Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Энзиматическое трансгликозирование продуктов стевиозида IS Stevia Rebaudiana Bertoni

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Энзиматическое трансгликозирование продуктов стевиозида IS Stevia Rebaudiana Bertoni"

^3 ШДВИЯ НАУК УКРАЇНИ ІВЗТИТУТ ВІОХІШІ 1Ы. 0. & ПАЛАЛ1НЛ

------ иа правах рукопису

ЛОБОВ Сергій Вікторович

ЕНЗИМАТИЧНЕ ТРАНСГЛІКОЗИЛШАННЯ ПРОШТ1В СЇШ0ВИ2У ІЗ ЭТША РЕВАДОІАНА ВЕЙТОНІ.

03.00.04 -біохімія

АВТОРЕФЕРАТ дисертаціі на здобуття вченого ступеню кандидата біологічних наук

Наукові керівники : кандидат біологічних наук

Борис юк ЕО. проф. а Танака

Офіційні опоненти : доктор біологічних наук

головний науковий співробітник . Суды на О.Г.

Вэдуча організація ; Інститут мікробіології АН України

Спеціалізованої ради Д 016.07.01 в Інституті бюхшп

їм. аЕПаладіна АН України (252030, г. Київ, вул. Лвонтовича.9)

З дисертацією дожна ознайомитись в бібліотеці Інституту

доктор біологічних наук професор Капля А.&

Захист відбудеться $^ травня 1993 року о Щ годині-на ваоїданні

Автфреферат ровісланий <№: КВІТНЯ 1993 р.

Вчений секретар £пеш&яі8ованоі

Актуальність проблеми. '■*

В останні роки в усьому овіті виникла проблема отримання цукру та інших цукристих сполук в достатній кількості,що задовольняють потреби населення та харчової промисловості. З іншого боку проблема захворювання людей цукровим діабетом та надмірною ваго» вимагає вуката дшрела нових низькокалорійних підсолоджуючих речовин. Підсолоджуючі речовини, до становлять інтерео з практичної точки зору, мокно розділити на природні та синтетичні

До природних речовин відносяться юно- та олігосахариди,продукти гідроліау крохмалю, а також цукрові спирти та підсолоджуючі речо-вшш.що не відносяться до сахаридів. До другої групи можна віднести солодкі сполука отримані хімічним шляхом .такі як еахаріга, дульцин, цикламат, сорбіт, кспліт, аопартам та mai. Bot ці речовини акоокр згзтооовуюріся п харчовій промисловості для виробництва консорвіа, кондитерських/виробів, напоїв, морозива, а такод в і;з-дішиїп та косцзтичній промисловості.

Після визначення структури деяішх природи 12 підсолоджуючих речовин, вдалось розробїгги мзтоди отримання даних речовин синтетичний шляхом, виклячавчи виділення їв природної сировини. Одним 18 дт-рал шгаькокалор і йних іцукро8амі нник і в являється рослина Stevia robaudlena Bertoni родіши Astcraoaæ , батьківщиною якої являється Парагвай. Рослппї стеВіі містять в собі низькоішлорійні дитерпе-нові глікозиди 8 високім ступенем солодості, але мають гіркуватий присмак. •

дуальність проблем полягає такоа в тому,що на Україні стовія інтродукуеться Інститутом цукрових буряків УЛАН з 1985 р. Застосування штоду ■ культури тканин дало иояянвють швидко розмножити придбані одиночні екземпляри рослини до промислових масштабів плантації. Розпочата селекційна робота, розробляється технологія і і промислової переробки, проведені токсикологічні дослідження та е дозвіл ІЙ>3 для використання продуктів на основі стевн в харчовій промисловості. , • . .. . ,

Мета та завдання досліджень.

Штою даної роботи було проведення реакціі трансглікозилювання за допомогою різноманітних ферментативних систем, основного дитер-пековбго глікозиду СТЄВІ08ИДУ. для отримання нових продуктів транс. глікозклшан'ня,'ідо маоть'крааіі смакові властивості та l-б гліко-

видний ав'явок.

Для дооягнекня кети роботи послідовно вирішувались декілька завдань: - ' ' ' . . • ’ 'V" . ■ ■■

1. Виділення та розділення дитерпенових глікозидів стевіозида, ре-баудіовидів А, О, Д. та Е. а також дулькозида А їв рослини Stevie rebaudiana Bertonl. ■ . : •

г. Визначення умов траноглі козилювання ва допомогою різноманітних ферментативних систем. . - , ,

а Виділення та накопичення продуктів траногліковилювання ва допомогою високоефективної рідинної хроматографії. " ■

4. Визначення структури продуктів траногліковилювання стевіозиду,

Б. Тестування смакових якостей еинтевованих продуктів траноглікови-лювання. ■

Наукова новизна та практична цінніоть робот

В ревультап виконаної роботи був досліджений цілийряд ферментативних оиотем мікробіологічного» походження. Заїх ^опомогоюсив-тевовані нові сполуки, щр маютьрівві Сіамові властивості.Деякі їв отриманих продуктів мають вьюокийступінь солодості та тарні смакові якості . Виділення та накопичення продуктів трано-глікоаилшання надало можливість вивчити будову та визначити структуру синтезованих речовин. Шерве були отриманГпродукги траногл і козилювання отевіовиду.цр мають в своєму скдадії-б гліко-видні зв’явки. Отримані даві доввоаші вивчити валмйість ступеню солодості та смакових якостей від структурного ровмідання юдеі^л глхкови та кількості траногл і коеильованихмолекул. Ьгриманнящю-дуктів траногліковилювання при ековошчнЬМгідішх умовахдовво-лить використовувати дані речовини в харчовій промисловості для вживання хворими, в» страждають цукровим діабетом.а також дозволить аначно скоротити вживання цукру.якооаовної оолодкоіречювини.

Структура та обсяг роботи^

Дисертація викладена ва 101 складається їв вступу, огляду літератури, віюверюкінтальвоі частини та обговорення результатів, ваключення та висновків.' Робота ілюстрована 35 малюнками та 2 таблицями. <^ск ц^тРваші; літера-

Апробація роботи.

Матеріали дисертації представлені на 8'іаді Японського фармацев-тичноготовариатва, Саппоро ( 1600 ), наукових семінарах xipö-сймоького університету та методичній Раді Інституту цукрових буряків УААЕ '

Публікації. .........

За маітвріаіамн Дйсертаці і опубліковано 2 статті.

Матеріали. та методи дооліддання.

Стевіовид був виділений їв оухих листків Stevia rebaudiana Bertonl ва методом О. Tanaka et.al. листка отевїї були надані Maruzen Kasel Cb., Ltd. ( Японія ).

Траногліковилювання проводили таким чином :

Розчин, ир містив стевіовид ( іг ), донор ( іг мальтови або пуллу-лана ) та фершнт ( 2000 од. активності кожної в гліковидав, цо виробляюгьсянакомерційнійоснові ), в 50 мл ацетатного буферу (pH 6,45 або 6;05 ), інкубували при 37°0 або 50°0 на протязі 32 годин. Реакційна суміш анотувалась 8а допомогою ВЕРХ після обробки ва допомогою іонообмінної смоли Dialon HP-20 ( Uitsubtshi Kasel Co., Ltd. ). Зразки брали черев 1, 2, 4. 8, 16 та 32 години. Умови для провейення ВЕРХ : колонка Tosoh TSK- gel OOS- 120Т (4,6 мм х 25 см); температура колонки 60°С ; реагент для розділення - БО X метанол. Швидкість протікання 1 ил / хв , детектор УФ- 210 нм.

Тонкошарова хроматографія ( ТШХ ) проводилась на пластинах Kiesel gel 60 TLC pläte фірми Merk Co., Ltd. ( ФРГ ). Високоефективна рідота хроматЬграфія ВЕРХ проводилась ва допомогою хрома-тьграфа' Tosoh ССРМ та реєструвалась ультрафіолетовим детектором Tosoh UV-8 { 210 нм). фірми Tosoh ( Японій ) Розділення глікозидів проводили на йборотньофавових колонках YKC D-0DS-5 ( 4.6 ш х 15

см для аналіву )та Tosoh TSK- gel ODS- 120 Т ( 21,5 їм х ЗО см для

препаративного 'розділення ) фірми Tosoh ( Японія ЯМР та

5 3C-flMP проводили на Ямр-спектрометрі jEOL JNM QX-400 . При 400

мегатерії для протон *Н ЯМР и при 100 мегагерц для вутлець 13С-ЯЫР.

Зразки розчиняли в піридині CgOgN. FAB- MS та ЕІ- КБ мас-бпект-

COO — R

19

І

Rt

R,

Стевіовид

Стевіол Ребаудіоаид A

Ребаудіоаид О

-Дулькоэид В Ребаудіоаид D

РебаудЮ8ид Б ДудЬкоеид А

glo

Н

glo

glo

glc^-'lglo

glo^—Iglo glo .

glcS--lgio

H

gl°§rlglO

' 4Л

'*glo

gloi\-^rham

V .

'*glc glclv^glo .

\1

glo

glc3__lg2o

glc^--^rham

glo - D-глікопірановил rham - L-рамнопіранозид

Шл. 1. Структурне розміщення молекул глюкози та рамнози в ' дитерпенових глікозидах, виділених is Stevia rebaudiana

Bertonl.

- , .. “б - • рй аапиоувалйоь ва допомого* JEW, JMS SX- 102 мас-спектроиетру. Оптична ротація проводилаоь ва автоматичному поляриметрі UNION РМ-101. Зразки розчинялись в етанолі.

Виділення та ровділеннядитерпенових ГЛІКОЗИДІВ .

З листків Stevtti rebaudiana Bertoni родини Asteraceas були виділені солодкі дитерпенові глікозиди, так ввані стевіозвд, реба-уд і os иди А, С, D, Е, а також дулькозид А . однотипний аглікон цих глікозидів стввюл. Щюшяткий вміст та співвідношення стевюзиду і ребаудіозидів А. С, D, Е та дулькозиду А , варіює в залежності від селекційного матеріалу листків отави (мал.1).

Визначення умов траногл і нозилхвання .

Ідея траногл і козилювання полягав в тому, що ва допомогою специфічних ензимів«/.- глікозндаз, які являються єкзокарбог і древами, вільні мэлекули глЕкози переносяться на основу дитерпенового ГЛ1К08ИД8. В залежності від розміпртш зв'язків між молекулами стевіолу та глюкози,. а такожкількості глюкови, пр приєднується до основи, бильно варіпиь ступінь солодості та якість смакового тестування .

В зв'язку з цим для подальшої роботи використовували чистій стевіовид у вигляді акцептора молекул вільної глюкови . Як донор вільних молекул глюкози виступали маньтова або пуллулан. Пуллулан являє собою лінійний водорозчинний полісахарид, ер складається із іальтотриоз та ыальтотетрао8, ер пов'язані ніж собою І-S глікозидним зв'язком . Коїлаяія Maruzen Kasai Co., Ltd. надала для дослідмзнь десять різних трансфераз. Лр класу трансфераз належать ферменти, wo каталізуйсь перенос цілих атомних угруповань від однієї сполуки до іншої. Аналогічний чином в иолекулах полісахаридів моїй відбуватися процес ферментативного переглікозилювання, тобто вамі пюння залишку одного моносахариду на другий. При трансі ■"глікозилюванні необхідно було визначити оптимальне співвідношння донора та . акцептора, температуру та час інкубації, pH середовища і кумування та кількість ферменту, достатню для проведення реакції. Серєловище інкубування містило ацетатний буфер 18 слабо кислым pH, який був здатний пдроліаувати вільні глікозидні зв’язки , зали-

Шл. г. Хроматограма продуктів траногліковилювання отриманих еа допомого» ферменту пулдуланави ВЕРХ умови : колонка УУС-раск 003-АМ-302 Елюент ! 60Х метанол Швидкість струму : 0,8 мл / хв.

Температура колонки : 60V

töus.a, їроаазограда продуктів тршгсгіікозїшваяня отртаышшз sa допомого» фэрнэнту Віогуто L

- - ' - 8 - . юши в цілісності ядро стевіовиду . Спочатку буди проведені експерименти в серіє» ензимів, виробництва Blozyn» laborafcori linited ( Англія), Ці ферменти мав» назви .* Biozyme А, С, М, і. і Суди виділені в Aspergillus sp. Воі вони являиться^гамі лавами . Цри проведенні експерименту температура інкубації вмішовалаоь від 40 до бб°С, pH середовища від 4.6 до б, б , кількість ензима від 20 од. активності до 2000 од. активності, чаоінкубаци від ао хвилин до 32 годин .Використання Biozyme А, СтаМ не принесло позитивній результатів. Через 12 годин відбувалося розщеплення мальтози на вільну глшову, але продуктів трансгліновилювання вафіксовано не було. ■ ■ . . у ■: .. rJ -y ' ' -’ у .

В1 ceyme L отримано шляхом очищання^амілави їв Aspergillus sp. Розчин, цр складався в стевіовиду ( 1г ), ензиму Biozyme L та мальтози в ацетатному буфері ( pH 5,46 ) , інкубувалипри температурі 50 0. Оптимальний час для інкубації 24 години. Потім реакцію вупинялн нагріванням до 100 0 на протяві 16 хвилин. Суміш деюнізували та очищали від ферменту, моносахаридів та інших домівок шляхом хроматографії на колонці о виоокопоркгтою синтетичною смолою Diaton HP- 20 (Mitsubishi Kasel Co., Ltd .) Метанольна фракція досліджувалась за допомогою ВЕРХ Вуло зареєстровано три піки їм , 2м и Зм (мал. З ). ’ У

Наступні два ферменти являли собою «¿-гліновидави, виділені їв дріюжів Вакера ( тип 1 } та дрііджів ( тип 2 ). виробннцтва Boehringer Mannheim Blochemica { ФРН ). Цри проведенні експерименту в даними ферментами проводили вмши температури від 40 до 55 С; pH середовища від Б до7,іб ; кількість фершнтувідбОдо 2000 од. активності *, час інкубації від ЗО хвилин до 32 годин. Продукти трансгліковилюваняй вафіксовані не булі;. ‘

№ два енвими Ftnizym и Cereflo являє собоюjB-Глкканави, вироб-ниитва Novo Enzymes Foundation ( Данія ). Вони вастосовуються в харчовий промисловості. Фермент Finizy» виділений i? Aspergillus niger . a Cereflo їв Bacillus subtilis .Дані енвими досліджувались в тих зю режимах, що і попередні ферменти . Як донор глюкози використовували мальтозу. Ftnizym розщеплював мальтову через ЗО хвилин після початку інкубації . Cereflo не розщеплював мальтозу на протязі 32 годин . Продуктів трансглікозилювання виявлено не було . .

Фермент пуллуланаза, виділений із Klebsiella pneumonia, виробля-

СТЄВІ09ИД

F

5NL

»

*

й

Мал. 4. Хроматограма продукт і в траисгл і кйвиловання

отриманих аа допомогою ферментативно» системи Transglucosilase L - мальтойа

Шл. 6, фоиатограыа продуктів трансглікоаидгаанна

отриманих ва допомогою ферментативноі;системи Transglucosliase L - пуллулан ■

зглі*

.. ._.... , . / '/у;- її - ■. . ■

етьсякомпаніею Amano Pharaaceauttoal Co., Ud ( Яаоаіа ). Використання пуллуланави в реакційній оумші, де докором глюкови виступала «альтова, не дало позитивних результатів. Пальтова ров-щвгшжалась на вільнуглюкову. але продуктів траисгліковилювання виявлено не було .

Тоді вирішено було як джерело вільної глюкози використати пул-лулан . Реакціййа суміш складалась з стевіовиду ( 1г ), пуллулану (2,бг ), ацетатного буферу в pH 6,06 води ( бОмл ), а також еноиму пуллуланави { ІБОО од. активності ). Реакція при температурі БО С проходила 8á 96 годин. Через 98 годин реакцію трансглікозилюванни зупиняли нагріванням до І00°0 на протязі 16 хв. суміш наносили на колЬнку 8 іонообмінною смолою Diaion HP- 20 . йетанольну ФІ>акцію досліджували эа допомогою ВВРХ, колонка TSK-gel 0DS-12O Т, швидкість течі і 1500 икл/ хв. Було одержано б піків нових зразків',1 в якюг ношра 4Р ( Збмг j,, 6Р ( 24мг ), та 6Р ( Ібмг ) являють со-(кіюкомврційний інтерес для подальших досліджень ( мал. 2) . Останнім ферментом пр вивчався. óyBTransgluoosilase L , виділений в Aspergillus ввпиз виробництва Ameno Phamaceautlcal Co., Ltd. (яяонія). Реакційнаеушв.яр^ складається а стевювиду ( іг), мадь-Т08И-( 20Г ); ацетатного буферу ( pH 6.46 ), води ( 100мм ) та

ф&рменту Transglucosilase L ( 300000 од. активності ). інкуСува-дась на протяві б годин при температурі 50° 0 . Потім продукти тршюгліковилшаина виділяли ва допомогою іонообмінної колонки Diaion HP- 20 . Метанольна фракція випаровувалась на ротаційному випаривачі. Осад дослідяувався за допомогою ВЕРХ, колонка TSK- -gel 0DS-12O Т . швидкість течи 1500 мкл / хв. В результаті досліджень було одержано б піків продуктів трансгліковиливання . Вихід даних продуктів складав до ЗО % від початкового стевювиду. Особливий і ітрее являть речовини 4HL ( {»2,3 мг) та 6HL ( 67,1 мг ) (МВЛ. 4 ) . ' ; '. ■ '

Були проведені експерименти 8 даним ферментом, в присутності донора глюкози - пуллулана . Реакційна сумш, складалась 8 стев і-озиду ( 2г У, пуллулану < 20г ), ацетатного буферу ( pH б,46 ), води ( 200мл ), фермента Transglucosilase L ( 300000 од. акаив-HocTl ) при температурі 60°С, шкубувалась на протяаі 24 годин . Потім продукти трансглікозилювання очищались ва допомогою іонообмінної смоли Оіаюп НР-гб. Метанольна фракція випаровувалась аа допомогою ротаці йного випаірювача. Осад вивчався ва допомогою ВЕРХ .

' - " 12 ' В результат» досліджень були отримані дав новях продукта трено-глікозилювання 1Ь ( гімг ) та ( ібмг) ( мал. 6 ). '.

Визначення структури продуктів трансглікозилювання оТввї«Ліиу .

Для вивчення структури' продуктів траногліковиЗадеіНня викбрисТо-вували спеї&роівтрі» Ядерного іШтітШа» ре&іі&су ( ЯЙ* >. ІЬтбд ЯМР вивчає поглинання елект^^нітно і радіаці ї рвФвйною.яка вію-ходйться в ¡¡уяв ОіШюмуоЗДбріднбму/Й^ЙІТв£Й*ЇГ полі. ^#К»рсЙкІЕГТ|>Ія

кротон % - Ш> *Ш і Йвлй&ться однинв яаМііьі роспдтсіц^Ш Методів дай ;-*йкйІЬеті

тільки про положення в молвікулі Шяіііу водню І^Раеом і тим для структурного аналіву більие вначейня Шв вуглецевий . скелет , безпосередня ін^орюція про який моле бути Отримана ва допомогою спектроскопі ї вугіець13С-ЯІІР. Використовуючи вуглець1^- ЯМР, можно визначити структуру ш*л ікону, ііоложння, конфігурацію глі-козильник>ав'я8ків та структуру карбогііфатяоі частини гліковидів без будь яких втрат. Вимірювання,які Проводились в данщй роботі , отримані в середовищі,ар містить дейтеріевий піридін. Якеталон для вивчення хімічних всувів. використовувалитетраметілсилан. Вуглець

13С-ЯМР має три сигнали аномерних вуглеці в при %- 95,2 ; Б ^ 96,0 та $ - 106,1 . Два перших сигнали характеризують аномерні вуглеці стевюла 19-0- та 13-0-^-гліко8Иди відповідно. Останній сигнал * біля Б -106 , характеризує $ -гліковил аномерний вуглець глікозидів . При вивченні продуктів трансгл ікозилювання стевіови-ду, отриманих в результаті обробки ферментом пуллуланаза .в присутності донора глюкози - полісахариду пуллулана , перві три компоненти 1Р , 2Р та ЗР виявились мінорними . Збільшення , ви-, ходу даних речовин не %ю успішним . Тому аацікавлейість для подальших досліджень яЬляли речовини 4Р , 6Р та 6Р , які

мали набагато більший процент виходу. Вивчаючи протон* Н-ЯМР й вуглець 13С- ЯМР спектри, було виявлено , шр речовини 4Р, 5Р та 6Р відповідно, являють собою 13-0 (^-мальтотриоэил ( 1-2 )^-0 глікозид )- 19-0-_£ -О-глікозил-стевюл, 13 О--мальтозил (1-2) -£о-глікозил ) -19-0^3-0- г л ікозил - стевіол та 13- о-^в, -софороаил19 0$ -маяьтотриозил-стевіол ! (мал. 6 ; ).;Ці продукти були вже от-

римані раніше шляхом; транс-оС-і-4-глікоаилюваиня 1» реакційно»

" ю - •

суміш , щ> містить стевіовид та циклодекстринтрансфераау. Як донор вільної глокоаи в даній системі виступав крохмаль. Серед великої кількості продуктів даногос&1-4-трансглікозидювання. речовини 4Р та 5Р являються не тільки найбільш солодкими, але і во-додіють найкравдми смаковими якостями. Яюдр ступінь солодості стевювиду порівняно 8 сахарозою, більше в 160 разів . то речовина 4Р солодше сахарови в 180 разів, компонент 6Р в 205 рае і в. Компонент 6Р має гірші скакові властивості , але ступінь соло дості тільки в 183 рази більше сахарови .

Пуллуланаваявляється ферментом,який гидроліеуеоб-1-6-глікозидні ав'язки в пуллулані, в результаті чого утвориться мальтотрио8и та мадьтотетраоан .В промисловості пуллуланааа використовується для перетворення крохмалю та виробництва глюкози і мальтоеи в промислових масштабах . Специфічне трансгліковилювання цукрів на 4-у повито глюкозної субодиниці, в результаті проведених досліджень, дозволяє судити про наявність нових функцій даного ензиму.або явля еться причиною забруднення промислового 8разка , Заслуговує уваги те ,ир траногліковилювання стевювиду ва допомогою циклодекстрин-трансферааа-крохмалю системи, продукує цілу серію моно-, ди-, три-1 більше гліковильованих продуктів. В той ж» час пуллуланава-пул-лулаи - система продукує, а цілому, три речовини 4Р, бР та бР, хоча вихід даних .продуктів значно нижче, ніж циклодекстринтрансфера-ва-крохмаль системі.

1Н-ЯЫР спектр речовини їм показав чотири аномерних протоних сигнали при%б,99 (1Н, ІО-СОО-^-ОІс ),$Б,26 ( 1Н._001с ), 55.12 (1Н.

^аіс), $6,33 (ІНДаїс ). Вуглець 13С-ЯМР спектр показав чотири аномерних вуглецевих сигнали при§95,5 (10-СОО-^-01о ), 897,0 (13-0-

^аіо ),Ьі06.? фОІо ) та <ІІ00,4 (оСаіо). Дані 1Н'ЯМР і 13С- ЯМР спектрів показують, до речовина їм повинна являти собою моио-- гликовильований Продукт стевювиду (мал. б) Для визначення структури речовини, одного методу ЯМР виявилося недостатньо. Тому для подальишх досліджень застосовували мтод мао-спектрометріі, який широко застосовується для ідентифікаці і та визначення структури природних сполук. Негативний РАБ- мас-спектр високого розривання , речовини їм вивів молекулярну формулу С44 023 ( мал. 7 ).

За допомогою реакції вибіркового ровриву ефір-гліковильних зв'язків,був отриманий стевюлбіозид ( іЗ-СЬД-софоровил-стевюл ).

MftSS SPECTRUM ’ Data File: 1M lB-flPR-90 13:40

Sample: Iffl - ' I

RT : 0'18“ :FRBCNe9,.} ЄС 1.4c BP: m/z-642.0000 Int. 77*3987 Lw 0.80 ¡

Scan* С4І

Мал. 7. Мас-спекгр продукту трансгліковилювання lu

О» дає підставу стверджувати, що рогшцзнвяоС-гліковядної субоди-ниці знаходиться на 19-С00-.Дтлшо8і. Аналізметилювання-адатилю-вання показав наявність основної глюкози їв зв'язком на 2-ій позиці і та глокоги.їв зв'язком в 6-ій позиції . Це підтверджує, № Ыгглокова прікршлена до 6-ої позиції Ів-са^-глюкови . Ці результати підтвердили раніше отримані дані вуглець130-ЯИР: по сигналу 6-го вуглеця, де при гліковилшанні відбувся всув $67,8, порівняно в $62,6. Кінцева, речовину їм можна сформулювати, як ІЗ-О-^-софоровил- 19-О-івоиальтозил-стевірл. Для речовини 2м негативний , високого Р08Р10ЭКНЯ РАВ- мас-спектр, визначив шлекуляр-

ну формулу С44 О^з , Протон ^Н-ЯНР спектр речовини 2м визна-

чив чотири аномерних протонних сигнали бб.07 (1Н, 10~СОО$~Шо ),{ $6,22 (ІН.^ЗІО ), 56,20 (ІН.^ОІО ), $6.48 ( ІН.оСШс ). Вуглець

13с-ЯМР спектр визначив чотири вуглецевих аномерних сигнали &65,8 { і9-соо-^- еіо ), 8в7.4 (13-О-Д-0Ю ). 3106,5 дввіс ) Та5100,4 (о(.01с Це показує,що речовина 2м повинна бути моно-^-глікозиль-ованим продуктом стевіозиду.В результаті реакціі в«3іркового розриву Єфір-ГДІК08ИЛЬНИХ зв'язків речовини 2м,був отриманий проаглі-

клн 2мА , Протон ^Н-ЯИР спектр речовини 2мА покавав три аномерних сигнали при 5б,20 (іН.^аїс ), 56,24 (1Н,/01с), йб.62 (інДШо ).

Вуглець 13с-ЯМР спектр речовини 2мА виявив три аномерних вуглецевих сигнали при^.баЗ-О^-Оїс),$106,6 (у8-Оіс ),$100,4 Шіо ), Оз показує, вр речовина 2мА повинна бути моно^{-гліко8ильовании продуктом стевіолбіогиду. Дані ЄІ-М5 мас-спектру ацетата. речовини 2мА, покагали піки іонів при в» / г 331 , 619 и 907 . Це доказує, по цукровий ланцюг на 13-ій позиці і являється лрямою перацетильо-ваною глікотриозил субодинииаю . Розміщення о(.-глікозильн6гсубо-диниці на 6-ій позиці і йсновноі^-гликозйльноі субодиниці було визначено за допомогою аналізу метилювання- ацетилювання речовини 2мА. Цей аналіз покавав наявність основної глюкози, глюкози, пов’язаної в 2-ому положенні та Глюкози .пов'язаної в 8 - ому положенні . Це розміщення було також підтверджено наявністю

вуглець С-ЯМР . сигналу . ГліковильованиЯ вуглець С-б викликав всув з $ 62,8 на $68,6. Виходячи із отриманих даних , можна сформулювати, що речовина. 2м це 13-0-{£-івомальтозил (1.-2 )• ^-0-глікозид )-і9-0-/-0-пиковил-стевюл , а речовина 2МА це 13

. . - - 17 - .

