Эколого-функциональные аспекты микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв

Плешакова, Екатерина Владимировна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Эколого-функциональные аспекты микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв
ВАК РФ 03.02.08, Экология (по отраслям)

Автореферат диссертации по теме "Эколого-функциональные аспекты микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв"

На правах рукописи

00461393!

Плешакова Екатерина Владимировна

ЭКОЛОГО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ АСПЕКТЫ МИКРОБНОЙ РЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННЫХ ПОЧВ

03.02.08 - экология (биологические науки) 03.02.03 - микробиология

Автореферат диссертации на соискание учёной степени доктора биологических наук

2 3 ДЕК 2010

Саратов-2010

004618937

Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН (ИБФРМ РАН) и Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского»

Научный доктор биологических наук, профессор

консультант: Турковская Ольга Викторовна

Официальные член-корр. РАН, доктор биологических наук, профессор оппоненты: Розенберг Геннадий Самуилович

доктор биологических наук, профессор Попов Николай Владимирович

доктор биологических наук, профессор Карпушша Лидия Владимировна

Ведущая Государственное образовательное учреждение высшего

организация: профессионального образования «Башкирский

государственный университет»

Защита состоится 29 декабря 2010 г. в 10.00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.243.13 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» по адресу: 410012, г. Саратов, ул. Астраханская, д. 83, E-mail: biosovet@sgu.ru

С диссертацией можно ознакомиться в Зональной научной библиотеке имени В.А. Артисевич ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского».

Автореферат разослан «14» ноября 2010 г.

Учёный секретарь f

диссертационного совета ШцШ^-ь С.А. Невский

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследований. В настоящее время в результате антропогенной деятельности происходит широкомасштабное загрязнение окружающей среды токсичными веществами. Нефть и нефтепродукты признаны основными загрязнителями окружающей среды (Eurosoil 2008). Потери нефти и нефтепродуктов в России при добыче, транспортировке, переработке и хранении по официальным данным оцениваются в 8-9 млн т в год. Особую нагрузку при этом испытывает почва, что проявляется в ухудшении её морфологических и физико-химических свойств, угнетении самоочищающей способности и негативных изменениях развития и функциональной активности организмов почвенного биоценоза (Пиковский и др., 2003; Stroud et al., 2007). Аварийные и хронические разливы нефти приводят к быстрой потере продуктивности земель или полной деградации ландшафтов. Ограниченность земельных ресурсов ставит неотложную задачу возврата в хозяйственное использование всех нарушенных и деградированных почв (Бурмиетрова, 2003).

Поскольку на современном уровне развития нефтяной промышленности не представляется возможным полностью исключить её негативное воздействие на окружающую среду, возникает необходимость разработки методов и технологий восстановления почв, загрязнённых нефтяными углеводородами (Сулейманов и др., 2005). Экологически перспективными являются микробиологические способы очистки от нефтезагрязнений, основанные на стимулировании роста и активности природных микроорганизмов (биостимуляция) или внесении в почву селекционированных микроорганизмов-деструкторов (биоаугментация) (Нечаева и др., 2009; Киреева и др., 2009; Mishra et al., 2001; Wilkinson et al., 2002; Ouyang et al., 2005).

В связи с тем, что деструкция нефти в окружающей среде - сложный многофакторный процесс, на который оказывают влияние физико-химический состав, концентрация и срок действия загрязнителя, ночвенно-климатические и биологические особенности экосистемы и другие факторы, сведения по этой проблеме нередко противоречивы.

При разработке приёмов микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв, выборе оптимального способа очистки необходим комплексный подход. Анализ изменений, происходящих в микробных сообществах нефтезагрязнённых почв, путём определения численности микроорганизмов различных физиологических групп, выделения и идентификации микроорганизмов-деструкторов углеводородов, изучения почвенной биодинамики на основании оценки активности ферментов в почве и определения интенсивности почвенного «дыхания», исследования динамики агрохимических показателей почвы с параллельным химическим анализом остаточного содержания в ней нефтяного загрязнителя и оценкой степени её токсичности, позволит разработать параметры микробиологических процессов в нефтезагрязнённых почвах, при которых нарушенные почвы возвращаются в устойчивое состояние.

Несмотря на многочисленные исследования микроорганизмов-деструкторов нефтяных углеводородов в окружающей среде, механизмы их функционирования в экстремальных условиях, например, в кислых почвах, обусловленных естественными или антропогенными факторами, которых немало на территории России и других стран (Широких, 2004; Орлов и др., 2005; Rothschild, Mancinelli, 2001), изучены

недостаточно. Многие экологические аспекты проблемы биоаугментации, касающиеся жизнеспособности и активности интродуцированных микроорганизмов в почве, их взаимоотношений с аборигенным микробоценозом, требуют всестороннего изучения. В связи с этим, разработка высокоспецифичных и чувствительных мониторинговых методов для идентификации внесённых в почву бактерий особенно актуальна.

Кроме того, для реализации принципов и практических мер, направленных на охрану почв, необходимо разработать оптимальные методы биотестирования, позволяющие построить наиболее полную картину деградации почв, получить интегральную токсикологическую характеристику загрязнённой среды до и после очистки, и, следовательно, оценить эффективность приёмов биоремедиации.

Цель и задачи исследований. Цель работы - выявление особенностей функционирования естественных микробных сообществ нефтезагрязнённых почв и интродуцированных в почву специализированных микроорганизмов при использовании приёмов биоремедиации.

Для достижения поставленной цели были определены задачи:

1. Исследовать биологические и эколого-функциональные свойства микробного сообщества нефтешлама с низким значением pH. Изучить генетические особенности кислотоустойчивых углеводородокисляющих микроорганизмов, выделенных из нефтешлама.

2. Провести сравнительную оценку жизнеспособности и динамики развития микроорганизмов Dietzia maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 при их интродукции в загрязнённые нефтью кислые и нейтральные почвы. Изучить стабильность свойств реизолятов штамма Л maris АМЗ.

3. Исследовать влияние интродукции нефтеокисляющих микроорганизмов на характер микробиологических и биохимических процессов в загрязнённой почве и деструкцию нефтяных углеводородов.

4. Разработать и апробировать иммунохимические методы анализа для мониторинга штамма D. maris АМЗ в нефтезагрязнённой почве в процессе биоремедиации.

5. Провести сравнительное исследование функционирования микробных сообществ почвы с разным сроком нефтяного загрязнения при самоочищении и использовании приёмов биостимуляции и биоаугментации.

6. Выявить оптимальные показатели для мониторинга процессов микробной ремедиации почв и разработать метод биотестирования для оценки уровня токсичности почвы после очистки.

7. Разработать и апробировать оригинальный способ активизации аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов для очистки нефтезагрязнённой ночвы и воды.

Научная новизна. Впервые из микробного сообщества, существующего в экстремальных условиях нефтешлама (pH 1,15), выделены и изучены 13 штаммов бактерий, идентифицированные как Corynebacterium spp., D. maris и Bacillus sp., способные к деструкции углеводородов в широком диапазоне pH. Получены доказательства плазмидной локализации генов, детерминирующих свойства биодеградации нефтяных углеводородов и ацидотолерантности у данных штаммов, что может обеспечить преимущества микроорганизмов сообщества при существовании в экстремальных условиях. Впервые подробно изучеи и охарактеризован штамм D. maris АМЗ как эффективный и стабильный деструктор

алкановых и ароматических углеводородов в широком диапазоне рН (4-9) и температуры (10-40°С), обладающий эмульгирующей активностью по отношению к нефтепродуктам и содержащий трансмиссивную плазмидную ДНК. Установлено, что после культивирования штамма на углеводородных субстратах увеличивается гидрофобность его клеток и нефтеокисляющая активность.

Разработаны иммунохимические методы анализа для выявления и количественной оценки штамма D. maris АМЗ в нефтезагрязнённой почве в процессе биоремедиации. Установлены особенности развития интродуцированных микроорганизмов D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 в нефтезагрязнённых кислых и нейтральных почвах, подтверждена их высокая конкурентная способность по отношению к микроорганизмам естественных почвенных сообществ, жизнеспособность и нефтеокисляющая активность. С помощью метода твёрдофазного иммуноферментного анализа (ИФА) показано, что максимальное развитие штамма D. maris АМЗ в почве происходит через 7-14 сут, интродукции и зависит от свойств почвы и загрязнителя.

На основании выявленных особенностей функционирования естественных микробных сообществ загрязнённых почв и интродуцированных нефтеокисляющих микроорганизмов разработаны научные основы применения и совершенствования технологий микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв. Научно аргументирована и экспериментально доказана перспективность использования штаммов D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 для очистки почв со свежим нефтяным загрязнением, которые не только ускоряют очистку в два раза в течение первого месяца ремедиации по сравнению с приёмом стимуляции, но также повышают биологическую активность почвы и способствуют снижению её токсичности. Установлено, что эффективность ремедиации при стимуляции естественного микробного сообщества почвы со свежим нефтяным загрязнением выше, чем при самоочищении, что выражается в увеличении степени деструкции нефтяных углеводородов и биологической активности почвы и снижении её токсичности. В случае многолетнего загрязнения показана одинаковая убыль нефтяных углеводородов при стимуляции аборигенной микрофлоры и интродукции штамма D. maris АМЗ, который на определённых этапах ремедиации повышает биологическую активность и снижает токсичность почвы.

Выявлены диагностические показатели по ферментативной активности для оценки эффективности апробируемых биоремедиадионных приёмов. Разработан метод определения токсичности нефтезагрязнённой почвы после биоремедиации по дегидрогеназной активности бактерий. Предложена новая комбинация добавок, стимулирующих развитие аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы, для получения биопрепаратов в виде почвенной суспензии.

Практическая значимость. Выделенные и охарактеризованные ацидотолерантные нефтеокисляющие бактерии Corynebacterium spp., D. maris и Bacillus sp. могут быть использованы для ремедиации нефтезагрязнённых почв с повышенной кислотностью. Бактериальные культуры D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 могут быть рекомендованы для ускорения и улучшения очистки почвы от свежего нефтяного загрязнения. Высокая жизнеспособность, конкурентоспособность и углеводородокисляющая активность позволяет применять эти штаммы в условиях, когда естественное микробное сообщество почвы малочисленно или не способно полноценно функционировать. Для очистки почв с многолетним загрязнением

разработан способ стимуляции аборигенной микрофлоры путём внесения минерального удобрения, структуратора, ПАВ и использования агротехнических приёмов. Результаты по способам очистки почвы от нефтяных загрязнений защищены двумя патентами РФ.

Метод твердофазного ИФА может быть рекомендован для практического применения при проведении биоремедиационных работ в качестве способа учёта численности интродуцированных микроорганизмов. Анализ показателей активности почвенных ферментов: дегидрогеназ, каталаз, липаз и уреаз может быть использован для оценки эффективности приёмов биоремедиации. Предложен метод определения токсичности нефтезагрязнённой почвы после биоремедиации по дегидрогеназной активности бактерий. Разработан способ получения и использования биопрепаратов в виде почвенной суспензии, основанный на активизации аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы.

Результаты исследования применяются при проведении лекционных и практических занятий по курсу «Экологическая токсикология», «Механизмы обезвреживания токсичных соединений», подготовке курсовых и дипломных работ в ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени Н.Г. Чернышевского» и ИБФРМ РАН. Материалы диссертации использованы при подготовке учебно-методических пособий: «Руководство к практическим занятиям по экологической токсикологии» (Саратов, 2006); «Общая биология: Материалы к гос. аттестации выпускников по спец. 011600 - «Биология»» (Саратов, 2006); «Экология. Материалы к государственной аттестации выпускников по специальности - «Экология»» (Саратов, 2009).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В состав микробного сообщества нефтешлама с экстремальной кислотностью (pH 1,15) входят микроорганизмы Corynebacterium spp., D. maris и Bacillus sp., осуществляющие деструкцию нефтяных углеводородов в кислой и нейтральной среде. Свойства ацидотолерантности у бактерий Corynebacterium spp. и деградации нефтяных углеводородов у D. maris АМЗ, детерминируемые плазмидными генами, способствуют устойчивому функционированию микробного сообщества нефтешлама.

2. Штамм D. maris АМЗ обладает рядом функциональных и экологических преимуществ, связанных со способностью к существованию в широком диапазоне pH и температуры, наличием биоэмульгирующей и деструктивной активности по отношению к алкановым и ароматическим углеводородам нефти и присутствием трансмиссивной катаболической плазмиды, характеризующейся высокой стабильностью. Адаптационным механизмом при культивировании D. maris АМЗ на углеводородах является увеличение гидрофобности его клеток.

3. Интродуцированные микроорганизмы П. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 характеризуются высокой жизнеспособностью в нефтезагрязнённых кислых и нейтральных почвах, они ускоряют очистку почв от свежего нефтяного загрязнения, повышая численность гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов в естественном сообществе, интенсифицируя биологическую активность почвы и снижая её токсичность.

4. Для выявления D. maris АМЗ в почве в процессе биоремедиации и количественной оценки динамики его численности применимы иммунохимические методы анализа. С помощью метода твёрдофазного иммуноферментного анализа установлено, что при интродукции штамма D. maris АМЗ в почву, его максимальное

развитие происходит через 7-14 суток (на 1-3 порядка в зависимости от свойств почвы и загрязнителя).

5. Способ стимуляции естественного микробного сообщества в чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением имеет существенные преимущества по сравнению с самоочищением, В случае многолетнего загрязнения показана одинаковая убыль нефтяных углеводородов при стимуляции аборигенной микрофлоры и интродукции штамма D. maris АМЗ.

6. Показатели активности почвенных ферментов: дегидрогеназ, каталаз, липаз и уреаз отражают направленность процессов биодеградации нефтяных углеводородов, обусловленных развитием и активизацией аборигенных и интродуцированных микроорганизмов в почве, и могут быть использованы для оценки эффективности приёмов биоремедиации. Показатель дегидрогеназной активности бактерий может использоваться для тестирования токсичности очищенной почвы.

7. Активизация аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы с помощью стимулирующих добавок обеспечивает получение эффективных биопрепаратов в виде почвенной суспензии для использования в процессе биоремедиации.

