Бесплатный автореферат и диссертация по географии на тему

Экспрессное определение ионов металлов в водных объектах окружающей среды

ВАК РФ 11.00.11, Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

Автореферат диссертации по теме "Экспрессное определение ионов металлов в водных объектах окружающей среды"

Г.

1 А !.'!л г: опт

I 1 г!А,'П

На правах рукописи

КОЩУГ ВАНДА АНАТОЛЬЕВНА

ЭКСПРЕССНОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ИОНОВ МЕТАЛЛОВ В ВОДНЫХ ОБЪЕКТАХ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

11.00.11 - Охрана окружающей среды и рациональное использование природных ресурсов

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата.химических наук

Москва - 1597

Работа выполнена в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева.

Научные руководители: доктор химических наук,

профессор Лейкин Ю.А.; кандидат химических наук, вед.н.с. Черкасова Т.А.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Градова Н.Б.; доктор химических наук, профессор Петров С.И.

Ведущая организация: Московский Государственный

Университет им. М.В.Ломоносова

Зашита диссертации состоится ¿¿гО'оЛ. 1997 г.

в 10 о0 час. в ауд.ла^^гглна заседании диссертационного совета Д 053.34.11 в Российском химико-технологическом университете им. Д.И. Менделеева (125047, Москва, А-47, Миусская пл., 9).

С диссертацией можно ознакомиться в научно-информационном центре РХТУ им. Д. И. Менделеева.

Автореферат разослан____1997 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

и. е. камешук

АКТУАЛЬНОСТЬ РАБОТЫ

Среди растворенных веществ, присутствующих в поверхностных и подземных водах, тяжелые металлы в различных ионных формах принадлежат к категории приоритетных загрязнителей, с ярко выраженными токсичными свойствами. Тенденция повышения содержания токсичных элементов в окружающей среде представляет большую опасность для здоровья человека и состояния биосферы. Опасность усугубляется тем, что тяжелые металлы не подвергаются химической и биохимической деградации, как это свойственно органическим токсикантам.

Особенно остро встает вопрос об оценке качества источников питьевой и технической воды по критериям контроля биосферы (КБ) и общему содержанию токсичных веществ. В связи с этим требуется постоянный контроль за содержанием тяжелых металлов в различных объектах окружающей среды, в том числе и в воде. Прежде всего это нужно для получения информации о содержании металлов в анализируемых объектах; для сокращения временных, экономических, трудовых затрат, которые связаны с транспортировкой проб, их хранением и последующим анализом. Такие методы необходимы для непрерывного контроля сбрасываемых вод, для работы в полевых условиях, для работы в экстремальных ситуациях, для режимного контроля масштабной сети подземных скважин.

Поэтому разработка новых, высокочувствительных, надежных, простых и экономичных экспрессных методов определения металлов является актуальной задачей. В последние годы в качестве чувствительных элементов все шире находят применение ферменты и, особенно, иммобилизованные на твердофазной подложке. Их высокая активность и избирательность действия позволяют значительно повысить чувствительность и селективность метода анализа. В настоящее время ферментативные методы используют для определения самих ферментов или их субстратов. Известно лишь небольшое число работ, посвященных определению неорганических и органических соединений, являющихся эффекторами - активаторами или ингибиторами ферментов. Одним из наиболее доступных, устойчивых в водных растворах и выпускаемых отечественной промышленностью ферментов, является уреаза, выделенная из невсхожих семян арбуза. На НП0"Биолар" Латвии выпущена опытно-промышленная партия иммобилизованной уреазы на гранульном макропористом сополимере стирола и диви-нилбензола, обладающей высокой стабильностью при хранении. Известно, что активность уреазы подавляется ионами многих металлов и это ее свойство широко используется при разработке различных ферментных электродов. Главными эффекторами уреазы являются в основном ионы тяжелых металлов,что и явилось предметом исследования в данной работе.

ЦЕЛЬ РАБОТЫ

Основная цель диссертационной работы состояла в разработке высокочувствительного, простого для пользователя, экспрессного метода определения ионов металлов в водных объектах окружающей среды. Для достижения этой цели решались следующие задачи:

- изучение кинетики ингибирования иммобилизованной уреазы ионами тяжелых металлов: свинца (II), кадмия (II), ртути (II), меди (II) и серебра (I);

- разработка тест-систем для визуального определения суммарного содержания ионов тяжелых металлов в объектах окружающей среды;

- апробация на реальных объектах экспрессной методики первичного контроля интегральной дозы тяжелых металлов в водных объектах.

