Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюционные основы формирования простейших систем хранения и передачи генетической информации

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эволюционные основы формирования простейших систем хранения и передачи генетической информации"

О ^РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК 7 ^Ьнститутбиохимии имени а.н.баха

На правах оикппчг ■ УДК 573.55:573.554:55^2

ОТРОЩЕНКО Владимир Андреевич

эволюционные основы формирования простейших систем хранения и передачи генетической информации

03.00.4 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

Москва - 1997 г.

Работа выполнена в Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН

Официальные оппоненты:

член-корреспондент РАН, ирофессор И.С. Кулаев

доктор физико-математических наук, профессор Д.С. Чернавский

доктор химических наук, профессор К.Л. Гладилин

Ведущая организация

Институт биологии гена РАН

Защита состоится "_"_ 1997 г. в_часов на

заседании специализированного совета Д 002.96.01 по защите диссертаций на соискание учёной степени доктора наук при Институте биохимии им. А.Н. Баха РАН (117071 Москва, -Ленинский пр., 33, корп. 2)

С, диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке биологической литературы РАН (Москва, Ленинский пр., 33, корд. 1)

Диссертация разослана "_"_1997 г

Учёный секретарь специализированного совета, доктор биологических наук

Т.А.Валуева

I Остановка проблемы и актуальность

Почти полная универсализация генетическою кода и связанных с ним молекулярных механизмов, так же как полное отсутствие альтернативных систем, предполагают, что все формы жизни в процессе ее эволюции, имели сходные системы хранения и транспорта генетической информации.

Основное предположение, положенное в настоящее время в основу схематической модели возникновения аппарата трансляции состоит в том, что первоначально все типы его главных компонент возникли из одного простого тина макромолекул. Дальнейшее их разнообразие - продукт дивергенции молекулярной эволюции.

В то же время, общеизвестным является тот факт, что любая клетка содержит в своем внутреннем устройстве, в последовательности нуклеотидов и аминокислот, свидетельства своего эволюционного развития. Именно поэтому Э. Цукеркандль и Л.Полинг называли информационные биополимеры "молекулярными документами эволюции". Эти живые реликты являются потенциально гораздо более информативными, чем подлинные окаменелости, и в предельном случае, позволяют надеяться на возможность воссоздания общего древнейшею предшественника всех живых форм.

Универсальность механизмов хранения и передачи генетической информации и возможность реконструкции их древнейших и простейших форм позволяют предположить, что может быть найден и неизвестный древнейший общий предшественник современного аппарата трансляции. Это позволит не только более четко выявить эволюционные пути развития генетического аппарата, но и, главным образом, ответить на вопросы о причинах и закономерностях их выбора. Таким образом, можно попытаться обнаружить хотя бы часть той программы, на основе которой первые органические молекулы вступали во взаимосвязь, образуя все более сложные молекулярные механизмы.

Поэтому разработка подходов к выявлению с одной стороны возможностей реконструкции элементарной генетической системы, а с другой - экспериментальных моделей, объясняющих возможные пути ее образования, представляется весьма актуальной научной задачей.

Цель и задачи работы Цель работы.

Экспериментально показать возможность самопроизвольного возникновения молекулярных механизмов, на основе которых возможно образование простейшего аппарата хранения и передачи генетической информации.

Основные задачи работы.

1 Экспериментально доказать принципиальную возможность образования веществ, служащих основой для синтеза аминокислот, нуклеотидов, олигопептидов или олигонуклеотидов, в условиях, соответствующих проявлениям вулканической активности в земной коре.

2 Экспериментально продемонстрировать возможность специфического, бесферментного матричного синтеза олигонуклеотидов.

3. Выявить возможность "узнавания" аминокислот комплементарными полинуклеотидными комплексами, содержащими в своем составе соответствующие кодон-антикодонные триплеты.

4. Исследовать банк данных генов тРНК с целью выявления в их составе древнейших последовательностей.

5. Построить возможную модель древнейшей тРНК, способной обеспечить безрибосомный и бесферментный направленный синтез пептидов.

Теоретическая ценность и научная новизна

Экспериментально показана возможность образования органических молекул - возможных предшественников нуклеотидов и аминокислот - путем восстановления такого ТИПИЧНОГО газового компонент атмосферы, как у|лекислый в условиях, имитирующих долговременные природные процессы, связанные с вулканической и поствулканической деятельностью,. Тем самым продемонстрирована связь геологических процессов с процессами синтеза органической материи.

Проведено экспериментальное моделирование абиогенного формирования генетических механизмов, начиная с поликонденсации отдельных нуклеозидмонофосфатов.

Экспериментально показана важная роль минеральной поверхности как стабилизирующего и конденсирующего фактора, которая одновременно на первых стадиях эволюции является своеобразным компартментом по отношению к биологически важным органическим молекулам.

Экспериментально показана возможность абиогенного специфического матричного синтеза пиримидиновых олигонуклеотидов.

Показана принципиальная возможность бесферментного "узнавания" соответствующих аминокислот кодон-антикодонной

и _

парой триплетов, входящих в состав комплекса полирибонуклеотидных молекул.

Па основе анализа банка данных генов тРНК предложена модель первичной адаторной молекулы РНК и на этой основе механизма направленного бесферментного синтеза пспетидов.

Практическая значимость.

Создание примитивной модели бесферментного и безрибосомного направленного синтеза пептидоь позволяет конструировать простейшие молекулярные механизмы, способные по заданной программе синтезировать пептиды, обладающие заданными полезными свойствами. Конструирование подобных химических систем, так называемых

"наноус.тройств", является основной задачей возникающей на наших глазах новой науки - нанобиологии, и неизбежнс связывается с проблемой происхождения жизни. Таким образом, изучение возможных форм молекулярной эволюции, обеспечивает с одной стороны более глубокое понимание проблем эволюционного развития материи, с другой - сугубс практические цели. К ним можно отнести также обоснование методов обнаружения следов жизни и ее примитивных форм, необходимых, при исследовании других планет, или, разработку новых методов генной терапии.

Апробация работы.

Материалы диссертации в виде докладов и сообщений были представлены и обсуждались на научных симпозиумах, съездах, конференциях, совещаниях и научных семинарах. Основные из них:

III International Conference on the Origin of Life. (Pont-a-Musson, France, 1971).

IV International Conference on the Origin ui Life. (Barcelona, Spain, 1973).

I, П и III Всесоюзные конференции по эволюционной биохимик и происхождению жизни. (Ереван, 1978г.; Петрозаводск, 1984г.; Телави, 1987г.).

•Международный симпролиум "Сборка предбиологических и

Аполитических структур" (Москва, 1979г.).

XVI Conference of FF.BS (Moscow. 1984г.).

VI International Conference oti the Origin of Life. (Prague, 1986!

OziH-.linslovakia.

V Всесоюзный биохимический съезд (Киев 1986г.). Всесоюзный симпозиум "Эволюция фотобиологических процессов" (Пущино 1986г.).

Международный семинар "Минеральные субстраты как основа для фотобиологических реакций; происхождение жизни': (Пущино 1990г.).

HI International Conference "Recontres dc Blois" - "Frontiers of Life" (Blois, France, 1991).

The International Workshop at the Argonne National Laboratory at the University of Chicago on the Integrated Biological Database (Argonne, USA, 1993).

Ill Trieste Conference on Chemical Evolution. - Conference on the Structure and Model of the First Cell (Trieste, Italy, 1994). Международный симпозиум, посвященный 100-летию со дня рождения академика А.И.Опарина "Биохимия 21то века: проблемы и горизонты" (Москва, 1994г.). Mini Conference - the Origin of Life (Glasgow, UK, 1995). Международная конференция , посвященная памяти академика А.Н.Белозерского "Горизонты биохимии и молекулярной биологии" (Москва, 1995г.).

XI International Conference on the Origin of Life (Orlean. France, 1996).

