Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электронно-зондовой микроанализ концентрации элементов (Na,Cl,K) в мышечной клетке изолированного сердца при гипоксической деэнергизации

ВАК РФ 03.00.02, Биофизика

Автореферат диссертации по теме "Электронно-зондовой микроанализ концентрации элементов (Na,Cl,K) в мышечной клетке изолированного сердца при гипоксической деэнергизации"

На правах рукописи УДК 582.264

ПОГОРЕЛОВА ВАЛЕНТИНА НИКОЛАЕВНА

ЭЛЕКТРОННО-ЗОНДОВЫЙ МИКРОАНАЛИЗ КОНЦЕНТРАЦИИ ЭЛЕМЕНТОВ (N3, С1, К) В МЫШЕЧНОЙ КЛЕТКЕ ИЗОЛИРОВАННОГО СЕРДЦА ПРИ ГИПОКСИЧЕСКОЙ ДЕЭНЕРГИЗАЦИИ

03.00.02 — биофизика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

ПУЩИНО 2004г.

Работа выполнена в лаборатории термодинамики и энергетики биологических систем (заведующий - доктор медицинских наук, профессор Е.И.Маевский) Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН (г. Пущино)

Научные руководители:

доктор медицинских наук, профессор Е.И. Маевский доктор биологических наук А.Г. Погорелов

Официальные оппоненты:

доктор биологичсеких наук, профессор Я.Ю. Комиссарчик доктор биологичсеких наук, профессор В.П. Зинченко

Ведущая организация: Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита диссертации состоится "21" января 2004 г. в 15 часов 30 мин. на заседании диссертационного совета Д 002.093.01 в Институте теоретической и экспериментальной биофизики РАН по адресу: 142290, г. Пущино Московской обл., ул. Институтская,3, ИТЭБ РАН

С диссертацией можно ознакомиться в Ученом Совете ИТЭБ РАН и в чительном зале НЦБП (гЛущино)

Автореферат разослан декабря 2003 г.

Ученый секретарь диссертационного совете кандидат физико-математических наук

200 &'А

213 030

-1-

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность работы.

Возможность коррекции гипоксических изменений предполагает обратимый переход мышечной клетки в новое физиологическое состояние. В частности, предполагается, что наличие сдвигов в активности специфичных механизмов ионного транспорта позволяет миоциту переживать гипоксию. Для такого предположения есть основания если исходить из того, что жизнь возникла и длительное время развивалась в среде с низким содержанием кислорода. В этот период эволюции возникли и закрепились механизмы адаптации клетки к гипоксическим условиям.

В какой степени эволюционно- обусловленные перестройки ионтранспортирующих систем способны проявить себя в современных условиях представляется одной из интригующих проблем миологии (Booth et al., 2002). При условии, что такие древние механизмы сохранились, они могут актвизироваться в экстремальных физиологических ситуациях и при патологических состояниях, для которых характерно понижение уровня кислорода в ткани. Известно, что быстрые и выраженные проявления гипоксии обусловлены деэнергизацией кардиомиоцита, которая сопровождается уменьшением концентрации АТФ в цитозоле и накоплением в нем протонов и анионов лактата (Allen, Orchard, 1987). К "спящим" механизмам, которые в гипоксических условиях непосредственно реагируют на снижение энергетического статуса миоцита можно отнести модификацию Na/K-АТФазы (Pogorelov et al., 1999; Rodriguez et al., 2002) и систему пассивного транспорта калия: АТФ-зависимый калиевый канал (Noma, 1983); Na -зависимый калиевый канал (Kameyama et al., 1984; Niu, Meech, 2000); кислород- зависимый калиевый канал: Kq2 (Conforti et al., 2000). Условия работы

всего энергозависимого комплекса, ответственного за транспорт ионов калия при гипоксии, рассмотрены ранее (Silverman, Stern, 1994; Pierce, Czubryt, 1995; Погорелов и др., 2002; Погорелов и др., 2003).

В гипоксических условиях активизируются также и процессы, чья активность направлена на компенсацию гипоксического ацидоза и лактоза. В их ряду: Na+-H+ обмен (Lazdunsky et al., 1985; Karmazyn et al., 1999); Na+-2HC03

симпорт (Camilion de Hurtado et al., 1995; Korichneva et al., 1995; Camilion de

+

Hurtado et al., 1996a); СГ- ОН" обмен и CI - H симпорт (Hun, Vaughan-Jones, 1997); СГ - НСОз" обмен (Linn et al., 1995); 2Cf/Na+/K+ симпорт (Ramasamy et al., 2001); К-C1 симпорт (Case, 1972); Lact -Н симпорт (Leeks, Halestrap, 1978;); Lact - К+ симпорт (Kleber, 1983; 1984; Lindinger et al., 1996); Lact* - Cl' и Lact" -НСОз~ обмен (Halestrap, McGivan, 1979).

Перечисленные выше системы адаптации кардиомиоцита к гипоксической деэнергизации включают перенос протонов и ионов натрия, калия и хлора через цитоплазматическую мембрану, что приводит к изменению ионного гомеостаза клетки. Изменение баланса основных внутриклеточных элементов (К, Na, Cl) не только описывает интегративную активность систем компенсации гипоксической деэнергизации, но и индуцирует молекулярно-генетические изменения в мышечной пптг гррлт Р"Т"иу лг" птчп'мпчип механизмов,

ЮС. НАЦИОНАЛЬНАЯ 6ИР ¡Í'^TEKA С.Петербург

т$рк_

лежащих в основе адаптации кардиомиоцита к условиям гипоксии, актуальным является анализ изменения во времени концентрации натрия, хлора и калия на фоне нарастающей деэнергизации. В настоящее время хорошо отработана методика измерения внутриклеточного pH (Camilion de Hurtado et al., 1995; 1996; Schafer et al., 2000). Однако не ясно в какой степени гипоксический ацидоз и лактоз связаны с изменением баланса основных цитоплазматических ионов (Na, CI, К); не понятно соотношение активного и пассивного транспорта калия в системе адаптации миоцита к гипоксии.

Прямого ответа на поставленные вопросы не было получено из-за отсутствия адекватного метода определения концентрации элементов (Na, С1, К) в отдельной морфологически идентифицированной клетке в ткани. Решение данной проблемы стало возможным после развития электронно-зондового микроанализа (Goldstein et al., 1992) и криогенных методов подготовки срезов ткани для электронной микроскопии (Echlin, 1992; Warley, 1997). Указанные подходы позволили разработать прямой метод измерения концентрации натрия, хлора и калия в цитоплазме мышечной клетки сердца ex vivo (Pogorelov et al., 1991). Цель исследований

В связи с изложенным, цель работы заключалась в изучении изменения во времени концентрации натрия, калия и хлора в кардиомиоцитах с помощью электронно-зондового микроанализа при гипоксической деэнергизации перфорированного сердца.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Разработать экспериментальную модель гипоксической деэнергизации кардиомиоцитов при перфузии изолированного сердца.

2. Посредством контроля параметров сократительной функции сердца (частота и амплитуда сокращения) и анаэробного гликолиза (изменение концентрации лактата в постперфузионной жидкости) стандартизировать условия экспериментальной гипоксической деэнергизации.

3. Методом электронно-зондового микроанализа измерить концентрации натрия, хлора и калия в мышечной клетке сердца в разные периоды гипоксической деэнергизации.

4. Определить значение эмпирического коэффициента КА для рубидия в уравнении, которое применяется при расчете внутриклеточной концентрации элементов по интенсивности их характеристического рентгеновского излучения.

5. В разные периоды гипоксической деэнергизации сердца измерить внутриклеточную концентрацию рубидия, используемого в физиологических экспериментах в качестве аналога калия, для анализа соотношения активного и пассивного транспорта калия в кардиомиоцитах.

Научная новизна

Методом электронно-зондового микроанализа показано, что при гипоксической деэнергизации изменение баланса основных элементов (К, Na, С1) в цитоплазме мышечной клетки протекает в три фазы. Во временной динамике эти изменения последовательно соответствуют начальной фазе нарастающей деэнергизации, которая затем переходит в электро-механическое разобщение функции сердца с последующей фазой глобальной деэнергизации.

-3В первой фазе гипоксической деэиергизации обнаружено явление разнонапраленного транспорта калия из миоцита и хлора в клетку, что, по-видимому, сопряжено с активацией систем выхода лактат-аниона в межклеточное пространство для компенсации гипоксического лактоза.

В отличие от сложившихся представлений о физиологической

+ +

идентичности катионов К и Rb экспериментально установлено, что рубидий не выходит из мышечной клетки сердца посредством пассивного транспорта.

Впервые выявлено, что наличие рубидия во внеклеточном пространстве ингибирует специфические калиевые каналы, которые активизируются в условиях гипоксии.

Практическая значимость

Разработана экспериментальная модель, позволяющая создавать контролируемую глубокую гипоксическую деэнергизацию на изолированном сердце крысы Wistar в условиях проточной перфузии.

На основе разработанной экспериментальной модели гипоксической деэнергизации предложен метод доклинического (на животных) изучения специфической активности кардиотропных препаратов.

Разработан метод количественного электронно-зондового микроанализа концентрации рубидия в миоцитах на лиофилизированных криосрезах папиллярной мышцы сердца. Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: 12 ICXOM (Cracow, 1989), "Low temperature microscopy and microanalysis" (Cambridge, 1990), 12th Pfefferkorn Conference "The Science of Biological Microanalysis" (Cambridge, 1993),"MICRO 96" (London, 1996), "CRYO 97" (York, 1997), "Scanning 97" (California, 1997), "Biological Motility: modern methods for studying" (Pushchino, 1998), "Heart disease-new trends in research, diagnosis and treatment" (Washington, 1999), "Electron probe microanalysis today-practical aspects" (Trest, 2000), "Modern developments and applications in microbeam analysis" (Tampere, 2001), "Biological motility: new trends in research" (Pushchino, 2001), а так же на Всероссийских конференциях:"Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996), "Гипоксия: механизмы, адаптация и коррекция" (Москва, 1997; 2002), "Профилактическая кардиология" (Москва, 2000), "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002), "Рентгеновская оптика-2003" (Н.-Новгород, 2003), "II Всероссийский сьезд токсикологов" (Москва, 2003). Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания протоколов, методов и обьекта эксперимента, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 102 страницах, включая 8 таблиц и 13 рисунков. Публикации.

По материалам диссертации опубликовано 27 печатных работ; из них 10 статей в отечественных и зарубежных изданиях.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Введение. Здесь обоснована актуальность темы, сформулирована цель работы и основные задачи исследований.

Обзор литературы по теме работы. В этой главе проведен анализ научных публикаций по проблеме ионных механизмов компенсации гипоксического ацидоза и лактоза; деэнергизации, гликолиза и гликогенолиза в гипоксических условиях; молекулярно-генетических нарушений при гипоксии. Методы, объект и протоколы эксперимента.

Исследования проводили на изолированном сердце крысы Wistar (самцы весом 350-400 грамм). Нормоксическую перфузию изолированного сердца (по Лангендорфу) осуществляли раствором Тироде, аэрированным газовой смесью (5% С02,95% 02).Условия гипоксической деэнергизации создавали, перфузируя сердце раствором Тироде без глюкозы, деоксигенацию которого было предложено проводить путем его вакуумной дегазации.

В течение перфузии проводили мониторинг амплитуды и частоты сокращения изолированного сердца. Регистрацию параметров осуществляли посредством измерения давления в катетере, который вводили в левый желудочек сердца. Сигнал преобразовывался в цифровой вид, записывался в базу данных компьютера Pentium III и обрабатывался с помощью авторской программы Закарян A.A. "Puisai5'. Здесь амплитуда (развиваемое давление) определялась как разница систолического (СД, мм.рт.ст.) и конечно-диастолического давлений (КДД. мм.рт.ст.) в левом желудочке сердца. Частота сердечных сокращений (ЧСС) вычислялась как единица, деленная на длительность периода (Р) между максимумами давления в левом желудочке: ЧСС^«*) = 1/Р. При построении графиков изменения параметров во времени каждая точка рассчитывалась как медиана экспериментальных значений, полученных за 5-6 секунд работы изолированного сердца.

Опосредованно развитие гипоксической деэнергизации описывается концентрацией лактата в постперфузионной жидкости, которая формируется из раствора Тироде при перфузии им изолированного сердца. Для определения концентрации лактата забирали пробы жидкости, вытекающей из сердца через 5 мин, 15 мин и 30 мин проточной перфузии. Концентрацию метаболита, основного интегративного показателя анаэробного гликолиза, определяли энзиматически по модифицированной методике (Bergmeyer, 1974) в предварительно подготовленных безбелковых экстрактах. Определение лактата основано на

сопряженной работе двух ферментов: лактатдегидрогеназы (ЕС 1.1.1.27) и

+

аланинаминотрансферазы (ЕС 2.6.1.2). В присутствии избытка НАД и

+

лактатдегидрогеназы лактат превращается в пируват с восстановлением НАД до НАД Н. Присутствующий в реакционной среде (0,15М глутаматный буфер, pH 8,9) фермент аланинаминотрансфераза катализирует превращение образующегося пирувата в аланин, что способствует полному окислению лактата. Изменение степени восстановленности НАД H определяли по увеличению флуоресценции при 340 нм с помощью модифицированного флуориметра ФАНУХ 2. Определение лактата в постперфузионной жидкости проводили в совместном эксперименте с к.б.н. Гришиной Е.В.

Метод подготовки лиофилизированных криосрезов мышечной ткани для электронно-зовдового микроанализа описан нами ранее (Pogorelov et а!., 1991). По окончании перфузии из левого желудочка сердца выделяли папиллярную мышцу Ткань монтировали на держатель из томпака и замораживали в жидком пропане (-188°С). Криофиксированный образец помещали в криостат (-30°С), где получали поперечные криорезы толщиной 10 мкм. В камере криостата срезы собирали в охлажденный медный контейнер, который в парах жидкого азота переносили на столик вакуумной-установки Micro ВА 3 (Balzers, Лихтенштейн), где они лиофилизировались 12 часов в вакууме 10"5 Ра. Затем криосрезы монтировали на медной сеточке и на их поверхность вакуумным распылением наносили слой углерода толщиной 20-40 нм.

На лиофилизированных криосрезах папиллярной мышцы сердца проводили измерение концентрации элементов в миоцитах посредством электронно-зондового микроанализа (Pogorelov eta!., 1991; 1994). Для анализа использовали сканирующий электронный микроскоп JSM-U3 (JEOL, Япония). Микроанализ проводили при ускоряющем напряжении 25 кВ, токе электронов зонда ~5 нА и времени накопления импульсов характеристического рентгеновского излучения 20 сек. Морфологию криосреза наблюдали в режиме вторичных (SEM) или прошедших (STEM) электронов. Результаты и их обсуждение.

Анализ различных схем перфузии изолированного сердца позволил прийти к заключению, что наиболее выражено деэнергизация проявляется при гипоксической перфузии без глюкозы. По этой причине указанный протокол выбран нами как базовый для проведения данного исследования. Ниже представлены характерные кривые изменения пульсовой амплитуды и частоты сокращения изолированного сердца с течением гипоксической деэнергизации.

3 5 7 9 1] 13 15 !7 19 Л 23 25 27

Рисунок 1. Изменение относительной пульсовой амплитуды (А%) сокращения изолированного сердца крысы линии \Vistar во время (мин) гипоксической деэнергизации. Начальный период (~6 мин) отвед ен для нормоКСической перфузии с глюкозой. Стрелкой отмечено начало гипоксической перфузии (Нур-Яи). Приведены средние для группы из 24 животных, где средневкадартичное отклонение не превышает 10% от значения параметра, указанного на кривой

II 13 15 17 19 II 23 25 27

Рисунок 2. Изменение частоты (Гц) сокращения изолированного сердца крысы линии \Vistar во время (мин) гипоксической деэнергизации. Начальный период (-6 мин) отведен для нормоксической перфузии с глюкозой. Стрелкой отмечено начало гипоксической перфузии (Нур-01и) Приведены средние для группы из 24 животных, где средневкадратичное отклонение не превышает 10% от значения параметра, указанного на кривой..

Видно (рис. 1-2), что гипоксическая перфузия без глюкозы вызывает нарушение функции сокращения изолированного сердца. Для обеих кривых характерно резкое снижение сократительной активности в первые 20 минут с дальнейшим практически полным прекращением сокращения сердца. На рисунке 3 представлены кривые изменения со временем содержания лактата в пробах постперфузионной жидкости для разных схем эксперимента.

Рисунок Э. Изменение со временем концентрации (мМ) лактата в пробах жидкости, собранных после перфузии (6 мл/мин) изолированного сердца, в зависимости от протокола эксперимента, нормоксическая перфузия с глюкозой (нижняя) - "Ыопп+СИи"; гипоксическая перфузия с глюкозой (верхняя) - "Нур+(г1и"; гипоксическая перфузия без глюкозы - "Нур-Ои" В указанные промежутки времени не включен стабилизационный период (-6 мин) нормоксической перфузии раствором Тироде. Приведены средние значения для группы из 5 животных, где 0 5 И »и 30 среднеквадратичное отклонение не

превышает 10% от значения параметра, указанного на кривой

На рисунке видно, что к 5 минутам нормоксической перфузии уровень лактата выходит на плато. Такое поведение кривой свидетельствует о стабилизации работы изолированного сердца Зависимость содержания лактата в постперфузионной жидкости от длительности гипоксической перфузии без глюкозы на рисунке 3 маркируется знаком "Нур-СТи" Для этого протокола в области 20 минут концентрация лактата снижается до минимальной величины и его уровень стабилизируется. В отличие от ранее рассмотренной нормоксической перфузии, причина этого явления совсем другая. В отсутствие потока экзогенного субстрата окисляется только глюкоза, образующаяся при гидролизе внутриклеточного гликогена. В гипоксических условиях гликогенолиз ускоряется во много раз, что приводит к быстрому истошению запаса гликогена в миоците. Однако пока есть источник глюкозы экзогенной или эндогенной природы анаэробный гликолиз инициирует поток лактата во внеклеточное пространство. Поэтому, например, гипоксическая перфузия с глюкозой "Нур+ОЬГ характеризуется постоянным и высоким уровнем образования лактата. По мере развития гипоксической деэнергизации "Нур-Ии" выход лактата из клетки снижается, что приводит к уменьшению концентрации метаболита в постперфузионной жидкости при гипоксической перфузии без глюкозы.

Сравнительный анализ интегративных параметров показывает, что наблюдается два периода гипоксической деэнергизации изолированного сердца. Для начального периода (до 20 минут) характерно состояние нарастающей деэнергизации, которая протекает на фоне снижения сократительной активности и уровня анаэробного гликолиза. В заключительный период - период глобальной деэнергизации- регистрируется прекращение функции сокращения и низкая активность анаэробного гликолиза.

Рассмотрим действие гипоксии на внутриклеточное содержание натрия и калия - основных элементов, в регуляции баланса которых принимает участие цитоплазматическая Ка/К-АТФаза (рис.4).

Рнсунок 4. Изменение концентрации (Д мМ) калия (К) и натрия (N3) в мышечной клетке изолированного сердца с течением гипоксической деэнергизации относительно интактного состояния ([К]=122мМ; [Ыа]=36мМ; [С1]=24мМ). Приведены средние значения для не менее, чем 100 клеток в группе из 4 животных, где средневкадрэтичное отклонение не превышает 10% от значения концентрации, указанного на кривой.

Видно (рис.4), что для гипоксической деэнергизации характерно постоянное снижение уровня внутриклеточного калия и накопление в цитозоле натрия. Данная тенденция в изменении цитоплазматической концентрации элементов согласуется с имеющимися данными (Silverman, Stern, 1994; Pierce, Czubryt, 1995). При этом отношение величины натриевой нагрузки к значению калиевого дефицита не равно стехиометрии активного транспорта натрия и калия (Na:K=3:2) через Na/K-АТФазу (рис.5).

и 9-.................................................-................ Рисунок 5. Изменение отношения наколения

Ne/к-АТФаза (Na к*з 2) натрия к дефициту калия (ANa/AK) в

мышечной клетке изолированного сердца с течением гипоксической деэнергизации (Hyp-Glu) Кривая построена и сглажена в приложении Excel по данным таблицы 4. Для сравнения тоже отношение построено

Hyp-Glu .я............. для ситуации игибирования Ыа/К-АТФазы с

.... а-................учетом стехиометрии (3:2) активного

ип транспорта натрия и калия через насос.

.ANa/AK

V

013

Из рисунка 5 видно, что при гипоксической деэнергизации в кардиомиоците наблюдается дисбаланс калия и натрия, течение которого отличается от ситуации ингибирования Na/K-АТФазы (Gadsmy, Cranefield. 1977; 1979; Isenberg, Trautwein, 1979; Wit et a!., 1981). Этот факт объясним, если учесть активизацию дополнительных систем транспорта ионов, специфичных для гипоксических условий. Их работа изменяет сложившееся при нормоксии равновесие между активным и пассивным транспортом натрия и калия.

Оценим роль Na/K-АТФазы на цитоплазматической мембране в регуляции ионного гомеостаза при гипоксической деэнергизации. Предположим, что только ингибирование данного насоса является причиной калиевого дефицита (рис.4). Тогда, с учетом стехиометрического отношения активного транспорта (Na:K=3:2), расчитаем кривую накопления в миоците натрия, которая соответствует регистрируемому падению концентрации калия. Для сравнения расчетная и экспериментальная кривые приведены на рисунке 6.

Рисунок б. Экспериментальная кривая изменения концентрации (А мМ) натрия (N3 эксп) в мышечной клетке изолированного сердца с течением гипоксической деэнергизации относительно интактного состояния. Расчетная кривая (Ыа расч) построена из предпосылки, что регистрируемое изменение концентрации калия обусловлено только ингибированием Ыа/К-АТФазы при стехиометрическом отношении активного транспорта Ка.К=3 2

Сравнение экспериментальной и расчетной кривых (рис.5) показывает, что реальный уровень накопления натрия гораздо ниже, чем можно ожидать исходя из условия, если регистрируемый дефицит калия обусловлен только ингибированием Na/K-АТФазы. Данное несоответствие можно было бы отнести к работе систем, обеспечивающих выход натрия из клетки без участия Na/K-

АТФазы. К таким механизмам относится гипотетический натриевый насос,

+

транспортирующий из клетки только ион Na (Page, Storm, 1965; McDonald, MacLeod, 1972). Однако на цитоплазматической мембране кардиомиоците Na-АТФазы не обнаружено.

Частично натрий выводится из клетки посредством Na+-Ca2+ обмена (Eisner, Lederer, 1985). Показано, что в цитоплазме кардиомиоцита возможно увеличение концентрации кальция на 0.4 мМ (Kondratev, Gallitelli, 2003). Для пула внутриклеточного кальция это приращение представляет значительную величину, но оно не может заметно повлиять на уровень накопления в цитозоле натрия. Таким образом, высказанное изначально предположение о том, что калиевый дефицит в кардиомиоците при гипоксической деэнергизации обусловлен только ингибированием Na/K-АТФазы, не корректно.

Предположим, что гипоксическое блокирование Na/K-АТФэзы вызывает накопление натрия в цитоплазме, которое регистрируется в эксперименте (рис.4). Тогда концентрация калия в миоците должна уменьшаться в соответствии с кривой, показанной на рисунке 7.

20 Д) Щ) 50 ЙО

Рисунок 7. Экспериментальная кривая изменения концентрации (ДмМ) калия (К эксп) в мышечной клетке изолированного сердца с течением гипоксической деэнергизации относительно интактного состояния. Расчетная кривая (К расч) построена из предпосылки, что регистрируемое изменение концентрации натрия обусловлено только ингибированием Ыа/К-АТФазы при стехиометрическом отношении активного транспорта Na:K=3:2.

К (эксп)

Сравнение экспериментальной и расчетной кривых (рис.7) показывает, что при гипоксической деэнергизации дефицит калия более выражен, чем это ожидалось при условии, если накопление натрия обусловлено только ингибированием Ка/К-АТФазы. Данный результат вполне объясним активацией специфичных для гипоксии каналов выхода калия из клетки, например N8- или АТФ-зависимый калиевые каналы; сопряженный транспорт калия и лактата. Другими словами, при гипоксии возможна ситуация, когда накопление натрия в миоците определяется только снижением активности Ыа/К-АТФазы.

Рассмотренные выше сценарии построены на предположении, что гипоксический дисбаланс клеточного калия и натрия обуловлен ингибированием Ка/К-АТФазы. Такая предпосылка не вполне корректна, так как гликолиз может поддерживать внутриклеточный уровень АТФ (0.1 мМ), достаточный для работы Na/K-ATФaзы. В разработанной модели гипоксической деэнергизации метаболитное ингибирование активного транспорта также исключено. Таким образом, изменение внутриклеточной концентрации натрия и калия представляет собой интегративный результат работы активного и пассивного транспорта ионов. В условиях гипоксической деэнергизации работа Ыа/К-АТФазы направлена на предотвращение накопления натрия в миоците. При этом активный транспорт калия в миоцит маскируется более интенсивным выходом этого иона через механизмы, которые направлены на адаптацию мышечной клетки сердца к гипоксической деэнергизации.

Выше были рассмотрены возможные причины изменения внутриклеточной концентрации натрия и калия при гипоксической деэнергизации. Особенность этой пары катионов заключается в том, что в регуляции их внутриклеточного баланса принимает участие Ыа/К-АТФаза. В настоящее время обсуждается несколько систем компенсации гипоксии, в функционировании которых ведущую роль играет пассивный поток хлора через цитоплазматическую мембрану кардиомиоцита. Рассмотрим изменение концентрации хлора в мышечной клетке изолированного сердца с течением гипоксической деэнергизации. Сопоставим изменение концентрации лактата в постперфузионной жидкости и калия и хлора в миоците (рис.8).

Рисунок 8. Изменение с течением (мин) гипоксической деэнергизации концентрации (ДмМ) хлора и калия в кардиомиоците относительно интактного состояния и лактата в пробах постперфузионной жидкости относительно нормоксической перфузии

На рисунке 8 приведены кривые изменения концентрации элементов (С1, К) в мышечной клетке сердца и лактата в пробе постперфузионной жвдкости. Сравнительный эксперимент с различными протоколами деэнергизации (рис.3) показывает, что в условиях перфузии обеспечивается эффективное удаление лактата и предотвращается рост его концентрации в ткани. В данной работе не

определяли степень разбавления лактата, выходящего из миоцита, перфузионным раствором. На основе представленного выше графика можно оценить только временные тенденции выхода метаболита из клетки в интерстиций.

Видно (рис.8), что изменения калия и хлора в клетке и лактата в постперфузионной жидкости в процессе гипоксической деэнергизации не синхронны.

Нарастающая деэнергизация (фаза I)

В начальный период нарастающей гипоксии (фаза I) регистрируется высокий

уровень выхода лактата, развитие калиевого дефицита и накопление хлора в

+

миоците. Другими словами, ситуация характеризуется наличием С10 - К , антипорта, который, по-видимому, является комплексом уже известных систем, например:

+ . + (С1 о - К , антипорт)=> (С10 - Lact \ обмен) + (Lact, - К j симпорт) Такое сочетание известных механизмов, включающих транспорт лактата из клетки, сохраняет электронейтральность пассивного разнонаправленного транспорта калия и хлора и компенсирует клеточный лактоз. Действительно, в начальный период гипоксической деэнергизации (фаза I) наблюдается пик выхода лактата из кардиомиоцита. Электра- механическое разобщение (фаза II)

После 20 мин гипоксической деэнергизации клетки прекращается сокращение сердца (рис. 1-2), регистрируется низкий уровень анаэробного гликолиза (рис.3) и, в результате, отсутствие лактоза и ацидоза. При этом на фоне стабилизации интегративных характеристик работы сердца наблюдается активность ионтранспортрирующих систем. В период с 20 минут до 35 минут гипоксической перфузии без глюкозы в миоците стабилизируется концентрация натрия и калия (рис.4) и нормализуется ситуация по хлору (рис. 8). Такая ситуация, когда отсутствует сократительная активность, но остается функция поддержания мембранного потенциала свидетельствует об электро-механическом разобщении (фаза II). Глобальная деэнергизация (фаза III).

В конце гипоксической перфузии без глюкозы наблюдается тенденция к уравновешиванию ионного состава внеклеточной среды и цитозоля, что

+

выражается в значительном накоплении в миоците экзогенных ионов (Na , С1) и падении внутриклеточной концентрации калия. Указанные изменения уже не связаны с механизмами компенсации гипоксической деэнергизации.

+ +

Одновременное резкое уменьшение градиента основных электролитов (К , Na ,

С1) может свидетельствовать о блокировании Na/K-АТФазы, обусловленном глобальной деэнергизацией миоцита. Однако, учитывая низкий уровень ингибирования активности указанного белка по АТФ (0.1 мМ), для любой из рассмотренных фаз деэнергизации остается вопрос о роли Ыа/К-АТФазы.

Анализ интегративной активности ионтранспортирующих систем

кардиомиоцита показывает, что по критерию внутриклеточного баланса ионов

+ - +

(Na , С1, К , Lact) регистрируется три периода гипоксической деэнергизации. Начальная фаза проходит на фоне нарастающей деэнергизации клетки и активизации механизмов транспорта ионов, направленных на компенсацию

аиидоза и лактоза. При этом падает сократительная активность сердца и снижается уровень анаэробного гликолиза. Для второй фазы характерно состояние электро-механического разобщения функции сердца, которое сопровождается прекращением сокращения на фоне активной Ыа/К-АТФазы. На заключительной фазе гипоксической деэнергизации наблюдается резкое и значительное уменьшение градиента на мембране кардиомиоцита. Тенденция к выравниванию концентрации основных электролитов (Ыа, С1, К) в цитозоле и внеклеточном пространстве свидетельствует об ингибировании Na/K-АТФгзы, что обусловлено глобальной деэнергизацией клетки.

В процессе гипоксической деэнергизации формируются два разнонаправленных потока для калия и натрия. Активная составляющая определяется работой Na/K-АТФазы, а пассивный транспорт комплексом специфических для гипоксии каналов. При этом мощный пассивный транспорт электролита маскирует работу Na/K-АТФазы. Таким образом, конечная внутриклеточная концентрация элемента (К, Na) зависит от интегративной активности системы ассиметричных ионтранспортирующих механизмов.

При наличии двух противоположно направленных потоков, суммарная концентрация калия в клетке может меняться незначительно. Как разделить эти два потока и оценить активность Na/K-АТФазы? С этой целью в экспериментах с ЯМР спектроскопией изолированного сердца в перфузирующую жидкость вводят ион рубидия (Cross et al., 1995; Kupriyanov et al., 1996; Kupriyanov et al., 1999a; Kupriyanov et al., 1999b). Замена во внеклеточном пространстве калия на рубидий используется и при изучении физиологии активного транспорта калия в системе нейрон-глиальная клетка (Saubermann et al., 1992). В последнем исследовании применяли элекгронно-зондовый микроанализ для качественной оценки замены внутриклеточного калия на рубидий. В перечисленных выше работах рубидий рассматривается как физиологический аналог внеклеточного калия. При этом предполагают, что вход рубидия в клетку маркирует активный траспорт калия через Na/K-АТФазу.

В данной работе описанный выше прием с рубидием, который разработан для оценки уровня активного транспорта внеклеточного калия, был применен к кардиомиоциту в условиях гипоксической деэнергизации сердца. На рисунке 9 приведены данные электронно-зондового микроанализа внутриклеточной концентрации рубидия и калия при гипоксической перфузии с рубидием и без него.

™ - Рисунок 9. Изменение концентрации

50 t

элементов (К, ЯЬ) в мышечной клетке изолированного сердца при гипоксической деэнергизации- К(+ЯЬ) - калий на фоне перфузии с рубидием; К(-ЯЬ) - калий на фоне перфузии без рубидия; ЯЬ - рубидий при перфузии, содержащей рубидий. Приведены средние значения, для которых среднеквадратичное отклонение не превышает 10% от значения, указанного на

о

10 20 30 40 »

а кривой.

Расмотрим изменение содержания калия и рубидия в кардиомиоците при при гипоксической деэнергизации (рис.9). В начальный период концентрация рубидия в цитозоле достигает величины, которая в несколько раз превышает

уровень рубидия в перфузате (2,5 мМ). Таким образом, если предположение об + +

идентичности ионов К и Ш> для мембранного транспорта признать верным, то накопление последнего в кардиомиоците подтверждает работу Na/K-ATФaзы. Присутствие рубидия в межклеточном пространстве значительно модифицирует

развитие внутриклеточного калиевого дефицита при гипоксической

+ +

деэнергизации (рис. 9). Предполагалось, что Ю>, конкурируя с К на Ыа/К-АТФазе, снизит поток калия в клетку и, в результате, в цитозоле усилится калиевый дефицит. При этом суммарная цитоплазматическая концентрация калия и рубидия должна быть равна содержанию калия в эксперименте без рубидия. Высказанный прогноз оказался неверным (рис. 9). Таким образом, предположение о том, что ионы калия и рубидия являются физиологическими аналогами, не корректно. Чтобы оценить роль рубидия при гипоксической деэнергизации был проведен эксперимент, который включал в себя комбинации перфузий с рубидием и без него (рис.10). (А)

К (бОмин)

90 т 75 4-иМ 60 -45 -30 -15 1

о н-

(В)

К (ЗОмин) К+Шэ(30мин)

(С)

К+Шэ(30мин) К (ЗОмин)

90 т

75+ "м 60 + 45 у 30 {

яь

90 т 75 |мМ 60 + 45

30 + 15 0

яь

Рисунок 10. Концентрация калия и рубидия в мышечной клетке изолированного сердца после 60 минут гипоксической деэнергизации в зависимости от схемы эксперимента.. (А) -60 минут перфузии без рубидия; (В) - 30 минут перфузии без рубидия и следующие 30 минут нагрузка рубидием; (С) - 30 минут перфузии с рубидием и следующие 30 минут отмывка рубидия. Уровень значимости между средними значениями элементов в экспериментах (АС) и (В), оцененный по критерию Стьюдента, составляет р<0 03

Видно (рис. 10), что в эксперименте с нагрузкой рубидием во второй половине перфузии (схема В) в миоците регистрируется около 3 мМ рубидия. Настолько же повышается концентрация элемента за последние 30 минут

непрерывной гипоксической перфузии, когда в перфузирующем растворе

+

постоянно присутствует ЛЬ (рис. 9), что почти на порядок меньше от уровня накопления за весь период перфузии. Полученный результат свидетельствует об очень низкой активности Ыа/К-АТФазы во второй половине гипоксичекой деэнергизации. Следует отметить, что в конце рассматриваемого эксперимента (схема В) концентрация калия гораздо выше, чем в протоколе с перфузией без рубидия (схема А). По-видимому, катион рубидия блокирует выход калия из клетки. Учитывая состояние глобальной деэнергизации, для которого характерны низкий уровень АТФ и высокая концентрация Ыа, можно полагать, что мишенью рубидия является К -канал или К -канал. Однако не понятно, находясь с

АТФ N8

какой стороны цитоплазматической мембраны рубидий оказывает ингибирующее влияние на транспорт калия из кардиомиоцита.

В случае противоположной схемы перфузии (С), когда сердце подвержено рубидиевой нагрузке в первой половине гипоксической деэнергизации, в конце эксперимента в миоците регистрируется 17 мМ рубидия (рис.10). Указанное значение соответствует уровню рубидия в клетке на 30 минуте непрерывной рубидиевой перфузии (рис.9). Таким образом, концентрация рубидия, который накопился в миоците за первую половину перфузии, не

меняется в результете последующих 30 минут перфузии без рубидия. Из этого

+

можно сделать вывод, что в отличии от калия, катион ЯЬ не "вымывается" из мышечной клетки сердца на заключительной фазе гипоксической деэнергизации.

В предыдущей схеме перфузии (В) транспорт калия из миоцита блокировался низкой концентрацией рубидия, который находился одновременно в цитоплазме и во внеклеточном пространстве. В последнем эксперименте (схема С) на заключительной фазе гипоксической деэнергизации регистрируется высокий уровень рубидия, но только в клетке. При этом, к концу перфузии внутриклеточная концентрация калия достигает минимальной величины, соответствующей гипоксической перфузии без рубидия (А). Из этого факта следует, что рубидий блокирует пассивный транспорт калия находясь только с внешней стороны цитоплазматической мембраны. Суммируя обсуждение результатов, полученных в экспериментах по гипоксической деэнергизации с участием рубидия, можно сделать следующее заключение:

• Рубидий, который используется как физиологический аналог внеклеточного калия, входит в мышечную клетку изолированного сердца посредством активного транспорта;

• В начальный период гипоксической деэнергизации регистрируется высокая активность Ыа/К-АТФазы, которая практически полностью ингибируется на заключительной фазе при глобальной деэнергизации;

• Анализ результатов чередующейся перфузии раствором, содержащим

+ +

рубидий и без него, показал, что катион Ш>, в отличие от К , не выходит из кардиомиоцита через систему пассивного транспорта калия;

• Присутствие рубидия во внеклеточном пространстве блокирует

пассивный транспорт калия из кардиомиоцита. Заключение

Анализ литературных данных и результатов собственных исследований показывает, что регистрируемые при гипоксической деэнергизации изменения внутриклеточного баланса элементов (N8, С1, К) являются результом интегративной работы активного транспорта и системы анти- и симпортов ионов.

В условиях гипоксической деэнергизации вход калия в клетку посредством Иа/К-

+

АТФазы маскируется более интенсивным выходом иона К через комплекс калиевых каналов.

+ - +

По критерию внутриклеточного баланса ионов (N8 , С1, К ) и интегративных характеристик работы сердца для гипоксической деэнергизации наблюдается три выраженных во времени фазы. Начальная фаза проходит на фоне нарастающей деэнергизации клетки и активизации механизмов транспорта ионов, направленных на компенсацию ацидоза и лактоза. Для второй фазы характерно состояние электро-механического разобщения функции сердца, которое сопровождается прекращением сокращения на фоне активной Иа/К-АТФазы. На заключительной фазе глобальной деэнергизации наблюдается резкое и значительное уменьшение градиента С1, К) на мембране кардиомиоцита, что свидетельствует об ингибировании Ыа/К-А'ГФазы.

Рубидий, который в физиологических экспериментах традиционно используется как аналог калия, входит в мышечную клетку изолированного

сердца посредством Ка/К-АТФазы. При этом в условиях гипоксической

+ +

деэнергизации катион Шз, в отличие от К , не выходит из кардиомиоцита. Более того, присутствие рубидия во внеклеточном пространстве блокирует индуцированный гипоксической деэнергизацией выход калия из кардиомиоцита. Выводы:

1. Методом электронно-зондового микроанализа показано, что при гипоксической деэнергизации изменение баланса основных элементов (К, Ма, С1) в цитоплазме мышечной клетки протекает в три фазы. Во временной динамике эти изменения последовательно соответствуют начальной фазе нарастающей деэнергизации, которая затем переходит в электро-механическое разобщение функции сердца с последующей фазой глобальной деэнергизации.

2. Разработана экспериментальная модель гипоксической деэнергизации кардиомиоцита в условиях проточной перфузии изолированного сердца по Лангендорфу с быстрой, глубокой, контролируемой деоксигенацией перфузирующего раствора путем его вакуумной дегазации и регистрацией интегративных параметров работы сердца: изменение со временем частоты сокращения; амплитуды пульсового давления; концентрации лактата в постперфузионной жидкость.

3. Показано, что в процессе гипоксической деэнергизации потеря кардиомиоцитом калия и накопление в цитоплазме натрия происходят в стехиометрии, не соответствующей функционированию Ыа/К-АТФазы: дефицит калия существенно превышает накопление натрия.

4. Проведенный анализ свидетельствует о том, что в начальной фазе гипоксической деэнергизации нарастающий калиевый дефицит обусловлен выходом калия при участии лактат-хлор транспортирующих систем

• компенсации ацидоза и лактоза тогда, как активность Na/K-АТФаза

направлена на предотвращение прироста внутриклеточной концентрации натрия. Изменение концентрации Na, К и Cl в процессе дальнейшей деэнергизации отражает состояние электро-механического разобщения и низкий уровень гликолиза. На заключительной фазе гипоксии происходит глобальная деэнергизация кардиомиоцита и ингибирование Na/K-АТФазы.

5. С помощью тест-объекта эмпирически определено значение поправочного коэффициента для определения концентрации рубидия методом электронно-зондового микроанализа.

6. Показано, что рубидий не является физиологическим аналогом калия. При гипоксической деэнергизации присутствие рубидия во внеклеточном пространстве блокирует пассивный транспорт калия из кардиомиоцита В такой ситуации рубидий может использоваться только для изучения активного транспорта калия через Na/K-АТФазу.

СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Pogorelov A.G., Allachverdov B.L., Burovina I.V., Mazay G.G., Pogorelova V.N., 1991. Study of potassium deficiency in cardiac muscle: cryotechniques and X-ray microanalysis. J, of Microscopy, 12:24-38.

2. Pogorelov A., Budantsev A., Pogorelova V., 1993. Quantitative electron probe microanalysis of AChE activity in rat brain section. J. ofHistoche. Cytochem., 41: 1795-1800.

3. Pogorelov A., Pogorelova V., Smirnova S., Spiridonov N., 1994. EPMA of dried biological substances. Mikrokimica Acta, 115/116: 405-411.

4. Pogorelov A., Pogorelova V., Repin N., Mizin I., 1994. Quantitative Electron Probe Microanalysis with a wavelength dispersive spectrometer. Scanning Microscopy, Suppl. 8.: 101-108.

5. Pogorelov A, Pogorelova V., Mizin I., 1995. Assay of elemental environment for AChE in brain sections with EPMA. The Journal of Scanning Microscopies, 27.

6. Pogorelov A., Budantsev A., Pogorelova V., Mi7in I., 1997. Assay of acetylcholinesterase activity and elemental composition in brain compartments by electronprobe microanalysis. Brain Research Protocols, 1: 44-48.

7. Погорелов А.Г., Кокоз Ю.М., Дубровкин М.И., Погорелова В.Н., Корыстова А.Ф, Кузьмин B.C., 1997. Сравнительный анализ внутриклеточного содержания калия для кардиомиоцита в ткани папиллярной мышцы и первичной культуре сердца Цитология, 39: 829-834.

8. Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Дубровкин М.И., Демин И.П., 2000. Анализ элементного состава (Na/K/Ca) мышечной клетки при ишемии на модели перфузированного сердца. Цитология, 42 (1): 62-65.

9. Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Дубровкин М.И., Хренова Е.В., Демин И.П., 2002. Активация специфичных мембранных механизмов мышечной клетки сердца на ранней стадии ишемии. Биофизика, № 47(2): 744-752.

10. Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Хренова Е.В., Дубровкин М.И., Демин И.П., 2004. Роль "спящих" механизмов в регуляции K/Na баланса мышечной клетки сердца при гипоксии. Ж. эволюционной биохимии и физиологии (в печати).

11. Pogorelov A., Pogorelova V., Dubrovkin M., 1996. The potassium excess in cardiomyocyte of hibernating ground squirrel. Royal Microscopical Society Journal/London, 31:147-148.

12. Pogorelov A., Pogorelova V., Dubrovkin M., 1997. Assay of anoxia-induced potassium depletion in cardiomyocyte with Electron Probe Microanalysis. The Journal of Scanning Microscopies, 19:213.

13. Погорелое А.Г., Погорелова B.H., Дубровкин М.И., Кузьмин С.В., 1997. Развитие гипокалиемии в мышечной клетке сердца при гипоксии. В сб. Гипоксия: механизмы, адаптация и коррекция (Москва), 96-97.

14. Pogorelov A., Pogorelova V., Dubrovkin М., Demin I., 1998. Electron probe microanalysis of ischaetnic changes in elemental contents of cardiomyicyte. In: Biological Motility: modem methods for studying (Puschcino), 120-122.

15. Погорелов А.Г, Демин И.П., Погорелова B.H., Зинченко В.П., 2000. Коррекция элементного состава (К, Na, CI) мышечной клетки сердца при ишемии тетрафенилфосфонием (ТРР+). В сб. "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино), 219-222.

16. Pogorelov A., Demin I., Pogorelova V., Khrenova Е., 2001. Assay of potassium active transport in myocell of isolated heart during cardiac ischaemia. In: "Biological motility: new trends in research" (Pushchino), 115-117.

17. Погорелов А.Г., Погорелова B.H., Хренова E.B., Демин И.П., 2002. Особенности ионного транспорта в мышечной клетке сердца при гипоксии. В сб. "Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция" (Москва): 92-93

18 Погорелов А.Г., Погорелова В.Н., Хренова Е.В., Демин И.П., 2003. Электронно-зондовый микранализ биоорганических пленок. В сб. "Рентгеновская оптика-2003" (Н.Новгород): 160-163. 19. Погорелов А.Г., Сухова Г.С., Погорелова В.Н., Хренова Е.В., Закарян А.А., 2003. Анализ Na/K баланса в мышечной клетке сердца при гипотермии. В сб. Съезда общества клеточной биологии и симпозиума по проблемам мейоза (С.Петербург): 79.

Принято к исполнению 16/12/2003 Исполнено 16/12/2003

Заказ №461 Тираж 70 экз

ООО «НАКРА ПРИНТ» ИНН 7727185283 Москва, Балаклавский пр-т, 20-2-93 (095) 318-40-68 www autoreferat.ru

РПБ Русский фонд

2006-4 17991

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Погорелова, Валентина Николаевна

ВВЕДЕНИЕ 3

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 11

Ионные механизмы компенсации ¿токсического ацидоза и 11-19 лактоза

Деэнергизация, гликолиз и гликогенолиз в гипоксических 19-23 условиях

Молекулярно-генетические нарушения при гипоксии 23

ПРОТОКОЛЫ, МЕТОДЫ И ОБЪЕКТЫ ЭКСПЕРИМЕНТА 26

Протоколы перфузии изолированного сердца крысы \Vistar 26

• Проточная нормоксическая перфузия изолированного сердца.

• Проточная гипоксическая перфузия изолированного сердца. 26

• Введение вещества на фоне проточной перфузии. 29 Методы измерения интегративных характеристик 30

• Измерение амплитуды и частоты сокращения изолированного 30-31 сердца.

• Измерение концентрации лактата в пробах постперфузионной 31-32 жидкости.

Электронно-зондовый микроанализ 32

• Подготовка лиофилизированных криосрезов 32

• Параметры электронно-зондового микроанализа 33

• Расчет концентрации элементов 34-35 РЕЗУЛЬТАТЫ 36-42 ОБСУЖДЕНИЕ 43-75 Стандартизация условий экспериментальной гипоксии и 43-54 анализа

• Количественный электронно-зондовый микроанализ. 43

• Деэнергизация кардиомиоцита, моделируемая в условиях 46-54 гипоксической перфузии (без глюкозы) изолированного сердца.

Изменение концентрации элементов (Иа, С1, К) в мышечной 55-74 клетке изолированного сердца при гипоксии

• Анализ изменения Иа/К баланса в мышечной клетке 55-62 изолированного сердца при гипоксии.

• Анализ изменения концентрации хлора в мышечной клетке 62-67 изолированного сердца при гипоксии.

• Анализ изменения в мышечной клетке концентрации рубидия- 67-75 маркера потока внеклеточного калия в миоцит.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Электронно-зондовой микроанализ концентрации элементов (Na,Cl,K) в мышечной клетке изолированного сердца при гипоксической деэнергизации"

Актуальность темы

Возможность коррекции гипоксических изменений предполагает обратимый переход мышечной клетки в новое физиологическое состояние. В частности, предполагается, что наличие сдвигов в активности специфичных механизмов ионного транспорта позволяет миоциту переживать гипоксию. Для такого предположения есть основания, если исходить из того, что жизнь возникла и длительное время развивалась в среде с низким содержанием кислорода. В этот период эволюции возникли и закрепились механизмы адаптации клетки к гипоксическим условиям.

В какой степени эволюционно-обусловленные перестройки ионтранспортирующих систем способны проявить себя в современных условиях представляется одной из интригующих проблем миологии (Booth et al., 2002). При условии, что такие древние механизмы сохранились, они могут актвизироваться в экстремальных физиологических ситуациях и при патологических состояниях, для которых характерно понижение уровня кислорода в ткани. Известно, что быстрые и выраженные проявления гипоксии обусловлены деэнергизацией кардиомиоцита, которая сопровождается уменьшением концентрации АТФ в цитозоле и накоплением в нем протонов и анионов лактата (Allen, Orchard, 1987). К "спящим" механизмам, которые в гипоксических условиях непосредственно реагируют на снижение энергетического статуса миоцита можно отнести модификацию Na/K-АТФазы

Pogorelov et al., 1999; Rodríguez et al., 2002) и систему пассивного транспорта калия: АТФ-зависимый калиевый канал (Noma, 1983); Na -зависимый калиевый канал (Kameyama et al., 1984; Niu, Meech, 2000); кислород- зависимый калиевый канал: Ко2 (Conforti et al., 2000). Условия работы всего энергозависимого комплекса, ответственного за транспорт ионов калия при гипоксии, рассмотрены ранее (Silverman, Stern, 1994; Pierce, Czubryt, 1995; Погорелов и др., 2002; Погорелов и др., 2003).

В гипоксических условиях активизируются также и процессы, чья активность направлена на компенсацию гипоксического ацидоза и лактоза. В их ряду: Na+-H+ обмен (Lazdunsky et al., 1985; Karmazyn et al., 1999); Na+-HC03 симпорт (Camilion de Hurtado et al., 1995; Korichneva et al., 1995; Camilion de Hurtado et al., 1996a); СГ-ОН" обмен и CI -H+симпорт (Hun, Vaughan-Jones,

1997); СГ-НСО3 обмен (Linn et al., 1995); 2Cl"/Na+/K+ симпорт (Ramasamy et al., - +

2001); К -С1 симпорт (Case, 1972); Lact -H симпорт (Leeks, Halestrap, 1978); Lact'-K+ симпорт (Kleber, 1983; Kleber, 1984; Lindinger et al., 1996); Lact'-СГ и Lact" -НС03" обмен (Halestrap, McGivan, 1979).

Перечисленные выше системы адаптации кардиомиоцита к гипоксической деэнергизации включают перенос протонов и ионов натрия, калия и хлора через цитоплазматическую мембрану, что приводит к изменению ионного гомеостаза клетки. Изменение баланса основных внутриклеточных элементов (К, Na, С1) не только описывает интегративную активность систем компенсации гипоксической деэнергизации, но и индуцирует молекулярно-генетические изменения в мышечной клетке сердца. Поэтому для понимания механизмов, лежащих в основе адаптации кардиомиоцита к условиям гипоксии, актуальным является анализ изменения во времени концентрации натрия, хлора и калия на фоне нарастающей деэнергизации.

В настоящее время хорошо отработана методика измерения внутриклеточного pH (Camilion de Hurtado et al., 1995; Camilion de Hurtado et al., 1996; Schafer et al., 2000). Однако не ясно, в какой степени гипоксический ацидоз и лактоз связаны с изменением баланса основных цитоплазматических ионов (Na, С1, К); не понятно соотношение активного и пассивного транспорта калия в системе адаптации миоцита к гипоксии. Прямого ответа на поставленные вопросы не было получено из-за отсутствия адекватного метода определения концентрации элементов (Na, С1, К) в отдельной морфологически идентифицированной клетке в ткани. Решение данной проблемы стало возможным после развития электронно-зондового микроанализа (Goldstein et al., 1992) и криогенных методов подготовки срезов ткани для электронной микроскопии (Echlin, 1992; Warley, 1997). Указанные подходы позволили разработать прямой метод измерения концентрации натрия, хлора и калия в цитоплазме мышечной клетки в ткани сердца ex vivo (Pogorelov et al., 1991).

Обзор литературы (Van Emous et al., 1998; Barmashenko et al., 1999; Kupriyanov et al., 1999; Clausen, Overgaard, 2000; Senatorov et al., 2000; Kometiani et al., 2001; Van Emous et al., 2001; Despa et al., 2002) и собственные данные

Погорелов, Мазай, 1990; Pogorelov et al., 1999; Погорелов и др., 2000; Pogorelov et al., 2001a; Pogorelov et al., 2001b; Погорелов и др., 2002; Погорелов и др.,

2003) указывают на то, что при гипоксии возникает два мощных » разнонаправленных потока калия. Выход катиона К из клетки обусловлен активацией специфичных для гипоксических условий калиевых каналов, а вход - Ыа/К-АТФазой. В результате активного и пассивного транспорта суммарная концентрация калия в клетке может меняться незначительно. Как разделить эти два потока и оценить активность Na/K-АТФазы? Один из способов решения данной проблемы состоит в том, чтобы добавить в перфузирующий раствор рубидий, который рассматривается как физиологический аналог калия (Allis et al., 1989; Van Winkly, Compione, 1991. Saubermann et al., 1992; Cross et al., 1995; Kupriyanov 1995; 1996; 1999; Pogorelov et al., 2001a; 2001b). При этом увеличение концентрации рубидия в клетке маркирует поток калия из внеклеточного пространства в миоцит через Na/K-АТФазу. Цель исследований

В связи с изложенным, цель работы заключалась в изучении изменения во времени концентрации натрия, калия и хлора в кардиомиоцитах с помощью электронно-зондового микроанализа при гипоксической деэнергизации изолированного сердца.

Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие основные задачи:

1. Разработать экспериментальную модель гипоксической деэнергизации кардиомиоцитов при перфузии изолированного сердца.

2. Посредством контроля параметров сократительной функции сердца (частота и амплитуда сокращения) и анаэробного гликолиза (изменение концентрации лактата в постперфузионной жидкости) стандартизировать условия экспериментальной гипоксической деэнергизации.

3. Методом электронно-зондового микроанализа измерить концентрации натрия, хлора и калия в мышечной клетке сердца в разные периоды гипоксической деэнергизации.

4. Определить значение эмпирического коэффициента КА для рубидия в уравнении, которое применяется при расчете внутриклеточной концентрации элементов по интенсивности их характеристического рентгеновского излучения.

5. В разные периоды гипоксической деэнергизации сердца измерить внутриклеточную концентрацию рубидия, используемого в физиологических экспериментах в качестве аналога калия, для анализа соотношения активного и пассивного транспорта калия в кардиомиоцитах.

Научная новизна

Методом электронно-зондового микроанализа показано, что при гипоксической деэнергизации изменение баланса основных элементов (К, N3,

С1) в цитоплазме мышечной клетки протекает в три фазы. Во временной динамике эти изменения последовательно соответствуют начальной фазе нарастающей деэнергизации, которая затем переходит в электро-механическое разобщение функции сердца с последующей фазой глобальной деэнергизации.

В первой фазе гипоксической деэнергизации обнаружено явление разнонапраленного транспорта калия из миоцита и хлора в клетку, что, по-видимому, сопряжено с активацией систем выхода лактат-аниона в межклеточное пространство для компенсации гипоксического лактоза.

В отличие от сложившихся представлений о физиологической идентичности катионов К и Шэ+ экспериментально установлено, что рубидий не выходит из мышечной клетки сердца посредством пассивного транспорта.

Впервые выявлено, что наличие рубидия во внеклеточном пространстве ингибирует специфические калиевые каналы, которые активизируются в условиях гипоксии. Практическая значимость

Разработана экспериментальная модель, позволяющая создавать контролируемую глубокую гипоксическую деэнергизацию на изолированном сердце крысы в условиях проточной перфузии. На основе разработанной экспериментальной модели гипоксической деэнергизации предложен метод доклинического (на животных) изучения специфической активности кардиотропных препаратов.

Разработан метод количественного электронно-зондового микроанализа концентрации рубидия в миоцитах на лиофилизированных криосрезах папиллярной мышцы сердца.

Апробация работы

Основные результаты диссертационной работы были представлены на международных конференциях: 12 ICXOM (Cracow, 1989), "Low temperature microscopy and microanalysis" (Cambridge, 1990), 12th Pfefferkorn Conference "The Science of Biological Microanalysis" (Cambridge, 1993),"MICRO 96" (London, 1996), "CRYO 97" (York, 1997), "Scanning 97" (California, 1997), "Biological Motility: modern methods for studying" (Pushchino, 1998), "Heart disease - new trends in research, diagnosis and treatment" (Washington, 1999), "Electron probe microanalysis today-practical aspects" (Trest, 2000), "Modern developments and applications in microbeam analysis" (Tampere, 2001), "Biological motility: new trends in research" (Pushchino, 2001), а так же на Всероссийских конференциях :"Прикладные аспекты исследований скелетных, сердечных и гладких мышц" (Пущино, 1996), "Гипоксия: механизмы, адаптация и коррекция" (Москва, 1997; 2002), "Профилактическая кардиология" (Москва, 2000), "Митохондрии, клетки и активные формы кислорода" (Пущино, 2000), "От современной фундаментальной биологии к новым наукоемким технологиям" (Пущино, 2002), "Рентгеновская оптика-2003" (Н.-Новгород, 2003), "II Всероссийский съезд токсикологов" (Москва, 2003). Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания протоколов, методов и объекта эксперимента, изложения полученных результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой

Заключение Диссертация по теме "Биофизика", Погорелова, Валентина Николаевна

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Анализ литературных данных и результатов собственных исследований показывает, что регистрируемые при гипоксической деэнергизации изменения внутриклеточного баланса элементов (ЪГа, С1, К) являются результом интегративной работы активного транспорта и системы анти- и симпортов ионов. В условиях гипоксической деэнергизации вход калия в клетку посредством Ыа/К-АТФазы маскируется более интенсивным выходом иона К через комплекс калиевых каналов.

По критерию внутриклеточного баланса ионов (Ыа , С1, К ) и интегративных характеристик работы сердца для гипоксической деэнергизации наблюдается три выраженных во времени фазы. Начальная фаза проходит на фоне нарастающей деэнергизации клетки и активизации механизмов транспорта ионов, направленных на компенсацию ацидоза и лактоза. Для второй фазы характерно состояние электро-механического разобщения функции сердца, которое сопровождается прекращением сокращения на фоне активной Ыа/К-АТФазы. На заключительной фазе глобальной деэнергизации наблюдается резкое и значительное уменьшение градиента (Ыа, С1, К) на мембране кардиомиоцита, что свидетельствует об ингибировании Ыа/К-АТФазы.

Рубидий, который в физиологических экспериментах традиционно используется как аналог калия, входит в мышечную клетку изолированного сердца посредством Ма/К-АТФазы. При этом в условиях гипоксической + деэнергизации катион Шэ , в отличие от К , не выходит из кардиомиоцита. Более того, присутствие рубидия во внеклеточном пространстве блокирует индуцированный гипоксической деэнергизацией выход калия из кардиомиоцита.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Погорелова, Валентина Николаевна, Пущино

1. Allen TJ, Hardin CD., 2000. Influence of glycogen storage on vascular smooth muscle metabolism. Am J Physiol., 278 : HI993-2002.

2. Allis JL., Snaith CD., Seymour AML., Radda GK., 1989.87Rb NMR studies of the rerfised rat heart. FEBS Lett., 242: 215-217.

3. Alvarez BV, Fujinaga J, Casey JR., 2001. Molecular basis for angiotensin II-induced increase of chloride/bicarbonate exchange in the myocardium. Circ Res., 89: 1246-253.

4. Bahinski A, Nakao M, Gadsby DC., 1988. Potassium translocation by the Na/K pump is voltage insensitive. PNAS, 85: 3412-3416.

5. Bauza G, Le Moyec L, Eugene M., 1995. pH regulation during ischaemia-reperfusion of isolated rat hearts, and metabolic effects of 2,3-butanedione monoxime. J Mol Cell Cardiol., 27: 1703-1713.

6. Beauloye C, Bertrand L, Krause U, Marsin AS, Dresselaers T, Vanstapel F,

7. Vanoverschelde JL, Hue L., 2001. No-flow ischemia inhibits insulin signaling inheart by decreasing intracellular pH. Circ Res., 88: 513-519.

8. Behmanesh S, Kempski O., 2000. Mechanisms of endothelial cell swelling fromlactacidosis studied in vitro. Am J Physiol., 279: HI512-1517.

9. Bergmeyer G., 1974. Methods of enzymatic analysis. 3: 1475-1479.

10. Bernatova I, Pechanova O, Babal P, Kysela S, Stvrtina S, Andriantsitohaina R.,2002. Wine polyphenols improve cardiovascular remodeling and vascular functionin NO-deficient hypertension. Am J Physiol Heart., 282: H942-948.

11. Bielen FY, Bosteels S, Verdonck F., 1990. Consequences of CO2 acidosis fortransmembrane Na+ transport and membrane current in rabbit cardiac Purkinjefobres. J. Physiol., 427: 325-345.

12. Booth FW, Chakravarthy MV, Spangenburg EE., 2002. Exercise and gene expression: physiological regulation of the human genome through physical activity. J Physiol., 543: 399-411.

13. Camilion de Hurtado MC, Perez NG, Cingolani HE., 1995. An electrogenic sodium-bicarbonate cotransport in the regulation of myocardial intracellular pH. J Mol Cell Cardiol., 27: 231-242.

14. Camilion de Hurtado MC, Alvarez BV, Perez NG, Cingolani HE., 1996. Role of an electrogenic Na(+)-HC03- cotransport in determining myocardial pHi after an increase in heart rate. Circ Res.,79: 698-704.

15. Case R.B., 1972. Ion alterations during myocardial ischemia. Cardiology, 56: 245262.

16. Clement S, Chaponnier C, Gabbiani G., 1999. A subpopulation of cardiomyocytes expressing alpha-skeletal actin is identified by a specific polyclonal antibody. Circ Res., 85:51-58.

17. Close L.A., Bowman P.S., Paul R.J., 1994. Reoxygenation-induced relaxation of coronary arteries: a novel endothelium-dependent mechanism. Circul. Res., 74: 870-881.

18. Cross HR, Clarke K, Opie LH, Radda GK., 1995b. Is lactate-induced myocardial ischaemic injury mediated by decreased pH or increased intracellular lactate?. J Mol Cell Cardiol., 27: 1369-1381

19. Cross HR, Opie LH, Radda GK, Clarke K., 1996. Is a high glycogen content beneficial or detrimental to the ischemic rat heart? A controversy resolved. Circ Res.,78: 482-491.

20. Doenst T., Taegtmeyer H., 1999. Ischemia-stimulated Glucose Uptake Does Not Require Catecholamines in Rat Heart. J Mol Cell Cardiol., 31: 435-443.

21. Dorge A, Rick R, Gehring K, Thurau K., 1978. Preparation of freeze-dried cryosections for quantitative X-ray microanalysis of electrolytes in biological soft tissues. Pflugers Arch., 373: 85-97.

22. Duan D, Fermini B, Nattel S., 1995. Alpha-adrenergic control of volume-regulated CI- currents in rabbit atrial myocytes. Characterization of a novel ionic regulatory mechanism. Circ Res., 77: 379-393.

23. Duan D, Ye L, Britton F, Horowitz B, Hume JR., 2000. A novel anionic inward rectifier in native cardiac myocytes. Circ Res., 86: 63-71.

24. Echlin P. Low-temperature microscopy and analysis. New York: Plenum Press, 1992. Egert S., Nguyen N., Schwaiger M., 1999. Myocardial Glucose Transporter GLUT1: Translocation Induced by Insulin and Ischemia. J Mol Cell Cardiol., 31: 1337-1344.

25. Eisner D.A., Lederer W.J., 1985. Na-Ca exchange: stoichimetry and electrogenicity. Am. J. Physiol., 248: C189-C202.

26. Emerson GG, Segal SS., 2000. Electrical coupling between endothelial cells and smooth muscle cells in hamster feed arteries: role in vasomotor control. Circ Res., 87: 474-479.

27. Endoh M., 2001. Acidic pH-induced Contractile Dysfunction via Downstream Mechanism: Identification of pH-sensitive Domain in Troponin I. J Mol Cell Cardiol., 33: 1297-1300.

28. Eng S., Maddaford T.G., Kardami E., Pierce G.N., 1998. Protection Against Myocardial Ischemic/Reperfiision Injury by Inhibitors of Two Separate Pathways of Na+Entry. J Mol Cell Cardiol., 30: 829-835.

29. Flatman PW, Creanor J., 1999. Stimulation of Na+-K+-2C1- cotransport by arsenite in ferret erythrocytes. J Physiol., 519: 143-152.

30. Foy RA, Shimizu S, Paul RJ., 1997. The effects of hypoxia on pHi in porcine coronary artery endothelium and smooth muscle. A novel method for measurements in endothelial cells in situ. Circ Res., 80: 21-27.

31. Frobert O, Mikkelsen EO, Bagger JP, Gravholt CH., 2002. Measurement of interstitial lactate during hypoxia-induced dilatation in isolated pressurised porcine coronary arteries. J Physiol., 539: 277-284.

32. Gadsmy DC, Craniefield PF., 1977. Two levels of resting potential in cardiac Purkinje fibers. J. Gen. Physiol., 70: 725-746.

33. Gadsmy DC, Craniefield PF., 1979. Electrogenic sodium extrusion in cardiac Purkinje fibers. J. Gen. Physiol., 73: 819-837.

34. Gaspardone A., Shine K.I., Seabrooke S.R., Poole-Wilson P.A., 1986. Potassium loss from rabbit myocardium during hypoxia: evidence for passive efflux, linked to anion extrusion. J. Mol. Cell. Cardiol., 18: 389-399.

35. Geukes Foppen RJ, van Mil HG, van Heukelom JS., 2002. Effects of chloride transport on bistable behaviour of the membrane potential in mouse skeletal muscle. J Physiol., 542: 181-191.

36. Gumina RJ, Auchampach J, Wang R, Buerger E, Eickmeier C, Moore J, Daemmgen J, Gross GJ., 2000. Na(+)/H(+) exchange inhibition-induced cardioprotection in dogs: effects on neutrophils versus cardiomyocytes. Am J Physiol., 279: HI 5631570.

37. Gumina RJ, Moore J, Schelling P, Beier N, Gross GJ., 2001. Na(+)/H(+) exchange inhibition prevents endothelial dysfunction after I/R injury. Am J Physiol., 281: H1260-1266.

38. Halestrap A.P., McGivan J.D., 1979. Measurement of membrane transport phenomena. In: Techniques in metabolic research (eds. Kornberg H.L., Metcalfe

39. J.C., Northcote D.H., Pogson C.I., Tipton K.F.), Amsterdam. Elsevier/North Holland, B206: 1-23.

40. Hardin CD, Roberts TM., 1997. Differential regulation of glucose and glycogen metabolism in vascular smooth muscle by exogenous substrates. J Mol Cell Cardiol., 29: 1207-1216.

41. Harrison S.N., Du X-J, Arthur J. F., Woodcock E. A., 2000. Activation of the Na+/H+ Exchanger is Required for Reperfusion-induced Ins(l,4,5)P3Generation. J Mol Cell Cardiol., 32: 1851-1858.

42. Heusch G., Schulz R., 1996a. Myocardial hibernation: adaptation to ischemia. Eur. Heart J., 17: 824-828.

43. Heusch G., Schulz R., 1996b. Hibernating myocardium: a review. J Mol Cell Cardiol, 28: 2359-2372.

44. Hu Q, Xia Y, Corda S, Zweier JL, Ziegelstein RC., 1998. Hydrogen peroxide decreases pHi in human aortic endothelial cells by inhibiting Na+/H+ exchange. Circ Res., 83: 644-651.

45. Hue L., Beauloye C., Marsin A.-S., Bertrand L., Horman S., Rider M. H., 2002. Insulin and Ischemia Stimulate Glycolysis by Acting on the Same Targets Through Different and Opposing Signaling Pathways. J of Mol Cell Cardiol., 34: 1091— 1097.

46. Jackson DC., 2002. Hibernating without oxygen: physiological adaptations of the painted turtle. J Physiol., 543: 731-737.

47. Jagger JE, Bateman RM, Ellsworth ML, Ellis CG., 2001. Role of erythrocyte in regulating local 02 delivery mediated by hemoglobin oxygenation. Am J Physiol., 280: H2833-2839.

48. Kameyama M., Kakei M., Sato R., Shibasaki T., Matsuda H., Irisawa H., 1984. Intracellular Na+ activates a K+ channel in mammalian cardiac cells. Nature, 309: 354-356.

49. Karmazyn M, Gan XT, Humphreys RA, Yoshida H, Kusumoto K., 1999. The myocardial Na(+)-H(+) exchange: structure, regulation, and its role in heart disease. Circ Res, 85: 777-786.

50. Kemppainen J, Fujimoto T, Kalliokoski KK, Viljanen T, Nuutila P, Knuuti J., 2002. Myocardial and skeletal muscle glucose uptake during exercise in humans. J Physiol., 2002; 542: 403-412.

51. Kerkhof CJ, Van Der Linden PJ, Sipkema P., 2002. Role of myocardium and endothelium in coronary vascular smooth muscle responses to hypoxia. Am J Physiol., 282: H1296-1303.

52. King LM, Opie LH., 1996. Does preconditioning act by glycogen depletion in the isolated rat heart? J Mol Cell Cardiol., 28: 2305-2321.

53. Kleber A.G., 1983. Resting membrane potential, extracellular potassium activity, and intracellular sodium activity during acute global ischemia in perfused guinea pig hearts. Circ. Res., 52: 442-450.

54. Kleber A.G., 1984. Extracellular potassium accumulation in acute myocardial ischaemia. J. Mol.Cell.Cardiol., 16: 389-394.

55. Kolocassides KG, Galinanes M, Hearse DJ., 1996. Ischemic preconditioning, cardioplegia or both? Differing approaches to myocardial and vascular protection. J Mol Cell Cardiol., 28: 623-634.

56. Kometiani P, Askari A, Liu J, Xie Z, Askari FK., 2001. Downregulation of cardiac myocyte Na(+)-K(+)-ATPase by adenovirus-mediated expression of an alpha-subunit fragment. Am J Physiol., 280: H1415-1421.

57. Kupriyanov V. V., Yang L., Deslauriers R., 1996. Cytoplasmic phosphates in Na-K balance in KCN-poisined rat heart: a 87Rb, 23Naand 3IP NMR study. Am J Physiol., 39: H1303-1311.

58. Kupriyanov V. V., Xiang B., Kuzio B., Deslauriers R., 1999a. PH regulation of K+ efflux from myocytes in isolated rat hearts: 87Rb, 7Li and 31P NMR studies. Am J Physiol., 46: H279-289.

59. Kupriyanov V. V., Xiang B., Kuzio B., Deslauriers R., 1999b. The Effects of Low■4* • 87

60. Flow Ischemia on K Fluxes in Isolated Rat Hearts Assessed by Rb NMR. J Mol Cell Cardiol., 31: 817-826.

61. Kusumoto K, Haist JV, Karmazyn M., 2001. Na(+)/H(+) exchange inhibition reduces hypertrophy and heart failure after myocardial infarction in rats. Am J Physiol., 280: H738-745.

62. McFalls EO, Murad B, Liow JS, Gannon MC, Haspel HC, Lange A, Marx D,

63. Sikora J, Ward HB., 2002. Glucose uptake and glycogen levels are increased in pigheart after repetitive ischemia. Am J Physiol. 282: H205-210.

64. Mcnulty PH; Sinusas AJ; Shi CQX; Dione D; Young LH; Cline GC; Shulman GI.,1996. Glucose-metabolism distal to a critical coronary stenosis in a canine model oflow-flow myocardial-ischemia. J of clinical investigation, 98: 62-69.

65. Meyer JW, Flagella M, Sutliff RL, Lorenz JN, Nieman ML, Weber CS, Paul RJ,

66. Shull GE., 2002. Decreased blood pressure and vascular smooth muscle tone inmice lacking basolateral Na(+)-K(+)-2Cl(-) cotransporter. Am J Physiol., 2002;283: H1846-1855.

67. Michea L, Irribarra V, Goecke I A, Marusic ET., 2001. Reduced Na-K pump but increased Na-K-2C1 cotransporter in aorta of streptozotocin-induced diabetic rat. Am J Physiol., 280: H851-858.

68. Ning X-H, Childs K.F., Boiling S.F., 1996. Glucose level and myocardial recovery after warm arrest. Ann. Thorac. Surg., 62: 1825-1829.

69. Niu XW, Meech RW., 2000. Potassium inhibition of sodium-activated potassium (K(Na)) channels in guinea-pig ventricular myocytes. J Physiol., 526: 81-90.

70. Noma A., 1983. ATP-regulated K channels in cardiac muscle. Nature, 305: 147148.

71. Page E., Storm S.R., 1965. J. Gen. Physiol., 48: 957-163.

72. Pan HL, Longhurst JC, Eisenach JC, Chen SR., 1999. Role of protons in activation of cardiac sympathetic C-fibre afferents during ischaemia in cats. J Physiol., 518: 857-866.

73. Pogorelov A.G., Allachverdov B.L., 1984. Microprobe quantitation procedure that calculates concentrations of chemical elenments in soft biological tissue sections. Micron and Microsc. Acta, 15: 177-180.

74. Pogorelov AG., 1987. Quantitation procedure for calculating the sensitivity of X-ray microanalysis of biological thin sections. Micron Microsc. Acta, 18: 159-163.

75. Pogorelov A., Allachverdov B., Burovina I., Mazay G., Pogorelova V., 1991. Study of potassium deficiency in cardiac muscle: quantitative X-ray microanalysis and cryotechniques. J. of Microscopy/Oxford, 12: 24-38.

76. Pogorelov A., Demin I., Pogorelova V., Khrenova E., 2001b. Assay of potassiumactive transport in myocell of isolated heart during cardiac ischaemia. In:»"Biological motility: new trends in research" (Pushchino), 115-117.

77. Poole R.S., Halestrap A.P., 1993. Transport of lactate and other monocarboxylatesacross mammaliam plasma membrane. Am.J. of Physiol., 264: C761-C782.

78. Ramasamy R, Hwang YC, Whang J, Bergmann SR., 2001a. Protection of ischemichearts by high glucose is mediated, in part, by GLUT-4. Am J Physiol., 281: H290297.

79. Ramasamy R, Payne JA, Whang J, Bergmann SR, Schaefer S., 2001b. Protection of ischemic myocardium in diabetics by inhibition of electroneutral Na+-K+-2C1-cotransporter. Am J Physiol., 281: H515-522.

80. Reimer K., Steenbergen Ch., Jennings R., 1985. Isolated cardiac myocytes: is their response to injury relevant to understanding of ischemic injury, in vivo? Laboratory Investigation, 53: 369-372.

81. Richter EA, Derave W, Wojtaszewski JF., 2001. Glucose, exercise and insulin: emerging concepts. J Physiol., 535: 313-322.

82. Rodriguez B, Ferrero JM Jr, Trenor B., 2002. Mechanistic investigation of extracellular K+ accumulation during acute myocardial ischemia: a simulation study. Am J Physiol., 283: H490-500.

83. Roomans GM, Seveus LA., 1977. Preparation of thin cryosectioned standards for quantitative microprobe analysis. J.submicrosc. Cytol., 9: 31-35.

84. Saubermann AJ., Castiglia СМ., Foster MC., 1992. Prefential uptake of rubidium from extracellular space by glial cells compared to neurons in leech ganglia. Brain Research, 577: 64-72.

85. Schaefer S, Prussel E, Carr LJ., 1995. Requirement of glycolytic substrate for metabolic recovery during moderate low flow ischemia. J Mol Cell Cardiol., 27: 101-109.

86. Schafer C, Ladilov YV, Siegmund B, Piper HM., 2000. Importance of bicarbonate transport for protection of cardiomyocytes against reoxygenation injury. Am J Physiol., 278: H1457-1463.

87. Siczkowski M, Davies JE, Ng LL., 1995. Na(+)-H+ exchanger isoform 1 phosphorylation in normal Wistar-Kyoto and spontaneously hypertensive rats.Circ Res., 76: 825-831.

88. Silverman H.S., Stern M.D., 1994. Ionic basis of ischaemic cardiac injury: insights from cellular studies. Cardiovasc. Res., 28: 581-597.

89. Symons JD, Schaefer S., Na(+)/H(+) exchange subtype 1 inhibition reduces endothelial dysfunction in vessels from stunned myocardium. Am J Physiol., 2001; 281: H1575-1582.