Экзополисахариды молочнокислых бактерий и их функциональная значимость в организме животных

Полукаров, Евгений Викторович

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экзополисахариды молочнокислых бактерий и их функциональная значимость в организме животных
ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Экзополисахариды молочнокислых бактерий и их функциональная значимость в организме животных"

003482460

На правах рукописи

Полукаров Евгений Викторович

ЭКЗОПОЛИСАХАРИДЫ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ И ИХ ФУНКЦИОНАЛЬНАЯ ЗНАЧИМОСТЬ В ОРГАНИЗМЕ ЖИВОТНЫХ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ 5 НОП 2 Г'О

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Саратов-2009

003482460

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова»

Научный руководитель

доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна

Официальные оппоненты доктор медицинских наук, профессор

Швиденко Инна Григорьевна доктор биологических наук, профессор Коннова Светлана Анатольевна

Ведущая организация:

ФГУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб»»

Защита диссертации состоится 26 ноября 2009 г в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский ГАУ им. Н.И. Вавилова».

Автореферат диссертации разослан 23 октября 2009 г. и размещен на сайте: www.sgau.ru

Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1, ученому секретарю диссертационного совета.

Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук, профессор

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Среди многочисленных веществ - метаболитов бактерий особое место занимают углеводы и их производные, которые в виде разнообразных производных комплексов входят в состав живых клеток, выполняя роль источника энергии, регуляторов специфических биохимических процессов.

Источником получения экзополисахаридов (ЭПС) на сегодняшний день являются многие микроорганизмы. К наиболее известным микроорганизмам, которые способны продуцировать ЭПС, относятся бактерии разных родов. Среди них значительное место занимают молочнокислые бактерии.

Изучение ЭПС, продуцируемые молочнокислыми бактериями, началось с 80-х годов прошлого столетия и активно развивается в настоящее время, отражением чего служат постоянно публикуемые обзоры (Sandford, Cottrell, Pettitt, 1984; Degeest, Van-ingelgem, Vuyst, 2001; Bergmaier, Champagne, Lacroix, 2003; Champagne, Gardner, Lacroix, 2007 и др.).

Среди молочнокислых бактерий особое внимание уделяется бактериям рода Lactobacillus, представители которого широко распространены в природе. Разными исследователями показано, что лактобацилльг обладают большим потенциалом в отношении синтеза экзополисахаридов (van den Berg et al., 1995; Gasscm, Schmidt, Frank, 1995; Macedo et al., 2002 и др.), однако функции этих биополимеров являются не до конца изученными. Для формирования представления о влиянии ЭПС молочнокислых бактерий на физиологические реакции в организме животных, необходимо накопление данных о химической структуре, физических и биологических свойствах ЭПС разных видов и штаммов.

В связи с этим исследования, посвященные изучению функций экзополисахаридов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus различных штаммов, являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.

Цель работы состояла в выделении ЭПС из Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, изучении их основных физико-химических свойств и влиянии их на содержание ци-токинов в организме животных в норме и при стафилококковой инфекции.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

1. Подобрать оптимальные условия культивирования L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (состав питательной среды, температура, рН, время культивирования) для обеспечения максимального продуцирования ими экзополисахаридов в лабораторных условиях.

2. Выделить и очистить экзополисахариды L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 из культуралыгой жидкости.

3. Определить молекулярную массу, химическую природу, моносахаридный состав и вязкость полученных экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596.

4. Изучить влияние in vivo экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 на содержание ци-токинов в сыворотке крови экспериментальных животных.

5. Оценить цитокиновый статус организма экспериментальных животных при моделировании стафилококковой инфекции на фоне действия ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596.

Научная новизна

Впервые выделены ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936, L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 и определены их молекулярные массы, химическая природа, моносахаридный состав и вязкость. Показано, что L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 максимально продуцируют экзополисахариды на среде A.Welman с соавт. (2003) в нашей модификации при 38°С, рН 5,5 на 44-46 ч культивирования.

Обнаружено, что введение ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 в организм лабораторных мышей оказывает неоднозначное влияние на содержание цитокинов: ИЛ-1а, ФНО-а, ИФ-у, ИЛ-4 в сыворотке крови. Показана возможность коррекции цитокинового статуса организма лабораторных мышей путем введения им ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 при стафилококковой инфекции.

Практическая значимость работы

Способность экзополисахаридов Ь. (1е1ЬгиескИ вэр. Ьи^апсиз, I. с1е1ЬгиескИ В-1936 и Ь. МЬгиескИ зиЬэр. йе1ЪгиесШ В-1596 регулировать содержание некоторых провоспалительных и регуляторных цитокинов в организме животных открывает перспективы использования их в качестве профилактических иммуномодулирующих препаратов и для коррекции цитокинового статуса при инфекционных заболеваниях.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по выделению и очистке экзополисахаридов бактериального происхождения» (в соавторстве с Г.Е. Рысмухамбетовой, Е.Н. Бухаровой, Д.А. Жемеричкиным, Л.В. Карпуниной) для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических, биотехнологических лабораторий, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 58 от 23 июня 2009 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании дипломных работ в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные из культуральной жидкости ЭПС I. <1е1Ъгиески .чБр. Ьи^агкш, Ь. йе1Ьгиески В-1936 и Ь. ¿г1Ьгиески виЬзр. <1е1Ъгиескп В-1596 представлены одной нейтральной фракцией с молекулярными массами 140 кДа, 220 кДа, 1700 кДа соответственно и характеризуются сходным моносахаридным составом, однако обладают разной относительной вязкостью.

2. Оптимальными условиями культивирования для наибольшей продукции экзополисахаридов для £. с1е1ЬгиескИ 5вр. Ьи^аг1сих, Ь. с1е1ЬгиескИ В-1936 и йе1Ьгиеска 5иЬ$р. ¿еШгиескИ В-1596 являются: 38 °С, рН 5,5, время культивирования 44-46 ч на модифицированной питательной среде Л.\¥е1ш;ш с соавт. (2003).

3. ЭПС Ь. с!е1Ьгиески ЗБр. Ьи^апсиз, с1е1Ьгиески В-1936 и /„. Ле1Ъгигски эиЬзр. с1е1ЬгиескП В-1596 оказывают влияние на цитокиновый статус организма экспериментальных животных в норме и при стафилококковой инфекции.

Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: II-Открытой Всероссийской конференции «Молодежь и наука XXI века» (Россия, Ульяновск, 2007); региональной конференции молодых ученых «Вавиловские чтения - 2007» (Россия, Саратов, 2007); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины (Россия, Саратов 2009); XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Россия, Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация состоит из введения, двух глав: обзора литературы и собственных исследований, включающей объект и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов и списка используемых литературных источников. Работа изложена на 106 страницах, содержит 2 таблицы, 25 рисунков. Список использованных литературных источников включает 148 наименований, в том числе 128 зарубежных.

СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объект и методы исследований

В работе использовали культуру L. delbrueckii ssp. bulgaricus, полученную из сухого порошка лиофилизированной бактериальной закваски болгарских палочек, используемую в России для производства йогуртов (Государственное унитарное предприятие производственно - экспериментальный завод РАСХН, г. Москва); L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii В-1596, полученные из Российской коллекции микроорганизмов (г. Пущино-на-Оке); культуру Staphylococcus aureus 209-Р, полученную из коллекции культур микроорганизмов кафедры микробиологии Саратовского государственного университета им. Н.Г. Чернышевского.

Для культивирования бактерий рода Lactobacillus использовали следующие питательные среды: лактобакагар, среда A. Welman с соавт. (2003) и S. Petry с соавт. (2000). S. aureus 209-Р выращивали на мясо-пептоном агаре.

Выделение и очистку экзополисахаридов лактобацилл проводили по методу J. Cerning с соавт. (1986) в нашей модификации.

Молекулярные массы экзополисахаридов лактобацилл определяли с помощью аналитической гель - хроматографии, используя гелиевый носитель TSK 6000G PWXL (Япония). ЭПС детектировали на автоматическом анализаторе 2690- Alliance Waters. Аналитическую колонку калибровали декстранами («Fluka» Швейцария, «Merck» Германия) с известными молекулярными массами (2000, 110,15-20 кДа).

Определение белка проводили по методу М. Bradford (1976).

Определение общего количества углеводов в экзополисахаридах лактобацилл проводили по фенол-серному методу (Dubois et al., 1956).

Химическую природу экзополисахаридов лактобацилл определяли методом ионообменной хроматографии, используя анионнообменный носитель DEAE-C Toyopearl 650 M (Остерман, 1985).

Моносахаридный состав экзополисахаридов лактобацилл определяли методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на пластинках с целлюлозным носителем «Fluka» (Остерман, 1985; Варбанец, 2006) и с помощью хроматографического метода', используя колонку Carbopac PA (Dionex, США), хроматограф SMART LINE 5000 (KNAUER, Германия) и детектор DECADE II Anthec Leyden (Нидерланды). Анализ проводили в соответствии с рекомендациями фирмы-производителя колонки (Dionex, США).

Динамическую вязкость определяли на ротационном вискозиметре Termo Haake Viskotester - 7R (Нидерланды), относительную вязкость - с помощью капиллярного вискозиметра ВПЖ-2 (Россия) (Рабек, 1983).

Моделирование инфекционного процесса у белых беспородных мышей (самцы, с массой тела 18-22 г) проводили введением суточной культуры S. aures 209-Р по 0,2 мл внутрибрюшинно в дозе 5 млн кл/мл. ЭПС в концентрации 0,0012 г/мл вводили белым мышам по 0,2 мл внутрибрюшинно через 1 час после заражения. Через 1 и 6 часов мышей умерщвляли транслокацией шейных позвонков, брали кровь из сердца и

1 Выражаем глубокую благодарность с.н.с., к.б.н. ИФРМ РАН (г. Саратов) Селиванову Николаю Юльевичу за практическую помощь при определении углеводного состава в ЭПС лактобацилл.

