Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-микробиологические основы рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-микробиологические основы рекультивации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами"

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ вмега М.В. ЛОМОНОСОВА

О А

ФАКУЛЬТЕТ ПОЧВОВЕДЕНИЯ

На пропах руксяшсп

Дпияяов Зрюш Мардопоашз

ЭКОЛОГО-МИКЮБИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСНОВЫ РЕКУЛЬТИВАЦИИ ПОЧВ, ЗАГРЯЗНЕННЫХ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ

Специальность 03.09.07 - иккробнология

Автореферат диссертации на соисетшэ ученой степени кандидата бйологачзсшх наук

Москва -1996

Работа выполнена на кафедре биологии почв факультета почвоведения Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.

Научный руководитель : доктор биологических наук,

ведущий научный сотрудник В.С. Гузев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Т.В. Коронелли; доктор технических наук, профессор В.В. Бирюков.

Ведущее учреждение: Институт микробиологии РАН

Защита диссертации состоится 1996. в 15 ч 30 мин в

аудитории М-2 на заседании специализированного совета К053.05.86 в МГУ им. М.В.Ломоносова по адресу: 119899 Москва, ГСП, Воробьевы горы, МГУ, факультет почвоведения, Ученый совет.

С диссертацией можно ознакомиться з библиотеке факультета почвоведения МГУ.

Автореферат разослан 1996.

Приглашаем вас принять участие в обсуждении диссертации на заседании специализированного совета по микробиологии н агрохимии в МГУ или прислать отзывы на автореферат в двух экземплярах, заверенные печатью, по адресу: 119899 Москва, Воробьевы горы, МГУ, факультет еачвоведстшя, Ученый совет.

Ученый секретарь специализированного совета, ,

доцент И.П. Бабьева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Аварийные разливы нефти превращают почвы в ехногенные пустыни. Вследствие того, что масштабы нефтяных мрязнений огромны (Пиковскин, 1993; Яблоков, 1995; Shukla, 1990) сключительную важность приобретает проблема рекультивации почв. При том, несмотря на значительные интеллектуальные усилия, финансовые нвестиции и некоторые успехи в области моделирования очистки ефтезагрязненных почв (Мурзаков и др., 1992; Воронин, Старовойтов, 994; Atlas, Bartha, 1992; Chen, 1992) эта проблема по прежнему далека от воего окончательного решения. По нашему мнению, это связано: во-¡ервых, с нечетким пониманием механизмов повреждающего действия :ефти на свойства почвы, а, во-вторых, с недостаточным вниманием к гсобенностям почвы как среды обитания микроорганизмов (Звягинцев, 987; Marshall, 1992), коренным образом отличающим ее от других сред, и грежде всего от воды.

Целью гмстоямего иссждоеатм является разработка теоретических >снов биотехнологии восстановления почв, загрязненных нефтью и [ефтепро дуктаии.

Оаювпые задечп раб&ть/. Исследовать экологические закономерности ювреждающего действия нефти на почвенную микробноту. На их основе, считывая особенности почвы, как среды обитания, оптимизировать >сновные операции биотехнологии рекультивации нефтезагрязнсшшх почв хутем лабораторного моделирования.

Научная новтшл, Установлено, что негативные последствия нефтяного ¡агрязнсния почвы в большей степе?ш связаны с действием тяжелых ¡зрахций нефти. Последние, увеличивая гидрофобность почвы, нарушают ее юдиый режим, что и лимитирует активность почвенной биоты.

Впервые экспериментально обнаружена зависимость, имеющая ярю выраженный максимум, темпов утилизации углеводородов нефти в почв от интенсивности процесса потребления в ней углеводов, и предлохсе! вероятный механизм этого эффекта.

Практическая значимость. Полученные данные о негативны: последствиях применения поверхносто-актавных веществ на первы: этапах рекультивации нефтезагрязненных почв (ингибнросаин потребления углеводородов и стимулирование денитрификации) должнь учитываться при использовании ПАВ в биотехнологии очиспа нефтезагрязненных почв.

Разработанные способы оценки эффективности биопрепаратов, могу быть использованы для лабораторного испытания культу] микроорганизмов, потенциально предназначенных для ш продукции s нефтезагрязненные почвы.

Предложенные методы биоиндихацни состояния нефтезагрязненныз почв и критерии эколого-микробиологнческого нормирования содержали; нефти в почве могут быть использованы при решении природоохранные задач.

Пубтхтут. По теме диссертации опубликовано 4 статьи и тезись докладов.

Jnpofksmm работы. Результаты диссертационной работы бьш доложены на конференции "Биотехнол. защиты окруж. среды" (Лущимо 1994); 3rd German-Russian Workshop Biotcchnol. (Berlin, 1994); J Bcepocc конф. "Актуальн. проблемы теор. и прикл. токсикологии" (Санкт Петербург, 1995), а также на совместном заседании кафедры биологии поче факультета почвоведения МГУ и Российского общества почвоведов (1996).

Qr.pyzsnypa и сйъем реМшз, Материал диссертации изложен на й страницах машинописи, состоит из введения, обзора литературы, описаш«

объектов и методов исследований, четырех глав результатов собственных юследований, двух глав обсуждения результатов и выводов. Работа ишюстрирована рисунками /У таблицами. Список использованной нтературы включает>Йнаименования, из иностранных языках.

