Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эндогенные и экзогенные фитогормоны и формирование структур INVITRO ели обыкновенной

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Эндогенные и экзогенные фитогормоны и формирование структур INVITRO ели обыкновенной"

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

4

ОРДЕНА ТРУДОВОГО КРАСНОГО ЗНАМЕНИ ИНСТИТУТ ФИЗИОЛОГИИ РАСТЕНИЙ

ем. К.А. ТИМИРЯЗЕВА

На правах, рукописи

хмага константин алексеевич

ЭНДОГЕННЫЕ И ЭКЗОГЕННЫЕ ФИТОГОИМИ И ФОНДИРОВАНИЕ СТРУКТУР in vitro ЕЛИ ОБЫКНОВЕННОЙ

03.00.12 - физиология растений

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой сгепени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Ордена Трудового Красного Знамени Института физиологии растений им.К.А.. Тимирязева РАН.

Научный руководитель . -кандидат биологических

наук Н.В. Катаева

Официальные оппоненты -доктор биологических

наук В.И. Кефели -кандидат биологических наук И.Д. Никифорова

Ведущая организация - Главный ботанический сад РАН Защита диссертации состоится "Д^" у! 1994 г.

в час, на заседании Специализированного совета но присуждению ученой степени кандидата биологических наук К 002-45.01 при Институте физиологии растений им.К.А.Тимирязева РАН го адресу: Москва 127276 ул.Ботаническая,35.

Автореферат разослан декабря 1993 г.

Учены® секретарь /_/ /

Специализированного ^ , ; -¿¿г

совета, к.б.н. Л.И.Сергеева

введение:

Актуальность■проблемы. Сохранение и улучшение наследственных свойств лесных древесных растений является одним из условий повышения продуктивности, качества и устойчивости лесов. Однако, промежуток времени до того как генетически улучшенные .деревья станут давать семенную продукцию довольно длителен и составляет для разных пород и отдельных особей от б до 30-60 лет. Вегетативное размножение селекционных форм большинства основных лесообразующих пород до сих пор остается трудной проблемой, поскольку традиционные методы (черенкование, прививки) не отличаются достаточной эффективностью.

В связи с уменьшением запасов спелой еловой древесины и все возрастающей потребностью в ней народного хозяйства одной из главных задач лесоводов является повышение продуктивности еловых насаждений. Ель хорошо размножается прививками и неплохо черенкуется. Однако эти методы не могут быть аффективными из-за ограниченного количества селекционного материала. Микро-размпожение с помощью культуры тканей и органов приобретает вакное значение в селекционных программах для этой цороды.

Несмотря на широкое использование клонального' шпсроразм-нокения для травянистых культур, техника ыикроразмножения для древесных, особенно хвойных пород, пока еще мало разработана. Одна из главных причин этого - недостаточность наши знаний о физиологических основах морфогенеза хвойных древесных растений in vitro. До сих пор не -изучены факторы, определяющие пути развития культивируемых клеток. Неизвестно, по каким причинам в культуре ткани реализуется та или иная морфогенетическвя программа. Согласно одной из существующих гипотез изменение внутреннего гормонального баланса, происходящее под влиянием экзогенных регуляторов роста, приводит к индукции определенного морфогейетичэского процесса. Больше накоплено информации относительно роли фатогормонов в регуляции роста и дифференци-ровки унэ существующих органов растений, чем о возможном значении этих гормонов в инициации морфогенеза ds novo. Изучение проблемы экзо- и эндогенной гормональной регуляции при микроразмножении растений позволит ответить на многие вопросы о роли фитогормонов при индукции различных морфогенетических процессов.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы было

изучение особенностей гормональной регуляции морфогенетических процессов in vitro ели обыкновенной и анализ изменения внутреннего гормонального баланса при индукции и реализации определенных морфогенетических программ in vitro.

Для этого необходимо было решить следующие задачи: разработать условия и ввести в культуру ткани ель обыкновенную;

- изучить особенности морфогенеза (активация пазушных меристем, адвентивный органогенез,соматический эмбриогенез) и способы его регулирования с помощью экзогенных регуляторов роста;

- изучить действие экзогенных регуляторов роста на морфогенез в зависимости от генетически детерминированной формы ветвления

' кроны;

- исследовать влияние регуляторов роста цитокишшового типа действия на индукцию органогенеза, возникновение детерминированного состояния при культивировании изолированных зародышей;

- исследовать изменение внутреннего содержания фитогормонов при индукции и реализации морфогенетических процессов экзогенными регуляторами роста и проанализировать возможные корреляции между действием экзогенных регуляторов роста, изменением содержания гормонов в культивируемых, тканях и индукцией морфогенеза в культуре изолированных зародышей;

- исследовать возможность длительного культивирования органо- и ембриогенного каллусов;

определить возможность использования соматического эмбриогенеза для ускоренного микроразмножения.

Научная новизна. Получены новые-данные о морфогенезе ели обыкновенной в культуре тканей. Впервые показана зависимость адвентивного органогенеза в культуре зародышей ели от генетически детерминированной формы ветвления крона родительского растения и на этой основе сделано заключение о наиболее перспективных деревьях для ускоренного микроразмножения и создания искусственных лесонасаждений.

Впервые изучено содержание фитогормонов в тканях культивируемых зародышей ели обыкновенной в процессе индукции органогенеза и соматического.эмбриогенеза и зависимость этих процессов от гормональных факторов среда.

Показано, что соотношение гормонов в культивируемых тканях при реализации различных морфогенетических реакций различ-

но. При индукции органогенеза в тканях зародышей ' наблюдается высокое содержание цитокининов ряда зеатина и сравнительно низкое - цитокининов ряда изопентениладенина. При индукции соматического эмбриогенеза соотношение цитокининов в тканях было противоположным: высокое содержание цитокининов ряда изопентениладенина и низкое - зеатина.

Выявлено, что высокое содержание ИУК в культивируемых зародышах приводит к ингибированию каллусогенезя и адвентивного органогенеза.

Практическая ценность. Показана возможность и перспективность соматического эмбриогенеза для клонального микроразмножения ели. Метод соматического эмбриогенеза может стать основой для разработки биотехнологии микроразмножения и создания лесонасаадений с помощью искусственных семян. Полученные результаты позволяю рекомендовать для использования в клональ-ном микроразмноженш ели обыкновенной семена, собранные с деревьев с четко выраженной мутовчатостью, что должно значительно повысить процент експлантов, образующих адвентивные почки и позволит увеличить количество посадочного материала.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 4 работы.

Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлялись на годичной научной сессии Архангельского Института леса и лесохимии, а также ежегодно докладывались на заседаниях аспирантской комиссии и на научных семинарах Отдела биологии клетки и биотехнологии ИФР АН СССР, на 2-ой Мекдународной конференции "Биология клетки и биотехнология", Алма-Ата, 1993 г.

Структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов. Содержит II)? страниц машинописного текста, 21 рисунок 13 таблиц. Список литературы содержит 176 наименования, из них 128 опубликованных за рубеком.

материалы и методу.

Растительный материал. Вегетативные почки заготавливались с 3-х,Б-ти и 12-ти летних деревьев ели. Семена собирали с отдельных деревьев в первой декаде .августа и в октябре в 1987, 1989 и 1990 г. на плантации семенного происхождения» созданной в 1963 г. в Устшенском лесхозе Вологодской области, а также использовали семена, собранные в Архангельской, Владимирской, Московской областях.

Стерилизация растительного материала. Семена стерилизова-

ли в течение 20 мин. в 0,1% растворе диацвда,'промывали стерильной водой и затем выдерживали в воде в течение 20 ч, что приводило к их.набуханию и облегчало вычленение зародышей для введения в культуру in vitro.

Культуральныэ среды. В качестве основной питательной среда (ОС-I) для индукции органогенеза при культивировании зародышей использовали среду, содержащую минеральные соли по Мура-сиге и Скугу (МО), сахарозу - 1%, агар - 0,6%, тиамин-НСи. - 5 иг/л, пиридоксин - I мг/л, никотиновую кислоту - Б мг/л, инозит - 100 мг/л, ИУК - 0,01 мг/л. К 00-1 добавляли вещества цитокининового типа действия: БАП, тидиазурон, 2иП, зеатин в. раз'личных концентрациях. Зародыши культивировали в чашках Петри d=IOO мм или во. флаконах v=50 cf.r.

Для индукции вмбриогенного каллуса в качестве основной питательной среды применяли 00-1 и питательную среду, составленную на основе среда Леповре (00-2), из регуляторов роста добавляли 2,4-Д, КУК, БАП, кинетин в различных концентрациях и сочетаниях. Концентрацию сахарозы в среде изменяли от 1% до 5%. Дальнейшее культивирование эмбриогенного каллуса осуществ-' лялось на OC-Ii содержащей 2,2 мг/л 2,4-Д и 1,1 мг/л БАП. Для регенерации соматических зародышей из ембриогенных каллусов использовали ОС-I, содержащую,в различных сочетаниях АБН, НУК, ИЫК. •Культивирование каллусов на этих питательных средах осуществлялось в течение 21 дня, после чего каллусы'переносили на безгормональную среду, содержащую половину нормы минеральных солей МС и 0,5% сахарозы.

Вегетативные почки культивировали на питательной среде 00-3, составленной на основа среда Мурасиге и Скута.

Каждый эксперимент, в котором культивировалось на менее 250 зародышей, проводили в 4 независимых повторностях. Для, каадого эксперимента производили подсчет средних арифмегичес- • ких и средних квадратичных отклонений..

Микроскопические препараты фиксировали по методу Карнуа,. окраска их осуществлялась.по методу Гейденгайна. Для определения эффективности эмбриогенеза, амбриогенную каллусную ткань окрашивали Z% раствором ацетокврмина по методу Гупты и Дурза-на, позволяющему избирательно окрашивать соматические зародыши. '

Определение наткпных фитогормонов. Определение содержания ¿aroгормонов проводили с помощью метода имыуноферментного ана-

лиза (ИФА), разработанного Катаевой-и др.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.

Культура вегетативных почек ели. В течение первых 6 недель культивирования вегетативных почек происходило интенсивное развитие самих почек, затем наблюдалось замедление роста. Часто у основания почки формировался каллус. Развитие вегетативных почек и формирование адвентивных почек зависело от состава фитогормонов в питательной среде. Присутствие в среде зевтина в концентрации 1мг/л вызывало интенсивный рост хвоинок, при этом удлинение стеблевой почки не наблюдалось, адвентивные почки не образовывались. 2иП индуцировал рост хвоинок, при этом происходило и незначительное удлинение самой почки. При добавлении в среду ОС-3 3 мг/л БАЛ почки удлинялись до 5 мм, основание почек утолщалось и впоследствии здесь образовывался каллус, в котором формировались адвентивные почки. Рост хвоинок в присутствии БАИ был слабый, однако, они разрастались в основании почки и приобретали шаровидную форму. Если концентрация БАЛ в питательной среде достигала 5 мг/л, то эффективность образования каллуса возрастала до 28%, а при концентрации БАЛ - 25 мг/л все почки покрывались каллусной тканью. При культивировании почек в течение 4 недель на питательной среде, содержащей кинетин в концентрации 0,5 мг/л, происходило удлинение почек и нормальное развитие хвоинок, наблюдалась дифференциация адвентивных почек у основания почки и развитие в пазухах растущих хвоинок меристем.

Большое влияние на образование адвентивных почек оказывал срок заготовки исходного растительного материала й его состояние. Наиболее благоприятным материалом для введения в культуру ткани были почки, находившиеся в состоянии покоя (декабрь-март). Возраст материнского растения оказывал влияние на способность вегетативных почек к образованию адвентивных меристем. Так, у почек с 5-ти летних саженцев образование адвентивных почек происходило в 14% случаев, а у почек с 12-ти летних растений - дифференциацию адвентивных почек не наблюдали ни в одном случае.

В наших экспериментах по индукции органогенеза наиболее благоприятной питательной средой била среда, содержащая кине-тин. Так, на питательной среде с 0,5 мг/л кинетина 29% почек образовывали почки, тогда как на среде с БАЛ процент образом ■ ния почек достигал только ЫЯ. На тггптолышх српдях, содчруц

щих природные цитокинины зеагин и 2иП, образования адвентивных почек нэ наблюдалось.

Питательная среда, содержащая 0,5 мг/л кинетина и I лег/л лимонной кислоты, повышала процент образования почек. На данной питательной среде наблюдалось повышение как. эффективности каллусообразования (до 42%), так и заложения почек (до 41%).

Культура изолированных зародышей, органогенез. Присутствие в среде ОС-1 веществ цитокининового типа действия было обязательным условием формирования органогенного каллуса. При культивировании зародышей в течение одного месяца на среде 00-1 без регуляторов роста происходило развитие только проростка с хорошо развитыми семядолями, каллус не формировался и ни в одном случае.мы нэ наблюдали возникновение адвентивных почек.

Культивирование зародышей в течение двух месяцев на средах ОС-1, содержащих ИУК, заатин, или 2иП, или БАП, или тидца-зурон стимулировало в той или иной степени пролиферацию органогенного каллуса и дифференциацию адвентивных почек. При этом в первые 7 дней культивирования наблюдали незначительное увеличение размера зародыша, затем в области пшокотиля и семядолей начинала образовываться каллусная ткань, которая к 15-му дню культивирования покрывала зародыш. После 20 дней культивирования наблюдали дифференциацию стеблевых апексов.

Влияние различных веществ цитокининового типа действия на адвентивный органогенез в культуре зародышей ели представлено в таОдЛ. БАП вызыезл появление органогенного каллуса в незначительной степени (у 25-38% зародышей), 2иП - только у 15-18%, добавление зеаиша приводило к образованию органогенного каллуса в среднем у 65% зародышей, а в случае с тидиазуроном - до 80%. Как видно из представленных данных, увеличение концентрации зеатина, 2иП, БАП более I да/л приводило к снижению органогенеза и одновременно к повышению процента некротизкрувдихся каллусов, который достигал 70-80% при концентрации регуляторов роста в среда более 3 мг/л. Увеличение концентрации тидиазуро-на до I мг/л приводило также к резкому снижению процента аксгг-лантов, способных к образованию адвентивных почек и к ингиби-роваиию киллусогенеза.

Формирование адвентивных почек при культивировании зародышей ели обыкновенной на питательной средесодержащей тидиа-пурон, происходило как в образовавшемся каллусе, так и нанос-

-Э-

редственно в тканях зародыша.

Дальнейшее развитие адвентивных почек и их рост в культуре ткани зависели от присутствия в питательной среде регуляторов роста. Так, на питательной среде, содержащей зеатин,- БАП, 2иЛ, происходило только залокение адвентивных почек, а развитие их наблюдалось лишь при переносе на бозгормональную среду. Другая картина наблюдалась на питательной среде с тидивзуро-ном, где одновременно происходили дифференциация адвентивных почек и дальнейший их рост, почки могли развиваться и формировать побеги без переноса на среду без регуляторов, роста.

Таблица - I.

Влияние веществ цктокининового типа действия на морфогенез изолированных зародышей ели обыкновенной в культуре ткани.

Развитие и морфогенез зародышей, Регуляторы Концент- в процентах от общего количества роста цитоки- рация, в культивируемых зародышей

шшового типа мг/л -г-г--

действия Образова- Некротиза- Образование

нив каллу- ция почек

са

г 0,1 г 54-3,2 ' 7-0,8 ' . 0

зеатин. 1.0 88±4,3 21-2', 4 65-3,7

3,0 99±3,8 48±2,7 30±2,4

5,0 $9±4,8 71-3,9 0

0,1 24-2,9 28^3,5 0

БАП 1.0 58-4,3 27±2,1 34-3,2

3,0 67±2,2 54-3,1 28-2,9

• 5,0 86±4,7 83±5,8 0

од 0 27-4,2 0

2иП 1,0 24±5,3 30-4,9 16±3,4

3,0 30±3,2 40-4,6 Ю±1,б

5,0 48-6,7 80-3,6 1*0.4

0,01 • 72-3,5 3±1,3 80-4,4

тидиазурон 0,1 50±6,7 30-5,8 12-2,5

1.0 Ю±3,6 70-4,5 0

без цитоюшшюв 0 0 0 0

Способность адвентивных почек развиваться в ' присутствии тидаазурона мозкно объяснить тем, что цитокининовый эффект ти-диазурона связан с ингибированием фермента изопентенилоксида-зы. Этот фермент, окисляя цитокинины, понижает их содержание в растительных тканях- Гидиазурон, ингибируя фермент, способствует повышению уровня эндогенных цитокининов. В том случае, когда в питательной среде присутствовали БАБ, зеатин или 2иП, которые способны снимать апикальное - доминирование, рост адвентивных почек не происходил.

Наш исследования показали, что оптимальной питательной средой для индукции адвентивного органогенеза в культуре ткани зародышей ели, являлась среда 00-1, содержащая МУК - 0,01 мг/л, зеатин - I мг/л или тидаазурон - 0,01 мг/л.

Для изучения условий, необходимых для возникновения детерминированного состояния и для индукции образования органогенного каллуса, была проведена серия экспериментов, в которых изолированные зародыши культивировали различные промежутки времени на среде ОС-1, содержащей: а) тидаазурон- 0,01 мг/л; б) зеатин - I мг/л; в) 2иП - I мг/л. Результаты экспериментов представлены в табл.2.

Как видно из полученных результатов, культивирование зародышей в течение 4 дней на среде с зеатином и 2иП было достаточным условием для начала формирования адвентивных почек, однако частота образования адвентивных почек достигала максимальных значений только к 8-15 дню культивирования на индукционной питательной среде. Дальнейшее культивирование на среде с зеатином или 2иП приводило к постепенному снижению количества каллусов, способных формировать адвентивные почки, и к концу субкультивирования (25-й день) эта величина снижалась до 30% в случае использования питательной среды с зеатином и до 14% на среде с'2иП. При этом к концу субкультивирования наблюдалось побурение части каллусов, что, на наш взгляд, и является одной из возмошых причин снижения эффективности органогенеза.

Почки, образовавшиеся на среде с зеатином, при переносе на бозгорлональную среду были способны формировать нормальные побеги, осли они культивировались на индукционной питательной средо не м-шое 7 дней, но наилучшее развитие происходило при культивировании зародышей на индукционной среде в течение 15. Ллнонтивныо почки, образовавшиеся в каллусе на среде

- и

с 2иП, как правило, в дальнейшем нэ развивались и'не формировали побегов.

Таблица - 2.

Способность изолированных зародышей ели к органогенезу в зависимости от продолжительности культивирования на среде ОС-1.

-г-1-

Продол- Количество зародышей, об- Размер адвентивных почек, житель- разовавших адвентивные в мм. ность почки, в Ж от общего числа

культивирования на индук-онной • Тидиа-зурон Г Зеатин Г ' 2иП Г т. Тидиа-зурон Г Зеатин Г 2иП

среде, (сут)

г г г г г г

I 0 0 0 0 0 0

3 0 0 0 0 0 0

4 0 40*4,2 10*3,1 0 0,2-0,3 0,2-0,3

Б 0 42-2,6 28*4,5 0 0,2-0,4. 0,2-0,4

6 0 46*1,7 30*1,9 0 0,4-0,7 0,3-0,6

7 27*2,8 47-3,5 31*2,7 0,4-0,5 1,0-3,0 0,5-1,0

8 31-2,4 55*0,4 30*1,8 0,7-0,8 3,4-4,0 0,7-1,2

9 36-2,2 64*4,7 30*2,3 0,8-0,9 2,0-4,0 0,5-1,1

10 38-1,7 60*6,1 22*1,9 0,8-0,9 3,0-4,0 0,6-1,0

13 42-2,6 70*2,5 17*2,7 1,0-1,5 3,0-4,0 0,5-0,8

16 47*2,8 Б8*4,3 14*1,6 2,0-3,0 3,0-5,0 0,5-0,6

22 48-2,3 40*3,7 13*2,8 4,0-8,0 2,0-4,0 0,4-0,7

25 52^4,1 36-2,9 14*3,4 5,1-8,4 3,4-4,6 0,3-0,7

28 64-3,9 33*3,5 14*2,7 4,6-8,2 2,3-3,9 0,4-0,6

49 76-4,1 25*2,6 16*5,2 3,0-5,7 2,3-3,0 0,3-0,5

Зародыш, культивируемые на питательной средэ о тидиазу-роном, приобретали способность формировать органогенный каллус только к 7 дню. Эффективность органогенеза на среде с тидиазу-роном находилась в прямой зависимости от длительности культивирования, достигая максимальных значений к концу пассака и

при дальнейшем субкультивировашш на индукционной питательной среде процент зародышей, образовавших адвентивные почки, постепенно возрастал. Тидиазурон, в отличие от других цитокини-нов, не тормозил развитие адвентивных почек, которые формировали побеги длиной 2-3 мм к концу субкультивирования на индукционной среде, на требуя при атом переноса на безгормональную среду. Если зародыши культивировали на питательной среде с тидиазуроном менее 15 дней, то образовавшиеся адвентивные почки были не способны к удлинению и формированию побега. Культивирование зародышей на данной среде более 15 дней приводило к нормальному развитию адвентивных почек.

Процесс адвентивного органогенеза при культивировании зародышей на индукционной питательной среде маша разделить на три этапа: I этап - индукция и возникновение детерминированного состояния. Продолжительность этапа - 4-5 дней, если зародыши культивировались на среде с БАЛ или зеатином и 7-8 дней -на среде с тидиазуроном; 2 этап - дифференциация адвентивных почек. Продолжительность этапа составляет не более 12 дней. Для этого этапа характерно то, что залоиившеся меристемати-ческие очаги формировали адвентивные почки, которые в течение этого этапа были не способны к росту и элонгации; 3 этап -рост адвентивных почек и.формирование побега.

В случае дифференциации адвентивных почек в культуре изолированных зародышей, индукция осуществляемая регуляторами роста цитокининового типа действия, приводит к изменению состояния клеток и тканей зародышей и возникновению детерминированного состояния, характеризующегося тем, что независимо от присутствий в среде индуктора происходит процесс адвентивного органогенеза. Как показали наш исследования, природные цито-киншш (зеатш, 2иШ индуцировали детерминированное состояние у первичного каллуса и тканей зародышей в течение 4 дней, тогда как тидиазурон только по прошествии 7 дней.

Нами было исследовано влияние форм ветвления кроны родительского дерева на способность изолированных зародышей ели к адвентивному органогенезу в культуре ткани. Изолированные зародыш культивировали в течение 1-2 месяцев на среде 00-1 с добавлением регуляторов роста (ВАЛ, зеатин, тидиазурон), после чого пересаживали на среду без регуляторов роста. Полученные результаты приведены в табл.3.

Походя из представленных дашшх очевидно, что способность

первичного каллуса и зародышей образовывать адвентивные почки находится в прямой зависимости от степени выраженности мутов-чатости материнского растения. На среде ОС-1 с I мг/л зеатина в течение одного месяца в среднем В2% аксплантов от деревьев с четко выраженной мутовчатостью образовывали адвентивные почки, тогда как экспланты от деревьев без признаков мутовчатости только в 47% случаев.

Таблица - 3.

Зависимость образования адвентивных почек в культуре изолированных зародышей ели обыкновенной от формы ветвления кроны родительских деревьев.

Количество зародышей, образующих адвентив-ССорма ные почки, в % к общему числу аксплантов

ветвления -г-г--

кроны 0,01мг/л 1,0 МГ/Л • .1,0 мг/л

тидааэурона. зеатина. БАЛ.

1-ый пассая Г Г" 2-ой 1-ый пасса® пассаи 2-ой пассаа Г1-ый Г 2-ой пассан пассан

Мутовча-тость выранена четко г сред. г г 47 ¿6,1 86-3,1 62-3,6 г 60-1,5 г г 3-1,1 33*1,3

Мутовча-тость выражена слабо сред. 24±2,9 58*3,7 51*8,8 48-9,3 4-1,8 19*1,8

Мутовча-тость не выражена сред. 20±1,4 52-3,2 47-4,6 41-5,6 8*0,9 20*1,8

При субкультивировании в течение двух месяцев на питательных средах, содержащих тидиазурон или БАЛ, наблюдали увеличение числа эксплантов, образующих адвентивные почки. Так, у аксплантов ,от деревьев с четко выраженной мутовчатостью субкультивирование на питательной среде о тидиазуроном (2-ой пас-саа) приводило к повышению процента зародышей, образующих адвентивные почки с 47 до 86®, а на среде с БАП - с 3% - 33%. Во всех случаях сохранялось влияние степени выраженности мутовчатости деревьев на способность аксплантов образовывать адвентивные почки. На питательных средах с тидиазуроном образовывались адвентивные почки у 86% эксплантов от деревьев с четко выраженной мутовчатостью и 58% у експлантов от деревьев со слабо выраженной мутовчатостью.

Такш образом, полученные результаты позволяют рекомендовать для использования в клональном шкроразмножении ели обыкновенной семена, собранные с деревьев с четко выраженной му-товчатостью, что, с одной стороны, долшо значительно повысить процент вксплантов, образующих адвентивные почки, а с другой стороны, позволит создавать быстрорастущие насаждения, так как деревья, относящиеся к донной группе, обладают лучшим ростом и высоким уровнем.плодоношения.

Соматический эмбриогенез в культуре изолированных зароды-При индукции соматического эмбриогенеза зародыши ели культивировали на средах 00-1 и ОС-2, - содержащих регуляторы роста в различных комбинациях.

Появление каллуса во всех испытанных вариантах наблюдалось спустя 2 недели культивирования. К концу первого субкуль-тивировашга (28 сут.) каллус укэ был хорошо сформирован и мое~ но было выделить 3 типа каллуеой ' ткани: I ■- светло-желтый каллус, быстро зелвнекщий при культивировании на свету, образовавшийся в верхней части зародаша. В этом каллусе часто могло было наблюдать, появление адвентивных почек, подобных, почкам, формирующимся при культивировании зародышей на питательной среде дая индукции органогенеза, содеркащай БАЛ или тидаазурон; 2 - коричневый плотный каллус, образующийся, как правило, в нижней части зародыша на первичном корешке; 3 -оводненный, прозрачный, рыхлый каллус, образующийся в нишей части гипокотиля.

В третьем типе каллуса'уже на первых этапах его образования можно было определить, что он состоит из полярно организованных структур (соматических зародышей', находящихся на разных стадиях развития).. Микроскопическое изучение.этого типа каллуса показало, что поляризованные . структуры.имели разные размеры, форму, но один тип организации. Они. состояли из. продолговатых вакуолизированйых .клеток,, .представляющих .собой' сус-пензор, характерный дая зародышей, л группы ыалких меристема-тичвских клеток,:-являющихся эмбриональной областьй диффвренци-рупцегося зародыша".' ;. ' '/V '■'' *'""-V'

.Наиболее благоприятной средой,для индукций эмбриогенеза оказалась среда 0С-2., содержащая 2,2 мг/л " 2,4-Д"-,и'. 1,1 мг/л ВАЛ. На данной .среде до 36% зародышей формировали эмбриогенный каллус.. При повышении концентрации-.регуляторов.роста" в, пита; тнльной сриде наблюдали стшшио процента-образования ' эмбрио-

генного каллуса. Так, на индукционной среде ОС-1 с макросолей, содержащей 2,2 мг/л 2,4-Д и 1,1 мг/л БАП , 21% зародышей формировали эмбриогенный каллус, а при содержании в данной питательной среде 10 мг/л 2,4-Д и 5,0 мг/л БАП, эмбриогенный каллус не образовывался.

Исследуя способность зародышей ели обыкновенной, собранных. в различных регионах России, к образовании эмбриогенного каллуса в культуре ткана можно сказать , что способность зародышей к индукции эмбриогенеза в значительной степени зависела от места сбора семян. Так, семена, собранные в более северных регионах (Архангельская, Вологодская области), тлела больший процент зародышей, способных образовывать эмбриогенный каллус - 20-36%, а семена, собранные в более южных (Московская, Владимирская области) имели низкий процент образования эмбриогенного каллуса - 10-14%. На наш взгляд, одной из возмогших причин этого является то , что сбор семяц происходил в одни и те ¿го календарные сроки независимо от региона, а созревание семян в северных регионах происходит позке, чем в шных. Поэтому зародыши семян из северных регионов не достигали той зрелости, которая била у зародышей из южных регионов.

В связи с этим были проведены эксперименты по изучению влияния степени зрелости семян на способность к соматическому абриогенезу. Оказалось, что незрелые зародыш (сбор в августе 65 дней после опыления) значительно превосходили зрелые зародыши (сбор в октябре, 125 дней после опыления) по способности к образованию эмбриогенного каллуса. Так, на питательной среде, содержащей 2,2. мг/л 2,4-Д и 1,1 мг/л БАП, только 22% зрелых зародышей образовывали • .эмбриогенный каллус, а незрелые зародыши образовывали эмбриогенный каллус, в 37% случаях.

■ После образования эмбриогенный '• каллус, в , конце первого пассажа отделяли от эксплонта и в . дальнейшем культивировали самостоятельно на.среде 0С-2, содержащей сахарозы. В процесса культивирования''. эмбриогенного.,' каллуса'' для ;уменьшения нокротизацки каллуса, проводили чередование•питательных сред, содержащих 1% и 3% сахарозы, что сокращался некротизацию с 21% до 5%..Получив эмбриогенный каллус мы культивировали . его в течение 2-х лет с периодом, су'бкультивировшшя 28 дней. Показано,'что способность эмбриогенного каллуса продуцировать сома- -.тичёскио зародыши не .зависела-от.длительности культивирования эмбриогенного каллуса.

для регенерации соматических зародышей' эмбриогенную кал-лусную ткань переносили на основную питательную среду без регуляторов роста или с добавлением АБК, НУК, ИМК в различных концентрациях.

Анализируя полученные результаты, можно . заключить, что процесс соматического эмбриогенеза в культуре ткани ели состоял из трех этапов: I - индукция эмбриогенного каллуса; 2 -пролиферация эмбриогенного каллуса; 3 - регенерация соматических зародашей и формирование проростков из них. Для индукции и пролиферации эмбриогенного каллуса в культуре ткани зародышей ели наиболее благоприятной питательной средой -была ореда на основе среды Леповре, содержащая I% сахарозы, 2,2 мг/л 2,4-Д и 1,1 мг/л ВАЛ, В качестве исходного материала лучше использовать незрелые зародыши ели. По нашим данным лучше результаты по регенерации соматических зародышей были получены при культивировании эмбриогенного каллуса в течение 21 суток на питательной среде, содержащей I мг/л АБК и I мг/л НУК. Эмбриоген-ный каллус сохранял способность к продуцированию соматических зародышей в течение длительного периода, что позволило проли-ферируидую эмбриогенную каллусную ткань культивировать в течение нескольких лет и постоянно получать проростки ели. Таким образом, показано, что при изменении соотношения и содержания регуляторов роста в питательной среде менялся путь морфогенеза in vitro (органогенез непосредствено в тканях экспланта, органогенез в каллусной ткани, соматический эмбриогенез), то есть экзогенные регуляторы роста являлись индукторами определенных морфогенетических реакций.

Одно из допустимых объяснений действия экзогенных регуляторов роста заключается в следующем: регуляторы роста поглощаются из питательной среда и поступают в ткани эксплантов, где они либо метаболизируются в биологически активные соединения, либо накапливаются без изменений, либо кнактивируются, но так или иначе оказывают влияние на внутренний гормональный баланс, складывающийся'в клетках зародышей. Возможно, экзогенные регуляторы роста, изменяя внутренний гормональный баланс, индуцируют образование каллусных тканей и определенные морфо-генетические процессы.

Для проверки этого предположения нами была проведена серия экспериментов по изучению изменения внутреннего гормонального баланса в тканях изолированных зародышей в связи с соде-

-п-

ржанием в среде тех или иных регуляторов роста и индукцией в соответствии с этим адвентивного органогенеза или соматического эмбриогенеза.

Изменение содержания фитогормонов при индукции адвентивного органогенеза. Для индукции органогенеза в питательную среду добавляли тидиазурон в концентрации - 0,01 мг/л и ИУК в концентрации - 0,01 мг/л. Выбор тидиазурона определялся тем, что это вещество, являясь производным тиомочевины и обладая хорошо выраженным цитокининовым эффектом, тем не менее не вступало в перекрёстные реакции с антисыворотками, полученными к цитокининам.

Измерение содержания фитогормонов проводили в следующих точках: 0 •- изолированные зародыши до посадки на питательную среду; I - зародыши после Б дней культивирования на индукционной питательйой среде. Зародыши к этому времени еще не приобрели детерминированного состояния, адвентивные почки не начали закладываться и зародыши были не чувствительны к экзогенным гормональным стимулам; 2 - зародыши после 12 дней культивирования. К 12 дню ткани культивируемых зародышей приобретали под воздействием регуляторов роста детерминированное состояние, происходило образование меристематических очагов, из которых дифференцировались адвентивные почт, которые в течение этого этапа были не способны к росту и к элонгации; 3- зародыши в конце первого субкультивировашш (28 сут.}.

Во время пересадки на среду без горюнов .отбиралось несколько типов зародышей: 3-а - зародыши, составляющие основную группу, для которых было характерно образование органогенного каллуса; З-б - зародыш, не образующие каллуса, но в тканях которых дифференцировались адвентивные почки; 3-в - зародыш неразвивающиеся, темнеющие и некротизиррдао при дальнейшем культивировании.

Данные иммунофврмэнтного анализа фитогормонов представлены в табл.4.

Изменение "содержания ИУК. В перше 12 дней культивирова-'. ния, когда происходила детерминация развития и начальные процессы дифференциации, наблюдалось резкое возрастание уровня ИУК. До конца первого субкультивирования уровень ИУК оставался на высоком уровне, затем, при переносе на бозгормональную сроду, где наблюдался рост побегов, уровень ИУК постепенно снижался. В том случае, когда зародыши формировали-только ■ вдвен-

-ак-

тивные почки минуя каллусогенез, содержание ИУК было значительно выше (в 2 раза) по сравнению с первым типом эксплвнтов. У зародышей, которые не развивались и у которых не наблюдалось никаких морфогенетических процессов, уровень ИУК был наивысшим, превышая содержаще ИУК в тканях растущих зародышей в 10-20 раз.

Таблица - 4.

Изменение уровня эндогенных фитогормонов в процессе индукции органогенеза у зародышей ели обыкновенной в культуре ткани на питательной среде, содернащей тидиазурон и ИУК.

Точка измерения г Содержание фитогормонов в нг на I гр. веса сухого

г ИУК АБК ' Зевтин+зеа-тин-рибозид Г 2иП+ИПА

0 г 82,5-1,8 ' 163,5-1,2 ' 109-8,I ' ' 4,2± 0,8

I 1275± 64,5 20,7±3,8 4868±78,8 4,5± 1.2

2 13812±401,2 517,5-60,7 8610-416,0 1250 ±11,4

3-а 12461-359,8 322,5±41,3 9829^595,8 1036 - 5,8

З-б 28855^1420 321,0-28,4 9774±341,0 795 ± 4,2

з-в 279082^5420 616,6^28,4 5668± 26,7 666, 8,4

Изменение__содержания АБК. Интактные зародыши имели высокое содержание эндогенной АБК (163 нг/г сухого веса), в течение первых б дней наблюдалось резкое 5-6 кратное снижение содержания АБК, затем опять значительное возрастание и до конца субкультивирования в тканях поддергивался высокий уровень АБК. При культивировании на безгормоналыюй среде, где происходил рост побегов, уровень АБК опять падвл. В тех случаях, когда зародыши были не способны к морфогенезу, содержание АБК было высоким.

Изменение содержания цитокининов ряда изопэнтеяиладенина и ряда зеатина: В течение первых двух недель культивирования происходило линейное возрастание содержания цитокининов, высокий уровень поддергивался в тканях эксплантов в течение всего периода субкультивирования.

По нашему мнению, цитокинины в процессе органогенеза имеют первостепеное значение, так как экспланты, способные образовывать адвентивные почки как через каллус, так и непосредст-

венно в тканях эксплантов, имели одинаковый высокий уровень эндогенных цитокининов. На процесс каллусогенеза основное влияние оказывал уровень эндогенного АБК и ИУК, резкое увеличение содержания этих фитогормонов в тканях приводило к ингибирова-нию как каллусогенеза, так и органогенеза.

Содержание фитогормонов при индукции соматического эмбриогенеза. Измерение внутренних фитогормонов в процессе индукции соматического эмбриогенеза проводили: О-в изолированных зародышах после стерилизации и выдерживания в течение 20 часов в стерильной воде; I - в зародышах после 5 дней культивирования, когда еще никаких видимых изменений не происходило; 2-а - в зародышах с начавшимся образовываться эмбриогенным каллусом. Тек как к 15 да» культивирования визуально можно было отличить зародыши способные к образованию вмбриогенного каллуса, было проанализировано содержание гормонов в зародышах, не образующих эмбриогешшй каллус (2-6); 3 - в зародышах, не образовавшие вмбриогенного каллуса после 28 дней культивирования (конец пассажа); 4 - в эмбриогегаом каллусе.

Результаты анализов представлены в табл.5.

Таблица - Б.

Изменение уровня внутренних фитогормонов в процессе индукции соматического эмбриогенеза у зародышей ели в культуре ткани на питательной среде, содержащей 2,4-Д и БАИ.

-г---

Точка Содержание фитогормонов в нг на I гр сухого веса

ИЗМ9— -1--Г-ц-

реши? ИУК АБК Зеатин+зэатин 2нП + Ш1А

рибозид

0 ! 82,5-1,8Г 163,5*1,2' 109*8,1' 4,2*0,8

I 1982-201,4 127,4*2,8 7402*194 4300* 121

2-а 99400*11217 2638 *21,2 10505*167 65304*3103

2-6 15658*308,6 1454 *П,3 12094*267 68902*6960

3 27000*800 874 * 5,6 8816* 12 62840*3211

4 74,0*26 1241*109 4256*272 1029* 117

МУК: Уке через Б дней культивирования зародышей в условиях, стимулирующих образование эмбриогешюго каллуса, происходило постепенное возрастание содержания ИУК, к 15 дню уровень ИУК превосходил исходный уровень более чем в 1000 раз. При сравнении же зародышей, образовавших эмбриогешшй каллус, с теми, которые но образовывали ого, оказалось, что в первом

случае зародаш содержали в 5-6 раз больше ИУК. В самом ке эмбриогешом каллусе содержание ИУК было невысоким и соответствовало исходному уровню в зародышах до посадки в условия m

vitro.

АБК. Анализ содержания АБН показал, что в первые 5 дней содержание АБК в тканях зародышей падвло, в'последующий временной интервал (5-15 сутки) происходило увеличение ее уровня, затем вновь уменьшение. При сравнении зародышей, образовавших и не образовавших эмбриогенный каллус, оказалось, что в первом случае содержание АБК превышало более чем в 2 раза. В собственно эмбриогенном каллусе наблюдался достаточно высокий уровень АБК, составляющий примерно 1241 нг на I г сухого веса.

Природные цитокинины. Содержание цитокининов группы зеа-тина возрастало в первые 5 дней с момента введения в' культуру in vitro, а затем в течение всего периода субкультивирования существенно не менялось. Что касается цитокининов группы изо-пентениладенина, то в первые 5 дней наблюдалось также возрастание их уровня, в последующий временной интервал произошло резкое увеличение их уровня, превышающий уровень цитокининов на 5 день культивирования более чем в 30 раз. При дальнейшем суОкультивировании этот высокий уровень цитокининов группы 2иП сохранялся. Таким образом, при культивировании зародышей- на среде с 1Д мг/л БАП происходило резкое возрастание уровня цитокининов группы ИПА.

Сравнивая мевду собой изменение внутреннего содержания гормонов при культивировании изолированных зародышей в условиях, стимулирующих адвентивный, органогенез или соматический эмбриогенез, необходимо, в первую очередь отметить однонаправленность происходящих изменений: при адвентивном органогенезе и соматическом эмбриогенезе наблюдалось увеличение содержания всех груш фитогормонов. В целом, на наш взгляд, это достаточно закономерно: присутствие в питательной среда экзогенных регуляторов роста цитокининового и ауксинового типов действия, с одной стороны, могут увеличивать пул внутренних фитогормонов, а с другой стороны, вызвать изменение физиологического состояния зародышей, когда они-из состояния покоя под воздействием культивирования in vitro переходят к активным ростовыг,1 процессам, в результате чего активируются собственные биосинтетические функции и увеличивается пул эндогенных фитогормонов. Что касается АБК, то в обоих случаях происходило вначале

-и-

;к 5 дню культивирования) резкое уменьшение, затем возрастание гровня, причем эмбриогенный каллус содержал в 2 раза больше ШК, чем неэмбриогенный каллус и в 3 раза больше,"чем органогенный. Интересно отметить, что возросший уровень АБК не препятствовал и не тормозил индукцию морфогенеза и его реализа-

Специфичность изменения внутреннего гормонального баланса 1ри соматическом эмбриогенезе заключалась в следующем: значительно большее содержание АБК, увеличение уровня цитокининов ■руппы изопэнтениладенина и характерное линейное возрастание юдернания ИУК в процессе культивирования.

Таким образом, получены данные о существовании больших зазличий в содержании фитогормонов мевду зародышами, способин-образовывать эмбриогенный каллус и зародышами не образующи-щ эмбриогенный каллус, а такие мевду эмбриогенным каллусом и :амкш зародышами, мазду органогенным и не способны!«! к орга-югенэзу каллусами, которые подтвердили предположение о боль-юй роли складывающегося гормонального баланса в индукции морфогенеза in vitro и особой роли чувствительности тканей заро-щшей к регулятором роста, которая определяет его компетент-юсть и готовность воспринимать экзогенный сигнал и реагиро-¡ать на него определенным образом.- .

Выводы

иизучвш морфогенетичеише потенции культивируемых за-юдьгагай ели. Впервые установлена корреляция мевду эффактивнос-,'ью адвентивного органогенеза и генетически детерлшпровашюй формой ветвления кроны родительского дерева. Зародыши из со-шн, собранных с деревьев с четко внракенной мутовчатостью :рош, отличаются более высоким потенциалом к морфогенезу (в ¡-3 раза) по сравнении с зародышами из семян, собранных от ;еревьев с невыраженной мутовчатостью. Это позволяет рекомендовать для использования в клональном микроразмнояенш семена >т деревьев с четко выраженной мутовчатостью, что позволит :оздать быстрорастущие насавдения, так как деревья, относящие-!Я к данной груше, обладают высокой скоростью роста и высоким гровнем плодоношения.

2 Существует обратная корреляция мевду способностью оксп-шнта к морфогенезу и возрастом родительского растают: с уво-шчшшам возраста происходит резкое снижение морфогенотичоских ютонцнй и жизнеспособности культивируемых эксшшнтоп. ltoCMOT-

ря на высокий морфогенетический потенциал зародышей (способность к каллусообразованию, адвентивному органогенезу, соматическому эмбриогенезу), экспланты уже с 5-ти летних саженцев некротизировали и погибали в течение 1-2 месяцев после посадки.

3)Способность изолированных зародышей ели к соматическому эмбриогенезу зависит от. степени зрелости семян. Незрелые зародыши (65 дней после опыления) образуют эмбриогенный каллус в 375Ь случаев, а зрелые (125 дней после опыления) - в 22% случаях.

4)Культивирование вегетативных почек на питательной среде, обогащенной кинетином и лимонной кислотой, повышает низ-неспособность почек и обеспечивает рост пазушных меристем и дифференциацию адвентивных почек.

5)Показана зависимость морфогенеза зародышей от содержания регуляторов роста в питательной среде: зеатин и тидиазурон индуцировали адвентивный органогенез, БАЛ в сочетании с 2,4-Д - соматический эмбриогенез, отсутствие в питательной среде регуляторов роста приводило к формированию проростка.

6)Индукция, осуществляемая регуляторами роста, приводит к изменению состояния клеток и тканей зародыша и возникновению детерминированного состояния, характеризующегося тем, что уке независимо от присутствия в среде индуктора происходит процесс адвентивного органогенеза. Природные цитокинины (зеатин, 2нП) индуцировали детерминированное состояние у первичного каллуса и тканей зародышей в течение 4 дней, тогда как тидиазурон в течение 7 дней.

7)Высокая концентрация регуляторов роста цитокшпшового типа действия вызывает некротизацию культивируемых эксплантов и каллусов, снижает интенсивность адвентивного органогенеза. Это связано с накоплением фитогормонов в культивируемых тканях выше необходимого физиологического уровня, что, по-видимому, оказывает токсичное действие.

8)0собенность изменения внутреннего гормонального баланса при соматическом эмбриогенезе заключается в значительно большем содержании АБК, в увеличении уровня цитокиншюв группы изс пентениладенина и в линейном возрастании содержания ИУК в процессе культивирования. При индукции органогенеза на среде с тидиазуроном происходит увеличение содержания эндогенных цито-кининов, ИУК, уронень эндогенной АБК в первые дни сшшаетоя.

-zi-

затем увеличивался.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации. .

1. Хмара К.А.Катаева Н.В. Влияние форм ели обыкновенной по степени выраженности мутовчатостн на органогенетическую способность их потомства в культуре ткани. // Материалы отчетной сессии по итогам научно-исследовательских работ за 1989 год, Архангельск I990,c.8-II.

2. Хмара К.А. Влияние фитогормонов на образование адвентивных'почек в культуре ткани ели обыкновенной. // 4 всесоюзная конференция молодых ученых по физиологии растительной клетки.-, Минск, 16-20 апреля 1990 г, стр.72, Москва 1990.

3. Хмара К.А..Катаева Н.В. Влияние фитогормонов на развита почек ели обыкновенной в культуре ткани. // Селекция и земеноводство хвойных пород на европейском севере., Архангельск, 1990,с.61-67.

4. »/ара К.А,Катаева Н.В. Влияние генотипа материнского растения и веществ цитокшпшового типа действия на способность гканей зародаша ели обыкновенной к органогенезу in vitro. // Ризиология растений, 1993,т.29,N.6 ,о.802^805.

I