Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспрессия генов транскрипционных факторов и В2 последовательностей ДНК в регенерирующей печени крыс

ВАК РФ 03.00.03, Молекулярная биология

Автореферат диссертации по теме "Экспрессия генов транскрипционных факторов и В2 последовательностей ДНК в регенерирующей печени крыс"

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ ІНСТИТУТ МОЛЕКУЛЯРНОЇ БІОЛОГІЇ І ГЕНЕТИКИ

РГ6 од

1 11 ІПР 1995

НОВІКОВА Леся Василівна

УДК 577.113.083:577.218 ЕКСПРЕСІЯ ГЕНІВ ТРАНСКРИПЦІЙНИХ ФАКТОРІВ І В2 ПОСЛІДОВНОСТЕЙ ДНК В РЕГЕНЕРУЮЧІЙ ПЕЧІНЦІ ЩУРІВ

03.00.03 - молекулярна біологія

• Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Київ 1998

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана у відділі молекулярних механізмів біосинтезу білка Інституту молекулярної біології і генетики НАН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук

Платонов Олег Максимович

Інститут молекулярної біології і генетики

НАН України, м.Київ

зав. відділом молекулярних механізмів біосинтезу білка

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук

Соломко Олександр Петрович Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, м.Київ зав. відділом біохімічної генетики

кандидат біологічних наук Погребний Петро Васильович Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ старший науковий співробітник відділу пухлинної клітини

Провідна установа : Інститут молекулярної генетики РАН, м. Москва Захист дисертації відбудеться 28 1998 р. о годині

на засіданні спеціалізованої вченої ради Д.01.86.01 Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою: 252143, м.Київ-143, вул. Заболотного 150.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту молекулярної біології і генетики НАН України за адресою:

252143, м.Київ-143, вул. Заболотного 150.

Автореферат розісланий 2І 1998 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради кандидат біологічних наук

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Завдяки успіхам, яких досягла сучасна біологія, в загальних рисах відомі основні молекулярні механізми функціонування клітини. На підставі цих знань виникає реальна можливість дослідження складних біологічних процесів розвитку, диференціації, росту. Одним з таких процесів є регенерація.

Експериментальною системою для вивчення регенераційного процесу є печінка щурів після часткової гепатектомії (ЧГЕ). При видаленні частини органа у залишеній тканині відбувається регенерація, під час якої відповідь на травму поєднується з компенсаторними реакціями, до яких належать швидка проліферація і підтримання найважливіших для організму функцій печінки. Відповідь на травму є однією з високоспеціалізованих функцій печінки, що проявляється при будь-якому пошкодженні організму. Вона полягає у синтезі білків “гострої фази”, які припиняють руйнівні процеси. Самостійний прояв відповіді печінки на травму моделюється з допомогою несправжньої операції (НО). Паралельне вивчення печінки після ЧГЕ і НО дозволяє з’ясувати, які молекулярні механізми причетні до реакції гострої фази або до інших складових регенераційного процесу.

Особливості життєдіяльності клітин печінки в обох досліджуваних процесах зумовлені змінами в програмі експресії геному і перш за все генів транскрипційних факторів, які визначають набір і кількість діючих білків. Для дослідження були обрані: гени загальноклітинних транскрипційних

факторів c-Fos і с-Мус, які вважаються причетними до канцерогенезу; ген тканинноспецифічного транскрипційного фактора - ядерного фактора гепатоцитів-la (ЯФГ-Іа); В2 послідовності ДНК; ген тканинно-специфічного білка печінки цитохрому Р450ІІЕ1. Експресія генів транскрипційних факторів добре вивчена на культурах клітин, але дані про неї in vivo обмежені. В2 послідовності ДНК представлені короткими послідовностями, які часто повторені в геномі гризунів і містять регуляторні області. Функція В2 послідовностей мало досліджена. Ген цитохрому Р450ІІЕ1 є однією з послідовностей ДНК, що мають у своєму складі В2 елемент.

Як відомо, регуляція експресії геному і досліджуваних генів, зокрема, відбувається на транскрипційному, посггранскрипційному рівнях, які визначають співівдношення між ядерною та цитоплазматичною РНК, а також на рівні трансляції. Найменш вивченим є посттранскрипційний рівень регуляції, який включає дозрівання і нагромадження транскриптів в ядрі, їх транспорт через ядерну мембрану, зберігання РНК в цитоплазмі. Ядерно-цитоплазматичні співвідношення РНК при експресії індивідуальних генів майже нез’ясовані.

Зв’язок роботи з науковими програмами, темами. Робота виконувалась впродовж 1988-1995 років за темами фундаментальних

досліджень відділу молекулярних механізмів біосинтезу білка ІМБіГ НАН України (зав. відділом О.М.Платонов): “Характеристика

цитоплазматичних білкових факторів, активуючих ядерний геном, на ранніх стадіях регенерації печінки” (№01.86.0069116,1986-1989 p.p.); “Вивчення генів, експресія яких залежить від клітинного циклу гепатоцитів” (№01.91000034,1990-1994 p.p.); “Послідовність експресії протоонкогенів і тканинноспецифічних генів в клітинному циклі гепатоцитів” (jN°0195U005358, 1995-1998 p.p.).

Мета і задачі дослідження. Мета роботи полягає у з’ясуванні молекулярних механізмів регенераційного процесу в печінці шляхом порівняльного дослідження експресії генів загальноклітинних (c-fos, c-myc) і тканинноспецифічного (ЯФГ-1а) транскрипційних факторів, гена цитохрому Р450ІІЕ1, а також В2 послідовностей ДНК під час регенерації і після несправжньої операції.