Автор выражает искреннюю благодарность профессору Д.Х. [оджаеву, к.б.н. И.С. Куличевской, к.б.н. C.B. Левину, к.б.н. Л.В. Лысгк и .б.н. А,Л. Степанову за консультации и содействие в работе.

Работа выполнена при финансовой поддержке ГНТП России Новейшие методы биоинженерии", основное направление "Биотехнология ахциты окружающей среды" и Российского фонда фундаментальных сследований (код проекта 96-04-48332).

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объекты исследования. В работе использовали образцы гумусового оризонта (5-25 см) четырех почв следующих зональных типов:

модельной дерново-подзолистой средиесуппошстой под многолетними ранами, отобранные на Почвенном стационаре МГУ в сентябре 1993 года;

типичного чернозема тяжелосуглинистого, отобранные в заповеднике Каменная степь" Воронежской области в мае 1992 года;

выщелоченного чернозема малогумусного и легаосуглкнистого под гменем, отобранные в ноябре 1993 года, в Самарской области в месте азлива нефти, произошедшего о апреле 1990 года вследствие разрыва марочного шва нефтепровода "Дружба".

каштановой тяжел осугянкистой под сенокосными угодьями, гобранные в Волгоградской области в апреле 1991 года;

типичного серозема яегкосупппшстого под хлопчатником, отобранные Самаркандской области в мае 1992 года.

Все образцы высушивали до воздушно-сухого состояния и хранили д использования в лаборатории. Перед экспериментом почву растирали ступке, предварительно удалив крупные корешки, просеивали через сито диаметром отверстий 1 мм, увлажняли до 60% от полной влагоемкости тщательно перемешивали.

Микроорганизмы. Чистые культуры дрожжеподобного гриба Candid lipolytics D40 и устойчивого к нистатину мнцелиальног микроскопического гриба Cladosporium resinac G-1 были получены i лаборатории почвенной микробиологии ИНМИ РАН.

Реагенты, В качестве реагентов использовали сырую нефть (удельны вес 863-865 мг/смЗ, содержание воды 0,15%, солей - 6-7 мг/л, серы 1,4% толуол, бензин марки АИ-92, летнее дизельное топливо, масло М-6з/12 ] "всесезонное" моторное (ГОСТ Î 0541-78 с изм, 1-7) и гудрон. Нефть нефтепродукты получены на Московском нефтеперерабатывающем заво; (Капотня).

Методы таггИоешкии 1. Реакцию почвенной микробиоты на нефташ загрязнение изучали с помощью метода инициированного микробно. сообщества (Guzev et al., 1982). Сущность и отличительные признал данного метода состоят в активации источником энергии (крахыало! развита микроорганизмов на поверхности почвы и последующем изучен! видового состава и структуры активно функционирующего сообщесл микроорганизмов. Инициированное микробное сообщество рассматрива* как реальную модель для оценки изменений почвешюй мшфобиоты щ загрязнении возрастающими дозами нефти и нефтепродуктов. Опит проводили в 9-кратной поаторности.

2. О фитотоксичности почвы, загрязненной поллютантом судили i ссхожесто семян тест-растения. Фитотоксической дозой назва!

:онцентрация поллютанта, при которой прорастает лишь 50% (LD50) семян фесс-салата. Повторность опыта была 6-кратной.

3. Метод целлофановых мембран. Для количественного определения (еллюлозолшпческой активности почвы применяли метод целлофановых «ембран (Гузев и др., 1988). Сущность метода состоит в инструментальном щредслении скорости нарушения механической прочности целлофановой тенки в процессе ее инкубации на поверхности почвенной пластинки. Зпыты проводили в 14-кратной повторности.

4. Определение оптимальной инокуляциотой дозы интродуцснтов. Испытуемые культуры вносили в почву в виде суспензии. Концентрацию сонидий или вегетативных клеток определяли в камере Горяева. Во всех )арнантах опыта в почву вносили нефть (10 объем.%), а также (NH4)2S04 и KL2HPO4 по I мг/г. Наличие и прирост внесенных в почву микроорганизмов эценивали по площади проективного покрытия поверхности почвенной пластинки данным микроорганизмом путем прямого микроскопирования. Цолю интродуцента выражали в процентах. Параллельно измеряли интенсивность дыхания почвы.

5. Попупяционную динамику интродуцентов в почве определяли путем высева на подкисленный сусло-агар через каждые 7 суток инкубации. Учет микроорганизмов в диапазоне низких плотностей проводили на среде, содержащей нистатин (500 ед./мл). В качестве контролен использовали варианты: исходная почва, почва + нефть и почва + интродуцируемый микроорганизм.

6. Определение денитрификациогтой и дыхательной активности почвы проводили на газовом хроматографе "Хроматограф" - модель 3700/4, и спгктрофотометрически с помощью И!С-газоанализатора "Инфралита-4". Повторность - 4-кратная.