. -0-{^-і80Ш*ЬТ08М (1-2 )-,£-СЬГЛ1К08ИЛ )-стевіол. Негативний. високого ровріпення PAB-MS мас-спектр речовини ЗМ , вивів формулу °44 ®70 °23 )• Визначення структури речовини Зы проводилось

ва допомого» таких самих методів, щр і полбредні речовини, фотон

1Н-ЯМР спектр речовини Зм виявив чотири аномерних протонных сигнали при 56.00 (1Н, 19-CWb^-Qlo ), S6.20 (ІН.^ВІО ), $6.09 (1Н,

jíGlc ), $6,91 (lH,o(Qlo ). Вуглець 13C -ЯЫР спектр виявив чотири аномерних вуглецбвих сигнали при Б95.8 (19-000-/G1C ) 597,9 (із-о-fiQlc ), S106.3 (jlGlc) та &101.8 (0СБІ0 )що доводять,що речовина Зы повинна бути моно - глікозильованим продуктом стевіовиду . В результаті проведення реакції вибіркового розриву Єфір-ГЛ1К08ИЛЬНИХ

зв'язків,був отриманий проаглігон ЗмА. Протбн^Н-ШР спектр речовини &ЫА покавав наявність трьох аномерних протонних сигналів при$ 5,20

(lH.^Glo ), % 6,10 (IH^Qlo ),5 6,98 (lH.dÍGlo ). Вуглець 13с-ЯЫР спектр виявив три аномерних вуглецевих сигнали при $98,0 (із-о-jlGlo )* S 106,3 (jIGlo ) та SlOÍ,7 (оСШо ). Ці Дані показують, щр речовина ЗмА являється моно- глі коэильоваяим продуктом стевіолбіо-виду . EI-MS мас-спектр ацетильованої речовини ЗмА . показав піки іонів при m / а 331, 619 та 907. Ш результати дозволяють ска-вати.нр цукровий ланцюг на 13-ій повиції являється перацетильова-НОЮ прямолінійною ГЛ1К0ТРИ08ИЛ СУбОДИНИЦеЮ . Розміщення <а(гГЛ і носильно 1 субодиниці було визначено за допомогою реакції штилювання - ацетилювання, яка показала наявність основної глккови , глюкози, пов’яваної в 2-ій позиції та глюкози , пов'язаної в 3-ій повни . Це було також підтверджено наявністю воуву сигналів

13С-ЯЫР 8 §78,4 на 1584.8,11» говорить про вв'язок в 3-ій вуглецевій субодиниці. Грунтуючись на отриманих даних, компонент ЗмА можна вивначити ЯК 13-0- 0-НИГЄРО8ИЛ ( 1-2 )-,Р -D-глі КОБИЛ )-стевіол , а речовину Зм як 13-0-(^ -нигеровил ( 1-2 )-^-0-ГЛ1КО8ИЛ )-19-0^3.* -D-ГЛІКОЗИД-СТЄВ10Л . ■ .

Щ>и дослідженні продуктів трансгліковилювання стевіовиду, отриманих ва допомогою Transglucosilase L-мальтоза системи, ів шести КОМПОНЄНТІВ чотири виявились мінорними ." Збільшення виходу речовин 1NL , 2NL , 3NL та 6NL не увінчалися успіхом . Тому інтерес для подальших досліджень являли собою речовини 4NL та 5NL , які мали до 30% виходу від первісного стевюэиду. При подальшому вивченні. спектрів. _ЯМР було виявлено,: шр вравок 4NI, являє собою

Со трсі. «1 «а

1 т -дїс^—’дїс -діс^-^ді с

2 т -в.с«<в,С -діс

Зт _ д 1 с?—-діс-—-діс ~д|с

4 N1.0 _дІс2—!дІ с — д1С 5—1 д1с

4МІ_Ь „дісі—’дісі—1діс ..." д,с

5ІУІІ. ,6>9»С -ЯІ<Кв«с - д і с

4Р - діс —ді с -—Зд І с~1д 1 с • ' ; ■ • : ’ Г - діс

5Р - діс—1дґс~діс -діс

6Р _д|С2—1д І с * - д 1 сМд 1 —- діс

4ЬД.а = 11а 4МІ.Ь = 1І_Ь 5МІ=_21.

- - - ~.

Мал. 8. структурне роамд швння молекул глюкози в

дитерпенових глікозидах, отриманих в результаті проведення реакції трансглікозилювання ."‘-/V..

. . • . , - ■ . . суши речовин. Використовуючи колонку TSK-gel 0DS-120T, вдалось виділити два компоненти 4MLa и 4HLb .

Вивчаючи протон 1Н-ЯУР та вуглець 13С-ЯМР , негативний FAB-MS мас-спектри, дані тонкотарової та високоефективної рідинної хроматографіЯ , було визначено , щ 8разки 4NLa , 4NLb та 5NL являють собою . 13-О-С0ф0Р08ИЛ - . 19-0-180ИаЛЬТ08Ш1-СТЄВ10Л, ІЗ-0-CjS.

-гентюбіовйя (1-2)-jJ-D-ГЛІК08ИЛ )-19-0^8-СЬГЛ1Кй8ИЛ- стевіол та ІЗ-О-^-івомальтовил ( 1-2 )-£-D-глікозил )-19-0-j&-D-raiKo-

8НЛ-стевіол Ці продукти трансгліковилювання були отримані раніш при використанні пудвулан-пуддуланава системи. Иояна стверджувати, вд речовини 4NLa та 6NL аналогічні вравкам їм , та 2м відповідно.

При вивченні продуктів транеглікоаияювання етевювиду, отриманих ва допомогою Trensglucosilase L - пуму лап систеші . Брааок 4L виявився сумішшю двух речовин lLa та Ш> . Ва основі спектрів

протон 15*ЯМР я вуглець 130-ШР . иао -спектрів . даних ТШХ та ВЕРХ ножна стверджувати , вд> врааки lLa , lLb , 2L аналогічні речовинам 4NLa, 4Ш>.та SNL відповідно (мал.8 ) .

. а 6. Визначення ступеню солодості та смакових якостей продуктів трансгдіковішяаігая . ■ ■

Інтенсивність солодості по відношенню до сахарози та смакові якості кожного 18 отриманих продуктів трансглікозилювання. досліджували в кошаіі i/arusen Kasel Co., Ltd. Шість професіональних дегустаторів спробували 6 % водні розчини продуктів трано-

тлікозішоваиня та порівнювали з 6 % водним розчино« сахароБи . Речовина 4P має відмиті сиакові якостями та ступінь соло-дості,. порівняно з сахарозоа більш а 1Ш ра8ів. .Речовша 5р нае відмівні сьіакові якостіта солодше сахарови в 205 разів. Речовина 6Р має добрі смакові якості та солодше caxaposn в 133 рави . Речовина ін »дає відмінні смакові, .якості іа Ьолодще сахарови в ПО

рааів.;: Речовинагм має кращі по врівнянню а стевіовидом смакові йіасїйвооті'■ і садодда сахарови в 40 равів . Речовийа зм дає

мряі сйййові якобтГта tíae ічрькуватий присмак. Речовин» 4P, 5Р та 6Р. , зараз використовуються харчовою промисловістю Японії. Ступінь сододості речовин їм та 2м менше, ніж етевювиду, а речовина Зм має взагалі гіркий oía«. Проте, в точки зору смакових якостей, яки» добитися збільшення виходу речовини їм , то їда речо-

вину можна рекомендувати для практичного використання 8 прокисло- * вих масштабах . " . :

ВИСІКШІ

1. їв листків роолини Stevla rebaudiana Bertonl родини Astегаоваэ

( СКЛаДНОЦВІТІ ) бУЛИ Виділені ДИТерПвНОВІ ГЛІК03ИДИ-СТЄВ108ИД, ребаудіовиди А, 0, D 1 Е, а також дульковид А . .

2. Визначені умови трансгліковилювання ва допомогою ферментативних

систем : Віогуто L - мальтовб , Pullulanaso - пуллулан, Trans-*

glucosllasG L - мальтова и Transglucosllase L - луллулан.

3.3a допомогою сучасних методів ВЕРХ визначені'умови та виділені продукти трансгліковилювання в достатній кількості для грунтовного їх дослідження . . ;

4. Визначені структури продуктів трансглікозшшвання sa допомогою

сучасних ‘ методів ^-ШР ,13С-ЯЫР , FAB-kG , ЕІ-Ш , газорідинної хроматографії - мас-спектрометри. .

5. Вперше були отримані продукти трансглікозішовашія, які шить в

своєму складі 1-6 глікозидні вв'Я8ки.0э речовшш їй , 2и , 4НІа, 4NLb та 5NL . . : \ . ' , • ' . -

6. Визначені ступінь солодості та смакові властивості синтезованих

речовин. Речовини 4P та БР мають відмінні смакові якості та мають ступінь солодості вище . ніж у етевювиду. Речовини їм та 2м мають високу ступінь солодості та смакові властивості кращі Ш а у етевювиду. • . ' : /

Список робіт,опублікованих по темі дисертації.

1. Лобов С. а Синтев и выделение продуктов транегднікоаилирования. -

В кн.:Введение в культуру стевии-источника низкокалорийного ваые-нителя сахара. К.*.ВНИ0, 1990.-С. 102-109. . . ;

2. Lobov S. V., Kasai R. * Ohtani К.. Tanakâ 0.. Yamasakl К., Enzymlc Production of Sweot Stevioside DerlvatlVes s Transgluoosllation by Glucosldases // Agrlc. Blol.Chem. -1991. -N ¿S (12).-p. 2959-2965.

■