Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Гольфитогормо... в развитии побегов яблони in vitro

ВАК РФ 03.00.12, Физиология и биохимия растений

Автореферат диссертации по теме "Гольфитогормо... в развитии побегов яблони in vitro"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УПИВЕИЛПЕТ

им. налошносовл

БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ

Ш правах рукописи

АЛЕКСАНДРОВА Ирина Георгиевна

ГОЛЬ<РитогаРМСЯОГ, £> РАЗВИТИИ ПОБЕГОВ ЯБЛОНИ IV о (03.00.12. - физиолог;^ растений)

АВТОРЕФЕРАТ диссертаций яа соискание ученой степе; кандидата биологических наук

Иэсква - 1$92

Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Ордена Трудового ¡фасного Знацеш: Института физиолога1 ¿»ете-шй iiu IL А. Тимирязева АН ОССР.

Научный руководитель

-кандидат биологических наук IL Е Катаева

Официальные оппоненты

-доктор биологических наук X. А. Цауриня -доктор биологических наук а И. Кефели

Ведущая организация - Главный ботанический сад ЛИ СССР

присуждению ученой степени кандидата биологических иаук К 053 05 14 при Биологическом факультете Московского государст венного университета im. U В. Лэыоносова по адресу: Москва 119899 Ленинские горы, Биологический факультет МГУ.

♦Автореферат разослан " " декабря 1991г.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке биологического факультета МГУ. :

Ученый секретарь Специализированного

совета, к. б. н. Полесская О. Г.

Защита диссертации состоится " в _час. на заседании Cnei

[шого совета по

►

... Актуальность проблемы .

..... Быстрое размножение древесных пород растений является необхо-

имым как для научных исследований, так и для практического :спользования. Выведение новых сортов древесных плановых видов (астений требует их быстрого внедрения в практику. Шкроюшальное (азмпожение является методом, который позволяет за короткий срок юлучить большое количество высококачественного безвкрусного поса-¡очного материала, генетически идентичного материнскому растению. Однако, при шкроразшожешш многих видов древесных растений про-юходит формирование физиологически аномальных побегов, что пре-штствует широкомасштабному использованию этого метода. Изучение ¿орфофизиологкческих особенностей аномальных побегов, причин возникновения аномалий, способов .их избежания позволит не только пропить свет на процессы, происходящие в различных органах растений, во и решить проблемы, возникающие на кавдом этапе шкроклонального рав'ыноженир. Большой интерес вызывает изучение роли экзогенных регуляторов роста гормональной природы, использующихся на различных этапах микроразинолюния, на процесс инициации аномалий. Выявление влияния экзогенных регуляторов роста на внутренний гормонагный баланс культивируемых побеге , а также изучение поглоезэния и метаболизма экзогенного регулятора роста, использующегося нг этапе размножения, (БЛП) позволит приблизиться к пониманию причин возникновения аномалий, а также разработать способы их устранения или избежания.

Цель и задачи исследования.

Основной ц&лью настоявшей работы было изучить особенности роста и развития побегов яблони при клонально» микроразмножении и участие экзогенных и эндогенных фитогормонов в регуляции ростовых процессов. Для этого необходимо было решить следующие задачи:

- изучить влияние различных регуляторов роста на процесса пролиферации паэушых побегов и угареняемости побегов яблони in vitro

- определить основные морфофизиологаческие особенности развития витрификации и апикальных некрозов

- провести сравнительное изучение внутреннего гормонального баланса у нитрифицированных побегов, побегов4с апикальными/некрозами и нормальных "обегов, воздействие н^ внутреннее содержание фитогормонов экзогенных регуляторов роста

- изучить особенности поглощения и метаболизма экэоге;гио добавленного БАЛ в побегах яблони в процессе мшрораамножвдия.

Научная новизна

Дани морфофизшлогические характеристики витрификации и апикального некроза, возникающих при микроклональном размножении по-Оегов яблони. Обнаружено, что основной причиной формирования аномальных побегов является избыток или недостаток щггогашина в питательной среде, что, в свою очередь, определяет нарушение внутреннего гормонального баланса побегов. Изучены процессы поглощения и метаболизма экзогенного цитошшна ( БАП ) в побегах яблони сортр "Ейшое" '. Показано, что зкзогенно добавленный

цитогашин поглошается культивируемыми побега!,ш с высокой скорость» и быстро метаболизируется, давая ряд метаболитов. Бее части побегг накапливают ВАЛ и его метаболиты.> Определена таганка предотвращэ-иия появления аномальных побегов.

Практическая ценность.

Применен метод иммуиоферментного анализа ( ИФА ) для определения содержания зеатина, зеатин рибозида, шзопентениладешша изопеитениладенозина, индолилуксусной кислоты, абсцизовой кислот! в побегах яблони in vitro, позволявший определять пикограммовш юэличества фитогормона в образце и проводить серию эксперимент одновременно. Модифицирован метод экстра/аут,. очиспси и разделен«. фитогориоиаз, присутствующих в растительной ткани. Шдифициров метод определения поглощения л метаболизма меченого БАП культиви руемыыи побегами.

Автор - участник ВДНХ СССР. Работа экспонировалась на гшегав ¡jax: "Советская паут и технология" март 1990г. , "Ресуреосбереже ние" 1909г.

Публикации

По теме диссертация опубликовано 11 работ.

Апробация работы

Материалы диссертационной работы докладывались на конферелщ ях: " II Всесоюзная конференция по регуляторам роста и развит* растений" Киев, ыай 1988г., "Ill всесоюзная конференция ыолодь ученых по физиологии растительной клетки" Петрозаводск, anpej 1988г., Мездународная конференция "Биология культивируемых клетс и биотехнология" Новосибирск, 1988г., "У Международный симпози; молодых ученых по регуляции метаболизма растений" Болгария, Варнг октябрь 1990г. и iia ежегодных сеыинарах Отдела биологии клетки биотехнологии ИФР АН СССР. *

Структура диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспер

! «

енталыюЯ части, зщшзчения, выводов и приложения. Содержит 130 ¡границ машинописного текста, 5 рисунков,10 таблиц, 7 графиков. Зписок литературы содержа 187 наименований.

МАТЕРИАЛЫ И ШОДИ ИССЛЕДОВАНИЯ

В работе использовали культивируемые in vitro побеги яблони :opT(f "Южное" , полученные из верхушек побе-

гов взрослых 25-летних деревьев. Побеги в течение нескольких лет ( юрт "Южное" с 1983 года, .) культи-

вировали на различных питательных средах с целью микроразмножешт. 1пительность субкультивирования составляла 1 месяц.

В экспериментах использовали верхние части культивируемых по-Зегов, состояние из 2-3 х междоузлий и 3-4 х листовых пластинок. В состав питательных сред входили минеральные элементы по прописи курасиге и Скуга ( Ш ) ( J&jrashtge, SKoog, 1062 ),■ сахароза 1%, агар 0,72. _ В зависимости Ьт условий и задач опытов в питательные среды добавляли различные сочетания витаминов и регуляторов роста

Определение содержания фктогормонов в побегах

Изучал!! содержание зеат"ча, зеатина рибозида, изопентениладе-mnia, изопентениладенозина, ^ядолил-З-уксусной кислоты, абс юовой кислоты в аномальных и нормальных побегах, культивируемых на средах с различны»,я сочетаниями регуляторов роста. Определение проводили с помощью иммуноферментного анализа ( 1№А ).

Были сняты основные параметры метода, а именно: определены титры антисывороток для анализа гсадого фитогорыона, разведение фермента, неспецифическое связывание фермента, количество гормона, необходимого для подавления активности ЩФ, лин^ная область определения гормонов, количество гормона, подавляющего на 50% ферментную реакцию.

Были проведены перекрестные реакции полученных аптис^воротик с соединениями, близкими по химическому строеникх

Эстракция фитогормонов и очистка экстрактов

Фитогормоны экстрагировали BOX метиловым спиртом. Для очистки растительных экстрактов использовали 2 метода: а) экстракты ' пропускали с помощью одноразового пластикового шрица через предко-лонки, заполненные обращенной фазой с-18 "Йорагоп", после; чего обесцвеченный экстракт делили на 2 части: одна - мля определения ИУК и АБК, другая - определения цитокининов; ' б) несчитанные экстракты делили на 2 части: для определения цитокининов раетитель-

иий экстракт подкисляли до рН 2,5 -3, наносили на небольшую колоше, 30x5 мы, заполненную смолой "Дауэкс"(50х Ш); колонку многократн промывали 802 метанолом, дистиллированной водой, цитокинины элшро вали с колонки 10 мл 5М N¡¡4011; для определения ЛУК и АВК расти тельный экстракт выпаривали под вакуумом, при температуре 30° С д водного остатка, перевода его в 0,1 Ы фосфатный буфер рН 8,3 8,5 и наносили на колонку размером 30x5 ым, заполненную адсорбенте "Паликлар АТ". Гормоны эдшровали 50 мл этого же фосфатного буфе ра. Дале гормоны экстрагировали из фосфатного буфера 3 раза диэ типовым эфиром, затеи выпаривали под вакуумом досуха при 25° С растворяли в 0,5 ил СШОН,метилировали свежеприготовленным диаза метаном и выпаривали на роторном испарителе. Сухой остаток раство ряли в 0,1 мл СИзОН.

Шсле экстракции и очистки любым из вышеуказанных метода разделение фитогорыонов проводили с помощью тонкослойной хроматог рафии ( "ГСХ ) на пластинках "БЦиГоГЧ система для разделения цитс кининов: Суганол-1:14» аммиак: вода-б: 1:2; для разделения ПУК и АЕ хлороформ: уксусная кислога-95: 5). "ГСХ позволяло достоверно разде лить зеатин, зеагин рибозвд, изопентениладенин, изопентеншшденс эти индолилуксусную кислоту, абсцизовую кислоту.

Получение антител

Иммунные сыворотки против ФГ получили иммунизацией кролике конъюгатами бычьего сывороточного альбушна ( БСА ) с ФГ. Конъюгг ты ЗР-БСА и ИПА-ВСА получалм методом периодатного окисления по ьк тодике* Эрлаягера и Бейсера в модификации Вайлера. Конгвгач ИУК-БСА и АЕК-БСА готов1Ш1 на основе получения смешанного ангидру да по методике Вайлера Конъвгати вводил]! внутримышечно по опреде ленной схеме. Сракци» иммуноглобулинов из антисыворотки пoлyчaJ осааденлем сухим сульфатом атония.

Процедура ИФА

Шлистироловые планшеты сенсибилизировали в течение но» раствором антител в гвдрокарбонате'натрия (рН 9,5-9,7) при 4°С. каждую лунку вносили по 200 мкл соответствующей антисыворотга * После сенсибилизации планшеты трижды промигали ТБС в течение 1 шн,в каадув лунку вносили по 200 мел 0,1% .ДА в ТБС и инкубировг ли 30 мин при 37°С (кроме вариантов,в которых проводил! определ« ние ИУК и АБК). За зм планшеты промывали,как укааано выше,в луш вносили по 50 мкл стандартного раствора гормона или растительно) экстракта с неизвестным содержанием ФГ, перемешивали 1 мин и инк; Сировали 1 час. В ИФА для определения цитокининов - температу] инкубации 37вС,а для определения ИУК и АБК - 18-22" С. Через 1 чг

в инкубационную смесь добавляли по ISO мкл соответствующего конъ-югата щелочная фосфатаза (ЩФ) -гормон, перемешивали 1 каш и инкубировали 1 час в тех л» условиях. Планшеты промывали так де.как указано выше,но в ТБС добавляли 0,01%детергента Тритон X-IT), заполняли 200 мкл субстрата (п-нитрофенилфосфат 1 мг/мя в гидрокарбонате натрия,рЯ 9,5-9,7),инкубировали 1 час при 37°С. Реакцию останавливали, добавляя в каждую лунку по 50 мкл 5N КОИ Оптическу» плотность продукта реакции измеряли при 405 им на спектрофотометре "Mil tí scan !.СС* фирмы "Flow".

В соответствии с методикой Родбарда строили калибровочные кривые, после чего определяли содержание фитогормонов в образце.

Изучение поглощения и метаболизма С-14 БАП

В питательную среду добавляли БАП в концентрации 1 мг/л. В обпем количестве БАП содержание меченого С-14 БАЛ ( агаивность 242 mkCí/mt, производство фирмы "Am>rsham") составляло 18,5 KBq на. 5 мл питательной среды. Длительность субкультивирования составила 28 ' дней. Анализы проводили в 1, 3, 6, 12, 28 дни от начала субкульти- • вирования. Исследовали содержание метаболитов в апикальной по"ке, стебле, листьях. Определяли содержание метки в растворимой части н осадке каждого органа. Диализ распределения радиоактивных с единений проводили на приборе "Rita 3200" ФРГ.

РЕЗУЛЬТАТЫ II ОБСУЖДЕНИЕ

При изучении процесс размножения микропобегов яблони казалось, что все испытанные регуляторы роста (БАП, ДРОП, ДПХ) в определенном интервале концентраций стимулировали развитие пазусных меристем. В среднем на 1 микрочеренок к концу иного периода субкультивирования формировалось 3 пазушных побега. Оптимальные концентрации составили: БАП - 1 мг/л, ДРОП и ДПХ - 0,01 мг/л. Ш 1-шим и литературным данным использование БАП в концентрации 1 мг/л дает наиболее высокий коэффициент пролиферации пазушных побегов. Так, высота формируемых побегов составляла 1,9¿0,0? см, а количество пазушных побегов на гаищиаль - 3,8+0,2. Однако, проведение серии многократных субкультивирований на средах, обогащенных БАП в концентрации 1 мг/л, приводило к формированию верифицированных

побегов. ^ /

i *

Показано (табл.1), что наибольпее количество верифицированных побегов появлялось при совместном действии дв>х анализируемых факторов, а именно при введении в питательную среду высх^у доз фитогормонов (БАП 5 мг/л и НУК 1 мг/л) и при укупорке культиваци-

онных сосудов штериалоы, шло пропускании влагу (ашашиевая фольга), что способствовало увеличению относительной влажности воздуха в сосуде. Результаты нашего исследования показали, что в отсутствие цитокининов в питательной среде повышение относительной влажности воздуха в культивационном сосуде м присутствие экзогенного ауксина не оказывало эффекта на появление аномальных побегов.

Табл. 1. Развитие витрификации в зависимости от способа укупорки сосудов и гормонального состава среды

• Способ Количество витриф. побегов.X

укупорки^——

■-"""Термов БАП (иг/л) О 1 0 1 5

ПУК (иг/л) 0 0 1 1 1

1. ватно-шрлевые пробки О 5-7 0 15-17 40-45

2. алюминиевая фольга О 10-15 0-5 25-30 70-77

Верифицированные побеги имели в значительной степени укороченный и утолщенный стебель, апикальное - доминирование практически отсутствовало, в связи с чей растение приобретало кустообразную форму, где основной стебель был не виден. Полярность роста пазушных побегов нарушалась, и рост боковых побегов был направлен в разные стороны. Избеги приобретали уродливую форму, становились стеклообразными и водянистыми, происходило образование листоподоб-цых утолщенных структур, которые имели недоразвитую скрученную форму. Растения становились хрупкими и ломкими. Микроскопические исследования анатомических срезов апикальных почек верифицированных побегов выявили нарушения цитогистологической вокальности апексов. • Количество слоев меристематических клеток в апикальной зоне было значительно редуцировано, а субаяикальная зона была представлена увеличенными и вакуолизированныш клетями. Проводящие ткани почек верифицированных побегов были недоразвиты, а в ряде случаев присутствовали лишь отдельные фрагменты сосудов. Аяа-' тонические срезы листьев витрифицированиых побегов показали, что 1сдетки мезофилла сильно увеличены, и, кроь,„- того, происходило образование больших межклеточных пространств. В большинстве случаев срезы верифицированных листьев имели У-образную форму, что являлось следствием скрученности листьев вдоль продольной оси.

Бри изучении поглощен»« и метаболизма С-14 БАП культивируемыми побегами показано, что общее количество метки в побеге на протяжении цикла су культивирования увеличивалось с линейной ско-

остып, скорости нарастшии печеных соедшкшй в побеге и ужепзик-ия в среде были практически одинаковым как в начале пассата» так в конце. Замедление погякзрпга БЛП пабадаог метоу 3 н 6 дата от ачала пассата. К 28-ому дкю субкультизираванкг в побег-т садажа-¡ось в средней 4Ш8 меченых соеданепиЗ в расчете от птагш» начения среди. В то хв врет количество радиоактивны* соедзгаеззй» ¡рисутствухвдос в пптатсгьпоЛ среде» ссстззязгп в среда» сот ¡ачалыгого значения срэды. Что касается зезчеяиз сггжэ екчеякз: -»единений, содеркапгясн в какдиЗ контрольгпй1 дет» в ппбйге гагпга-шзовшшой среде, то его уровень составлял 75-С5Х от пгуцдццгаггтг-юго значешш среда К! в один га гоптрсшЕцг дней, в тс» чппда ш шрвый, зга су>?.!3 по достигала 1003, -прхгчегг опредглэнгса ззлиш-юети вариаций се зпачогаш от д и субкралтагирссгаяя та саззпэ е£пе-зуяеио (граф. 1).

<3 Граф;. '1. Скорость парасташя галтагстаз кэтешиг есгдаялптЯ и Ц* ■ . уиепьгэпиа в средз в течстэ еубк^гкпцнфования!

ео

го

4 } € 12. 25 Д«га оЛ^ьг,

Грз$. 2~ Старость ггчасташтз ЮЕтастаа иачешлс соедтпткий! а зкстрагируетй часта и осадке аггетлзгаЗ ЕсгагскСсзьт.)),. сзггб>-Л£(ст.)» л;;сте(л) в течение субкультотЕрогагет.

г*гстг. (тмхгг «сад.висг

ЭКСТ. Д1Т.ГТ, ссаи.кгу.п.

< > < 12, 25 су&су/ыь >

При изучении дичашвш иакгшепкз шчбеш?- соединений в1 экстрагируемой части и осадке апикальной почки, стебля! и: листве® обтопу-жено, что абсолютное содержание радиоантеннах соединений «а^сталп. «ад всех анализируемых частях & течет:е циклы субкультиЕирования.

Однако, все кривые, отражающие зависимость накопления метки от дня субкультивирования, имеют участок прямой между 3 и 6 днем, практически параллельный оси абсцисс, В каждый контрольный день изучения количество меченых соединений в экстрагируемой части органа всегде было больше этого аначешя в осажденной части. Так, для апикально{ почки значение метки в метаяольном экстракте превышало эту величину для неэкстрагируемой части в среднем в 1,5 раза, для стебл5 разница составляла 3-4 раза, для листьев - 3-4 раза (граф.2).

Суммарное количество меченых соединений, приходящихся на единицу сухого веса каждого анализируемого органа, в течение цикл; субкультивирования значительно увеличивалось. В каждый из дне! анализа количество радиоактивных соединений в стебле было значительно выше, чем в апикальной почке и листьях. В стебле содержали* метки составляло 6(Н5Х от количества в единице сухого веса побега

Кроме изучения абсолютного накопления метки в этих трех органах растений, нас интересовал метаболизм экзогенного БАП и изучение накопления разнообразных соединений. Постольку при автоклав» ровании не происходило разрушения БАП, присутствие раз-

нообразных соединений в органах растения является следствием вов лечения • экзогенного цитокинина в процесс жизнедеятельности расти тельного организма. Показано, что метаболизм меченого ВАЛ иде-очень активно. Так, уд® в первый день анализа в апикальной почке стебле и листьях был обнаружен комплекс метаболитов, значительв отличающихся по Rf между собой. Соединения, соответствующие по R яуклеотиду БАП, глшозиду ВАЛ, аденоэину, БАП-рибозиду, аденину были зарегистрированы во всех частях побега во все дни анализа включая первьй£табп.2Л.

Абсолютное содержание анализируемых соединений в "апикалыю почке, стебле и листьях значительно увеличивалось к 2В дню суб культивирования. , Показано, что наибольшее количество сое

динений, соответствующих по Rf нуклеотиду БАП, после б-oro дн пассажа аккумулировалось в-стебле, причем к 28 дню по сравнению первыми днями содержание увеличилось в 30 раз. Количество гдкжозп * да БАП значительно нарастало в стебле и листьях к 28 дню. К кони цикла количество аденина и аденозина нарастало в стеблевом листовом экстрактах. Что Касается БАП-рибозада, то его количеств увеличивалось во вс«х трех анализируемых частях побега, и к кош цикла его содержание в листьях было незначительно выше, чем в апу калькой почке и стебле. Количественное содержание БАП к кош пассажа значительно отличалось в анализируемых частях побега таи

что наибольше количество аккуко^ировалось в скс.:,'з, в листе содержалось 50Z от количества в стебле, а в апикальной почке соответственно - 3QZ.

Т.о., показано, что поглощение и метаболизм БАЛ s культивируем побегах яблони сорт?: "Южное" ~ идет с высокой скоростью. Так, уже в первый день анализа во всех анализируемых частях побега обнаружен комплекс метаболитов. ■ В то же Бремя на протяжении цикла происходит аккумулирование свободного БАЕ Тот факт, что наибольшее количество метаболитов и БАЛ обнаручсено в стебле, объясняется, по-видимому, тем, что значительная часть этих соединений накапливается в базальной части побега, что вызывает формирование каллуса и рост адвентивных побегов. Данное предположение было подтверждено одним экспериментом, где нами было обнаружено, что 70% метки от содержащейся в побеге находилось в нижней части растения.

Тот факт, что витрификация У культивируемых in vitro побегов яблони развивалась только на среде с экзогенным цитокинином, позволил нам сделать предположение о том, что таким образом оказывается влияние и на статус биосинтезируемых фитогорыонов, в иерзую очередь, цитокининов. При проведении исследований по поглощению и метаболизму>0-14 БАЛ, был обнаружен комплекс метаболитов ( в том числе аденин и аденозин ), и можно предположить их возможное участие в синтезе ряда соединений, в том числе и цитокининов. Кроме того, такие свойства витрифмцированных побегов, Kai« отсутствие апикального доминирования и отсутствие ризогенеэа, являются непрямыми доказательствами накопления в тканях большого количества ци-тогашинов. Количественные значения фитогормоков в побегах со среды с ДРОП можно считать эндогенными, так как не было поступления в побеги извне соединений пуринового ряда, в то время как производные тиомочевины не реагировали с антителами, полученными к 3 и Ш1А. Причем, следует отметить, что для определения гормонального статуса растений наш отбирались верифицированные побеги, имеющие описанные выше аномальные морфологические и анатомические характеристики, и нормальные, побеги.

- 12 -

Табл. 2 • Процентное содержание соединений в мстаиолыюм экстракте

апикальной почки (ал.п.), стебля (ст.). листа (л.) в определенные дни анализа от общей суммы меченых соединений

Содержание соединений в метвиольных экстрактах п. п., ст., л., X от общего содержания в экстракте

день 1'3 6 12 28

орган! ап. п. ст. л. I ап.п. ст. л. I ал. п. ст. л. I ап. п. ст. л. 1 ал. п. ст. л.

* Н i 8i2 6*1 5*1 I 5*2 5*1 8+2 ! Oil 0±2 5*2 I 8t2 2*1 3+2 I 4*1 35*5 3*1

, Г I 8*3 1+1 1*1 I 5+1 Б±2 8±3 I 5*2 10±3 5*1 I 5*2 4*2 0±2 I 8i2 17±4 5±1

A3 I 8*2 6±1 5*2 I 6*2 5±3 10±3 I 1+1 5*2 5±1 I 2*1 4*2 3*1 I 4*1 8*3 3*1

AH I 8*3 7*3 1*1 I 5*3 5±1 8+2 1 5+2 4+2 5±3 I 5*1 4*1 6*3 1 4±2 2*1 5*2

BP . I 1*1. 6*2 6*2 I 5*2 10*4 8*1 I 6*2 5+1 1*1 I 2*1 4+2 3*1 I 8*3 2*1 5*2

БА I 15*5 12*3 12*3 I 10*3 10±3 16*4 I 12*3 10+4 12±3 I 8*2 15+4 9+3 I 8+2 11*3 20*4

* где H - нуклеотиды, Г - глхкозиды, Аз - вденозин, Ан - еденин, БР - БАП рибозид, БА - ВАЛ

Табл.3. Внутреннее содержание фитогорконов в верифицированных и нормальных побегах яблони

шределение Содержание Фитогормонов нг/г сухого веса

»бегов --------------------------------------------------

КПЛ 2иП ЗР 3 ИУК АБК

йирифицир. 538+100 339*102 490±199 199±45 985±210 58±28 БАП lf.iT/Л [УК 1мг/л) Ьрмальные

ВАЛ 1 мг/Л 210И59 1б9±68 387*118 155±62 5251315 43110

(УК 1 МГ/Л)

Ьрмальные

ДРОП 0,01мг/л) 119ь70 130144 117±36 189*61 864+125 43*14

Из представленных данних видноСтабл. 3), что содержание трех цитокининов, а именно изопентениладенозина, изопентениладенина и зеатинрибозида, значительно отличалось при сравнении витрифициро- ' ванных побегов и нормальных. Аномальные побеги содержали в 1,2-2 1 раза большее количество ИПА, 2нП, ЗР по сравнению с нормальными растениями, юторые культивировались на той же среде. Концентрации этих же цитокининов в верифицированных побегах по сравнениями с ^ нормальными, растущими на питательной среде с тиадиазуроиом, были вида в 3-4 раза Т. о., экзогенный БАП способствует аккумулированию ' растительны?.«! тканями цитокининов, что является одной из главных причин развития и углубления процесса витрификации. Поэтому для избежания этой аномалии при культивировании яблони использовали чередование питательных сред для субкультивирования. Так,при появлении первых признаков витрификации (оводненность тканей, значительное калдусообразовалие в базадьной части стебля, скрученность листьев) побеги переносили на обедненные по цитокининам, а иногда и безгормоналыше среди. Кроме того, для избежания витрификации в качестве покрытия кульгивациоинш сосудов использовали ватно-марлевые пробки вместо алюминиевой фольги. Есе эти действия в боль- ! шинстве случаев приводили к полной нормализации физиологического состояния и восстановлению жизнеспособности побегов. ■

б. Особенности укоренения побегов яблони сорт({ "Шное"

Бри добавлении ауксина ( 1ШК, ИУК, НУК ) в концентрация: 0,5-1 мг/л и использовании безгормональных сред происходило укоре-ненке побегов. В среднем количество укорененных побегов через 2! дней субкультивирования <1 пассаж) составляло 15 - 202. Побег; формировали 1-2 корня,. лишенных корневых волосков, длина корней : ряде случаев составляла 4-5 см. К концу субкультивирования на сре' дах без цитокининов происходило значительное увеличение длины меж доузлий и размера листовых пластинок, однако пролиферации пазуины побегов на этих питательных средах не наблюдали. В ряде случае происходило утолщение и одревеснение стебля в основании побега Однако, при проведении многократных субкультивирований на безцита кининовых средах с целью увеличения количества укорененных побеге наблюдали постепенное нараст&чие количества побегов с апикальяь некрозом. Первые признаки апикальных некрозов шгао было набладат уже к концу первого месяца субкультизирования на безцитошшновь средах. '

Табл. 4. Количество побегов с апикальными некрозами и сфорш роЕавимх корни на безцитокшшнозых средах поело 3 месяцев культа

Количество взятых Количество побегов Количество укоренен.

побегов, % с апик. некрозам!, % . побегов,%

100 50-60 10-20

следует отметить., . что укоренения побегов с апикальным некр! зом наблюдали в единичных случаях (табл.4). Так, уже к концу не] вого месяца роста на обедненной цитокининами среде в ряде случа наблюдали пожелтение верхушки стебля, подсыхание небольтого кол чества листьев. В течение 2-3 субкультивирований на этой же сре, наблюдал!-! постепенное прекращение апикального роста и активац пазушных меристем. Т. о., если в первом пасса.1® еще наблюдали обр. зование 1-2 боковых побега, то в последующие ветвление прекращ лось полностью.' Кроме того, прекращение ветвления сопровождало! углублением процесса: апикальная почка бурела и засыхала Одновр* менно с этим процессом наблмдали подсыхание, пожелтение или поб. рение и опадение листьев. В ряде случаев происходило полное опад ние листьев, причем апикальная верхушка бьша некротизирована. дальнейшем побурение охватывало весь побег вплоть до базальн чзсти, после чего растение погибало. Т.о., к концу третьего меся

суб!сульт1шф0вашга иа Сезгоршнальной среде теряли до 50-60Х кик-ропобегов яблони. ...

Т.о.. главной причиной появления аномальных побегов с апикальными некрозами, по нашим данным, являлось' обеднение побегов по цитокишшам в случае побегов без корней. По всей видимости, кеуко-ренешше побеги не обладали достаточной способностью биосинтезиро-вать необходимый комплекс регуляторов роста, что оказывало непосредственное влияние на дальнейвуо жизнедеятельность организма. •

Т- 1С- в качестве главной причины возникновения и даяьнейсего развития апикальных некрозов, по нашим данным, являлось отсутствие в питательной среде экзогенных цитокининов, нами было сделано предположение о существовании корреляций развития физиологической аномалии с внутренним содержанием ОГ в культивируемых микролобе-гах.

Табл.5. Внутреннее содержание фитогормонов в побегах с апи-1<альиыш некрозами и нормальных побегах яблони

определение Содержание фитогормонов нг/г сухого веса

побегов --------------------------------------------------

ИЛА 2иП ЗР 3 ИУК АБК

Побеги с некрозами 52±36 68±24 120±32 1415 15±8 11±4 (среда беа гормонов)

Нормальные |

(среда с 119170 13б±44 117+35 189±61 8б4±125 43±14 | ДРОП 0,01i.tr/л)

Показано, что содержание праотически всех изучаемых нами ФГ (ИПА, 2иП, 3, ИУК, АБК ) значительно снижено по сравнению с яор-мапьными растениями(табл. 5).

Т.о., мы считаем, что в последовательности событий, ведуэдх к инициации и развитии апикальных некрозов, на первом месте стоит сильное истощение побегов по цитокикинам. В даяьнейпем некротиза- • ция и отмирание верхушки ведет к резкому снижению содержания ауксинов в побеге, что, в свою очередь, оказывает влияние на транспорт и присутствие ионов кальция в побегах. Для избежания гибели растительного материала побеги с первыми признаками апикальных некрозов и потери жизнеспособности (небольшое пожелтение апекса и подсыхание листьев) переносили на свежую питательную среду с экзогенными регуляторами роста, обычно цитокининами, что

- 16 - • способствовало возврату жизнеспособности га счет роста пазушных побегов.

Выводы

1. Яблоня coprij'- "йягое" характеризуется высокими морфогенетическими потенциями в культуре тканей. , Степень их проявления зависит oí присутствия в питательной среде регуляторов роста гормональной природы. - *

2. Экзогенные регуляторы роста оказывают влияние на формирование аномальных побегов: длительное культивирование на средах, обогащенных БАИ, приводит к формированию верифицированных побегов, длительное культивирование на безцитокишшовых средах - i формированию побегов с апикальными неврозами.

3. Экзогенные регуляторы роста оказывает влияние на внутренний гормональный баланс культивируемых побегов.

4. Физиологическая аномалия -витрификация коррелирует с повы кенным содержанием цитокининов'в культивируемых побегах, появлехш апикального некроза коррелирует с низким содержанием фитогорыоно в побегах.

5. 'При субкультивировании побегов яблони на питательной сред с С-14 БАП меченые соединения присутствуют во всех частях побега апикальной почке, стебле, листьях во все дни анализа, включая пер вый; большая часть меченых соединений (около 70%) присутствует базальной части стебля.

6. Во все дни анализа на питательной среде с С-14. Б/Л в ат кадь й почке, стебле, листе обнаружен спектр соединений, cooi ветствуквдих по Rf нуклеотидам, глшозидам, адениау, аденозищ БАП-рибозиду, БАИ

Слисок работ, опубликованных по теме диссертации:

1. Н. В. Катаева, 31 Г. Александрова, Т. Б. Нарягина, А. X. Шилова И муноферментный анализ: определение фитогормонов в побегах ябл ни, культивируемых in vitro//®í3. растекий1990-Т. 37-Еып. 4-С. 813-82

2. ЕВ. Катаева,Л Г. Александрова,Е.Е Драгавцеза. Значение го монов в формировании верифицированных побегов яблони при микр размножении //В книге "Биология культивируемых клеток и биотехн логия растений". Изд. "Наука", 1991ГС. 189-192.

3. И. Г. Александрова,ЕВ.Катаева. Определение эндогенных цит кининов в растительных тканях методом иммуноферментного аяал за/УТез. Бсес. конф. молодых ученых по физиологии растительн клетки. Петрозаводск: Изд. АН СССР.-1988.-С. 28.

4. Александрова!! Г. , Катаева Е В., Вутенко Р. Г., Матчке Т. „ Звальд Д.. Юэхлер Г. Изменение содержания эндогенных гормонов в хвое и. почках ели обыкновенной /Picea abies/: связь с ¡тональным микроразшгажешем // Тез. 11 Всес. конф. по регуляторам роста и развития растений. Киев: Изд. "Наукова думка"г1989гС. 185.

5. Е Е Катаева, И. Г. Александрова Клональное микроразкножение яблони: связь с содержанием эндогенных цитокшиноз //Тез. Y межд. 1сонф. "Биология культивируемых клеток и биотехнология". Ноеоси- ^ бирс 1С Изд. ЛИ СССРП988.-С. 128.

6. Aleksandrova I. G. .Katayeva !J. V. , Butenko R. G. Exogenous growth regulators influence on the vitrification and apical necrosis of shoots cultivated iv vitro and endogenous horiranes content. In: Proceedings of Y international youth symposium on plant metabolism regulation. Varna,Bulgaria,October, 8-13. -1990. -P. 53.

7. I. Q. Aleksandrova,N. V. Katayeva Uptake, translocation of C-14 labelled benzylaminopurine by apple shoots during micropropagation. In: Proceedings of YII international congress on plant tissue and cell " culture. Amsterdam,Holland,June, 24-29. -1990. -P. 87.

8. IL В. Катаева, II Г. Александрова. Проблема витрификации: связь с содержанием эндогенных регуляторов роста// Тезисы докладов второго съезда всес. общества физиолсгив растении. Москваг1990гС. 42.

9. I. Aleksandrova, N. Katayeva Translocation S metabolism of С - 14 labelled benzylaminopurine by apple shoots in vitro. In: Proceedings of International Symposium "Physiology and biochemistry of cytokinins in plants" Liblice, Czechoslovakia, September ,10-14,-1990. -P. 3.

10. N. Katayeva & I. Aleksandrova Effect of applied a endogenous hormones on vitrification and shoot tip necrosis in apple shoot culture. In: Proceedings of International Symposium "Physiology and biochemistry, of cytokinins in plants" Liblice, Czechoslovak! a, September, 10-14,-1990. -P. 27.

11. N. V. Kataevav I. G. Aleksandrova,R G. Butenko, E. V. Dragavtceva Effect of applied- and: internal hormones on vitrification and apical necrosis; o£ different plants cultured, in vitro // Plant; Cell, Tissue and) Organ, Culture.-1991. - V. 27.-P.149-154.