7. Численность отдельных групп углеводородокисляющи: микроорганизмов почвы определяли методом посева на агаризованнук среду, рекомендованную для выделения липолитических микроорганизме) (Watanabe et al., 1977), в которой в качестве источника углерода вмесп оливкового масла использовали дизельное топливо. Повторностъ опыта 1 кратная. Типичные колонии микроскопировали, рассеивали ш стандартные питательные среды и полученные чистые культур ь идентифицировали используя руководства (Нестсренко, 1985 Добровольская и др., 1989; Bergey's, 1994).

8. Для сравнительной количественной оценки гидрофобных свойат почвы разработан метод, основанный на определении скорости впитыванш капли дистиллированной воды (объемом 0,02 ил) на выравненно» поверхности насыпного образца воздушно-сухой почвы, предварительно просеянной через сито диаметром 0,25 мм. За действующую доз) поллкжигга (К ]ЫШ1) принята концентрация, при которой время впнтыва; ния капли увеличивалось до I минуты (в контроле - не более 1 сек). Опыты проводили в 9-кратной повторности.

Все опыты проводили при 25°С. Результаты экспериментов статистически обрабатывали с использованием пакета программ "Statgraf и выражали в виде таблиц, графиков и диаграмм с помощью пакстгд программ "Harvard Graphics", использовали текстовой редактор "Microsoft Word".

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Совершенствование основных приемов биотехнологии восстановления ефтезагрязненных почв осуществлено нами на основе исследования меха-измов повреждающего действия нефти на биологические свойства почвы.

Экологические аспекты повреждающего действия нефти на почвенную йоту. Нефть является сложным конгломератом более 1000 индивидуальных оединений, поэтому исследовали действие собственно нефти и отдельных ефтепродуктов, моделирующих ее различные фракции. Проведенные нами сследования показали (рис. 1), что фитотоксичность нефти определяется е легкими фракциями (Ткипения < 300° С). Высокой токсичностью бладают низкомолекулярные ароматические соединения, например толуол

LD50 - 30± 10 мл/кг поч- концентрация (lg) реагента, мл/кг почвы ы). Бензин и дизельное 100С

опливо обнаруживают

реднюю фитотоксич-

ость (LD50 - около 250

:л/кг почвы), близкую

амой нефти. Более тяже-

ьте фракции, такие как

оторное масло и гуд-

100

10

Т

т

т

н 5 об» af уже» с

Т

нефть толуол бензин д.топлиоо масло гудрон

Рис. 1. Фитотоксичеааио свойства (LD50) дсрково-подзолистой почвы, загрязненной нефтью и нефтепродуктами

он, не оказывают фитотоксического действия.

Дизельное топливо при концентрации до 100 мл/кг почвы практически е влияло на целлюлозолитическую активность, а более высокие дозы нгибировали разрушение целлофана в почве (рис. 2,А). В отличие от того, моторное масло во всем изученном диапазоне концентраций остоверно не изменяло целлюлозолитическую активность почвы. Можно гметить лишьиезначителъную тенденцию к снижению активности при

очень высоких дозах.

Зависимость дыхательной активности почвы от концентрации дизельного топлива описывается Б-образной кривой (рис. 2,Б). В диапазоне низких концентраций нефтепродукта (до 30 мл на кг почвы) продукция диоксида углерода медленно увеличивалась. По мере возрастания дозы поллкшшта наблюдали интенсивный рост продукции СС>2 и при концентрации более 200 мл/ кг происходила относительная стабилизация продукции диоксида углерода. В противоположность этому моторнс масло при всех испытанных концентрациях отчетливо не стимулировал дыхательную активность почвы, то есть активно не метаболизировалос почвенными микроорганизмами.

Поверхность почвы, загрязненной нефтью или дизельным топливом интервале доз от 50 до 300 мл/кг почвы, через две недели щпсубаци обрастала большим количеством микроколоний аборигенных почвенны микроорганизмов (до 20 шгУсм^), тогда как в контрольных вариантах и почвах, загрязненных тяжелыми фракциями нефти (моторным маслом гудроном) количество микроколоний было на порядок меньше. При это пик дыхательной активности и обильное развитие микроколоний и поверхности почв, загрязненных более легкими нефтепродуктам

Скорость снижения Суммарная

прочности целлофана, продукция СОг

мм рт.ст./час мг С/г почвы

_Ц диз.топлизо; .......д мотор.масло

Рис. 7. Блняяио нефтепродуктов на цоллюлозоттзчгскую (А) и дыхательную (Б) активность почвы

»впадали. При рассеве этих колоний на питательную среду обнаружилось, гго они включают 10 видов микроорганизмов, представленных в различных »отношениях. Многие из них относятся к группе активно окисляющих углеводороды нефти.

В продолжение работ, выполненных на кафедре биологии почв МГУ Гузев и др., 1989; Звягинцев й др., 1989), исследовали действие нефти на сачественньш состав амилолитического микробного сообщества почв юиального ряда (рис. 3). На всех почвах подтверждаю наличие 4-х зон реакции инициированного сообщества на загрязнение. Они по своей сути этражают микроботокснческие свойства нефти как поллютанта. Установленные различия изученных почв но устойчивости к нефтяному шгрязнешяо образуют традиционный зонально-генетический ряд от герново-подеолисгой почвы до серозема, при этом более гумусированный эернозем оказался и более устойчивым.