получали сыворотку по общепринятой методике (Кондратьева и др., 2001). Содержание цитокинов: ИЛ-1а, ФНО-а, ИФ-у и ИЛ-4 определяли в сыворотке крови постановкой иммуноферментного анализа (ИФА) с тест-системами на основе монокло-нальных антител (наборы реактивов "цитокиновый тест" АО "Иммунодиагностика" г. Санкт-Петербург и тест-сисгемы «ИФА-БЕСТ», производства ЗАО «Вектор-БЕСТ», г. Новосибирск). Определение каждого цитокина осуществляли в соответствии с рекомендациями производителя тест-систем, результаты учитывали на Multiskan Plus version 2.01. По значениям оптической плотности стандартных образцов строили калибровочные кривые и с учетом оптической плотности образцов определяли концентрации цитокинов.

Статистическую обработку результатов проводили по стандартным методикам (Воробьев, 1989), а также с использованием программы StatPlus 2007 Professional 4.9.4.1.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Подбор питательных сред и условий культивирования лактобацилл

В процессе работы было показано, что при выращивании L.delbrueckii ssp. bulga-ricus при 38°C и pH 5,5 на среде A. Welman с соавт. (2003), выход экзополисахаридов составил 350 мг/л, в то время как при культивировании бактерий при температуре 35°С и 43°С при этом же значении pH выход ЭПС был 180 мг/л и 156 мг/л соответственно (рис. 1).

При культивировании лактобацилл на среде

со значением pH 5,0 и значениях температур

Рис. 1. Влияние температуры и pH среды 35 °С, 38 °С, 43 °С выход ЭПС составил 147, 180, на продукцию ЭПС X. delbrueckii ssp. bul-

garicus (среда A. Welman с соавт. (2003), на I 128 мл/л соответственно. Изменение значения лактозе)

pH с 5,0 до pH 6,0 при тех же температурах привели к тому, что выход экзогликанов составил 150, 218, 139 мг/л соответственно (рис. 1). Выбор значений pH проводили | исходя из литературных данных (Petry et al., 2000; Welman, Maddox, Archer., 2003; Champagne et al., 2007 и др.).

При выращивании лактобацилл при температуре 38 °С и разных значениях pH было отмечено, что при pH 5,0 и 6,0 происходило торможение роста и размножения

клеток в лаг-фазе в отличие от значения рН 5,5, что сказывалось на дальнейшей продукции экзополисахаридов (рис. 2).

Культивирование L. delbrueckii ssp. bulga-ricus проводили на термостатируемой качалке для выращивания бактерий при 185 об/мин.

Выбор источника углерода также оказывает большое влияние на биосинтез экзополиса-харидов молочнокислыми бактериями. Основными источниками углерода для молочнокислых бактерий являются глюкоза, галактоза, лак- Рис. 2. Влияние рН на рост L. delbrueckii

ssp. bulgaricus (на среде A. Welman с соавт. тоза, манноза, фруктоза и сахароза, а также ком- (2003) при температуре 38 °С на лактозе)

бинации из этих Сахаров (Gamar-Nourani, Biondeau, Simonet, 1997; Yuksekdag, Aslim, 2008). Для выращивания L. delbrueckii ssp. bulgaricus в среде культивирования помимо лактозы были использованы глюкоза и сахароза (рис. 3). При введении в среду выращивания в качестве источника углерода сахарозы наблюдали отсутствие роста лак-тобацилл. При выращивании их на лактозе выход ЭПС составил 350 мг/л. В случае замены лактозы на глюкозу в тех же концентрациях (20 г/л), выход экзополисахаридов увеличивался до 495 мг/л.

По литературным данным известно, что внесение в питательную среду полисахаридной затравки способствует увеличению биосинтеза экзополисахаридов (Волова, 1999). Использование в качестве такой затравки полисахарида - декстрана (м. м. 5 кДа) в количестве 0,1 г/л, которую добавляли в среду совместно с глюкозой, способствовало увеличению синтеза экзополисахаридов, выход которого достигал 750 мг/л (рис. 3).

При культивировании лактобацилл в течение 64 ч иа синтетической среде S. Petry с соавт. (2000) (в качестве источника углерода использовали глюкозу) при температурах 35 °С, 38 °С и 42 °С и значении рН 6,0 было показано, что наибольший

I i

- ti fejj Щ

t Ail

1 l ]

у- 1 i |

1 ! ! 1 i i-L [ 1 1

0 2 4 6 8 10 12 M 16 ta 20 22 24 26 38 30 32 34 36 38 40 42 « « 48 [-«-РН5.0 —[Н5.5

Рис. 3. Влияние источника углерода па продукцию ЭПС Ь. с!е1ЬгиескИ ssp.hu/garicus на среде А. %'е1тап с соавт. (2003) Примечание: а - термостатируемая качалка б - ферментер

выход ЭПС - 220 мг/л, происходил при 38 °С. В то время как при выращивании лактобацилл при температурах 35 °С и 42 °С выход ЭПС составил не более 150 и 180 мг/л соответственно (рис. 4).

Использование декстрана на данной среде выращивания лактобацилл также способствовало увеличению синтеза экзополисахаридов - до 410 мг/л.

Таким образом, как показали результаты наших исследований, лучшей средой для получения максимальной продукции ЭПС при культивировании лактобацилл являлась среда A. Welman с соавт. (2003) в нашей модификации. В связи с этим выращивание L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii В-15 96 для получения ЭПС также проводили на этой среде при подобранных условиях культивирования.

При культивировании L. delbrueckii ssp. bulgaricus в лабораторном ферментере2 (марка КФ-104, версия программы управления ферментером Kek. Lab. 1.0.0.69) при 38 °С, рН 5,5, VMemarao, 110±5 об/мин, продувка воздухом 0,5 мин'1 на среде A.Welman с соавт. (2003), продукция ЭПС составила 980 мг/л, что в 1,3 раза было больше по сравнению с культивированием на той же питательной среде на термостатируемой качалке (рис. 3).

Выделение и очистка экзополисахаридов лактобацилл Выделение ЭПС проводили по методу J. Cerning с соавт. (1986) в нашей модификации. Для выделения ЭПС продуцируемых L.delbrueckii ssp. bulgaricus, ¿.delbrueckii B-1936 и L.delbrueckii subsp delbrueckii B-1596 культуры выращивали на среде A.Welman с соавт. (2003) в течение 44-46 часов. Далее культуральную жидкость центрифугировали при 16660g и температуре 4 °С в течение 30 мин. Осадок биомассы удаляли. Освобожденную от биомассы культуральную жидкость упаривали на роторном испарителе при пониженном давлении. Отсутствие бактерий на данном этапе

1 Выражаем глубокую благодарность с.н.с., к.б.н. ЗАО «Биоамвд» (г. Саратов) Сингирцеву Игорю Николаевичу за практическую помошь при культивировании L. delbrueckii ssp. bulgaricus в лабораторном ферментере.

Рис. 4. Влияние температуры на продукцию ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus на среде S. Petry с соавт. (2000)

контролировали путем микроскопирования, с использованием метода Грама. Затем ЭПС осаждали двойным объемом охлаж-

I <

П !i

А/ !\

- !

\1\

денного 96 % этилового спирта (3-5) °С. ' Осаждение ЭПС проводили в течение 1,5 часов при температуре (3-5)°С. Полученные ЭПС очищали от низкомолекулярных соединений путем проведения диализа. Использовали диализные мембраны фирмы «Serva» с пределом исключения 12-14 кДа. Выделенные фракции высушивали. Все они имели желто-коричневый цвет за счет имеющихся в них пигмента Полученные образцы подвергали дальнейшей очистки методом гель-фильтрации (рис. 5). Выделенные ЭПС молочнокислых бактерий содержали белка менее 0,1 % и не имели пигмента, что говорило об их высокой чистоте. В то время как ЭПС, полученные по метод)' J. Cerning с соавт. (1986) содержали белка до 5 % и желто-коричневый пигмеет. Выделенные ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 были условно нами названы лаксаран Z, лаксаран 1936 и лаксаран 1596 соответственно.

Рис. 5. Хроматограммы лаксарана 1596 (I), 1936 (2), Z (3), пигмента (4), на колонке с Toyopearl HW-55 F. Vo=60. Буфер фосфатный 0,05 М (рН 5,5).Скорость элюции 1,5 мл/мин

Определение молекулярных масс лаксаранов

Молекулярные массы экзополисахаридов определяли методом аналитической гель - хроматографии. Экзополисахариды лактобацилл детектировали на автомагическом анализаторе 2690 Alliance Waters (рис. 6). Аналитическую колонку калибровали дексгранами («Fluka» Швейцария, «Мегск» Германия) с известными молекулярными массами (2000, 110, 15-20 кДа). Для калибровки графически отображали зависимость элюционных объемов от молекулярных масс декстранов. Имея данные элюционных объемов выделенных ЭПС и калибровочный график, находили молекулярные массы лаксаранов (табл. 1).

Таблица 1 - Определение молекулярных масс лаксаранов

Образец Время выхода максимального пика, мин Молекулярная масса, кДа

Декстран 20,945 2000

Дексгран 23,003 110

Декстран 24,345 15-20

Лаксаран Ъ 22,994 140

Лаксаран 1936 22,942 220

Лаксаран 1596 21,095 1700

Рис. б. Хроматограммы определения молекулярных масс лаксаранов на колонке с ТБК 600(Ю РТОа. Буфер 0,1 М №N0,, 0,03% ИаИз (рН 6,95). Скорость элюции 0,5 мл/'мин Примечание:

24,345 - время выхода декстрана м м. 15-20 кДа 23,003 - время выхода декстрана м.м. 110 кДа 22,994 - время выхода лаксарана Z (а) 22,942 - время выхода лаксарана 1936 (б) 21,095 - время выхода лаксарана 1596 (в) 20,945 - время выхода декстрана м.м. 2000 кДа

Определение химической природы и моносахаридного состава лаксаранов

Определение химической природы лаксаранов Ъ, 1936, 1596 проводили методом ионообменной хроматографии. Для этого на колонку ОЕАЕ-С Тоуореаг! 650 М нано-

сили 0,5 мл образцов ЭГ1С лактобацилл. Фракции с колонки собирали с помощью коллектора и затем исследовали на содержание углеводов фенол-серным методом. Было установлено, что все образцы выходили одной фракцией соответствующей нейтральным веществам (рис. 7).