Для досягнення поставленої мети вирішувались задачі: 1) розробка методу виділення ядерної і цитоплазматичної РНК з одного і того ж зразка тканини печінки, який гарантує інтактність і високе представництво РНК;

2) вивчення відносного вмісту транскриптів генів c-fos, c-myc, ЯФГ-1а, цитохрому Р450ІІЕ1 і транскриптів В2 послідовностей ДНК в ядерній і полі(Л)* цитоплазматичній РНК печінки після ЧГЕ та НО; 3) з’ясування співвідношення між ядерними та цитоплазматичними транскриптами індивідуальних генів при регенерації і після несправжньої операції; 4) виявлення змін вмісту транскриптів досліджуваних генів в полі (Ау цитоплазматичній РНК печінки після ЧГЕ, пов’язаних з відповіддю на травму і з компенсаторними реакціями регенераційного процесу.

Наукова новизна одержаних результатів. Удосконалено метод виділення ядерної та цитоплазматичної РНК з тканини печінки, що дало основу для оцінки змін вмісту індивідуальних досліджуваних РНК в ядерній і цитоплазматичній РНК та визначення їх співвідношення.

Внаслідок паралельного дослідження регенераційного процесу і відповіді печінки на травму вперше визначено, що гени c-fos, ЯФГ-la і цитохрому Р450ІІЕ1 задіяні в реакції гострої фази з боку печінки, ген c-myc у проходженні G, і G2 фаз клітинного циклу, гени Р450ІІЕ1 і ЯФГ-1а - в ранній тканинноспецифічній реакції на часткову гепатектомію.

Виявлено, що розподіл між ядром і цитоплазмою транскриптів індивідуальних генів залежить від характеру досліджуваного процесу і його часового інтервалу.

Вперше показано, що зміни вмісту індивідуальних транскриптів в цитоплазмі по відношенню до ядра можуть бути одаонаправленими, протилежнонаправленими або відбуватись на фоні сталої концентрації в ядрі.

з

Продемонстровано, що зростання експресії В2 послідовностей ДНК характерне для регенераційного процесу і відповіді печінки на травму. На ранніх етапах обох процесів воно зумовлене підвищенням вмісту РНК цитохрому Р450ІІЕ1, до складу якої входить В2 транскрипт .

Практичне значення одержаних результатів. Запропонований в даній роботі підхід до досліджень експресії генів на основі вивчення вмісту індивідуальних транскриптів в ядерній і полі(Л)* цитоплазматичній РНК може бути використаний в роботах аналогічного спрямування.

Визначення процесів і часових інтервалів, при яких відбуваються максимальні зміни експресії досліджуваних генів, відкриває можливості для цілеспрямованого пошуку досі малознаних генів-мішеней для транскрипційних факторів с-Роя, с-Мус, ЯФГ-Іа, а також для з’ясування функції фермента дезінтоксикаційної системи печінки цитохрому Р450ІІЕ1 при відсутності дії ксенобіотиків.

Експериментальні дані, одержані в роботі, розкривають молекулярні механізми процесу регенерації печінки і реакції відповіді на травму та мають медико-біологічне значення.

Особистий внесок здобувача. Основні результати викладені у дисертації, одержані автором самостійно. Висловлюю щиру подяку Оболенській Марії Юріївні за допомогу і увагу, надані при виконанні дисертаційної роботи.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень були представлені на школі-конференції “Структура і функції біополімерів”, Львів, 1989 р.; Всесоюзній нараді “Актуальні питання клітинної біології”, Ленінград, 1989 р.; Всесоюзній школі-семінарі “Молекулярна біологія і медицина”, Ленінград, 1990 р.; Міжнародному симпозіумі “Білки-регулятори печінкових генів”, Базель, Швейцарія, 1989 р.; Міжнародному з’їзді по захворюваннях печінки “Молекулярна біологія і клініка”, Базель, Швейцарія, 1995 р. ; міжвідцільському семінарі ІМБіГ НАН України, листопад 1997 р.; Міжнародній робочій нараді "Нормальний і злоякісний ріст клітин печінки", Халле, Німеччина, 1998 р.

Публікації. За темою дисертації опубліковано 5 статей в вітчизняних і зарубіжних журналах і 7 тез доповідей наукових конференцій.

Структура і обсяг роботи. Дисертація викладена на /50 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, об’єктів і методів дослідження, результатів дослідження та їх обговорення, підсумків і висновків. Список літератури охоплює 222 найменуваня. Дисертація проілюстрована 10 таблицями і 15 рисунками.

ОБ’ЄКТИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Об’єкт дослідження. Для роботи використовували білих щурів лінії “Wistar”, самців, віком 4-5 місяців, вагою 150-180 г, які знаходились в віварії на стандартному раціоні живлення.

Процес регенерації печінки викликали за допомогою часткової гепатектомії , відповідь печінки на травму - за допомогою несправжньої операції. ЧГЕ проводили за стандартною методикою, видаляючи середню і ліву латеральну частки печінки [Higgins, 1931]. При несправжній операції тваринам розтинали черевну порожнину і зашивали, не видаляючи печінкової тканини. У інтактних і оперованих тварин в різні терміни після ЧГЕ і НО (15 хв, ЗО хв, 1 год, 3 год, 6 год, 12 год, 15 год, 18 год, 20 год, 23 год, 29 год, 32 год, 37 год) видаляли печінку, заморожували в рідкому азоті і зберігали при -70°С.

Виділення препаратів РНК . За основу виділення РНК взято метод з використанням солей гуанідину [Cathala, 1983]. Для одержання ядерної і цитоплазматичної РНК наважку печінкової тканини, заморожену рідким азотом, розтирали в ступці і гомогенізували в 10 об’ємах 2,5%-ного розчину лимонної кислоти і 0,05% -ного тритону Х-100. Ядра від цитоплазми відділяли центрифугуванням при 1000 g на протязі 5 хв при 4"С. Супернантант, що містив цитоплазматичну фракцію, осаджували етанолом. Ядра, додатково очищені за допомогою диференціального центрифугування в розчинах сахарози, і осад цитоплазматичної фракції гомогенізували в лізуючому розчині (4 М гуанідинізотіоціанат, 10 мМ ЕДТА, 50 мМ трис-НСІ, pH 7,6, 8%-ний 2-меркаптоетанол, 0,5%-ний саркозил) з розрахунку 5 мл розчину на 1 г тканини. Для зменшення в'язкості гомогенату лізованих ядер його пропускали 5-7 разів через голку для ін’єкцій №8 і обробляли ультразвуком (20 кГц, ЗО сек, 0°С). Наступні етапи виділення препаратів РНК не відрізнялися від оригінального методу [Cathala, 1983].

Одержання полі (AY цитоплазматичної РНК проводили методом хроматографії на оліго(с1Т)-целюлозі [Маниатис и др.,1984].

Електрофоретичне розділення РНК здійснювали у вертикальному напрямі в пластинках 1,7%-ного гелю агарози, що містить 6 М сечовину і розчин 40 мМ трис, 36 мМ NaH2P04, 1 мМ ЕДТА, pH 7,4 на протязі двох годин [Locker, 1979]. Після електрофорезу гель фарбували толуїдиновим синім для аналізу якості РНК [Маниатис и др., 1984], або використовували для перенесення РНК на сорбуючу мембрану для наступної блот-гібридизації з радіоактивним зондом.

Вакуумне перенесення РНК на мембрану виконували аналогічно до того, як описано для ДНК [Зайцев, Яковлев, 1983], але при цьому гель

послідовно обробляли 5хв в дистильованій воді, 45 хв в 50 мМ NaOH, 10 мМ NaCl, 45 хв в 0,1М трис-НСІ, pH 7,5 [Маниатис и др., 1984]. Спеціально для перенесення РНК був сконструйований апарат.

Приготування Фільтрів для dot-гібридизації. Препарати РНК, які відповідають різним термінам після операцій (ЧГЕ або НО), і препарати РНК з печінки інтактних тварин в розчині lOxSSC, 20% формальдегіду наносили на нейлонові мембрани у кількості 1, 3, 9 мкг на пляму [Маниатис и др., 1984].

РНК-ДНК гібридизація. Радіоактивномічений гібридизаційний зонд кДНК отримували за допомогою реакції нік-трансляції згідно [Rigby, 1977]. Питома активність ДНК звичайно складала 8хіоМхіо8 імп/хв.мкг. Гібридизацію з міченою пробою проводили за загальноприйнятою методикою [Маниатис и др., 1984]. В якості зондів для гібридизації використовували Xbal-SacI фрагмент (1000 п.н.) протоонкогена с-шус миші, Pstl-фрагмент (1100 п.н.) v-fos гена в складі pGEM2, Pstl-

фрагменг (300 п.н.) структурної частини гена цитохрому Р450ІІЕ1 миші у складі pUC19, BamHI-PstI фрагмент (250 п.н.) В2 елемента.

Детекція і принципи аналізу результатів. Основним показником дослідження були обрані відносний вміст індивідуальних транскриптів в пробах ядерної і полі(Л)+ цитоплазматичної РНК, який вимірювали за інтенсивністю потемніння радіоавтографа за допомогою денситометрії. Виходячи з того, що кількість ядерної і полі(Л)* цитоплазматичної РНК змінюється протягом реакцій відповіді на ЧГЕ і НО, нами були визначені показники, які враховують ці зміни та відображають вміст транскриптів у фракціях по відношенню до ДНК. Використання показників вмісту транскриптів індивідуальних генів, приведених до спільного знаменника, дає можливість порівнювати між собою зміни, які відбуваються в ядерній і полі (А)* цитоплазматичній фракціях однієї і тієї ж тканини і в клітинних фракціях з печінки тварин після ЧГЕ і НО. Вміст індивідуальних транскриптів гена в полі(Л)+ цитоплазматичній РНК максимально наближений до кількісті відповідного білка, оскільки полі(Л)* цитоплазматична РНК є інтенсивно трансльованою, що дає можливість передбачати участь генів в досліджуваних процесах. Всі експериментальні дані були піддані статистичній обробці (Плохинский, 1961).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Характеристика удосконаленого методу виділення РНК і особливостей вакуумного перенесення РНК з гелю на мембрану. Метод виділення РНК з використанням солей гуанідину [Cathala, 1983], який дозволяє отримувати інтактні препарати сумарної РНК, був вперше пристосований до виділення ядерної і цитоплазматичної РНК з тканини печінки.

Рис.2.Блот-гібридизація попі(Л)* цитоплазматичної РНК з печінки інтактних тварин (1) та з регенеруючої печінки (2-7) відповідно через 0,25 год, 0,5 год, 1 год, З год, 6 год, 12 год після ЧГЕ. В якості зонда використовували Р32кДНК цитохрому Р450ІІЕ1; а - 288, 6- 188 РНК.

Рис.1. Гель-електрофорез препаратів РНК, виділених з використанням гуанідин ізотіоціанату з тканини печінки: 1- ядерна РНК, виділена оригінальним методом ; 2- сумарна РНК, виділена оригінальним методом; 3- цитоплазматична РНК, виділена модифікованим методом; 4- полі(Л)' цитоплазматична РНК, виділена модифікованим методом; 5- ядерна РНК, виділена модифікованим методом; 6- сумарна РНК, виділена фенольним методом. Після електрофорезу гель фарбували толуїдиновим синім; а, б, в, г -відповідно 458, 288,188, 58 РНК.

Оскільки найбільшої деградації РНК зазнає на перших етапах виділення, нами були підібрані умови для блокування ендогенної РНКазної активності при розділенні ядер і цитоплазми (2,5% лимонна кислота, 0,05% тритон Х-100).

Подальше використання оригінального методу для виділення РНК з цитоплазматичної фракції дозволило отримати інтактні препарати (Рис.1, доріжка

3). Однак, при застосуванні цього методу до ядерної фракції одержана РНК ( доріжка 1), так як і сумарна (доріжка 2), практично не містить 458-попередника рРНК, але в багатьох випадках проявляє чітку смугу на старті доріжки, яка відповідає клітинній ДНК. Запропонована нами обробка ядерної фракції лізуючим розчином за допомогою ультразвуку і протискання через голку дозволяє усунути домішки ДНК з препаратів РНК, при цьому не пошкодивши високомолекулярних РНК (доріжка 5).

Однак, слід зауважити, що переваги описаного методу не поширюються на низькомолекулярні РНК (менше 58), так як вони втрачаються при розділенні нуклеїнових кислот центрифугуванням в З М ІлСІ.

Перенесення РНК на мембрану здійснювали після її електрофорезу в агарозному гелі, що містить 6 М сечовину, який на відміну від гелів, що містять формальдегід, гідроксид метилртуті або формамід [Маниатис и др., 1984], вважаються не повністю денатуруючими, однак, є нетоксичним, міцним, дає добре розрізнення смуг і стабільно відтворювані результати [СаЛаїа, 1983].

Метод вакуумного перенесення ДНК з гелю на мембрани [Зайцев, Яковлев, 1983] був адаптований для перенесення РНК. Як показали результати дослідження різних проб, після електрофорезу гель має бути вимоченим у дистильований воді для видалення надлишкової сечовини, а потім підданий лужній обробці. Частковий лужний гідроліз РНК в гелі, зменшуючи розміри найбільших молекул, покращує їх рухливість при перенесенні.

Тривалість процесу перенесення РНК з гелю на нейлонові фільтри становила 1,5 год при тиску в камері близько 0,05 атм, який здатний забезпечувати навіть водоструминний насос. Вакуумне перенесення на відміну від традиційного капілярного відбувається значно швидше (1,5 год проти 16 год), що знижує ризик деградації РНК. Якість РНК, отриманої модифікованим методом після її електрофорезу і перенесення на сорбуючу мембрану, демонструє радіоавтограф (Рис. 2).

і і і і г 5 10 15 20 25 30 35 40

І І Г 5 10 15 20 25 30 35 40

час після операції (год)

Рис.З. Вміст с-шус транскриптів в полі (А)+ цитоплазматичній і ядерній РНК печінки щурів при регенерації (ЧГЕ) і після несправжньої операції (НО) в порівнянні з їх вмістом у інтактних тварин.

Відносний вміст транскриптів індивідуальних генів в ядерній і полі (А)* цитоплазматичній РНК при регенерації і несправжній операції

Відносний вміст транскриптів генів с-ЇЬб, с-тус, ЯФГ-1а, цитохрому Р450ІІЕ1 в ядерній і полі (А)* цитоплазматичній фракції печінки щурів змінюється на протязі регенераційного процесу і відповіді печінки на травму, причому зміни для кожного виду транскриптів і у кожному з процесів мають свої особливості. Тим не менше в експресії генів можна відмітити деякі. спільні для обох процесів закономірності.

Відхилення вмісту індивідуальних транскриптів в полі(Л)* цитоплазматичній РНК від значень, характерних для інтактних тварин, більші ніж у ядерній РНК в обох досліджуваних процесах. Це пояснюється з тим, що концентрація індивідуальних пре ІРНК в ядерній РНК менша, ніж концентрація відповідних ІРНК в полі(Л)+ цитоплазматичній фракції, і тим, що посттранскрихщійні процеси задіяні в регуляції експресії генів. Наприклад, для с-тус гена в регенеруючій печінці вміст транскриптів в ядерній РНК коливається в межах 25-60% від вихідних значень, тоді як в цитоплазматичній в межах 100-160%. (Рис.З).

Співвідношення між вмістом транскриптів в ядерній і полі(Л)+ цитоплазматичній РНК змінюється в ході обох процесів і за характером змін поділяється, принаймні, на три типи. Зміни вмісту транскриптів в цитоплазмі по відношенню до відповідних змін у ядрі можуть бути однонаправленими, протилежнонаправленими і відбуватися на фоні сталої концентрації у ядрі (Рис.4).

260

б 180 « 160 Ч

а 140

н 120

.а юо -

а 8060

1 І—І—г 5 10 15 20 25 30 35 40

С^ОБ,*- —1

ЧГЕ і і т—

1 ' Ц

і «

и б

7

0 5 10 15 20 25 30 35 40

170 160 150 140 130 120 110 100 Н 90

Р450ІІЕ1, “Т 1 1

НО

н! 1 і—.

—• в

І І г

0 5 10 15 20 25 30 35 40 час після операції (год)

Рис.4. Вміст транскриптів в ядерній і полі(А)+цитоплазма-тичній РНК печінки щурів після ЧГЕ і НО в перерахунку на ДНК в порівнянні з їх вмістом у інтактних тварин.

Найбільш часто серед досліджуваних генів ( с-Ров при НО, с-шус -ЧГЕ, цитохром Р450ІІЕ1 - НО і ЧГЕ ) зустрічаються зміни, при яких вміст транскриптів в обох фракціях коливається в протифазі - періоди підвищення в цитоплазматичній фракції супроводжуються періодами зниження в ядерній і навпаки (Рис.4а). Такий характер змін свідчить, на наш погляд, про періодичність переходу індивідуальних транскриптів з ядра в цитоплазму, причому, часові закономірності процесів переходу специфічні для кожного гена. Ці дані на рівні індивідуальних РНК вказують на існування вибірковості переходу РНК з ядра в цитоплазму і заборони на перехід деяких РНК.

Інший тип змін ядерно-цитоплазматичного співвідношення транскриптів проявляється в однонаправленості змін в ядерній і полі(Л)+ цитоплазматичній РНК ( наприклад, вміст транскриптів с-іте і Р450ІІЕ1 в інтервалах 6-24 год і 0,25-6 год після ЧГЕ відповідно), що свідчить про синхронність змін на транскрипційному і посттранскрипційному рівнях (Рис.4б).

Третій тип спостережуваних змін ядерно-цитоплазматичних співвідношень індивідуальних транскриптів полягає в збільшенні вмісту транскриптів в полі (Ау цитоплазматичній РНК на фоні практично незмінного показника в ядерній РНК (Рис.4в). Це спостерігається на прикладі транскриптів с-тус після ЧГЕ і цитохрому Р450ІІЕ1 на протязі більшої частини реакції відповіді на НО. Таке співвідношення транскриптів може забезпечуватися внаслідок збільшення впливу посттранскрипційних подій в регуляції експресії генів (посилення транспорту новоутворених транскриптів з ядра в цитоплазму і стабілізації РНК в цитоплазмі). Для с-тус гена відомо, що тільки на ранньому етапі регенерацїі (15 хв -3 год після ЧГЕ) спостерігається підвищена транскрипція гена, після чого вона зменшується в О, періоді. Таким чином, визначальним у зростанні вмісту с-тус транскриптів у цитоплазматичній РНК при незмінній концентрації ядерної є значне підвищення їх стабільності.

При вивченні експресії досліджуваних генів в печінці тварин після ЧГЕ виявлені особливості, характерні для різних складових регенераційного процесу: реакції гострої фази і компенсаторних реакцій (проліферації та посиленого виконання тканинноспецифічних функцій).

Зміни вмісту поліаденільованих транскриптів генів с-Гоб, ЯФГ-1а і цитохрому Р450ІІЕ1 в печінці щурів після ЧГЕ, аналогічні за характером і часом прояву до змін після НО, були класифіковані як прояв реакції гострої фази в складі регенераційного процесу. Суттєво, що близький для обох процесів вміст полі(Л)+ цитоплазматичних транскриптів досягається за допомогою різних регуляторних механізмів, що видно при порівнянні змін вмісту транскриптів в ядерній РНК.

Підвищення вмісту с-ґоз транскри-птів в полі (А)* цитоплазма тичній РНК охоплює інтервал 12-24 год після ЧГЕ і співпадає з фазою синтезу ДНК та з утворенням білків гострої фази. Оскільки можливість участі с-Ров білка або транскрипційного фактора АБ-1 у власне реплікації ДНК залишається нез’ясованою і згідно інших даних експресія гена с-йи не є необхідною умовою проліферації, принаймні, в двох паренхіматозних органах, печінці і нирках [Сопі, 1990], то на основі часової і кількісної подібності в змінах полі (АУ с-ґов транскриптів після ЧГЕ і НО (Рис.5б) можна вважати, що підвищена експресія с-ґоз гена в інтервалі 12-18 годин після ЧГЕ характерна для реакції гострої фази зі сторони печінки, жа входить складовим компонентом в регенераційний процес.

Підвищення вмісту ЯФГ-1а транскриптів в полі(Л)* цитоплазматичній РНК в інтервалі 15-24 год після ЧГЕ співпадає за часом з тим, який відмічений після НО (Рис.5в). Ці зміни корелюють із збільшенням кількості білків гострої фази (альбуміну, фібриногену, трансферину, а-1 антитрипсину, с-реактивного білка), гени яких регулюются цим транскрип ційним фактором |Р1осІЬу, 1993].

Зменшення вмісту транскриптів гена цитохрому Р450ІІЕ1 в інтервалі 12-24 год після НО і ЧГЕ (Рис.5а) також співпадає з максимальними проявами реакції гострої фази зі сторони печінки. Ці зміни корелюють зі зниженням монооксигеназної активності на протязі Б-фази клітинного циклу гепатоцитів в регенеруючій печінці щурів [Бродский, 1981], що вказує на відповідність між вмістом Р450ІІЕ1 ІРНК та білка.

—•— ЧГЕ — НО

180 160 140 120 100 80 60

0 10 20 ЗО 40

^220

'“'200

І 180

В 160

РЛ40

8 120

* 100

£ 80

ь 60 и ЛГі

0 10 20 ЗО 40

220 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0

0 10 20 ЗО 40

час після операції (год) Рис.5. Вміст транскриптів досліджуваних генів в полі(А] цитоплазматичній РНК при регенерації і несправжній операції порівнянні з їх вмістом у інтактних тварин.

Зміни вмісту поліаденільованих транскриптів генів c-myc, Р450ІІЕ1 і ЯФГ-la, які знайдені тільки після ЧГЕ і не спостерігались після НО, були віднесені до компенсаторних реакцій регенераційного процесу, спрямованих на відновлення маси і функцій органа.

Виражене підвищення вмісту с-шус транскриптів в складі полі(Л)+ цитоплазматичної фракції в перерахунку на РНК і ДНК через 1-3, 6-18, 2430 год співпадає за часом відповідно з G0-Gt переходом, G, і G2 періодами першого клітинного циклу гепатоцитів і властиве проліферативній реакції.

Підвищений вміст с-тус транскриптів, починаючи з першої години після ЧГЕ і в Gt фазі гепатоцитів, співпадає за часом зі збільшенням активності і вмісту білків, гени яких є мішенями для білка с-Мус як регулятора ініціації транскрипції (орнітиндекарбоксилази, циклін Е - і D -залежних кіназ) [Beilo-Fernandez, 1993]. Підвищений вміст транскриптів с-шус в G2 періоді, вперше продемонстрований в цій роботі в умовах in vivo, корешоє із зростанням здатності с-Мус до трансактивації, яка була виявлена у цьому ж періоді клітинного циклу в дослідженнях in vitro [Seth, 1993].

Підвищена експресія тканинноспецифічних генів цитохрому Р450ІІЕ1

і ЯФГ-la на ранньому етапі відновлювального процесу (0,25-6 год після ЧГЕ) пов’язана з посиленим виконанням печінкою своїх функцій після видалення 2/3 органа.

Збільшення вмісту поліаденільованих транскриптів гена транскрипційного фактора ЯФГ-la в цитоплазмі відразу після ЧГЕ з наступним підвищенням концентрації білка [Mendel, 1991] може бути причимною різкої активації тканинноспецифічного гена фосфоенол-піруват-карбоксикінази - ключового фермента глюконеогенезу, який регулюється на рівні транскрипції ЯФГ-la [Taub,1996].

Підвищена експресія гена цитохрому Р450ІІЕ1 на ранньому етапі після ЧГЕ ймовірно пов’язана з участю його білка в каталізі глюконеогенезу для покриття дефіциту енергії, що виникає після операції як і після будь-якої пошкоджуючої дії. Підйом у вмісті індивідуальної CYPIIE1 РНК в перші години після ЧГЕ виражений більшого мірою, ніж після НО, що корелює з більш глибоким дефіцитом енергії, викликаним ЧГЕ. Одночасне підвищення глюкагону в крові, вмісту цАМФ і специфічного транскрипційного фактора в печінці доповнюють картину компенсаторної реакції, спрямованої на підтримання рівня глюкози в організмі [ГаиЬ,1996].

Позитивна кореляція між вмістом поліаденільованих транскриптів генів ЯФГ-la та підвищена експресія гена цитохрому, яка проявляється у збільшені вмісту РНК Р450ІІЕ1 гена як в ядерній, так і в цитоплазматичній фракціях, та наявність ЯФГ-la регуляторної області в промоторі гена

Р450ІІЕ1 свідчать про можливу регуляцію транскрипції гена цитохром; фактором ЯФГ-Ісх на ранньому етапі після ЧГЕ (0,25-6 год). В періо, максимального прояву реакції гострої фази після НО і ЧГІ встановлюються, ймовірно, інші регуляторні зв’язки, так як попередню кореляція між вмістом обох (А)* транскриптів зникає.

Описана нами динаміка змін вмісту транскриптів ЯФГ-1а в полі(лу цитоплазматичній РНК печінки після НО в цілому співпадає зі змінамі концентрації відповідного білка - спад До 10% вихідного рівня через 2 го; після НО змінюється відновленням попередніх значень на 8 год і 2,5 кратним збільшенням їх через 24 год після НО [НосіЬу, 1993]. ТранскрипцЬ гена ЯФГ-Ісс не змінювалась в першій половині досліджуваного періоду зростала у другій. Ці результати разом з отриманими в даній робот свідчать про те, що несправжня операція викликає зміни експресії гена ш посттранскрипційному рівні, які викликають різке зниження вмісту РНК т перших етапах. Транскрипційні і посттранскрипційні процесі забезпечують підвищення РНК на другому етапі. Цей висновок заперечу? той, що зроблений в роботі [НосіЬу, 1993], - про першорядну роль трансляційних і посггрансляційних змін в регуляції експресії гена ЯФГ-1а після НО. Основою для висновку стала невідповідність між змінами вмісту в клітині білка ЯФГ-1а та сумарної клітинної ІРНК ЯФГ-Ісс. Даний приклад демонструє переваги використання полі (А)* цитоплазматичної РНК для орієнтовної оцінки кількості утворюваного білка і переваги обраного способу представлення кінцевих результатів для адекватних висновків відносно природи змін, що відбуваються.

Експресія В2 послідовностей ДНК в печінці несправжньооперованих і частковогепатектомованих щурів.

За даними електрофореграми В2-вмісна РНК з печінки інтактних тварин, а також тварин після НО і ЧГЕ представлена набором смуг (Рис.6). РНК цитоплазми менші за розмірами в порівнянні з молекулами ядра. Низькомолекулярних (близько 6Б) поліаденільованих В2-вмісних РНК в цитоплазмі виявити не вдалося. Відносний вміст В2 транскриптів в ядерній РНК вищий, ніж в полі (Л)* цитоплазматичній. Це узгоджується з уявленням про те, що частина В2 транскриптів входить до складу інтронів високомолекулярних пре-іРНК і руйнується під час процесінгу, не потрапляючи в цитоплазму.

Після обох операцій наступає миттєва реакція, котра характеризується підвищенням концентрації В2 транскриптів в полі(Л)+ цитоплазматичній РНК. Виражене підвищення кількості В2 транскриптів у складі полі (Л)+ цитоплазматичної РНК супроводжує реакцію відповіді печінки на НО на всьому її протязі і реакцію відповіді на ЧГЕ, починаючи з 6 год після операції (Рис.7). Ці результати узгоджуються з даними інших лабораторій відносно підвищення транскрипції послідовностей, які часто повторюються, у час реакції на стрес, викликаної різними факторами.

Питання відносно функції В2 транскриптів під час цих реакцій в організмі залишається поки що відкритим.

На ранніх етапах після ЧГЕ і НО існує подібність в експресії сумарних В2 послідовностей ДНК і індивідуального В2-вмісного гена цитохрому Р450ІІЕ1 [Дувкоу, 1983]. Однак, кількісно зміни зі сторони В2-вмісних РНК виражені в більшій мірі, ніж зі сторони РНК цитохрому Р450ІІЕ1, що є основою для припущення про участь інших В2-вмісних молекул РНК в знайдених змінах, а також їх визначальної ролі в подальшому підвищенні відносного вмісту поліаденільованих В2-вмісних молекул РНК на протязі реакцій відповіді на ЧГЕ і НО. До них належать РНК, які кодують О і Ь білки першого класу основного комплексу гістосумісності рСгеэз, 1984]. Виключити участь поки неідентифікованих (якщо такі, взагалі, існують) В2-вмісних РНК в знайдених змінах також не можна.

Паралельні зміни вмісту поліаденільованих В2-вмісних РНК і с-Гоз транскриптів після НО і ЧГЕ, виявлені в даній роботі, та позитивна кореляція між експресією гена с-Роб та О і Ь генів ОКГ, відмічена в інших системах [Но\усгой, 1993], свідчать про можливу роль с-Роб як регулятора цих генів та підтверджують наші припущення.

На основі представлених даних підвищену експресію здогадуваних генів гістосумісності після НО і ЧГЕ можна пов’язати з реакцією на травму і станом готовності системи клітинного імунітету до захисту.

Рис.б.Блот-гібридизація полі (лу цитоплазматичної (1-3) та ядерної (4-6) РНК регенеруючої печінки з Р32 міченим В2 зондом; а - 28Б, б - 18Б, в - 58 РНК.

д 350 І 300 §- 250 в 200

се

S’ 150

Ь іоо

п 50

0 10 20 30 40

час після операції (год)

Рис.7. Вміст В2 транскриптів в полі(А)+ цитоплазматичній РНК печінки щурів після ЧГЕ і НО в порівнянні з їх вмістом у інтактних тварин.

ВИСНОВКИ

1. Удосконалено метод виділення ядерної і цитоплазматичної РНК з одного і того ж зразка тканини печінки. Розроблена система вакуумного перенесення РНК з агарозного гелю на сорбуючі мембрани. Гібридизацією РНК з радіоактивноміченою кДНК продемонстровано ефективність запропонованих модифікацій для аналізу розмірів і розподілу транскриптів між ядром і цитоплазмою.

2. Встановлено, що вміст і розподіл транскриптів індивідуальних генів між ядром і цитоплазмою змінюється в процесі регенерації і відповіді печінки на травму. Коливання відносного вмісту індивідуальних транскриптів за амплітудою в полі (лу цитоплазматичній РНК більші, ніж у ядерній РНК. За спрямованістю зміни вмісту транскриптів в цитоплазмі і в ядрі можуть бути однонаправленими, протилежнонаправленими або відбуватись в цитоплазмі на фоні сталого вмісту індивідуальної РНК в ядрі.

3. В процесі регенерації печінки виявлені зміни в полі(Л)* цитоплазматичній РНК, які характерні для відповіді на травму: підвищення вмісту транскриптів с-Роб і ЯФГ-1а та зниження вмісту транскриптів Р450ІІЕ1 в інтервалі 6-24 год після ЧГЕ.

4. В процесі регенерації печінки виявлені зміни в полі (Ау цитоплазматичній РНК, які віднесені до компенсаторних реакцій: підвищення вмісту транскриптів с-тус в С, і С2 періодах першого клітинного циклу гепатоцитів, властиве проліферації, та підвищення вмісту транскриптів Р450ІІЕ1 і ЯФГ-1а через 0,25-6 год після ЧГЕ, пов’язане з посиленням деяких тканинноспецифічних функцій.

5. Продемонстровано, що для регенераційного процесу і відповіді печінки на травму характерне зростання вмісту високомолекулярних РНК, до складу яких входять В2 транскрипти. З’ясовано, що на ранніх етапах обох процесів воно зумовлене підвищенням вмісту РНК цитохрому Р450ІІЕ1, яка містить В2 транскрипт.

СПИСОК ПРАЦЬ ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Оболенская М.Ю. Прима В.И., Клочко Т.А., Патер Л.В., Шоколенко И.Н., Платонов О.М. Циклозависимая экспрессия гена, кодирующего В 2 мРНКх // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 1991. -N6,- С.30-32.

2. Патер Л.В., Хрипунов В.А., Прима В.И. Модификация методов выделения РНК с гуанидинийтиоцианатом и вакуумный перенос на мембраны улучшают возможности анализа высокомолекулярных транскриптов из клеток животных // Биополимеры и клетка. - 1991. - 7, N1.- С.70-75.

3. Прима В.І., Мартиненко О.І., Патер Л.В., Вагін Ю.В. Перебудови ДНК у регенеруючій печінці, виявлені за допомогою “геномної дактилоскопії” // Биополимеры и клетка. - 1993.-9. N3.-C.106-108.

4. Патер Л.В., Хрипунов В.А., Квітницька Г.Б., Прима В.І., Оболенська М.Ю., Платонов О.М. Експресія протоонкогенів c-myc і c-fos протягом першого клітинного циклу в регенеруючій печінці щурів // Биополимеры и клетка. - 1994. -10, N2. -С. 57-61.

5. Obolenskaya М., Pater L., Sazonova L., Elskaya A., Decker K. Kupffer Cells and Liver Regeneration. In: Cells of the Hepatic Sinusoid. Eds.:E.Wisse, D.L.Knook, C.Balabaud.CE Leiden, The Netherlands. 1997.-6.-P.340-343.

АНОТАЦІЇ

Новікова Л. В. Експресія генів транскрипційних факторів і В2 послідовностей ДНК в регенеруючій печінці щурів. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.03 - молекулярна біологія. - Інститут молекулярної біології і генетики НАН України, Київ, 1998.

Дисертацію присвячено питанням експресії генів, які кодують загальноклітинні (c-fos, c-myc) і тканинноспецифічний (ЯФГ-Іа) транскрипційні фактори та експресії В2 послідовностей ДНК в регенеруючій печінці щурів. Показано, що розподіл транскриптів індивідуальних генів між ядром і цитоплазмою змінюється в ході регенераційного процесу. В регенеруючій печінці виявлені особливості експресії генів c-fos, ЯФГ-Ja і цитохрому Р450ІІЕ1, характерні для відповіді на травму; гена c-myc, зумовлені його участю в проліферації, та генів цитохрому Р450ІІЕ1 і ЯФГ-1а, пов’язані з посиленим виконанням печінкою специфічних функцій на ранньому етапі регенерації. Продемонстровано, що регенеруюча печінка характеризується підвищеиим вмістом високомолекулярних РНК, до складу яких входять В2 транскрипти.

Ключові слова: регенерація печінки, ядерна РНК, цитоплазматична РНК, c-fos, c-myc, ЯФГ-1 а, цитохром Р450ІІЕ1, В2 послідовності.

Новикова JI.B. Экспрессия генов транскрипционных факторов и В2 последовательностей ДНК в регенерирующей печени крыс,- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.03 - молекулярная биология. - Институт молекулярной биологии и генетики НАН Украины, Киев, 1998.

Диссертация посвящена вопросам экспрессии генов, кодирующих общеклеточные (c-fos, c-myc) и тканеспецифический (ЯФГ1-а) транскрипционные факторы, и экспрессии В2 последовательностей ДНК в регенерирующей печени крыс. Показано, что распределение транскриптов индивидуальных генов между ядром и цитоплазмой изменяется в ходе регенерационного процесса. В регенерирующей печени выявлены особенности экспрессии генов c-fos, ЯФГ-1а и цитохрома P450IIE1, характерные для ответа на травму; гена с-тус, обусловленные его участием в пролиферации; генов цитохрома P450IIE1 и ЯФГ-1а, связанные с усиленным выполнением печенью специфических функций на раннем этапе регенерации. Продемонстрировано, что регенерирующая печень характеризуется повышенным содержанием высокомолекулярных РНК, в состав которых входят В2 транскрипты.

Ключевые слова: регенерация печени, ядерная РНК,

цитоплазматическая РНК, c-fos, c-myc, ЯФГ-1а, цитохром P450IIE1, В2 последовательности.

Novikova L.V. Transcriptional factors genes and B2 DNA sequences expression in regenerating liver of rats. - Manuscript.

Thesis for candidate’s degree on speciality 03.00.03 - molecular biology. - The Institute of Molecular Biology and Genetics of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 1998.

The dissertation is devoted to investigation of gene expression coding ubiquitous (c-fos, c-myc) and tissue - specific (HNF -la) transcriptional factors and B2 DNA sequences expression in regenerating rat liver. It has been shown that during regenerative process a distribution of individual gene transcripts between nucleus and cytoplasm changes. In regenerating liver c-fos, HNF-la and cytochrome P450IIE1 cytoplasmic RNAs reveal changes specific to a response for trauma; c-myc RNA reveals changes pointing to its participation in proliferation; increased relative amount of P450IIE-1 and HNF-la RNA at the early stage of regeneration corresponds with the increased functional demand to the restricted amount of the liver. It has been demonstrated that regenerating liver is characterized by increased content of high-molecular weight RNA containing transcripts from B2 sequences.

Key words: liver regeneration, nuclear RNA, cytoplasm RNA, c-fos, c-myc, HNF-la, cytochrome P450IIE1, B2 sequences.