Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Электрофизиологический и радиолигандный анализ синаптической передачи в электрорецепторах скатов

ВАК РФ 03.00.13, Физиология

Автореферат диссертации по теме "Электрофизиологический и радиолигандный анализ синаптической передачи в электрорецепторах скатов"

РГ6 од

российская академия наук Ордена Трудового Красного Знанени Институт Физиологии имени И. п. Павлова

На правах рукописи

РЫГОВА Ирина Викторовна

ЭЛЕЖТРОФИЗМОЛОГНЧЕСКНН Н РАДЯОЛНГЛНДНЫИ АНА/ШЭ СШШЮТШСКОИ ПЕРЕДАЧИ В ЭЛЕКТРОРЕЦЕПТОРАХ СКАТОВ

Специальность: оз. 00.13 - Физиология человека и животных

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург 1993

Работа выполпепа в' Лаборатории Физиологии рецепции Института Физиологии ии. И. П. Павлова РАН.

Научный руководитель - Заведующий лабораторией Физиологии рецепции Института Физиологии ин. Я. П. Павлова, доктор биологических наук Г. II. АКОЕВ.

Научный консультант - Заведующий лабораторией нолеку-лярной нейгобиологии Института иоэга человека РАН доктор биологических паук С. А. Дамбинова

Официальные опиоцевти: д. н. н., профессор В. С. Гуревич. к. б. н. В. Т. Яуваев

Еедушее учрехдение: Санкт-Петербургский Педиатрический институт '

Зашита состоится года час.

на заседании Специализированного совета к 002. 36.01 Института Физиологии ии И. П. Павлова по адресу: 199034, С. -Петербург, наб. Накарова> 6.

С диссертацией нохно ознакомиться в библиотеке Института Физиологии ин И. п. Павлова РАН.

Автореферат разослан 1993 г.

Ученый секретарь Специализированного совета, кандидат биологических наук:

Э. А. Ховза

- 3 -

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ. Электрорецепторная система наряду с другими анализатора?® играет ваяшую роль в процессе взаимодействия организма с окружающей средой и предназначена для восприятия животными электрических полей биологического, физического и физико-химического происхождения. Электрорецепторы отражают изменение электрических и магнитных полей, возникающих и распространяющихся в водной среде, а также изменение температуры и солености зоды (Bullock, 1932; Броун, Ильинский 1984; Акоев Андрианов, 1989). Электрорецепторная система была открыта сравнительно недавно у слабоэлектрических африканских рыб (Ыввиаш, 1958) и в настоящее время обнарунена у круглоротых, всех некостистых и у ряда костистых рыб, а таете у амфибий, у низших млекопитающих - австралийского утконоса и ехидны. Указанная система наряду с вестибулярным аппаратом, органом слуха л органами боковой линии входит в состав акустико-латеральной системы.

Рецепторы акустико-латеральной системы являются вторично-чувствующими. Передача сигнала на афферентное" нервное волокно в этих рецепторах происходит с помощью синаптического переключения. Исследование механизмов синаптической передачи в сенсорном синапсе электрорецепторов шеет важное значение» поскольку позволяет понять природу высокой чувствительности злектрорецепто-ров к адекватным стимулам, на примере относительно простой модели исследовать механизмы синаптической передачи в акустико-латеральной системе и возможность модуляции синаптической функции сенсорого синапса физиологически активными вещества!,и.

Одной из вакных проблем сенсорной физиологии является изучение природы нейромедиатора в рецепторах акустико-латеральной системы. Несмотря на существование обширного фактического материала, посвященного идентификации медиатора в сенсорном синапсе акустико-латеральной системы ( Obara, Bennett 1976; Bledsoe et. al., 1988; Klinke, 1981, 1986; Akoev, Andrianov, 1993), природу нейропередатчнка нельзя считать окончательно установленной. Принято, что предполагаемый медиатор долиен удовлетворять ряду требований (Burnstok, 1986), выполнение которых требует привле-

чешя электрофизиологических, фармакологических и биохимических методов. Большинство исследований, посвященных изучению природа нейромедааторэ в электрорецепторах, получены с использованием электрофизиологических методик. Ряд экспериментальных данных имеет противоречивый характер и до сих пор не находит удовлетворительного объяснения (ШеМЛа а1,1980). Данные литературы о биохимических исследованиях, посвященных идентификации нейро-медиатора и исследованию свойств синаптических рецепторов, в электрорецепторной системе в настоящее время отсутствуют. Практически неосвещенным остается и вопрос о возможных механизмах регуляции сенсорной функции физиологически активными вещества!,и.

ЦЕЯЬ РАБОТЫ. При помощи комплекснс.'о подхода с использованием электрофизиологических, фармакологических и биохимических методов исследовать природу нейромедиатора в электрорецепторах (ампулах Лоренцини) скатов и выявить возможные способы её регу-ляцш; -

ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ;

1. Изучить влияние предполагаемого нейропередатчика (ь-глутамата или ь-аспартата) на импульсную активность афферентных нервных волокон, иннервирувдих ампулы Лоренцшш, и сопоставить полученные эффекты с изменениями активности, при адекватном раздракешш.

2. Исследовать влияние антагониста возбувдающих амикокис-лот I.- серин-О-фосфата (ь-СМ) на синаптическую передачу ампул Лоренцыы.

3. Показать принципиальную возможность регуляции афферентных сигналов в электрорецепторах нейропептидами. Исследовать влияние синтетического аналога лей-энкефалина - даларгина на синаптическую передачу в ампулах Лоренцини.

4. Радаолигандным методом исследовать характеристики связывания ь-[Нэ]глутамата с мембранами электрсрецепторов и доказать принадлежность рецепторов к синаптическим структурам.

5. При помощи агонистов глутамата определить фармакологический профиль выявленных глутаматных рецепторов.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

1. Исследовано действие 1,-С0Ф на синаптическую передачу в

ампулах Лоренцини и показано, что Ь-СОФ является антагонистом рецепторов н-метшнэ-аспартата.

2. Показана принципиальная возможность модуляции афферентного потока в электрорецепторах физиологически активными вещества1®. Установлено, что влияние синтетического аналога лей-ен-кефалина - даларгина осуществляется через опиатнне рецепторы.

3. Впервые в электрорецепторах радиолигандннм методом выявлены высокоафЕинныэ мембранные рецепторы глутачата, определен их фармакологический профиль и параметры связывания.

4с Показано, что выявленные высокоаффинные глутаматнькз рецепторы принадлежат синаптическим структурам.

ТЕОРЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ РАБОТЫ: Представленные экспериментальные данные вносят вклад в исследование синоптической передачи в рецепторах акустико-латеральной системы и отражают один из возможных способов регуляции функции сенсорного синапса.

ПРАКТИЧЕСКОЕ«ЗНАЧЕНИЕ: результаты электрофизиологического и радиолигаядного анализа позволяют использовать ампулы Лоренцини скатов в качестве простой и адекватной модели для исследования глутаматных рецепторов, для изучения синаптической передачи в сенсорном синапсе акустико-латеральной системы и для скрининга новых фармакологических препаратов.

Результаты представленной работы вошли в курс лекций по физиологии электрорецепторов^ прочитанных в Санкт-Петербургском Государственном университете и ряде университетов США, Италии, Франции, Германии, Финляндии и Голландии.

АЛПРОЕАЦИЯ РАБОТЫ: Экспериментальный материал, представленный в диссертации, доложен и представлен па расширенном мек-Л2бораторном заседании Института физиологии км. И.П.Павлова РАН, на 15 съезде Всесоюзного физиологического общества, Кииэ-пев 1987; на Всесоюзном симпозиуме "Механизмы действий горюнов и медиаторов на эффекторные клетки", Суздаль,- 1989: яа V Всесоюзной конференции, посвященной 90- летаю со дня ровденпя академика Х.С.Коштоянца, Москва 1990 г., на 21 конгрессе по нейрона-укам, Новый Орлеан, 1991; на решональном совещании меадународ-ного сома по физиологическим наукам, Прага, 1991; на международной конференции "Сенсорная физиология морских рыб", Мурманск

1992; на 15 ежегодном Европейском совещании по нейронаукам, Мюнхен, 1992, на всесоюзной конференции по сенсорным системам, Москва, 1992.

МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Исследование синаптической передачи в ампулах Лоренцини скатов проводили комплексно с использованием электрофизиологических, фармакологических, радиолигандных методов и элементов иммуноферментного анализа. При помощи электрофизиологического и фармакологического методов на изолированном препарате мандибу-лярой группы ампул Лоренцини скатов Raja clavata исследовали влияние различных фармакологических ь-ществ на фоновую и вызванную активность рецепторов. Метод радиолигандкого связывания позволил выявить и охарактеризовать на мембранах ампул Лоренцини специфические высокоаффинные рецепторы глутамата. Радиоли-гандные опыты проводились на гиоидной груше ампул Лоренцини. Применение элементов иммуноферментного анализа позволило доказать принадлежность выявленных высокоа®инных глутаматных сайтов к синаптическим структурам.

Электрофизиологические эксперименты были выполнены на базе Карадагского отделения Института Биологии Юкных Морей совместно с д.б.н. Акоевым Г.Н., д.б.н. Андриановым Ю.Н. и мл.н.с. Шерман Н.О. Биохимическая часть работы проведена совместно с сотрудниками лаборатории молекулярной нейробиологии Института Мозга человека РАН д.б.н. Дамбиновой С.А. и к.б.н. Городинским А.И.

ЭЛЕКТРОЖИОЛОЩЕСКИЕ МЕТОДЫ. Скатов отлавливали в Черном море в акватории Карадагской биостанции и выдерживали в течение 3 дней в аквариумах в условиях постоянного протока морской воды. Мандибулярную группу ампул Лоренцини и отходящий нервный ствол vil пары черепно-мозговых нервов (п. íaoialis) выделяли из тела рыбы и под контролем бинокулярного микроскопа ос-вобоадали от окружающих тканей в специальной ванночке объемом 0,2 мл при 12°-13°С в условиях непрерывного протока физиологического раствора. Для обеспечения доступа исследуемых веществ к базальной мембране рецептора вскрывали ' соединительнотканную оболочку капсулы и частично удаляли келе.

Для изучения влияния фармакологических веществ на синапти-ческую передачу ампул Лоренцини проводили анализ импульсной активности, отводимой от одиночного нервного волокна in vitro при помощи методики "вазелинового мостика" (Акоев и др. 1991). Им-пульсащю, отводимую серебряными электродами, через катодный повторитель подавали на вход усилителя переменного тока оригинальной конструкции. Биопотенциалы визуально контролировали, используя осциллограф и электронно-счетный частотомер, и регистрировали с помощью фоторегистратора ФОР-г. Средний уровень частоты импульсной активности регистрировали на самописце.

Электрическую стимуляцию ампул Лоренцини осуществляли прямоугольными импульсами тока, подаваемыми через изолирующий блок. В качестве генератора прямоугольных импульсов использовали злектростимулятор ЭСЛ-2. Электрическое раздранение ашул Лоренцини проводили с помощью серебряных электродов, располагаю. щихся в ванночке с препаратом.

Для перфузии препарата использовали физиологический раствор, следующего состава: (мМ) Nad - 260, KCl - 3, HgOl - 1, глюкоза -5, трисбуфер - 2, Са012- 2, мочевина - 350, рН=7,4. Температуру пер5узирующего раствора поддерживал! на постоянном уровне (12°-13°С) и контролировали в течение всего эксперимента. Исследуемые вещества: ь-глутамат (L-ГЛУ), ь-аспартат . (Ь-АСП), даларган (ДАЛ), налоксон (НАЛ), ь-серин-О-фосфат (L-C05), кашат (Ка), квисквалат (Кв), N-метил-в-аспартат (ВДЙА) добавляли в нормальный раствор в требуемых концентрациях. Полная смена перфузирующего раствора в экспериментальной ванночке происходила за сорок секунд.

Для исследования влияния поликлональных антител на фоновую активность ампул Лоренцини препарат инкубировали без протока при 5°-7°С в 250-300 икл антисыворотки в течение 4-5 часов. В качестве контроля проводили инкубации препарата с политональной антисывороткой к пролактину. Перед физиологическим экспериментом активность поликловальной антиснворотки к глутаматсвязы-вающему белку головного мозга человека (ПКС к ГМБ) контролировали с помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа. Антитела диализовали на магнитной мешалке. при 5°с в течение

12-16 часов против 1 литра физиологического раствора.*

Электрофизиологическая часть работы выполнена на 294 рецепторах.

БИОХИМИЧЕСКИЕ МЕТОДУ. Гиоидные скопления ампул Лоренцини черноморских скатов выделяли из тела рыбы и хранили в адком азоте. В каждом опыте использовали биологический материал нескольких животных. Препарат мембран для радиолигаидных экспериментов готовили методом дифференциального центрифугирования (Рыжова и др., 1991).

Для изучения кинетики связывания радиоактивного лиганда с мембранами ампул Лоренцини исследуемый образец инкубировали с различными концентрациями меченного трогаем глутамата. Разделение связанного и свободного лиганда осуществляли методом фильтрации через микропористые фильтры gf/c (Whatman). Инкубационные смеси объемом о,1 мл готовили на 96 -луночном планшете. 0,4-0,5 мкг препарата мембран инкубировали в среде, содержащей ю мкл ЗИН3]-глутамата (25-800 нМ, зо Ки / мМ), 30-50 мкл трис HCl (рн.7.4) в течение зо минут при 19°С, Для исследования влияния ионов 01" на специфическое связывание L-[H31-ГЛУ с синаптическими мембранами ампул Лоренцини инкубацию проводили в трис-ацетатном буфере (рН=7,4). Реакцию запускали добавлением суспензии мембран. Исследование катионов на уровень связывания проводили, добавляя в инкубационную среду растворы солей: Naci (0,1-150 ММ), KCl (0,5-50 ММ), Са01а (0,05-50 мМ), MgCl3 (0,5-50 Mj\1). При определении фармакологического профиля глута-матних рецепторов в инкубационную- среду добавляли растворы не-мечешшх агонистов глутамата: Ка, Кв и НМДА. Одновременную фильтрацию 96 проб проводили на 96-луночном приборе (Dynateoh, США). Фильтры промывали ю кратным объемом ледяного буфера, сушили и помещали в стандартный сщшцилляционный коктейль на ос-

* Политональная антисыворотка к гдутаматсвязывающему мембранному белку головного мозга человека ( ПКС к НЕ) с молекулярной массой 68-70 кДа была любезно предоставлена сотрудниками института Мозга человека РАН к.б.н. Городинским А.И., Савиновым A.D. и Черепановым A.A.

нове толуола. Радиоактивность измеряли на сцинцилляционном счетчике Яяок-Вега (ькв, Швеция). Неспецифяческое связывание определяли, включая в инкубационную среду ь-глутамат (конечная концентрация в пробе о,1 мМ). Для определения содержания белка в пробах применяли метода Лоури (Ьоягу, 1951) или модифицированный метод Бредфорда (Вгаа/ош, 1976).

ОБРАБОТКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫХ ДАННЫХ. Для вычисления параметров распределения экспериментальных данных применяли стандартные методы, принятые для малых выборок (Ашмарш и др., 1975). Достоверность различия меящу исследуемыми веж шами вычислялась с помощью непараматрического критерия "И" Валкоксо-на-Мавна-Уитни.

В радиолигандных экспериментах значение каждой экспериментальной' точки определяли по четырем параллельным пробам. Величину специфического связывания вычисляли, вычитая из суммарого значения связывания величину неспещфтаеского связывания. Определение характеристик связывания: константы связывания и плот-носта участков связывания, проводилось на персональном компь-Бтора РС/АТ-28& по метолу Скетчарда (Боа-ЬсИага, 1949).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Афферентные нервные волокна мандибулярной группы а),шул Лоренцини черноморских скатов обладали фоновой активностью, частота которой колебалась от з до 50 ими/сек. Частота фоновой активности большинства волокоп (65Я) находилась в диапазоне от ю до 25 имп/сек, а среднее значение частоты импульсации составляло 17,5±о,з имп/сек. У большинства волокон фоновая активность тлела равномерный характер, а ее частота не изменялась в течение длительного времени. Гистограммы распределения межим-пульсиых интервалов этих волокон приближались к гауссову распределению. Фоновый уровень импульсной активности зависел от температуры перфузирущэго раствора и имел положительный температурный коэффициент.

Раздражение ампул Лоренцини католическим стимулом вызывало в нервных волокнах вспышку импульсной активпости с латентным периодом 20-50 мс. После выключения стимула наблюдалось торможение импульсации, длительность которого зависела от интенсив-

ности и длительности приложенного раздражения. При увеличении амплитуда стимула возрастали количество и частота импульсов в разряде, а латентный перод реакции сокращался. В значительном диапазоне шгаенсивностей зависимость количества импульсов в ответе от амплитуды приложенного стимула имела линейный характер. При сверхсилыюм раздражении наблюдалось уменьшение ответной реакции. Анодические стимулы вызывали противоположно направленную реакцию - торможение импульсации при включении стимула, и ее увеличение при выключении стимула.

Величину ответной реакции электрорецепторов на аппликацию возбуждающих аминокислот оценивали по изменению уровня активности через з минуты после начала перфузии. Добавление в нормальный 'физиологический раствор L-ГЛУ ( Ю"3-10"7М) и 1г-АСП(ю"3--10"' М) приводило к изменению уровня фоновой активности и увеличению вызванных ответов ампул Лоренцини. Пороговые концентрации L-ГЛУ и L-АСП составляли Ю"7М. Все исследованные во- . локна по направленности ответной реакции можно было подразде- ■ лить на три группы. Большая часть волокон на аппликацию аминокислот (7156 для L-ГЛУ и 8156 для L- АСП) отвечала увеличением частоты спонтанной активности. У меньшей части волокон ( 1056 для L-ГЛУ и 8% для L-АСП) частота фоновой импульсации понижалась. У 19 % волокон не наблюдали изменение импульсации при перфузии-L-ГЛУ, ш не отвечали на аппликацию L-АСП. Направленность ответной реакции на предъявление аминокислот хорошо коррелировала с начальным уровнем частоты афферентной импульсации. Рецепторы с фоновой активностью до 25 имп/с, отвечали на предъявление L-ГЛУ и L -АСП увеличением импульсации, тогда как у волокон со спонтанной активностью выше 25 имп/с при аппликации аминокислот уровень импульсации мог понижаться. При высоких концентрациях аминокислот увеличение фоновой активности сменялось ее резким понижением и развивался блок синаптмеской передачи. При последующей замене раствора на нормальный уровень фоновой активности восстанавливался.

Необходимо отметить, что при увеличении концентрации аминокислот уменьшался латентный период ответа, а величина реакции на приложение L-ГЛУ и L-АСП обнаруживала четкую зависимость от

их концентрации.

В ходе перфузии препарата растворами Ь-ГЛУ и ь-АСП изменялась и вызванная активность. Динамика изменения вызванных ответов на электрическую стимуляцию и скорость их восстановления в нормальном растворе была выше, чем скорость изменения фоновой активности. При перфузии нормальным раствором амплитуда вызванных ответов также возвращалась к исходному уровню.

Внешняя перфузия препарата ампул Лоренцини скатов раствором ь- СОФ в концентрации ю"7- 1СГ1 М приводила к уменьшению частоты фоновой активности. Пороговая концентрация Ь-СОФ в этой реакции составила Ю"7 М. В диапазоне концентраций Ь-СОФ Ю"7-Ю"в м Частота'фоновой активности снижалась в зависимости от концентрации антагониста, устанавливался новый уровень им-пульсации; который сохранялся длительное время. При концентрации ь-СОФ ю"4 М наблюдалось полное подавление импульсной активности рецепторов. В кавдом из экспериментов степень ингибирующего влияния ь-СОФ четко зависела от концентрации антагониста. Параллельно ей снижением частоты фоновой активности в нервных волокнах ампул Лоренцини при перфузии Ь-СОФ наблюдалось уменьшение вызванных ответов на электрическую стимуляцию. При перфузии нормальным раствором первоначальный уровень фоновой активности и вызванных ответов полностью восстанавливался.

Для доказательства ингибирующего влияния ь-СОФ на глута-матнне рецептора и для определения подтипов глутаматных рецепторов, на которые действует ь-СОФ, проводились опыты по исследованию влияния ь- СОФ на ответы, вызванные аппликацией Ь-ГЛУ и его агонистов Ка, Кв и ШДА. Для этого ампулы Лоренцини тестировали раствором, содержащим ь-ГЛУ или его агонист, и величину этою ответа сопоставляли с аналогичным ответом в присутствии Ь-СОФ. Лерфузия электроргцепторов раствором ь-СОФ приводов к снижению величины ответа на экзогенно приложенный Ь-ГЛУ. Степень ингибирующего влияния Ь-СОФ на ответы, вызванные экзогенным ь-ГЛУ, зависела от концентрации антагониста, что выражалось в постепенном снижении ответов на ь-ГЛУ вплоть до ах полного исчезновения. В нормальном растворе величина ответа на экзогенно приложенный Ь-ГЛУ полностью восстанавливалась.

- 12 -

Перфузия препарата ампул Лоренцшш раствором агонистов Х-ГЛУ: Ка, Кв и ИЩА, также вызывала увеличение частоты фоновой активности, которая возвращалась к исходному уровню в нормальном растворе. Анализ результатов экспериментов по перфузии св-наптичеекой области- электрорецепторов растворами агошстов Ь-ГЛУ на фоне действия ъ-СОФ показал, что последний ингибировал ответы, вызванные НЦДА, незначительно потенциировал реакции электрорецепторов на Кв и не влиял на ответы, вызванные Ка.

Внешняя перфузия препарата ампул Лоренцини раствором синтетического аналога лей-энкефалина - даларгина приводила к уменьшению уровня фоновой и выданной активности афферентных волокон. Отчетливое уменьшение уровня фоновой активности наблюдалось при концентрации даларгина Ю"10 М. В диапазоне концентраций ю-1О-10-7 И уменьшение уровня фоновой активности линейно зависело от концентрации даларгина. При перфузии препарата растворами болйе высоких концентраций (ю"7-ю ~6 М) возрастала скорость ингибирования ответа, а дозо-зависимый эффект был менее отчетливым. В диапазоне указанных концентраций все наблюдаемые изменения фоновой и вызванной активности были обраиаш.

Ингибирование фоновой активности ампул Лоренцшш „ вызванное аппликацией даларгина, устранялось налоксоном (ю"Е М). Наблюдаег,шй эффект свидетельствует в пользу того, что ингибирование даларгином фоновой активности ампул Лоренцини осуществляется через опиатные рецепторы.

Возможность модулирующего влияния даларгина на глутама-тэргическую синоптическую передачу в электрорецепторах нашла подтверждение в экспериментах по влиянию даларгина на ответы, вызванные экзогенно-приложенным ъ-ГЛУ. Для этого эксперимент проводили по следующей схеме: первоначально регистрировали величину реакции ампул Лоренцини на аппликацию ъ-Ш; затем величину этого оть.га сопоставляли с реакцией ампул Лоренцшш на Ь-ГЛУ в ' присутствии даларгина. Перфузия синаптической области ампул Лоренцини раствором.ь-ГЛУ приводила к увеличению импуль-сации, которая возвращалась к исходному уровни в нормальном растворе. Добавление в нормальный физиологический раствор даларгина в концентрации ю"7 М приводило к снижению.амплитуды

- 13 -

ответов на экзогенно приложенный Ь-ГЛУ.

Для подтверздения гипотезы о трансмиттерной роли Ь-ГЛУ пс-ледовали кинетику связывания ь-[н3]-ГЛУ с грубой фракцией мембран ампул Лоренцини. Для определения оптимальных условий связывают х.- [ Нэ ] —ГЛУ с плазматическими мембранами ампул Лоренцини были проведет эксг1рименти по определению уровня специфического связывания ь-[Нэ]-ГЛУ в зависимости от концентрации белка в пробе, от времени и температуры инкубации. Зависимость уровня связывания ь-[Н3]-ГЛУ от концентрации белка в пробе исследовалась при концентрации лиганда в инкубационной среде юо нМ. Опыты показали, что зависимость специфического связывания Ь-Ш31-ГЛУ с синаптйческими мембранами ампул Лоренцини от содержания белка в пробе в диапазоне концентраций от 50 до 150 мкг/мл носила линейный характер. При концентрации белка в просе >150 мкг/мл наблюдалась низкая скорость фильтрации инкубационной смеси, что сопровождалось большим разбросом результатов. Быстрая скорость фильтрации проб, а также значительное превышение уровня специфического связывания над неотецифяческим наблюдалось при содержании белка в пробе от 50 до 70 мкг.

Анализ результатов экспериментов по влиянию температуры и времени инкубации на уровень специфического связывания ь-[нэ]-ГЛУ показал, что удовлетворительный уровень специфического связывания лиганда с мембранами ампул Лоренцини достигался либо при температуре инкубации 37°С и временя инкубации 15 минут, либо при комнатной температуре (19°С) в течение зо минут. Учитывая температурные условия шзнеобитания скатов и оптимальный температурный реким функционирования электрорецепторов (12°-18°0),препарат инкубировали при температуре 19°С зо тану?.

Зависимость связывания 1г-[нэ1-ГЛУ о синаптическими мембранами шгул Лоренцини в интервале концентраций от 25 до 400 нМ носила насыщающий характер. Обработка результатов экспериментов по методу Скетчарда позволила выявить один тип участков связывания ь-[н3]-ГЛУ с К = 2867Ю нМ и В = 2,1718 рМ/мг белка.

Д ШЛЯ ^

Известно, что идентификация рецепторов возбуадающих аминокислот на синаптических мембранах затруднена из-за сложности разделения рецепторных участков связывания и участков, принад-

лежащих системам переносчиков аминокислот. Из литературы известно, что связывание аминокислот с высокоаффинной системой захвата и транспорта в значительной степени зависит от внеклеточной концентрации Ма+ (Poster, Fagg, 1984; Nicholls, Attwell, 1990). Следовательно, 'связывание глу тема та с мембранами в без-натриев'ой инкубационной среде может свидетельствовать о присутствии на мембранах рецепторных участков связывания.

Добавление в инкубационную среду ионов Na*n К* в конечных концентрациях от о,1 до 100 мМ вызывало зависимое от дозы подавление уровня специфического связывания. Действие ионов На" имело многофазный характер: сезкое инмбирущее действие при малых концентрациях (ЮБОоколо 50 мкМ) сменялось небольшой, но статистически достоверной активацией связывания, за которой следовало повторное ингибироваше связывания при концентрациях, превышающих 25 мМ. Участки связывания, иигибируемне малыми концентрациями Na+, составляли около 55% от полной популяции участков связывания.

Влияние ионов К" на связывание 1-(Нэ]-ГЛУ с мембранами электрорецепторов носило аналогичный характер, однако, концентрационная зависимость эффекта была сдвинута по сравнению с ш* в сторону больших концентраций, а активация связывания при концентрациях 1-ю мМ была статистически недостоверна.

Ионы Са** в концентрациях 5-50 мМ оказывали на связывание ь-[Нэ]-ГЛУ ингибирующее действие. Стимулирующего эф|юкта Са**, характерного для мембран, выделенных из головного мозга млекопитающих, йе было обнаружено.

Введение в инкуоационнуи среду ионов Kg*"1' приводило к двухфазной реакции: незначительное (15-20%) увеличение связывания при концентрации 1 мМ сменялось последующим ингибируюцим эффектом в диапазоне концентраций до 50 мМ.

Добавление в инкубационную среду ионов хлора не приводило к статистически достоверному изменению уровня специфического связывания. Однако совместное присутствие в инкубационной среде ионов ci"/ Са** активировало процесс связывания.

Дгонисты глутакатаг Кв, Ка, и ШЛА - зшгибироваш связывание ь-Шэ]-ГЛУ соответственно на 4055, 38Ж, и 34 % , причем иц-

гибированпе проходило по насыщающему типу. Чувствительность глутаматовязывающих сайтов ампул Лоренцини к агонистам аминокислот по данным радиолигандного анализа можно выразить рядом: Ка > Кв> ШДА.

Для доказательства принадлежности глутаматовязывающих сайтов к синаптическим структурам проводились опыты по влиянию 1ЖС к ГИБ головного мозга человека на фоновую активность электрорецепторов. Инкубация препарата мандибулярной группы ампул Лоренцини в среде, содержащей ПКС к ГМБ, приводила к изменению импульсной активности. После инкубации препарата в ПКС к Ш5 в разведении 1:50, наступало резкое ингибированиэ фоновой активности, и в течение нескольких минут развивался блок синаптичес-кой передачи. Немедленная отмывка препарата физиологическим раствором приводила к восстановлению активности. Повторная аппликация антител вызывала полное и более быстрое ингибирование пмпульсации с развитием стойкого блока сияаптической передачи, который сохранялся в течение полуторачасовой отмывки препарата в нормальном растворе.

Контрольная инкубация препарата с поллклональными антителами к пролактину в течение 12 часов не изменяла уровня фоновой импульсной активности рецепторов.

ОБСУЖДЕШ РЕЗУЛЬТАТОВ

Анализ фармакологических экспериментов, выполненных на изолированном препарате ампул Лоренцини, и анализ кинетических параметров связывания Х.-[Я3]-ГЛУ с мембранами ампул Лоренцини позволяет сделать вывод о присутствии в афферентном синапсе электрорецепторов скатов глутаматсвязывавщего рецепторного комплекса.

Исследование влияния ь-СОФ на процесс синаптичесхой передачи в °лектрорецепторах показало, что ь-СОФ ингибирует только глутаматные рецепторы НМДА типа. Результаты этих экспериментов подтверждают гипотезу о возможном участий кислого мембранного липида фосфотидилсерина, в полярную группу которого входит х-серин-О-фосфат, в регуляции функции глутаматных рецепторов.

Характеристики рецепторного связывания, полученные на мембранах ампул Лоренцини, близки к кинетическим параметрам связи-

вания ь-[н3]-ГЛУ с рецепторами глутамата центральной нервной системы.

Результаты радиолигандных экспериментов . по влиянию на процесс связывания агонистов Ъ-ГЛУ: Ка, Кв и ЩДА, показали, что выявленная популяция глутаматных рецепторов гетерогенна и представлена рецепторами каината, квисквалата и ИЩА.

Выполненные ранее фармакологические эксперименты по иссле-довашю влияния на синаптическую передачу ампул Лоренцини воз-бувдающих аминокислот: Ь-ГЛУ, Ь-АСП, их агонистов: Ка, Кв и НВДА), антагонистов: аминофосфоновалериата, мшнсфосфонобутира-та, кинурената, диэтилового зфита ГЛУ, (А1соев, Андрианов, 1989; Акоеу et а1., 1991 а.Ь) также продемонстрировали присутствие в' афферентном синапсе ампул Лоренцини трех подтипов глутаматных рецепторов. Чувствительность мембранных рецепторов к агонистам Ь-ГЛУ в этих опытах, так же как и в радиолигандных экспериментах, выражалась рядом Ка> Кв> НМДА. Результаты радиолигандных экспериментов по определению фармакологического профиля популяции рецепторов глутамата хорошо согласуются с данными, полученными на изолированном препарате ампул Лоренцини в фармакологических экспериментах (Акот, АпсМапоу, 1993).

Принадлежность выяшешшх глутачзтсвязываищих сайтов к си-наптичесиш структурам подтвердилась опытами по ипгибировашш фоновой афферентной импульсации поликлональной ' аитисывороткой к глутамагсвязывавдему мембранному белку головного мозга человека. Длительное блокирование афферентной импульсации поликлональными антителами по нашему мнению свидетельствует о значительной коьшлем." .парности и высоком аффинитете мезду глу-таматными рецепторами ампул Лоренцини скатов и ПКС к ИБ головного мозга человеке, а также о принадлежности высокоаффкнкых . глутаматсвязываищх сайтов к синаптическим структурам. Наблюдаемый нами эфйкт полного и стойкого иншбировшшя антителами синоптической передачи в ампулах Лоренцини скатов подтверждает гипотезу о присутствии специфических глутаматных рецепторов в синапсах ампул Лоренцини и о нейротрансмиттерной роли Ь-ГЛУ. Также эти опыты позволяют высказать предположение о присутствии общих антигенных детерминант в глутаматэргических синапсах коры

головного мозга человека и в афферентном синапсе электрорецептора ската. Это позволяет рассматривать электрорецепторы ската в качестве простой и адекватной модели для исследования тонких механизмов глутаматэргической синЕПтической передачи и для скрининга новых лигандов возбуждающих аминокислот.

Результаты эк-териментов по влиянию на процесс синаптичес-кой передачи синтетического аналога лей-эикефалина - даларгина - свидетельствуют о присутствии опиатннх рецепторов в ампулах Лоренцини скатов и о модулирующем влиянии, которое оказывают опиатные рецепторы на глутаматэргическую игааптическую передачу. С другой стороны, эти да!шые позволяют сделать предположение о возможности модулирования энкефалянаш избыточного потока афферентной импульсации, поступающего в центральную нервную систему, уке на уровне первого синаптического переключения. Выявленный феномен, вероятно, может служить одним из возможных механизмов адаптации организма к среде обитания.

ВЫВОДЫ

1. Исследование влияния возбуждающих аминокислот на сшаптическую передачу ампул Лоренцини черноморских скатов показало, что ь-глутамат и 1-аспартат (ю"э-10"7 М) вызывали зависимое от концентрации увеличение уровня фоновой и вызванной активности рецепторов.

.2.-Антагонист возбуждающих аминокислот - ь-серин -о-фосфат вызывал зависимое от концентрации угнетение фоновой и вызванной активности, а также уменьшал ответы на экзогенно приложенный Ь-ГЛУ. Выявлено, что ь-серш-О-фосфат ингибировал ответы только на аппликацию ЩЦА, что дает возможность предполагать, что Ь-СОФ является антагонистом ЩЦА рецепторов.

3. Синтетический аналог лей-энкефзлина -дэларгин (ю"10 ;о"7 М) ингибировал фоновую и вызванную активность электрорецепторов, а таете ответы на экзогенно приложенный глута-мат. Налоксон блокировал реакции на даларган. Полученные данные позволяют сделать вывод о модулирующем влиянии энкефалинов на синаптическую передачу в злектрорецегггорах.

рецепторы, определены динамические характеристики связывания (Кд= 286 нМ, вмя= 2,1 пМ/ мг белка) и зависимость уровня связывания от концентрации катионов и анионов.

5. Агонисты глутамата Кв, Ка„ и №ЩА ингибировали процесс связывания соответственно на 4056 зя% и 34S6, что свидетельствует о гетерогенности глутаматных рецепторов ампул Лоренцшш, и существовании каикатных, квисквалатных и НМДА подтипов рецепторов.

6. Применение элементов имуноферментного анализа доказало, что выявленные высокоаффинные глутаматсвязывагощие сайты принадлежат синаптическим структурам.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТИЛЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Акоев Г.Н., Дамбинова С.А., Андрианов D.H., Городанс-ский А.И., Рыжова И.В. Исследование природы нейропередатчика в волосковых клетках электрорецепторов (ашул Лоренцшш) черноморских ска^в. Докл. АК СССР, 1990, т. 313, И 4, 1007-1010.

2. Рыкова И.В., Городинский А.И., Акоев Г.Н., Дамбинова СЛ. Рецепторные участки связывания Ъ-Ш3]-глутамата на мембранах, выделенных из ампул Лоренцшш скатов Raja olavata. Журнал эвол. биохим. и физиол.с 1991, т. 27, N 1, 3-5.

3. Акоев Г.Н., Андрианов Ю.Н., Дамбинова С.А., Городинский А.И. Электрофизиологический и радаолигандный анализ рецепторов возбуждающих аминикислот в ампулах Лоренцшш скатов. Биологические мембраны 1991. т.8. N11, 1203-1204.

4. Акоев Г.Н., Андрианов Ю.Н., Рыкова И.В., Шерман Н.О. Влияние ь-серин-О-фосфата на синаптическую передачу в афферентном синапсе ампул Лоренцини скатов. Нейрофизиология, 1991, т. 23, N 4, 3Q7-391.

5. Akoev G.N., Andrianov G.N., Ryzhova I.V., Sixenaan И.О.. L-Borine-O-phosphate blocks ШША-evoked гевропваз ill the ampullae of Lc .>nzini of skates. Neuroreport. 1992. 3, 7-9.

6. Акоев Г.Н., Андрианов D.H., Рыкова И.В., Шерман Н.О., Дамбинова С.А. Механизмы синаптической передачи в электрорецепторах. / Сенсорные системы 1992, т.6, N 4, 55-58.

7. Акоев 1.11., Андрианов Ю.Н Браун X.А., Рыжова И.В., Фогт К, Шерман Н.О. Модулирующее влияние даларгона на глутама-

тэргическую синаптическую передачу в ампулах Лоренцшш скатов. Биологические мембраш 1992, т.9, N ю-11, 1126-1127.

8. Аксев Г.Н., Андрианов Ю.Н. Браун Х.А., Рыкова И.В. Шешап И.О., Фогт- К. Эффект синтетического аналога лей-энкёфа-лина даларгана на синаптическую передачу в- ампулах Лоренцнни скатов. Нейрофизиология, 1993, т.25. Н 4, 18-21.

9. Antoianov G.N., Akoev C.N., Braun H.A., Hyzhova I.V., Voigt K.R., Sherman N.O. Actions of dalargln upon single unit activity In the ampul 1^.9 of Lorenaini of skates /Raja olavata/ Neuroreport 1993, V.4, N 1, 53-54.

подписано к печати Ч.08.93. Закая 237. Тираж 100 Объем I щл. ПНЛ ГПГУ. 19"034, Санкт-Петербург, наб. МаКарова,6.