) (ПФК/МПК) 25 и выше (Карпов О.И. 1999).

Результаты наших исследований позволяют утверждать о перспективности применения азитромицина в отношении респираторных патогенов, так как отношение площади под фармакокинетической кривой к минимальной подавляющей концентрации, в зависимости от микроорганизма, находится в пределах от 24 до 116.

На основе данных по изучению фармакокинетики азитромицина в плазме крови поросят после однократного внутримышечного введения нами были рассчитаны основные фармакокинетические параметры, характеризующие пролонгированное действие и постепенное выведение азитромицина из организма животных (см.Табл. 5).

Площадь под фармакокинетической кривой (AUC) при изучении фармакокинетики азитромицина в плазме поросят составила 2546,9 иг/млхч, что свидетельствует о постепенном всасывании и длительном нахождении антибактериального вещества в тканях организма животных. Объем распределения (Vd) азитромицина в организме поросят был на уровне 77,9 л, что подтверждает способность вещества проникать внутрь клетки и накапливаться в тканях в более высоких концентрациях, чем в плазме крови. Такой характер распределения антибиотика играет важную роль при терапии респираторных инфекций смешанной этиологии, когда патогенны локализуются внутри клетки.

Максимальная концентрация азитромицина в плазме крови после однократного внутримышечного введения достигалась через 1,3 ч. и составила 166,40 нг/мл, что позволяет сделать вывод о быстром всасывании азитромицина из места инъекции. При этом азитромицин не создает высоких плазменных концентраций за счет выраженного тканевого аффинитета.

Таблица 5.Фармакокинетические параметры Азитромицина раствор для инъекций 10% после однократного внутримышечного введения в дозе 5 мг/кг.

Параметры Номер поросепка - SD CV

1 2 3 4 5 б X %

Сяих, НГ/МЛ 168,51 131,94 273,40 115,51 171,20 137,84 166,40 56,69 34,0

Тщах, Ч 1,0 1,0 3,0 1,0 1,0 1,0 U 0,8 61,2

AUQO-T), нг/мл*ч 2240,67 1584,12 2531,25 2581,38 2514,11 2625,94 2346,25 396,96 16,9

kciX' 0,0317 0,0342 0,0244 0,0328 0,0238 0,0235 0,0284 0,0050 17,6

AUCy.,, нг/мл*ч 2417,71 1693,36 2768,45 2737,79 2787,04 2877,43 2546,96 446,69 17,5

t|/2. Ч 21,84 20,25 28,45 21,13 29,15 29,50 25,1 4,4 17,6

AUMCío-T), (нг/мл*ч)хч 51548,07 33021,3 58821,8 63009,2 73514,7 80157,5 60012,1 16725,4 27,8

AUMQo.«). (нг/мл*ч)хч 74121,81 46699,4 91327,4 82792,9 111194,1 115002, 86856,3 25281,4 29,1

MRT, ч 30,66 27,58 32,99 30,24 39,90 39,97 33,6 5,2 15,6

CI, л/ч 2,23 3,16 1,98 1,94 1,99 1,90 2,2 0,5 22,0

УД л 70,39 92,29 80,96 59,05 83,56 81,02 77,9 11,6 14,9

Пролонгированное действие и постепенное выведение антибиотика из организма подтверждают длительный период полувыведения азитромицина (25,1 час.) и величина среднего времени удерживания вещества в организме поросят (33,6 час).

Наши данные подтверждаются исследованиями разных авторов, которые отмечали поддержание высоких концентраций азитромицина в организме человека и животных даже после однократного перорального введения в течение длительного периода времени (Leclere M., Magdesian К. G., Cole, 2011, Cárceles C.M., Fernandez-Varon E., Marin P., Escudero E., 2007).

2.2.8. Терапевтическая эффективность Азитромицина раствор для инъекций 10%.

Для оценки терапевтической эффективности Азитромицина раствор для инъекций 10% и подтверждения режима дозирования, предложенного на основании данных, полученных при изучении фармакокинетики и фармакодинами-ки препарата, был проведен ряд опытов на сельскохозяйственных животных (телята, поросята) и собаках в хозяйствах Саратовской области.

Азитромицин раствор для инъекций 10% вводили однократно, при необходимости повторяя инъекцию через 96 часов.

Таблица 6. Терапевтическая эффективность Азитромицина раствор для инъекций 10%.

Показатели Острый катаральный бронхит телят Бронхопневмония телят Трахеобронхит собак Энзоотическая пневмония свиней

Азитромицин Тилозин 200 Азитромицин Нитокс Азитромицин Байтрил 5% Азитромицин Тилозин 50

Количество животных, голов 10 10 24 14 8 5 30 15

Средняя масса животных до лечения, кг 50 52 63 62 30 28 22 23

Среднесуточный привес, г 550 535 580 590 - - 430 340

Выздоровело, голов 10 8 24 11 8 5 28 11

Продолжало болеть, голов 0 1 0 3 0 0 0 0

Пало, голов 0 1 0 0 0 0 2 4

Время наступления клинического выздоровления, дней 4-6 7-9 4-7 4-8 4-6 7-8 4-6 5-6

Кратность применения 4 гол. - однократно; 6 гол. - двукратно с интервалом 96 ч 7 гол. - ежедневно 7 дней; 3 гол - ежедневно 9 дней 18 гол,- однократно; 6 гол. - двукратно с интервалом 96 ч 2 гол. - однократно; 1 гол. - двукратно; 1 гол. - четырехкратно 6 гол. - однократно; 2 гол. - двукратно с интервалом 96 ч 3 гол. - шестикратно; 2 гол. - восьмикратно 23 гол. - однократно; 5 гол. - двукратно с интервалом 96 ч 11 гол. - ежедневно 5 дней

Доза препарата, мл 1,5 2,5 3,1-3,2 6,3-6,4 3,0 3,0 ¡,0 1,3

Терапевтическая эффективность, % 100 80 100 78,5 100 100 93,3 60

Применение препарата Азитромицин раствор для инъекций 10% позволило значительно сократить кратность инъекций антибиотика и уменьшить сроки лечения животных по сравнению с контрольными группами животных. В опытной группе, как правило, было достаточно одной инъекции, при необходимости повторяя ее через 96 часов, в то время как в контрольных группах требовалось многократное введение антибиотика (5-6 инъекций).

Таким образом, результаты изучения терапевтической эффективности в производственных условиях доказывают высокую эффективность и удобство применения Азитромицин раствор для инъекций 10%, что позволяет рекомендовать его для лечения заболеваний животных в дозе 1 мл на 20 кг массы для телят и поросят (5 мг/кг массы по действующему веществу), в дозе 1 мл на 10 кг массы собакам (10 мг/кг массы по действующему веществу). Тропность к очагам воспаления, накопление антибиотика в иммунокомпетентных клетках и медленная элиминация азитромицина из организма животных позволяет достичь терапевтического эффекта, как правило, только однократной внутримышечной инъекцией.

На основании проведенной нами работы и полученных результатов можно сделать вывод о том, что Азитромицин раствор для инъекций 10% является перспективной пролонгированной лекарственной формой антибиотика для лечения респираторных заболеваний животных, благодаря высокой антибактериальной активности, низкой токсичности и оптимальным фармакокинетическим свойствам.

выводы

1. Апробирована инъекционная форма азитромицина, изучены его антибактериальная активность, фармако-токсикологические свойства, установлена оптимальная доза, схема применения и терапевтическая эффективность при респираторных болезнях бактериальной этиологии у крупного рогатого скота, свиней и собак.

2. Экспериментально установлено, что азитромицин обладает выраженной антибактериальной активностью в отношении стафилококков, стрептококков, пастерелл и клебсиелл (МПК от 0,1 до 2,5мкг/мл) и превосходит по активности широко применяемые в ветеринарии макролидные антибиотики (тилозин, тил-микозин, тиамулин, толутромицин), тетрациклины (тетрациклин, доксициклин), ß -лактамы (амоксициллин, цефтиофур), фторхинолоны (энрофлоксацин), амфе-николы (флорфеникол) и сопоставим по своей активности с гентамицином.

3. Подтверждением высокой антибактериальной эффективности препарата служит взаимосвязь фармакодинамических и фармакокинетических показателей азитромицина, определяющихся коэффициентом отношения площади под фармакокинетической кривой к минимальной подавляющей концентрации, который в зависимости от микроорганизма, находится в пределах от 24 до 116 при введении Азитромицмна в терапевтической дозе 5 мг/кг массы.

4. Азитромицин раствор для инъекций 10% независимо от пути введения (перорально, подкожно, внутримышечно) по параметрам острой токсичности, согласно принятой классификации ГОСТ 12.1.007-76, относится к IV классу опасности - вещества малоопасные. LDS0 препарата при пероралыюм введении крысам и мышам составила 8115 и 6183 мг/кг соответственно, при внутримышечном введении крысам - 2975 мг/кг и при подкожном введении крысам - 3357 мг/кг.

5. Введение Азитромицин раствора для инъекций 10% в течение 10 суток в дозах 595 мг/кг/сутки (1/5 ЛД5о) и 298 мг/кг/сутки (1/10 ЛД50) приводит к обратимым изменениям массовых коэффициентов органов, гематологических и биохимических показателей, а в дозе 149 мг/кг/сутки (1/20 ЛД50 - пятнадцатикратная терапевтическая) не вызывает функциональных изменений в организме животных. По параметрам установленным в субхроническом опыте дозу 595 мг/кг/сутки следует считать токсической, дозу 298 мг/кг/сутки - пороговой, а дозу 149 мг/кг/сутки - недействующей.

6. Азитромицин раствор для инъекций 10% при десятикратном введении в дозах 1/5 ЛД50, 1/Ю ЛД5о, 1/20 ЛД5о не оказывает влияние на состояние центральной нервной системы по поведенческим реакциям крыс (стойка без опоры, стойка с опорой, короткий и продолжительный груминг, число пересеченных квадратов, норковый эффект, выход в центр и дефекация) и иммунологический статус животных по оценке гуморального и клеточного звеньев иммунитета.

7. Фармакокинетика азитромицина в сыворотке крови разных видов животных после однократного введения Азитромицин раствор для инъекций 10% в дозе1 мл на 20 кг массы телятам и поросятам (5 мг/кг массы по действующему веществу) и в дозе 1 мл на 10 кг массы собакам (10 мг/кг массы по действующему веществу) характеризуется сходным распределением - быстрое всасывание в течение 1-3 ч и медленное выведение из организма в течение 72-96 ч.

8. Фармакокинетические параметры азитромицина подтверждают медленную элиминацию антибиотика из организма, о чем свидетельствует большая площадь под фармакокинетической кривой (AUC=86856,3 нг/млхч), среднее время удерживания антибиотика в организме (MRT = 33,6 час) и длительный период полувыведения (Т1/2 =25,1 час), что обеспечивает поддержание эффективных концентраций азитромицина в течение 72-96 час.

9. Азитромицин раствор для инъекций 10% при лечении респираторных заболеваний бактериальной этиологии при однократном внутримышечном введении в дозе 1 мл на 20 кг массы телятам и поросятам (5 мг/кг массы по действующему веществу) и в дозе 1 мл на 10 кг массы собакам (10 мг/кг массы по действующему веществу) обеспечивает выздоровление 75-90% животных и при двукратном введении с интервалом в 96 ч - 90-100% животных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ

В результате проведенных исследований Азитромицин раствор для инъекций рекомендован для лечения респираторных болезней животных смешанной этиологии в дозе 1 мл на 20 кг массы (5 мг/кг) однократно, при необходимости с повторным введением через 96 часов.

Полученные результаты исследования будут включены в проект инструкции по применению Азитромицина раствора для инъекций 10% при лечении болезней животных бактериальной этиологии и войдут в состав регистрационного досье в разделы доклинические и клинические исследования.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Тягнибедина, Н.И. Чувствительность полевых изолятов стафилококков к антибиотикам / П.С. Лобова, В.Е. Абрамов, A.B. Морозова, А.Ю. Гуляева, Н.И. Тягнибедина, Б.В. Виолин //Аграрная наука. - 2009. - № 11. - С. 26 - 28.

2. Тягнибедина, Н.И. Чувствительность стафилококков и стрептококков к антибактериальным препаратам / А.Н. Панин, П.С. Лобова, А.Ю. Гуляева, Н.И. Тягнибедина, В.Б. Муравьева, Б.В. Виолин // Аграрная наука. - 2010. - № 11. -С.27-29.

3. Тягнибедина, Н.И. Применение азитромицина в комплексной терапии хла-мидиоза кошек / Н.И. Тягнибедина, П.С. Лобова, А.Ю. Гуляева, Б.В. Виолин, Е.А. Жаринова//Ветеринария. - 2011.-№4.-С. 54-56.

4. Тягнибедина, Н.И. Фармакокинетика азитромицина в организме телят после его однократного внутримышечного введения / Н. И. Тягнибедина, М.С. Се-мышева, A.B. Морозова, Б.В. Виолин // Аграрная наука. - 2012. - № 11. - С. 27 -28.

5. Тягнибедина, Н.И. Фармакокинетический профиль азитромицина в организме собак / Н.И. Тягнибедина, Б.В. Виолин // Актуальные вопросы ветеринарной фармакологии, токсикологии и фармации: Матер. IV съезда ветеринарных фармакологов и токсикологов России. - М: ФГБОУ ВПО МГАВМиБ. - 2013. - С. 590-592.

Подписано в печать: 07.11.2013

Заказ № 9036 Тираж - 100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Текст научной работыДиссертация по сельскому хозяйству, кандидата биологических наук, Тягнибедина, Наталья Игоревна, Москва

ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ БЮДЖЕТНОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ «ВСЕРОССИЙСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ ЦЕНТР КАЧЕСТВА И СТАНДАРТИЗАЦИИ ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ДЛЯ ЖИВОТНЫХ И КОРМОВ»

На правах рукописи

04201450521

Тягнибедина Наталья Игоревна

ФАРМАКО-ТОКСИКОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА И ТЕРАПЕВТИЧЕСКАЯ ЭФФЕКТИВНОСТЬ ИНЪЕКЦИОННОЙ ФОРМЫ АЗИТРОМИЦИНА

06.02.03 - ветеринарная фармакология с токсикологией

ДИССЕРТАЦИЯ

на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Научный руководитель: кандидат ветеринарных наук, старший научный сотрудник Виолин Б.В.

Москва - 2013

(и

СОДЕРЖАНИЕ

Стр.

ВВЕДЕНИЕ................................................................................. 3

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ............................................................. 7

1.1. Респираторные болезни животных бактериальной,

микоплазменной и хламидийной этиологии....................................... 7

1.2. Терапия респираторных заболеваний животных............................ 12

1.3. Азитромицин и его свойства..................................................... 18

2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ........................................... 26

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ...................................................... 26

2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ............................................ 45

2.2.1. Результаты изучения антибактериальной

активности азитромицина............................................................. 45

2.2.2. Результаты изучения токсичности Азитромицин раствор для

инъекций 10% в опытах на лабораторных животных......................................................50

2.2.2.1. Результаты изучения острой токсичности в опытах на

мышах и крысах.......................................................................... 50

2.2.2.2. Результаты изучения субхронической токсичности

в опытах на лабораторных животных................................................ 54

2.2.3. Результаты изучения фармакокинетики азитромицина

в организме телят, щенков и поросят................................................ 66

2.2.3.1. Изучение фармакокинетики азитромицина в плазме крови телят после введения Азитромицина раствор для инъекций 10%.................... 66

2.2.3.2. Изучение фармакокинетики азитромицина в плазме крови щенков собак после введения Азитромицина раствор для инъекций 67 10%.........................................................................................

2.2.3.3. Результаты изучения фармакокинетики азитромицина в плазме крови поросят после введения Азитромицина раствор для инъекций 68 10%.........................................................................................

2.2.4. Результаты изучения терапевтической эффективности Азитромицина раствор для инъекций 10% в производственных условиях............................................................................................................................................................................................................69

3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ................................................. 75

ВЫВОДЫ................................................................................. 94

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕДЛОЖЕНИЯ................................................ 96

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ............................................................ 97

ПРИЛОЖЕНИЕ А...................................................................... 125

ПРИЛОЖЕНИЕ Б...................................................................... 147

Введение

Актуальность проблемы

Болезни респираторного тракта ведут к серьезным экономическим потерям в свиноводстве, которые складываются из негативного влияния на рост и развитие, недополучения продукции от больных и переболевших животных, гибели животных, а также дополнительных затрат на приобретение лекарственных средств (20, 72, 86, 88). Уровень заболеваемости респираторными болезнями в России находиться в зависимости от региона, сопутствующих климатических условий, технологии содержания, кормления животных и составляет от 30 до 70 %, при этом летальность может достигать 9,7-30,6 % (14). Ряд авторов, учитывая широту распространения, смертность, вынужденный убой, снижение привесов, считают, что заболевания органов дыхания у молодняка по значимости превалируют над всеми остальными болезнями (54, 91).

Респираторные болезни животных, как правило, имеют полиэтилогиче-ский характер, т.к. на фоне первичного патогена всегда развивается вторичная бактериальная микрофлора, вызывающая серьезные деструктивные изменения в бронхах и альвеолах. Поэтому для лечения респираторной патологии у жи-

вотных используют антибиотики широкого спектра действия, обладающие высокой активностью в отношении основных возбудителей бактериальных инфекций, а также хламидий и микоплазм(35, 47, 51).

Нарушение схемы применения, использование антибиотиков в заниженных дозах приводит к появлению устойчивых к антибиотикам форм микроорганизмов (31, 152).

Учитывая, что некоторые микроорганизмы характеризуются мультирези-стентностью, только выбор наиболее активного противомикробного препарата определяет рациональную тактику лечения и успешный результат, позволяющий сохранить не только здоровье животного, но и его продуктивность (11).

До настоящего времени в зарубежной и отечественной ветеринарной практике лекарственная форма - раствор азитромицина для инъекций не использовалась, поэтому представлялось актуальным изучить фармако-токсикологические свойства Азитромицин раствор для инъекций 10% и его эффективность применения для лечения респираторных заболеваний животных смешанной этиологии.

Для внедрения Азитромицина раствор для инъекций в ветеринарную практику и доказательства безопасности и эффективности предложенной лекарственной формы был проведен ряд исследований, направленных на изучение антибактериальной активности, острой и субхронической токсичности препарата в опытах на лабораторных животных, его фармакокинетики в организме разных видов животных и терапевтической эффективности.

Цели и задачи исследования

Для достижения поставленной цели нами были определены следующие задачи:

Научная новизна

Впервые на основе результатов экспериментальных исследований установлена антибактериальная активность азитромицина в отношении выделенных от больных животных возбудителей респираторных заболеваний, дана фармако-токсикологическая характеристика лекарственной формы антибиотика и обоснована возможность применения в ветеринарной практике азитромицина в форме раствора для инъекций.

Практическая значимость работы

Основные положения диссертации, выносимые на защиту:

• результаты изучения антибактериальной активности азитромицина;

• характеристика фармако-токсикологических и фармакокинетических свойств антибактериального препарата на основе азитромицина в форме раствора для инъекций по результатам доклинических исследований;

• результаты клинического испытания эффективности и безопасности Азитромицина раствора для инъекций 10% для лечения респираторных инфекций смешанной этиологии у крупного рогатого скота, свиней и собак;

• практические предложения по применению Азитромицина раствора для инъекций 10% в ветеринарии.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 4 научные работы, в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Апробация работы

Основные положения диссертационной работы доложены на: - Московском Международном Ветеринарном Конгрессе по болезням мелких домашних животных в 2011 г.;

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Респираторные болезни животных бактериальной, микоплазменной и хламидийной этиологии

Респираторные болезни инфекционной этиологии широко распространены во всех странах мира. Наибольший экономический ущерб причиняют смешанные формы инфекций, возникающие вследствие нарушения условий содержания, температурных режимов, влажности, вентиляции помещений, скученность поголовья, несоблюдения сроков плановой вакцинации, что приводит к снижению иммунитета, нарушению обмена веществ, активизации роста условно - патогенной микрофлоры в организме животных. Вследствие этого повышается восприимчивость к возбудителям инфекций, вызывающих заболевания верхних и нижних дыхательных путей (47, 48, 77). В условиях хозяйств патологию респираторного тракта чаще отмечают у молодняка 1,5-4 месяцев, реже болеют животные старшего возраста. Уровень заболеваемости респираторными заболеваниями в зависимости от различий в технологии содержания и кормления животных составляет 30-70 %, при неблагоприятных условиях летальность может достигать 9,7-30,6 % (90, 138).

Вирусы, микоплазмы, хламидии, бактерии, грибы по отдельности, но чаще в ассоциации, являются основными факторами развития респираторных инфекций (51).

Как правило, основная роль в возникновении первичных респираторных патологий принадлежит вирусам или микоплазмам. Респираторные инфекции вирусной этиологии обычно протекают легко, но в случае наслоения бактериальной, микоплазменной или хламидийной инфекции, развивается смешанная бронхопневмония, которая имеет тяжелое течение и требует серьезного лечения (2, 26, 52, 55).

Смешанные инфекции на фоне стрессов и иммунодефицитов протекают значительно тяжелее, вызывая глубокие патологические изменения в бронхах и легких, иногда заканчивающиеся гибелью животного (77, 78, 106, 222).

Под воздействием вирусов или микоплазм происходит подавление факторов естественной защиты респираторного тракта, которое приводит к уменьшению количества мерцательного эпителия на слизистой оболочке воздухоносных путей, выделению экссудата, нарушению обменных процессов в легочной ткани, что создает благоприятные условия для колонизации бронхов и альвеол микроорганизмами различных групп (39, 74, 87).

Предложена классификация респираторных патогенов бактериальной природы, которые в зависимости от способности вызывать патологический процесс, подразделяют на три группы (138). В первую группу входят первичные патогены, например, Mycoplasma hyopneumoniae, Actinobacillus pleuropneumoniae, Bordetella bronchiseptica, имеющие факторы вирулентности и приводящие к развитию пневмонии.

Вторая группа включает вторичные патогены, например, Pasteurella multocida, Streptococcus spp., Mycoplasma hyorhinis, которые только на фоне изменения функционального состояния легочной ткани, вызывают развитие пневмонии.

Третья группа - бактериальные патогены, поступающие в респираторный тракт с кровью при развитии септицемии (Salmonella spp., Actinobacillus spp., Actinomyces,pyogenes) (138, 251).

По данным Федюка В.И. (1997) из пораженных легких, трахеальной и бронхиальной слизи выделяют стафилококки (14 %), стрептококки (38 %), пас-тереллы (24 %), сальмонеллы (32 %) (78). Из пневмотических очагов, трахеальной и бронхиальной слизи выделяли одновременно Streptococcus pneumonia, Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Pasteurella multocida, Pseudomas aeruginosa (35). Кокковая микрофлора (стафилококки и стрептококки) является частой

причиной катаральной и катарально-гнойной бронхопневмонии у молодняка сельскохозяйственных животных (52, 53).

При респираторной патологии, обусловленной ассоциациями микроорганизмов в различных сочетаниях, все чаще первичным этиологическим фактором бронхопневмоний становятся внутриклеточные персистирующие микроорганизмы - Mycoplasma spp. и Chlamydia spp. (87).

Современная систематика относит микоплазм, уреаплазм, ахолеплазм, спироплазм и анаэроплазм к семейству Mycoplasmatacea, класс Mollicutes.

Mycoplasma spp. - один из основных респираторных патогенов, способных вызвать патологический процесс в респираторном тракте животных (свиней, телят, коров, собак) за счет разнообразного негативного влияния На клетки макроорганизма (нарушение функций макрофагов, деструктивное воздействие на иммунокомпетентные клетки, развитие аутоиммунных реакций). Микоплаз-мы вызывают поражение эпителиальных клеток респираторного тракта, нарушение функций ресничек по удалению частиц пыли и микроорганизмов, что, в свою очередь, приводит к развитию воспалительного процесса в легких и создает условия для размножения вторичной микрофлоры (249).

Заболевание, обусловленное Mycoplasma hyopneumoniae и осложненное вторичной бактериальной флорой (Pasteurella multocida, Pasteurella haemolitica, Corynebacterium pyogenes, Bordetella bronchiseptica, Streptococcus suis, Haemophilus parasuis) называют энзоотической пневмонией свиней, которая является одной из распространенных форм проявления смешанной инфекции респираторного тракта (10, 79).

Возбудители хламидиоза животных относятся к семейству Chlamydiaceae роду Chlamidia и роду Chlamydophila.

В опытах Raiks и Jonis (1944) экспериментально доказано, что негативные эффекты хламидий на клетки макроорганизма приводят к резкой дистрофии эндотелия сосудов, массовым некрозам паренхиматозных клеток печени, тромбозу капилляров, дистрофии эпителия извитых канальцев почек (214). При по-

падании в кровь, хламидии способны вызывать внелегочные патологии, становясь причиной эндокардитов и артритов, что подтверждается и результатами других исследователей (153, 211,215, 225).

В основном хламидиозная инфекция в чистом виде существует только в начальной стадии ее развития. Хламидии, являясь внутриклеточными паразитами, создают благоприятные условия для развития другой микрофлоры за счет отрицательного воздействия на клетки слизистых оболочек. Вследствие этого развивается смешанная или вторичная инфекция респираторного тракта, которая протекает значительно тяжелее заболевания, вызываемого одним возбудителем (225).

Респираторной формой хламидиоза болеют животные всех возрастов. Источником возбудителя инфекции чаще всего являются больные и переболевшие производители и самки, в организме которых хламидии сохраняются длительное время. Передача возбудителя осуществляется половым, трансплацентарным, аэрогенным, алиментарным путем (84, 86).

В крупных хозяйствах промышленного типа болезнь проявляется в виде медленно протекающей скрытой инфекции, которая переходит в клиническую форму (повышение температуры тела до 40,5-41,0°С, кашель, серозное или се-розно-слизистое истечение из носовых отверстий, слезотечение, учащение дыхания) (48).

Долгое время считалось, что патогенные микоплазмы и хламидии видос-пецифичны и заражение человека от животных невозможно. Однако в литературе встречаются сообщения о случаях развития у владельцев кошек, больных хламидиозом, пневмонии и острого фолликулярного конъюктивита хламидиоз-ной этиологии. Хламидии, выделенные от человека, в свою очередь вызывали экспериментальный конъюнктивита у кошки. Chlamydophila felis, может вызывать генерализованную скрытую инфекцию у людей, приводя к развитию эндокардита и гломерулонефрита. По данным разных исследователей Chlamydophila

felis выделенные от человека и от представителей семейства кошачьих были идентичны(109, 123, 130, 156, 247).

Несмотря на разницу в этиологии респираторных заболеваниях, патогенез имеет сходный характер. Под действием повреждающего фактора при респираторных заболеваниях происходит закупорка бронхиальной веточки экссудатом, сдавливание кровеносного сосуда, что приводит к некрозу участка легкого, в котором микроорганизмы могут вызвать образование гнойных очагов. Распространяющееся катар

Информация о работе

Тягнибедина, Наталья Игоревна
кандидата биологических наук
Москва, 2013
ВАК 06.02.03

Диссертация

Фармако-токсикологические свойства и терапевтическая эффективность инъекционной формы азитромицина - тема диссертации по сельскому хозяйству, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы