Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эмбриональное развитие морской нематоды Enoplus brevis

ВАК РФ 03.00.11, Эмбриология, гистология и цитология

Автореферат диссертации по теме "Эмбриональное развитие морской нематоды Enoplus brevis"

РГ6 од РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ НАУК

ИНСТИТУТ БИОЛОГИИ РАЗВИТИЯ им. Н.К.КОЛЬЦОВА

На правах рукописи

ВОРОНОВ Дмитрий Анатольевич

ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ МОРСКОЙ НЕМАТОДЫ ЕШРИБ ВИЕУ^

03.00.11 - эмбриология, гистология и цитология

Автореферат-Диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва - 1993

Работа выполнена в Институте проблем передачи информации

Научный руководитель: чл.-корр. РАН, профессор Л.М.Чайлахян

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Л.В.Е лоусов, доктор биологических наук Н.Н.Ротт.

Ведущее учревдение - Институт паразитология РАН.

на васедании Специализированного совета Д002.85.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук при Институте биологии развития им. Н.К.Кольцова РАН (117334, Москва, ул.Вавилова, 26).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биологии развития им. Н.К.Кольцова АН СССР.

Автореферат разослан " АИ^е/Я. 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета,

кандидат биологических наук Е.М.Протопопова

Российской Академии Наук.

Защита состоится

ВВЕДЕНИЕ.

Актуальность проблемы. Исследования развития нематод внесли большой вклад в эмбриологию. Именно у нематод в конце прошлого века было впервые найдено и детально изучено детерминированное, или мозаичное, дробление и сформулированы гипотезы о его механизмах, не потерявшие своего значения до настоящего времени. Исследуя развитие аскариды, Бовери (Boveri, 1887) на основании обнаруженного им явления димину-ции хроматина предположил, что механизм детерминации эмбриональных клеток непосредственно сопряжен с процессом их деления; позднее при изучении того же объекта было разработано представление . об ооплазматической сегрегации (zur Strassen, 1891; Boveri, 1899, 1910).

Существенная роль ооплазматической сегрегации вскоре была экспериментально обнаружена у многих животных, не только с мозаичным, но и регулятивным развитием (Morgan, 1927; Иванов, 1937). Идея о непосредственной сопряженности детерминации клеток с процессом их деления в настоящее время широко обсуждается (Stent, 1985; Bailey, 1986), но прямых экспериментальных доказательств этого механизма пока нет.

Важнейшим признаком мозаичного развития с самого начала предполагалась строгая предопределенность судеб клеток на всех стадиях, то есть инвариантность их генеалогии, приводящая в результате к формированием личинки с постоянным клеточным составом. Фактически, однако, доказать это удалось лишь недавно при изучении нового модельного объекта - мелкой почвенной нематоды Caenorhabdltis elegans (Sulston et al., 1983). На этом виде были проведены и обширные экспериментальные исследования, в настоящее время составляющие основу знаний о механизмах развития нематод.

Расположение и судьба всех клеток зародыша С. elegans зтрого постоянны. На ранних стадиях дробления различия блас-гомеров связаны с ооплазматической сегрегацией. На стадии 28 1 более клеток все они детерминированы, так как в это время зародыш С. elegans полностью лишен способности к регуляции. ï то же время, на более ранних стадиях (например, "четырех теток) некоторые из бластомеров С. elegans еще не детерми-

нированы; существенную роль в их детерминации играют межклеточные индуктивные взаимодействия. Лежащие в основе развития С. elegans молекулярные механизмы в ряде случаев обнаружили глубокое сходство с таковыми у других животных, в том числе позвоночных. Таким образом, за исключением такой особенности, как инвариантность генеалогии эмбриональных клеток, по механизмам развития С. elegans от других животных принципиально не отличается.

В связи с вышеизложенным, возникает вопрос: является ли жесткая программа клеточных делений необходимым условием развития нематод и насколько она связана с механизмами детерминации клеток и постоянством клеточного состава личинок? Имеющиеся в настоящее время данные о развитии С. elegans не позволяют дать однозначный ответ на этот вопрос.

Одним из путей решения сформулированной проблемы может стать сравнительное исследование. Действительно, если инвариантность генеалогии клеток связана с фундаментальными механизмами развития нематод, то она должна быть обнаружена у всех видов. Разумеется, что для подобного сравнения необходимо достаточно полное представление о генеалогии клеток -от яйца до личинки. До настоящего времени подробные исследования генеалогии клеток проводились только на представителях подкласса Rhabditia - С. elegans, аскаридах и некоторых других. У всех них она оказалась поразительно единообразной, различаясь лишь незначительных деталями (Sulston et al., 1983). У.других нематод генеалогия клеток глубоко не прослежена, но, по-видимому, у большинства она инвариантна, хотя в ряде случаев проспективное значение бластомеров явно ревко отличается от такового у нематод Rhabditia (Дроздовский, 1975; Малахов, 1986). Наиболее своеобразным оказалось развитие представителей отряда Enoplida, у которых была обнаружена вариабельность расположения бластомеров на ранних стадиях дробления, что привело к предположению об изменчивости их проспективного значения (Черданцев и др., 1972; Малахов, Акимушкина, 1976). Таким образом, сравнение развития и анатомии личинок С. elegans и нематод отряда Enoplida представляло наибольший интерес, но до настоящего времени его нельзя било осуществить из-за недостаточной изученности последних: так, у них не были исследованы генеалогия клеток и процессы

морфогенеза, отсутствовали сведения об ооплазматической сегрегации и регуляции развития, практически не было изучено строение личинок (в частности, не было известно, характерно ли для' них постоянство клеточного состава).

Цель и задачи исследования. Целью работы было исследование эмбрионального развития и анатомии личинки первой стадии у морской нематоды Епор1иэ Ьгеу1э из отряда ЕпорШа.

В ходе работы решались следующие задачи:

1) Подробно описать развитие и, в частности, изучить значение схемы расположения бластомеров на ранних стадиях и связь клеток зародыша через высокопроницаемые контакты.

2) Экспериментально исследовать проблему регуляции развития и ооплазматической сегрегации.

3) Разработать методику маркировки зародыша внутриклеточными метками (Люцифером желтым и пероксипазой хрена) и с ее помощью изучить процесс гаструляции и генеалогию эмбриональных клеток.

4) Исследовать анатомию личинки первой стадии и проблему постоянства у нее клеточного состава.

5). Сопоставить развитие и строение личинки Е.Ьгеу1з с таковыми у нематод других видов.

Научная новизна. Проведено подробное исследование раннего развития Е. Ьгеу1Б. Описан процесс выделения направительных телец. Впервые для нематод экспериментально показана связь эмбриональных-клеток с помощью высокопроницаемых контактов. Показано, что, в отличие от большинства изученных видов нематод, у Е. Ьгеухэ. геометрия раннего дробления не играет существенной роли и не предопределена изначально. Проведено экспериментальное изучение регуляции развития. Впервые для нематод разработайа методика прижизненной маркировки клеток зародыша внутриклеточными метками (Люцифером желтым и перок-сидазой ; хрена). С помощью маркировки бластомеров на разных стадиях развития подробно исследованы раструляция и генеалогия клеток у Е. ЬгбУ1з. Проведены детальные исследования знатомии личинки первой стадии у Е. ЬгеУ1Б. Впервы изучена 1роблема постоянства клеточного состава'у личинок нематод юдк^асса ЕпорПа.

Теоретическое и практическое значение. Полученные результаты позволяют рассматривать Е. brevis в качестве удобной модели 1ЛЯ изучения проблем эмбриологии. Ценность исследований этого вида повышается благодаря возможности сопоставления с С. elegans - стандартным объектом современной биологии развития.

Полученные данные позволили выявить общие закономерности развития нематод и, в частности, показать, что наблюдаемая у большинства видов нематод инвариантность генеалогии зародышевых клеток не имеет фундаментального характера.

Полученные данные могут быть использованы в университетских курсах по эмбриологии и зоологии беспозвоночных животных.

Апробация работы. Материалы диссертации докладывались на VII Всесоюзном научном совещании эмбриологов "Закономерности индивидуального развития животных" (Ленинград, 1986), на II Всесоюзной конференции "Простые нервные системы и их значение для теории и практики" (Казань, 1988), на III Европейском конгрессе по клеточной биологии (3-rd Europ. Cong. Cell Biol., Firenze, Italy, 1990), на Ежегодной конференции Британского общества Биологии развития, Ассоциации исследований мозга и Британского общества Клеточной биологии (Ann. Conf. BSDB, BRA and BSCS, Leeds, 1991), на научных заседаниях и семинарах Института проблем передачи информации РАН, кафедры эмбриологии ЛГУ, кафедры зоолсгии беспозвоночных МГУ.

Публикации. Основные материалы диссертации изложены в восьми печатных работах.

Структура и объем работы. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста и состоит из введения, пяти глав (обзор литературы, объекты и методы исследований и три главы результатов и их обсуждения), заключения,, выводов v иллюстраций. Иллюстрации включают 36 таблиц микрофотографик и рисунков. Список литературы включает 216 источников, иг них 39 на русском и 177 на иностранных языках.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Рассмотрены основные работы, посвященные описанию эмбрионального. развития нематод, основное внимание уделено исследованиям, выполненным на наиболее изученном виде - С. elegans. Кроме того, обсуждаются работы, посвященные описанию развития других видов нематод. Приводятся литературные данны" об экспериментальных исследованиял ооплазматической сегрегации и клеточных взаимодействиях в процессе эмбрионального развития. Кратко рассмотрено постэмбрионшшное развитие нематод.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом наших исследований была свободноживущая морская нематода Enoplus Brevis Bast., 1865, принадлежащая к семейству Enoplidae, отряду Enoplida, подклассу Enoplia. Кроме Е. brevis, мы также исследовали некоторые аспекты развития нематод следующих видов, принадлежащих, вместе с Е. brevis, к одному отряду Enoplida: Pontonema vulgare (Bast., 1865) (сем. Oncholalmidae), Odoncholaimus lepidus de Man, 1889 (сем. Oncholaimidae) и Dolicholaimus marioni de Man, 1888 (сем. Ironidae). Материал был собран на.Беломорской биологической станции Зоологического института РАН.

Анатомию личинок изучали на живом или окрашенном по стандартным гистологическим методикам материале. Для селективного выявления ядер гиподермы живых личинок окрашивали раствором люминесцентного красителя Hoechst-33258 на морской воде. Расположение и число чувствительных щетинок и клеток гиподермы изучали с помощью импрегнации серебром по методу Ранвье (Ромейс, 1954). Гистохимическую реакцию выявления биогенных аминов проводили на тотальных препаратах, используя глиоксиловый (de la Torre, Surgeon, 1976) и модифицированный водный формальдегидный (Sakharova, Sakharov, 1971) методы.

Направительные тедьца окрашЕали растворенным в морской воде люминесцентным красителем Hoechst-33258.

Для изучения роли геометрии раннего дробления в развитии

E. brevis яйца до качала первого деления дробления расплющивали покровным стеклом или помещали в тонкий капилляр.

В оп«тах по остановке клеточных делений зародыши выдерживали в 1СГ4 М растворе колхицина (Sigma, США) на морской воде.

Высокопроницаемые межклеточные контакты (ВПК) - исследовали с помощью внутриклеточных инъекций флуоресцентных красителей флуоресцеина (СССР) и Люцифера желтого двух типов - Lucifer Yellow СН и Lucifer Yellow VS (Sigma) и стандартных злектро-фивиологических методов.

Фрагменты цитоплазмы зиготы или отдельные бластомеры зародыша отделяли, перевязывая яйца лигатурой из тонкого шелкового или хлопкового волокна. Временную изоляцию частей зародыша осуществляли, пережимая скорлупу тонкой стеклянной нитью закрепленной на микроманипул-^оре сразу после завершения первого деления дробления.

Для центрифугирования яйца Е. brevis наклеивали на покровные стекла. Направление центробежной силы относительно продольной оси скорлупы яиц задавалось ориентацией этих стекол в центрифужных стаканах. При центрифугировании использовали ускорение 100-400 g в течение нескольких (до 12) часов или 5000 g в течение 10-15 минут. В каждом варианте опыта использовали не менее 50 яиц.

В качестве люминесцентной внутриклеточной метки использовали Люцифер желтый (Ж) типов Lucifer Yellow СН (LYCH) и Lucifer Yellow VS (LYVS) производства фирмы Sigma. В отдельные бластомеры зародышей, находившихся на стадии двух или восьми клеток, вводили приготовленный на дистиллированной воде раствор. ЛЖ концентрацией около 2-ЗХ. Все зародыши, развитие которых после маркировки ЛИ не- привело к формированию нормальной личинки, выбраковывались. Всего на стадии двух и восьми бластомеров было промаркировано с помощью ЛЖ около трехсот яиц.

Второй использованной нами внутриклеточной меткой была пероксидаза хрена (ПХ) фирм Sigma (тип VI и XII), Calbiochem и Олайнского химфармзавода. Готовили 10-20%-ный раствор ПХ на дистиллированной воде, к которому для визуального контроля качества инъекции добавляли около 0,1% LYCH. Сразу после вылупления личинок первой стадии фиксировали смесью 0,4%-го

формальдегида и 1,25%-го глютарового альдегида на натрий-ка-кодилатном или натрий-фосфатном буфере (ОД М, рН 7,2) при 4° С в течение одного часа и проявляли по модифицированному методу Грэхема и Карновского (Ме15Ь"^ еЬ а1., 1978, 1984). Всего на разных стадиях с помощью ПХ было промаркировано более 50 яиц.

Г ЛАГА 3. АНАТОМИЯ ЛИЧИНКИ ПЕРВОЙ СТАДИИ ЫОРШБ BREVIS.

В этой главе рассмотрен общий план строения личинки первой стадии Е. ЬгеУ1э и детально описаны гиподерма, катехола-.минсодержащие нейроны (КА-нейроны) и органы чувс:в.

3.1. Общая характеристика анатомии личинки. Длина личинки Е. Ьгеу1Б первой стадии около 1200 мкм,. толщина - 80 мкм. Тотальное окрашивание ядер личинки показало, что она состоит более чем из 1000 клеток. Общий план строения личинок Е. Ьгеу1з сходен с таковым у других изученных нематод. На протяжении большей части тела - от нервного кольца до ануса - у личинки Е. Ьгеу1э имеется шесть продольных нервнах стволов: мойные вентральный и дорсальный (едоль первого расположен ряд нейронов) и две пары тонких субмедианиых. Эти стволы связаны между собой поперечными субкутикулярными ксмиссура-ми. У личинки Е. Ьге71э во всех нервных стволах имеются отростки нейронов области нервного кольца, а отростки вентральных -нейронов располагаются только в вентральном и дорсальном стволах и комиссурах.

3.2. Органы чувств.. Органы чувств личинки Е. Ьгеухз представлены 38 рецепторами. На переднем конце тела вокруг ротового отверстия расположены последовательно круг из шести губных папилл, передний круг из шести и задний круг из четырех головных щетинок, пара амфид. Кроме головных, у личинки имеется 10 чувствительных щетинок, расположенных на других участках тела; далее эти щетинки мы иудем называть соматическими. Соматические щетинки первой.пары лежат латерально перед нервным кольцом. Соматические щетинки второй пары расположены сразу позади нервного кольца. Между ними и аналь.чш отверстием расположены четыре одиночные соматичеа г щетинки, первая и третья из которых лежат справа, а вторая и четвертая - слева. В хвостово:; отделе латерально расположены

две соматические щетинки, передняя из которых лежит слева, а задняя - справа. У личинки имеется 10 специализированных ме-ханосенсорных органов.

. 3.3. -Гиподерма. Ядра клеток гиподермы расположены в гипо-дермальных валиках. На участке от нервного кольца до ануса, т.е. на протяжении большей части тела, имеются два латеральных валика, в каждом из которых расположено по 3 ряда ядер. Впереди нервного кольца находятся 4 гиподермальных валика с однорядным расположением ядер: два латеральных, дорсальный и вентральный. Точный учет клеток гиподермы проводили на имп-регнированных серебром личинках. У всех личинок строение гиподермы было постоянно впереди нервного кольца и в хвостовом отделе; варьировало лишь общее число клеток на участке от нервного кольца до ануса.

3.4. Катехоламинсодержащие нейроны. После проведения гистохимической реакции на биогенные амины в телах некоторых нейронов и их отростках регистрируется специфическая зеленая люминесценция. Спектральный анализ показал, что максимум эмиссии находится в области 480 нм, что характерно для кате-холаминов (1лпс1уа11, Взогк1ипс1, 1974). В нервной системе личинки Е. ЬгеуХг первой стадии насчитывается 14 катехоламин-содержащих нейронов (КА нейронов). Их число, расположение и строение строго постоянны у всех изученных личинок. Четыре нейрона расположены в районе нервного кольца, и еще 10 лежат позади кольца вдоль тела в латеральных валиках гиподермы. Отростки КА нейронов наблюдаются в нервном кольце, вентральном и дорсальном нервных стволах, причем пучок отростков в вентральном стволе значительно мощнее, чем в дорсальном.

3.5. Обсуждение. Изложенные выше результаты показывают, что клеточный состав личинки Е. Ьгеу1Б в целом непостоянен. Вариабельность числа гиподермальных клеток нельзя объяснить разновозрастностью личинок, так как клетки у них не делятся. Вместе с тем, у всех исследованных личинок был одинаковый состав гиподермы переднего (до нервного кольца) и хвостового отделов тела, а также постоянный набор КА нейронов и сенсорных органов.

Г.-ЛВА 4. ЭМБРИОНАЛЬНОЕ РАЗВИТИЕ ENOPLUS BREVIS В НОРМЕ И ПРИ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ВОЗДЕЙСТВИЯХ.

В этой главе рассмотрена картина эмбрионального развития Е.. brevis, полученная с помощью прижизненных наблюдений за интактными или подвергнутыми определенным экспериментальным воздействиям зародышами.

4.1. Ранние этапы развития. Развитие Е, brevis начинается после попадания яиц во внешнюю среду. Исследования окрашенных Hoechst-33258 зигот Е. brevis показали, что через полчаса после начала развития женский пронуклеус находится на стадии телофазы первого деления мейоза. В отличие от других изученных нематод, в это время мужской и женский пронуклеусы у Е. brevis могут располагаться не на противоположных полюсах яйца, но произвольно. Через один час после начала развития происходит отделение первого направ"тельного тельца; i началу дробления отделяется второе.

4.2. Дробление. Борозда первого деления обычно проходит под прямым углом к продольной оси скорлупы; соответственно, вдоль этой оси располагаются и первые два бластомера. В тех случаях, когда угол между плоскостью борозди и осью скорлупы не прямой, бластомеры проскальзывают относительно скорлупы и поворачиваются в стандартное положение. Деления раннего дробления следуют друг за другом с пятичасовыми интервалами. Позднее деления двуклеточного зачатка средней кишки задерживается, и в результате зародыш насчитывает 30 бластомеров. В дальнейшем наблюдается запаздывание делений бластомеров вентральной поверхности зародыша. До стадии восьми-шестнад-цати клеток размеры бластомеров приблизительно одинаковы; какие-либо заметные под микроскопом закономерные различия между ними не наблюдаются.

Геометрические фигуры, образуемые бластомерами на ранних стадиях дробления, у разных яиц варьируют. В результате второго деления дробления образуются всевозможные связные четы-рехбластомррные фигуры: тетраэдр, ромб (как плоский, так, чаще, изогнутый), квадрат и Т-образная. За счет интерфазных движений бластомеров эти фигуры могут переходить д. ,т в друга, причем не запрещены никакие варианты подобных преобразо-

- 10 -

в&чий. °

Изложенные выше факты наводят на мысль о том, что в развитии Е. Ьгеу15 геометрия раннего дробления изначально никак не предопределена» наблюдаемая же ограниченность числа вариантов расположения бластомеров на стадии четырех клеток объясняется лишь чисто геометрическими причинами. Такое предположение подтверждается и полученными нами данными о геометрии раннего дробления у родственных Е. Ьгеу1Б видов - 0. 1ер1с1из и Б. таг1оги. Скорлупа яйца 0. 1ер1с1из практически шарообразна, а свободное пространство под ней невелико. У этого вида на четырехклеточной стадии наблюдались только тетраэдры с плотной упаковкой бластомеров. Скорлупа яйца Б. таг1оги всегда сильно вытянута, благодаря чему на стадии четырех клеток бластомеры располагаются всегда линейно.

При экспериментальном изменении формы скорлупы яйца Е. Ьгеу1з были получены необычные конфигурации бластомеров. У яиц с искусственно вытянутой скорлупой на четырехклеточной стадии бластомеры располагались линейно. У расплющенных яиц на стадии четырех бластомеров встречались только плоские ромбы, а н^ восьмиклеточной стадии бластомеры образовывали всевозможные однослойные фигуры, например, двурядные пластины, кольца и т.п. Из всех подопытных зародышей в результате формировались нормальные личинки. Таким образом, для дробления Е. Ьгеу1э в отличие от других нематод, не характерны инвариантность расположения времени деления бластомеров. Дробление подобного типа можно назвать анархическим.

4.3. Поздние этапы эмбрионального развития. Гаструляция начинается с погружения двуклеточного зачатка средней кишки на стадии приблизительно 30 клеток, и в целом напоминает таковую у нематод ШаМШа. Поверхностный слой клеток зародыша все более и более упорядочивается и приобретает облик эпителия. Через четверо суток от начала развития зародыш начинает вытягиваться. Приблизительно до этого времени обработка колхицином блокирует дальнейшее развитие, тогда как после она на развитие никак не влияет, и из яиц вылупляются нормальные личинки. В возрасте пяти-шести суток зародыш достигает стадии запятой, когда у него формируются массивный передний конец тела и загибающийся на . вентральную сторону тела хвост. Начиная со стадии запятой, деление клеток заро-

дыша полностью завершается. В ходе дальнейшего развития продолжается оытягивание зародыша, дифференцировка клеток, синтез кутикулы, начинаются движения личинки. Общая длительность эмбрионального развития Е. brevis от начала и до вы-лупления личинки первой стадии при 18° С составляет около трех недель.

4.4., Высокопроницаемые контакты. Высокопроницаемые межклеточные контакты (ВПК) в ходе развития Е. brevis исследовали от стадии двух бластомеров до стадии сложенного вдвое зародыша с помощью инъекций люминесцентных красителей и стандартных электрофизиологических методов. Между клетками Е. brevis на всех стадиях развития обнаружена связь через ВПК, прерывающаяся во время митотических делений. Измерения коэффициента электрической связи на стадии двух бластомеров показали, что он составлял от 0 сразу после завершения первого деления до 0,2 в интерфазе. У сложенного вдвое зародыша наблюдается компартментализация клеток по связям через ВПК: клетки гиподермы связаны между собой, но не,связаны с внутренними клетками зародыша: Связь'через ВПК полностью блокировалась при понижении внутриклеточного рН, достигаемого с помощью инкубации зародышей в содержащей ионы бикарбоната среде (Turin, Warner, 1977).

4.5. Экспериментальное исследование развития. У зародышей Е. brevis экспериментально обнаружена высокая способность к регуляции развития. Нормальное течение эмбриональных процессов, приводящее к формированию полноценной личинки, наблюдалось после удаления до половины материала зиготы или до четверти материала зародыша на стадии 4 или 8 клеток.

Разделенные на стадии двух бластомеров эмбрионы дробятся, в ряде случаев у них наблюдаются начальные признаки морфогенеза, но их развитие блокируется на поздних стадиях и сформировать личинку они неспособны. Однако после воссоединения половин длительно (до двух недель) разделенных зародышей они формируют нормальную'личинку.

Центрифугирование яиц Е. brevis при больших ускорениях блокировало первое деление дробления и нарушало развитие, а при малых его влияние было незначительным, несмотря на расслоение ооплазмы и модификацию раннего дробления. На продольную полярность яиц центрифугирование не влияло.

ГЛАВА 5. -ГЕНЕАЛОГИЯ КЛЕТОК И ГАСТРУЛЯЦИЯ У ЕШРШБ В!?ЕУ13. .

В этой главе приводятся результаты исследования эмбрионального развития Е. Ьгеу1Б с помощью маркировки бластомеров внутриклеточными метками двух типов - люминесцентным красителем Люцифером желтым и ферментом пероксидазой хрена

5.1. Методические проблемы изучения развития Е. Ьгеу1з. Исследование процессов морфогенеза и генеалогии клеток у Е. Ьгеу1Б и других ЕпорНс1а затруднено из-за непрозрачности зародышей, продолжительлости эмбрионального развития, изменчивости расположения бластомеров и отсутствия выраженных различий между ними. Поэтому достоверные результаты можно получить только с помощью маркировки бластомеров.

5.2. Особенности применения внутриклеточных меток для исследования эмбрионального развития Е. Ьгеухэ. Люцифер желтый (ЛЖ) оказался пригоден для наблюдения за развитием ранних эмбрионов - от начала дробления.до стадии запятой включительно, после которой четкость картины распределения метки теряется. Его достоинством является возможность исследования динамики перераспределения маркированного материала, в том числе и расположенного внутри, что при наблюдениях без маргафОЕки из-за непрозрачности зародыша абсолютно невозможно. Пероксидаза хрена (ПХ) благодаря удовлетворительной сохраняемости в цитоплазме применима как для изучения распределения метки в личинке первой стадии, так и для детального исследования строения меченых клеток. Маркировка ЛЖ и ПХ не нарушает нормального развития.

5.3. Распределение маркированных клеток в зародыпг и личинке первой стадии. На ранних стадиях развития не происходит значительного перемешивания потомства первых двух бластомеров и они распределяются в зародыше компактными массами.

5.4. Гаструляция. Будущий зачаток всей средней кишки личинки выделяется на стадии восьми бластомеров. На этой стадии все они приблизительно одинакового размера и по облику друг от друга не отличаются. Исходное расположение энтодер-мального бластомера прс звольно. После стадии шестнадцати бластомеров деление двуклеточного зачатка энтодермы всегда

задерживается. На стадии 30 клеток зародыш представляет собой морулу с лежащим на ее поверхности др^клеточным зачатком энтодермы. Внутри зародыша в это Бремя расположены клетки не энтодермальной природы. Гаструляция начинается погружением пары предшественников энтодермы с поверхности зародыша внутрь. Образующийся при погружении зачатка энтодермы блас-' топор полностью закрывается близлежащими клетками приблизительно на стадии от 100 до 150 клеток. В дальнейшем бласто-поральная поверхность зародыша соответствует вентральной поверхности личинки. После замыкания бластопора на. месте погрузившегося зачатка энтодермы формируется углубление. Это углубление начинает постепенно удлиняться за счет погружения близлежащих клеток, формирующих в дальнейшем пищевод, соматическую мускулатуру и первичные половые клетки личинки. Продольная ось возникающей в результате этого процесса вентральной щели совпадает с продольной осью зародыша. Погрузившиеся при формировании вентральной щели зачатки постепенно прикрываются наползающими с боков нейробластами, что приводит к ее замыканию. Анальное отверстие прорывается на вентральной стороне впереди от заднего края вентральной щели, ротовое отверстие образуется вблизи ее переднего края. На поздних стадиях развития лежащие на вентральной стороне зародыша нейробласты прикрываются надвигающимися с боков пластами гиподермы.

5.5. Генеалогия клеток. Картина распределения потомков первых двух бластомеров у каждого зародыша была уникальной. По их распределению относительно продольной оси зародыша на стадии боба или запятой мы выделяли три группы - с преимущественно продольным, косым или поперечным расположением границы между окрашенным и неокрашенным материалом. Среди потомков каждого из двух первых бластомеров всегда присутствовали нервные, мышечные и гиподермальные клетки. В то же время, клетки энтодермы происходили только от одного из них. Предшественником энтодермы чаще оказывался тог из двух первых бластомеров, который вносил' больший вклад в формирование передней половины тела личинки.

На стадии 8 клеток один бластомёр дает начало всей энтодерме, и только ей, тогда как судьбы остальных бластомеров жестко не предопределены. Как правило, потомство каждого из

не энтодермальных бластомеров включает нервные, мышечные и гиподермальные клетки, но в разных пропорциях. Таким образом, у Е. Ьгеу1Б судьбы потомков бластомеров ранних стадий, за исключением предшественника энтодермы, строго не предопределены.

На стадии приблизительно 60 клеток обнаружена закономерная связь между проспективным значением клеток и их положением в зародыше. Потомство клеток, расположенных на вентральной поверхности зародыша вблизи от зачатка энтодермы, в личинке формировало преимущественно клетки пищевода, соматической мускулатуры и ^ ряде случаев нейроны,, а, потомство дорсальных бластомеров формировало клетки гиподермы. Таким образом, в отличие от раннего дробления, в начале гаструля-ции судьба клеток в значительной степени уже предопределена и связана.с их положением в зародыше.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Нами было исследовано эмбриональное развитие и строение личинки первой стадии у морской нематоды ЕпорХиБ Ьге71э.

Строение личинки Е. Ьгеу1Б принципиально сходно'с таковым у других видов нематод и, в частности, у С. е^апэ. Это относится как к общему плану строения,' так и, например, к деталям устройства нервной системы, органов чувств и гиподермы. -

Всего у личинки Е. Ьге71э насчитывается приблизительно 1500 клеток. Полного постоянства клеточного состава у нее нет: например, общее число клеток гиподермы колеблется от 158 до 172. Однако у личинки Е. Ьгеу1Б наблюдается ло.альное постоянство клеточного состава гиподермы переднего участка тела (несколько далее нервного кольца) и хвоста, а также постоянство числа и строения катехоламинсодержащих нейронов (КА-нейронов), которых всегда 14. Кроме указанных структур, с локальным постоянством клеточного состава у личинки Е. Ьгеу1з, по-видимому, связано и фиксированное число сенсорных органов, которых 38 (26 чувствительных папилл и щетинок, 2 амфида и 10 метанем) и ...елезистых клеток (одноклеточная шейная ж»леза и трехклеточная хвостовая).

Детальное сопоставление органов чувств, гиподермы и

- 15 -

КА-нейронов у личинки Е. Ьгеу1з и единственной среди других нематод подробно изученной личинки С. е^апэ позволило обнаружить много общего. При значительно большем числе'сенсорных органов у личинки Е. . Ьгеу1з, каждой сенсилле личинки С. е1едапз, кроме фазмид, у первой может быть найден аналог. Совпадают даже такие мелкие детали, как латеральное размещение первой пары соматических щетинок у Е. Ьгеу1з и дейрид у С. е^апэ и дорсальное расположение других соматических щетинок у Е. Ьгеу1г и постдейрид у С. е1е^апз (последние, правда, отсутствуют у личинок и появляются лишь в ходе пос-эмбрионального развития). При более чем двукратном превышении общего числа клеток гиподермы у личинки Е. Ьгеу1э по сравнению с личинкой С. е1егапБ, число дорсальных ядер в гиподерме переднего конца тела оказалось поразительно близким - соответственно восемь и семь. Очень сходными оказались и некоторые КА-нейроны обеих личинок - по-видикому, у. них совпадает даже расположение образуемых ими массивных' синапти-ческих окончаний. Практически во всех рассмотренных нами структурах у личинки Е. Ьге71г можно выделить те, которые имеются у личинки С. е1едапз, и добавочные, -отсутствующие у последней.

Картина эмбрионального развития у Е. Ьгеу1э в целом напоминает таковую у других исследованных нематод. Так, процессы гаструляции у Е. Ьге'Лг и С. е1ее;апз или аскариды очень похожи. На стадии восьми клеток выделяется чисто знтодермаль-ный зачаток, который в дальнейшем дробится медленнее других. Состоящий из двух клеток зачаток энтодермы начинает погружаться внутрь зародыша приблизительно на стадии 30 бластоме-ров. Далее начинается .погружение зачатков мускулатуры, пищевода и половых клеток, что приводит к раннему замыканию бластопора и постепенному формированию на месте погрузившихся клеток вытянутой вдоль продольной оси зародыша вентральной щели, позднее закрывающейся с боковых сторон. Ко времени образования рта и ануса вентральная поверхность зародыша покрыта нейробластами, которые 1 затем прикрываются надвигающимися с боков пластами гиподермы. Таким образом, порядок миграции зачатков при гаструляции у нематод сходен с таковым у других животных и соответствует традиционной схеме зародышевых листков. В то же время, генеалогия клеток у всех нема-

тод, и в первую очередь у Е. Ьгеу^, с зародышевыми листками почти не согласована, так как потомство большинства ранних бластомеров вносит вклад в формирование самых разных тканей личинки.

Для Е. Ьгеу1з, в отличие от других исследованных нематод, характерна вариабельность расположения бластомеров в ходе дробления. Опыты по деформации яиц свидетельствуют в пользу того, что геометрия дробления у него скорее всего определяется, формой свободного пространства под скорлупой и случайным перераспределением клеток за счет их высокой подвижности.

В опыте удавалось без существенных нарушений развития отделить до половины объема ранней зиготы Е. Ьгеу1з. В то же время, опыты по постоянному или временному разделению зародышей Е. Ьгеу1Б на двуклеточной стадии свидетельствуют о существенной роли в его развитии ооплазматической сегрегации. Можно полагать, что с сегрегацией ооплазмы также связано раннее выделение (на стадии восьми клеток) зачатка энтодермы. Вероятно, нарушением сегрегации объясняется к блокировка в ряде случаев морфогенеза после центрифугирования делящихся оигот. По-видимому, процесс сегрегации ооплазмы у Е. Ьгеу1Б осуществляется в ходе интерфазы перед первым делением дробления, что сближает его в этом отношении с С. е1едалз. Результаты опытов по успешному (без нарушения дальнейшего развития) удалению до четверти материала раннего зародыша - (одного бластомера на стадии четырех клеток или одного-двух -на стадии восьми) свидетельствуют о том,, что сегрегация ооплазмы у Е. Ьгеу1э во всяком случае не предопределяет судьбы всех бластомеров раннего зародь. а. Обнаруженная в эт гх опытах способность к регуляции развития отличает Е. Ьгеу15 от С. е1е2апБ и других изученных нематод.

Из опытов по временному разделению зародышей Е. Ьгеу1э пополам с их последующим воссоединением следует, что ранние этапы развития (в частности, дробление) не требуют межклеточных взаимодействий. В дальнейшем взаимодействие клеток зародыша может осуществляться разными способами, одним из которых являются высоксроницаемые каналы (ВПК). У поздних зародышей Е. Ьгеу1Б связь через ВПК компартментализована: все к. _;тки гиподермы сообщаются друг с другом, но не связаны

с внутренней тканями.

Если у С. elegans и, по-видимому, в^ч других изученных нематод генеалогия эмбриональных клеток жестко предопределена, у Е. brevis она варьирует. Граница между потомством двух первых бластомеров в достигшем стадии боба или запятой зародыше проходит поперек, наклонно или вдоль. На стадии двух бластомеров энтодермы сосредоточен только в одном из них. Обычно (но не всегда) он ассоциирован с тем бластомером, который формирует преимущественно переднюю часть тела зародыша и личинки; эту закономерность легче всего объяснить сегрегацией соответствующих детерминант. Проспективное значение всех бластомеров восьмиклеточной стадии,, кроме знтодермаль-ного, также варьирует.

Постоянство числа клеток (полное, как у С. elegans, или локальное, как, например, число нейронов в ганглиях пиявки) обычно связывают с мозаичным развитием, когда в результате жестко заданной программы делений образуётся точное число клеток, судьба которых однозначно предопределена генеалогией. В связи с этим очень привлекательной представлялась идея о том, что генеалогическое древо отражает реальный механизм (программу) развития за счет "переключения" по ходу дробления управляющих детерминацией клеток генов (Stent, 1985; Stent, Weisblat, 1985; Bailey, 1986). Хотя в основных работах по эмбриологии С. elegans эта идея никогда не формулировалась, по личному сообщению их авторов (J.E. Sulston и J.G. White) она ими также широко обсуждалась. Один из. основных результатов нашей работы состоит в том, что при высокой степени сходства личинок первой стадии у С. elegans и Е. brevis (иногда вплоть до совпадения числа и деталей строения некоторых типов клеток), генеалогия клеток у Е. brevis варьирует. В недавних исследованиях у С. elegans также обнаружена возможность значительного изменения генеалогии клеток экспериментальным воздействием, а также большая роль в их детерминации индуктивных взаимодействий. Следовательно, инвариантность генеалогии эмбриональных клеток не является общим принципом, но формируется вторично (например, как приспособление к ускоренному развитию - Иванов, 1937).

ВЫВОДЫ

1. Разработана методика маркировки одиночных клеток зародыша Е. Ьгеу1э с помощью инъекции Люцифера желтого и перок-сидазы хрена, позволяющая исследовать динамику, процессов морфогенеза и генеалогию клеток.

2. У зародышей Е. Ьгеу1Б экспериментально обнаружена высокая способность к регуляции развития. Нормальное течение эмбриональных процессов, приводящее к формированию полноценной личинки, наблюдалось после удаления до половины материала зиготы или до четверти материала зародыша на стадии 4 или 8 клеток.

3. На всех стадиях развития у зародышей Е. ЬгеУ1з обнаружены функционирующие высокопроницаемые контакты, через которые может осуществляться межклеточная связь.

4. Б отличие от других, изученных нематод, расположение бластомеров в ходе раннего -дробления у Е. ЬгеУ1э не. имеет существенного значения и без нарушения развития может быть изменено в эксперименте.

5. Процесс гаструляции у Е. Ьгеу1з протекает сходным с другими нематодами образом. Выделившийся на стадий 8 клеток .зачаток всей энтодермы начинает погружаться на стадии 30 клеток на будущей вентральной стороне зародыша. Следом за ним погружаются зачатки мускулатуры," пищевода и половых клеток, которые затем закрываются надвигаквдмися с бскоз -кей-робластами.

6'. Потомки каждого бластомера двуклеточной стадии представляют компактную группу, формирующую приблизительно половину эмбриона. Граница между ьими может проходить п' терек, вдоль, или неким промежуточным образом; их распределение у каждого зародыша уникально. Оба бластомера принимают участие в образовании всех зародышевых листков, за исключением энтодермы, которая всегда происходит только от одного из них. На стадии 8 клеток один бластомер дает начало всей энтодерме, и только ней, тогда как судьбы остальных бластомеров жестко не предопределены. Как правило, потомство каждого из не энто-дермальных бластомеров ■ -лючает нервные, мышечные и гиподер-мальные клетки, но в разных пропорциях. Таким образом, у Е.

brevls судьбы потомков бластомеров ранних стадий, за исключением предшественника энтодермы, строго не предопределены:

7. Клеточный состав личинки первой стадии Е. brevis в целом непостоянен, но у нее наблюдается локальное постоянство клеточного состава в гиподерме переднего и заднего участков тела, сенсорных органах и катехоламинсодержащей части нервной системы. Строение личинок Е. brevis и нематод с детерминированным развитием и постоянным клеточным составом очень сходно, в некоторых случаях с точностью до клетки.

8. Для Е. brevis и нематод с детерминированным развитием характерна высокая степень сходства строения личинок и общей картины морфогенеза, но они отличаются тем, что у Е. brevis генеалогия клеток жестко не предопределена и возможна регуляция после удаления значительной части зародыша. Таким образом, лежащие в основе развития нематод механизмы непосредственно с инвариантностью генеалогии клеток не связаны.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Воронов Д.А, Малахов В.В. Морфогенез головного конца свободноживущей морской нематоды Pontonema vulg-аге (Bastian, 1865) Nematoda Enoplida // Докл. АН СССР. 1979. Т. 245. С. 1508-1510.

2. Воронов Д.А., Макаренкова Е.П., Незлин Л.П., Спиридонов С. Э., Панчин Ю.В. Изучение эмбрионального развития свободноживущей морской нематоды Enoplus brevis методом маркировки бластомеров // Докл. АН СССР. 1986. Т. 286. С. 201-204.

3. Воронов Д.А., Макаренкова Е.П., Незлин Л.П., Спиридонов С.Э., Панчин Ю.В. Исследование эмбрионального развития свободноживущей морской нематоды Enoplus brevis // Онтогенез. 1986. Т. 17. С. 419.

4. Воронов Д.А. Развитие и строение нервной системы личинки морской нематоды Enoplus brevis. В сб. Простые нервные системы. Л., "Наука", 1988, с. 48-51.

5. Воронов Д.А., Незлин Л.П., Панчин Ю.В., Спиридонов С.Э. Личинка первой стадии свободноживущей морской нематоды Enoplus brevis. Гиподерма и сенсорные органы // Онтогенез. 1989. Т. 20. С. 416-422.

6. Незл"я Л.П., Воронов Д.Д., Панчин Ю.В., Спиридонов С.Э. Личинка первой стадии свободноживущей морской нематоды Enoplus brevis. Катехоламинергические нейроны // Онтогенез. 1990. Т. 21. С. 69-75.

7. Voronov D.A., Makarenkova Н.Р., Mezlin L.P., Panchin Yu.V., Splrldonov S.E. The development of marine nematoda Enoplus brevis // Cell. Biol. Int. Rep. (Abstr. suppl.). 1990. V. 14. P. 173.

8. Voronov D.A., Makarenkova H.P., Nezlin L.P., Panchin Yu.V., Spiridonov S.E. The ce"! lineage in the marine nematode Enoplus brevis. In: Ann. Conf. BSDB, BRA and BSCB (Abstracts). Leeds, 1991, P. 153.

V.

Подплсано в печать "0.01.1933 г. Зак. 749 Оор:.ш 60.^3-1/15. Тар. 133

Цосква. Типография Р13П