Используя метод тонкослойной хроматографии было показано, что все лаксара-ны: Ъ, 1936, 1596 не отличаются по моносахаридному составу и включали в себя только глюкозу (рис. 8). Для уточнения моносахаридного состава ЭПС использовали хроматографический метод фирмы Оюпех (США) (рис. 9, 10). Данный метод подтвердил результаты метода ТСХ о том, что ЭПС лактобацилл состоят только из глюкозы.

[ \

1 / !

1 V

0 5 10 15 20 25 X 35 40 45 М 55 (X) 65 70 7 5 80 55

Рис. 7. Профили элюции лаксарана Ъ (а), ! 936 (6) 1596 (в) при ионообменной хроматографии на колонке ПЕАЕ-С Тоуореаг! 650 М (детекция по углеводам)

Рамноза

Рис. 8. Определение моносахаридного состава лаксаранов методом тонкослойной хроматографии

Примечаете: 1, 5 - углеводы-сввдетели, 2 - лаксаран 1596, 3 - лаксарап 1936, 4 - лаксаран Ъ.

Глюкоза

Манноза Галактоза

Рис. 9. Хроматограмма выхода арабинозы (1), фукозы (2), глюкозы (3), галактозы (4), маннозы (5) на колонке СагЬорас РА (Оюпех, США). Буфер 20 тМ ЫаОН. Скорость элюции 0,7 мл/мин

А.

Рис. 10. Хроматограммы определения моносахаридного составалаксарана2(а), 1936(6), 1596(в)

Примечание; 1 - глюкоза.

Определение относительной вязкости лаксаранов

В связи с тем. что данные экзополисахариды обладают низкой вязкостью и определить динамическую вязкость не представлялось возможным, была определена относительная вязкость с помощью капиллярного вискозиметра.

Данные об относительной вязкости экзополисахаридов представлены в таблице 2.

Таблица 2 - Определение относительной вязкости лаксаранов

Образец Время истечения, с Относительная вязкость

Растворитель (дистиллированная вода) 12,16±0,07 1,00

Лаксаран Z (10%) 12,76±0,05 1,05

Лаксаран 1936 (10%) 14,03±0,09 1,15

Лаксаран 1596 (10%) 17,98±0,0б' 1,48

Примечание: * - достоверность при р<0,05.

Исследование влияния лаксаранов на содержание цитокинов в сыворотке крови живот ных в норме

При изучении влияния лаксаранов на цитокиновый статус лабораторных мышей представляло интерес определить изменение содержания основных провоспали-телыгых цитокинов ИЛ-¡а и ФНО-а, отвечающих за инициацию факторов естественной резистентности организма животных и развитие воспалительной реакции защитного характера, а также ИФ-у, ответственного за развитие клеточных иммунных реакций, и ИЛ-4, регулирующего пре- Рис. 11. Влияние лаксаранов на содержание ИЛ-1а

в сыворотке крови экспериментальных животных имущественно реакции гуморального звена в НОрМе

у. Примечание: ! - контроль, 2 - лаксарак Z,

иммунитета. Было установлено, что при /_лаксараи т6^7Шксараи ¡596

внутрибрюшинном введении лаксарана Z в

концентрации 0,0012 г/мл через 1 час концентрация ИЛ-1а в сыворотке крови достоверно увеличивалась по сравнению с исходным значением в 3 раза (с 35,9 пкг/мл до 93,4 пкг/мл), а через 6 часов содержание ИЛ-1а было на уровне контроля (рис. 11). Действие лаксарана 1936, напротив, сопровождалось увеличением уровня ИЛ-let в

сыворотке крови спустя 1 и 6 часов в 1,5 и 3 раза соответственно по сравнению с контрольной группой животных. Введение лаксарана 1596 сопровождалось аналогичными изменениями содержания ИЛ-1а, как и при воздействии лаксарана Ъ на организм экспериментальных животных (рис. 11).

При исследовании лаксарана Ъ на содержание ФНО-а в сыворотке крови животных в норме через 1 час после введения в организм животных концентрация ФНО-а понижалась в 1,8 раза по отношению к исходному значению, после 6 часов эксперимента содержание ФНО-а в сыворотке крови мышей было на уровне контроля. При введении животным лаксарана

Рис. 12. Влияние лаксаранов на содержание ФНО-а 1936 наблюдали уменьшение содержания Е сыворотке крови экспериментальных животных

ч^ре, , Ю.С л чер^ О чaw8 ПО ОТ- Примечание: 1 - контроль, 2 - лаксаран Ъ, ношению с контролем в 1,3 и в 1,7 раз со- 3 " лаксаРан 1936,4 - лаксаран 1596.

ответственно. При введении лаксарана 1596 мышам содержание ФНО-а в сыворотке крови через 1 час увеличивалось в 1,5 раза, а через 6 часов уменьшалось в 1,7 раза по сравнению с контролем (41,4 пкг/мл и 24,6 пкг/мл, соответственно) (рис. 12).

Содержание ИФ-у в сыворотке крови

у мышей, которым вводили лаксаран Рис п Влияние лаксаранов на содержание ИФ-у в

достоверно не отличался от уровня дан- ».воротке крови экспериментальных животных

в норме

ного цитокина у контроля, а В случае С Примечание: 1 - контроль, 2-лаксаран г,

3 - лаксаран 1936, 4 - лаксаран 1596,

лаксараном 1936 наблюдалось уменьшение содержания ИФ-у в сыворотке крови через 1 и 6 часов. При введении лаксарана 1596 через 1 час наблюдалось достоверное увеличение этого цитокина в 1,5 раза, однако через 6 часов показатель содержания ИФ-у после введения лаксарана 1596 был на уровне контроля (рис. 13).

При изучении влияния лаксаранов на ИЛ-4 было показано, что при введении лаксарана Ъ уровень ИЛ-4 через 1 час достоверно увеличивался в 3 раза по отношению к контролю, а спустя 6 часов приближался к уровню контроля. При введении лаксаранов 1596 и 1936 на всем временном промежутке исследований уровень ИЛ-4 в крови исследуемых животных не отличался от контроля (рис. 14).

Рис. 14. Влияние лаксаранов на содержание ИЛ-4 в сыворотке крови экспериментальных животных в норме

Примечание: 1 - контроль, 2 - лаксаран Ъ, 3 - лаксаран 1936, 4 - лаксаран 1596.

Исследование влиянии лаксаранов на синтез цитокинов

xnií >ДАП1аг111ПАпл111д>< л-гпА(1:'1Л1ЛП1Л«<ппл1> МИАЛГЛГГЯГ/ чри iii|/uuuuii>! ч. > aijiii^ivivutvrvu'Uuri >iiii|/vniu»'i

В дальнейших экспериментах представляло интерес оценить действие лаксаранов in vivo на цитокиновый статус в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой инфекции.

Рис. 15. Влияние лаксаранов на содержание ИЛ-la в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой инфекции Примечание: 1 - контроль, 2-5. aureus 209-Р, 3 - S. aureus 209-Р + лаксаран Z, 4 -S. aureus 209-Р + лаксаран 1936, 5 - S. aureus 209-Р + лаксаран 1596.

содержания ИЛ-1а в сыворотке крови мышей при стафилококковой инфекции (рис.

15).

При введении лаксарана 1596 мышам через 1 час после инфицирования стафилококком достоверных изменений концентрации ИЛ- 1а на всем периоде наблюдения не происходило по сравнению с содержанием этого цитокина в сыворотке крови зараженных мышей (контроль 2) (рис. 15).

Содержание ФНО-а в сыворотке крови зараженных мышей через 1 и 6 часов после воздействия лаксарана Ъ достоверно не отличалось от контрольных значений (для интактных животных и инфицированных стафилококком) (рис.

16).

На фоне действия лаксарана 1936 через 6 часов отмечено достоверное снижение уровня ФНО-а в сыворотке крови зараженных мышей в 1,2 раза по сравнению со значениями в контроле 2. Более значительным это снижение было также через 6 часов при введении лаксарана 1596 после моделирования стафилококковой инфекции: содержание ФНО-а уменьшалось в 2,6 раза по сравнению с контрольными значениями (рис. 16).

При оценке действия ЭПС лактоба-цилл на изменение содержания ИФ-у в сыворотке крови лабораторных мышей при моделировании стафилококковой инфекции (рис. 17) была отмечена сходная ответная реакция на введение лаксарана Ъ

Рис. 16. Влияние лаксаранов на содержание ФНО-а сыворотке крови экспериментальных животных npi стафилококковой инфекции Примечание: ! — контроль, 2 — S. aureus 209-Р, 3 -5. aureus 209-Р + лзксаран Z, 4 - S. aureus 209-Р + лаксаран 1936, 5 - S. aureus 209-Р + лаксаран 1596.

Рис. 17. Влияние лаксаранов на содержание ИФ-у сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой инфекции Примечание. 1 - контроль, 2 - S. aureus 209-Р, 3 - S. aureus 209-Р + лаксаран Z, 4 - S. aureus 209-Р + лаксаран 1936, 5 - S. aureus 209-Р + лаксаран 1596.

и 1936: достоверное снижение уровня этого цитокина через I час по сравнению к контролю 2 в 1,6 и 2,7 раз соответственно. Через 6 часов концентрация данного цитокина достоверно не отличалась от контроля 2 (рис. 17).

При введении лаксарана 1596 содержание ИФ-у в сыворотке крови зараженных мышей незначительно увеличивалось через 1 час по сравнению со значениями для инфицированных животных, через 6 часов после введения зараженным мышам содержание данного цитокина достоверно не отличалось от значений 1 часа при введении ЭПС зараженным мышам (рис. 17).

Установлено, что все исследованные ЭПС лактобацилл не вызывали достоверных изменений в содержании ИЛ-4 в сыворотке крови экспериментальных животных, инфицированных стафилококком, через 1 и 6 часов по отношению к контролю 1 и контролю 2 (рис 18).

Таким образом, полученные результаты позволяют говорить о возможности использования ЭПС лактобацилл в качестве профилактических иммуномодулирующих препаратов и для коррекции цитокинового статуса при некоторых инфекционных заболеваниях.

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия культивирования для I. <1е1Ьгиескп вБр. Ьи^апсиз, Ь. с1е1Ьгиески В-1936 и с1е1Ьгигскп б-иЬзр. с1е1Ьгиески В-1596 (среда А.\¥е1тап с соавт. (2003) в нашей модификации, 38°С, рН 5,5 время культивирования 44-46 ч культивирования) для обеспечения максимального продуцирования ими экзо-полисахаридов в лабораторных условиях.

2. Впервые выделены экзополисахариды Ь. (1е1Ьгиески ээр. Ьи^апсия, Ь. с1е1ЬгиескИ В-1936 и Ь. с1е1Ьгиески эиЬвр. <1е1ЪгиескИ В-1596 из культуральной жидкости. Усовершенствован метод получения ЭПС, который позволяет получать хрома-тографически чистые препараты.

Рис. 18. Влияние лаксараков на содержание ИЛ-4 в сыворотке крови экспериментальных животных при стафилококковой инфекции Примечание: ! - контроль, 2 - S. aureus 209-Р, 3-5. aureus 209-Р + лаксаран Z, 4 -S. aureus 209-Р + лаксаран 1936, 5 -S. aureus 209-Р + лаксаран 1596.

3. Установлено, что ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 представляют собой нейтральные вещества с молекулярными массами 140, 220, 1700 кДа соответственно, обладают сходным мо-носахаридным составом, но различаются относительной вязкостью.

4. Показано, что ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 оказывают влияние на щггокиновый статус организма экспериментальных животных (мышей) в норме и при стафилококковой инфекции.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1.Полукаров, Е.В. Выделение и очистка экзополисахаридов из молочнокислых бактерий / Е.В. Полукаров, Д.А. Жемеричкин, Л.В. Карпунина // Молодежь и наука XXI века: Материалы II-Открытой Всероссийской конференции, 24-26 апреля 2007. - Ульяновск, 2007. - С. 64.

2. Полукаров, Е.В. Оптимизация процесса получения экзополисахаридов лактобацилп / Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина, Е.Н. Бухарова // Вавиловские чтения - 2007: Материалы конференции, посвященной 120-й годовщине со дня рождения академика Н.И. Вавилова, 26 - 30 ноября, 2007. - Саратов, 2007. - С. 334.

3. Полукаров, Е.В. Оптимизация условий культивирования Lactobacillus bulgaricus для продуцирования экзополисахаридов / Л.В. Карпунина, Е.В. Полукаров, А.В. Нур-мухамедов // Материалы конференции по итогам научно - исследовательской и производственной работы студентов за 2007 г., 7-11 апреля, 2008. - Саратов, 2008. - С. 8-9.

4. Полукаров, Е.В. Выделение экзополисахаридов Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus при различных условиях культивирования / Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина, Д.А. Жемеричкин // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова - 2009. - №. 4.-С. 20-23.

5. Полукаров Е.В. Влияние лаксарана Z на цитокиновый статус мышей при моделировании стафилококковой инфекции / Е.А. Горельникова, Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина // Сборник материалов всероссийской научно-практической конференции 2-6 февраля 2009 года, посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины. - Саратов, 2009. - С. 41-43.

6. Полукаров Е.В. Влияние экзополисахаридов Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus на цитокиновый статус лабораторных мышей / Е.А. Горельникова, Е.В. Полукаров, Л.В. Карпунина, Е.И. Тихомирова // Медицинская иммунология. - 2009. - Т. 11, № 4-5.-С. 309-310.

Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Подписано в печать 20.10.2009

Гарнитура Times. Печать Riso. _Усл. печ. л. 1,00. Тираж 100 экз. Заказ 0299_

Отпечатано с готового оригинал-макета в типографии ИП «Экспресс тиражирование» 410005, Саратов, Пугачевская, 161, офис 320 ® 27-26-93

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Полукаров, Евгений Викторович

Список условных сокращений.

Введение.

1. Обзор литературы.

1.1. Полисахариды микробного происхождения и перспективы их применения.

1.2. Классификация и структурная организация экзополисахаридов бактерий.

1.3. Факторы, влияющие на продукцию экзополисахаридов молочнокислых бактерий.

1.4. Роль экзополисахаридов, продуцируемых молочнокислыми бактериями в организме животных.:.

2. Собственные исследования.;.

2.1. Объект и методы исследований.

2.1.1. Объект исследований.

2.1.2. Среды, используемые для культивирования бактерий.

2.2. Методы исследований.

2.2.1. Выделение и очистка экзополисахаридов лактобацилл.

2.2.2. Определение молекулярных масс экзополисахаридов лактобацилл.

2.2.3. Определение вязкости растворов экзополисахаридов лактобацилл.

2.2.4. Определение белка.

2.2.5. Определение общего количества углеводов.

2.2.6. Определение химической природы экзополисахаридов лактобацилл методом ионообменной хроматографии.

2.2.7. Определение моносахаридного состава экзополисахаридов лактобацилл.

2.2.8. Моделирование инфекционного процесса у мышей.

2.2.9. Определение цитокинов.

2.2.10. Статистическая обработка результатов.

2.3. Результаты исследований и их обсуждение.

2.3.1. Подбор питательных сред и условий культивирования Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936, L. delbrueckii subsp. del-brueckii B-1596.

2.3.2. Выделение и очистка экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 иL. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596.

2.3.3. Определение основных физико-химических свойств лаксара

2.3.3.1. Определение молекулярных масс лаксаранов.

2.3.3.2. Определение химической природы лаксаранов.

2.3.3.3. Определение моносахаридного состава лаксаранов.

2.3.3.4. Определение вязкости лаксаранов.

2.3.4. Исследование влияния лаксаранов на синтез цитокинов при моделировании инфекционного процесса.

2.3.4.1. Исследование влияние лаксаранов на продукцию цитокинов в сыворотке крови неинфицированных животных.

2.3.4.2. Исследование влияния лаксаранов на продукцию цитокинов в сыворотке крови мышей при моделировании стафилококковой инфекции.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Экзополисахариды молочнокислых бактерий и их функциональная значимость в организме животных"

Актуальность темы

Изучение ЭПС, продуцируемых молочнокислыми бактериями, началось с 80-х годов прошлого столетия и активно развивается в настоящее время, отражением чего служат постоянно публикуемые обзоры (Sandford, Cottrell, Pettitt, 1984; Sutherland, 1986; Degeest, Vaningelgem, Vuyst, 2001; Bergmaier, Champagne, Lacroix, 2003; Champagne, Gardner, Lacroix, 2007 и

ДР-)

Среди молочнокислых бактерий особое внимание уделяется бактериям рода Lactobacillus, представители которого широко распространены в природе. Разными исследователями показано, что лактобациллы обладают большим потенциалом в отношении синтеза экзополисахаридов (van den Berg et al., 1995; Gassem, Schmidt, Frank, 1995; Macedo et al., 2002 и др.), однако функции этих биополимеров являются не до конца изученными. Для формирования представления о влиянии ЭПС молочнокислых бактерий на физиологические реакции в организме животных, необходимо накопление данных о химической структуре, физических и биологических свойствах ЭПС разных видов и штаммов.

В связи с этим» исследования, посвященные изучению функций экзо-полисахаридов молочнокислых бактерий рода Lactobacillus различных штаммов, являются актуальными и могут иметь значительный научный интерес и прикладное значение.

Цель работы состояла в выделении ЭПС Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596, изучении их основных физико-химических свойств и влиянии их на содержание цитокинов в организме животных в норме и при стафилококковой инфекции.

В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:

2. Выделить и очистить экзополисахариды L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 из культуральной жидкости.

3. Определить молекулярную массу, химическую природу, углеводный состав* и вязкость растворов полученных экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596.

4. Изучить влияние in vivo экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 на содержание цитокинов в сыворотке крови экспериментальных животных.

Научная новизна

Впервые выделены ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 и определены их молекулярные массы, химическая природа, моносахаридный состав и вязкость. Показано, что L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 максимально продуцирует экзопо-лисахариды на среде A.Welman с соавт. (2003) в нашей модификации при 38°С, рН 5,5 на 44-46 ч культивирования.

Обнаружено, что введение ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 в организм лабораторных мышей оказывает неоднозначное влияние на содержание цитокинов: ИЛ-1а (интерлейкин-1а), ФНО-а (фактор нейкроза опухоли-а), ИФ-у (интерферон-у), ИЛ-4 (интерлейкин-4) в сыворотке крови. Показана возможность коррекции цитокинового статуса организма лабораторных мышей путем введения им ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 при стафилококковой инфекции.

Практическая значимость работы

Способность экзополисахаридов L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 регулировать содержание некоторых провоспалительных и регуляторных цитокинов в организме животных открывает перспективы использования их в качестве профилактических иммуномодулирующих препаратов и для коррекции цитокинового статуса при некоторых инфекционных заболеваниях.

По материалам диссертационной работы опубликованы «Методические рекомендации по выделению и очистке экзополисахаридов бактериального происхождения» (в соавторстве с Г.Е. Рысмухамбетовой, Е.Н. Бу-харовой, Д.А. Жемеричкиным, Л.В. Карпуниной) для студентов старших курсов, аспирантов, специалистов микробиологических, биотехнологических лабораторий, рекомендованные Учебно-методической комиссией и одобренные Ученым советом факультета ветеринарной медицины и биотехнологии Саратовского государственного аграрного университета им. Н.И. Вавилова (протокол № 58 от 23 июня 2009 г). Результаты диссертационной работы используются в учебном процессе при чтении лекций по микробиологии, биотехнологии, проведении лабораторно-практических занятий и написании дипломных работ в Саратовском государственном аграрном университете им. Н.И. Вавилова.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Выделенные из культуральной жидкости ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 представлены одной нейтральной фракцией с молекулярными массами 140 кДа, 220 кДа, 1700 кДа соответственно и характеризуются, сходным моно-сахаридным составом, однако обладают разной относительной вязкостью.

2. Оптимальными условиями культивирования для наибольшей продукции экзополисахаридов для L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 являются: 38°C, pH 5,5, время культивирования 44-46 ч на модифицированной питательной среде A.Welman с соавт. (2003).

3. ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii В-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 оказывают влияние на цитокиновый статус организма экспериментальных животных в норме и при стафилококковой инфекции.

Работа выполнена на кафедре микробиологии вирусологии и иммунологии ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова».

Апробация работы:

Материалы диссертации были представлены на: П-Открытой Всероссийской конференции «Молодежь и наука XXI века» (Россия, Ульяновск, 2007); региональной конференции молодых ученых «Вавиловские чтения -2007» (Россия, Саратов, 2007); Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 90-летию факультета (института) ветеринарной медицины (Россия, Саратов 2009); XIII Всероссийском научном Форуме с международным участием имени академика В.И. Иоффе «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Россия, Санкт-Петербург, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 6 работ, из них 2 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Объем и структура диссертации

Заключение Диссертация по теме "Микробиология", Полукаров, Евгений Викторович

Выводы

1. Подобраны оптимальные условия культивирования для L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 (среда A.Welman с соавт. (2003) в нашей модификации, 38°С, рН 5,5 время культивирования 44-46 ч культивирования) для обеспечения максимального продуцирования ими экзополисахаридов в лабораторных условиях.

2. Впервые выделены экзополисахариды L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 из культу-ральной жидкости. Усовершенствован метод получения ЭПС, который позволяет получать хроматографически чистые препараты.

3. Установлено, что ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 представляют собой нейтральные вещества с молекулярными массами 140, 220, 1700 кДа соответственно, обладают сходным моносахаридным составом, но различаются относительной вязкостью.

4. Показано, что ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 оказывают влияние на ци-токиновый статус организма экспериментальных животных (мышей) в норме и при стафилококковой инфекции.

Заключение

Одним из перспективных направлений в современной микробиологии является изучение таких биополимеров бактериальной клетки как ЭПС. Согласно многим исследователям, большое значение на биосинтез ЭПС и его количество оказывают такие факторы как состав питательной среды (источник углерода, азота, витаминов, минералов) и условия культивирования (температура, рН), т.к. они для каждого рода и вида молочнокислых бактерий являются индивидуальными. В связи с этим начальным этапом наших исследований стал подбор питательной среды и оптимальных условий культивирования лактобацилл различных штаммов: L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 для получения наибольшего выхода ЭПС в лабораторных условиях. В результате проведенной работы было установлено, что оптимальной средой для выращивания данных лактобацилл и биосинтеза ими ЭПС явилась среда A. Welman с соавт. (2003) в нашей модификации, которая заключалась в замене лактозы на глюкозу в тех же концентрациях (20 г/л), как источника углерода и добавлением в состав среды в качестве затравки для биосинтеза ЭПС декстрана (м.м. 5 кДа) в количестве 0,1 г/л. В процессе изучения влияния условий культивирования нами было установлено, что оптимальными значениями температуры культивирования и рН явились: 38 °С и 5,5 соответственно. При данных значениях температуры, рН и при использовании глюкозы как источника углерода, выход ЭПС составил 495 мг/л. Добавление декстрана (м.м. 5 кДа) также способствовало увеличению синтеза ЭПС, выход которого возрос с 495 мг/л до 750 мг/л. При культивировании лактобацилл в ферментере (марка КФ-104, версия программы управления ферментером Kek.Lab. 1.0.0.69) при вышеподобранных уеловиях культивирования биосинтез ЭПС лактобациллами увеличивался до 980 мг/л.

Выделение ЭПС проводили по методике J. Cerning с соавт. (1986) в нашей модификации, которая позволила получить хроматографически чистые экзополисахариды, не содержащие клеток продуцента и пигмента.

Выделенные ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 были условно нами названы лаксаран Z, лаксаран 1936 и лаксаран 1596 соответственно.

Дальнейшие физико-химические исследования полученных ЭПС показали, что L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii В-1596 продуцируют нейтральные экзополисахариды с молекулярными массами 140, 220 и 1700 кДа соответственно. Анализ моносахаридного состава показал, что в составе всех полученных ЭПС лактобацилл имеется только глюкоза.

Несмотря на то, что в настоящее время выделено и охарактеризовано множество ЭПС, продуцируемых различными молочнокислыми бактериями, и, в частности, бактериями рода Lactobacillus, воздействие бактериальных ЭПС на организм человека и животных остается недостаточно изученными.

В процессе эксперимента было показано, что при внутрибрюшинном введении лаксарана Z через 1 час концентрация ИЛ-1а в сыворотке крови достоверно увеличивалась по сравнению с исходным значением в 3 раза (с 35,9 пкг/мл до 93,4 пкг/мл), а через 6 часов содержание ИЛ-1а было на уровне контроля. Действие лаксарана 1936, напротив, сопровождалось увеличением уровня ИЛ-1а в сыворотке крови спустя 1 и 6 часов в 1,5 и 3 раза соответственно по сравнению с контрольной группой животных. Введение лаксарана 1596 сопровождалось аналогичными изменениями содержания ИЛ-la, как и при воздействии лаксарана Z на организм экспериментальных животных.

Наибольшая индуцирующая активность ИЛ-la была отмечена у лаксарана 1936. Как показано на рисунке 18, при введении лаксарана 1936 содержание ИЛ-la в сыворотке крови увеличилось по сравнению с контролем в 1,5 и 3 раза (через 1 и 6 часов соответственно).

При исследовании влияния лаксарана Z на содержание ФНО-a в сыворотке крови животных в норме через 1 час после введения в организм животных концентрация ФНО-a понижалась в 1,8 раза по отношению к исходному значению, после 6 часов эксперимента содержание ФНО-a в сыворотке крови мышей было на уровне контроля. При введении животным лаксарана 1936 наблюдали уменьшение содержания ФНО-a через 1 час и через 6 часов по отношению с контролем в 1,3 и в 1,7 раз соответственно. При введении лаксарана 1596 мышам содержание ФНО-a в сыворотке крови через 1 час увеличивалось в 1,5 раза, а через 6 часов уменьшалось в 1,7 раза по сравнению с контролем (41,4 пкг/мл и 24,6 пкг/мл, соответственно).

Содержание ИФ-у в сыворотке крови у мышей, которым вводили лак-саран Z достоверно не отличался от уровня данного цитокина у контроля, а в случае с лаксараном 1936 наблюдалось уменьшение содержания ИФ-у в сыворотке крови через 1 и 6 часов. При введении лаксарана 1596 через 1 час наблюдалось достоверное увеличение этого цитокина в 1,5 раза, однако через 6 часов показатель содержания ИФ-у после введения лаксарана 1596 был на уровне контроля.

При изучении влияния лаксаранов на ИЛ-4 было показано, что при введении лаксарана Z уровень ИЛ-4 через 1 час достоверно повышался в 3 раза по отношению к контролю (с 31,4 пкг/м до 95,1 пкг/мл), а спустя 6 часов приближался к уровню контроля. При введении лаксаранов 1596 и 1936 на всем временном промежутке исследований уровень ИЛ-4 в крови исследуемых животных не отличался от контроля.

Таким образом, результаты проведенных исследований показали, что экзополисахариды, продуцируемые L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 способны оказывать влияние в сыворотке крови экспериментальных животных на уровень провосполительных цитокинов ФНО-а и ИЛ-1а. Так же было установлено, что на провоспалительный цитокин ИФ-у и противоспалитель-ный цитокин ИЛ-4 лаксараны существенного действия не оказывают.

Было показано, что введение лаксарана Z через 1 час после заражения мышей не изменяет достоверно содержание ИЛ-1а в сыворотке крови по сравнению с контролем 2 (содержанием цитокина в сыворотке крови зараженных мышей), а через 6 часов повышается до значений концентрации этого цитокина в сыворотке крови здоровых животных (контроль 1), тогда как у зараженных мышей его содержание достоверно увеличивалось в 2,7 раза по отношению к контролю 1. Отмечено аналогичное действие лаксарана 1936 на изменения содержания ИЛ-1а в сыворотке крови мышей при стафилококковой инфекции. При введении лаксарана 1596 мышам через 1 час после инфицирования стафилококком достоверных изменений концентрации ИЛ-1а на протяжении всего периода не происходило по сравнению с содержанием этого цитокина в сыворотке крови зараженных мышей (контроль 2).

Содержание ФНО-а в сыворотке крови зараженных мышей через 1 и 6 часов после воздействия лаксарана Z достоверно не отличалось от контрольных значений (для интактных животных и инфицированных стафилококком).

При оценке действия ЭПС лактобацилл на изменение содержания ИФ-у в сыворотке крови лабораторных мышей при моделировании стафилококковой инфекции была отмечена сходная ответная реакция на введение лаксарана Z и 1936: достоверное снижение уровня этого цитокина через 1 час по сравнению к контролю 2 в 1,6 и 2,7 раз соответственно. Через 6 часов концентрация данного цитокина достоверно не отличалась от контроля 2.

Таким образом, представленные исследования позволяют говорить о перспективе применения ЭПС L. delbrueckii ssp. bulgaricus, L. delbrueckii B-1936 и L. delbrueckii subsp. delbrueckii B-1596 в качестве профилактических иммуномодулирующих препаратов и для коррекции цитокинового статуса при некоторых инфекционных заболеваниях. Полученные результаты вносят существенный вклад в представление о функциональной значимости ЭПС молочнокислых бактерий в организме животных.

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Полукаров, Евгений Викторович, Саратов

1. Анализ влияния факторов персистенции S. aureus на продукцию цитокинов лейкоцитами периферической крови условно-здоровых лиц / П.П. Городечный и др. // Медицинская иммунология. 2006. - Т. 8, № 2-3. -С. 259-260.

2. Варбанец, Л.Д. Методы исследования эндотоксинов / Л.Д. Варбанец, Г.М. Здоровенко, Ю.А. Книрель // Киев: Наукова Думка. 2006. - 234с.

3. Волова, Т.Г. Биотехнология / Т.Г. Волова // Издательство СО РАН Новосибирск. 1995. - 254с.

4. Воробьев, В.Я. Теория и эксперимент / В .Я. Воробьев, А.И. Елсуков // Минск: Выща шк. 1989. - 109с.

5. Блинов, Н.П. Основы биотехнологии. Для студентов институтов; аспирантов и практических работников / Н.П. Блинов // СПб.: Наука. — 1995. -600с.

6. Блинов, Н.П. Химия микробных полисахаридов / Н.П. Блинов // М.: Высш. шк. 1984. - 254с.

7. Зайчик, А.Ш. Основы общей патологии / А.Ш. Зайчик, Л.П. Чурилов // СПб.: Элби. 2001.-624с.

8. Исследование индукции фактора некроза опухоли и интерлейкина-1 под воздействием гликополимеров, выделенных из Pseudomonas solanacea-гит и Clavibacter micheganense И Л.Д. Варбанец и др. / Микробиологический журнал. 1990. - Т. 52, № 5. - С. 17 - 23.

9. Кондратьева, И.А. Практикум по иммунологии: Учебное пособие / И.А. Кондратьева, И.В. Воробьева, О.В. Буракова // М.: МГУ. 2001. - 224с.

10. Коршунов, В.М. Микроэкология влагалища. Коррекция микрофлоры при вагинальных дисбактериозах / В.М. Коршунов, Н.Н. Володин, Б.А. Ефимов // Учебное пособие. М. 1999. - 79с.

11. Наумов, Д.Г. Молекулярный и генетический анализ некоторых семейств гликозил гидролаз микроорганизмов / Д.Г. Наумов // Автореферат канд. дис. . — Москва. - 2001. - 23с.

12. Определитель бактерий Берджи / Д. Хоулт и др. // М.: Мир. 1997. -Т. 2. - С. 574 - 577.

13. Остерман, Л. А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л. А. Ос-терман // М.: Наука. 1985. - 536с.

14. Рабек, Я. Экспериментальные методы в химии полимеров / Под ред. В.В. Коршака М.: Мир. - 1983. - 253с.

15. Рябинченко, Е.В. Молекулярные аспекты повреждающего действия бактериальных липополисахаридов / Е.В. Рябинченко, Л.Г. Веткова, В.М. Бондаренко // Журнал эпидемиологии, микробиологии и иммунологии. 2003, № 3. - С. 98 - 105.

16. Сравнительная оценка монокинсинтезирующий активности липополисахаридов Yersinia pestis и Escherichia coli / Г.И. Васильева и др. // Иммунология. 2000, № 6. - С. 27 - 29.

17. Уровень цитокинов плазмы крови при стафилококковой инфекции / Н.А. Курлович и др. // Медицинская иммунология. 2006. - Т. 8, № 2-З.-С. 276.

18. Фармакология некрахмальных полисахаридов / Ю.С. Хотимченко и др. // Вестник ДВО РАН. 2005. - № 1. - С. 72 - 82.

19. Фрейдлин, И.С. Клетки иммунной системы I II / И.С. Фрейдлин, А.А. Тотолян // СПб.: Наука. - 2000. - 231с.

20. Химия углеводов / Н.К. Кочетков и др. // М.: Химия. 1967. - 672с.

21. Alejandro Petroni, A. Isolation and Nucleotide Sequence of the GDP-Mannose: Cellobiosyl-Diphosphopolyprenol a-Mannosyltransferase Gene from Acetobacter xylinum / A. Alejandro Petroni, L. Ielpi // J.of Bacteriology. 1996. -Vol. 178, N. 16.-P. 4814-4821.

22. Amrouche, T. Contribution a l'etude du pouvoir immunomodulate des bifi-dobacteries: analise in vitro et etude ex vivo des mecanismes moleculaires impliques / T. Amrouche // Philosophie doctor. . -2005. 181p.

23. Antitumoral activity of slime-forming encapsulated Lactococcus lactis subsp. cremoris isolated from Scandinavian ropy sour milk, "viili" / H. Kitazawa et al. // Anim. Sci. Technol. 1991. - Vol. 62. - P. 277 - 283.

24. Anti-ulcer effects of lactic acid bacteria and their cell wall polysaccharides / M. Nagaoka et al.//Biol. Pharm. Bull. 1994.-Vol. 17.-P. 1012-1017.

25. Augmentation of macrophage functions by an extracellular phosphopoly-saccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. Bulgaricus / H. Kitazawa et al. // Food Microbiology. 2000. - Vol. 17. - P. 109 - 118.

26. Bergmaier, B. Exopolysaccharide production during batch cultures with free and immobilized Lactobacillus rhamnosus RW- 9595M // B. Bergmaier, C.P. Champagne, C. Lacroix / Jour, of Appl. Microbiol. 2003. - Vol. 95. -№5.-P. 1049-1057.

27. Bouzar F. Exopolysaccharide production and texture-promoting abilities of mixed-strain starter cultures in yoghurt production / F. Bouzar, J. Cerning, M. Desmazeaud // J. Dairy Sci. 1997. - Vol. 80. - P. 2310 - 2317.

28. Boyd, A. Pseudomonas aeruginosa biofilms: role of the alginate exopolysaccharide / A. Boyd and A.M. Chakrabarty // J. Ind. Microbiol. 1995. - Vol. 15.-P. 162- 168.

29. Bradford, M.A. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding / M.A. Bradford // Anal. Biochem. 1976. - Vol. 72, N. 1. - P. 248 - 254.

30. Budd, P. M. Preliminary ultracentrifuge studies of the polyelectrolyte behaviour of Welan gum / P.M. Budd // Progr. Colloid. Polym. Sci. 1995. - Vol. 99.-P. 39-44.

31. Callaghan, T. High rates of in vitro synthesis of 1,4-D-glucan in cell-free preparations from Phaseolus aureus / T. Callaghan, M. Benziman // Nature. 1984.-Vol. 311.-P. 165- 167.

32. Carbohydrate polymers as wound management aids / L. Lloyd et al. // Car-bohydr. Polym. 1998. - Vol. 37. - P. 315 - 322.

33. Carbon source requirements for exopolysaccharide production by Lactobacillus casei CG11 and partial structure analysis of the polymer / J. Cerning, et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1994. - Vol. 60. - P. 3914 -3919.

34. Cerning, J. Exocellular polysaccaride produced by lactic acid bacteria / J. Cerning // Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 87. - P. 113 - 130.

35. Cerning, J. Exocellular polysaccharide production by Streptococcus thermophilus / J. Cerning, C. Bouillanne, M.J. Desmazeaud // Biotechnol. Lett. -1988. Vol. 10. - P. 255 - 260.

36. Cerning, J. Isolation and characterization of exocellular polysaccharide produced by Lactobacillus bulgaricus / J. Cerning, C. Bouillanne, M.J. Des-mazeaud // Biotechnol. Lett. 1986. - Vol. 8. - P. 625 - 628.

37. Cerning, J. Polysaccharides exocellulaires produits par les bacteries lac-tiques / J. Cerning, I.H. Roissart, F.M. Luquet // Bacteries Lactiques, Grenoble, France. 1994. - P. 309 - 329.

38. Champagne, C.P. Fermentation technologies for the production of exopoly-saccharide synthesizing Lactobacillus rhamnosus concentrated cultures / C.P. Champagne, N.J. Gardner, C. Lacroix // Journal of Biotechnology. 2007. -Vol. 10, N. 2.-P. 211 -220.

39. Characterization of a water-soluble polysaccharide fraction with im-munopotentiating activity from Bifidobacterium adolescentis Ml 01-4/ J. L. Hosono et al. // Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 1997. - Vol. 61.-P. 312-316.

40. Cholesterol lowering activity of ropy fermented milk / H. Nakajima et al. // J. Food Sci. 1992. - Vol. 57. - P. 1327- 1329.

41. Clinical evaluation of Sizofiran an assistant immunotherapy in treatment of head and neck cancer / Y. Kimura et al. // Acta Otolargynzol. 1994. -Vol. 511.-P. 192-195.

42. Colorimetris method for determination of sugars and related substances / M. Dubois et al. // Anal. Chem. 1956. - Vol. 28. - № 3. - P. 350 - 356.

43. Comparison of exocellular polysaccharide production by thermophilic lactic acid bacteria // J. Cerning et al. // Sci. Aliments. 1990. - Vol. 10. - P. 443 -451.

44. Crescenzi, V. Microbial polysaccharides of applied interest: ongoing research activities in Europe / V. Crescenzi // Biotechnol. Prog. 1995. - Vol. 11. - P. 251 -259.

45. De Baets, S. Extracellular Tremella polysaccharide: structure, properties and applications / S. De Baets, E. Vandamme // Biotechnol. Lett. 2001. -Vol. 23.-P. 1361 - 1366.

46. De Vuyst, L. Heteropolysaccharides from lactic acid bacteria / L. De Vuyst, B. Degeest // FEMS Microbiol Rev. 1999. - Vol. 23. - P. 153 - 177.

47. Degeest, B. Microbial physiology, fermentation kinetics and process engineering of heteropolysaccharides production by lactic acid bacteria / B. Degeest, F. Vaningelgem, L. de Vuyst // Int. Dairy J. 2001. - Vol. 11.-P. 747-758.

48. Dudman, W.F. The role of surface polysaccharides in natural environments / W.F. Dudman // Academic Press, New York, USA. 1977.

49. Ebina, T. Antitumor effect of Lactobacillus bulgaricus 78R / T. Ebina, N. Ogata,. K. Murata // Biotherapy. 1995. - Vol. 9. - P. 65 - 70.

50. Effect of culture pH on the growth characteristics and polysaccharide production by Lactobacillus casei / F. Mozzi et al. // Milchwissen. -1994. Vol. 49. - P. 667 - 670.

51. Effect of medium supplementation on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus RW-9595M in whey permeate // M.G. Macedo et al. / Int. Dairy J. 2002. - Vol. 12, N. 5. - P. 419 - 426.

52. Effects of structural modifications on some physical characteristics of exopolysaccharides from Lactococcus lactis / R. Tuinier et al. // Biopoly-mers. 2001. - Vol. 59. - P. 160 - 166.

53. Effects of the oral administration of the exopolysaccharide produced by Lactobacillus kefiranofaciens on the gut mucosal immunity / G. Vinderolaa et al. // Elsevier. 2006. - Vol. 36. - P. 254 - 260.

54. End point result of a randomized controlled study of the treatment of gastrointestinal cancer with a combination of lentinan and chemotherapeutic agents / T. Taguchi et al. //ExcerptMedica. 1984.-P. 151 - 165.

55. Enhancement of exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus NCFB 2772 with a simplified defined medium / G.J. Grob-ben, et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64. - P. 1333 - 1337.

56. Exopolysaccharide from Lactobacillus rhamnosus RW-9595M stimulate TNF, IL-6 and IL-12 in human and mouse cultured inmunocompetent cells, and IFN-g in mouse splenocytes / S. Chabot et al. // Lait. 2001. -Vol. 81.-P. 683-697.

57. Exopolysaccharide production by Bifidobacterium lortgum BB-79 / C.M. Roberts et al. // J. Appl. Bacteriol. 1995. - Vol. 78. - P. 463 - 468.

58. Exopolysaccharide production by Lactobacillus casei under controlled pH / F. Mozzi et al. // Biotechnol. Lett. 1996. - Vol. 10. - P. 435 - 439.

59. Exopolysaccharide production by Lactobacillus casei. I. Influence of salts / F. Mozzi et al. // Milchwissen. 1995. - Vol. 50. - P. 186 - 188.

60. Exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis: from genetic engineering to improved rheological properties? / M. Kleerebezem et al. // Antonie van Leeuwenhoek. 1999. - Vol. 76. - P. 357 - 365.

61. Factors affecting exocellular polysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus grown in a chemically defined medium / S. Petry et al. // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 3427 -3431.

62. Flemming, H.C. Relevance of microbial extracellular polymeric substances (EPS) part I: structural and ecological aspects / H.C. Flemming, J. Wingen-der // Water Science and Technology. - 2001. - Vol. 43, N. 6. - P. 1 - 8.

63. Fractionation and purification of polysaccharides with marked antitumour activity, especially Lentinan from Lentinus edodes (Bark) sing, an edible mushroom / G. Chihara et al. // Cancer Res. 1970. - Vol. 30. - P. 2776 - 2781.

64. Functional alteration of murine macrophages stimulated with extracellular polysaccharides from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1Q73R1 / J. Nishimura-Uemura et al. 11 Food Microbiology. 2003. - Vol. 20. -P. 267-273.

65. Gamar-Nourani, L. Influence of culture conditions on exopolysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus strain C83 / L. Gamar-Nourani, K. Blondeau, J.-M. Simonet // J. Appl. Microbiol. 1998. - Vol. 85. - P. 664 -672.

66. Gamar-Nourani, L. Physiological approach to extracellular polysaccharide production by Lactobacillus rhamnosus strain C83 / L. Gamar-Nourani, K. Blondeau, J.-M. Simonet // J. Appl. Microbiol. 1997. - Vol. 83. - P. 281 -287.

67. Gamma scintigraphic comparison of eye drops containing pilocarpine in healthy volunteers / G. Meseguer et al. // J. Ocul. Pharmacol. Ther. 1996. Vol. 12.-P. 481 -488.

68. Gancel, F. Exopolysaccharide production by Streptococcus salivarius ssp. thermophilus cultures. 1. Conditions of production / F. Gancel, G. Novel // J. Dairy Sci. 1994. - Vol. 77. - P. 685 - 688.

69. Garcia-Garibay, M. Polymer production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus / M. Garcia-Garibay, V.M.E. Marshall // J. Appl. Bacterid. -1991. Vol. 70. - P. 325 - 328.

70. Gassem, M.A. Exopolysaccaride production from whey lactose by fermentation with Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus / M.A. Gassem, K.A. Schmidt, J.F. Frank // J. Food Sci. 1997. - Vol. 62. - P. 171 - 174.

71. Gassem, M.A. Exopolysaccharide production in different media by lactic acid bacteria // M.A. Gassem, K.A. Schmidt, J.F. Frank / Cultured Dairy Products Journal. 1995.-Vol. 30.-P. 18-21.

72. Gassem, M.A. Extracellular polysaccaride production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR in a continuous fermentor / M.A. Gassem, K.A. Sims, J.F. Frank // Lebensm. Wiss. Technol. 1997. - Vol. 30. - P. 273 -278.

73. Genetics and engineering of microbial exopolysaccharides for food: Approaches for the production of existing and novel polysaccharides / R. van Kranenburg et al. // Curr. Opin. Biotechnol. 1999. - Vol. 10. - P. 498 -504.

74. Gibson, G.R. Dietary modulation of the human colonic microbiota: Introducing the concept of prebiotics / G.R. Gibson, M.B. Roberfroid // J. Nutr. -1995. Vol. 124. - P. 140 - 1412.

75. Homopolysaccharides from lactic acid bacteria / P. Monsan et al. // Int. Dairy J. 2001. - Vol. 11. - P. 675 - 685.

76. Immunomodulatory Effects of Polysaccharides Produced by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus OLL1073R-1 / S. Makino et al. // J. Dairy Sci. — 2006. Vol. 89. - P. 2873 -2881.

77. In vitro study of prebiotic properties of levan-type exopolysaccharides from lactobacilli and non-digestible carbohydrates using denaturing gradient gel electrophoresis / F. D. Dal Bello et al. // Syst. Appl. Microbiol. 2001. -Vol. 24.-P. 232-237.

78. Induction of IFN-gamma and IL-1 alpha production in macrophages stimulates with phosphopolysaccharide produced by Lactococcus lactis ssp. cre-moris / H. Kitazawa et al. // Int. J. Food Microbiol. 1996. - Vol. 31. - P. 99-106.

79. Influences on the formation and structure of fibrin / G. Carlin et al. // Thromb. Res. 1976. - Vol. 9. - P. 623 - 636.

80. Internalization of Staphylococcus aureus by endothelial cells induces cytokine gene expression / L. Yao et al. 11 Infect. Immun. 1995. - Vol. 63, N. 5.-P. 1835- 1839.

81. Isolation and characterization of exocellular polysaccharides produced by Bifidobacterium longum / S. Abbad-Andaloussi et al. // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1995. - Vol. 43. - P. 995 - 1000.

82. Isolation and characterization of exopolysaccharides from slime-forming mesophilic lactic acid bacteria / J. Cerning et al. // J. Dairy Sci. 1992. -Vol. 75.-P. 692-699.

83. Isolationand characterization of exocellular polysaccharide produced by Lactobacillus bulgaricus / J. Cerning et al. // Biotechnology Letters. -1986. Vol. 8, N. 9. - P. 625 - 628.

84. Kimmel, S.A. Development of a growth medium suitable for exopolysaccharide production by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus RR / S.A. Kimmel, R.F. Roberts / Int. J. Food Microbiol. 1998. - Vol. 40. - P. 87 -92.

85. Lactobacillus therapy for acute infectious diarrhea in children: a metaanalysis / C. W. Van Niel et al. // Pediatrics. 2005. - Vol. 109. - P. 678 -684.

86. Laws, A. Biosynthesis, characterization, and design of bacterial exopolysac-charides from lactic acid bacteria / A. Laws, Y. Gu, V. Marshall // Biotech-nol. Adv. 2001. - Vol. 19. - P. 597 - 625.

87. Leibovich, S.J. Promotion of wound repair in mice by application of glucan / S.J. Leibovich, D. Danon // J. Reticuloendothel Soc. 1980. - Vol. 1. - P. 1 - 11.

88. Lipoteichoic acids from Lactobacillus strains elicit strong tumor necrosis factor alpha-inducing activities in macrophages through Toll-like receptor 2 / T. Matsubuchi et al. // Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003. - Vol. 10. - P. 259-266.

89. Ljungh, A. Lactic acid bacteria as probiotics / A. Ljungh and T. Wadstro // Curr. Issues. Intest. Microbiol. 2006. - Vol. 7. - P. 73 - 89.

90. Looijesteijn, P.J. Uncoupling of growth and exopolysaccharide production by Lactococcus lactis subsp. cremoris NIZO B40 and optimization of its synthesis / P.J. Looijesteijn, J. Hugenholtz // J. Biosci. Bioengin. 1999. - Vol. 88. -P. 178- 182.

91. Maede, Y.Y. The nature of immunopotentiation by the antitumor polysaccharide Lentinan and the significance of biogenic amines in its action / Y.Y. Maede, J. Hamuro, G. Chihara // Int. J. Cancer. 1974. - Vol. 12. - P. 259-281.

92. Marshall, V.M. Analysis and production of two exopolysaccharides from Lactococcus lactis subsp. cremoris LC330 / V.M. Marshall, E.N. Cowie, R.S. Moreton // J. Dairy Res. 1995. - Vol. 62. - P. 621 - 628.

93. Naidu, A.S. Probiotic spectra of lactic acid bacteria (LAB) / A.S. Naidu, W.R. Bidlack and R.A. Clemens // Crit. Rev. Food Sci. Nutr. 1999. - Vol. 39. -P. 113-126.

94. Observation of the Helical Structure of the Bacterial Polysaccharide Acetan by Atomic Force Microscopy / R. Andrew Kirby et al. // Biophysical Journal. 1995. - Vol. 68. - P. 360-363.

95. Pham, P.L. Production of exopolysaccharides by Lactobacillus rhamnosus R: Effect of oxygen tension / P.L. Pham, D. Roy // Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 2302 - 2310.

96. Phosphate group requirement for mitogenic activation of lymphocytes by an extracellular phosphopolysaccharide from Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus / H. Kitazawa et al. // Int. J. Food Microbiol. 1998. - Vol. 40. -P. 169-175.

97. Physicochemical characterization of carboxymethyl A lipid A derivatives in relation to biological activity / U. Seydel et al. // FEBS Jornal. 2005. -Vol. 272.-P. 327-340.

98. Physiological function of exopolysaccharides produced by Lactococcus lactis / P.J. Looijesteijn et al. // Int. J. Food Microbiol. 2001. - Vol. 64. - P. 71 -80.

99. Pigeon, R.M. Binding of free bile acids by cells of yogurt starter culture bacteria / R.M. Pigeon, E.P. Cuesta, S.E. Gilliland // J. Dairy Sci. 2002. - Vol. 85.-P. 2705-2710.

100. Pirog, Т. P. Improvement of biotechnology of microbial exopolysaccharide ethapolan on ethanol / T.P. Pirog, Ju.V. Korzh // Biotechnology. 2008. — Vol. 3, N. 3. — P. 47-55.

101. Prevention of chronic gastritis by fermented milks made with exopolysaccharide producing Streptococcus thermophilus strains / C. Rodriguez et al. I I J. Dairy Sci. - 2009. - Vol. 92. - P. 2423 - 2434.

102. Production by and isolation of exopolysaccharides from Streptococcus thermophilus grown in a milk medium and evidence for their growth-associated biosynthesis / De Vuyst et al. // J. Appl. Microbiol. 1998. - Vol. 84. - P. 1059- 1068.

103. Production of a novel extracellular polysaccharide by Lactobacillus sake O-l and characterization of the polysaccharide / D.J.C. van den Berg et al. // Appl. Environ. Microbiol. 1995. - Vol. 61. - P. 2840-2844.

104. Production of exopolysaccharide by Lactobacillus rhamnosus R and analysis of its enzymatic degradation during prolonged fermentation / P.L. Pham et al. //Appl. Environ. Microbiol. 2000. - Vol. 66. - P. 2302 - 2310.

105. Production of extracellular polysaccharides by Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus NCFB 2772 grown in a chemically defined medium / G.J. Grob-ben et al. // J. Appl. Bacteriol. 1995. - Vol. 79. - P. 103 - 107.

106. Purication and Characterization of a Novel Polysaccharide Involved in the Pellicle Produced by a Thermotolerant Acetobacter Strain / S. Moonmang-mee, et al. // Biosci. Biotechnol. Biochem. 2002. - Vol. 66, N. 4. - P. 777 -783.

107. Recent developments in the biosynthesis and applications of heteropolysac-charides from lactic acid bacteria / De Vuyst et al. // Int. Dairy J. 2001. -Vol. 11.-P. 687-708.

108. Rheological evaluation of Gelrite in situ gels for ophthalmic use / J. Carlfors et al. // Eur. J. Pharm. Sci. 1998. Vol. - P. 113 - 119.

109. Ricciardi, A. Exopolysaccharides from lactic acid bacteria: Structure, production and technological applications / A. Ricciardi, F. Clementi // Ital. J. Food Sci. 2000. - Vol. 12. - P. 22 - 45.

110. Ruas-Madiedo, P. An overview of the functionality of exopolysaccharides produced by lactic acid bacteria / P. Ruas-Madiedo, J. Hugenholtz, P. Zoon // Int. Dairy J.-2002.-Vol. 12.-P. 163-171.

111. Ruas-Madiedo, P. Invited Review: Methods for the Screening, Isolation, and Characterization of Exopolysaccharides Produced by Lactic Acid Bacteria / P. Ruas-Madiedo, C.G. de los Reyes-Gavilan // J. Dairy Sci. 2005. - Vol. 88.-P. 843-856.

112. Ruijssenaars, H.J. Biodegradability of food-associated extracellular polysaccharides / H.J. Ruijssenaars, F. Stingele, S. Hartmans // Current Microbiology. 2000. - Vol. 40. - P. 194 - 199.

113. Sandford, P.A. Microbial polysaccharides: new products and their commercial application / Paul A. Sandford, Jan W. Cottrell, David J. Pettitt // Pure & Appl. Chem. 1984. - Vol. 56, N. 7. - P. 879 - 892.

114. Screening and characterization of Lactobacillus strains producing large amounts of exopolysaccharides / G. H. van Geel-Schutten et al. // Appl. Microbiol Biotechnol. 1998. - Vol. 50. - P. 697 - 703.

115. Sebastiani, H. Texture formation by thermophilic lactic acid bacteria / H. Se-bastiani, G. Zelger // Milchwissen. 1998. - Vol. 53. - P. 15 - 20.

116. Shapes and interaction of carbohydrate chains / D.A. Rees et al. // Polysaccharides. New York; London: Acad. Press. 1982. - Vol. 1. - P. 196 - 281.

117. Sikkema, J. Extracellular polysaccharides of lactic acid bacteria / J. Sikkema, T. Oba // Snow Brand R&D Reports. 1998. - Vol. 107. - P. 1 - 31.

118. Stacey, M. Polysaccharides of microorganisms / M. Stacey, S.A. Barker // London: Oxford Univ. press. 1960. - 312p.

119. Stimulation of TNF-a Release by Fungal Cell Wall Polysaccharides / J. Ma-jtana et al. // Z. Naturforsch. 2005. - P. 921 - 926.

120. Sucrose metabolism and exopolysaccharide production in wheat and rye sourdoughs by Lactobacillus sanfranciscensis / M. Korakli et al. // J. Agr. Food Chem. -2001.- Vol. 49. P. 5194 - 5200.

121. Sutherland, I. W. Microbial exopolysaccharides structural subtleties and their consequences / I.W. Sutherland // Pure Appl. Chem. - 1997. - Vol. 69. -P. 1911-1917.

122. Sutherland, I.W. Bacterial exopolysaccharides dans. / I.W. Sutherland // Advances in Microbial Physiology. Academic Press, New York, NY, USA. — 1972.

123. Sutherland, I.W. Biosynthesis of microbial exopolysaccharides / I.W. Sutherland // Adv. Microbial. Physiol. 1982. - Vol. 23. - P. 79 - 150.

124. Sutherland, I.W. Biotechnology of microbial exopolysaccarides / I.W. Sutherland // Cambridge University Press. 1990. - 163p.

125. Sutherland, I.W. Industrially useful microbial polysaccharides / I.W. Sutherland // Microbiol. Sci. 1986. - Vol. 3, N. 1. - P. 5 - 9.

126. Sutherland, I.W. Novel and established applications of microbial polysaccharides / I.W. Sutherland // Trends Biotechnol. 1998. - Vol. 16. - P. 41 - 46.

127. Svensson, I.A. Staphylococcal enterotoxin A, D and E structure and Function including mechanism of T-cell superantigenicity / I.A. Svensson, E.M. Se-had, M. Sundstrrom // Preparative Biochemistry, Biotechnology. 1997. -Vol. 27. - P. 111-114.

128. T-cells activated by zwitterionic molecules prevent abscesses induced by pathogenic bacteria / A.O. Tzianabos et al. // Journal of Biological Chemistry. 2000. - Vol. 275. - P. 6733.

129. Thapa, D. Antimutagenic property of exopolysaccharide-producing lactic acid bacteria / D. Thapa, Z. Hao // International probiotic conference. 2008.

130. The intercellular adhesin involved in biofilm accumulation of Staphylococcus epidermidis is a linear 3-1,6-linked glucosaminoglycan: purification and structural analysis / D. Mack [et al. I I J. Bacteriol. 1996. - Vol. 178. - P. 175- 183.

131. Thirumavalavan, K. Pullulan production from coconut by-products by Aureobasidium pullulans / K. Thirumavalavan, T.R. Manikkadan, R. Dha-nasekar I I African Journal of Biotechnology. 2009. - Vol. 8, N. 2. - P. 254 -258.

132. Tzianabos, A. Biological chemistry of immunomodulation by zwitterionic polysaccharides / A. Tzianabos, J.Y. Wang,. D. Kasper // Carbohydrate Research. 2003. - Vol. 338. - P. 2531 - 2538.

133. Valyasevi, R Lactococcus lactis subsp. lactis C2 bacteriophage ski involves rhamnose and glucose moieties in the cell wall / R. Valyasevi, W.E. Sandine, B.L. Geller // J. Dairy Sci. 1994. - Vol. 77. - P. 1 - 6.

134. Vandamme, E. The search for novel microbial fine chemicals, agrochemi-cals and biopharmaceuticals / E.J. Vandamme // J. Biotechnol. 1994. -Vol. 37.-P. 89- 108.

135. Wasser, S.P. Therapeutic effects of substances occurring in higher asidiomy-cetes mushrooms, a modern perspective (review) / S.P. Wasser, A. Weis // Crit. Rev. Immunol. 1999. - Vol. 19. - P. 65 - 96.

136. Welman, A.D. Screening and selection of exopolysaccharide-producing strains of Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus / A.D. Welman, I. S. Maddox, R. H. Archer // J. Appl. Microbiol. 2003. - Vol. 95. - P. 1200-1206.

137. Xanthan gum: production, recovery and properties / F. Garcia-Ochoa et al. // Biotechnology Advances. 2000. - Vol. 18. - P. 549 - 579.

138. Zhang, X. Q. Measurement of polysaccharides and proteins in biofilm extracellular polymers / X. Zhang, P.L. Bishop, M.J. Kupferle // Water Sci Technol. 1998. - Vol. 37. - P. 345 - 348.

139. Zwitterionic polysaccharides stimulate T cells by MHC class Independent interactions / W.M. Kalka-Moll et al. // Journal of Immunology. -2002.-Vol. 169.-P. 6149-6153.

Информация о работе

Полукаров, Евгений Викторович
кандидата биологических наук
Саратов, 2009
ВАК 03.00.07

Диссертация

Экзополисахариды молочнокислых бактерий и их функциональная значимость в организме животных - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы