Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Экспериментальная разработка и клиническое применение ксеногенной трансплантации клеток Лейдига для лечения тесотерондефицитных состояний у мужчин

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Экспериментальная разработка и клиническое применение ксеногенной трансплантации клеток Лейдига для лечения тесотерондефицитных состояний у мужчин"

На правах рукопиЩщ^

РГБ ОД

2 о НОЯ 7ППП

ЗЫБИН ДМИТРИЙ ВЛАДИМИРОВИЧ

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ РАЗРАБОТКА И КЛИНИЧЕСКОЕ ПРИМЕНЕНИЕ КСЕНОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ КЛЕТОК ЛЕЙДИГА ДЛЯ ЛЕЧЕНИЯ ТЕСТОСТЕРОНДЕФИЦИТНЫХ СОСТОЯНИЙ У МУЖЧИН

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

Диссертации иа соискание ученой степени кандидата биологических наук

Москва 2000

Работа выполнена в Московском научно-исследовательском институ медицинской экологии

Научный руководитель:

доктор биологических наук Катуков В.Ю.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор Лобанова Е.Г. доктор биологических наук, профессор Киселев В.И.

Ведущая организация:

Московский государственный медико-стоматологический университет

Защита состоится «_»_2000 г. на заседании Диссертационного

совета Д.171.02.01. при Центре медико-биологических и экологических проблем РАЕН по адресу: 113149 Москва, Симферопольский бульвар, 8.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Центра медико-биологических и экологических проблем

Автореферат разослан «_»_2000 г.

Ученый секретарь Диссертационного совета Д.171.02.01. кандидат биологических наук В.В. Отраднова

н

)

Общая характеристика работы Актуальность проблемы. Спектр нарушений мужской половой системы включает в основном крипторхизм, миоплазию полового члена, гипоплазию и аплазию семенных пузырьков, предстательной железы, моно- и анорхизм, различные варианты гипоспадии. Пороки развития мужской половой системы сопроождается тестостерондефицитными состояниями и приводят к бесплодию. Наряду с пороками развития инфертильное состояние мужчин связано с воспалительными заболеваниями половых органов, влиянием вредных факторов внешней среды, аллергическими заболеваниями, бесконтрольным и широким применением лекарственных средств, злоупотреблением алкоголем и никотином и пр. Бесплодие является одной из ключевых проблем андрологии. Проблема мужского бесплодия приобретает в последние годы особую медицинскую и социальную значимость, так как удельный вес бесплодных браков в мире достигает 15%, половина из которых обусловлена бесплодием у мужчин.

Полиэтилогичность тестостерондефицитных состоянияний и мужского бесплодия, сложность развития заболеваний, функциональная взаимосвязь мужских гонад со всеми системами и органами создают большие трудности в разработке адекватных методов лечения нарушений сперматогенеза.

Интерстициальные клетки Лейдига (KJI) семенников синтезируют андрогены, с чем связано их влияние на дифференцировку и функцию клеток мужской половой системы. Нарушение сперматогенеза, многие заболевания яичек и нарушение репродуктивной функции можно рассматривать как следствие нарушения активности KJI. Поэтому чрезвычайно актуальным является разработка методов культивирования и способов трансплантации KJI для лечения тестостерондефицитных состоянияний и бесплодия. Цели и задачи исследования. Целями настоящей работы было:

1. Изучить возможность трансплантации без иммуносупрессорной терапии ксеногенных KJI экспериментальным животным;

2. Разработать оптимальные методы трансплантации КЛ;

3. Изучить эффективность трансплантации для леченю тестостерондефицитных состоянияний у экспериментальных животных;

4. Использовать полученные экспериментальные результаты для леченш мужчин, страдающих тестостерондефицитными состояниями и

бесплодием.

При этом поставлены следующие задачи исследования:

1. разработать методы забора и хранения трансплантируемого материала;

2. разработать способы хирургической трансплантации КЛ;

3. изучить условия культивирования и их влияние на биологическук активность КЛ;

4. осуществить ксеногенную трансплантацию КЛ экспериментальные животным;

5. осуществить наблюдение за эффективностью трансплантации;

6. осуществить трансплантацию КЛ мужчинам, страдающие тестостерондефицитным состоянием и бесплодием;

7. осуществить наблюдение за успешностью лечения мужчин с помощьк трансплантации КЛ.

Научная новизна исследования. Впервые была изучена возможность трансплантации ксеногенных КЛ в иммунопривилегированный орган -семенник экспериментальных животных. У животных-реципиентон травматизацией семенников было предварительно вызвано тестостерондефицитное состоянияние. Впервые осуществлено лечение мужчин, страдающих тестостерондефицитным состояниянием и инфертильных пересадкой ксеногенных КЛ в семенник.

Практическая значимость исследований. Разработаны методы получения хранения и культивирования КЛ. Изучена функциональная активность КЛ £ зависимости от условий получения материала для трансплантации и условий

культивирования. Разработаны способы трансплантации КЛ в семенник животных-реципиентов. Изучено влияние операции транплантации на преодоление тестостерондефицитного состоянияния у экспериментальных животных. Осуществлено успешное лечение инфертильных мужчин трансплантацией ксеногенных КЛ без применения иммуносупрессорной терапии. Предложенное лечение мужского тестостерондефицитного состояния и бесплодия имеет преимущества по сравнению с гормонотерапией, поскольку больные не нуждаются в постоянном введении извне андрогенов или фармпрепаратов андрогенного действия. Кроме того, длительное введение андрогенов при лечении часто сопровождается повреждением печени.

Ксеногенная трансплантация имеет преимущества по сравнению с аллогенной трансплантацией, так как получение материала для трансплантации не имеет определенных ограничений. Возможно получать материал для трансплантации в нужном количестве и у животных наиболее подходящего возраста.

Таким образом, разработанный метод ксеногенной трансплантации КЛ в семенник мужчин может быть широко внедрен в практическую медицину. Апробация работы

Апробация диссертации проходила на совместном заседании научного коллоквиума Центра медико-биологических и экологических проблем и Московского научно-исследовательского института медицинской экологии. Структура и объем работы Диссертационная работа содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты работы и их обсуждение, выводы и список цитируемой литературы.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.

Содержание работы.

Материалы и методы исследования.

Донорским материалом для последующей трансплантации реципиента в эксперименте и клинике служили тестикулы млекопитающих: эмбрионе телят, новорожденных поросят, особей африканской зеленой мартышк пубертатного периода жизни. По литературным данным, в эти периоды жизн млекопитающих наиболее активно идет выроботка КЛ андрогенов. Тестикул! изъятые у животных с соблюдением правил асептики и антисептик1 доставляли в лабораторию культивирования тканей и органов.

Получение суспензии клеток тестикул для культивирования.

Извлеченные из мошонки тестикулы дважды промывали растворо Хенкса, с помощью стерильного скальпеля освобождали от оболоче измельчали и подвергали действию дезагрегирующих агентов (либо 0.25' трипсин в растворе Хенкса, либо 0.02% версен в 0.9% ЫаС1, либо раствс коллагеназы - 20 мг в 100 мл раствора Хенкса) в течение 5-10 мин при 37 °( Полученную суспензию помещали в охлажденный до 4°С раствор Хенкс центрифугировали при 1000 об/мин в течение 10 мин в стерильных флакона: Надосадок сливали, освобождаясь таким образом от дезагригирующих агенто а в клеточную массу добавляли охлажденную до 4°С питательную среду 199 20% лактальбумина и 2% сыворотки крупного рогатого скота (СКРС).

Определение количества и жизнеспособности клеток

Подсчет количества клеток и их жизнеспособности проводили п| помощи светового микроскопа (рабочее увеличение 10x12) с использование счетной камеры Горяева и красителя - трипанового синего. Раствор красите]

10.5% готовили на стерильном 0.85% растворе NaCl. Пробу суспензии клеток, объемом 100 мкл, стерильно отбирали в ламинарном шкафу, помещали во флаконы, вместимостью 5-10 мл, пипетировали и 10 мкл переносили в одну из лунок стандартной культуральной планшетки (48- или 96-луночной), добавляли 10 мкл раствора красителя, тщательно (40-50 раз) пипетировали, заполняли обе счетные камеры. Подсчет клеток вели последовательно в обеих счетных камерах, по всей площади каждой камеры. Считали все клетки в поле зрения: живые (неокрашенные) поврежденные (синего цвета). Результаты подсчитывали следующим образом:

1. X = X] +Х2 где: X - общее количество клеток в счетной камере;

X] - количество живых клеток;

Х2 - количество мертвых клеток

где: Х3- концентрация клеток в исследуемой суспензии, х10б кл/мл

3 Р = ^--100 X

где: Р - % живых клеток в пробе.

Пригодным для культивирования либо после культивирования пригодным для трансплантации считали тот образец, где уровень жизнеспособных клеток оказывался не менее 80-85%.

Индекс пролиферации (Ип) определяли как отношение количества клеток осле определенного времени культивирования к количеству клеток, взятых для посева.

Получение чистой фракции клеток Лейдига.

Сырой препарат KJI очищали путем центрифугирования в непрерывном градиенте перколла. Стартовый раствор получали смешиванием 9 частей перколла и 11 частей (v/v) сконцентрированной в 1,8 раза среды 199,

содержащей 0,1% бычьего сывороточного альбумина (БСА) и 0,1°/ пенициллина (100 ед/мл) или канамицина в той же концентрации. Формировал: непрерывный градиент: 35 мл стартового раствора помещали в центрифужны: стакан, объемом 50 мл, и центрифугировали при 20000g 60 мин при 4°С. Дл разделения клеток на верхний уровень градиента наносили 2 мл клеточно суспензии с концентрацией жизнеспособных клеток 0,5'108 кл/мл центрифугировали при 800£ в течение 20 мин при 4°С. Верхние 27 мл градиент не содержали КЛ. Следующие 3 мл отбирали, переносили в стерильну! центрифужную пробирку, содержащую 9 мл среды 199 с 0,1% БСА, 100 ед/м пенициллина, 100 ед/мл стрептомицина, 25 мл НЕРЕБ. Центрифугировали 1 мин при 150§ и комнатной температуре. Супернатант отбрасывали; осадо промывали 10 мл среды для культивирования и центрифугировали 5 мин пр 300§. Клетки ресуспендировали, проводили морфологическую идентификаци; и испоьзовали для культивирования.

Морфологическая идентификация клеток Лейдига.

Идентификацию КЛ проводили путем их окрашивания, возникающего результате реакции, катализируемой специфическим для КЛ ферментом - 3| гидроксистероиддегидрогеназой (субстрат - дегидроэпиандростерон) присутствиии тетранитросинего тетразолия. 1 мл клеточной суспенз! инкубировали при 37°С в течение 100 мин с 0,3 мл окрашивающего раствор содержащего 0,07 М фосфатный буфер, рН 7,2; 0,3 мл никотинамида; 1,8 г никотинамиддинкулеотида; 0,45 мг тетранитросинего тетразолия и 0,3 г дегидроэпиандростерона. Затем подсчитывали в камере Горяева под световь микроскопом количество окрашенных клеток и общее число клетс определяли долю (в %) клеток, в цитоплазме которых обнаружены син: гранулы формазана (КЛ). При содержании в суспензии не менее 70 окрашенных клеток, суспензию использовали для культивирования КЛ.

Культивирование клеток Лейдига.

При посеве 250-400 тыс. клеток помещал в 100 мл питательной среды 199 и инкубировали в течение 8-12 часов в термостате при 37°С. Через 8-12 часов сливали среду, содержащую неприкрепившиеся клетки, элементы соединительной ткани, крови и др. компоненты. В культивационные матрасы добавляли свежую питательную среду 199 и снова помещали их в термостат. Следующие замены питательной среды проводили через каждые 24-48 часов. Проводили микроскопический контроль образовавшегося монослоя клеток и контроль питательной среды, чтобы исключить контаминацию клеточной культуры микробной, грибковой флорой и микоплазмой. Для предотвращения контаминаций использовали предварительно прогретую в течение 30 мин (56°С) СКРС и добавляли в ростовую среду гентамицин (1,6 мг/мл), канамицин или линкомицин (1,0 мг/мл).

Оценка возможных контаминаций клеточных культур

Вожможную контаминацию клеточной культуры микробной и грибковой флоры оценивали при помощи микроскопии монослоя клеток (световой микроскоп).

Для обнаружения микоплазменной контаминации проводили культивирование клеток на покровном стекле. Покровные стекла с монослоем клеток помещали на 1 час в охлажденный 70% (v/v) этанол для фиксации, высушивали, наносили на стекло рабочий раствор оливомицина (20 мг на 1 мл с 20 мкмоль Mg 2+ в виде MgCl2 и MgSo4), который использовали в качестве флюорохрома. Покровное стекло с оливомицином помещали в темное место на 1 час, промывали дистиллированой водой 1-2 мин, помещали на предметное стекло в раствор глицерина в воде в соотношении 1:1 (v/v). Просматривали препарат в люминисцентном микроскопе (при увеличении хЮ окуляр х90

объектив с масляной иммерсией или х70 объектив с водной иммерсией I фильтрами Ф.С.1-4, С.С. 15-2, Б.С. 8-2). Микоплазмы выглядят как однородн» окрашенные часто зеленым цветом образования сферической, элипсовидно] формы, выявляются преимущественно в цитоплазме клеток и мсжклеточно? пространстве.

Хранение клеток

После культивирования клетки помещали на хранение. Для этоп сливали питательную среду, монослой обрабатывали трипсин-версеново] смесью (в концентрациях, как указано ранее, в соотношении 1:2 по объему) течение 2-5 мин. Матрасы с трипсин-версеновой смесью выдерживали при 37°( до появления «окон» - свободных участков в монослое, заметных визуальнс Остатки монослоя и открепившиеся клетки смывали питательной средой ¡9е тщательно пипетируя, добиваясь отсутствия агрегатов клеток, но сохраняя и целостность. Состояние клеток оценивали микроскопически. Полученну! суспензию центрифугировали в течение 10 мин (1000 об/мин), надосадо сливали, к осадку клеток добавляли криопротектор с питательной средо (глицерин 10%, диметилсульфоксид 5%), помещали в стерильны закрывающиеся флаконы, оставляли флаконы в течение 30 мин в холодильник при +4°С, далее хранили при -70°С.

Использование замороженных клеточных культур

При использовании замороженных клеточных культур в любое время с начала криоконсервации от 1 до 22 месяцев флаконы с клеточной культуро размораживали в водяной бане, постепенно повышая температуру бани. Поел оттаивания клетки промывали питательной средой, центрифугировали (10 мш 1000 об/мин) и удаляли надосадочную жидкость.

Оценив жизнеспособность клеток и убедившись в отсутстви контаминантов, готовили клетки для трансплантации. В зависимости с поставленной цели, употребляли соответствующее количество клеток в разнь:

объемах питательной среды 199. Плотность клеток в питательной среде оценивали, подсчитывая их количество в 1 мл среды. Подготовленные таким образом трансплантаты помещали в стерильные флаконы с воздушным пространством, превышающим объем клеточной суспензии минимум в 5 раз. Невыполнение этих условий приводит к гибели большого числа клеток.

Трансплантация клеток Лейдига.

В экспериментах были использованы в качестве животных-реципиентов половозрелые крысы-самцы линии Вистар, весом 150-200 г. После двухнедельного карантина крысы содержались в группах по 4 особи без самок. Перед трансплантацией у животных вызывали эпидидимоорхит путем травматизации паренхимы яичка и придатка препараторской иглой. Возникший посттравматический двусторонний эпидидимоорхит приводил к атрофии придатка, лизису паренхимы яичка, к снижению содержания тестостерона в сыворотке крови и, как следствие, к бесплодию. Для купирования воспалительного процесса животным проводили курс антибиотикотерапии (в/м инъекции гентамицина 8 ед/кг веса) в течение пяти дней. После исчезновения симптомов эпидидимоорхита опытным животным проводили трансплантацию культур КЛ. В каждой группе (опытных и контрольной) было по 20 особей. Объем вводимой суспензии — 0,5 мл, содержание клеток - 2, 4, 8 млн в 1 мл питательной среды. Контрольным животным вводили 0,5 мл питательной среды. Трансплантацию проводили в стерильных условиях (в клинике - в условиях операционной) либо культивируемыми клеточными культурами, либо реконсервируемыми. Под белочную оболочку и в область придаточной связки реципиенту в оба яичка инъекционной иглой шприца вводили клеточную суспензию.

Определение тестостерона в сыворотке крови

Тестостерон определяли радиоиммунологическим методом.

Результаты исследования и их обсуждение

Оптимизация условий культивирования и хранения клеток Лейдига

Результаты морфологических исследований показали, что при использовании градиента перколла удается получить клетки из семенников млекопитающих, содержащие 65-70% КЛ, которые были использованы для культивирования КЛ. Оптимизацию условий культивирования КЛ в монослое проводили по таким параметрам, как посевная концентрация клеток, состав питательной среды, продолжительность культивирования. Для трансплантации необходимо было получить достаточное количество (в 1 мл) функционально активных (синтезирующих тестостерон) КЛ. В качестве критериев были выбраны: количество выросших в 1 мл клеток (продуктивность), доля жизнеспособных клеток в культуре, концентрация тестостерона в культуральной жидкости. Найдено, что оптимальные значения посевных концентраций клеток находятся в диапазоне (3-4)-105 клеток в 1 мл.

Изучали зависимость роста и тестеронсинтезирующей способности КЛ от содержания в среде 199 гидролизатов ряда белков, сыворотки крови телят, концентрации аминокислот и витаминов. В результате исследований получена оптимизированная пропись ростовой среды (таблица 1).

Из литературных данных известно, что наибольшей андрогенсинтезирующей способностью обладают КЛ эмбрионов и новорожденных, что подтвердилось и нашими исследованиями. При культвировании, как было показано во многих работах, андрогенсинтезирующая способность КЛ уменьшается. В наших опытах клетки сохраняли функциональную активность, как и наибольшую способность к пролиферации, в течение 2-5 дней культивирования (1-3 смены среды), при более длительном культивировании уровень тестостерона в культуральной жидкости и индекс пролиферации уменьшаются (рис. 1, 2, 3).

Таблица 1

Оптимизированный состав питательной среды при культивировании КЛ

Компонент Содержание мг/л Компонент Содержание мг/л

СаС12-2Н20 33,22 L-acnapaniH-H20 15.01

CuS04-5H20 0,00249 L-аспарагиповая кислота 13,30

FCS04-7II20 0,834 Ь-цистеинНС1 Н20 35,12

KCl 223,6 L-глутаминовая кислота 14,70

КН2РО4 - L-глугампн 146,00

MgCl2-6II20 57,22 глицин 7,50

MgS04 - L-гистндин HCl Н20 20,96

NaCl 7599,0 L-изолсйцин 3,940

Na2HP04 142,04 L-лейцин 13,10

ZnS047H20 0,863 L-лизин HCl 36,5

D-глюкоза 180,0 L-метионин 4,48

Гипоксантин Na-соль 4,770 L-фенилалании 4,96

Линолсвая кислота 0,084 L-пролин 34,5

Линоевая кислота 0,210 L-серин 10,5

Феноловый красный 1,20 L-треонин 11,9

I Путресцин-2НС1 0,161 L-триптофан 2,04

Пируват Na 110,0 Витамин В¡2 1,36

Тимидин 0,73 L-ннозитол 18,0

L-аланин 8,90 Ниацинамид 0,037

L-apniiiiiH'HCI 211,0 Пиридоксин HCl 0,062

L-тирозин (дипатривая Рибофлавин 0,038

соль) 7,78 Фолиевая кислота Тиамин 1,3

L-валин 11,70 HCl 0,34

Биотип 0,00730 Лактальбумин 1,0 г/л

I D-Са-пантотенат 0,480 Сыворотка крови телят 10% v/v

Холип (хлорид) 13,96

Рис. 1. Индекс пролиферации и содержание тестестерона (нмоль/мл) культуральной жидкости при культивировании в монослое клеток Лейдш зеленой африканской мартышки в зависимости от времени культивировали (М- смена среды, проводимая через 24-48 часов).

Т/Ип

-Количество тестостерона -Индекс пролиферации

Рис.2. Индекс пролиферации и содержание тестестерона (нмоль/мл) ] культуральной жидкости при культивировании в монослое клеток Лейдип новорожденных поросят в зависимости от времени культивировани! (обозначения, как на рис. 1).

Рис.3. Индекс пролиферации и содержание тестестерона (нмоль/мл) в кулыуральной жидкости при культивировании в монослое клеток Лейдига эмбриональных телят в зависимости от времени культивирования (обозначения, как на рис. 1).

Процент жизнеспособных клеток был также высоким в первые 5-6 дней культивирования (98%) далее снижался, однако сохранялся на высоком уровне (80%) до конца культивирования. При подборе условий криоконсервации изучали жизнеспособность и функциональную активность клеток в зависимости от режима замораживания (скорость замораживания и оттаивания) и концентрации криопротекторов (глицерина и диметилсульфоксида). Наблюдения за культурой после криоконсервации показали, что при выбранных условиях хранения (см. раздел «Материалы и методы») жизнеспособность клеток сохраняется на уровне 88-96% в течение 18-22 месяцев. Более длительное хранение клеточных культур вызывает как снижение количества жизнеспособных клеток, так и уменьшение их андрогенсинтезирующей способности.

В результате оценки жизнеспособности, способности к пролиферации и функциональной активности КЛ при культивировании, хранении при низкой

температуре (-70°С) и реконсервации были отобраны для трансплантац следующие клеточные культуры:

1. первичные культуры КЛ семенников африканской зелен мартышки (особи пубертатного возраста), выдержавшие не более 1 сме] питательной среды (24-48 час);

2. культуры КЛ эмбриональных телят, выдержавшие не более 3 см

культуральной среды;

3. культуры КЛ новорожденных поросят, выдержавшие не более

смен культуральной среды.

Ксенотрансплантация КЛ экспериментальным животным

Органом-мишенью для ксенотрансплантации служили тести ку> реципиентов, не только из-за универсальности гормонпродуцирующих КЛ д всех млекопитающих, но и из-за принадлежности семенников млекопитающ] к иммунопривилегированным органам наряду с тканью головного мозга передней камерой глаза, что позволило отказаться от иммуносупрессор» терапии. Показателем воздействия ксенотрансплантации является урове: тестостерона сыворотки крови животных-реципиентов (крысы линии Виста] который измерялся у экспериментальных и контрольных животных.

Как видно из табл. 2, при трансплантации КЛ зеленой африканец мартышки уровень тестостерона у крыс достигает 5-6 нмоль в 1 мл сыворот! крови при трансплантации 8 млн/мл КЛ, причем максимальное содержан: гормона наблюдается через 2-3 месяца после трансплантации. При пересад КЛ эмбриональных телят уровень тестостерона в сыворотке крови животнь реципиентов достигает 7 нмоль/мл через 2-3 месяца после трансплантации 4 млн/мл КЛ (табл.3). Аналогичные результаты получены и при трансплантац! КЛ новорожденных поросят (табл. 4).

Таблица 2

Содержание тестостерона (средние значения) в сыворотке крови крыс линии Вистар после трансплантации КЛ африканской зеленой мартышки (по 20 особей в каждой группе; Т-содержание тестостерона в нмоль/мл, 0-120 - сутки после трансплантации)

Таблица 3

Содержание тестостерона (средние значения) в сыворотке крови крыс линии Вистар после трансплантации КЛ эмбриональных телят (по 20 особей в каждой группе; Т-содержание тестостерона в нмоль/мл, 0-120 - сутки после трансплантации)

Таблиц;

Содержание тестостерона (средние значения) в сыворотке крови кр линии Вистар после трансплантации КЛ новорожненных поросят (по 20 особ в каждой группе; Т-содержание тестостерона в нмоль/мл, 0-120 - сутки пос трансплантации)

При гистологическом исследовании тестикул животных реципиент после трансплантации (90-120 дней) было выявлено большое количест жизнеспособных КЛ, воспалительных и других изменений ткани яш обнаружено не было.

Ранее попытки пересадить тестикулярную ткань как свободн трансплантат были безуспешны. Описаны удачные эксперимен изотрансплантации суспензии тестикулярной ткани и выделенных кастрированным животным-реципиентам. Трансплантация приводила нормализации прироста веса тела, развитию вторичных половых признак увеличению содержания тестостерона в сыворотке крови животш реципиентов. Известны также эксперименты и попытки применения в клин] аллогенной трансплантации клеток семенников, однако ксеноген: трансплантация КЛ нами разработана впервые.

Применение ксеиогениой трансплантации клеток Лейдига для лечения тестостерондефицитных состояний у мужчин.

Тестостерондефицитные состояния у мужчин наблюдаются при пороках развития мужской половой сферы, при некоторых эндокринных растройствах, заболеваниях гениталий различной этиологии.

Трансплантация КЛ эмбрионов телят (8 млн клеток в 1 мл среды) под белочную оболочку яичка была проведена мужчине 35 лет, страдающему олигоспермией и бесплодием в течение по крайней мере 7 лет. До хирургического вмешательства пациент лечился традиционно. Постоперационных осложнений не было. Изучение сперматограмм показало значительное улучшение функции сперматогенеза.

Таблица 5

Содержание тестостерона в сыворотке крови больного до и после трансплантации КЛ.

Время наблюдения, дни До операции " 20 "7 60 240 360

после трансплантации

Количество тестостерона, нмоль/л 8.6 16.2 1 21.0 24 26.0

Группе мужчин (15 человек) в возрасте от 21 года до 56 лет, страдающим секреторным бесплодием (первичный и вторичный гипогонадизм, микропения), была проведена ксенотрансплантация КЛ (8млн клеток в 1 мл среды). Наблюдали за данной группой пациентов в течение 14 месяцев. Одновременно наблюдали за группой пациентов с аналогичными заболеваниями, которых лечили согласно традиционным схемам лечения

бесплодия. Содержание тестостерона в сыворотке крови у последней груга пациентов колебалось в пределах 8-10 нмоль/л.

Таблиц;

Содержание тестостерона в сыворотке крови 15 больных муж1« страдающих бесплодием, после трансплантации клеток Лейдига (8млн клето] 1 мл среды

Время наблюдения, дни после операции Количество тестостерона, нмоль/л (средние значения)

Контроль сперматограмм также показал значительное улучшен функции сперматогенеза после трансплантации.

Травматизации, атрофии, воспалительного процесса тести* реципиентов не выявлено.

Таким образом, можно считать успешными проведенные операи ксенотрансплантации как со стороны отсутствия каких-либо нежелательн изменений в семенниках реципиентов, так и функциональной активное донорских клеток.

Выводы

1. Разработаны способы выделения и культивирования жизнеспособных, активнопролиферирующих и синтезирующих тестостерон клеток Лейдига животных.

2. Установлено, что культивируемые и выделенные клетки Лейдига, пригодные для трансплантации, возможно подвергать криоконсервации.

3. Разработан метод трансплантации ксеногенных клеток Лейдига под белочную оболочку тестикул реципиентов.

4. Найдено, что ксенотрансплантация клеток Лейдига экспериментальным животным нормализует половую функцию реципиентов.

5. Проведено успешное лечение мужчин, страдающих тестостерондефицитным состоянием, с помощью ксеногенной трансплантации клеток Лейдига

Публикации по теме:

1. Зыбин Д.В., Пригода A.C., Васильев В.И., Акопян A.C., Савицкий С.С. «Способ лечения больных с нарушением мужской половой функции методом трансплантации». Патент РФ №2026643. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 20 января 1995 г.

2. Акопян A.C., Зыбин Д.В., Корякин М.В., Мишиев В.Г. «Способ лечения хронического простатита». Патент РФ №2078590. Зарегистрирован в Гос. реестре изобретений РФ 10 мая 1997 г.

3. Зыбин Д.В., Акопян A.C., Васильев В.И., Сологуб В.К. «Лечение больных с нарушением мужской половой функции с помощью имплпнтации клеток Лейдига». Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии, 1999, №2, с.25-27.

4. Зыбин Д.В., Акопян A.C., Васильев В.И., Корякин М.В., Соло В.К. «Использование клеток Лейдига в лечении хроничесю простатита». Вопросы биологической, медицинской и фармацевтичеа химии,1999, №2, с.23-25.

5. Зыбин Д.В.,Котелевиц А.Г. Северин С.Е., Сологуб В.К. «Спо< культивирования и модификации гетерогенных кле: млекопитающих». Патент РФ №2152800. Зарегистрирован в Гос. реес изобретений РФ 20 июля 2000 г.