1000 100 Ю 1 0.1

Концентрация (1д) реагента, мл/кг почвы

!

уаЙЙ НШ 1 1 1 }

7Г-- - -

!

серозем

дерново-подзолистая чернозем каштановая Типы реакции шкробиоты: сгз гомеостаз; гтт стресс; ест резистентность; чтя репрессия Рис. 3. Реакция юккробемпы почп на зггрязнекке нзфтью

Реакции амилолитического микробного сообщества на отдельные иефтепродутпи отличалась от реаквдга ш нефть (рис. 4). Бензин и дизельное топливо индуцируют образование 3-х зон: гомсостаза - до 2 и 1,5 мл/ггг, стресса - 20 и 35; и резистентности - более 20 н 35 мл/кг, соответственно. При действии моторного масла и гудрона обнаружено только

2 зоны реакции - гомеостаза и репрессии, составляя 150 мл и 35 г/кг, соответственно.

причем первая очень велим При дальнейшем увеличении

Концентрация (lg) реагента, мл/кг почвы 1000

100 10 1 0,1

? 1 J- f III" рщ

!

| • •

т

Нефть

Диз. топливо Моторное масло Гудрон

Бензин

Типы реакции микробиоты: >го*шсстаз; еяэстрасс; шиш резистентность; бза репрессия Рис. 4. Реакция микробиоты дзрноао-подаолшггой почгы на загркзпгнио изфтыо » нефтепродукте»»

дозы поллютантов развитие амилолитачсских микроорганизмов полностьк прекращалось.

В литературе неоднократно отмечалось влияние нефти на водно воздушные свойства почвы (Солнцева, 1988; Пиковский, 1993; Atlas, Bartha 1992). Проведенные нами исследования показали (табл. 1), что гидрофоб-

Таблица I.

Гидрофобные свойства дерного-подзолнегой почвы, зегразпешзой нефтью ы нефтепродуктами

| Испытуемый реагент К 1мин.< мл/кг почвы Коэффициент корреляции

Нефть 34 ± 12 0.95

Бензин не обнаружено -

Дизельное топливо не обнаружено -

Моторное масло 71 ± 21 0.96

Гудрон 0.93 ± 0.38 0.94

Примечание: время впитывания капли воды незагрязненной почвой не превышало 1 секунды.

1ые свойства почвы резко увеличиваются при загрязнении нефтью, юторным маслом и гудроном. При этом чем тягселее фракция нефти, тем >олее гидрофобной становится загрязненная ею почва: гудрон в 35 раз ффективнее нефти и в 70 раз - моторного масла. В отличие от этого более [епсие фракции в широком диапазоне доз практически не изменяют время шитывания капли воды в почву, свойственное незагрязненной почве.

Таким образом, впервые комплексный эффект нефтяного загрязнения [а почвенную гетеротрофную микробиоту объяснен с учетом гринцшталъно различных механизмов действия основных составляющих [ефти: легкие фракции частично ингибируют гетеротрофные гикроорганизмы почвы, но при этом выступают как субстрат для глеводородокисляющих микроорганизмов. Более тяжелые фракции не оксичны для микроорганизмов, но и активно не метаболизируются ими. )днако, они резко увеличивают гидрофобность почв, и тем самым при ысоких дозах полностью лимитирует активность почвенной биоты.

Проведенные исследования демонстрируют принципиальное отличие в ;ействии нефтяного загрязнения в наземных и водных экосистемах. В одной среде тяжелые компоненты нефти под действием волн и ветров бразуют устойчивую эмульсию, названную А. Кильсон-Смит (1973) шоколадным муссом", который оседает и консервируется в донных тложениях. То есть, в водных системах существует естественный механизм даления тяжелых компонентов нефти с поверхности воды, который нижает негативные последствия от нефтяного загрязнения. В ротивоположность этому, при впитывании нефти в почву а поверхностных гсоях закрепляются ее самые тяжелые компоненты, которые, нарушая одный резким почвы, на длительное время лимитируют жизнедеятельность сей биоты.

Совершенствование биотехнология восстаиошюшя почв, загрязиеины* нефтью в нефтепродуктами. Рассмотренные выше закономерности использовали для совершенствования биотехнологических приемо* рекультивации загрязненных почв. Как было показано фитотоксичностг нефти определяется прежде всего действием ее легких фракций (рис. 1), которые, как известно, являются наиболее мобильными. Это позволяет предполагать возможность их удаления из почвы путем испарения Поэтому нами испытаны различные физико-химические обработки направленные на детоксикацию нефтезагрязненных почв (рис. 5).

Время (1д), час

_- всхсмсастъсемян; ......-длинапроростка

£ -воздушная сушка; ° -вахуумироааннэ; -термосушка Загрязненность почвы нефтью - 20%; всхожесть и длина проростков сеиян кресс-салата не 3 сутки; длина проростка в контроле - 2,5 си Рис. 2. Влшнйо физичоскнх обработок ш фитотоксичсскио свойства кофтезагргинашого серозема

Воздушная сушка после 80 суток частично элиминировала фитотохсичность: прорастало до 100 % семян, хотя проростки были угнетены. Вакуумнрование почвы оказывало близкий эффект, но после 2 суток обработки. Прогрев почвы до 80° С оказался значительно боле« эффективным: оба показателя (процент прорастания и длина проростков] уже через сутки прогревания достигали контрольных значений. Промывкг почвы водой, напротив, мало эффективна, поскольку действующ!»

количества промывной воды очень велики: только при использовании 400 мл воды на 10 г загрязненной почвы последняя теряла фитотоксичность.

Итак, моделирование различных физико-химических воздействий показало, что на начальном этапе рекультивации необходимо обеспечить условия для интенсивного выветривания летучих и остротоксичных компонентов нефти путем многократного рыхления почвы и ограничения доступа к ней влаги.

Одной из общепринятых операций в биотехнологии очистки нефтезагрязненных почв является использование поверхностно-активных веществ (Schussler, 1986; Federle, Pastwa, 1987). Подтверждено, что ПЛВ являются мощным модификатором гидрофобных свойств нефтезагрязненных почв: в диапазоне концентраций от 0,1 до 1 мг/г почвы CMC "Лотос" резко снижает гидрофобность почвы и при дозе около 3 мг/г восстанавливает ее до значений свойственных нативной почве. Однако стимуляции активности углеводородокисляющих микроорганизмов загрязненной почвы с помощью ПАВ нами не обнаружено (рис. 6А). Видно, что продукция диоксида углерода в нефтезагрязненной почве, в широком

Продукция СС>2. мет С/час/г почвы 64 5 4 3 2

^Р-'ЙГ

Продукция N20. мхг N/чес/г почвы 0,02

01

-гп——т

(nh4)2s04, мг/г почвы

0,01 0,1 KNO3, мг/г почвы # контроль; л нефть; а нефть+ПАВ Время инкубации -10 суток; нефти - 10%; концентрация CMC "Полюс" -0,2% Рис. 6. Влияние ПАВ на дыхательную (А) я данктриф'лкгцискиую (Б) активность а нофтэзагризкониой дерново-подзолистой почла

диапазоне доз минеральных удобрений, в вариантах опыта с добавлением ПАВ всегда была на 10-30% ниже контрольной. По-видимому, детергенты, снижая гидрофобность поверхностей как нефти, так и клеток, препятствуют их контакту и тем самым ингибируют утилизацию углеводородов нефти. Негативное действие ПАВ также проявилось в стимуляции процесса деншрификации в 2 раза (рис. 6Б). Кроме того, ПАВ сами по себе проявляют высокую фитотоксичность: LD50" Лотос"" " 0,23 г/л, а для "Биолана" - 2,1.

Считается, что утилизация углеводородов нефти происходит с использованием двух различных механизмов: путем активного метаболизма сравнительно простых углеводородов и путем сопряженного метаболизма высококонденсированных углеводородов (Бесг и др., 1988; Atlas, Bartha, 1992). Так как, гидрофобность нефтезагрязненных почв обусловливается действием тяжелых фракций нефти, которые почвенными микроорганизмами активно не метаболизируются, есть основания полагать, что эффективность использования ПАВ будет много выше при применении их по завершении процесса активного метаболизма.

Установлено, что токсическое действие ПАВ в нефтезагрязненной почве на 3 порядка ниже, чем в воде

(LD50 "Лотос" в не<Ьтезагояэненной почве " 37±8,3 г/кг). Наиболее вероятным объяснением этого эффекта может быть интенсивная адсорбция ПАВ этой почвой, сопровождающаяся нарушением связи между почвой и нефтью. Именно за счет этого послед-

Количество собранной нефти, %

Объем еоОы - 3 л; масса почвы -200 г; содержание нефти - 25% Рис. 7. Влияние CMC "Бколан" на флотационный сбор нефтм из нефте за грязненного серозема

няя легко десорбируется из почвы при перемешивании. Экспериментально показсло, что флотационным способом удается собрать до 80% нефти из загрязненной почвы (рис. 7), что соответствует литературным данным (Пиковский, 1993). Оптимизация условий флотационного сбора позволила собрать до 200 мл нефти из 1 кг загрязненной почвы, содержащей 25% нефти, расходуя при этом 16 г детергента CMC "Биолан" и 1,6 л воды. Эти результаты показывают, что флотационная очистка почвы с помощью десорбентов, хотя и требует значительных материальных затрат, но как и использование адсорбентов для очистки воды является радикальным способом очистки почв.

Целый ряд известных биотехнологий основан на внесенин в загрязненные среды микроорганизхгов-деструкгоров углеводородов нефти (Мурзаков и др., 1992; Atlas, Bartha, 1992). Для сравнительного изучения углеводородокисляющей активности использовали 2 культуры микроорганизмов Candida lipolytica и Cladosporium resinae, предназначенные для интродукции в нефтезагрязненные почвы. Установлено, что испытуемые микроорганизмы по своей конкурентной способности существенно различаются между собой. Доминирование мнкромицета С. resinae над аборигенными микрооргагазмами в нефтезаг-рязненной почве может быть достигнуто при инохуляционной дозе 10^ хл./г. Тот же эффект для дрожжей обеспечивается дозой 10** кл./г почвы.