НАУЧНАЯ НОВИЗНА:

- впервые исследован процесс ингибирования уреазы, иммобилизованной на сополимере стирола и дивинилбензола, ионами тяжелых металлов и анионами; определены основные кинетические параметры, константы ингибирования ^ и механизмы ингибирования; показано, что более сильное ингибирующее действие на подавление ферментативной активности оказывают катионы;

- по основным кинетическим параметрам и Кх выявлены отличительные особенности различных ионов металлов, позволяющие определить сродство ионов металлов к иммобилизованной уреазе;

- показано, что для ионов свинца (II), кадмия (II), серебра (I) характерен конкурентный тип ингибирования,позволяющий варьировать диапазон определяемых содержаний, изменяя стандартную концентрацию субстрата, уменьшать нижние границы определяемых содержаний;

- определен новый подход для селективного определения ионов металлов в воде с использованием оптимальной концентрации субстрата;

- найденная корреляционная зависимость показателя контроля биосферы' от концентрации ионов металлов в воде позволила разработать новые тест-системы с визуальным определением ионов ртути (II),серебра (I), меди (И), свинца (II), кадмия (II) в водных растворах их солей на уровне <ПДКв.;

- найденная корреляционная зависимость степени ингибирования биотестера от суммарного показателя контроля биосферы позволила разработать новые тест-системы первичного контроля агрессивности водных объектов.

ПРАКТИЧЕСКАЯ ЗНАЧИМОСТЬ РАБОТЫ:

- разработаны способы определения приоритетных металлов с чувствительностью на уровне, а в ряде случаев значительно превышающей, известные инструментальные методы, в частности, методы атомно-абсорб-

ционной спектроскопии (ААС) с электротермической атомизацией или с плазменной ионизацией;

- показана возможность создания экспрессных тест-систем на базе иммобилизованного фермента и твердофазного рН-индикатора. Тест-системы апробированы на технологической воде для производства медпрепаратов и на вытяжках из биологического сырья на Московском эндокринном заводе; на воде родников г. Радонежа: на сети подземных скважин г.Минска.

- разработанные способы могут быть рекомендованы гидрогеологическим службам для первичного анализа суммарной агрессивности воды в режимном контроле сети подземных скважин; Аналитической инспекции Мос-комприроды; институту Водных проблем РАН; Институту океанологии РАН им. П. П. Ширшова.

АПРОБАЦИЯ РАБОТЫ И ПУБЛИКАЦИИ

Основные результаты работы доложены на международных конференции, симпозиуме и конгрессе: 5t.ii Symposium on Kinetics in Analytical Chemistry (Moscow, 1995); IX Международная конференция молодых ученых по химии и химической технологии, РХТУ им. Д.И. Менделеева,1995; International Congress on Analytical Chemistry (Moscow,1997).

По теме диссертации опубликованы тезисы трех докладов.

СТРУКТУРА И ОБЪЕМ РАБОТЫ

Диссертация состоит из введения и трех глав, содержащих литературный обзор, результаты и их обсуждение, апробацию ферментного тестирования на реальных объектах. Работа включает также экспериментальную часть, выводы, список использованных библиографических источников, насчитывающий 136 наименований, и приложение. Работа изложена на ... страницах машинописного текста, содержит ... таблиц и ... рисунков.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Оценка чувствительности уреазного биотестера при ферментативном тестировании ионов металлов.

Уреазу,иммобилизованную на гранульном макропористом сополимере стирола и дивинилбензола будем считать основным чувствительным элементом в разрабатываемом методе и в дальнейшем будем называть ее биотестером (биохимический тестер).

Использование иммобилизованной уреазы позволяет существенно увеличить чувствительность метода, благодаря эффекту сорбционного концентрирования на твердой фазе. Таким образом есть возможность использовать интегральный эффект накопления ингибитора в отличие от

систем с нативным ферментом.