Доклады на научных семинарах:

Институт белка АН СССР (Пущино 1980 г)

Jniversity of Maryland (College Park, USA, 1982r)

Jniversity of Houston (Houston, USA, 1982r)

Jniversity of Illinois (Chicago, USA, 1982r)

VJASA Ames Research Center (Moffett Field, USA, 1985r)

¿oswell Park Memorial Institute (Buffalo, USA, 1985r)

Rensselaer Polytechnic Institute (Troy, USA, 1985r)

Special Seminar. - Informal Talk on Nucleic Acids and Genetic

lode. University of California at Los Angeles, Salk Institute (San

35ego, USA, 1985).

Centre de Biophysique Moleculaire CNRS (Orleans, France, 990r)

nstitute Jacques Monod (Paris, France, 1991 r) кесоюзное совещание, посвященное процессам, связанным с формированием и эволюцией вулканогенных озер (Москва, 1ГЕМ АН СССР, 1991г.)

I! уб л щсздии

По теме диссертации опубликовано 26 печатных работ в отечественных и зарубежных научных журналах.

()бъем диссертации

Диссертация изложена на_ страницах

машинописного текста, _ рисунков и

литературы состоит из_названий, из них

на иностранных языках.

Экспериментальная часть

Материалы и методы исследования

Методы электрохимии.

При изучении возможности электрохимического восстановления СО2 применялись методики получения поляризационных кривых на вращающемся дисковом электроде из пирита, помещенном в фосфатный буфер (рН 7,0) в атмосфере инертного газа (аргон) или в атмосфере СО2.

Минеральные матрицы и их обработка.

В работе использовались также следующие вулканические породы: вулканический шлак вулкана Ключевский (извержение 1966 г.), базальт вулкана Гекла (извержение 1970 г.), вулканический шлак вулкана Тятя (извержение1973 г,), вулканичсеский пепел вулкана Толбачик (извержение 1975 г,). В качестве более эффективных адсорбентов использовали также глины: каолинит (Турбов и Великогадоминецкое месторождение) и монтмориллонит (месторождение Кунабари). Навески (0,5 - 2,5 г.) предварительно измельченных (60-100 меш), промытых и высушенных вулканических пород перемешивали при комнатной темрературе в течение 8 или 24 часов с водными растворами нуклеозидмонофосфатов (22 мкмоль/л) при рН 2,5. Для проведения анализа и дальнейших

, из них _ страниц

_ таблиц. Список

_на русском и_

процедур инкубационную смесь разделяли центрифугированием в течение 15 мин при 6.5 х 10й об./мин.).

Определение коэффициента адсорбции.

Концентрацию нуклеозидфосфатов в надосадочной фракции определяли сиектрофотометрически по поглощению спета при соответствующей длине волны. Удельную поверхность адсорбции вулканических пород определяли с помощью метода адсорбции молекул инертного газа на адсорбирующей поверхности. Построив изотермы адсорбции, подчиняющиеся уравнению Лэнгмюра, определяли коэффициенты адсорбции.

Образование на минеральной поверхности олигонуклеотидов под воздействием излучения.

Каолинит измельчали до состояния, при котором величина частицы была менее 170 мсш. Полученный образец промывали 0,5 н НС1, с последуцющей промывкой бидистиллировашюй водой до значения рН 3. При изучении воздействия излучения на адсорбированные на минеральной поверхности молекулы навески <4 г) смешивались с инкубационной средой • водными растворами меченых по 1'4С] нуоеозидмонофосфатов. Инкубацию полученных таким образом образцов проводили 6 час. при комнатной температуре. Для облучения адсорбировавшихся на минеральной поверхности молекул образовавшийся при центрифугировании осадок промывали дважды холодной бидистиллированной водой при рН 2,5 с последующим центрифугированием, а затем высушивали его в вакуумном эксикаторе. Для облучения образцов УФ светом при различных экспозициях использовали ртутную лампу сверхвысокого давления ДРШ-1000. Для облучения гамма лучами использовали кобальтовый источник ([60Со] , 10 Мрад) в течение 12 час.

Облученный материал десорбировали 0,01 М фосфатным буфером при рН 8 в течение 3-4 час. с последующим центрифугированием. Надосадочную фракцию после упаривания ресуспендировали в 0,01 М трис-буфере рН 7,5 и раствор

фильтровали через мембранные фильтры No 2 (Chemapol, ЧССР). Затем его анализировали хроматографически на колонке с DEAE-цллюлозой (SERVA) с помощью 0,01 M Трис-буфера (рН 7,5) и 7 M мочевины в линейном градиенте NaCI (от 0 до 0,5 M) (Tomlinson and Tener, 1962). Радиоактивность хроматографических фракций измеряли с помощью сцинтилляционного счетчика SL-4000.

Степень полимеризации образовавшихся олигомерных продуктов определяли по градуировочной кривой, полученной на этой же колонке по [14С] олигонуклеотидным стандартам.

Энзиматический гидролиз образовавшихся олигонуклеотидов проводили с помощью фосфодиэетеразы и РНКазы То с последующим хроматографическим анализом на колонке с DEAE целлюлозой. Перед гидролизом фракции предварительно обессоливали (Rushizky,Sober, 1962).

Одновременный синтез на поверхности глины олигонуклеотидов и олигопептидов.

При изучении одновременного синтеза пептидов и олигонуклеотидов образцы каолинита подготовляли аналогичным образом. Инкубацию проводили при температуре 5°С и рН 8,5. В каждый опыт брали навеску 1 г каолинита. После проведения опытов в течение 3,5 час суспензию минеральной матрицы центрифугировали и отдельно исследовали надосадочную фракцию, а также фракцию, образовавшуюся после десорбции с осадка глины, проведенной в градиенте рН 5-7. В случае использования в реакционной орсле буфера, мрсднарительш, до градиентной элюции, 11рошдили обессоливание на сефадексе G-10. При этом реакционная среда использовалась в двух вариантах: водная, доведенная до рН 8,5, и буферная - 0.05М трис-буфер рП 8,5. В состав реакционной среды в обоих случаях входили 25 мкмоль ала-аденилата и по 10 мкмоль аминокислот аланина и глицина. Анализ полученных продуктов проводили методами колоночной хроматографии (гель-фильтрация на сефадексе G-10; фракционирование надосадочной и десорбированной с глины

фракции на колонке с SP-сефадексом С-25 в линейном градиенте 0,5 н NaCl в 0,05 М цитратно-фосфатном буфере (pH 4,5); фракционирование олигонуклеотидов на колонке с DEAE-целлюлозой в линейном градиенте 0,5 н NaCl в трис-буфере pH 7,6 с добавлением 7 М. мочевинн на старте градиента). Для регистрации оптической плотности элюированных веществ использовали Увикорд III 2089 (LKB) одновременно при двух длинах волн - 206 и 254 нм.

Гидролиз пептидов проводили в течение 24 час -при температуре 130° в 6 н HCl. Аминный азот до и после гидролиза определяли по Муру и Штейну (Moore, Stein, 1954). Степень полимеризации олигонуклеотидных продуктов определяли по градуировочной кривой, полученной на этой же колонке по олигонуклеогидным стандартам

Матричный синтез

При изучении матричной активности полинуклеотидов, связанных с минеральной поверхностью использовании монтмориллонит. Пред экспериментами его измельчали, промывали, как сказано выше, и переводили в магниевую форму. Навески (2 г) перемешивали с раствором поли А или поли U (6,8 10 3М) в 1 10 3 фосфатном буфере с 0,2 М NaCl и 1 10"3 М MgCl2 при pH 5,0 и инкубировали в течение 24 час при комнатной температуре.

При работе с полинуклеотидами осадок монтмориллонита с адсорбированной на нем поли-А отделяли центрифугированием, промывали исходным буфером и бидистиллированной водой и инкубировали с меченым [14С] UMP в описанном выше инкубационном буфере в течение 5 суток при 5°С. Промытый и высушенный над Р2С>5 сухой минерал с адсорбированным на нем комплексом поли-А - [14С] UMP термостатировали в течение 7 час при 85°С. Десорбцию комплекса проводили 0,07 М фосфатным буфером, содержащим 0,5 М NaCl и 0,001 М MgCl2 (pH 8,0) в течение 24 час при комнатной температуре. Десорбент анализировали на хроматографической колонке с гидроксилапатитом в линейном градиенте концентрации

фосфатного буфера (0.001-0,5 М, pH 6,0). Хроматографические фракции, соответствующие объему элюции комплекса поли-А -иоли-U. объединяли, упаривали в роторном испарителе и обессоливали с помощью биотеля Р-2 (Bio Rad, США) (Neal, Flovini, 1973). Полученный материал разделяли на две части. Первую - для контроля пропускали через колонку с шдроксилапатитом без предварительного нагревания. Вторую -нагревали в кипящей водяной бане в течение 15 мин (для диссоциации комплекса) с последующим быстрым охлаждением в ледяной бане. Для предотвращения реассоциации полинуклеотидов в раствор добавляли формальдегид до конечной концентрации 1 %. Обработанный таким образом материал вновь подвергали хроматографии с помощью 1идроксилапатита. Радиоактивность полученных

хроматографических фракций определяли с помощью сцинтилляционного счетчика.

Гидролиз образовавшихся олигонуклеотидов проводили с помощью формиата аммония (pH 10), инкубируя материал в плотно закрытом сосуде, находившимся в кипящей водяной бане п течение 10 час. Анализ гидролизата проводили на кроматографической колонке со смолой Ag50x4 (Bio Rad, CUJA) с помощью 0.1 М формиата аммония (pH 3.2).

Получение деградированных нуклеотидных

последовательностей для специфического

взаимодействия с аминокислотами

Для образования поли-А - поли-U комплексов использовали ранее разработанные методики (Rieh, Davis, 1956; Felsenfeld, i «vi; . Rich, 1957). Для отщепления азотистого основания полипуклеотида был применен метод мягкой апуринизации í Liiidliai, Nyberg, 1972).

Для определения степени связывания аминокислот с бимолекулярным полинуклеотидным комплексом последний инкубировали со 100 мкл ['^С] аминокислоты в течение 5 суток при 4°С. Для определения степени неспецифического снязыпания предварительно проводили инкубацию аминокислот

в тех же условиях с неапуринизированным комплексом. Полученный после инкубации материал исследовали с помощью гель-фильтрации па Сефалсксе G-10. Степень радиоактивности фракций определяли с помощью сцинтилляционного счетчик.').

Анализ банка данных последовательностей генов тРНК.

Для анализа банка данных последовательностей генов тР1 1К (Sprinzl et al. 1989, Sequenc.es Suppl.) с целью выявления последовательности, которую можно было бы рассматривать как исходную в эволюции этого типа молекул, использовали метод оптимального выравнивания поело ti^z ¡.ностей (Needlman. Wunsch, 1970)

Результаты и обсуждение

1 Возможность образования органических мшюкул.....

и редшествёнпиков нуклеозидмонофосфатов и ам iюкислот ири восстановлении СОо..

Формирование органических соединений было обусловлено на первых стадиях своего развития явлениями, связанными с активностью неживой природы, и происходящими, в частности, на границе раздела жидкой и твердой фазы. Для того, чтобы понять, как геологические процессы, связанные с формированием и эволюцией земной коры, могли дать начало синтезу и последующей эволюции органического вещества, которая привела к образованию систем хрнения и передачи информации, необходимо по возможности всесторонне выяснить роль поверхности природных минералов. В последнее время в работах, евзаиных с изучением эволюции органического вещества на Земле, большое внимание уделяется роли минералов, связанных с вулканической и поствулканической активностью земной коры, например, широко распространенных сульфидных минералов, о частности, пирита [Wachtersh äuser, 1992; Kaschke et al., 1994]. Электрохимические процессы, происходившие на минеральной

поверхности, могли дать существенный вклад в синтез и эволюцию органического вещества, помимо участия минералов в чисто химических реакциях. Физико-химические свойства таких минералов, так же как и гидротермальные условия их образования соответствуют характеристикам формирования электрохимических систем, способных к восстановлению СО2 и синтезу примитивных органических молекул. Сущность такого электрохимического феномена основана на электронной проводимости твердых минералов и ионной проводимости иодных растворов большинства неорганических электролитов. Источноком электрического тока в земной коре являются рзнообразные минеральные компоненты сложных рудных отложений или отдельные рудные образования [Рысс, 1973].

Контакт токопроводящих минералов с раствором электролита вызывает формирование двойного электрического слоя на поверхности их раздела и образование соответствующего потенциала. Сухой контакт между поверхностями двух электрохимически различных минералов, погруженных своими противоположными частями в электролитический раствор, приводит к возникновению электрической цепи.

Среди сульфидных минералов пирит является одним из наиболее типичных участников такого рода процессов. Содержащие его руды очень распространены в земной коре и характерны для проявлений гидротермальной активности (в особенности, с деятельностью так называемых "черных курильщиков") на океаническом дне, то есть в окружении электролитического раствора. Продукты бескислородного химического выветривания пирита содержатся даже в докембрийских образцах рудных отложений, что указывает на его присутствие в земной коре на ранних стадиях ее развития [Руттен, 1973; БЬорГ, 1992].

С другой стороны, двуокись углерода, являющаяся наиболее типичным компонентом природных термальных растворов, хорошо известна в качестве одного из возможных участников электрохимических реакций, конечным продуктом которых

являются органические вещества [Hayxies, Sawyer, 1967; Wawzonek et al., 1955]. Величина электродного потенциала при этом у пирита колеблется в пределах от 0 до ЮООмВ, а в некоторых случаях даже превышает один вольт. Такой величины потенциала достаточно для инициирования катодного восстановления СО2 с образованием органических соединений. Подобно электродным материалам, которые обеспечивают электрохимическое восстановление С02, пирит обладает полупроводниковыми сойствами и слабой адсорбционной способностью [Чантурия, Видергауз, 1993]. Следует подчеркнуть, что подобный электрохимический процесс на поверхности пирита и подобных ему сульфидных минералов принципиально отличен от предполагавшихся ранее возможных химических реакций на его поверхности, связанных с химической эволюцией органического вещества. Существенным его моментом на первой стадии является прямой переход электрона с катода-минерала на акцепторную молекулу в отличие от межмолекулярного обмена электронами, происходящего обычно в растворе в ходе химических реакций,

Нашими экспериментами было показано, что, действительно, на катоде, изготовленном из монокристалла пирита, происходит восстановление СО2 (Рис Л). Различие поляризационных кривых, снятых в присутствии СО2 и Аг, указывает на наличие катодного восстановления даже при нормальном атмосферном давлении в большом диапазоне температур. Заметные токи восстановления были зарегистрированы в области потенциалов отрицательнее 500-600мВ. Такой уровень потенциала находится в пределах значений, полученных при изучении гальванопар на основе сульфидных минералов [Сахарова, Лобачева, 1978]. Газохроматографический анализ продуктов восстановления показал, что происходит образование органических соединений (например, формальдегида) (Рис.2), некоторые из которых можно рассматривать в качестве прямых предшественники биологически важных молекул: азотистых оснований, Сахаров, нуклеозидфосфатов и аминокислот [Владимиров и др., 1996; Kritsky et al. ,1996].

isa

150

^a ido -1

50 0

0 zoo 400 sao too looo 1200

-E. иВ

Рис. I. Поляризационные кривые, полученные с помощью дискового эдектрода, вырезанного из монокристалла пирита, в фосфатном буфере (рН 7,0) при атмосферном давлении и температуре 40° в присутствии аргона и С02

Рис. 2. Разделение с помощью газового хроматографа продуктов, образовавшихся при восстановлении в течение 4 час СОг на Ре¿2 при напряжении 900 мВ и средней площади катода около 10 см2.

и , . ■ ' Г ' ( - ' ! 1

\ : соау;/ : У iл

Таким образом, можно сказать, что электрохимические реакции с участием широко распространенных в земной коре минералов, характерные для гидротермальной активности, тесно связанной с процессами формирования и эволюции земной коры, являются, наряду с другими известными источниками энергии, естественным источником возникновения органического вещества в системе сложных геологических явлений неорганической природы, необходимого лля возникновения и последующего развития живых систем.

2. Возможность образования олигонуклеотидов на минеральной поверхности под воздействием излучения

Как известно, все информационно-генетические системы современных организмов в своей основе имеют линейные биополимеры. Каким же образом могли происходить полимеризация отдельных мономеров, образовавшихся в небиологических условиях?

За последние 30 лет в модельных экспериментах по синтезу биологически важных мономеров активно изучалось влияние излучения различной природы (прежде всего, УФ света), однако, данных, касающихся абиогенного формирования биополимеров под воздействием таких источников энергии все еще недостаточно. Подчеркивалось, в основном, лишь деструктивное воздействие излучения на процессы предбиологического синтеза биополимеров. Это не удивительно, так как хорошо известными фактами радиобиологии являются, например, димеризация оснований, гидратация, таутомеризация, разрыв полинуклеотидных цепей и т. п.

Однако, синтез биополимеров при непосредственном воздействии излучения представляется более вероятным, если учесть возможности, открывающиеся при адсорбции органических молекул на минеральной поверхности. Еще в 1951 г. это предположение было высказано Дж. Берналом (Bernai, 1951), а в 1967 г. академиком А.Н.Терениным (Теренин, 1967) было показано, что при облучении УФ светом адсорбированных на неорганической матрице органических

молекул происходит перераспределение электронов с учетом разрешенных дискретных состояний, и две системы (органическая молекула и адсорбирующая минеральная матрица) в результате переходят в энергетически более выгодное состояние, при котором энергия бинарной системы оказывается меньше, чем сумма энергий каждого участника изаимодействия. При этом кристаллическая решетка минерала со своей электронной структурой выступает как равноправный участник такой пары. К настоящему времени выполнен целый ряд экспериментальных работ, подтверждающих эту точку зрения [Aronowitz et al., 1982; Gupta et al., 1983; Coyne et al., 1984; Lahav et al., 1985; Nishita and Hamilton, 1970; 1971; 1972]. По-видимому, в этом случае можно говорить о своего рода "откачке" энергии, поглощаемой органическими молекулами, в кристаллическую решетку адсорбента.

На какие же органические молекулы в первую очередь следовало обратить внимание? По современным представлениям древнейшие молекулы РНК надо рассматривать как ключевой биополимер первых живых систем [Orgel, 1987; Orgel, Crick, 1993]. Результаты, полученные в свое время Дж.Оро и нами [Ого and Stephen-Sherwood, 1974; Отрощенко и др., 1985; Otroshchenko et al., 1985], указывают на возможность их абиогенного возникновения. Они, вероятно, осуществляли как катализ, так и хранение и передачу генетической информации. Известна высокая лабильность этих молекул по сравнению с молекулами ДНК, обусловленная присутствием гидрокисльной группы как у 2\ так и у 3' атома углерода рибозы. Именно поэтому рибоза легко атакуется в этих положениях различными окислителями. Следовательно, с химической точки зрения в результате облучения можно ожидать, в частности, и возникновения процесса поликонденсации адсорбированных молекул, например, ииионуклеозидфосфата с образованием фосфодиэфирных межнуклеотидных связей в местах воздействия окислителей, обусловленного с одной стороны делокализацией энергии

возбужденных азотистых оснований этих молекул, а с другой -фотолизом воды под действием УФ света с выделением кислорода и пероксидных радикалов, являющихся активными окислителями. Фотодиссоциация воды на минеральной поверхности с выделением кислорода и даже более сложные процессы типа фотоокисления за счет адсорбированного кислорода были ранее продемонстрированы экспериментально 1Солоницын и др., 1980].

Прежде всего, исходя из предположений о характере минеральной поверхности первобытной Земли, была показана возможность адсорбции нуклеозидфосфатов, на поверхности базальта и вулканических шлаков (Рис.З) [Отрощеико, Васильева, 1976; Otroshchenko and Vasilyeva, 1977].

, 1/г

UM/м2)-1

(//М/л)"1

Рнс. 3. Адсорбционные кривые нуклеозидмонофосфатов на базальтовом шлаке вулкана Ключевская сопка 1 - СМР, 2 - GMP, 3 -AMP 4 - UMP.

Была сделана попытка на основе этих результатов экспериментально изучить возможность фотохимического синтеза олигонуклеотидов при воздействии различных типов излучения (главным образом, - ультрафиолетового или гамма излучения, характерного для многих горных пород) на адсорбированные минеральной поверхностью

нуклеозидмонофосфаты. В этом случае в качестве адсорбента использовались также и глины, потому что, во-первых, они являются конечным продуктом процессов физико-химического выветривания земных пород и поэтому очень широко распространены в природе, а во-вторых, потому что они обладают большой удельной площадью адсорбции. Для адсорбции на поверхности частиц глины молекул нуклеозидмонофосфата использовали водный раствор [,4С] AMP. Было показано при этом, что в результате облучения адсорбированных молекул на минеральной поверхности образуются более сложные по сравнению с исходными молекулы, характерные объемы элюции которых на хроматографической колонке в максимальном случае соответствовали декамерам (Рис.4-7) [Otroshchcnko, Vasilyeva, 1983; Otroshchenko et a!., 1986; Strigunkova et al., 1986]. Из полученных результатов следует также вывод, касающийся механизма подобного фотохимического синтеза. По-видимому, как фотолиз воды, так и последующее взаимодействие его продуктов с уязвимыми 2" и 3" атомами углерода в рибозном цикле действительно имеют здесь решающее значение (Рис.8) lOtro.shehenko et al., 1992]. поскольку продукты фотохимического синтеза при облучении адсорбированных молекул ЛМР в вакууме не обнаруживались в отличие от результатов экспериментов в парах воды и в воздухе.

11ри анализе результатов соответствующих контрольных экспериментов по облучению аденозинмонофосфата в отсутствие адсорбента (было использовано высушивание на поверхности оптически чистого кварца) было отмечено значительное снижение как разнообразия, так и количества

колонке с DEAE-целлюлозой, продуктов, синтезированных при облучении УФ светом адсорбированных на поверхности каолинита молекул [uCl AMP в течение: А - 0,5 час; Б - 2,0час; В 6,0час. Стрелками обозначены объемы элюции стандартных олигонуклеотидов (п=2,7,8,9). Пунктиром показаны результаты, полученные в контрольном эксперименте в отсутствии каолинита.

Рнс. 5. Образование олигонуклеотидов на

минеральной поверхности под воздействием гамма излучения. Разделение на

хроматографической колонке с DEAE-целлюлозой, продуктов, синтезированных при

облучении гамма лучами адсорбированных на

поверхности кварца молекул l14C) AMP. Дня сравнения показано разделение смеси стандартных олигонуклеотидов, состоящих из 1, 2, 7, 8 и 9 мономеров.

Рнс. 6, Образование олигонуклеотидов на

минеральной поверхности под воздействием гамма излучения. Разделение на

.хроматографической колонке с DEAE-целлюлозой продуктов, синтезированных при

облучении гамма лучами адсорбированных на

поверхности базальта

(вулканического пепла)

молекул [HCj AMP. Рис. 7. Образование олигонуклеотидов на

минеральной поверхности под возлейотпием гамма излучения.

на

,шпин, I с ЛрйД) к сов, при лучами на

каолинита AMP.

Равелем;? хромат ограф/ ¡ескпй DEAE целлюлозой синтезированных облучении гамма адсорбированных поверхности молекул [14С]

вновь синтезированных продуктов (Рис. 5). Кроме того, в качестве контроля адсорбированные молекулы подвергались также термическому воздействию. При этом было зарегистрировано лишь образование продуктов деструкции. Определение типа образовавшихся в условиях эксперимента межнуклеотидных связей при использовании специфическою ферментативного гидролиза фосфодиэстеразой и РНКазой Т2 показало, что синтезированные продукты содержат как 3'-5" так и 2N-5' межнуклеотидные связи, а также по-видимому связи других типов, например, пирофосфатные (Рис. 9 А, Б).

Таким образом, одним из вероятных путей образования олигонуклеотидов, которые впоследствии могли служить основой для возникновения первых гиперциклов [Eigen, 1971 ], объединявших хранение информации, ее трансляцию и синтез примитивных пептидных катализаторов, можно считать их фотохимический синтез из адсорбированных минеральной поверхностью нуклеозидмонофосфатов под воздействием излучения разной природы.

3. Одновременный синтез олигонуклеотидов и пепетидов ...в абиогенных условиях.

На примере современных генетических систем видно, что для их нормального функционирования необходимо наличие по крайней мере двух важных компонентов: полинуклеотидов и полипептидов. Понятно, что одновременное возникновение таких молекул могло обеспечить эффективное совершенствование и дальнейшую эволюцию механизма синтеза молекул, способных нести информацию, ибо при одновременном возникновении возрастает вероятность взаимодействия между процессами синтеза полипептидов и полинуклеотидов. Возможность одновременного ооразования этих двух типов молекул была нами проверена экспериментально. С этой целью в качестве исходного субстрата использовались бифункциональные макроэргические

«wr/vuu

«04

Рис. 8. Образование олигонуклеотидов на минеральной поверхности под воздействием УФ света. Разделение на хроматографической колонке с DEAE-целлюлозой продуктов, синтезированных при облучении У<Ф светом адсорбированных на поверхности каолинита молекул [14С] AMP.в течение б час при комнатной температуре в вакууме (А), в воздухе (—) и в парах воды(—) (Б).

Рже. 9. Анализ олигонуклеотидов, образовавшихся на минеральной поверхности под воздействием УФ света. Разделение на хроматографической колонке с ОЕЛЕ-целлюлозой гидролизатов фракций, соответствующих (А) объему элюиин с п=10-12 (циэстеразой) и фракций (Б), соответствующих объему элюции олигомероа с п=3-5 (РНКазой Т^): (—) до гидролиза, (—) после гидролиза

молекулы аминоациладенилатов, которые энергетически могут обеспечивать синтез пептидных и нуклеотидных олигомеров. Богатые энергией молекулы этого типа представляют особый интерес для эволюции. Это было отмечено и использовано А.Качальским и М.Пехт-Горовиц в экспериментах по изучению абиогенного синтеза полипептидов на минеральной поверхности еще в 60-х годах [Paecht-Horowitz and Katchalsky, 1972; Paecht-Horowitz and Eirich, 1988].

В наших экспериментах было показано, что при взаимодейс.тваии молекул аминоациладенилатов,

адсорбированных на поверхности частиц глинистых минералов (в нашем случае адсорбция проходила на суспезии частиц каолинита при рН 8,5 и 5°С), происходит образование как олигопептидов, так и олигонуклеотидов (Рис. 10, 11) [Егофарова и др., 1990; Otroshchenko et а1.,1992]. При хроматографическом анализе надосадочной фракции и десорбированной с поверхности частиц глины, образование и накопление тетрануклеотидов в водной фазе происходит одновременно с возникновением пентапептидов на поверхности частиц глины. При этом выход олигонуклеотидов, например, значительно превышает следовые количества этого продукта, образующегося в таком же растворе в отсутствие каолинита. Таким образом, и в этом случае поверхность глинистых частиц (минеральная поверхность) может катализировать из одного и того же исходного субстрата одновременный синтез не только олигонуклеотидов, являющихся молекулярной основой систем хранения и передачи информации, но и олигопептидов, потенциально способных обеспечить катализ необходимых реакций и повысить тем самым эффективность соответствующих молекулярных механизмов.

4Возможность бесферментного матричного синтеза олигонуклеотдов.

Среди процессов, происходивших в ходе химической эволюции органического вещества, большое значение для его дальнейшего усложнения и хранения полученной информации

D

206,254

D

MNaCI 206,254

\л м«лч

Ряс. 10. Одновременный синтез олкгонуклеотидоа и олкгопептидов на минеральной поверхности. Разделение на хроматографической колонке с помощью гель-фильтрадан на сефадексах суммарных надосадочной и десорбировакной с каолинита фракций: А надосадочная, Б - десорбированная: 1 - поглощение пептидов при 206 нм, 2 - поглощение нуклеотидов при 254 ни.

Mi£

а

ÜL

Рис. И. Одновременный синтез олигокуклеотидов и олигопептидов на минеральной поверхности. Разделение на хроматографической колонке с ВЕАЕ-целлюлозой нуклеотидной надосадочной фракции в линейном градиенте концентраций 0.5 н. ЫаС1 после проведения реакции в водной растворе без буфера: 1 - контроль без каолинита, 2 - опыт.

должно было иметь формирование механизма примитивного специфического матричного синтеза. К. Уоддингтон в связи с этим писал: "Использование линейных последовательностей, по-видимому, представляет собой простой путь создания системы, в которой возможно образование очень большого числа чередующихся специфических комплексов из ограниченного числа единиц" (Уоддингтон, 1964). Так могли возникнуть первые системы репликации, способные хранить и передовать информацию, необходимую для обеспечения максимальной выживаемости образующихся молекулярных комплексов. Необходимым условием для их организации было образование ноли (олиго-) нуклеотидов.

Уже в работах Л.Оргеля [Orgel, 1987 a,b] была экспериментально продемонстрирована возможность матричного синтеза, правда, при довольно больших ограничениях: в этих экспериментах в качестве исходного материала использовался водный раствор химически активированных мононуклеотидов, таких как нуклеозид-5'-фосфо (2-метил) имидазолидов, что вряд ли соответствует реальным геологическим и химическим условиям первобытной Земли. Но даже несмотря на успешно осуществленный матричный синтез луриновых полинуклеотидов, синтеза ниримидиновых полинуклеотидов получить не удалось (Hill et al., 1993].

С нашей точки зрения более перспективной и соответствующей гипотетическим условиям окружающей среды является гетерогенная система, в которой часть взаимодействующих молекул адсорбирована на минеральной поверхности. Концентрация мономеров-предшественников на минеральной поверхности, так же как присущие ей функции катализа и перераспределения энергии делают ее необходимым элементом процесса образования примитивных биокаталитических и генетических систем.

В самом деле, при адсорбции, например, полинуклеотидной матрицы, поли А, на поверхности глинистых частиц нашими экспериментами показана возможность образования на ней

комплементарных пиримидиновых олигонуклеотидов, поли U из стандартных нукпеозидмонофосфатов [Otroshchenko et ai„ 1992; Отрощенко и др.. 1985; Отрощенко и др.. 1989; Otroshchenko et al., 1992; Otroshchenko, 1993; Otroshchenko, 1994; Otroshchenko and Kritsky, 1995] (Рис.12 А, Б). В наших экспериментах на адсорбированную на поверхности глинистых частиц матрицу поли А дополнительно адсорбировали молекулы [,4С] UMP. После икубирования при 5°С в течение 5 суток адсорбированный на минеральной поверхности продукт нагревали, а затем десорбировали и анализировали с помощью хроматографии и счетчика радиоактивности. Существенно, что эта реакция происходит всего лишь при сравнительно слабом нагревании сухого "заряженного" минерала (4 часа при 80°С), то есть реально возможной на земной поверхности температуре в условиях высокой солнечной радиации при отсутствии ферментов или специально активированных нуклеотидов. С помощью хроматографических методов установлено, что длина вновь образованных молекул может достигать 4-5 нуклеотидов (Рис.13). Кроме того, удалось продемонстрировать, что несмотря на отсутствие каких-либо ферментов, этот матричный синтез происходит со специфичностью порядка 70% (Рис. 14). Таким образом, можно предположить, что минеральная поверхность облегчает конденсацию пиримидиновых нуклеотидов с образованием олигомерных молекул, по-видимому, благодаря эффективной фиксации

полинуклеотиднон матрицы, играя в этом случае роль своего рода компартмента. Тем самым обеспечивается образование матричного механизма специфичесеого синтеза в абиогенных условиях.

5. Возникновение адапторНых молекул: роль химически деградированных нуклеотидных последовательностей в узнавании аминокислот.

Очень важная роль в образовании и эволюции генетического аппарата принадлежит возникновению адапторного механизма, с помощью которого кодирующие триплеты генетической

Рнс. 12 А.. Матричный синтез пиримидинов. Разделение на хроматографической колонке с гидроксилапатитом в фадиенте фосфатного буфера комплекса поли-А - 114С1 поли-и: а - область элюцки поли-Ц б - область элюши комплекса поли-А - поли-У; 1 - до диссоциации комплекса, 2 - после диссоциации.

Рнс. 12 Б. Матричный синтез пиримидинов. Разделение на хроматографической колонке с гидроксилапатитом в градиенте фосфатного буфера продуктов гадролизата панкреатической рибонуклеазой продукта матричного синтеза: а - до гидролиза; б -после гидролиза.

Рис. 13. Матричный синтез гшримидинов. Разделение на хроматографической колонке с ионообменной смолой Ag 50чг х 4 гидролизата олигомера, полученного при матричном синтезе с использованием всех четырех типов нуклеозидфосфатов: 1 хроматографическое разделение стандартной смеси мономеров; 2 -хроматографическое разделение гидролизах! олигомера. з эксперименте.

Рис. 14. Анализ продукта матричного синтеза. Разделение на хроматографической колонке с ЭЕАЕ и&ллюлозой полимерных продуктов матричного синтеза: 1 - динуклеотид, 2 - тринуклеотид, 3 - тетрануклеотид, 5 - пентануклеотид.

матрицы могут узнавать соответствующие аминокислоты. Правильное решение вопроса о структуре и функциях первичных адапторных молекул имеет ключевое значение в решении проблемы возникновения первичного мехенизма трансляции. В современных организмах адапторную роль выполняют молекулы тРНК и аминоацил-тРНК синтетаз. Для того чтобы редуцировать современный генетический аппарат до уровня простейшего начального генетического механизма, неоднократно предпренимались попытки по конструированию наиболее простой модели, в которой такое узнавание достигалось бы прямой дискриминацией аминокислоты с помощью нуклеотидной последовательности. К настоящему времени получены данные, указывающие па то, что имеется определенная аффинность между аминокислотными радикалами и соответствующими антикодонными триплетами, однако, величина такого сродства оказывается очень незначительной.

Исходя из имеющихся данных [Hendry et al., 1981 a,b], полученных при сравнительных исследованиях "пространственной структуры моделей нуклеиновых кислот и аминокислот, можно предположить, что специфичность взаимодействия аминокислоты с соответствующим кодоном на первых этапах возникновения генетического кода, при отсутствии ферментов, была обусловлена не современной его структурой, а некоторым набором нуклеотидов, представляющим собой "недоразвитый" современный триплет. Согласно этим представлениям, отщепление второго основания из кодирующего триплета при сохранении нативного фосфатно-сахарнош скелета вызывает образование полости в пространственной структуре двуспиральной молекулы нуклеиновой кислоты (Рис. 15). Ее топологическое соответствие пространственной структуре боковой цепи аминокислоты, кодируемой этим триплетом, позволяет последней специфически встроиться в двуспиральную структуру адапторной молекулы. Тем самым обеспечивается специфическое узнавание кодон-антикодонной парой соответствующей аминокислоты без участия ферментов. В

наших экспериментах по изучению специфического стереохимического взаимодействия аминокислот с двуспиральным комплексом полинуклеотндов поли А-поли и, в котором предварительно было удалено около 2% пуриновых оснований, ["С] аминокислоты инкубировались с модифицированным таким образом комплексом полинуклеотидов (5 суток при 4°С). Продукты инкубации анализировали с помощью гель фильтрации. Было показано, что действительно существует заметная дискриминация соответствующей аминокислоты (Ь-лизина) кодон-антикодонной парой (в нашем случае, ААА-иии), в результате которой аминокислота специфично связывается с иолинуклеотидной двуспиральной структурой [Отрощенко и др., 1987; О^озЬсЬепко е1 а1., 1989; ОкозЬсЬепко, 1993; 01гоэ11с11епко, 1994; СПгоз11с11епко апс! КпЬку, 1995; ОкозЬсЬепко, 1996] (Рис.15). Кодон при этом, вероятно, теряет одно из своих оснований, а соответствующий ему цуклеотид антикодонного триплета выталкивается из линейной последовательности нуклеотвдов, вызывая, тем самым, искажение в регулярной

_ О О п

структуре двойной спирали. В этом случае должно происходить некоторое перемещение и раскручивание соседних оснований с образованием полости, стерически соответствующей боковой цепи кодируемой аминокислоты. Если полинуклеотидный комплекс поли А - поли и не был апуринизирован, специфического связывания Ь-лизина не наблюдалось. То же самое происходило при использовании ЕКлизина. Таким образом, на основании этого явления может происходить специфическое узнавание и захват соответствующей аминокислоты кодон-антикодонной парой без участия ферментов, что могло явиться основой для функционирования первичных адаптороных молекул'.

6. Исследование банка данных тРНК с целью выявления в их составе древнейших последовательностей.

Как уже отмечалось выше, достаточно хорошо известен тот факт, что сами клетки содержат свидетельства своего

6ШЗЩА1АМ53Л| А| Л{Л] ■ •'• ■ •1■•'••■' • •

1 1 '

. . ■ . . ■ ■ ■ ■ ! . . .1 . .

|ц|и|м!цТ1<|ч|ц1м||<|ц|и11П

ДОН!

и1 ц|Ч

таг

и з1 а

Рис. 15. Специфическое связывание аминокислот полинуклеотидным комплексов. Разделение на хроматографической колонке с помощью гель-фильтрации на сефадексе О-10 комплекса поли-А - поли-и с А) Ь лизинои, с Б) Ьглутаминовой кислотой, В) О-лизином, и Г) Ь корлейцином: 1 - контроль (связывание аминокислоты с комплексом до апуркнизации). 2 - (связывание аминокислоты с комплексом после апуринизации); а бимолекулярный комплекс, б - свободная аминокислота

эволюционного развития в прошлом в составе аминокислотных последовательностей протеинов и нуклеотидных

последовательностей ДНК и РНК. С точки зрения изучения эволюционного развития механизмов хранения и передачи генетической информации чрезвычайно важно было бы выделить в составе современных нуклеотидных последоватекльностей наиболее древние, то есть такие, которые были исходной основой для последующей эволюции, и стало быть, входят в состав любых молекул данного типа. Ибо, как было отмечено К. Вузом [\Уое:;е, 1965]. сравнение большого набора гомологичных последовательностей позволяет реконструировать с определенной степенью точности различные варианты древних генов. С целью обнаружения таких консервативных последовательностей был проведен компьютерный анализ банка данных генов тРНК (981 молекула разных в эволюционном отношении организмов) [Евстигнеева и др., 1991; Ма1коуа е1 а!., 1992; Евстигнеева и др., 1994]. Как известно, вторая функция адапторной молекулы заключается в "узнавании" с помощью своего антикодона места на матрице. Видимо, без этой функции существование адапторной молекулы также невозможно, ибо "узнавание" - это ее первооснова. Поэтому для поиска таких молекулярных реликтов взяли последовательность, состоящую из 11 нуклекотидов, 5, 6 и 7 позиции которой занимал антикодонный триплет. Таким образом, при анализе банка, начиная с первых 11 нуклеотидов первой молекулы, сравнивались соединенные незначащим для сравнения антикодоннным триплетом четыре первых и четыре последних позиции. Компьютерное сравнение проводилось по методу Нидлмана - Ванча. В результате в различных частях молекулы были обнаружены три похожих мотива:

1. 3-12 в^Ш ^ССЦ

2.18-26 ООиШЫАССХ,

3.30-40 <ЗАУиШЫАА-С, или

29-41 СаУШШААСС,

4. 52-62 СаШЫ ЫААиС. или 52-63 ОСиШШАиСС,

где прочерк (-) означает позицию с неопределенным доминированием, X и У - доминирование пуринового (X) или пиримидинового (У) нуклеотида и N означает возможность присутствия любого нуклеотида. Нетрудно видеть, что все эти последовательности могут происходить от одного и того же Г древнего нуклеотида-предшественника:

осииМшЮАА/ос/ис или оошшшы)аа/осс. Существенно, что эти молекулы самокомплементарны по восьми позициям своих нуклеотидов.

Опираясь на эти данные, мы предположили, что примитивная адапторная молекула могла быть построена из структурно схожих олигонуклеотидов, таких например как ааиШШАА/СЮ/иС и СОиШШАА/ССС или из какой-либо молекулы-предшественника, представляющей собою не-противоречащую этим нуклеотидным последовательностям версию. Вероятно, эволюция прото-тРНК могла происходить путем конденсации таких блоков. В окончательном виде прото-тРНК могла представлять собой шпилечную структуру, составленную тремя подобными блоками, способную дискриминировать аминокислоты и одновременно "узнавать" свое место на полинуклеотидной матрице, стабилизация и функционирование которой обеспечивалось связью с минеральной поверхностью {ОкозЬсЬепко, 1993; 1994, 1996] (Рис.16).

"Узнавание" аминокислоты или некоторого семейства аминокислот с помощью такой рибонуклеиновой структуры могло происходить благодаря стереохимическому взаимодействию аминокислотного радикала с несколько измененной кодон-антикодонной парой, расположенной на стебле "шпильки". Повидимому, такая примитивная тРНК могла нековалентно связывать соответствующие молекулы

аминокислот. Специфическое связывание заряженной молекулы нрото-тРНК с соответствующим кодоном

полирибонуклеотидной матрицы могло обеспечиваться антикодонным триплетом, расположенным на ее малой петле. Разумеется, "узнавание" аминокислоты или соответствующего кодона на матрице при отсутствии высокоэффективных ферментов происходило с низкой эффективностью и с. ошибками. Однако эта лрото-тРНК вместе с РНК-матрицей могли выполнять очень важные функции: они явились специфическими центрами связывания и ориентации свободных аминокислот, которые, вступая в этом случае во взаимодействие друг с другом, образовывали первые регулярные пептиды (Рис. 16). Если при этом возникали пептиды, обладавшие каталитическими свойствами, обеспечивающими более эффективный синтез полинуклеотидов или самих пептидов, то тем самым в среде более или менее хаотически взаимодействующих молекул, своеобразном молекулярном кластере, связанном с поверхностью минерала, формировался гиперцикл, выделявшийся своей эффективностью из ему подобных, что способствовало стабилизации процессов самовоспроизведения, более эффективному сохранению накопленной информации и, следовательно, более длительному времени его существования.

Таким образом, селектировались молекулярные системы объединенные в гиперциклы, способные дать нача к, образованию первых протоклеток, которое могло происходить при переходе к новому типу компартмента. Один из таких возможных переходов нам удалось продемонстрировать экспериментально на примере включения полинуклеотидов и их комплексов в липосомы [Отрощенко, 198В]. Гак во^никпли образования, которые А.И. Опарин называл "фазовообособленными системами".

ГТГгП

А

I

Л

I

N О

I

и

1

и

. N

I

■ А

. с.

I

. о

I

• и

I

• и

I

л/

N

"Шпилька", состоящая из трех блоков. Каждый блок отмечен пунктиром, полость внутри кодон-актикодонкого триплета - кружком.

Рис. 16. Модель прото-гРНК - "шпилька", состоящая из трех одинаковых блоков и схема примитивного синтеза пептидов, осуществляемая такой прото-тРНК на полинуклеотидной матрице.

Заключение

Таким образом, экспериментальные данные свидетельствуют о важной роли минеральной поверхности в ходе формирования молекулярных систем, послуживших основой для возникновения аппарата хранеия и передачи генетической информации. Использование при моделировании гетерогенной системы вместо обычной для химических экспериментов гомогенной - позволяет снять одно из самых серьезных опасений - возможность гидролиза вновь образующихся органических молекул. Благодаря четырем своим функциям: энергетической, концентрируещей, каталитической и компартментализующей, - минеральная поверхность, участвующая как обязательный компонент системы, значительно расширяет возможности синтезов.

Например, электрохимические процессы, на поверхности минералов, обеспечивают возможность образования биологически важных органических соединений. Далее, адсорбируясь на поверхностях различных вулканических пород или минеральных продуктов их физико-химического выветривания, исходные, биологически важные, молекулы поп воздействием внешних энергетических факторов (УФ спета, тепла, гамма излучения горных пород и т. д.) или используй свои внутренние энергетические ресурсы (нестабильные макроэргичес.кие связи), могли вступать во взаимодействие и путем поликонденсации образовывать первичные олигопепгиды и олигонуклеотиды, не подвергаясь преждевременно гидролизу. Существуют данные о способности современных природных минералов, например входящих в состав донных отложений океана, связывать биологически важные молекулы. При этом сорбция таких молекул способствует сохранению от разрушающих факторов внешней среды и обеспечивает тем самым их функциональную активность (природная иммобилизация) [Корнеева и др., 1993].

В свою очередь, взаимодействие этих более сложных молекул на минеральной поверхности могло обусловить с большей легкостью, чем в гомогенной среде, формирование и

более сложных систем - примитивных систем хранения и передачи генетической информации (систем трансляции и репликации), способных даже при отсутствии ферментов, благодаря взаимодействию с минеральной поверхностью, к специфическому матричному синтезу и специфическому связыванию полинуклеотидных комплексов с определенными аминокислотами или группами аминокислот. Это обстоятельство позволяет предположить, что примитивные информационные молекулы могли быть во многом похожи на наши экспериментальные модели.

Как показал компьютерный анализ банка данных генов тРНК, действительно, существуют короткие

последовательности характерные для любой молекулы этого банка. Данный факт, указывает на то, что эти короткие последовательности могли явиться той исходной формой первичной молекулы тРНК, от которой произошли все последующие.

Полученные результаты позволяют предложить модель первичной бесферментной и безрибосомной системы трансляции, функционировавшей, благодаря существованию своеобразного примитивного компартмента в виде минеральной поверхности. Суть ее заключается в следующем. Несущая информацию полинуклеотидная матрица, адсорбированная на минеральной поверхности, взаимодействует непосредственно с адапторной молекулой (прото-тРНК), которая представляет собой "шпильку", образованную всего тремя блоками -идентичными самокомплементарными олигонуклеотидами. В центре каждого блока расположен кодон или антикодон. Две взаимокомплементарные молекулы, составляющие стебель шпильки, в центре ее образуют кодон - антикодонную пару триплетов, в то время как третий блок, замыкающий эту бимолекулярную структуру с одной стороны, образует в том месте, где находится антикодонный триплет, малую петлю. С помощью кодон - антикодонной пары адапторная молекула специфически связывает соответствующую аминокислоту, а с помощью антикодона малой петли находит свой кодон на

матрице. Если две - три "заряженные" аминокислотами адапторные молекулы на матрице расположатся рядом, то в случае временного обезвоживания всей системы и нагрева или при наличии подходящего конденсирующего агента (цианамид, полифосфаты) две аминокислоты, расположенные на соседних "шпильках" могут образовать пептидную связь. Возникший таким образом пептид мог стать катализатором, обеспечивающим более эффективную работу молекул в этой системе или в каком-либо ее звене. Если существовали определенные молекулярные кластеры, в которых происходило взаимодействие молекул как друг с другом, так и с минеральной поверхностью, куда входили подобные примитивные молекулярные системы, то понятно, что наиболее устойчивыми среди них были те, у которых механизм хранения и передачи информации был наиболее эффективным и надежным. Возникновение в связи с таким механизмом систем примитивного метаболизма и их обособление на основе какого-либо нового компартмента, имеющего органическую природу, могло служить основой для образования прообразов живой клетки.

Выводы

1. Показано, что электрохимические процессы могли играть важную роль в синтезе органического вещества на Земле, обеспечивая образование биологически важных молекул при участии железосульфидных минералов. Тем самым установлена связь между геологическими процессами формирования земной коры и первыми этапами возникновения в ней органики.

2. Показано, что под воздействием излучения на минеральной поверхности возможно образование, по крайней мере, олигонуклеотидов - молекул информационных биополимеров, являющихся основой систем хранения и передачи информации.

3. Используя аминоациладенилаты, удалось показать возможность одновременного синтеза олигопептидов и олигонуклеотидов, что создает основу для образования первых молекулярных механизмов, использующих полинуклеотиды и каталитические свойства пептидов.

4 Установлена возможность специфического бесферментного матричныого синтеза с образованием в результате комплементарных полинуклеотидных комплексов в условиях, когда матрица адсорбирована на минеральной поверхности, а субстратом являются лиримидиновые нуклеотиды.

5. Удалось обнаружить, существование селективного связывания кодируемой аминокислоты с кодон-антикодонной парой триплетов при удалении второго основания кодона. Тем самым устанавливается напосредственное сродство кодона с соответствующей аминокислотой без участия ферментов, то есть взаимодействие, при котором происходит передача информации на более высоком уровне, чем в случае простого комплементарного связывания нуклеотидов при матричном синтезе.

6. На основании этих результатов а также анализа банка данных генов тРНК показавшего существование "реликтовых" последовательностей в этих молекулах, предложена модель

бесферментного и безрибосомного синтеза пептидов, которая способна в принципе обеспечить формирование устойчивого гиперцикла на первых этапах формирования систем хранения и передачи генетической информации..

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО

МАТЕРИАЛАМ ДИССЕРТАЦИИ

1. Отрощенко В.А., Васильева Н.В.- Изучение адсорбции нуклеозидфосфатов на поверхности базальтового шлака. -ДАН СССР. - 1976. - Т.229, №3. - С. 749-750.

2. Otroshchenko V.A. and Vasilyeva N.V. - The Role of Mineral Surfaces in the Origin of Life - Origins of Life -1977 - Vol.8. - P 25-31.

3. Otroshchenko V.A., Vasilyeva N.V. - The Influence oi Inviroiimental Factors on the Prebiotic Evolution of the Organic Matter: Abstr. 4th ISSOL Meeting. - Mainz. FRG. -1983. - C2-10.

4. Отрощенко B.A., Васильева H.B., Шведова \ A , Лаврентьев Г.А., Стригункова ТФ. - Возможный пуп» образования и эволюции нуклеиновых кислот: Тг.чнсы сообщений на 16й конференции ФЕБО. - Москва. 1'Jivli . -С.24 1.

5 Отрощенко В А., Васильева Н.Г . Копылот» А.М -Образование олигонуклеотвдов на минеральной поверхности. - Известия АН СССР, серия биологическая. - 1985. - Т.4. - С. 622-625.

6. Otroshchenko V.A., Vasilyeva N.V., Kopilov A.M. - Abiotic Formation of Oligonucleotides on Basalt Surfaces. - Origins of Life - 1985. -Vol. 15. - P.l 15-120.

7. Отрощенко B.A., Васильева H.B., Шведова Т. A. -Возможность образования полинуклеотидов и их комплексов в предбиологических уелдовиях древней

Земли. - Тезисы докладов на V Всесоюзном биохимическом съезде.. - Т.1. - Киев. - 1985г. - С.238.

8. Otroscenko V.A., Lavrentjev G.A.. Strigunkova T.Ph. -Oligonucleotide Formation on the Mineral Surface Irradiated with Gamma Rays. - Studia Biophysica. - 1986. - V.113, №3. - P.241-245.

9 Strigunkova T.F., Lavrcntiev G.A., Otroshchenko V.A. -Abiogenic Synthesis of Oligonucleotides on Kaolinite Under the Action of Ultraviolrt Radiation.- J.Mol.Evol. - 1986. -V.23. - P.290-293.

10. Отрощенко B.A., Шведова T.A., Васильева H.B., Стригункова Т.Ф.- Структурное соответствие между кодоном и кодируемой аминокислотой- ДАН СССР. -1987. - Т.294. - №1 - С. 241-244

11. Отрощенко В. А., Деборин Г.А., Янопольская Н.Д., Васильева Н.В., Шведова Т.А. - Исследование включения нуклеотидов в липосомы. - Известия АН СССР серия биологическая. - 1988. - Т.5. - С. 772-776.

12. Отрощенко В.А., Васильева Н.В., Стригункова Т.Ф., Шведова Т.А. - Матричный синтез полинуклеотидов на минеральной поверхности. - Известия АН СССР серия биологическая. - 1989. - Т. 4. - С. 616-619.

13. Otroshchenko V.A., Vasilyeva N.V., Shvedova Т.А., Strigunkova T.F. - Stereochemical Properties of Polynucleotides and Origin of Primitive Systems of the Information Storage and Transfer. - Origins of Life. - 1989. -V.3-5. - P.338.

14. Егофарова P.X., Васильева H.B., Моисеева Jl.H., Отрощенко В.А., Павловская Т.Е. - Одновременный синтез пептидов и олигонуклеотидов на каолините с участием аминоациладенилатов. - Известия АН СССР, серия биологическая. - 1990. - Т.1. - С.136-140.

15 Евстигнеева Р.П., Малкова О.В.. Катенев О.В., Отрощенко В.А. - Особенности структуры транспортных РНК с точки зрения возникновения генетического кода.-ДАН СССР. - 1991. - Т.320. - №6. - С. 1501-1504.

16. Malkova O.V., Evstignceva R.P., Katenev A.V., Otroshchenko V.A. - Some Properties of the tRNA Structure in Term of the Origin of the Genetic Code. - Third "Recontres de BJois" - "Frontiers of Life" (eds. J. and K.Tran Thanh Van, J.C.Mounolou, J.Schneider, CJVLcKay) - Editions Frontieres. - France. - 1992. - P. 451-452.

17. Otroshchenko V., Vasilyeva N.. Strigunkova T. - Non-enzymatic Synyhesis of Oligonucleotides on a Polynucleotide Template Adsorbed on a Mineral Surface. - Third "Recontres de Blois" - "Frontiers of Life" (eds. J. and K.Tran Thanh Van, J.C.Mounolou, J.Schneider, C.McKay) - Editions Frontieres. - France. - 1992. - P. 465-466.

18. Otroshchenko V.A., Moiseeva L.N., Vasileva N.V., Strigunkova T.F., Egofarova R.Kh. - Polycondensation Reactions of Certain Biologically Essential Molecules on Mineral Surfaces. - J.Brit. Interpl. Soc. - 1992. - V.45. -P. 15-21.

19. Otroshchenko V,A. - Development of Primitive Systems of Matrix Synthesis and Translation. - Nanobiology. - 1993. -V.2. - P.245-249.

!0. Корнеева Г.А., Отрощенко B.A., Шведова T.A., Романкевич Е.А. - К вопросу о локализации и функционировании внеклеточных ферментов. - ДАН СССР. - 1993. - Т.332, - №5. - 646-649.

!1. Евстигнеева Р.П., Отрощенко В.А., Малкова О.В. -Особенности структуры транспортных РНК с точки зрения возникновения генетического кода. - ДАН СССР. - 1994. -Т.334. - №6. - С. 782-784.

2. Otroshchenko V,- Evolutionary Roots of Genetic Code. -J.Biol.Physics. - 1994.- V.20. - P.295-300.

3. Otroshchenko V.A., Kritsky M.S. - Search of Evolutionary Roots of Informational Coding Systems. - "Evolutionary Biochemistry and Related Areas of Physicochemical Biology". - (eds. Poglazov B.F., Kurganov B.L, Kritsky M.S. and Gladilin K.L.). - Bach Institute of Biochemistry and ANKO. -Moscow. - 1995. - P. 251-259.

24. Владимиров М.Г., Крицкий М.С., Отрощенко В.А.-Геоэлектрохимические процессы как источник органических молекул в предбиологической эволюции.-Успехи биол. химии. - 1996. - Т.36. - С. 187-212.

25. Kritsky M. S., Vladimirov M.G., Otroshchenko V.A., Bogdanovskaya V.A.-Mineral Metal SulpJbur Clusters as a Testbed for Studies of Evolutionary Continuity. "Chemical Evolution: Physics of the Origin and Evolution of Life", (eds. J.Chela-Flores and F.Raulin) Kluver Academic Publish. - The Netherlands. -1996 - P. 151-156.

26. OtroshchenkoV.A. - The Approaches to a Search of Evolutionary Roots of the Informational Coding Systems: -Abstr. 8th ISSOL Meeting. - Orleans, France. - 1996. - P. 99.