Исследование динамики популяций интродуцентов подтверждает зывод о низкой котсуренткой способности культуры щююхей в почве (рис. 8). Видно, что оба интродуцента имеют близкую емкость почвы как среды обитания, приближающуюся к уровню 107 КОЕ/г почвы. Однако, если микромицет способен самостоятельно увеличивать плотность с исходной концентрации I05 кл./г до уровня емкости среды, то культура дрожзеей нуж-

Плотность (lg) популяции, млн. КОЕ/г почвы

10cw

щ

1 0.1 0,01 0,00

" I I

10 15 Время, сутки

—г—

20

*- С. гЫпае без нефти*. С. Пропса без нефти; В - С. г«цпае с нефтью*- С. Кросса с нефтью

Рис. 8. Популяционная динамика С. 1!ро(уйса и С. гев1пао в нофтехг грязненной дерново-подаолистой почве

Суммарная продукция СОг, мг С/г почвы 3i

дается в искусственном внесении ее в количестве, близком к этому уровню.

Абсолютные величины продукции СС>2 были в 2-3 раза выше в вариантах с внесением в почву С. Про1уг1са по сравнению с С. гевтае. Для оценки эффективности использования микробных препаратов в биоремедиации нефтезагрязненной почвы были рассчитаны кумуляты продукции СС>2 (рис. 9) за вычетом фонового дыхания почвы (почва без нефти и без ннокулятов). Кривая, полученная для С. Нро1уиса, имела 5-образную форму и напоминала таковую для чистой культуры. Динамика окисления нефти, интродуцентом С. гехтае и аборигенной микрофлорой почвы, отличалась линейным характером процесса и абсолютными значениями продукции СОг более низкими, чем для С. Пропса.

Таким образом, разработан способ лабораторного тестирования микроорганизмов, предназначенных для биоремедиации пефтезагразнешюй почвы, который позволяет оценить перспективность

я W

Время, сутки

в С. lipolytic»; л С. resinac; контроль;

Загрязненность почвы нефтью -10% Рис. 9. Сравнительная эффективность р&алохюния нефтм интродуценгеии и аборигенными микроорганизмами в дорноао-подзолистой почве

использования биопрепарата в условиях конкретной почвы. Способ включает определение: 1) конкурентной способности испытуемого организма путем подбора минимально необходимой инокуляционной дозы; 2) его эффективности в процессе разложения углеводородов нефти по сравнению с аборигенными углеводородокисляющими микроорганизмами. Показано, что микромицет С. resinae проявляет большую конкурентную способность, становясь доминантом при инокуляционной дозе 10^ конидиеспор/г, но ускоряет процесс очистки почвы всего в 1,5 раза. Дрожжи стимулируют деградацию углеводородов нефти in situ существенно сильнее (в 3 раза), но для этого требуется в тысячу раз большая инокуляционная доза. То есть, испытанные микроорганизмы не удовлетворяют требованиям, предъявляемым к "идеальному" микроорганизму. Один из них относительно мало эффективен, а другой недостаточно конкурентноспособен. Поэтому мы полагаем, что в настоящее время более перспективен поиск способов интенсификации активности аборигенной микрофлоры почвы. Успехи имеющиеся в практике использования биопрепаратов для очистки акваторий от нефти, связаны со сравнительно низкой биогенностыо водной среды, в частносш, в незагрязненных водах обнаруживают единицы углеводородокисляющих микроорганизмов (Квасников, Юпошникова, 1981), тогда как в почвах -десятки тысяч КОЕ/г (Паников и др., 1989). Именно эта особенность почвы, как среды обитания углеводородокисляющих микроорганизмов, и определяет трудности интродукции в нее новых микроорганизмов, окисляющих углеводороды нефти.

Во многих биотехнологиях для очистки почв от нефти используется внесение различных органических вещеста: отходов пищевой промышленности и т.п. (Исмаилов, 1985; Amadi et al., 1993). Поэтому задачей заключительного раздела настоящей работы было выявление осо-

бенностей действия легкометзболизи-руемых углеводов на примере глюкозы на активность углеводородокис-ляющих. микроорганизмов в почвах, загрязненных нефтепродуктами. В интервале концентраций до 0,8 мг/г почвы глюкоза стимулирует продукцию СС>2 почвой, загрязненной дизельным топливом (рис. 10А). При увеличении доз углевода интенсивность процесса снижается, а затем опять возрастает. Результирующая кривая (рис. 10В), полученная вычитанием опытных (рис. 10А) и контрольных (рис. 10Б), заимствованных из литературы данных (Абу-Эль Нага и др., 1983), позволяет утверждать, что углевод выступает в качестве регулятора процесса утилизации нефтепродукта в почве. Качество обратной связи (положительная или отрицательная) определяется концентрацией глюкозы в загрязненной почве. Результаты микробиологического высева из почвы, в которой происходила активная утилизация дизельного топлива, показали (рис. 11), что продукт«: СОг синхронно озазана с изменениями численности

Суммарная продукция СО2, мг С/г почвы

* -диз.топливо+гпюкоза;

• - толыя глюкоза;

а - только диз.толливо Дизельное топливо - 10%; инкубация -16 суток Рис. 10. Влияние глюкозы на

утилизацию дизельного топлива микроорганизмами в сероземе

Численность, тыс. КОВг почвы

Дизельное топливо -10%; инкубация -10 суток

Рис. 11. Влияние глюкозы на численность бактерий в серозеш, загрязненном дизельным топливом

Rhodococcus ruber - представителя рода активных (Коронелли, 1984) деструкторов углеводородов.

Анализ дифференциальных кривых зависимости интенсивносш дыхания загрязненной почвы от концентрации глюкозы показывает (рис. 12А), что в интервале доз глюкозы до 1,5 мг/г почвы, обнаруживается два максимума выделения СС>2, то есть типичный диауксический рост почвенных микроорганизмов на двух субстратах с их последовательной утилизацией. При более высоких дозах глюкозы - более 2 мг/г почвы (рис. 12Б), вопреки представлениям о диаукснческом росте, утилизации дизельного топлива, не происходило: кривая имела всего один максимум.

Продукция СО2, мкг С/час/r почвы 201

Продукция СОг, мкг С/час/г почвы 601

Б

"1б0~ 2150 300 ЗЬО "О 100 200 зоо Время, час Время, час

Дозы глюкозы, мг/г почвы: ♦0; *0,5; +0,8; +-1;*1,5 *2; *5; »10

Рис. 12. Влияние глюкозы на дыхательную активность серозема,

ззгряэиоинсго дмзольньш топлкоом

Сравнивая эти закономерности с особенностями влияния глюкозы на процесс микробного разложения углеводных полимеров в почве (Гузев и др., 1986, 1988; Голышин, Гузсз, 1992), можно отметить наличие как общих, так и отличительных признаков. В обоих случаях обнаруживаются

пороговые концентрации глюкозы, превышение которых существенно препятствует биодеструкции углеводов и углеводородов в почве. Главной отличительной особенностью влияния глюкозы на микробное разложение углеводородов в почве является то, что допороговые концентрации глюкозы стимулируют этот процесс. При изучении разрушения углеводных полимеров этого не обнаружено. Принципиальным отличием регуляторного действия глюкозы на процесс деструкции полимерных углеводов по механизму "пролонгированной" катаболитной репрессии является задержка его начала, при этом абсолютные значения скорости их разложения не изменяются. В рассматриваемом случае, глюкоза подобно ингибитору влияет только на скорость утилизации углеводородов, но не оказывает воздействия на момент начала этого процесса (рис. 12). При низких концентрациях она ускоряет выход СС>2 на максимальный уровень (в контроле - 300 часов; 0,5 иг/г - 200 часов; 0,8 мг/г почвы - 120 часов) и далее, по мере увеличения дозы, снижает максимум продукции СС>2 (0,8 мг/г почвы - 17,5 мт/г почвы; 1 мг/г - 13; 1,5 мг/г - 12), который впоследствие более не обнаруживается.

Следует отметить, что вопрос влияния глюкозы в питательных средах на активность углеводородокисляющих микроорганизмов неоднократно обсуждался в литературе. Имеются сведения о том, что в морской воде глюкоза не оказывает существенного влияния на биодеградацию дизельного топлива МусоЬааепит тисоБит (Гусев и др., 1980), тогда как в других работах отмечается, что глюкоза, в избыточной концентрации, в питательной среде с дефицитом источников минерального питания снижает метаболическую активность микроорганизмов до минимального уровня и у них развивается состояние "отмирания, вызванное субстратом" или "субстратной смерти" (Са1сои, Postgate, 1972).

В литературе имеются лишь отрывочные сведения о механизмам отрицательного действия глюкозы на углеводородокисляющие микроорганизмы. Считается, что это свойство связано не с неким токсическим продуктом метаболизма глюкозы, а с механизмом экспрессии генов, кодирующих те или иные ферменты (Перт, 1978). По результатам Т.В. Коронелли (1984) глюкоза в своем действии подобно ингибитору биосинтеза мнколовых кислот (изониазиду) может приводить к утрате способности поглощать углеводороды сапротрофными микобактериями. Показано, что отрицательный "глюкозный эффект" в хемостатной культуре у Rhodococcus minimus при концентрации более 660 мг/л реализуется как на уровне синтеза белка транспортной системы, так и на уровне регулировании активности этой системы путем активации-инактивации ее белков (Барышникова и др., 1994). Можно предполагать, что все эти механизмы и определяют отрицательную обратную езязь концентрации глюкозы с процессом утилизации углеводородов в почве.

Таким образом, впервые экспериментально показано, что процесс утилизации углеводородов нефти в почве может регулироваться концентрацией поступающих в нее легкометаболизируемых углеводов. В езязи с этим при разработке и обосновании биотехнологии восстановления нефтезагрязненных почв следует учитывать, что в них одновременно протекают разнообразные и взаимовлияющие процессы.

ВЫВОДЫ

1. Впервые комплексный эффект нефтяного загрязнения на почвенную гетеротрофную микробиоту объяснен с учетом принципиально различных механизмов действия основных составляющих нефти: легкие фракции (бензин и дизельное топливо) частично инп!б1груют активность гетеротрофных микроорганизмов почвы, но при этом выступают кате

субстрат для углеводородокисляющих микроорганизмов. Тяжелые фракции (масло и гудрон) не токсичны для гетеротрофных микроорганизмов, но и активно не метаболизируются ими. Однако, эти компоненты нефти резко увеличивают гидрофобность почв, что при высоких дозах полностью лимитирует жизнедеятельность почвенной биоты.

2. Сигнальным показателем повреждающего действия нефти в почве является изменение ее микробиологических свойств, проявляющееся в перераспределении степени доминирования активно функционирующих микроорганизмов почвы. На этом основании предложен способ определения экологически допустимой концентрации нефти в почвах, который учитывает как токсичность нефти конкретного месторождения, так и буферные свойства почв различных типов.

3. Показано, что микробиологический способ индикации, основанный на ответной реакции амилолитического микробного сообщества на стрессовую дозу загрязнителя, позволяет определять средний уровень загрязнения почв нефтью и поэтому дает возможность достаточно аргументированно оценивать состояние нефтезагрязненных почв в процессе их рекультивации.

4. Моделирование различных физико-химических воздействий показало, что на начальном этапе рекультивации необходимо обеспечить условия для интенсивного выветривания летучих и остротоксичных компонентов нефти путем многократного рыхления почвы и ограничения доступа к ней влаги.

5. Установлено, что поверхностно-активные вещества существенно снижают гидрофобность нефтезагрязненных почв, но при этом ПАВ повышают фитотоксичностъ почвы, ингибируют активность углеводородокисляющих микроорганизмов и стимулируют процесс денитрнфикации, приводящий к потерям азота. Поэтому можно считать

оправданным использование ПАВ, только по завершении активного метаболизма сравнительно простых углеводородов нефти и начала медленной деструкции высококонденсированных ее фракций. Подтверждена эффективность использования ПАВ для флотационной очистки нефтезагрязненных почв.

6. Разработан способ лабораторного тестирования микроорганизмов, предназначенных для биоремедиации нефтезагрязненной почвы, который позволяет оценить перспективность использования биопрепарата в условиях конкретной почвы. Способ включает определение: 1) конкурентной способности испытуемого организма путем подбора минимально необходимой инокуляционной дозы; 2) его эффективности в процессе разложения углеводородов нефти по сравнению с аборигенными углеводородокисляющими микроорганизмами.

7. Впервые экспериментально показано, что процесс утилизации углеводородов нефти в почве может регулироваться поступающими в нее легхомстаболизируемымн углеводами. Глюкоза, внесенная и концентрациях до 1 мг/г почвы на порядок увеличивает плотность популяции углеводородокисляю!цих бактерий и, тем самым, в 3 раза ускоряет разложение углеводородов нефти, тогда как более высокие ее дозы в значительной степени ингибируют этот процесс.

По материалам диссертации опубликованы следующие работы:

1. Гузев B.C., Хапшов Э.М. /Общие принципы оптимизации комплекса рекультивационных мероприятий на нефтезагрязненных почвах //Конф. "Биотехнол. защиты окруж. среды" (18-19 окт. 1994 г.). Тезисы докл. -1994. -С.39-40,- РАН, Мин. науки и техн.политаки, ИБФМ.-Пущино.

2. Zvyagintsev D.G., Levin S.V., Guzev V.S., Khalimov E.M. /Ecological and Microbiological Monitoring of Crude Oil Polluted Soils //3rd

German-Russian Workshop Biotechnol. (Oct. 3-5, 1994). Poster. -1994. -TU Berlin Inst, of Biochem. & Molecular Biol. -Berlin.

3. Левин C.B., Холимое Э.М. /Эколого-микробиологическая оценка состояния почв, загрязненных нефтью // "I Всеросс. конф. "Актуальн. проблемы теор. и прикл. токсикологии" (20-23 дек. 1995 г.). Тезисы докладов. -1995. -Ч. 3. -С. 31. -РАМН, МЗМП РФ, -Санкт-Петербург.

4. Левин C.B., Холимое Э.М., Гузев B.C. /Эколого-микробиологическое нормирование содержания нефти в почве //Токсикологический вестник. -1995. -№ 1. -С. 11-15. -РРПЩХБВ. -Москва.

5. Гузев B.C., Левин C.B., Холимое Э.М., Звягинцев Д.Г. /Исследование закономерностей микробиологической деградации нефти и нефтепродуктов в почвах //Отчет РАН о деятельности академии за ¡995 год. -1996. -РАН. -Москва, в печати.

6. Холимое Э.М., Левин C.B., Гузев B.C. /Эколого-микробиологические аспекты повреждающего действия нефти в почве II Вестник Моск. ун-та, серия 17. Почвовед. -19%. № 2. -С. 59-64. -Изд-во МГУ. -Москва.

7. Семенов A.M., Куличевская И.С., Холимое Э.М., Гузев В. С., Паников Н. С. /Лабораторные тесты для оптимизации интродукции в почву микроорганизмов-деструкторов нефти //Прикладная микробиология. -1996. -РАН. -Москва, в печати.

8. Гузев B.C., Холимое Э.М., Волде М.И., Куличевская И.С. /Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляюидах микроорганизмов в почве //Микробиология. -1996. -РАН. -Москва, в печати.

Подписало в печать IOS. 96 Формат 60 iSfy/iïj Заказ fbS

Усл. печ.л. Тираж

Типографии Россельхозакадсмии