Для создания эффективного экспрессного метода контроля необходимо определять ионы металлов на концентрационных уровнях ниже nDKjj р , что требует подбора оптимальных условий определения. Для более эффективного использования таких биосенсоров в системе экологического контроля необходимо изучение не только количественной связи между концентрацией эффекторов и аналитическим сигналом биосенсора, но и закономерностей кинетических процессов ферментативной реакции в присутствии тяжелых металлов.

Предварительные исследования влияния ионов металлов на иммобилизованную уреазу позволили оценить эффективность действия ионов металлов на фермент и подойти к оценке сродства фермента и ингибитора. Как показали результаты, ингибирующий эффект металлов проявлялся по-разному. Ниже приведен ряд сродства, характеризующий степень ин-гибирования фермента различными ионами металлов: Ag** >Fe+3 >Fe+2 >Cu2 + >Mg2 + >Pb2+>А13 ->Са2 + >Со2 + >Ni2 +>Cd2 + >Zn2 +.

Влияние анионов изучали по растворам солей йа+ и К+, поскольку эти катионы не оказывали ингибирующего действия на уреазу. Ряд эффективности ингибирующего действия анионов следующий: СГ04 2 " >В4 07 2 '>СГ>СН3 COO'>НС03->F~>As033 т>S042">N03">N02">1">Br".

Долю вклада катионов и анионов в ингибирование фермента определяли из соотношения степени ингибирования уреазы катионом к степени ингибирования анионом в идентичных условиях.

Показано, что начиная с концентрации катиона 10"5 моль/л в сторону ее увеличения, начинает проявляться влияние аниона, главным образом нитрата и сульфата, что связано с закислением среды, влияющим на активность фермента. Сульфат-анионы в отличие от хлорид-ионов заметнее усиливают ингибирование фермента, но в целом долевое влияние аниона в области малых концентраций (<1СГ4 моль/л) проявлялось незначительно. Дальнейшие исследования были направлены на изучение влияния ионов металлов при исключении влияния Н+ и ОН" ионов за счет бу-ферирования системы.

Для более глубокой оценки сродства исследуемого иона металла к ферменту, представляло интерес исследовать ферментативную реакцию в присутствии ионов металлов и по основным кинетическим параметрам и константе ингибирования выявить отличительные особенности различных ионов металлов, выявить возможности избирательного действия ионов металлов определенной концентрации на уреазу, иммобилизованную на твердофазной подложке.

Перед проведением основных кинетических исследований была установлена линейная зависимость между скоростью реакции и концентрацией

фермента. При изучении ингибирования уреазы ионами металлов необходимо определить тип ингибирования и в зависимости от этого подобрать оптимальные условия определения ингибиторов (в данном случае ионов металлов)-. Анализируя константы ингибирования Kt можно оценить сродство металла к уреазе (сродство обратно пропорционально Kt). Зависимости обратных величин начальных скоростей (1/tf) от обратных величин концентраций субстрата (1/[S]) в присутствии и в отсутствии ингибиторов дают информацию о типе ингибирования. Учитывая характер ингибирования, можно изменять стандартную концентрацию субстрата, добиться дальнейшего снижения нижних границ определяемых содержаний токсикантов.

Основные исследования проводили на иммобилизованной уреазе с суммарной активностью в твердой фазе 0,7 + 1,1 Е. Концентрацию мочевины варьировали в интервале 0,1 + 1,8 мг/мл, рН=7,4, при температуре 37 0С. Ферментативную активность определяли на титрационной установке фирмы "Radiometer" (Дания) в режиме рН-статирования. В качестве эффекторов уреазы были рассмотрены ионы: Cu2 + , Hg2+, Pbz+, Cd2+, kg*. Диапазон содержаний ионов металлов в специально очищенной воде составлял 10"2 * 10"12 моль/л, исходя из расчета, что величина ПВКЕ исследуемых металлов находится на уровне 10"5 + 10"8 моль/л.

Иммобилизованную уреазу помещали в растворы солей различных металлов, выдерживали 10 мин., отделяли уреазу и помещали ее в реакционную среду (К+-фосфатный буфер и мочевина). Скорость гидролиза мочевины определяли на титрационной установке.

На рис.1 приведены зависимости fl=f[S] и на рис.2 зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации мочевины в координатах Лайнуивера-Бэрка для исходной и ингибированной ионами серебра уреазы. В практике расчета основных кинетических параметров ферментативных процессов используют уравнения Михаэлиса-Ментен и Лайнуивера-Бэрка:

V 1 К„ 1 1

9 --------- ; — = — х — + — , где

1 + KM/S -3 V S V

д - скорость реакции при концентрации субстрата равной S; V - максимальная скорость реакции;

Км - константа Михаэлиса рассматриваемого фермента для данного

субстрата.

В координатах Лайнуивера-Бэрка прямая, пересекающая ось абсцисс в точке - 1/Км , ось ординат в точке 1/V и имеет наклон KM/V дает достаточно точное определение величин К„ и У. Kt рассчитывали по зави-

Рис.. ^ Зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации мочевины в присутствии ионов серебра (I):

1- для исходной, не ингибированной уреазы;

2- для уреазы, ингабированной 10~5М Ag+;

3- 10"7М 4- Ю-10М Ае+; 5- 10"12М

Рис ¿> Зависимости скорости ферментативной реакции от концентрации мочевины в координатах Лайнуивера-Бэрка:

1- для не ингибированной уреазы;

2- для уреазы, ингибированной ионами А^ с концентрацией 10*5М;

3- 10^7М; 4- Ю"10М; 5- 10"12М.

симостям 1А' ~ [1пЬ.] или Кц/У ~ ЦпЬ. ] в зависимости от механизма ингибирования, причем = - [1Ш. ].

Рассчитанные по Лайнуиверу-Бэрку величины констант Михаэлиса и максимальные скорости реакции приведены в таблице 1.

Таблица 1

Кинетические параметры реакции гидролиза мочевины для уреазы, ингибированной ионами серебра (I).

1 ¡Концентрация ионов серебра i 1 i 1 i

1 в воде: V [S] о п тим . 1 V |

1 i х 103 I 1

I мг/л | i i моль/л моль/л мг/л |дМоль/мин. | 1 I

1 1 I 0,0000001 | Ю-12 6,8 2,46 I 1 1 7,53 |

1 0, 00001 I 10-Ю 6,9 2,41 1 7,49 |

I 0, 0001 I 10'9 7,2 2, 32 1 7,53 |

1 0,001 *** | 10'8 8,3 2, 02 1 7,36 |

1 0,01 *• | 10~7 10,0 1, G6 1 7,41 |

1 0,1 | 10~б 10,8 1,54 1 7,30 i

1 1,0 I 1 1 10"5 12,3 1, 35 1 7,31 | i i

f Не ингибированная уреаза i * 4,5 i 3,75 1 1 1 * 7,42 | i i

* - Км и V для не ингибированной уреазы.

** уровень ППКа (nDKB = О,05мг/л ) "'уровень П0Кв.р (ПОК8 .р .= 0, 005мг/л ) Км' = 0,018 + 0,001 LgtAg4"]; RKOpp.=0-99 Для диапазона концентраций: Ю-5 + 10"10 моль/л.

Тип зависимостей на приведенных графиках характерен для механизма конкурентного ингибирования. С увеличением концентрации ионов серсбра в исследуемом растворе К„'увеличивается и Км < К,/ при всех содержаниях ионов Ag+ в растворе. Для конкурентного ингибирования степень ингибирования зависит от относительных количеств ингибитора и субстрата. Если при постоянной концентрации ингибитора ввести в систему достаточное количество субстрата, то можно вытеснить весь ингибитор из комплекса с ферментом в результате образования фермент-субстратного комплекса. Следовательно, V ( активность в условиях, при которых весь фермент находится в составе комплекса фермент-субстрат) не будет изменяться в присутствии ингибитора. Но поскольку равновесие в системе фермент-ингибитор смещается, для достижения V, а следовательно, также и 1/2 V следует создать в системе

большую концентрацию субстрата, т.е. К,,' в присутствии конкурентного ингибитора увеличивается. Это видно из таблицы 1.

Константа ингибирования Кх= 1*10"47 моль/л определена из зависимости Км' / V ~ ] по уравнению:

К//У = 0,076 + 0,002 ] (ЕКОрр. = 0,950),

диапазон определяемых содержаний ионов серебра (Ю-7 + 1 мг/л) или 10~5 * 10"12 М найден из зависимости V ~ [Ая"Ч.

Подобные исследования и обработка данных были проведены для уреазы, ингибированной ионами Си2РЬ2+, Сй2+, Н§2+. Результаты представлены в таблице 2.

Таблица 2

Основные характеристики ингибирования уреазы ионами металлов в воде.*

I I 1 Ион | к4. 1 1 1 тип ИшКв.р 1 Диапазон определяемых 1

1метал| 1 ингибирования | содержаний ионов метал-1

|ла 1 моль/л 1 | мг/л 1 | лов, мг/л 1

1 | |Си2+ | 10-35 1 1 (смешанное !ю~3 6,4х10'6 + 0.64 1

1 - 1 бесконкурентное 110~3 2x10"5 * 20.1 |

|Рв2+ | Ю-22 1 конкурентное |0.1 2x10"5 * 207 |

\Сйг+ | 10-18 [конкурентное |5хЮ"3 10~5 * 1.12 I

| г 1 10-47 ¡конкурентное ¡5x10'3 1 .1 10'7 * 1 | 1

* - исследования проведены на модельных растворах.

Исследованные ионы можно расположить в ряд по уменьшению сродства к уреазе: Ag+ > Си2* > РЬ2 + > Сс1г+, что вполне согласуется с литературными данными.

Таким образом, твердофазный биосенсор с исходной суммарной ферментативной активностью 0,7 * 1,1 Е. обеспечивает количественное определение ионов Ag+, Кё2 +, РЬ2 + , Сй2 + в водных растворах их солей в широком диапазоне определяемых концентраций, в том числе и ниже ПДКВ.Р.

2. Разработка биохимических тест-систем

Тестовые устройства обладают рядом преимуществ перед уникальной дорогостоящей аппаратурой: они просты в изготовлении и эксплуатации, достаточно экономичны при массовом производстве и служат средством первичного или ориентировочного контроля токсичных веществ в анализируемой пробе. Особенную ценность такой анализ представляет в случае выполнения его непосредственно на обследуемом объекте, что

исключает проблемы отбора, хранения и транспортировки проб.

При организации тестирующей системы основная задача исследования состояла в подборе оптимальных условий работы биохимического тестера, определяющего чувствительность метода. Водорастворимые ферменты не нашли практического применения в таких системах из-за нестабильности и ограниченного срока службы тестов. Уреаза, иммобилизованная на нерастворимом сополимере стирола и дивинилбензола достаточно стабильна, легко регенерируется и при правильном хранении может быть использована многократно.

В качестве второго чувствительного элемента были выбраны твердофазные рН-индикаторы, способные быстро реагировать изменением окраски на концентрацию ионов в системе. Основываясь на кинетических закономерностях ферментативной реакции и свойствах цветных рН-инди-каторов, был разработан визуальный экспрессный метод контроля ионов металлов в воде.

Одной из основных задач данной работы явилось установление корреляционных зависимостей между уровнем реакции биотестера на ион металла и нормативными величинами токсичности. В качестве токсикомет-рического параметра был выбран показатель, отражающий отклонение концентрации вещества от нормированного - показатель контроля биосферы (КБ).

Тест-метод основан на изменении ферментативной активности уреа-зы за счет ингибирования ионами металлов и на последующем изменении окраски твердофазного рН-индикатора, взятого в качестве рН-чувстви-тельного элемента для контроля количества выделенного аммония при контакте ингибированной уреазы с мочевиной. Изменившийся цвет индикатора идентифицировали по эталонной шкале.

Тестирование проводили на модельных растворах солей ртути (11,1. серебра (I), свинца (II), кадмия (II), меди (II), приготовленных на воде, деионизованной в смешанном слое ионитов. Изменение окраски твердофазного рН-индикатора в реакционной среде после фермент-тестирования для различных ионов металлов наступало в широком диапазоне их содержаний.

Полученная зависимость показателя КБ от степени ингибирования для всех исследуемых ионов металлов линейна в определенном диапазоне их содержаний, что позволяет проводить анализ с достаточной точностью, все прямые характеризуются высокими коэффициентами корреляции.

Базируясь на этих данных, были составлены шкалы по оценке ионов ртути (II), серебра (I), кадмия (II), свинца (II), меди (II).

К сожалению, чувствительность твердофазного рН-индикатора имеет

диапазон изменения окраски уже, чем диапазон изменения ферментативной активности уреазы и позволяет определить содержание ионов Сиг+, РЬ2 + , Сс1г\ на уровне ПДК,,, но не ПДКВ.Р., так как в этой области изменение цвета индикатора практически не происходило (рис.3). Как показано на рис.3, чувствительность биохимического тестера значительно вше чувствительности твердофазного рН-индикатора и находится на уровне (для ионов Си2 + , РЬ2+), а для ионов Ag+ и Н^ превышает чувствительность метода атомно-абсорбционной спектроскопии с электротермической атомизацией.

Метод тестирования базировали на измерении активности фермента исходного и ингибированного, а точнее на снятии показаний степени ингибирования, которая может быть расчитана по формуле:

Ао ~ П л .

Рщп.----------- . где

А0

степень ингибирования; Ао- А1пП - соответственно, ферментативная активность исходного и ингибированного биохимического тестера, Е/г.

Градуировочные графики зависимости степени ингибирования от концентрации ионов металлов представляют собой линейные зависимости, позволящие рассчитать концентрацию определяемого иона по экспериментальной величине степени ингибирования Р1пц.(табл.3).

Таблица з

Градуировочные уравнения для расчета концентрации определяемого иона металла.

1 |Ион ме- i Уравнение прямой i |Коэф. ------ 1 Диапазон определяв-1

1талла |корр. мых содержаний Ме, 1

1 le^p a c .= к + В x Flnb 1 в котором работает 1

1 1 уравнение, мг/л 1

1 Ag+ 1 l^^p а с .= -25,60 + 46,37 х Flsh 1 10,961 1 ю-7 + 1 . 1

1 Hg2 + 11&Срас . = -20,15 + 53,20 x FlBh. 1 |0,903 I 2x10"5 * 20,1 !

I Pb2 + 1 lSCpac .= -25,99 + 35.76 x Flnn. 1 10,959 l 2x10"5 * 207 |

I Сц2 + 1^SCpac .= -27,15 + 39,80 x Flnh 1 10,981 I 64x1О-7 * 0,64 |

I Cd2 + i 1IS^pac i .= -23,43 + 29,62 x F11Ul 1 10,960 i Ю"5 * 1,12 I |

а) по степени ингибированкя биохимического тестера.

10'

12

10

10

10

-8

10"

10

1-4

10"2 моль/л

Си'

.2 +

РЬ

Ае+

2 +

с<г

£ +

—1—1—I—1—1—1—

41

1 1 1 1 1 1

ШШШШШШШмШЩ^ШШШШШШШ

щ —

11111

у*

1 Г 1

« #

1111

у #

б) по твердофазному цветному индикатору.

Си'

,2 +

2 +

РЬ'

Ag С(Г

;2 +

1

8 1 1

Г 1 I

ЩШШШШШШШ!

Биохимическое тестирование

Атомно-абсорбционная спектроскопия с электротермической атонизацией

#-ЯДКв. Ш - ПДКвр

Рис.3 Диапазон определяемых содержаний ионов металлов в водных растворах без разбавления.

-12В таблице 4 приведены основные результаты ферментативного тестирования модельных растворов.

Как видно, коэффициенты чувствительности, которые равны угловому коэффициенту градуировочного графика для определяемых ионов металлов достаточно малы. Предел обнаружения - это то наименьшее содержание металла, при котором по данной методике можно обнаружить присутствие определяемого компонента с заданной доверительной вероятностью (Р = 0,95) лежит ниже уровня ПДКвр. для данных металлов. Относительное стандартное отклонение для рассматриваемых металлов Бг< 0,15, что говорит о высокой точности и чувствительности метода. Полученные данные могут быть положены в основу разработки переносного портативного анализатора/ включающего разработанный биохимический тестер.

При сравнении различных методов определения ионов металлов в воде, метод ферментного тестирования с использованием иммобилизованной уреазы имеет явное преимущество по пределу обнаружения ионов, но отстает по селективности.

Таблица 4.

Основные технико-аналитические характеристики ферментативного тестирования ионов металлов в воде.

1 !Параметр ................ | Разработанный.метод определения ионов: (

№ г РЬ2 + СЙ2 + 1 Сиг+ 1

1 Коэффициент 1 чувствительности 0,056 0,066 0,063 0,078 0,094 1

1 Диапазон определяемых содержаний, мг/л 10"7-1 2х10"5-20,1 2x10"5+ 207 10"5* 1. 12 64x10"7 - ( 0,64 I

1 Предел обнаружения, 1 Сш1п, мг/л 10"8 5, 6x10"6 1,1х10"6 1.2x10"6 16, 6х10"8 |

[Относительное стандартное отклонение, 1 Бг 0, 0030 0, 0023 0,0027 0, 0018 0,0040 I | |

1 Время отклика, с I 5+10 1 1 1

-13В практике создания ферментных тестирующих систем для селективного определения ионов, обычно используют приемы вытеснения ионов из комплекса ЕМе растворами Щ4Ж)3, К1, Ш43, ЕДТА-с образованием соответствующих солей металлов или изменением рН, или многократным разбавлением исследуемой воды.

В определении новых подходов к селективному определению ионов металлов особенный интерес представляет область низких концентраций веществ, а известные приемы разбавления и маскирования не дают точного результата.

Развивая пути достижения селективного определения ионов металлов в многокомпонентных растворах мы решили обратиться прежде всего к результатам исследования кинетики ферментативных процессов, рассмотренных нами. Так как ферментативные реакции высокоспецифичны, то можно предположить, что и ингибирозание ионами металлов, также должно быть специфично для каждого иона. В качестве кинетического параметра была выбрана оптимальная концентрация субстрата 13]оптим , соответствующая конкретной величине Км и V для определенной концентрации иона металла.

Величины [5]оптим , найденные при изучении растворов с различной концентрацией ионов заметно отличаются друг от друга. Проведя определение активности фермента после ингибирования известным составом воды, содержащим ионы РЬ2+, С<Зг+ с содержанием каждого на уровне ПДКв р , при значении [5]0ПТНИ., взятом для уреазы, ингибиро-ванной ионами свинца с содержанием его на уровне ПДКВ р., был получен адекватный результат по формуле "введено=найдено". Показано, что оптимальная концентрация субстрата, найденная при изучении ферментативного гидролиза мочевины уреазой, ингибированной ионами металла определенной концентрации, является параметром, позволяющим избирательно определить концентрацию иона металла в воде, что несомненно требует дальнейшего исследования.

3. Апробация ферментного тестирования на реальных объектах.

Полученные результаты позволяют утверждать, что исследованные е данной работе детектирующие элементы (ферментный и рН-индикатор) обладают высокой чувствительностью и могут быть рекомендованы для экспрессного анализа суммарного содержания ионов металлов в водных объектах окружающей среды. Апробация разработанного визуального метода на практике с дополнительным контролем ААС показала возможность применения его и для многокомпонентных растворов. Так результаты обследования подземных скважин гидрогеологической службы г. Минска и родников в г. Радонеже подтвердили высокую чувствительность биотестера и

показали на примере родников возможность применения его для определения как макро, так и микроэлементов. Исследования образцов воды Черного моря, взятой на различной глубине, так же показали широкие возможности использования биотестера не только для анализа ионов металлов, но и для определения в ней мочевины или уреазной активности.

При выполнении хоздоговора с Московским эндокринным заводом аппробирован экспрессный метод анализа тяжелых металлов в экстрактах пантов и в используемой на производстве технологической воде.

Были разработаны экспрессные методики, позволяющие оценить суммарное содержание ионов металлов в воде, используемой для приготовления медпрепаратов с расчетом по уравнению:

п» .= 0-013 + 2,6x10"32КБ (Ккорр - 0,973) и для оценки биологического сырья с расчетом по уравнению: °'380 + 1,8x10"52КБ (Нкорр . = 0,993).

Апробация нового подхода к селективному определению ионов на примере свинца была проведена на воде неизвестного состава: водопроводной, океанской и в луже. Результаты биохимического тестирования и метода вольтамперометрии практически совпадали (табл. 5).

Таблица 5

Результаты определения ионов свинца (II) в воде неизвестного состава.

[ I Тип воды 1 1 Обнаружено свинца 1 (II) методами: 1

1 1 1 1 биотестирования! вольтамперометрии 1 1 I 1

1 1 1 моль/л 1 I 1 моль/л |

1 водопроводная 1 1 I 1,40x1О"8 I 1 1 4, 80хЮ"8 1

1 океанская Г ......1 | 9,15x10"7 | 1 | 2, 35x10"7 1

I из лужи с тер- ¡ритории РХТУ 1 1 1 1 1 I 9,40х10"6 | | 1 15, 30x10"6 | 1

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ.

■ 1. Проведен комплекс исследований физико-химических характеристик биотестера на основе иммобилизованной уреазы, и показана высокая чувствительность и применимость предложенной системы для экс-

пресс-анализа в водных средах малых и следовых количеств приоритетных по токсичности тяжелых металлов в вариантах приборного и визуального детектирования.

2. Впервые исследован процесс ингибирования уреазы, иммобилизованной на макропористом сополимере стирола и дивинилбензола, ионами металлов и анионами в широком диапазоне их концентраций. Показано, что основной вклад в ингибирование уреазы вносят катионы, заметное влияние анионов проявляется, начиная лишь с уровня концентрации 10"5 М. Диапазон концентраций непосредственного индивидуального определения ионов металлов изменяется от 10_1г М до 10'3 М в зависимости от типа металла.

3. Исследована кинетика гидролиза мочевины ингибированной и не ингибированной уреазой, определены основные кинетические параметры: константы Михаэлиса К„, максимальные скорости гидролиза V, оптимальные концентрации субстрата [5]0ПТИМр и механизмы ферментативных реакций ингибирования уреазы различны® металлами (Аё*, Си2 + , РЬ2*, са2\

4. Рассчитаны константы ингибирования ^ и определены ряды сродства ионов металлов к ферменту, диапазоны определяемых содержаний ионов металлов в воде. Получены основные технико-аналитические характеристики биотестирования ионов металлов в воде.

5. Впервые показано, что с применением разработанного биотестера возможно определение параметров общей токсичности тяжелых металлов по принципу суммации агрессивности или показателя КБ (контроля биосферы). В ряду исследованных металлов на многокомпонентных смесях впервые установлены корреляционные зависимости степени ингибирования и приведенной токсичности суммы металлов. Найдены корреляционные зависимости показателя КБ от концентрации ионов различных металлов в водных средах.

6. Показана применимость биотестера для экспресс оценки качества питьевой воды по тяжелым металлам. Разработаны новые тест-системы с визуальным и приборным определением ионов : РЬй + , Не2*, Аё*, СсР. Си2+ на уровне ПДКв. в водных растворах их солей. Показано, что изменением концентрации субстрата возможно селективное определение ионов металлов в водных объектах окружающей среды.

7. Проведена апробация экспрессного метода биотестирования в визуальном варианте на Московском эндокринном заводе, которая показала возможность его применения для анализа агрессивности воды и содержания тяжелых металлов в сырье экстрактов пантов.

8. Обследование родников в Радонеже позволяет рекомендовать разработанный биотестер для первичного экспрессного анализа суммар-

ной агрессивности и качества питьевой воды.

9. Обследование скважин природной подземной и морской воды также позволяет рекомендовать экспрессный метод для первичного контроля воды для определения суммарной агрессивности по тяжелым металлам в пресных и соленых водах.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ ИЗЛОЖЕНО В СЛЕДУЮЩИХ ПУБЛИКАЦИЯХ:

1. Кощуг В.А., Черкасова Т.к., Лейкин Ю.А. Экспрессное определение ионов металлов в воде различной природы. //Тез. докл. IX Международной конф. молодых ученых и студентов по химии и технологии "МКХТ-95". Москва. РХТУ.-1995 г.-Т.2.-С.145.

2. Cherkasova Т. А., Koschug V.A., Leikln Yu.A. Express determination of relative aggressivity index of metal ions in water of different nature //5th International Symposium on Kinetics in-Analytical Chemistry. September 25-28. Moscow. MSU.-1995. -P. 54.

3. Cherkasova T.A., Koschug V.A., Leikin Yu.A. Express determination of concentration of silver ions In drinking water //International Congress on Analytical Chemistry. Moscow. June 15-21.-1997.-P.

4. Черкасова Т.А., Кощуг В.А., Лейкин Ю.А. Изучение ферментативного гидролиза мочевины иммобилизованной уреазой, в присутствии ингибиторов //Прикладная биохимия и микробиология. -1997 г. в печати