Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эволюционные аспекты строения гликофоринов позвоночных

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Эволюционные аспекты строения гликофоринов позвоночных"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ВІДДІЛЕННЯ РЕГУЛЯТОРНИХ СИСТЕМ КЛІТИНИ ІНСТИТУТУ БІОХІМІЇ ім. О.В. ПАЛЛАДША

РГб 0.1 2 7 ОКТ 1998

СТАСИК ТАРАС ВОЛОДИМИРОВИЧ

УДК: 591.111.1:612.111:547.963.1

ЕВОЛЮЦІЙНІ АСПЕКТИ БУДОВИ ГЛПСОФОРИНІВ ХРЕБЕТНИХ

03.00.04 - біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Львів-1998

Дисертацією с рукопис

Робота виконана у Відділенні регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

Науковий керівник:

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук, професор Головацький Іван Дмитрович,

Наукове товариство ім. Т. Шевченка, голова біохімічної комісії

кандидат біологічних наук, доцент Стадник Андрій Максимович,

Львівська академія ветеринарної медицини ім. С. Гжицького, завідувач кафедри внутрішних хвороб

Провідна установа:

Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К. Заболотного НАН України, відділ біохімії мікроорганізмів, м. Київ

Захист відбудеться "5 "Лис70/7еіда 1998 року о •/У' годині на засіданні спеціалізованої вченої ради К 35.238.01 у Відділенні регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України (290005, м. Львів, вул. Драгоманова, 14/16).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В.Палладіна НАН України

Автореферат розісланий " У " ?+Є(р$7-/-/£ 1998 р,

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,

доктор біологічних наук, ст. науковий співробітник Луцик Максим Дмитрович,

Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, провідний науковий співробітник

кандидат біологічних наук

Федорович Д. В.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. В останні роки незаперечно доведено, що вуглеводні ермінанти глікопротеїнів клітинних мембран виконують сигнальну функцію, беручи сть у процесах міжклітинної взаємодії, зокрема у впізнаванні, міграції і адгезії клітин, а ож у регуляції їх диференціації (Varki, 1993; Crocker and Feizi, 1996; Gabius, 1997).

Характерними представниками мембранних глікопротеїнів є глікофорини - гетеро-на група сіалоглікопротеїнів еритроцитарної мембрани, які відіграють важливу роль у змуванні вуглеводної структури поверхні еритроцита. Вони містять основну кількість неводів і сіалових кислот плазматичної мембрани еритроцита і, таким чином, вносять ібільший вклад у надання гідрофільних властивостей і негативного заряду поверхні ини. У глікофоринах знаходяться детермінанти груп крові MN, Ss, Ge, рецептори для терій, вірусів (вірус грипу, реовірус), паразитів (малярійний плазмодій) (Lisowska, 1988; imberg and Hermonen, 1988; Cartron and Rahuel, 1992, Sim et al„ 1994). Зміни в будові певодного компоненту глікофоринів служать сигналом для розпізнавання старіючих і пошкоджених еритроцитів і видалення їх з кров'яного русла (Aminoff, 1988; Beppu, І5). Взаємодіючи з білками цитоскелету, глікофорини впливають на стабільність і санічні властивості еритроцита (Lu et al., 1992, Anstee et al., 1995, Workman, 1998).

Глікофорини людини досліджені досить грунтовно. Встановлено їх амінокислотну ілідовність і структуру вуглеводних ланцюгів, досліджено антигенні властивості юфоринів і організацію їх генів (Thomas and Winzler, 1969; Tomita et al., 1978; Yoshima il., 1980; Irimura et al., 1981; Siebert and Fukuda, 1986; Kudo and Fukuda, 1989,1990; Le-l-Kim et al., 1996). Вивчені глікофоринові гени у вищих приматів (Rearden, 1986; arden et al., 1993; Huang et al., 1995; Xie et al., 1997). Для декількох видів ссавців також іністю або частково встановлена первинна структура глікофоринів (Krotkiewski, 1988; tsuiet al., 1989; Herraez et al., 1992).

Глікофорини ссавців є специфічними для еритроцитів трансмембранними юглікопротеїнами з молекулярною масою 20-30 кДа без чітких консервативних :лідовностей у поліпептидному ланцюзі. Характерною рисою глікофоринів є високий ст вуглеводів, які становлять біля половини маси молекули і представлені чисельними пованими олігосахаридними ланцюгами, зв'язаними з поліпептидним ланцюгом О-юзидним зв'язком.

На відміну від глікофоринів ссавців сіалоглікопротеїни ядровмісних еритроцитів кчих класів хребетних не досліджені. Досі не було встановлено, якого типу полі-О-созильовані сіалоглікопротеїни присутні у складі їх плазматичних мембран. Тому уальним було дослідити еритроцити нижчих класів хребетних і встановити наявність відсутність глікофоринів у їх складі. Попри глибокі структурні дослідження глікофоринів гозначної фізіологічної функції для них не встановлено. Тому еволюційний підхід може -и нові дані для вияснення ролі глікофоринів в еритроцитах. Дослідженню сіало-солротєїнів еритроцитів представників різних класів хребетних і порівнянню їх істивостей з глікофоринами людини та інших ссавців присвячена дана робота.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна роб виконана у лабораторії біохімії глікопротеїнів та у відділі регуляції проліферації клі Відділення регуляторних систем клітини Інституту біохімії ім. О.В.Папладіна Н України згідно з планом науково-дослідної роботи за темами: “Застосування пектинів і фракціонування глікопротеїнів і аналізу структури їх вуглеводних ланцюгів” (№ деі реєстрації 0190.0062553) та “Еволюційні аспекти будови глікофоринів хребетних” держреєстрації 5.3/435 ДФФД).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи: дослідити сіалоглікопроте плазматичної мембрани еритроцитів представників нижчих класів хребетних у порівня з глікофоринами людини та інших ссавців. Для досягнення цієї мети вирішували насту завдання:

1. Розробити метод одержання сіалоглікопротеїнів еритроцитів нижчих клг хребетних.

2. Дослідити фізико-хімічні властивості еритроцитарних сіалоглікопротеїнів пта: земноводних і риб і порівняти їх з глікофоринами ссавців.

3. Охарактеризувати вуглеводний компонент сіалоглікопротеїнів за допомог леїстинів як зондів, специфічних до певних вуглеводних структур.

4. Дослідити імунологічну спорідненість між глікофоринами людини і їх аналогам еритроцитах нижчих класів хребетних.

Наукова новизна одержаних результатів.

1. Вперше отримано препарати сіалоглікопротеїнів (СГП) плазматичних мемб| еритроцитів нижчих класів хребетних - птахів (курка), амфібій (жаба), риб (короп) проведено дослідження їх у порівнянні з глікофоринами людини та інших ссавців, даними електрофорезу в ПААГ у присутності DS-Na основні СГП еритроцитів ку| мають молекулярну масу 28, 55, 130 і 155 кДа, еритроцитів жаб і коропа - 130-160 кДа.

2. Вперше виявлено аналога глікофоринів у складі ядровмісних еритроци зокрема в еритроцитах птахів. За своїми властивостями СГП еритроцитів курей з м масою 28 і 55 кДа відповідають глікофоринам людини та інших ссавців. Показано, глікопротеїни з мол. масою 28 і 55 кДа є мономерною і димерною формою од молекули. СГП еритроцитів нижчих класів хребетних з мол. масою 130-160 кДа деякими властивостями подібні до лейкосіаліну людини.

3. Встановлено, що, подібно до глікофорину ссавців, О-зв'язані олігосахари ланцюги глікофорину курей представлені сіалованими дисахаридами Galß1-3GalNAc також більш складними розгалуженими ланцюгами із залишками дисахариду N-ацет лактозаміну. Характерною рисою глікофорину курей є більша кількість N-гпіканів і мен

О-гліканів у складі вуглеводного компоненту, причому N-глікани мають склади розгалужену будову.

4. Показано, що СГП плазматичних мембран еритроцитів нижчих класів хребеті не виявляють імунологічної спорідненості з глікофорином А людини. СГП еритроці жаби і коропа імунологічно неспоріднені з глікофорином еритроцитів курей.

з

Практичне значення одержаних результатів. Модифіковано метод одержання ¡матичних мембран (строми) з еритроцитів людини та інших ссавців. Препарати роцитарної строми визначених груп крові людини можуть бути використані для ірбції фупоспецифічних антисироваток з метою досягнення їх високої специфічності. Розроблено методику одержання глікопротеїнів плазматичних мембран клітин у іаративних кількостях.

Особистий внесок здобувана. Робота виконана дисертантом самостійно за 1ТК0М аналізу будови олігосахаридів глікофорину курей методом метилювання, який проведений здобувачем спільно з доктором H.Krotkiewski (відділ імунохімії Інституту ології і експериментальної терапії (Вроцлав, Польща)).

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації були представлені на 4-ій чародній науковій студентській конференції (ISSC) (Ґданськ, Польща, 1996); на 7-му і Українського біохімічного товариства (Київ, 1997); на 17-ій Міжнародній конференції ектинах (INTERLEC17) (Вюрцбург1, Німеччина, 1997).

Публікації. Матеріали дисертації висвітлені у 6 наукових публікаціях, з них 3 статті. Структура і об'єм дисертації. Дисертація складається зі вступу, трьох розділів, новків, списку використаних джерел. Робота викладена на 122 сторінках, ілюстрована іблицями і 16 рисунками (окремі рисунки займають 2 сторінки). Список використаних рел містить 183 найменування.

ЗМІСТ РОБОТИ

Огляд літератури. Наводяться дані про структуру глікофоринів людини та інших зців, зокрема про структуру їх вуглеводного компонента. Висвітлена роль глікофоринів /нкціонуванні еритроцитарної мембрани.

Методика досліджень. У роботі використовували еритроцити людини, великої атої худоби, щура, курей Gallus domesticus породи білий легорн, жаби Rana ridibunda, эпа Cyprinus carpió. Мембрани еритроцитів ссавців очищали за модифікованим нами одом з використанням поліетиленгліколю (ПЕГ) або за методом Dodge et al. (1963). гржання плазматичних мембран ядровмісних еритроцитів нижчих класів хребетних водили за модифікованою методикою Chan (1977).

Глікопротеїни плазматичних мембран виділяли за модифікованим нами методом naguchi (1972) шляхом обробки мембран сумішшю хлороформ-ізопропанол. Очистку офоринів людини і ВРХ проводили іонообмінною хроматографєю на ДЕАЕ-целюлозі.

Аналіз препаратів проводили методом електрофорезу в пластині ПААГ в буферній темі Laemmli (1970). Елекгрофореграми зафарбовували на глікопротеїни методом цна кислота - реактив Шиффа", як описано в роботі Луцика і Кусеня (1987), і на білки ассі діамантовим блакитним R-250. Препаративний електрофорез в ПААГ з DS-Na і ікгроелюювання фракцій проводили, як описано Луциком і співавт. (1990).

Репліки електрофореграм на нітроцелюлозі одержували методом електропереносу wbin et al., 1979). Глікопротеїнові фракції на електроблотах виявляли лектинами, еними пероксидазою хрону або флуоресцеїнізотіоціанатом (ФІТЦ).

Вміст гексоз у препаратах визначали антроновим методом (Kleinzeller 19! сіалових кислот - резорциновим методом (Jourdian et аі.,1971), концентрацію білка -Lowry etal. (1951) або методом ВСА (Smith etal., 1985).

Моносахариди визначали за допомогою газо-рідинної хроматографії/^ спектрометрії (ГРХ/МС) (Sawardeker et al„ 1965). Структуру олігосахаридів глікофор курей встановлювали методом метилювання. Для цього олігосахаридні ланці відщеплювали р-елімінуванням (Likhosherstov et al„ 1990), продукти дефад фракціонували гельфільтрацією на сефадексі G-15. Вуглеводвмісні фракції були піді метилюванню (Gunnarsson, 1987), гідролізу, переведені у форму альдітацетаті проаналізовані методом ГРХ/МС.

Для проведення імунологічних досліджень імунізацією кролів було одержано п клональні антитіла до глікофорину А людини і до головних СГП еритроцитів куреі також антитіла до IgG кроля ("другі антитіла"). Взаємодію мембранних глікопроте еритроцитів різних видів хребетних визначали на нітроцелюлозних репліках елекі фореграм імуноблотингом або імуно-дот-аналізом. Зв'язування антитіл з глікофорин: курей досліджували також імуноферментним методом у полістирольних планшетах.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ.

Одержання і характеристика глікофоринів ссавців (людини. ВРХ. щураУ

За модифікованим нами методом очистку плазматичних мембран еритроц ссавців проводили із застосуванням ПЕГ. До суспензії гемолізованих еритроц додавали ПЕГ молекулярної маси (м.м.) 4000-5000 до кінцевої концентрації

Застосування ПЕГ на стадії відмивання мембран дозволяє проводити цей процес лиш З рази при використанні звичайної центрифуги. Нами розроблена методика регенер ПЕГ для багатократного його використання.

Глікопротеїни виділяли з плазматичних мембран модифікованим нами мето Hamaguchi (1972). Як один з компонентів екстрагуючої суміші хлороформ-спирт використали ізопропанол, змінили співвідношення компонентів і порядок їх додавання

При електрофорезі в ПААГ з DS-Na (рис.1) у препараті глікофорину люді

кДа

- 480

80-

¿УЗ •,

t:C -V-

■ ■■ ■

.. -22

Рис. 1

Епектрофореграми в пластині ПАА присутності ОЄ-Ма препаратів глікофор людини (а), ВРХ (б), щура (в). Фарбувг на вуглеводи реактивом Шиффа.

а б в

щеному за допомогою хроматографії на ДЕАЕ-целюлозі, виявлено дві головні зони офорину А з м.м. 80 «Да (димерна форма) і 38 кДа (мономер). Особливістю офорину великої рогатої худоби є низька електрофоретична рухливість, яка ювідає м.м. 480 кДа. В препараті глікофорину щура виявлено кілька фракцій з м.м. 27, 22 і 19 кДа, з них основна з м.м. 22 кДа.

Аналіз вмісту гексоз і сіалових кислот у глікофоринах ссавців (табл.1) свідчить, що актерною рисою глікофоринів є високий вміст вуглеводів, зокрема сіалових кислот.

Таблиця 1

Вміст білка, гексоз і сіалових кислот у препаратах глікофоринів ссавців _______і сіалоглікопротеїнів еритроцитів нижчих класів хребетних.______________

Глікофорин Білок, % Гексози Сіалові кислоти

% мкг/мг білка % мкг/мг білка

людини ВРХ щура курки жаби коропа 34,0+0,5 27,5±0,4 62,0±1,8 58,0±1,0 18,4±0,2 37,5+0,5 7,6±0,4 13,9±0,8 525+16 1360±66 123±8 240+20 180±22 146±11 14,9+0,2 19,0±0,5 7,2±0,3 16,2+0,1 440+5 691±40 223±15 279+24 73±12 50±8

За допомогою дот-аналізу взаємодії глікофоринів з ФІТЦ-лектинами виявлено певні ономірності, характерні для глікофоринів. Зокрема, глікофорини після десіалювання іре взаємодіють з лектином арахісу (PNA), особливо глікофорин людини (таб.2). PNA є цифічним до О-гліканів, проявляючи найбільшу спорідненість до дисахариду Gaipi-alNAc (антиген Томсена-Фріденрайха), який складає основу О-глікозидних ланцюгів юфоринів. Інтенсивне зв'язування глікофоринів з лектином арахісу свідчить про ;окий вміст О-гліканів у складі їх вуглеводних компонентів. Це вирізняє глікофорини між більшості інших мембранних глікопротеїнів, в яких переважають глікани N-типу ihmberg and Tolvanen,1996). Глікофорини не зв'язувалися з конканаваліном А (Соп А), іцифічним до залишків a-D-манози у складі N-гліканів. Глікофорин ВРХ краще ємодіяв з лектином рицини (RCA), ніж глікофорин людини. Це свідчить про те, що в О-;анах глікофорину ВРХ є більше залишків P-D-галактози, ніж у глікофорині людини, азування глікофоринів з WGA - лектином зародків пшениці, специфічним до сіалових лот, корелює з вмістом сіалових кислот у препаратах, визначеним хімічним методом.

Таблиця 2

Дот-аналіз взаємодії глікофоринів з міченими ФІТЦ пектинами (мінімальні кількості (мкг) препарату, що виявляються лектином).

Глікофорин PNA1 RCA WGA Соп А

людини 0,15 1,25 0,60 -(40)

ВРХ 0,50 0,25 0,50 -(40)

щура 1,0 2,0 1,0 -(40)

Примітка. 1 - після десіалювання глікопротеїнів м'яким кислотним гідролізом.

Виходячи з результатів лєктино-дот-аналізу, лектин PNA було використано як зі для виявлення глікопротеїнів, багатих на О-глікозидні ланцюги, аналогів глікофорині нижчих класах хребетних. Конканавалін А був взятий як свого роду "антизонд", оскіл він не взаємодіяв з глікофоринами.

Одержання сіалогліколротеїнів еритроцитів нижчих класів хребетних. Ана методом електрофорезу в ПААГ.

Нами розроблено спосіб очистки плазматичних мембран ядровмісних еритроци який передбачає розділення мембран і ядер гомогенізованих еритроцитів.

На епектрофореграмах сопюбілізованих плазматичних мембран еритроцитів кур жаб і коропа при зафарбуванні методом “йодна кислота-реактив Шиффа” чіт глікопротеїнових зон не виявлено. Глікопротеїни не виявлялись при значне перенавантаженні гелю зразками (до 400 мкг мембранного білка в лунці), що свідчить г невисокий вміст їх у мембрані. На відміну від високого ступеня подібності білков спектру плазматичних мембран еритроцитів ссавців і нижчих класів хребетних, кількії СГП в плазматичних мембранах ядровмісних еритроцитах є значно нижчою.

У препаратах очищених глікопротеїнів, одержаних обробкою плазматичних мембр хлороформ-ізопропанопом, виявлено ряд Шифф-позитивних фракцій (рис.2).

кДа ..

155- -160

130- |у:#і^іі'-ізо

55 -

а б в

В еритроцитах курей виявлено головні СГП з м.м. 28, 55 кДа, а так високомолекулярні компоненти з м.м. 130, 155 кДа. У препаратах глікопротеїнів з ериті цитів жаб і коропа головні Шифф-позитивні фракції були представлені дифузними зона з м.м. 130-160 кДа. СГП еритроцитів нижчих класів хребетних гірше зафарбовувалися електрофореграмах методом “йодна кислота-реактив Шиффа” у порівнянні глікофоринами ссавців, що свідчить про меншу кількість сіалової кислоти в їх складі.

Сіалоглікопротеїни О-типу плазматичних мембран ядровмісних еритроци' хребетних. Виявлення за допомогою лектиноблотингу.

Пектини арахісу і хлібного дерева (JFA, аналог PNA за специфічністю) виявляли нітроцелюлозних репліках електрофореграм мембранних глікопротеїнів еритроци

Рис. 2

Електрофореграми в пластині ПААГ присутності DS-Na водорозчинн

глікопротеїнів плазматичних мембр

еритроцитів курей (а), жаб (б), риб одержаних обробкою мембран суміши хлороформ-ізопропанол, зафарбування глікопротеїни реактивом Шиффа, у лy^ внесено 200 мкг речовини.

ей дві фракції з м.м. 28 і 55 кДа (рис.З.а). Соп А виявляв ряд фракцій і не зв'язувався з і ^А-позитивними фракціями.

У препараті глікопротеїнів еритроцитів жаб основна PNA- і JFA-позитивна речовина ходилась в області м.м. 130-160 кДа, причому, PNA інтенсивніше зв'язувався з акцією 150-160 кДа, а JFA - з фракцією 130-150 кДа. Соп А зв'язувався з фракціями <чої м.м. (рис.3,6).

У препараті глікопротеїнів еритроцитів коропа пектини PNA і JFA виявляли смуги з

і. 38, 75, 105, 130-160 кДа (рис.З.в). Глікопротеїн з масою 130-160 кДа зв'язував також і А, цим він відрізнявся від аналогічної фракції глікопротеїну курей і жаб. Взаємодія з і А свідчить про присутність N-глікозидних ланцюгів у його вуглеводному компоненті.

На всіх блотах PNA-позитивні зони відповідали Шифф-позитивним. Це свідчить про що глікопротеїни, які виявляються на електрофореграмах реактивом ІІІиффа, є СГП ■ипу. Очевидно, основна частина сіалової кислоти поверхні еритроцитів нижчих класів ібетних, як і в еритроцитах ссавців, входить до складу невеликої кількості СГП О-типу.

Для глікофоринів людини та інших ссавців характерною є аномальна рухливість при ;ктрофорезі в ПААГ у присутності DS-Na. Визначені за даними електрофорезу пекулярні маси глікофоринів є більшими від вирахованих на основі відомої нокислотної послідовності і вуглеводного складу. Відомо, що така властивість іактерна для глікопротеїнів з великою кількістю О-глікозидних ланцюгів і зумовлена їх ємними вуглеводними компонентами (Krotkiewski, 1988). Графік залежності їктрофоретичної рухливості глікофоринів людини від логарифму їх дійсних пекулярних мас представлений на рис. 4.

За відношенням до глікофоринових стандартів значення молекулярних мас СГП ззматичних мембран еритроцитів курей становлять - 23, 45, 78 і 85 кДа (відносно ііпептидних стандартів - 28, 55, 130 і 155 кДа, відповідно), а високомолекулярних СГП

а

б

в

160

. і

І 80

Лектиноблоти електрофоре-грам глікопротеїнів плазматичних мембран еритроцитів курей (а), жаб (б), і риб (в) з пектинами РМА (1), ^А (2), Соп А(3).

Рис.З

1 2 З

1 2 З

1 2 З

еритроцитів жаб і коропа - 80-90 кЦа. Оскільки глікофорини мігрують при електрофоре ПААГ з повільніше від неглікозильованих білків, молекулярна маса глікофорино

дібних СГП, визначена відносно глікофоринових стандартів може бути ближча до дійсн

Відносна електрофоретична рухливість

Рис. 4

Визначення молекулярної маси глікофори курей за їх відносною електрофоретичн рухливістю при електрофорезі з РБ-І Величини електрофоретичних рухпивос глікофоринів курей (світлі квадрати) позначені графіках залежності електрофоретич рухливості від логарифму молекулярної м; поліпептидних стандартів (темні квадрати глікофоринів еритроцитів людини (темні круї 2А - димер ЄРА, 60 кДа; АВ - гетеродимер ЄР ЄРВ, 47 «Да; 2В - димер ЄРВ, 34 кДа; У мономер ЄРА, ЗО кДа; В - мономер ЄРВ, 17 к/]

Одержання індивідуальних фракцій сіалоглікопротеїнів еритроцитів ку метом препаративного електрофорезу.

Відносно значна кількість СГП з м.м. 28 і 55 кДа в еритроцитарних мембранах ку дозволила одержати їх в чистому стані препаративним електрофорезом в ПАА присутності DS-Na. При ре-електрофорезі ізольованих індивідуальних фракцій б виявлено інтерконверсію смуг головних СГП з м.м. 28 і 55 кДа. А саме, в препа глікопротеїну 28 кДа була завжди присутня невелика кількість смуги 55 кДа внасл димеризації, і навпаки, у препараті 55 кДа утворювалася невелика кількість смуги 28 внаслідок дисоціації димерів (рис.5).

Властивість димеризуватися є характерною для глікофоринів, які утворюют розчинах за рахунок гідрофобних трансмембранних доменів димери, стійкі навіть денатуруючих умов електрофорезу у присутності DS-Na (див. рис.5,Б).

Властивість взаємопереходу димерної і мономерної форм була використана наступної очистки глікопротеїнів з м.м. 28 і 55 кДа шляхом повторного препаративі електрофорезу. Вирізанням з гелю новоутворених смуг мономеру і димеру вдаг позбутися домішки супутніх білків з близькою електрофоретичною рухливістю, які 6yj вихідних препаратах. Такий методичний підхід дозволив одержати препарати чиї індивідуальних фракцій СГП еритроцитів курей.

Паралельно з очисткою препаративним електрофорезом головних СГП еритрои курей з м.м. 28 кДа і 55 кДа було одержано невеликі кількості препаратів чистих міної: високомолекулярних СГП з м.м. 130 кДа і 155 кДа (150 мкг і 120 мкг, відповідно).

Електрофореграми в ПААГ у присутності DS-Na (А) сіалоглікопротеїнів еритроцитів рей, 200 мкг речовини на трек (1) та окремих фракцій, одержаних препаративним іектрофорезом (2-5), 20 мкг на трек, фарбування реагентом Шиффа і кумассі R-250. зктиноблоти з PNA, мономер (28 кДа) одержаний з димеру (55 кДа) (6) і навпаки (7) за )помогою повторного препаративного електрофорезу, 5 мкг білка на трек; і (Б) ікофорину А людини (1), фракції димеру (2) і мономеру (3), виділені препаративним іектрофорезом. Нанесено по ЗО мкг препаратів.

Порівняльна характеристика будови вуглеводних компонентів глікофорину 'РЄЙ і глікофорину А людини.

Дот-аналіз взаємодії глікопротеїну 28 кДа з лектинами показав, що, подібно до іікофорину А людини (GPA), цей глікопротеїн зв'язує PNA, WGA, PVA, RCA, LCA, LABA і і взаємодіє з Соп А (табл.З). Взаємодія з PNA після десіалювання глікопротеїнів м'яким іслотним гідролізом свідчить, що О-глікозидні ланцюги є сіапованими дисахаридами Gal

l-3GalNAc, типовими для глікофоринів. Взаємодія з НРА (пектин виноградного слимака) іідчить про присутність серед О-гліканів недобудованих ланцюгів GalNAc-, Відсутність і'язування глікофорину курей з Соп А свідчить, що, як і в глікофоринах людини, в складі )го вуглеводного компоненту відсутні N-глікани манозного типу. Взаємодія з PVA (лектин іасолі) свідчить про присутність у глікофорині курей N-глікозидних ланцюгів імплексного типу з бісектним N-ацетилглюкозаміном і (або) розгалужених багатоденних N-гліканів, які не взаємодіють з Соп А. На користь цього також свідчить зв'язу-іння з лектином сочевиці LCA, специфічним до манозних і N-ацетилглюкозамінових іпишків. Взаємодія з RCA свідчить про значну кількість залишків N-ацетиллактозаміну у тлеводній частині цього глікопротеїну, а зв'язування з LABA (лектин золотого дощу іичайного) про присутність термінальної L-фукози. Взаємодія з WGA є характерною для ікофоринів, в яких сіалові кислоти складають значну частину вуглеводного компонента.

Таблиця З

Взаємодія ФІТІ_ -лектинів з глікофоринами курей і людини1.

Пектини Глікофорин курей Глікофорин А людини

PNA 1 2.4

LCA 0,25 1.2

RCA 2 2.5

НРА 1 не взаємодіє

LABA 1 1.3

PVA 4 2.5

Соп А не взаємодіє не взаємодіє

WGA + +

Примітка: У таблиці подано кількості ФІТЦ-лектинів (мкг), що зв’язуються з 1 мкг білка в плямі (леїстино-дот-аналіз).

За своїми властивостями, зокрема переходом у водну фазу при обробці мембр хпороформ-ізопропанолом, молекулярною масою, характеристиками зв'язуваї-лектинів, властивістю димеризуватися в розчинах СГП еритроцитів курей з м.м. 28 і кДа відповідають глікофоринам ссавців.

За допомогою методу ГРХ/МС визначено моносахаридний склад індивідуальних С еритроцитів курей. Результати аналізів представлені на рис.6 і в табл.4. Вуглсводь склад фракцій з м.м. 28 кДа і 55 кДа є дуже близьким, що є підтвердженням того, що мономерна і димерна форми одного глікопротеїна. Певну відмінність моносахариди' складу цих фракцій можна пояснити мікрогетерогенністю будови вуглеводних компонек окремих молекул. Імовірно, у процесі димеризації певні популяції глікоформ ць глікопротеїну мають перевагу над іншими. Вуглеводний склад високомолекулярних С значно більше різниться між собою. У складі СГП фракції з м.м. 130 кДа практи1 відсутня фукоза, а більша кількість N-ацетилгапактозаміну, ніж в СГП з м.м. 155 і свідчить про більшу кількість О-глікозидних ланцюгів у його вуглеводному компоне Глікофорин курей містить у своєму складі ті ж моносахариди, що й GPA людини та і глікофорини, у складі яких є О- і N-глікани. Проте, на відміну від GPA глікофорин ку| містить більше GIcNAc, ніж GalNAc, відносно багато манози і значно менше сіалс кислоти. Велика кількість манози свідчить про те, що в глікофорині курей N-глікан відносно чисельнішими, ніж в GPA людини (співвідношення Man:GalNAc становить 1, глікофорині курей і 0,2 в GPA). Крім того співвідношення GIcNAc.GalNAc в глікофор курей є більшим, ніж в GPA (1,6 і 0,3, відповідно), що також може вказувати на білі кількість N-глікозидних ланцюгів у складі глікофорину курей. Кількісна перевага галакт над N-ацетилгалактозаміном свідчить про більш складну, ніж в GPA, будову О-гліка зокрема про присутність N-ацетиллактозамінових послідовностей. Вміст сіалової кисл у складі глікофорину курей свідчить про суттєво меншу кількість О-глікозидних ланцк ніж в GPA людини. Вуглеводний компонент глікофорину курей складає біля 33% м молекули, що є менше, ніж в GPA, у якому вуглеводи становлять понад 50%.

1600000

1600000

1400000

1200000

10ЭС000

SOQ000

600000

400000

шш

Xyt

Fuc

(.93

i7.41 7.998.38

Gal

Man

QcNflc jBIN»c

уУ

900000 ^ 800000 | 700000 j 600000 | ! soooooj

1 400000-1 !

Fu:

«.sJ

№n

Gd

■ і

л/

Q&Vc / GalWc

1І.57 ✓

11.19 lil.M/

• X >\ *

Xyl

1 ! >5 600000 і

Ll.iSy^

i \S

GaiNfic

асмчс Gal№\c

Рис.6.

Профілі елюції газо-рідинної хроматографії/мас-спектрометрії кислотних гідролізатів юглікопротеїнів еритроцитів курей, одержаних методом препаративного ктрофорезу: 28 кДа (А), 55 кДа (Б), 130 кДа (В), 155 кДа (Г); ХуІ - внесений стандарт.

Таблиця 4

Вуглеводний склад сіалоглікопротеїнів плазматичних мембран еритроцитів курей.

Фракція 28 кДа Фракція 55 кДа Глікофорин А людини Фракція 130 кДа Фракція 155 кДа

%1 моль%2 % моль% % моль% моль%3 моль%3

коза 1,3 5,8 1,6 6,4 0,5 1.4 сліди сліди

іноза 4,6 18,4 3,9 14,1 1,6 4,3 12,8 12,8

лактоза 6,0 23,8 7,2 26,1 9,3 24,7 34,6 34,6

зцетилглюкозамін 5,7 18,4 5,9 17,5 3,4 7,2 34,3 34,3

ацетил галактозамін 3,3 10,7 3,9 11,5 10,3 21,9 18,3 18,3

злова кислота 10,0 22,8 11,6 24,4 27,2 40,4

Білок 68,8 65,7 47,7

шмітки: 1. Сума вмісту в препаратах моносахаридів, визначеного методом

ГРХ/МС, сіалової кислоти, визначеної резорциновим методом і білка, визначеного методом ВСА була взята за 100%.

2. Кількість молів кожного вуглевода на 100 моль всіх вуглеводів.

3. Без врахування вмісту сіалової кислоти.

Gal

З метою встановлення структури олігосахаридів глікофорину курей було проведеї аналіз будови відщеплених О- і N-гліканів методом метилювання. Для цього СГП курі були піддані ß-елімінуванню, продукти деградації фракціонували гельфільтрацією і сефадексі G15 на дві вуглеводвмісні фракції (рис.7). Ці фракції метилювал гідролізували, перацетилювали і аналізували методом ГРХ/МС.

-Е206 ~ Е490

Рис.7

Профіль елюції продуктів елімінування сіалоглікопротеїн еритроцитів курей при гел фільтрації на сефадексі G-15. фракціях визначали нейтраль цукри (Е49о) і білок (Е2оє). 1 і 2 - £ вуглеводвмісні фракції, зібрані ді аналізу методом метилювання.

номер фракції

Продукти метилювання першої фракції (рис.8) містили в основному похі, компонентів типових для N-гліканів (Gal, Man і GlcNAc). Виявлені метильовані похі, вуглеводів свідчать, що N-глікани є переважно двоантенними ланцюгами (про це свідчі присутність 3,4,6-Ме-Мап, яка є головною похідною манози), частина з них місті бісектний залишок GlcNAc (3,4,6-Me-GlcN(Me)Ac, а також 2-Ме-Мап і 2,4-Ме-Мап). Сер N-гліканів присутні також три- або/і тетраантенні ланцюги (3,6-Ме-Мап і 3,4-Ме-Мс Більшість залишків GlcNAc заміщені при С4, більшість залишків Gal заміщені при СЗ і (3,6-Me-GlcN(Me)Ac, 2,4,6-Me-Gal, 2,3,4-Me-Gal).

2.3.4-f.te-Flcr

2.3.4.6-Mä-Gal

2.4.6-МеМЗеі

2.3.4-Мэ4й

3.4.6-Мэ-Мп 3,6-МэЛЬп 3,+М>Мп 2,4-Мз-№п

2-Nfe-Mïl

3,4,6-IVfe-GlcNAc

3.6-M>GcNAc

1,4,5,6-M&Gal№c -1,4,5,-M3-GeiN0c

СП Откаж

-f—

20

40

60

ВІДНОСНИЙ ВМІСТ

80

100

120

Рис. 8

Аналіз структури оліг сахаридів сіалоглікопротеїн еритроцитів курей методе метилювання. Метильовг похідні проаналізовані мет дом газо-рідинної хромат графІЇ/мас-спектрометрії.

Основні метильовані похідні другої фракції (2,3,4,6-Me-Gal, 2,4,6-Me-Gal, 2,3,4-Ме-зі, 3,6-Me-Me-GlcN(Me)Ac, 1,4,5,6-Me-GalN(Me)Ac і 1,4,5-Me-GalN(Me)Ac) свідчать про исутність О-гліканів, що містять С4-заміщений N-ацетилглюкозамін і термінальну лактозу. Виявлення метильованих похідних лише редукованого GalNAc і відсутність лих метильованих форм GalNAc свідчить, що N-ацетилгалактозамін є термінальним дукуючим залишком в О-гліканах, через який олігосахаридні ланцюги зв’язані з ліпептидним ланцюгом.

Характеристики взаємодії глікофорину курей з пектинами, кількісні показники вмісту ньому вуглеводів і результати метилювання відщеплених р-елімінуванням ігосахаридів дозволили вивести основні типи олігосахаридних ланцюгів глікофорину зей, які представлені на рис.9.

Sia Sia-Gal-GlcNAc

і І

О-глІкани Sia-GalNAc- Sia-Gal-Ga!NAc - Sia-Gal-GalNAc -

Sia-Gal-GlcNAc-Man Fuc

I !

GlcNAc-Man-GlcNAc-GlcNAc-

і

N-глікани Sia-Gal-GlcNAc-Man

Sia-Gal-GlcNAc-Man

і

GlcNAc-Man Fuc

I I I

Sia-Gal-GlcNAc-Man Man-GlcNAc-GlcNAc-

i

(Sia-Gal-GlcNAc)12 -Man

Рис.9

Типи структур олігосахаридних ланцюгів глікофорину курей.

Імунологічне дослідження глікофоринів хребетних.

Для проведення імунологічних досліджень імунізацією кролів були отримані тисироватки до глікофорину А людини і до СГП з м.м. 28 кДа і 55 кДа еритроцитів зей, очищених препаративним електрофорезом. Імунізацією курей були одержані тисироватки до IgG кроля, з яких афінною хроматографією на агарозі з ¡мобілізованим З кроля були виділені антитіла до IgG кроля; їх було помічено пероксидазою хрону для оведення імуноблотингу та імуно-дот-аналізу.

Імуно-дот-аналізом встановлено, що антитіла до глікофорину людини не аємодіють на дотах з СГП еритроцитів нижчих класів хребетних. Антитіла до СГП курей кож не взаємодіяли з глікофоринами людини. Це свідчить про відсутність спільних тигенних детермінант між цими глікопротеїнами. Антитіла до глікофорину курей не являли споріднених фракцій на імуноблотах СГП еритроцитів жаби і коропа.

Зв'язування антитіл з глікофоринами курей було також досліджене за допомогою жоферментного аналізу в планшетах з ¡мобілізованими глікофоринами (рис.10).

Виявлено, що зв'язування антитіл було практично однаковим як з ¡мобілізованим П з м.м. 28 кДа, так і з СГП з м.м. 55 кДа. Це підтверджує висновок про те, що ці екгрофоретичні фракції є мономером і димером однієї молекули. Відсутність язування антитіл з ¡мобілізованим глікофорином А еритроцитів людини свідчить про

специфічність одержаних антитіл до СГП еритроцитів курей.

Розведення антиснроватки

Рис. 10

Імуноферментний аналіз зв'язування антитіл до СГП еритроцитів курей з м.м. 28 к, (А) і 55 кДа (Б) з електрофоретично очищеними СГП з м.м. 28 «Да (1) і 55 кДа ( ¡мобілізованими на полістирольних планшетах. Глікофорин А людини як контроль.

Поліклональні антитіла до СГП з м.м. 28 і 55 кДа еритроцитів курей зв'язувалися імуноблотах з фракціями мономеру і димеру, а також взаємодіяли з СГП з м.м. 130 і 1 кДа, хоча дуже слабко (рис.11).

А - - ... Б . В

кДа

-i

ї-т

§

,v * ЛУ

-155

-130

, '¿¿а*

1 2 3 4 5 12345 12 345

Рис. 11

Імуноблоти ізольованих препаративним електрофорезом сіапоглікопроте' еритроцитів курей (28кДа (1), 55 кДа (2), 130 кДа (3), 155 кДа (4), нанесено по 3 мкг біл глікофоринів людини (5), нанесено ЗО мкг білка еритроцитарних мембран) з попік нальними антитілами до фракції 28 кДа (А) і до фракції 55 кДа (Б); лектиноблоти з РІ після десіалювання блотів в 0,05 н H2S04(B), позначено позиції глікофоринів А, В і С.

Дещо краще зв'язування антитіл до фракції димеру з зоною димеру, ніж з зоь мономеру на блоті свідчить про те, що під час димеризації цього глікопроте утворюються нові антигенні детермінанти, відсутні у мономерному стані молекули.

сть цього служать характеристики зв'язування антитіл з антигенами, одержані эферментним аналізом (див. рис. 10).

Взаємодія високомолекулярних СГП з антитілами до глікопротеїнів 28 і 55 кДа шть про певне імунологічне споріднення між ними. Крім того, під час електрофорезу зідуальних фракцій 130 і 150 кДа з'являються слабкі смуги з м.м. 28 і 55 кДа, які ляються антитілами. Цей факт може бути пояснений присутністю невеликої домішки протеїну 28 кДа в препаратах високомолекулярних фракцій внаслідок існування їх у иі гетеродимерів. Можливо, в антисироватках до СГП еритроцитів курей присутні тіла до вуглеводних детермінант. Виходячи з подібності вуглеводного складу СГП з 28 і 55 кДа з таким високомолекулярних глікопротеїнів (див. табл.4) можна іустити існуваня у них спільних антигенних детермінант у вуглеводних компонентах, гористь цього припущення може служити відомий факт, що структура О-зв'язаних юахаридних ланцюгів глікопротеїнів однієї клітини є побудована за одним планом, тений в ядровмісних еритроцитах хребетних високомолекулярний компонент за ими своїми властивостями (молекулярна маса, масивний вуглеводний компонент з ¡важанням О-гліканів, дві субфракції, які можуть відповідати різним глікоформам зкули) подібний до лейкосіапіну - головного СГП плазматичної мембрани лейкоцитів ини та інших ссавців.

ВИСНОВКИ.

Розроблено методи очистки сіалоглікопротеїнів (СГП) з мембран ядровмісних еритро-з і отримано препарати СГП з еритроцитів птахів (курка), амфібій (жаба), риб (короп), зедено порівняльне дослідження їх з глікофоринами ссавців (людини, ВРХ, щура). Встановлено, що головні СГП еритроцитів курей представлені молекулами з мол. эю 28, 55, 130 і 155 кДа, а еритроцитів жаби і коропа - 130-160 кДа (електрофорез в Г у присутності ОБ-№). Кількість СГП в еритроцитах птахів менша ніж в еритроцитах іців, а в еритроцитах земноводних і риб менша, ніж в еритроцитах птахів. Спільною )Ю глікофоринів ссавців і еритроцитарних СГП нижчих класів хребетних є пере-ання О-гліканів в складі вуглеводного компонента і високий вміст сіалових кислот. Цослідження властивостей чистих СГП еритроцитів курей свідчить про те, що СГП з эю 28 і 55 кДа подібні до глікофорину А людини та інших ссавців і можуть лядатися як аналоги глікофоринів ссавців. Доведено, що СГП з мол. масою 28 і 55 є мономерною і димерною формою однієї молекули.

Іля вуглеводного компонента глікофорину курей, порівняно з глікофорином А ссавців, іктерними є більша кількість М-гліканів і менший вміст гліканів О-типу. Останні уставлені сіалованими дисахаридами Саірі-ЗСа^Ас, а також більш складними алуженими ланцюгами із залишками дисахариду М-ацетилпактозаміну. Високомолекулярні СГП ядровмісних еритроцитів хребетних з мол. масою 130-160 за властивостями подібні до лейкосіаліну людини. СГП цього типу кількісно зважають у мембранах еритроцитів риб і земноводних.

Показано, що СГП плазматичних мембран еритроцитів нижчих класів хребетних ологічно неспоріднені з глікофорином А людини. СГП еритроцитів жаби і коропа ¡ологічно неспоріднені з глікофорином еритроцитів курей.

7. Одержані результати дозволяють припускати, що в процесі еволюції кількіс глікофорину в мембрані зростала, а зміни в будові вуглеводного компонента відбувалк в напрямі зменшення кількості N-гліканів, зростання кількості О-гліканів і підвищеп вмісту сіалових кислот у складі олігосахаридних ланцюгів цього глікопротеїна.

8. Модифіковано метод очистки плазматичних мембран (строми) еритроцитів людини інших ссавців, що передбачае використання поліетиленгліколю (ПЕГ) на ста відмивання мембран від гемоглобіну. Використання цієї модифікації дозвог інтенсифікувати процес і отримувати клітинні мембрани у препаративній кількостях f застосування ультрацентрифуги. Розроблено метод регенерації ПЕГ для й< багаторазового використання.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ.

1. Стасик Т.В., Луцик-Кордовський М.Д. Одержання і властивості глікофорі плазматичних мембран еритроцитів курей //Біополімери і клітина,- 1996.- 12,N 4,- С.94-

2. Стасык Т.В., Луцик-Кордовский М.Д. Сиалогликопротеины О-типа эритроцитарь мембран низших позвоночных: идентификация и исследование с применением лектиі //Ж. эволюц. биохим. физиол,- 1997,- 33, N 4-5.- С. 406 -411.

3. Stasyk T.V., Krotkiewski Н., Lutsik-Kordovsky M.D. A comparative study of carbohydi component of hen and human glycophorins //Biopolymers and Cell.-1998.-14,N 2.- P.152-1

4. Stasyk T.V. Studies on glycophorin-like sialoglycoproteins of red blood cells in diffei classes of vertebrates /Abstr.4th Int.Sci.Student Conf., May 23-25,1996, Gdansk, Poland, P

5. Стасик T.B. Виявлення і характеристика глікопротеїнів, споріднених з глікофорин; ссавців в ядровмісних еритроцитах хребетних II Тези доповідей 7-го з'їзду Укр. біо тов., 3-5 вересня 1997 p., Київ, Україна, С. 50.

6. Stasyk T V., Lutsik-Kordovsky M.D. Lectin binding characteristics of sialoglycoproteins f erythrocytes of different classes of vertebrates: a comparative study / Abstr. INTERLEC September24-27,1997, Wuerzburg, Germany// Eur. J. Cell Biol.-1997.-74, N 46(Supl.), P

Стасик T.B. Еволюційні аспекти будови глікофоринів хребетних.- Рукопис. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук спеціальністю 03.00.04 - біохімія.- Відділення регуляторних систем клітини Інсти біохімії ім. О.В. Палладіна НАН України, Львів, 1998.

Проведено дослідження сіалоглікопротеїнів плазматичних мембран еритрои різних класів хребетних - птахів (курка), амфібій (жаба), риб (короп) - у порівняй глікофоринами ссавців (людини, великої рогатої худоби, щура). Вперше вияв/ аналоги глікофоринів у складі ядровмісних еритроцитів, зокрема в еритроцитах пт: Глікофорини еритроцитів курей одержано в чистому стані і досліджено будов вуглеводного компонента, а також деякі імунохімічні властивості. Одержані резуль дозволяють припускати, що в процесі еволюції кількість глікофорину в еритроцита мембрані зростала, а зміни в будові вуглеводного компонента цього глікопрої відбувалися в напрямі зменшення кількості N-гліканів, зростання кількості О-гліка підвищення вмісту сіалових кислот в складі олігосахаридних ланцюгів. В еритроц нижчих класів хребетних виявлено також сіалоглікопротеїни, які за своїми властивос

і до лейкосіаліну людини, при чому вони кількісно переважають у плазматичних анах еритроцитів земноводних і риб.

пючові слова: глікофорини, сіалоглікопротеїни, плазматичні мембрани, еритроцити, гні.

асыкТ.В. Эволюционные аспекти строения гликофоринов позвоночных.- Рукопись, ссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по зльности 03.00.04 - биохимия,- Отделение регуляторных систем клетки Института йии им. А.В. Палладина НАН Украины, Львов, 1998.

сведено исследование сиалогликопротеинов плазматических мембран щитов разных классов позвоночных - птиц (курица), амфибий (лягушка), рыб (карп) іавнении с гликофоринами млекопитающих (человека, крупного рогатого скота, ). Впервые выявлены аналоги гликофоринов в составе ядросодержащих щитов, в частности в эритроцитах птиц. Гликофорины эритроцитов кур получены в л состоянии, исследовано строение их углеводного компонента, а также некоторые охимические свойства. Полученные результаты позволяют предполагать, что в ссе эволюции количество гликофорина в эритроцитарной мембране возрастало, а ения в строении углеводного компонента этого гликопротеина происходили в влении уменшения количества N-гликанов, роста количества О-гликанов и нения содержания сиаловых кислот в составе олигосахаридных цепей. В эцитах низших классов позвоночных найдены также сиалогликопротеины, которые оим свойствам похожи на лейкосиалин человека, при этом они количественно ладают в плазматических мембранах эритроцитов земноводных и рыб. кочевые слова: гликофорины, сиалогликопротеины, плазматические мембраны, оциты, позвоночные.

asyk T.V. An evolutionary aspects of giycophorins structure in vertebrates.- Manuscript, lesis for a Candidate’s of Biological Sciences degree by speciality 03.00.04 -;mistry. Division of Regulatory Cell Systems of the A.V.Palladin Institute of Biochemistry National Academy of Science of Ukraine, Lviv, 1998.

study of sialoglycoproteins of erythrocyte plasma membranes from animals belonging to int classes of vertebrates - birds (hen), amphibian (frog), fishes (carp) - in comparison nammalian giycophorins (human, bovine, rat) has been conducted. For the first time ihorin analogues in nucleated erythrocytes were revealed. Hen erythrocyte giycophorins obtained in pure state and the structure of their carbohydrate component and some nochemical properties were investigated. The obtained results permit to suggest that in mrse of evolution the number of glycophorin in erythrocyte membrane has been growing іе changes in the carbohydrate component of this glycoprotein was directed to decrease llycans and increase of O-glycans and number of sialic acid in oligosaccharide chains, llycoproteins similar for their properties to human leukosialin in erythrocytes of lower •s vertebrates were found, moreover they quantitatively predominate in plasma iranes of amphibian and fish erythrocytes.

/ words: giycophorins, sialoglycoproteins, plasma membranes, erythrocytes, vertebrates.