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены в виде стендовых и устных сообщений на Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия, экология, проблемы» (Пермь, 1996); Я International Symposium on Biosorption and Bioremediation (Prague, Czech Republic, 1998); 9th European Congress on Biotechnology (Brüssels, Belgium, 1999); 7th и 8rtl International FZK/TNO Conference on Contaminated Soil (Leipzig, Germany, 2000; Gent, Belgium, 2003); II и V съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2009); 9th International Symposium on Microbial Ecology (Amsterdam, The Netherlands, 2001); конференции «Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды» (Пущино, 2001); Xth International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology (Paris, France, 2002); 3rd International Conference OIL POLLUTION: Prevention, Characterization, Clean Technology (Gdafisk, Poland, 2002); I-IV межрегиональных конференциях молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2002, 2004, 2006, 2008); Всероссийских научно-пракгических конференциях, посвященных 115-летию и 117-летию со дня рождения академика Н.И.Вавилова (Саратов, 2002, 2004); I-III Международных конгрессах «Биотехнология - состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005); International Symposium Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants (Saratov, Russia, 2003); II Международной научной конференции «Биотехнология - охране окружающей среды» (Москва, 2004); Международной научной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань, 2005); Всероссийской Молодёжной школе-конференции «Актуальные проблемы современной микробиологии» (Москва, 2005); Международной научной конференции «Микробные биотехнологии» (Одесса, 2006); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва, 2007); EGU General Assembly (Vienna, Austria, 2008); Международной научЕЮ-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологии» (Москва, 2008); IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009); IV

Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов, 2009); Первых Международных научно-практических Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010); XXII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010); Московской международной научно-практической конференции «Биотехнология: экология крупных городов» (Москва, 2010); II Всероссийской научной интернет-конференции «Научное творчество XXI века» с международным участием (2010); совместном заседании лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии и биофизики СГУ (2005-2010 гг.).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 62 научные работы, из них 10 публикаций в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ, включая два патента РФ.

Структура и объём диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 5 глав с изложением результатов работы и их обсуждением, заключения, выводов, списка цитируемой литературы, включающего 443 источника. Диссертация изложена на 358 страницах машинописного текста, включая приложение, содержит 85 рисунков и 29 таблиц.

Работа выполнена в лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН в соответствии с плановой темой НИР «Исследование взаимодействия микроорганизмов и растений с техногенными загрязнителями окружающей среды» (№ гос. регистрации 01.9.90 003293, научный руководитель зав. лаб. профессор, д.б.н. Турковская О.В.) и кафедре биохимии и биофизики СГУ по заданию Минобразования и науки РФ по теме «Исследование влияния биотических и абиотических факторов на структуру и функционирование экосистем и популяций» (научный руководитель зав. каф. ботаники и экологии СГУ профессор, д.б.н. Болдырев В.А.). Работа поддержана Грантом Президента РФ № МК-1968.2003.04.

Благодарности. Выражаю искреннюю благодарность научному консультанту профессору, д.б.н. Турковской О.В., сотрудникам лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и особенно: к.б.н. Дубровской Е.В. за проведение совместных микрополевых исследований, к.б.н. Поздняковой H.H. за совместную разработку ; оригинального способа активизации аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов, к.б.н. Голубеву С.Н. за помощь в проведении генетических исследований, а также д.б.н. Матора Л.Ю., к.б.н. Бурыгину Г.Л., к.х.н. Макарову O.E. и коллегам с кафедры биохимии и биофизики СГУ.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. МИКРОБНАЯ ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТЯНЫХ УГЛЕВОДОРОДОВ В ЗАГРЯЗНЁННЫХ ПОЧВАХ

В главе приводится обзор современного состояния острейшей экологической проблемы - загрязнения почв нефтью и нефтепродуктами, рассмотрено токсическое воздействие нефтяных углеводородов на живые организмы, характер изменений физико-химических и биологических свойств почвы при нефтяном загрязнении, особенно подробно описано его влияние на ферментативную активность почв в связи с возможным использованием показателей активности почвенных ферментов для мониторинга технологий биоремедиации. Изложены основные принципы микробной

деградации нефтяных углеводородов, представлено описание микроорганизмов-деструкторов нефтяных углеводородов, их физиологических особенностей, приведены пути микробной деструкции нефтяных углеводородов, подробно описаны бактерии рода Rhodococcus, их экологическое значение и генетическая организация.

В данной главе рассмотрены основные факторы, влияющие на эффективность биоремедиации, проанализированы проблемы и перспективы интродукции нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязнённую почву. При обобщении сведений о способах микробной очистки нефтезагрязнённых почв и методах контроля биоремедиации, делается вывод, что вопросы целесообразности использования и преимуществ технологий биостимуляции и биоаугментации остаются спорными, деградация нефтяных углеводородов бактериями в экстремальных условиях, например, в почве при пониженных значениях рН, изучена недостаточна. Проблемы биологического мониторинга почв после биоремедиации, изучения жизнеспособности внесённых в загрязнённую почву микроорганизмов требуют оптимального решения.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектами исследований являлись 13 штаммов, выделенных из нефтешлама (рН 1,15) (г. Саратов). Кроме того, в работе использовачи штаммы из коллекции почвенных свободноживущих и ризосферных микроорганизмов ИБФРМ РАН: 14 штаммов Escherichia coli, Acinetobacter calcoaceticus TM-31, Rhodococcus terrae A73 и 5 штаммов рода Rhodococcus: R. rhodochrous M8, R. rhodochrous rh, R. erythropolis Hx7, Rhodococcus sp. 261 и Rhodococcus sp. 2/4 из коллекции микроорганизмов ЗАО «Биоамид». Для установления специфичности антител D. maris АМЗ применяли штаммы D. maris ИЭГМ 44 и D. maris ИЭГМ 305 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов Института экологии и генетики микроорганизмов УрО РАН (г. Пермь).

Работа выполнялась на базе лаборатории экологической биотехнологии ИБФРМ РАН и кафедры биохимии и биофизики СГУ (1999-2010 гг.).

Способность микроорганизмов и их мутантных клонов использовать для роста нефть и нефтепродукты определяли с помощью чашечного метода Мак-Кланга, согласно которому отмечалось наличие роста культуры вокруг и внутри капель нефтяного субстрата на поверхности плотной минеральной среды (Теппер и др., 1993). Способность микроорганизмов и их мутантных клонов к деструкции индивидуальных углеводородов парафинового ряда (0,4 г/л) определяли с помощью метода лунок (Егоров, 1976). Биотрансформирующую активность бактерий изучали в жидкой минеральной среде М9 с добавлением к ней в качестве единственного источника углерода одного из следующих субстратов, в процентах по весу: нефти (1,0), мазута (2,5), индивидуальных углеводородов: гептадекана (2,5), гексадекана (1,0), толуола (1,0) или декалина (1,0). Деградацию углеводородных субстратов исследуемыми культурами изучали в жидкой среде при различных значениях рН (3,5; 4,6; 5,0 и 7,0).

Деструктивную активность микроорганизмов устанавливали при их культивировании в жидких средах по остаточному содержанию нефтяных углеводородов гравиметрическим методом (Инструкция по контролю за состоянием почв..., 1990) или ИК-спектроскопией (Государственный контроль качества воды..., 2003) на спектрофотометре «Specord IR-75» после их экстракции четырёххлористым

углеродом. Деструкцию гептадекана, гексадекана и декалина оценивали методом газовой хроматографии (Хроматографический анализ..., 1979; Ларионова и др., 2005; Другое, Родин, 2007). Степень деструкции толуола рассчитывали на основании данных, полученных с помощью УФ-спектрофотометрии (Осипов, Белова, 1968). Оптическую плотность бактериальной суспензии штамма D. maris АМЗ, культивируемого на минеральной среде с гексадеканом (1,0%), определяли путём измерения на фотоколориметре КФК-2 при 1=540 нм через 1, 3 и 7 сут. культивирования. Прирост бактериальной биомассы определяли весовым методом (Стабникова и др., 1995). Эмульгирующую активность бактерий (экзогенную и эндогенную) определяли методом Купера (Cooper, Goldenberg, 1987). Для изучения гидрофобности клеток штамма D. maris АМЗ и его реизолятов применяли метод Е.В. Серебряковой с соавт. (2002), основанный на адсорбции бактериальных клеток на поверхности капель хлороформа.

Генетическую природу свойств деградации нефтяных углеводородов и ацидотолерантности изучали путём спонтанной элиминании этих свойств и индуцированной элиминации с использованием субингибируюших концентраций профлавина и налидиксовой кислоты (Миллер, 1976). 'Грансмиссивность свойства биодеградации углеводородов нефти с помощью конъюгационного переноса исследовалась по стандартной методике (Chakrabarty, 1980) с различными модификациями. Для трансформации клеток плазмидной ДНК применяли комбинированную методику, основанную на сочетании двух классических методов: кальциевой обработки и криотрансформации (Гловер, 1988). Плазмидную ДНК в исходных штаммах и предполагаемых элиминантах выявляли с помощью метода выделения, разработанного С.Н. Голубевым (2002), и последующего электрофореза в агарозном геле. Молекулярный размер плазмид определяли, сравнивая их электрофоретическую подвижность с подвижностью реперных плазмид, используя компьютерную программу «One-Dimensional Gel Analysis».

Приёмы микробной ремедиации исследовали в лабораторных экспериментах (почва со свежим загрязнением нефтью) и микрополевом (смешанный грунт с многолетним загрязнением нефтепродуктами). Для очистки от свежего нефтяного загрязнения использовали чернозём южный и тёмно-серую лесную почву, отобранные в Саратовской области. Почву инкубировали в пластмассовых контейнерах при температуре 25°С. В микрополевом масштабе грунт очищался на специально оборудованной площадке в естественных условиях. Для стимуляции естественных микробных сообществ в почву вносили отдельно или в различных комбинациях: минеральное удобрение азофоску, являющееся источником азота и фосфора, древесные опилки в качестве структуратора и неонол АФ9-12-С в качестве эмульгатора. В случае аугментации в почву и грунт интродуцировали штамм D. maris АМЗ в количестве 1х107 КОЕ/г почвы совместно со стимулирующими добавками, штамм Bacillus sp. УН2/5 вносили в почву в количестве 5x107 КОЕ/г почвы. В процессе очистки почвы и грунта регулярно проводили агротехническую обработку: рыхление один раз в неделю и поддержание влажности на уровне ~ 10-15%.

Динамика численности интродуцированного штамма D. maris АМЗ изучалась методом подсчёта характерных ярких кораллово-красных колоний на МПА (Практикум по микробиологии..., 2005), параллельно проводился твердофазный ИФА (вариант ELISA) (Иммуноферментный анализ..., 1988). Присутствие D. maris АМЗ в образцах почвенных суспензий выявляли с помощью кроличьих антител, специфичных к углеводным антигенам данного штамма. В качестве ферментной

метки использовали пероксидазу хрена, конъюгированную с козьими антикроличьими антителами. Субстратным реагентом являлся орто-фенилендиамин с перекисью водорода. Измерения оптической плотности исследуемых проб проводили при длине волны Х,=490нм на иммуноферментном анализаторе АИФ-Ц-01С с последующей обработкой результатов с помощью программы ЛабАРМ. Численность штамма Bacillus sp. УН2/5 оценивалась на селективной среде с антибиотиками. Общую гетеротрофную микрофлору (ОГМ) в почве во всех экспериментах учитывали общепринятым методом на МПА (Практикум по микробиологии..., 2005). Углеводородокисляющие микроорганизмы (УОМ) выявляли на агаризованной минеральной среде с дизельным топливом в качестве единственного источника углерода и энергии (Гузев и др., 1997), а также с помощью метода мембранных фильтров на среде с нефтью в качестве единственного источника углерода (A.c. СССР №1629319..., 1991). Количество клеток микроорганизмов азотного цикла определяли методом предельных разведений (Практикум по микробиологии..., 2005). Разведения почвенной суспензии высевали на соответствующие питательные среды: на среде Виноградского учитывали нитрифицирующие микроорганизмы; на среде Гильтея — денитрифицирующие; на мясопептонном бульоне (МПБ) - аммонифицирующие. Наиболее вероятное число микроорганизмов в единице объёма рассчитывали по таблице Мак-Креди, разработанной на основании методов вариационной статистики. Экологическую совместимость D. maris АМЗ с естественной почвенной микрофлорой изучали методом лунок и перекрёстных посевов (Руководство для большого практикума по микробиологии..., 1981).

Дыхательную активность почвы измеряли согласно (Основные микробиологические и биохимические методы..., 1987). Активность дегидрогсназ в почве определяли колориметрически на КФК-2 по восстановлению 2,3,5-трифенилтетразолий хлорида (ТТХ), активность каталаз измеряли с помощью титриметрического метода P.C. Кацнельсона и В.В. Ершова (Хазиев, 2005). Активность уреаз в почве определяли колориметрическим методом путём измерения количества аммиачного азота (Временные методические рекомендации..., 1984). Активность триацилглицерол-липаз в почве определяли титриметрическим методом К.А. Козловой, В.П. Кислицыной, Ю.А. Марковой и Э.Н. Михайловой (1968) (Хазиев, 2005). Количество в почве общего и растворимого углерода определяли методом И.В. Тюрина, подвижного фосфора (Р2О5) - с использованием солянокислой почвенной вытяжки (Временные методические рекомендации..., 1984), концентрацию в почвенных микрокосмах нитратного и аммонийного азота - согласно (Практикум по агрохимии..., 1987) и (Андреюк и др., 1988) соответственно. pH почвы измеряли согласно (ГОСТ 26483-85. Почвы).

Остаточное содержание нефтяных углеводородов в почве определяли гравиметрическим методом (РД 52.18.647-2003. Методические указания..., 2003), извлекая сумму неполярных и малополярных углеводородов из почвенного образца четырёххлористым углеродом с одновременной очисткой элюата на окиси алюминия в хроматографической колонке. Анализ фракций нефтепродуктов проводили в соответствии с методом Л.Г. Полуниной и Г.И. Кушина (Методы анализа органического вещества пород, нефти и газа..., 1977). Токсичность почвы до и после ремедиации оценивали в фитотесте на трёхсуточных проростках пшеницы сорта «Саратовская 29» и редиса сорта «Заря» по следующим показателям: всхожесть семян, %; средняя длина ростка и средняя длина корня (корневой системы для пшеницы), мм (Остроумов, 1990). Определение токсичности почвы проводили также

разработанным нами методом по дегидрогеназной активности штамма D. maris АМЗ путём сравнения количества 2,3,5-трифенилформазана (ТФФ), образованного дегидрогеназами тест-микроорганизма, в опытных и контрольных образцах.

Статистическая обработка результатов проводилась с использованием программы Microsoft Excel 2003. Достоверность различий полученных результатов оценивали с использованием коэффициента Стьюдента (Р>0,95).

3. ИЗУЧЕНИЕ РЯДА БИОЛОГИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ ШТАММОВ

При разработке приёмов биоремедиации нефтезагрязнённых почв, характеризующихся повышенной кислотностью, было изучено микробное сообщество нефтешлама (г. Саратов) с крайне низким значением рН (рН 1,15). Из состава данного экстремального сообщества выделено 13 микробных штаммов. Штаммы с лабораторными шифрами УН 1/1; УН 1/2; УН 2/1м; УН2/1к; УН 2/2м; УН 2/3м; УН 3/1; УН 3/2; УН 4/1 и УН 4/2 по совокупности изученных морфологических, хемотаксономических, физиолого-биохимических признаков были идентифицированы как Corynebacterium sp., два штамма: УН 1/3 и АМЗ - как Dietzia maris, один штамм УН 2/5 - как Bacillus sp. В ходе исследований установлено, что все выделенные микроорганизмы, входящие в состав микробного сообщества нефтешлама, в разной степени устойчивы к повышенной кислотности среды, они росли в мясопептонном бульоне в диапазоне рН 1-7 (табл. 1).

Таблица 1.

Показатели роста микроорганизмов через 7 сут. культивирования в МПБ в интервале __рН от 1 до 7 при исходной посевной дозе (ОР54о=Р,4 ед.)_

Штаммы Оптическая плотность (OD540) при различных значениях рН

7 5 3 1

Corynebacterium sp. УН 1/1 0,97±0,05 0,20±0,03 0,48±0,04 0,52±0,05

Corynebacterium sp. УН 1/2 1,16±0,07 0,24±0,03 0,54±0,04 0,50±0,05

D. maris УН 1/3 3,00±1,17 2,50±1,11 1,39±0,05 0,86±0,06

Corynebacterium sp. УН 2/1 к 1,20±0,05 0,65±0,05 0,44±0,04 0,47±0,04

Corynebacterium sp. УН 2/1м 1,35±0,06 0,85±0,05 0,77±0,04 0,64±0,05

Corynebacterium sp. УН 2/2м 1,40±0,05 0,95±0,06 0,72±0,04 0,66±0,05

Corynebacterium sp. УН 2/Зм 1,65±0,08 1,20±0,05 0,89±0,04 0,67±0,05

Bacillus sp. УН 2/5 2,24±0,12 1,84±1,0 1,29±0,05 0,84±0,06

Corynebacterium sp. УН 3/1 1,55±0,05 1,08±0,09 0,83±0,05 0,67±0,06

Corynebacterium sp. УН 3/2 1,06±0,08 0,79±0,07 0,56±0,04 0,48±0,04

D. maris AM3 3,20±0,19 2,68±1,11 1,92±0,07 0,77±0,05

Corynebacterium sp. У H 4/1 1,56±0,06 1,08±0,04 0,89±0,05 0,5б±0,05

Corynebacterium sp. УН 4/4 1,45±0,06 1,12±0,05 0,51±0,05 0,18±0,02

Бактерии были охарактеризованы как умеренные ацидофилы. Как известно, способность к росту при низких и высоких значениях рН обеспечивает микроорганизмам определённые преимущества в окружающей среде, т.к. в таких условиях конкуренция со стороны большинства других организмов невелика. Выявленный широкий диапазон роста данных штаммов мог свидетельствовать об их

приспособленности к изменяющимся условиям природной среды, что представляло интерес для практического использования бактерий в биоремедиации загрязнённых почв.

При изучении деструктивного потенциала микроорганизмов сообщества нефтешлама было показано, что все выделенные штаммы обладали способностью к росту на агаризованной среде, содержащей в качестве единственного источника углерода и энергии спектр углеводородных субстратов: сырую нефть, керосин, вазелиновое масло, дизельное топливо, ряд индивидуальных углеводородов: н-алканы и ароматические соединения (табл. 2).

Таблица 2.

Субстратный спектр исследуемых микроорганизмов_

Субстрат Оценка роста штаммов

1/1 1/2 1/3 2/1 к 2/1м 2/2 м 2/Зм 2/5 3/1 3/2 4/1 4/4 АМЗ

Сырая нефть + +- + + +- + +- + +- + + + +

Вазелиновое масло - - +- - - - - + - - - - +

Дизельное топливо -+ -+ + -+ +- +- -+ + +- +- - +- +

Керосин -+ -+ + -+ +- +- +- + -+ - - +- -

я-ялканы: Октан -+ -+ + -+ -+ +- +- + + -+ +- +- +

Гексан +- -+ + +- -+ +- +- + -+ +- +- -+ +

Гептан +- -+ + +- -+ +- +- + -+ -+ +- -+ +

Декан --I- -+ + +- -+ +- +- + -+ -+ + + +

Трвдекан -+ -+ + +- -+ -+ -+ + -+ -+ + + +

Гексадекан -+ -+ + -+ -+ -+ -+ + +- -+ +- +- +

Гептадекан -+ -+ + -+ -+ -+ -+ +- -+ -+ +- +- +

Ароматические углеводороды: Бензол +- + +- +- + +- +- +

Толуол -+ - + - - -+ +- + -+ +- +- +- +

Ксилол - -+ + +- -+ - - + -+ +- + +- +

Фенол -+ -+ + -+ -+ +- +- + -+ +- +- -+ +

Псевдокумол +- +- + -+ -+ -+ - + + -+ + + +

Амилбензол - - + +- - - -+ + -+ +- - + +-

Нафтены: Декалин -+ -+ + +- _ -+ + -+ -+ +- -+ +

Примечания: «-» - отсутствие роста; «-+» - едва выраженный рост; «+-» - небольшой рост; «+» - отчётливый рост.

По результатам качественного анализа было выделено несколько наиболее активных штаммов-деструкторов нефтяных углеводородов: D. maris 1/3, Bacillus sp. УН 2/5 и D. maris АМЗ. По данным ИК-спектроскопии деструкция нефти в жидкой среде при pH 3,5 изучаемыми штаммами составила от 29 до 47% за 14 сут. культивирования. У большинства штаммов деструкция углеводородов нефти в кислой среде происходила более эффективно, чем в нейтральной, например, у штаммов: Bacillus sp. УН 2/5, D. maris УН 1/3 и Corynebacterium sp. УН 4/1, которая составила 46,4, 44,0 и 29,6% соответственно (рис. 1). Штамм D. maris АМЗ свою максимальную деструктивную активность (до 70%) проявлял при нейтральных значениях pH,

степень деструкции нефтяных углеводородов мри культивировании этого штамма в среде с рН 3,5 составляла 47%.

Наблюдался значительный прирост биомассы D maris ЛМЗ по сырому весу ири культивировании штамма на минеральной среде с гексадеканом (Юг/л) в течение 7 сут., который составлял 1,38 г/л при рН 5,0 и 1,62 г/л при pll 7,0. что свидетельствовало о том, что данный углеводород являегся источником углерода и энергии, обеспечивающим активный рост клеток при исследуемых значениях рН.

70 60 °«50

* 40

О 30 г>

"20 ю о

□ рН3.5 @рН7,0

1/3

4/1

ЛМЗ

Рис. 1. Деструктивная активность штаммов по отношению к сырой нефти (10 г/л) при культивировании их в жидкой среде в течение 14 сут.

Степень деструкции гептадекана (25 г/л) штаммом D. maris АМЗ в жидкой среде за 7 сут. культивирования составляла 53,6% при рН 7,0 и 51,5% при pll 4,6; толуола (10 г/л) - 80,6% при нейтральном рН. Представитель нафтеновых углеводородов -декалин (10 г/л) разрушался штаммом D. maris АМЗ в жидкой среде при рН 7,0 на 9,5%. Данный штамм также осуществлял деградацию мазута (25 г/л) на 8,1% в жидкой среде за 14 сут. культивирования (рис. 2).

Рис. 2. Рост штамма О. maris ЛМЗ в жидкой среде с мазутом (25 г/л) в сравнении с контрольной незасеянной колбой

Таким образом, показано, что штамм D. maris АМЗ способен к деструкции как алкановых, так и ароматических углеводородов нефти. Данные особенности делают штамм особенно перспективным для его практического использования в биоремедиации нефтезагрязнённых природных объектов, т.к. деструкторы алканов, как известно из литературных данных (Churchill et al., 1999), обычно не затрагивают ароматические кольца углеводородов. К редкому сочетанию деструктивных свойств у штамма D. maris АМЗ добавляется также возможность осуществления им утилизации нефтяных углеводородов в условиях повышенной кислотности.

У D. maris АМЗ была обнаружена эмульгирующая активность по отношению к нефти, экзогенная активность составляла: Е24= 49,3% и Eiä= 37,3%, эндогенная -E4S=1 5,0%, что свидетельствовало о возможных преимуществах штамма в процессах утилизации нефтепродуктов, т.к. биоэмульгирующая активность микроорганизма в сочетании с биодеградирующей способностью может обеспечить большую биодоступность углеводородов в различных условиях. Показано, что D. maris АМЗ обладал также рядом экологических преимуществ, т.к. хорошо рос как на МПА, так и на агаризованной минеральной среде с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии в диапазоне pH: 4-9 и температуры: 10-40°С и в присутствии 10% NaCl.

В целом, полученные результаты свидетельствовали о перспективности использования штаммов микробного сообщества нефтешлама для очистки нефтезагрязнённых объектов окружающей среды, характеризующихся повышенной кислотностью. Штаммы хранятся в коллекции почвенных свободно-живущих и ризосферных микроорганизмов Учреждения Российской академии наук Институте биохимии и физиологии растений и микроорганизмов (г. Саратов).

4. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ

КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ ШТАММОВ

Известно, что на плазмидах часто локализованы гены, кодирующие биодеградацию органических соединений или устойчивость к абиотическим факторам окружающей среды (Измалкова и др., 2005; Whyte et al., 1998; Singh, Ward, 2004). В ходе выявления механизмов адаптационной устойчивости микроорганизмов сообщества нефтешлама к повышенной кислотности среды и определения природы генетического детерминирования признака деградации углеводородов нефти у исследуемых микроорганизмов был осуществлён плазмидный скрининг по PEG-DEX методу (Голубев, 2002). У десяти ацидотолерантных углеводородокисляющих штаммов Corynebacterium spp. обнаружены плазмидные ДНК, сходные по размеру (около 45-50 т.п.н.), у двух штаммов D. maris АМЗ и D. maris 1/3 обнаружены близко расположенные две плазмидные ДНК размером около 54 т.п.н. (рис. 3). У штамма Bacillus sp. 2/5 плазмидные молекулы не визуализировались.

Тот факт, что практически все исследованные штаммы микробного сообщества нефтешлама оказались плазмидосодержащими, согласуется с известными литературными данными о преимущественном распространении плазмид в загрязнённых местообитаниях (Хоменков и др., 2008; Leahy, Colwell, 1990; Wallace, Sayler, 1992). Результаты, показавшие наличие сходной плазмидной молекулы у десяти штаммов p. Corynebacterium, выделенных из одного источника, могли свидетельствовать о существовании горизонтального переноса плазмиды в микробном сообществе нефтешлама.

Установлено, что под действием ингибирующего агента профлавина свойство деструкции нефтяных углеводородов элиминировало с частотой от 1,3 до 5,0%, а свойство ацидотолераптности - с одинаковой частотой 12,5% у десяти кислотоустойчивых штаммов Corynebacterium spp., содержащих 45-50 т.п.н,-плазмидные ДНК. Плазмидный скрининг в 65 отобранных элиминантных клонах показал наличие корреляции между утратой плазмидной молекулы из штаммов и потерей свойства ацидотолерантности.

хр.

Рис. 3. Электрофореграмма плазмидной ДНК кислотоустойчивых нефтеокисляющих штаммов: I - Corynebacterium sp. УН 1/1; 2 - Coiynebacterium sp. УН 1/2; 3 - Coiynebacterium sp. УН2/1м; 4 - Corynebacterium sp. УН2/1к; 5 - Coiynebacterium sp. УН2/2м; 6 -Corynebacterium sp. УН2/Зм; 7 — Corynebacterium sp. УНЗ/1; 8 - Coiynebacterium sp. УНЗ/2; 9 - Corynebacterium sp. УН4/1; 10 - Corynebacterium sp. УН4/4; 11 - Bacillus sp. УН 2/5; 12 - D. maris 1/3; 13 - D. maris АМЗ; реперные плазмиды (т.п.н.): 14 - p90 (135); 15 - pSfl (54); 16 -рММВЗЗ (13,75); 17,I8-pUC19 (2,7)

В связи с чем было высказано предположение о контроле функции ацидотолерантности у штаммов Corynebacterium spp. плазмидными генами. Было показано, что данные плазмидные молекулы стабильно наследуются при хранении содержащих их штаммов в подкисленной среде.

Были получены доказательства высокой стабильности 54 т.п.н.-плазмиды штамма D. maris АМЗ при его культивировании в неселективных условиях (до 10 пассажей на МПА), а также при длительном хранении (в течение пяти лет на агаризованной LB-среде) в музейной коллекции. Установлено, что под действием ДНК-тропного агента (налидиксовой кислоты) с частотой 14% возникали клоны D. maris АМЗ с редуцированной способностью к утилизации нефтяных углеводородов. Последующий скрининг плазмидных ДНК в отобранных элиминантных клонах показал отсутствие экстрахромосомных элементов в четырёх из них (рис. 4).

хр .ДНК —

Рис. 4. Электрофореграмма плазмидной ДНК клонов штамма D. maris АМЗ, частично утративших способность к деструкции нефтяных углеводородов: 1 - исходный штамм D. maris АМЗ; 2 - 15н; 3 - 17н; 4 - 21н; 5 - 23н; 6 - 31н; 11 -34н; 12-44н; 13-46н; 14-47н; реперные плазмиды (т.п.н.): 7 - RP4 (39); 8 - R1 (93); 9 - R16 (103,5); 10 - R386 (117)

Морфологически эти клоны не отличались от исходного штамма D. maris АМЗ, формируя на МГ1А колонии с гладкой блестящей поверхностью и характерной яркой кораллово-красной окраской. Результат иммунодиффузионного анализа со специфическими антителами данного штамма показал, что углеводные антигены клеточной поверхности элиминантных клонов не претерпели каких-либо изменений и абсолютно идентичны данным структурам исходного штамма D. maris АМЗ. Степень деструкции гексадекана элиминантами составляла 53% и не отличалась от таковой у исходного штамма D. maris АМЗ. Оценка деструктивной активности данных элиминантов показала снижение способности к деструкции сырой нефти (в 2-5 раз), толуола (в 3-7 раз) и декалина (в 2-3 раза) по сравнению с исходным штаммом (рис. 5).

На основанни полученных данных о высокой частоте (14%) индуцированной элиминации свойства биодеградации углеводородов нефти, заметном снижении способности к деструкции нефти, толуола и декалина при утрате плазмидной ДНК штаммом D. maris АМЗ высказано предположение об участии плазмидных генов в процессе биодеградации нефтяных углеводородов. Обладающая кагаболическими генами клетка-хозяин имеет очевидное преимущество перед другими микроорганизмами, поскольку способность расщеплять поллютант является защитным механизмом и обеспечивает микроорганизм дополнительным источником углерода и энергии.

В ходе дальнейших исследований было обнаружено, что признак деструкции толуола с высокой частотой (10"3-10"5) передавался от донорного штамма D. maris АМЗ реципиентным бесплазмидным штаммам Rhodococcus sp. 261 и R. terrae А13 одновременно с переносом 54 т.п.н.-плазмиды. Показана принципиальная возможность передачи данной плазмиды с помощью трансформации в бесплазмидные клетки D. maris АМЗ. При оценке деструктивной активности

трансформантов по отношению к толуолу было показано, что степень деградации толуола составляла 75-78%, не отличаясь существенным образом от степени деградации у родительского штамма D. maris АМЗ. Результаты этик экспериментов явились доказательствами в пользу детерминации признака деструкции толуола генами, локализованными на 54 т.п.н.-плазмиде D. maris АМЗ.

Таким образом, полученные новые сведения о генетической регуляции свойств деградации нефтяных углеводородов и ацидотолерантности у микроорганизмов -членов сообщества нефтешлама раскрывают механизмы, лежащие в основе устойчивого функционирования данного сообщества. Вероятно, под селективным давлением загрязнителя и факторов окружающей среды у микроорганизмов экспрессируются плазмидные гены, обеспечивающие преимущества штаммов при существовании в экстремальных условиях (такие как использование широкого круга субстратов и возможность расти в кислой среде). Наличие у штамма D. maris АМЗ трансмиссивной катаболической плазмиды увеличивает метаболический потенциал аборигенного микробного сообщества и позволяет рассматривать данный штамм как источник распространения генетических элементов, ответственных за процессы разрушения углеводородов, что представляет перспективу для практического применения штамма.

5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮ1ЦИХ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ для РЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННОЙ ПОЧВЫ

Закономерности развития штамма D. maris АМЗ при его интродукции в нефтезагрязнённую почву. В связи с вышеперечисленными физиологическими, биохимическими и генетическими преимуществами штамма D. maris АМЗ исследовали возможность его использования для ремедиации нефтезагрязнённой почвы и грунта р лабораторных и микрополевом экспериментах (табл. 3).

При изучении экологической совместимости D. maris АМЗ с естественной почвенной микрофлорой методом перекрёстных посевов и методом лунок не было обнаружено угнетения роста D. maris АМЗ, несмотря на его замедленное развитие (35 сут.) по сравнению со многими исследованными быстрорастущими бактериями. Было установлено таким образом, что штамм обладал высокой конкурентной способностью по отношению к микроорганизмам естественных почвенных сообществ.

Для идентификации и мониторинга штамма D. maris АМЗ, интродуцированного в почву, был успешно апробирован иммунохимический тест на основе полученных поликлональных кроличьих антител, специфичных к углеводным антигенам клеточной поверхности данного штамма. Отработана качественная реакция, включающая высев бактерий из очищаемой почвы на МПА (методом последовательных разведений), получение препаратов углеводных антигенов и исследование данных антигенов в тесте иммунодиффузии со специфическими антителами. Продемонстрировано, что данный тест позволяет быстро и однозначно идентифицировать интродуцированный в почву штамм D. maris АМЗ (рис. 6А).

Таблица 3.

Условия проведения лабораторных и микрополевого экспериментов с использованием штамма P. maris АМЗ__

Эксперимент

Э1.1. Э1.2. 31.3. Э1.4. Э2.

Почва Чернозём южный Тёмно-серая лесная почва Чернозём южный* Чернозём южный Смешанный грунт с территории промышленных предприятий

Загрязнение Сырая нефть, 20 г/кг почвы, свежее загрязнение Многолетнее загрязнение нефтепродуктами, около 20 г/кг

Стимуляция, приёмы Внесение азофоски — 0,7 г/кг и структуратора (древесные опилки) - 1/3 объёма почвы; регулярный полив и рыхление почвы Регулярный пол ив и рыхление почвы Внесение азофоски -0,7 г/кг и структуратора (древесные опилки) -1/3 объёма почвы: ретулярный полив и рыхление почвы Внесение азофоски -0,7 г/кг; регулярный полив и рыхление почвы Внесение азофоски - 0,7 г/кг, структуратора (древесные опилки) - 1/3 объёма почвы, неонола АФ9-12-С-0,02 г/кг; регулярный нолпв и рыхление почнм

Аугментация, приемы Внесение D. maris АМЗ (1*! О7 КОЕ/r почвы), азофоски — 0,7 г/кг, структуратора (древесные олилки) ~ 1/3 объёма почвы; регулярный полив и рыхление почвы Внесение D. maris АМЗ (1*107 КОЕ/г почвы) Внесение D, maris АМЗ (1*107 КОЕ/г почвы), азофоски - 0,7 г/кг, структуратора (древесные опилки) -1/3 о&ьёма почвы; регулярный полив н рыхление почвы Внесение D. maris АМЗ (lxlO1 КОЕ/г почвы), азофоски - 0,7 г/кг, структуратора (древесные опилки) -1/3 объёма почвы; регулярный нолив и рыхление почвы

Самоочищение - - - Регулярный полив

Продолжительность эксперимента, сут. 90 30 30 60 ад

Примечание. * - почва после эксперимента с растениями.

Установлено, что полученные антитела могут выявлять специфический антиген не только в составе препаратов, изолированных с бактериальной поверхности D. maris АМЗ, но также и в супернатанте его культуральной среды (рис. 6Б), что свидетельствовало о высокой экскреции данного антигена исследуемыми бактериями в окружающую среду.

2 3

1 Г

¥ т

Рис. 6. Иммунодиффузионный анализ со специфическими антителами препаратов изолированных углеводных антигенов: (А) - 1 - D. maris АМЗ, 2- бактериальных клеток, высеянных из нефтезагрязненной почвы до интродукции D. maris АМЗ, 3 - после интродукции D. maris АМЗ; (Б) - 1 - с бактериальной поверхности D. maris АМЗ, 2 - из супернатанта культуральной среды D. maris АМЗ

Этот факт создал предпосылки для разработки высокочувствительного теста на основе твердофазного ИФА, который сделал возможным выявление изучаемого штамма-десгруктора непосредственно в почвенной суспензии, минуя стадию высева бактерий на питательную среду.

Динамику развития D. maris АМЗ в чернозёме южном (эксперименты Э1.1. и Э1.3.), тёмно-серой лесной почве (Э1.2.) со свежим нефтяным загрязнением и смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами (Э2.) оценивали двумя способами: твердофазным ИФА и классическим микробиологическим методом подсчёта кораллово-красных колоний D. maris АМЗ на МПА. Были обнаружены определённые закономерности развития штамма-интродуцента в разных почвенных сообществах (рис. 7). Максимальное развитие штамма во всех экспериментах наблюдалось через 7-14 сут., затем происходило снижение его численности до исходного уровня внесения.

Данные, полученные с помощью двух методов исследования численности D. maris АМЗ (ИФА и микробиологический анализ), существенным образом коррелировали. При этом обнаружено, что максимальная численность штамма рег истрировалась с помощью микробиологического анализа через 7 сут., а с помощью ИФА - через 14 сут., что, на наш взгляд, связано с периодом накопления специфического антигена в почве. Характерно, что во всех проведённых экспериментах титр D. maris АМЗ до конца обработки сохранялся на достаточно высоком уровне (около 107 КОЕ/г почвы), что свидетельствовало о жизнеспособности данного интродуцента в различных загрязнённых почвах.

сутки

|—А—по результатам ИФА —И-по данным микробиологического анализа |

Рис. 7. Корреляция между значениями численности штамма D. maris АМЗ в чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением в эксперименте Э1.3. (А) и смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами в эксперименте Э2. (Б), полученными методом ИФА и с помощью микробиологического анализа

Лучше всего исследуемый штамм-интродуцент развивался в чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением (максимальное увеличение - в 373 раза через 14 сут. после внесения), что связано, скорее всего, со свойствами этой почвы, отличающейся высоким содержанием органических и минеральных элементов. Менее интенсивно штамм развивался в тёмно-серой лесной почве и чернозёме южном, используемом вторично после вегетационного эксперимента, увеличиваясь в численности в 6-26 раз.

Наименьшее развитие D. maris АМЗ наблюдалось в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами (в 2-10 раз), что обусловлено рядом причин: физико-химическими и биологическими особенностями грунта, который менее питателен, чем почвы, разнообразием и сроком действия загрязнителей, что могло способствовать накоплению в нём токсичных метаболитов, образующихся при разложении углеводородов, разнообразием аборигенных микробных сообществ, возникшим при смешивании различных грунтов и создающим для интродуцента жёсткие конкурентные условия и др.

В целом, наблюдаемая динамика специфического антигена D. maris АМЗ в почве, несомненно, отражала развитие штамма в процессе ремедиации и характеризовала направленность этого процесса, что позволяет рекомендовать метод ИФА для практического использования при проведении биоремедиационных работ для мониторинга интродуцированных микроорганизмов, что может существенно улучшить прогнозируемость хода и эффективности очистки.

Изучение реизолятов штамма Р. maris АМЗ после культивирования на углеводородных субстратах. Исследование характеристик реизолятов нефтеокисляющего штамма D. maris АМЗ после культивирования на углеводородных субстратах, с одной стороны, представляло интерес с точки зрения появления у него новых свойств в результате возможных изменений в клеточной мембране, с другой -это было необходимо для подтверждения генетической и функциональной стабильности микроорганизма, предназначенного для очистки нефтезагрязнённых объектов. Были изучены рсизоляты D. maris АМЗ после культивирования штамма в нефтезагрязнённой почве и фунте в течение трёх месяцев, а также в жидкой минеральной среде (рН4,6 и 7,0) с гексадеканом (10 г/л) в качестве единственного источника углерода и энергии после культивирования в течение 14 сут.

Установлено, что после культивирования штамма на углеводородных субстратах увеличивается гидрофобность клеток (максимально на 15,5%). У ряда реизолятов обнаружена повышенная способность к деструкции индивидуального углеводорода гептадекана при рН 7,0 (на 5-22%), сырой нефти - максимум на 6% (рис. 8). Отмечена положительная корреляция между повышенными значениями деструктивной активности в отношении нефтяных углеводородов и увеличенной гидрофобностью клеток. Обнаруженные изменения связаны, скорее всего, с увеличением содержания суммарных клеточных липидов и другими модификациями в гидрофобном липидном слое клеточной оболочки D. maris АМЗ и благоприятны для штамма, являющегося активным нефтеокисляющим микроорганизмом.

Дегидрогеназная активность у некоторых реизолятов была выше, чем у исходного штамма (максимально - на 17%). На основании изучения реизолятов выявлено повышение резистентности D. maris АМЗ к антибиотическим веществам после культивирования его на нефтяных углеводородах, что также связано с изменениями в клеточной оболочке бактерий. У реизолятов обнаружена высокая стабильность плазмидных молекул, эмульгирующей активности по отношению к нефти и способности к деструкции толуола. Результат иммунодиффузионного анализа со специфическими антителами данного штамма показал отсутствие изменений в углеводных антигенах клеточной поверхности реизолятов.

g 70

I 60

0 ffi

g 50

1 40

=г ^

& 30

о а>

5 20 X

й)

ш 10 О

■ нефть, pH 7,0

□ гептадекан, pH 7,0

□ гептадекан, pH 4,6 ППГ

АМЗ 1

10 16 18 19 Реизоляты

L1 L2 KG1 KG2

Рис. 8. Степень деструкции нефти, гептадекана (при рН 7,0 и 4,6) штаммом D. maris АМЗ и его реизолятами и показатель гидрофобности (ПГ) бактериальных клеток

Выявленные особенности позволяют рассматривать штамм как эффективный и стабильный деструктор и свидетельствуют о перспективности длительного использования D. maris АМЗ для биоремедиации нефтезагрязнённых почв.

Изучение процессов ремедиации нефтезагрязнённой почвы на основе интродукции штамма Bacillus sp. УН2/5. У штамма Bacillus sp. УН2/5, который был выбран по высоким показателям способности к деструкции сырой нефти в жидкой среде, была изучена нефтеокисляющая активность в почве. Данный микроорганизм, как было установлено, отличался высокой жизнеспособностью в нейтральной и кислой почве в условиях нефтяного загрязнения. Через 15 сут. численность данного штамма в кислой (pH 3,5) и нейтральной (pH 7,0) стерильной почве с нефтью была на уровне вносимой дозы: 5><107 КОЕ/г почвы, при пониженных значениях pH почвы -несколько выше, чем при нейтральных.

Увеличение численности Bacillus sp. УН2/5 в нефтезагрязнённом чернозёме южном без дополнительных стимулирующих мероприятий происходило примерно на порядок через 15 сут. после внесения, что сравнимо с ростом D. maris АМЗ в чернозёме южном, используемом после вегетационного эксперимента, и смешанном грунте с многолетним нефтяным загрязнением при дополнительном внесении различных добавок.

Показано, что интродукция Bacillus sp. УН2/5 в почву способствовала более высокой численности ОГМ и УОМ (на 2 и 3 порядка), чем стимуляция естественного микробного сообщества путём внесения минерального удобрения, полива и рыхления почвы. Данный штамм обеспечивал высокую степень деградации нефти (49,5% за 15 сут.), которая в два раза превышала степень деградации при биостимуляции (24,3%). В целом, полученные данные свидетельствовали, что Bacillus sp. УН 2/5 не только

отличается высокой жизнеспособностью в кислой среде, но и способен к эффективной деструкции нефтяных углеводородов в кислой и нейтральной почве, что представляет практический интерес.

6. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ САМООЧИЩЕНИЯ

НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННОЙ ПОЧВЫ И ТЕХНОЛОГИЙ БИОРЕМЕДИАЦИИ

Динамика развития микробных сообществ в нефтезагрязнённой почве в процессе самоочищения, стимуляции и аугментации на основе интродукции штамма Р. maris АМЗ. Для того чтобы доказать преимущества использования той или иной технологии биоремедиации нефтезагрязнённой почвы, необходимо было выявить основные биологические факторы и механизмы, определяющие эффективность применения различных технологий. В первую очередь, определяли закономерности развития микробных почвенных сообществ при использовании биотехнологий очистки. Условия проведения экспериментов представлены в таблице 3.

В ходе экспериментов было установлено, что первый месяц после начала ремедиационных мероприятий загрязнённой почвы, а в большинстве случаев - это 714 суток - период наибольшего развития и аборигенной, и интродуцированной микрофлоры в почве (рис. 9 и 10). После максимального развития численность штамма-интродуцента D. maris АМЗ снижалась, численность ОГМ и УОМ также постепенно уменьшалась, что может быть связано с уменьшением концентрации органических субстратов в почве. Нами установлено, что на содержание УОМ и ОГМ влияла численность интродуцированного в почву штамма D. maris АМЗ, особенно в период его максимального развития (первый месяц ремедиации).

Доля интродуцированного штамма в популяции УОМ в почве со свежим загрязнением составляла на протяжении эксперимента 40-80%, на последнем этапе очистки - 70%, что свидетельствует о высокой выживаемости штамма D. maris АМЗ в нефтезагрязнённой почве. При оценке количества УОМ в образцах грунта с многолетним загрязнением подсчитывали колонии на мембранных фильтрах с нефтью (рис. 11). На рисунке хорошо видны ярко-окрашенные колонии штамма D. maris АМЗ в соответствующем варианте очистки через 3 сут. после интродукции.

Сравнивая динамику развития ОГМ и УОМ в разных почвах, необходимо отметить, что наибольшее развитие микроорганизмов происходило в чернозёме южном (эксперимент Э1.1.). При стимуляции, основанной на внесении удобрения совместно со структуратором, регулярном поливе и рыхлении почвы, численность ОГМ максимально увеличилась в 63 раза, УОМ - на три порядка через 7 сут., при аугментации численность ОГМ максимально увеличилась в 220 раз (рис. 9А), УОМ -на четыре порядка через 14 сут. (рис. ЮБ). При аугментации численность ОГМ и УОМ в этой почве была выше, чем при стимуляции, на всём протяжении эксперимента.

20 30 сутки В

• ОГМ в чистой почве; ♦ ОГМ при самоочищении; - ОГМ при аугментации;---D. maris АМЗ

—ВОГМ при стимуляции;

Рис. 9. Динамика численности ОГМ в процессе биоремедиации чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением в экспериментах: Э1.1. (А), Э1.3. (Б), Э1.4. (В) и смешанного грунта с многолетним загрязнением нефтепродуктами в эксперименте Э2. (Г)

УОМ при самоочищении; -

40 50 сутки

УОМ при стимуляции;

— УОМ в чистой почве; -А УОМ при аугментации

Рис. 10. Динамика численности УОМ в процессе биоремедиации чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением (А) в эксперименте Э1.4.; (Б): 1 - стимуляция, 2 -аугментация чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением в эксперименте Э1.1.; 3 — стимуляция, 4 - аугментация смешанного грунта с многолетним загрязнением нефтепродуктами в эксперименте Э2.

А Б

Рис. 11. Колонии УОМ, обнаруживаемых в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами через 3 сут. использования приёмов стимуляции (А)

и аугментации(Б)

Внесение удобрения без структуратора способствовало меньшему развитию микроорганизмов в чернозёме южном (ОГМ и УОМ в 35 раз через 30 сут.) (рис. 9В и 10А), так же, как и использование стимуляции и аугментации в чернозёме южном, используемом после вегетационного эксперимента (ОГМ в 6 и 11 раз через 7 и 14 сут. соответственно) (рис. 9Б). Минимальное увеличение численности ОГМ и УОМ при стимуляции и аугментации происходило в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами - в 2-2,5 и 8-10 раз (рис. 9Г и 10Б). Численность ОГМ в грунте при аугментации слегка превышала значения при стимуляции в период от 7 до 30 сут., численность УОМ при аугментации была выше, чем при стимуляции в период от 7 до 45 сут. Наиболее высокая численность УОМ в грунте в обоих вариантах обнаруживалась через 3 сут. ремедиации (рис. 1 ОБ и 11).

Через 7 сут. после внесения в грунт D. maris АМЗ доминировал над остальными членами микробного сообщества (рис. 12), через 90 сут. в очищаемом грунте обнаруживались в равном количестве колонии других микроорганизмов.

Рис. 12. Микробные сообщества загрязнённого грунта, очищаемого с помощью интродукции штамма D. maris АМЗ через 7 сут. (А) и 90 сут. (Б)

В этих условиях интродукция D. maris АМЗ способствовала подавлению развития плесневых грибов в очищаемом грунте, которые обнаруживались через 75

сут., в отличие от фунта со стимулирующими приёмами, где плесневые грибы стали выявляться уже через 14 сут.

Таким образом, развитие ОГМ и УОМ в нефтезафязнённой почве при использовании биотехнологий, как было показано, зависит от стимулирующих добавок, свойств почвы, типа и срока действия зафязнителя. Важно подчеркнуть, что при самоочищении нефтезагрязнённой почвы не происходило существенного увеличения содержания ОГМ и УОМ, что уменьшало потенциальную возможность микроорганизмов почвенного сообщества к быстрой утилизации зафязнителя.

В ходе исследований было продемонстрировано, что стимуляция естественной микрофлоры почвы путём внесения минерального удобрения, регулярного полива и рыхления почвы способствовала активизации процессов аммонификации, свидетельствующих об интенсификации процессов обмена азотсодержащих органических веществ, денитрификации, что предполагало возможное участие деиитрификаторов в процессах биодеградации углеводородов (рис. 1 ЗА и Б).

сутки сутки

сутки

- в чистой почве; ♦ при самоочищении; В при стимуляции

Рис. 13. Динамика численности аммонифицирующих (А), денитрифицирующих (Б) и нитрифицирующих (В) микроорганизмов в нефтезагрязнённом чернозёме южном (эксперимент Э1.4.)

Происходила стимуляция численности нитрифицирующих микроорганизмов, которые среди других бактерий наиболее заметно ингибировались под воздействием нефтяного зафязнения (рис. 13 В).

Численность аммонифицирующих, денитрифицирующих и нитрифицирующих микроорганизмов увеличилась примерно в 10 раз через 14 сут. и сохранялась на этом уровне до конца эксперимента. Функциональная стабильность как характерный пример самоорганизации и саморегулирования микробных сообществ обеспечивается

развитием в нефтезагрязнённой почве своеобразных «компенсационных» механизмов, соответствующих «тонкой настройкой» биоценоза на различных уровнях, изменением ритмики функционирования микробных сообществ. Примером развития таких «компенсационных» механизмов является резкое увеличение численности и активности микроорганизмов, принимающих участие в круговороте азота, несмотря на ингибирующее влияние нефтяных углеводородов на функциональную активность почвенных ферментов.

Показатели численности микроорганизмов азотного цикла отражали интенсификацию очистки загрязнённой почвы при использовании технологии стимуляции по сравнению с естественным самоочищением и могли служить в качестве мониторинговых показателей биоремедиации.

Изменение показателей биологической активности почвы в процессе ремедиации. Оценка возможности использования этих показателей для мониторинга процессов очистки. При оценке функционального состояния микробоценозов нефтезагрязнённых почв в процессах биоремедиации изучали динамику показателей биологической активности почвы. Показано увеличение интенсивности почвенной респирации, являющейся интегральным показателем общей биологической активности почвы (рис. 14).

0,5

5 0,45

6 0.4

0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0

- Э1,1., чистая почва

-----\3

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 сутки

Рис. 14. Динамика почвенного дыхания в процессе ремедиации чернозёма южного (эксперимент Э1.1.): I - стимуляция, 2 - аугментация и смешанного грунта с многолетним загрязнением нефтепродуктами (эксперимент Э2.): 3 - стимуляция, 4 - аугментация

Максимальная интенсивность почвенной респирации и в чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением, и в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами, наблюдалась к 30 суткам - периоду максимального развития микроорганизмов почвенного сообщества.

В этот период интродукция D. maris АМЗ в чернозём южный способствовала повышению почвенной респирации в большей степени, чем стимулирующие приёмы, а в грунте с многолетним загрязнением данный показатель был выше в варианте с интродуцентом только на ранних этапах очистки (7-14 сут.).

Показатели активности ферментов в почве перспективны для мониторинга процессов очистки почв от различных загрязнителей, в связи с тем, что активность ферментов в почве определяется с высокой точностью, простотой и является устойчивым и чувствительным показателем биогенносги почв. В настоящих экспериментах способы очистки, основанные на стимуляции природных микроорганизмов почвенного ценоза и интродукции нефтеокисляющего штамма D. maris АМЗ, приводили к увеличению активности дегидрогеназ в почве и грунте, особенно выраженному в первый месяц ремедиации, что связано с интенсивным развитием почвенных микроорганизмов, в том числе и УОМ, и высокой скоростью биодеградации нефтяных углеводородов в этот период (рис. 15).

сутки

чистая почва; -

самоочищение:

О 10 20 30 40 50 60 70 80 90 сутки

стимуляция; —А-вугментация

Рис. 15. Динамика активности дегидрогеназ в процессе биоремедиации чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением (А) в эксперименте Э1.4.; (Б): 1 - стимуляция, 2 -аугментация чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением в эксперименте Э1.1.; 3 — стимуляция, 4 - аугментация смешанного грунта с многолетним загрязнением нефтепродуктами в эксперименте Э2.

Дегидрогеназы катализируют реакции дегидрирования органических веществ и выполняют функцию промежуточных переносчиков водорода, таким образом, они принимают непосредственное участие в разложении углеводородов. Поэтому увеличение активности дегидрогеназ в загрязненной углеводородами почве напрямую связано с биодеградацией углеводородов.

При этом интродукция штамма D. maris АМЗ в нефтезагрязнённый чернозём южный способствовала большему увеличению активности дегидрогеназ через 30 сут. по сравнению со стимулирующими приёмами, через 90 сут. активность дегидрогеназ в этом варианте увеличилась ещё заметнее, в 4 раза превышая активность в почве при использовании стимуляции и в 2,6 раза в исходной чистой почве (рис. 15Б). В этом варианте очистки максимальные показатели дегидрогеназной активности почвы соответствовали минимальному остаточному содержанию нефтяных углеводородов (рис. 16А). При стимуляции аборигенных микроорганизмов в чернозёме южном, напротив, дегидрогеназная активность плавно снижалась вместе с убылью загрязнителя, что может быть связано с накоплением в почве продуктов деградации углеводородов, оказывающих ингибирующий эффект на дегидрогеназы.

S £1,5

10 15 20

С нефтепродуктов, г/кг

■ стимуляция д аугментация

7,4 7,6 7,8

lg числа КОЕ/г почвы

Рис. 16. Зависимость дегидрогеназной активности от концентрации нефтепродуктов в черноземе южном в эксперименте Э1.1. (А); от численности ОГМ в грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами (Б)

В грунте с многолетним загрязнением как при интродукции штамма D. maris АМЗ, так и при использовании стимулирующих приёмов наблюдалось одинаковое повышение дегидрогеназной активности, наиболее заметное - через 7 сут.: примерно в 1,7 раза. Обнаружены положительные корреляции между активностью дегидрогеназ и численностью ОГМ (стимуляция и аугментация в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами) (рис. 16Б) и У ОМ (стимуляция в чернозёме южном с помощью внесения удобрения, рыхления и полива почвы), что свидетельствовало о вкладе почвенной микрофлоры в общий пул почвенных дегидрогеназ. При самоочищении почвы от нефтяного загрязнения

повышения дегидрогеназной активности почвы не происходило, как и увеличения численности ОГМ и УОМ.

В ходе проведённых экспериментов было установлено, что при очистке почвы от нефтяных ингредиентов активность каталаз в почве увеличивалась, что связано, как мы полагаем, с активизацией аэробных процессов в ходе ремедиации. Данное предположение подтверждалось установленной обратной корреляционной зависимостью между активностью каталаз и остаточным содержанием нефтяных углеводородов в почве. Высокоактивный кислород, образующийся при участии каталаз, обеспечивает доступным кислородом микроорганизмы, участвующие в процессах разложения углеводородов.

В чернозёме южном при стимуляции естественной микрофлоры путём внесения удобрения, регулярного полива и рыхления почвы, активность каталаз в период 14-60 сут. значительно возрастала, превышая значения в почве при самоочищении примерно в 4 раза (рис. 17А).

А Б -чистая почва; ♦ самоочищение; —И-стимуляция; —А-аугментация

Рис. 17. Динамика активности каталаз в процессе биоремедиации чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением в эксперименте Э1.4. (А) и смешанного грунта с многолетним загрязнением нефтепродуктами в эксперименте Э2. (Б)

Повышенная активность каталаз в почве при использовании технологии стимуляции по сравнению с самоочищением может свидетельствовать о более интенсивной очистке почвы от нефтяньгх углеводородов и служить критерием, характеризующим процесс ремедиации.

Наблюдалась более выраженная активность каталаз в нефтезагрязнённом чернозёме южном с шггродуцированным штаммом по сравнению со стимуляцией в конце очистки (эксперимент Э1.1.) и в грунте с многолетним загрязнением в период 7 и 30 сут. (рис. 17Б), что может свидетельствовать о преимуществах использования штамма-интродуцента D. maris АМЗ для ремедиации нефтезагрязнённой почвы.

Показано увеличение липазной активности в почве со свежим нефтяным загрязнением и грунте с многолетним загрязнением с ходом ремедиации, максимальные значения активности липаз наблюдались на последних этапах очистки (рис. 18). Такой результат связан, по нашему мнению, с индукцией активности почвенных липаз продуктами распада нефтяных углеводородов, увеличением метаболической активности и биомассы микроорганизмов, утилизирующих липиды,

и возможным накоплением в почве с ходом очистки липидоподобных веществ биологического и химического происхождения, являющихся субстратами для липаз. Установлено, что технология стимуляции способствует большей активизации липаз по сравнению с самоочищением, а технология аугментации ещё большей активизации как в почве, так и в грунте.

А Б

! в

-чистая почва; + самоочищение; -Щ-стимуляция; —А-аугмснтация

Рис. 18. Динамика активности липаз в процессе биоремедиации чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением в эксперименте Э1.4. (А), эксперименте 31.1. (Б) и смешанного грунта с многолетним загрязнением нефтепродуктами в эксперименте Э2. (В)

В чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением наибольших значений липазная активность достигала в образце с добавлением штамма D. maris АМЗ в течение всего периода наблюдений, в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами - на определённых этапах очистки (45 и 75 сут.). При этом максимальному уровню очистки соответствовала. максимальная интенсификация активности липаз в почве, что позволяет рассматривать данную ферментативную активность как перспективный показатель мониторинга процессов биоремедиации нефтезагрязнённой почвы.

Активность уреаз в чернозёме южном со свежим нефтяным загрязнением (эксперимент Э1.4.) возрастала через 30 и 60 сут. при стимуляции аборигенной микрофлоры путём внесения удобрения, регулярного полива и рыхления почвы в 1,4 и 4 раза по сравнению с исходной почвой, превышая показатели при самоочищении в 1,2 и 3 раза соответственно (рис. 19).

сутки

-чистая почва; + самоочищение; -щ-етимуляция; —А-аугментация

Рис. 19. Динамика активности уреаз в процессе биоремедиации чернозёма южного со свежим нефтяным загрязнением в эксперименте Э1.4. (А) и Э 1.1. (Б)

Повышенный уровень активности уреаз при использовании технологии стимуляции может свидетельствовать о более высокой интенсивности гидролитических процессов в очищаемой почве и, следовательно, о биодеградационных процессах, что совпадало с повышенной степенью деструкции нефтяных углеводородов в этом варианте. В то же время, высокие уровни активности уреазы не всегда благоприятны, т.к. приводят к значительным потерям азота мочевины (Девятова, 2005), что отрицательно сказывается на азотном балансе почвы. В чернозёме южном со штаммом-интродуцентом (эксперимент Э1.1.) активность уреаз была примерно в 1,4 раза выше в период 14-60 сут., чем при стимуляции естественной микрофлоры путём внесения удобрения со структуратором, регулярного полива и рыхления почвы.

В целом, в вариантах очистки с максимальной активностью дегидрогеназ, каталаз, липаз и уреаз в почве наблюдалось максимальное увеличение численности ОГМ и УОМ по сравнению с другими вариантами и максимальная степень деградации нефтяных углеводородов. При самоочищении почвы дегидрогеназная, каталазная, липазная и уреазная активности в ней не увеличивались. Таким образом, динамика исследованных показателей биологической активности нефтезагрязнённой почвы и грунта отражала характер процессов очистки, выявляла преимущества различных технологий ремедиации, что даёт возможность использовать эти показатели для мониторинга процессов очистки почв от углеводородных загрязнителей.

Оценка токсичности почвы после ремедиации. В ходе фитотестирования чернозёма южного (эксперимент Э1.1.) показано, что на основании всхожести семян и средней длины корня проростков редиса почва после ремедиации была нетоксичной, по результатам средней длины ростка редиса - слаботоксичной, по всем показателям проростков пшеницы фитотоксичность почвы оценивалась как средняя (табл. 4). В присутствии штамма-интродуцента средняя длина корня проростков редиса была на 26,6% выше, чем при стимуляции.

Таблица 4.

Фнтотестирование почвы на проростках пшеницы и редиса __

Тестовое растение Варианты эксперимента Длительность эксперимента, сут. Показатель

Всхожесть Средняя длина корня Средняя длина ростка

% %от контроля мм % от контроля мм 1 % от контроля

Эксперимент Э1 Л.

Пшеница сорта «Саратовская 29» котроль, чистая почва 92,5*2.24 100 119,1*3,11 100 20.8*0,45 100

стимуляция 0 80.fttl.83 S6,5*2,33 46,2*0,82 38,8*0,92 4.1*0,13 19,7*0,53

90 82,5*2.65 89,2*2,12 70,3*1.27 59,0*0,57 12.7*0,33 61,1*0,83

аугментация 0 80,0*1,83 86,5*2,33 46,2*0,82 38,8*0,92 4,1*0.13 19,7*0,53

90 86,6*2,23 93,6*2,93 73,4*1,56 61,3*2,06 11,3*0.41 54,3*1,21

Релис сорта «Заря» контроль, чистая почва 95.0*2,75 100 40,2*1,07 НЮ 27,4*0,49 100

стимуляция 0 85,0*3,04 89,5*3,23 11,6*0,32 28,9*0.52 4.0*0,18 14,2*0,76

90 98,3*2,77 103.5*3,46 36,5*0,94 90,8*2,04 17,8*0,73 65.0*1,53

аугментация 0 85.0*3.04 89,5*3.23 11,6*0,32 28,9*0,52 4,0*0,18 14,Z*0,76

90 95,8*3,05 100,8*3.45 47,2*1,24 117,4*3,10 17.6*0.84 64,2*1,44

Эксперимент Э2.

Пшеница сорта «Саратовская 29» контроль, чистая почва 95,0*1,97 100 138,5*2,78 100 34,05*1,22 100

стимуляция 0 90,0*1,58 94,7*2,58 100,6*2,42 72.6*2,24 17,9*1,96 52,5*1.62

90 86,7*2,88 91,2*3,11 92.8*2,56 67.0*2,18 13,1*0,63 38,3*0.76

аугментация 0 83,3*3,36 87,7*3.41 72.9*1,95 S2.6±0,86 12,0*0.38 35,2*1.20

90 85,0*1,86 89,5*1,98 85,3*2,29 61,6*0,76 12.4*0.88 36,3*1.41

Редис сор-га «Заря» контроль, чистая почва 82,5*2,57 100 24.9*1,05 100 16,3*0,56 100

стимуляция 0 88,3*3,54 107,1*3.06 40,7*3.31 163.3*3,77 7.4*0,20 45.5*0,60

90 91,6*3,77 111,0*3,13 3S,7±2,62 155,4*3,15 8.0*0.41 49,4*0,81

аугментация 0 83,3*3,35 101,0*3,89 40.1*1,56 160.9*3,06 7,6*0,38 46,9*0,56

90 100.0*3,70 121,2*3,89 49,2*1.29 197,4*3,18 7,4*1.04 45,3*1,04

Таблица 5.

Оценка токсичности почвы с помощью фитотсстировамия на проростках редиса и по дегидрогеназной активности штамма ____Р. пшп.ч АМЗ (эксперимент Э1.4.) _______________

Вариант эксперимента Длительность эксперимента. сут. I 1окаш ель

Вс хожесть семян Средняя длина корня Средняя длина ростка Содержание ТФФ

■ ы '! о о г КОНТрОЛЯ мм % от контроля мм % от контроля МКГ'МЛ % от контроля

Контроль, чистая почва 92.5*3.76 100 29.5 И.87 100 25,3*2.41 100 100

Самоочищение 0 87,542,89 94,6*2.96 26.41:2.89 89.4*2.97 20.8*1,49 82.2*2.02 60,1*1,18 27.1*1.54

30 84,3*2.44 9I.1-2.4X 31,2*2,42 105.7*2.76 15.5*1,12 61,2*2.11 55,5*1,01 25.0*1,34

60 109.612.35 101,4*2.58 30.2il.4S 102.U-3.09 36.2*1,9.5 142,9*2.97 24,4*0.29 11,0*0,41

Стимуляция 0 79,5*2.45 К6.0±2,63 25,13*2.93 85.2*2,96 20,3*0.49 80.2*2.54 60.1*1.18 27.1*1.54

.ад 80.М.65 86.Ki2.76 32.0* \.95 Ш.6*3.<» I2.2i0.45 48,2*1.37 HJ.3tl.18 37.5*1.92

60 85,3*2,91 92.2*2.95 31.9*0.97 108.312.98 42.2*1.49 166.7*3,07 40,6*1.31 18.3*1,40

После очистки смешанного грунта с многолетним загрязнением нефтепродуктами стимуляцией естественного микробного сообщества токсичность почвы по отношению к пшенице несколько увеличилась, по отношению к редису не изменилась, сохранялось угнетённое развитие надземной части проростков (табл. 4). При внесении штамма D. maris АМЗ наблюдалась тенденция к снижению токсичности, что, на наш взгляд, связано с подавлением данным штаммом патогенных микромицетов в почве, которые, как известно (Киреева и др., 2005; Назаров, Иларионов, 2005), увеличиваются в численности при нефтяном загрязнении и определяют фитотоксичность нефтезагрязнённой почвы. Данное предположение подтверждалось микробиологическим анализом - плесневые грибы при этом способе обработки появились значительно позже и в меньшем количестве.

Было установлено, что через 60 сут. очистки чернозём южный (эксперимент Э1.4.) по всем изученным показателям был нетоксичным для проростков редиса (табл. 5). При стимуляции естественного микробного сообщества путём внесения удобрения, полива и рыхления почвы токсичность почвы была ниже по показателю средней длины корня и ростка проростка редиса, чем при самоочищении.

В ходе исследований нами был разработан метод определения токсичности нефтезагрязнённой почвы после биоремедиации по дегидрогеназной активности бактерий. Дегидрогеназы высоко чувствительны к действию ядовитых веществ, в присутствии которых их активность снижается, что позволило нам путём сравнения количества ТФФ, образованного дегидрогеназами микробного штамма D. maris АМЗ, в опытах и контроле оценить степень токсичности исследуемых образцов почвы. Следует отметить, что разработанный и апробированный нами метод биотестирования прост, хорошо воспроизводим, обеспечивает получение точных и стабильных результатов. Для анализа используются непосредственно образцы почвы, а не почвенная вытяжка, как в методах на основе гидробионтов (инфузорий, дафний и др.), что позволяет наиболее достоверно оценить токсичность почвы. Метод обладает высокой чувствительностью, он позволяет регистрировать возможность образования в почве опасных метаболитов токсикантов.

При оценке токсичности нефтезагрязнённого чернозёма южного (эксперименты Э1.1. и Э1.4.) по дегидрогеназной активности тест-организма D. maris АМЗ наблюдались тенденции, обнаруженные при фитотестировании: через 30 сут. ремедиации показана средняя степень токсичности почвы (табл. 5). Установлено, что очистка почвы, основанная на стимуляции аборигенной микрофлоры, способствует снижению токсичности почвы в большей степени, чем процесс самоочищения, а использование штамма-интродуцента снижает токсичность почвы сильнее, чем стимулирующие приёмы, через 30 сут., т.е. в период максимального развития и активности почвенных микроорганизмов. В конце очистки в обоих экспериментах обнаруживались различия между двумя способами оценки токсичности почвы: почва оказалась не токсичной для растений, но ещё токсичной для микробных ферментов, что свидетельствует о необходимости использования нескольких оптимальных биотестов для достоверной оценки токсичности почвы после биоремедиации.

Изменение содержания нефтяных углеводородов и ряда агрохимических показателей в ходе ремедиации. Эксперименты показали, что первый месяц после начала ремедиационных мероприятий загрязнённой почвы характеризовался максимальным развитием аборигенной и интродуцированной микрофлоры в почве, активностью дегидрогеназ в почве и максимальной скоростью деструкции нефтяных углеводородов.

В ходе экспериментов было установлено, что при стимуляции естественного почвенного сообщества внесением минерального удобрения совместно с регулярным поливом и рыхлением почвы (эксперимент Э1.4.) убыль общих нефтяных

углеводородов в чернозёме южном в ходе очистки была выше на 13-15%, чем при самоочищении. В случае свежего нефтяного загрязнения чернозёма южного (эксперимент Э1.1.) интродукция D. maris АМЗ способствовала убыли общих нефтяных углеводородов на 39% в почве за 30 сух, что было в два раза выше степени их разложения аборигенным микробным сообществом при стимуляции путём внесения удобрения со структуратором, регулярного полива и рыхления почвы, которая составила 19% за данный период (рис. 20). Значительная разница в убыли нефти свидетельствовала о высокой активности интродуцированного штамма в течение первого месяца очистки. Через 90 сут. эта разница исчезла. Разрушение нефтяных углеводородов в почве при внесении штамма достигла 66, а при стимуляции - 60%.

сутки

Рис. 20. Степень деструкции общих нефтяных углеводородов в эксперименте Э1.1. (1 - стимуляция, 2 - аугментация) и Э2. (3 - стимуляция, 4 - аугментация)

В смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами степень его очистки при внесении нефтеокисляющего штамма АМЗ была даже несколько ниже в первый месяц, чем при биостимуляции, и сходные результаты наблюдались через 3 мес. очистки (50 и 48% в почве при стимуляции и аугментации соответственно). При ремедиации фунта происходило некоторое увеличение концентрации нефтепродуктов, наблюдаемое в период от 30 до 60 сут. в варианте с использованием стимуляции и от 45 до 75 сут. в варианте с интродукцией штамма, что можно объяснить снижением связывания загрязнителя с грунтом за счёт процессов, происходящих при ремедиации (МаПа, С1ое1е, 2005), кроме того, под воздействием температуры, влажности и механической обработки разрушились агрегаты с высоким содержанием твёрдых нефтепродуктов, что можно было наблюдать визуально.

В условиях свежего загрязнения нефтью аборигенной микрофлоре необходимо время для адаптации к загрязнителю, поэтому, на наш взгляд, внесение активного штамма-деструктора ускоряло процесс очистки в первый месяц. Многолетнее загрязнение, выступающее в роли селекционирующего фактора для УОМ, создало повышенный деструктивный потенциал микробных сообществ, который реализовался при использовании оптимального комплекса стимулирующих мероприятий.

Показано, что как при свежем нефтяном загрязнении почвы, так и многолетнем загрязнении фунта, убыль нефтепродуктов происходила в основном за счёт разложения парафино-нафтеиовых углеводородов, через 90 сут. степень их

деградации составляла 53-58%, существенной разницы между двумя способами обработки не наблюдалось. Хорошо также разрушались моно- и бициклические ароматические соединения в почве с интродуцентом и без него - на 52 и 59% при свежем нефтяном загрязнении чернозёма южного и на 49 и 39% - при многолетнем загрязнении грунта При внесении штамма в свежезагрязнённую почву эффективнее разрушалась фракция ПАУ (41 против 18% при стимуляции) и спирго-бензольных смол (41 против 23% при стимуляции). При многолетнем загрязнении грунта, наоборот, концентрация ПАУ в почве при использовании стимулирующих приёмов снижалась сильнее, чем в почве со штаммом. Снижения содержания фракции смол в грунте не происходило, через 90 сут. оно было выше исходного.

В смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами исследовали динамику агрохимических показателей. Было показано увеличение содержания общего углерода через 45 сут. ремедиации, что прямо коррелировало с увеличением содержания общих нефтепродуктов в почве в этот период. Содержание водорастворимого углерода увеличивалось через 45 сут. в почве со штаммом D. maris АМЗ, и через 90 сут. оно было выше, чем в исходной почве. Наблюдаемые тенденции можно объяснить тем, что в смешанном грунте происходят разнонаправленные процессы. С одной стороны, развитие почвенной микрофлоры связано с потреблением запасов растворимого углерода, с другой - разрушение нефтепродуктов с давним сроком загрязнения сопровождается увеличением содержания водорастворимого углерода в почве. Содержание нитратного азота в обоих вариантах очистки на протяжении всего эксперимента было низким. Содержание аммонийного азота и подвижного фосфора в первой половине ремедиации снижалось, что было сопряжено с интенсивными процессами окисления нефтепродуктов, в последний месяц - увеличивалось, вероятно, вследствие высвобождения связанного аммонийного азота из почвы в процессе очистки и подвижного фосфора в ходе минерализации микробной биомассы. Изменения pH почвы в ходе очистки были несущественными.

Обоснование использования приёмов биоремедиации почв при свежем и многолетнем нефтяном загрязнении. В ходе экспериментов обнаружено, что при самоочищении почвы от свежего нефтяного загрязнения не происходило существенного увеличения содержания ОГМ и УОМ, активности почвенных дегидрогеназ и каталаз, численность денитрификаторов и нитрификаторов, активность липаз и уреаз в почве была меньше, чем при использовании приёма стимуляции естественного микробного сообщества Токсичность этой почвы, напротив, была выше, чем при стимуляции. В связи с этим, убыль нефтяных углеводородов при самоочищении почвы на всём протяжении эксперимента была ниже на 13-15%, чем при стимуляции естественного микробного сообщества. Таким образом, на основании эффективности очистки почвы от свежего нефтяного загрязнения показано преимущество приёма стимуляции аборигенной микрофлоры перед самоочищением.

При внесении штамма D. maris АМЗ в чернозём южный со свежим нефтяным загрязнением на всём протяжении эксперимента следующие показатели биологической активности почвы были выше, чем при стимуляции аборигенной микрофлоры: численность ОГМ, УОМ, почвенное дыхание, активность дегидрогеназ, липаз и уреаз. Это способствовало, по нашему мнению, интенсификации процессов биодеградации нефтяных углеводородов, степень разрушения которых после первого месяца очистки была в два раза выше, чем при биостимуляции. Это преимущество D. maris АМЗ при необходимости может использоваться специалистами-биотехнологами для ускорения ремедиации в климатических зонах с коротким тёплым сезоном. Почва со штаммом-интродуцентом также отличалась меньшей

токсичностью в конце очистки по результатам фитотестирования и тестирования по дегидрогеназной активности D. maris АМЗ на определённом этапе ремедиации (30 сут.).

Ускорение и улучшение качества очистки загрязнённой почвы под влиянием штамма D. maris АМЗ позволяет рекомендовать его для ремедиации почв при свежем нефтяном загрязнении.

Сохранение жизнеспособности и активности штамма при повышенной кислотности среды даёт возможность применять его в условиях, когда естественные микробные сообщества малочисленны или не способны полноценно функционировать.

В смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами внесение D. maris АМЗ не ускоряло очистку, при использовании приёмов стимуляции и аугментации наблюдалась одинаковая скорость и степень разложения нефтяных углеводородов. И при выборе способа очистки приём стимуляции может быть рекомендован как экономически более выгодный. В то же время, штамм-интродуцент положительно влиял на биологическую активность грунта. Наблюдались повышенные значения численности ОГМ от 7 до 30 сут., УОМ - от 7 до 45 сут., почвенного дыхания -от 7 до 14 сут., активности каталаз - в период 7 и 45 сут., липаз - 45 и 75 сут. по сравнению со стимуляцией естественного микробного сообщества. Также существенным было снижение фитотоксичности очищенного фунта под влиянием D. maris АМЗ, что связано, вероятно, с ингибирующим действием данного штамма на фитопатогенные микромицеты. Влияние штамма D. maris АМЗ на качество очистки, что существенно для восстановления плодородия почв, предусматривает применение данного микроорганизма для очистки почвы или грунта от многолетнего нефтяного загрязнения.

7. ПОЛУЧЕНИЕ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩЕГО БИОПРЕПАРАТА ПУТЁМ СТИМУЛЯЦИИ АБОРИГЕННОЙ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ

Реализовать принцип создания оптимальных условий для развития природной нефтеокисляющей микрофлоры в ряде случаев проще в лабораторных или промышленных биореакторах. Нами оценивалась эффективность деградации углеводородов нефти в почве и воде с помощью технологии, основанной на обогащении образцов загрязнённой почвы в лабораторных условиях аборигенными УОМ и индукции их ферментативных систем, катализирующих дефадацию углеводородов нефти.

Для получения жидкой обогащенной культуры использовалась почва, длительное время загрязнённая нефтью, поскольку в этом случае УОМ микробного почвенного сообщества уже адаптированы и частично активизироваиы. На первом этапе образцы нефтезагрязнённой почвы культивировали в жидкой среде с разными добавками. В ходе проведённых исследований было установлено, что среди исследуемых добавок (табл. 6), стимулирующих развитие почвенных УОМ при культивировании их в виде почвенной суспензии, оптимальным был следующий комплекс, г/л: нефть - 5,0, минеральные компоненты - 10,0 и синтетическое моющее средство (CMC)-0,2.

Таблица 6.

Варианты стимуляции развития УОМ в почвенной суспензии_

Вариант Вносимые добавки, г/л

минеральные компоненты нефть парекс глюкоза CMC синтанол

1 10,0 5,0 - - - -

2 10,0 - 5,0 - - -

3 10,0 5,0 - - - 0,02

4 10,0 5,0 - - 0,2 -

5 10,0 5,0 - 10,0 - -

6 10,0 - - 10,0 - -

7 10,0 - - - - -

Количество УОМ возрастало на пять порядков (до величин кратных 109 клеток) по сравнению с исходным содержанием (рис. 21).

Повторное внесение питательных субстратов стимулировало развитие в среде УОМ в среднем на два порядка При этом наибольший эффект оказывало добавление Ь-бульона и мелассы по отдельности и в различных комбинациях. При аналогичной подготовке обогащённой культуры в твёрдой фазе количество УОМ увеличивалось примерно в 700 раз, хотя их максимальное содержание в почве было также около 109 КОЕ/г.

сутки

Рис. 21. Динамика численности УОМ в процессе культивирования почвенной суспензии с внесением стимулирующих добавок (номер вариантов соответствует табл. 6)

После предварительной обработки образцы, являющиеся по сути биопрепаратом - источником активной нефтеокисляющей микрофлоры, вносили в загрязнённые образцы почвы и воды одновременно с необходимыми добавками, повышающими эффективность утилизации загрязнителя. Для этой цели был использован лучший вариант жидкой обогащённой культуры с максимальной численностью УОМ (табл. 6, вариант №4), который вносили в количестве 107 КОЕ/г(мл) с различными комбинациями минеральных добавок и CMC (табл. 7).

Таблица 7.

Варианты очистки загрязнённых образцов с помощью жидкой обогащенной культуры

УОМ

Вариант Образцы Исходная концентрация нефти, г/л(кг) Вносимые добавки, г/л(кг)

минеральные компоненты смс

1. Вода 5,0 10,0

2. то же 5,0 10,0 0,2

Контроль 1. -II- 5,0 - -

3. -II- 50,0 10,0

4. -II- 50,0 10,0 0,2

Контроль 2. -II- 50,0 - -

]. Почва 5,0 10,0

2. то же 5,0 10,0 0,2

Контроль 1. -II- 5,0 - -

3. -II- 50,0 10,0

4. -II- 50,0 10,0 0,2

Контроль 2. -II- 50,0 - -

Определение остаточного содержания нефтепродуктов в очищаемых образцах обнаружило, что использование обогащенной жидкой культуры позволило деградировать нефть за 15 сут. на 98,9-100% от исходного содержания 5 г/л(кг) как в воде, так и в почве (рис. 22).

.111 _

я нефш, г/л

варианты

Рис. 22. Степень деградации нефти в загрязнённых водных (А) и почвенных (Б) образцах (номер вариантов соответствует табл. 7) за 15 сут. использования жидкой обогащенной культуры

контроль

концентрация 1':ШТ /. г/Л

При содержании в опытных образцах нефти в количестве 50 г/л(кг) её деструкция в почве составляла 65,0-66,8%, в жидкой среде наблюдали близкие результаты: 62,8-65,0%. В контрольных вариантах убыль нефти составляла: 2,7% в водной среде и 14,4% в почве. Таким образом, степень очистки с помощью биопрепарата была выше по сравнению с контролем в 4-8 раз в почве и в 18-24 раза в воде в зависимости от концентрации в них нефти (5 и 50 г/л(кг)).

Такой способ активизации аборигенных микробных сообществ почвы может иметь большие перспективы для практического использования, он экологически безопасен, достаточно экономичен и легко осуществим для очистки загрязнённых объектов даже большого масштаба

В целом, проведённые исследования, основанные на комплексной оценке изменений, происходящих в почве и её микробных сообществах в условиях нефтяного загрязнения при использовании технологий биоремедиации, продемонстрировали пути повышения эффективности различных приёмов микробной очистки нефтезагрязнённых почв. Одним из них является внесение исследованных уникальных нефтеокисляющих микроорганизмов D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН2/5, способных ускорять очистку и улучшать её качество. Использование специализированных углеводородокисляющих бактерий для ликвидации нефтяного загрязнения в кислых почвах отличается научной новизной. Установленная в ходе исследований целесообразность применения штаммов D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН2/5 для очистки почв, различающихся по своим свойствам и по срокам нефтяного загрязнения, значительно расширила современные представления о возможностях нефтеокисляющих микроорганизмов.

Полученные новые данные о биологических и эколого-функциональных свойствах микробного сообщества нефтешлама с низким значением pH, в том числе, обнаруженная плазмидная детерминация свойств ацидотолерантности и деструкции нефтяных углеводородов у микроорганизмов сообщества, способствуют пониманию устойчивого функционирования естественных микробных сообществ в экстремальных условиях и создают предпосылки для использования природных процессов в технологиях очистки.

ВЫВОДЫ

1. Выделенные из микробного сообщества нефтешлама (pH 1,15) 13 штаммов, идентифицированные как Corynebacterium spp., Dietzia maris и Bacillus sp., являются умеренными ацидофилами, утилизирующими нефтяные углеводороды в широком диапазоне pH.

2. Новый штамм D. maris АМЗ обладает рядом функциональных и экологических преимуществ, к которым относятся: рост в широком диапазоне pH (49) и температур (10-40°С), в присутствии 10% NaCl, способность к деструкции алкановых и ароматических углеводородов нефти, биоэмульгирующая активность по отношению к нефти, наличие трансмиссивной катаболической плазмиды с высокой стабильностью. После культивирования на углеводородных субстратах увеличивается гидрофобпость клеток и нефтеокисляющая активность штамма D. maris АМЗ.

3. Свойство ацидотолерантности у бактерий Corynebacterium spp. и деградации нефтяных углеводородов у штамма D. maris АМЗ, входящих в микробное сообщество нефтешлама, детерминируется плазмидными генами.

4. Микроорганизмы D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5, интродуцированные в нефтезагрязнённые кислые и нейтральные почвы, отличаются высокой жизнеспособностью. Интродукция штаммов в почву со свежим нефтяным загрязнением ускоряет очистку в 2 раза в течение первого месяца ремедиации по сравнению с приёмом стимуляции, интенсифицирует биологическую активность почвы и способствует снижению её токсичности.

5. Иммунохимические методы анализа применимы для выявления штамма D. maris АМЗ в почве в процессе биоремедиации и количественной оценки динамики его численности. С помощью твёрдофазного иммуноферментного анализа установлено, что при интродукции штамма D. maris АМЗ в почву, его максимальное развитие происходит через 7-14 суток (на 1-3 порядка в зависимости от почвы и загрязнителя).

6. При свежем нефтяном загрязнении приём стимуляции естественного микробного сообщества почвы способствует более эффективной убыли нефтяных углеводородов, активизации биологической активности почвы и снижению её токсичности по сравнению с самоочищением, а в случае многолетнего загрязнения этот приём сравним по степени деструкции нефтепродуктов с интродукцией штамма D. maris АМЗ, который на определённых этапах ремедиации повышает биологическую активность и снижает токсичность почвы.

7. Показатели активности почвенных ферментов: дегидрогеназ, каталаз, липаз и уреаз, отражающие направленность процессов биодеградации нефтяных углеводородов в почве, обусловленных развитием и активизацией аборигенных и интродуцированных микроорганизмов, а также показатели токсичности очищенной почвы, определяемые по дегидрогеназ ной активности тест-микроорганизма, являются индикаторными для мониторинга процессов биоремедиации.

8. Оптимальная комбинация стимулирующих добавок, включающая нефть, минеральные компоненты и CMC, активизируя аборигенные углеводородокисляющие микроорганизмы в образцах загрязнённой почвы, способствует получению биопрепаратов в виде почвенной суспензии, которые эффективно очищают нефтезагрязнённую почву и воду.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

* - публикации в печатных изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ

Научные статьи:

1. Плешакова Е.В., Турковская О.В. Создание и использование биокатализаторов для деструкции минеральных масел // Биотехнология. - 1993. - № 11-12. - С. 46-49.

2. Турковская О.В., Муратова А.Ю., Плешакова Е.В., Панченко Л.В. Утилизация отработанных моющих растворов с помощью микроорганизмов // Химия и технология воды. -1996.-Т. 18, №2.-С. 212-216.

3. Turkovskaya O.V., Muratova A.Yu., Panchenko L.V., Pleshakova E.V. Utilization of spent detergent solution and lubricating cooling liquids // Global Environmental Biotechnology / Ed. D.L. Wise. - Amsterdam: Elsevier Science B.V., 1997. - P. 799-805.

4. Плешакова E.B., Тимофеева З.Ю. Изучение стабильности микробной деструкции анионного поверхностно-активного вещества еульфонола // Химия для медицины и ветеринарии; Сб. науч. тр. - Саратов: Изд-во СГУ, 1998. - С. 146-150.

* 5. Плешакова Е.В., Муратова Л.Ю., Турковская О.В. . Деградация минерального масла штаммом Acinelobacler calcoaceticus // Прикл. биохим. и микробиол. - 2001. - Т. 37, №4. -С. 398-405.

6. Panchenko L., Turkovskaya О., Volkov М., Muratova A., Dubrovskaya Y., Pleshakova Y., Pozdnyakova N. Large scale in situ bioremediation of oil-slime // Proceeding of 3rd International Conference OIL POLLUTION: Prevention, Characterization, Clean Technology. - Gdansk, Poland, 2002. - P. 25-33.

7. Pleshakova Ye.V., Pozdnyakova N.N., Turkovskaya O.V. Stimulation of the indigenous hydrocarbon-oxidizing microflora in the oil-contaminated soil // Proceeding of 3rd International Conference OIL POLLUTION: Prevention, Characterization, Clean Technology - Gdansk, Poland, 2002.-P. 33-41.

8. Турковская O.B., Панченко Л.В., Дубровская E.B., Плешакова Е.В., Муратова А.Ю., Позднякова Н.Н., Игнатов В.В. Биотехнологии для очистки окружающей среды // Высокие технологии - путь к прогрессу: Сб. науч. тр. - Саратов: Научная книга, 2003. - С. 76-81.

9. Pleshakova Е., Dubrovskaya Е., Turkovskaya О. Stimulation of the activity of oil oxidizing microorganisms in contaminated soil // Proceeding of 8th International FZK/TNO Conference on Contaminated Soil. - Gent, Belgium, 2003. - 8 p.

* 10. Плешакова E.B., Дубровская E.B., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры // Биотехнология. - 2005. - № 1. - С. 42-50.

11. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Турковская О.В. Интродукция нефтеокисляющего штамма Dietzia maris в загрязненную почву // Сборник статей / Под ред. О.В. Турковской. - Саратов: Научная книга, 2005. - С. 148-156.

* 12. Плешакова Е.В., Позднякова Н.Н., Турковская О.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путем стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры // Прикл. биохим. и микробиол. — 2005. - Т. 41, № 6, - С. 634-639.

13. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Эффективность технологий микробной очистки почв от нефтяного загрязнения // Энергосбережение в Саратовской области. - 2006. - № 2 (24). - С. 17-19.

14. Pleshakova Е., Dubrovskaya Е., Turkovskaya О. Stimulation of the activity of oil oxidizing microorganisms in contaminated soil // New Research on the Environment and Biotechnology / Eds. A.E. Kuznetsov and G.E. Zaikov. - Nova Science Publishers, Inc., New York, 2006. - P. 7-49.

15. Слюзова О.В., Груздева М.С., Плешакова Е.В. Снижение воздействия кадмий содержащих токсичных веществ на живые организмы // Энергосбережение в Саратовской области. - 2007. -№ 2 (28). - С. 24-26.

16. Плешакова Е.В., Голубев С.Н., Турковская О.В. Биодеградация нефтяных углеводородов штаммом Dietzia maris, ее генетические особенности И Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. - 2007. - Т. 7, Вып. 1. - С. 54-57.

* 17. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Сравнение эффективности интродукции нефтеокисляющего штамма Dietzia maris и стимуляции естественных микробных сообществ для ремедиации загрязненной почвы // Прикл. биохим. и микробиол. - 2008. - Т. 44, №4.-С. 430-437.

18. Плешакова Е.В., Голубев С.В., Колесникова О.В. Изучение реизолятов штамма Dietzia maris АМЗ после его культивирования на углеводородных субстратах II Биологические науки Казахстана. - 2008. - № 1. - С. 53 -59.

19. Плешакова Е.В., Шейкина А.С. Восстановление численности микроорганизмов азотного цикла в процессе рекультивации нефтезагрязненной почвы // Энергосбережение в Саратовской области. - 2008. - №3 (33). - С. 37-39.

20. Плешакова Е.В. Генетический анализ микробных консорциумов модельной установки для очистки сульфонолсодержащих сточных вод, возможности его практического использования // Вода и экология. Проблемы и решения. —2008. —№ 3. —С. 50-56.

21. Dubrovskaya Е., Pleshakova Е., Turkovskaya О. Using molasses for stimulation of the degradative and activities of the microbial community in soil contaminated with oil shale liquid fuel // Soil Contamination: New Research / Ed. A.N. Dubois. - USA: Nova Science Publishers, 2008. - P. 121-138.

22. Плешакова Е.В., Нежинская Е.Г. Изменение биологической активности нефтезагрязненной почвы при самоочищении и использовании технологии стимуляции аборигенной микрофлоры // Вестник ОГУ. Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала». -2009. - Ч. III. - С. 79-481.

23. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Турковская О.В. Применение иммунохимических методов для мониторинга штамма Dietzia maris, интродуцированного в нефтезагрязненную почву // Бюллетень МОИП. - 2009. - Т. 114, вып. 3. Приложение 1. Ч 2. Экология. Природные ресурсы. Рациональное природопользование. Охрана окружающей среды. - С. 233-239.

24. Плешакова Е.В., Варюшин A.B. Приёмы биотестирования для оценки токсичности нефтезагрязнённой почвы в процессе биоремедиации // Сб. науч. тр. 4-ой Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов». - Саратов, 2009. - Ч. 1. - С. 50-52.

25. Беляков А.Ю., Плешакова Е.В., Любунь Е.В., Решетников М.В. Изменение активности ферментов в почве, загрязненной тяжелыми металлами, в процессе фиторемедиации // В мире научных открытий. - 2010. - № 4 (10), Ч. 5. - С. 34-36.

* 26. Плешакова Е.В., Кабанцева Е.Г., Черновол B.C. Активность дегидрогеназ в нефтезагрязненных почвах как инструмент мониторинга технологий биоремедиации //Известия Саратовского университета. Серия Химия. Биология. Экология. - 2010. - Т. 10, Вып. 1. - С. 4047.

27. Плешакова Е.В., Любунь Е.В., Варюшин A.B., Нежинская Е.Г. Оценка токсичности загрязнённой почвы после биоремедиации по дегидрогеназной активности бактерий // Первые Международные научно-практические Беккеровские чтения: Сб. науч. тр. - Волгоград, 2010. -4.2.-С. 302-303.

* 28. Плешакова Е.В. Разработка нового метода определения токсичности нефтезагрязнённой почвы // Вестник СГТУ. -2010. -№ 3 (46), Вып. 1. - С. 188-193.

* 29. Плешакова Е.В. Экологические аспекты кислотоустойчивости нефтеокисляющих микроорганизмов в ходе биоремедиации загрязнённых почв // Поволж. экол. журн. - 2010. -№ 4. -С. 375-383.

* 30. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Турковская О.В. Нефтеокисляющий штамм Dietzia maris и возможности его использования для биоремедиации загрязненной почвы // Вестник МГОУ. Серия Естественные науки. -2010. - №4. - С. 82-89.

Патенты:

* 31. Патент RU 2 288 044 С1, МПК В09С 1/08. Способ очистки грунта от нефтяных загрязнений / Дубровская Е.В., Турковская О.В., Плешакова Е.В. - 9 е.: ил. Опубликовано

27.11.2006. Бюл.№ 33.

* 32. Патент RU 2 301 258 С2, МПК C12N 1/26 В09С 1/10. Способ очистки грунта от нефтяных загрязнений / Дубровская Е.В., Турковская О.В., Плешакова Е.В. - 9 е.: ил. Опубликовано

20.06.2007. Бюл. № 17.

Учебно-методические пособия:

33. Общая биология: Материалы к гос. аттестации выпускников по спец. 011600 - «Биология» / Степанов С.А., Забалуев А.П., Плешакова Е.В. и др. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. - 232 с.

34. Руководство к практическим занятиям по экологической токсикологии: Учеб. пособие для студ. биол. фак., обуч. по спец. 011600, 032400.00 «Биология», 013100 «Экология» / Сост. Е.В. Плешакова, С.А. Коннова, Е.В. Степанова, О.В. Слюзова; Под ред. проф. В.В. Игнатова. -Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. - 56 с.

35. Экология. Материалы к государственной аттестации выпускников по специальности -«Экология» / Аникин В.В., Беляченко A.B., Плешакова Е.В. и др. - Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2009.- 188 с.

Тезисы и материалы конференций:

36. Dubrovskaya E.V., Pleshakova E.V., Panchenko L.V., Muratova A.Yu. Structure of ABS- and Aph-degrading microbial communities // Abstr. Book of 9"1 European Congress on Biotechnology. -Brussels, Belgium, 1999. - ECB9/2717.

37. Turkovskaya О., Panchenko L., Dubrovskaya E., Pleshakova E., Pozdnyakova N. The application of active sludge in bioremediation processes // Abst. Book of Seventh International FZK/TNO Conference on Contaminated Soil. - Leipzig, Germany, 2000. - V. 2. - P. 1296.

38. Плешакова E.B. Генетические аспекты деструкции сульфонола микробными консорциумами модельной установки // Мат. 2-го съезда Вавиловского общества генетиков и селекционеров. - Санкт-Петербург, 2000. - Т. 2. - С. 17.

39. Pleshakova E.V., Turkovskaya O.V., Pozdnyakova N N. Method for stimulation the development of hydrocarbon-oxidizing microorganisms in soil // Abst. Book of 9th International Symposium on Microbial Ecology. - Amsterdam, The Netherlands, 2001. - P. 23.056.

40. Турковская O.B., Панченко JI.B., Муратова А.Ю., Дубровская Е.В., Плешакова Е.В., Позднякова Н.Н. Использование активного ила в процессе биоремедиации // Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды: Тез. докл. конф. - Пущино, 2001. - С. 7374.

41. Dubrovskaya Е., Pleshakova Е., Turkovskaya О. Study of dynamic for the development of microbial association during the biostimulation of oil-contaminated soil // Abstr. book of Xй1 International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology, The world of microbes. - Paris, France, 2002. - P. 203.

42. Плешакова E.B., Дубровская E.B. Исследование динамики микробного сообщества нефтезагрязненной почвы в процессе биорекультивации // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Мат. первой региональной конференции молодых ученых. - Саратов, 2002. - С. 6.

43. Плешакова Е.В. Использование ацидотолерантных микроорганизмов для восстановления нефтезагрязненных земель // Научная конференция молодых ученых, аспирантов и студентов, посвященная 115-летию со дня рождения академика Н.И. Вавилова: Тез. докл. - Саратов, 2002 -С. 103.

44. Турковская О.В., Дубровская Е.В., Муратова А.Ю., Панченко Л.В., Плешакова Е.В., Позднякова Н.Н. Возможности современных приемов биоремедиации окружающей среды // Биотехнология - состояние и перспективы развития: Мат. 1-го Международного конгресса. -Москва, 2002. - С. 290.

45. Dubrovskaya E.V., Pleshakova E.V., Turkovskaya O.V. Possibilities of use of a biostimulation method for cleaning up soil polluted by a high concentration of residual oil // Abstr. of International Symposium Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants. - Saratov, Russia, 2003. - C. 10-11.

46. Плешакова E.B. Перспективы использования кислотоустойчивых микроорганизмов для восстановления нефтезагрязненных земель // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Тез. докл. 2-го Московского международного конгресса. - Москва, 2003. - Ч. 2. - С. 37-38

47. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю. Изучение эффективности биоремедиации нефтезагрязненной почвы при интродукции в нее штамма Rhodococcus maris АМЗ //Биотехнология - охране окружающей среды: Тез. докл. 2-ой международной научной конференции. - Москва, 2004. - С. 178.

48. Плешакова Е.В. Влияние интродукции штаммов-деструкторов на эффективность биоремедиации нефтезагрязненных почв // Стратегия взаимодействия микроорганизмов с окружающей средой: Мат. второй региональной конференции молодых ученых. - Саратов, 2004. - С. 49-50.

49. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Турковская О.В. Перспективы использования нефтеокисляющего штамма Dietzia maris для биоремедиации загрязненной почвы //«Вавиловские чтения-2004»: Мат. Всероссийской научно-практической конференции, посвященной 117-й годовщине со дня рождения академика Н.И.Вавилова. - Саратов, 2004. -С. 85-87.

50. Плешакова Е.В. Ремедиация загрязненной почвы с использованием нефтеокисляющего штамма Dietzia maris // Биотехнология: состояние и перспективы развития: Тез. докл. 3-го Московского международного конгресса. - Москва, 2005. - Ч. 2. - С. 26-27.

51. Плешакова Е.В., Матора Л.Ю., Никифоров М.В. Интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненную почву // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей

окружающей среды: Тез. докл. международной научной конференции. - Саратов, 2005. - С. 8788.

52. Панченко Л.В., Дубровская Е.В., Плешакова Е.В., Турковская О.В. Рекультивация почвогрунтов, загрязненных нефтепродуктами в условиях промплощадок: опыт in situ и ex situ // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Тез. докл. международной научной конференции. - Саратов, 2005. - С. 86-87.

53. Дубровская Е.В., Плешакова Е.В., Турковская О.В. Нефтеокисляющий потенциал почвенных микробных сообществ в процессах биоремедиации загрязненных почв и грунтов // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Тез. докл. международной научной конференции. - Саратов, 2005. - С. 68.

54. Турковская О.В., Муратова А.Ю., Дубровская Е.В., Плешакова Е.В., Голубев С.Н., Бондаренкова А.Д. Деструктивный потенциал микроорганизмов и возможности его повышения // Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал; Мат. 2-ой международной конференции. - Пермь-Казань-Пермь, 2005. - С. 101-102.

55. Плешакова Е.В. Изучение штамма-деструктора углеводородов нефти Dietzia maris АМЗ и возможности его использования для биоремедиации загрязненной почвы // Актуальные проблемы современной микробиологии: Тез. докл. Всерос. Молодежной школы-конференции. -Москва, 2005. - С. 101-102.

56. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Использование нефтеокисляющих микроорганизмов для ремедиации загрязненных почв // Микробные биотехнологии: Тез. докл. Международной научной конференции. - Одесса, 2006. - С. 204.

57. Колесникова О.В., Плешакова Е.В. Исследование гидрофобное™ и деструктивной активности реизолятов нефтеок-исляющего штамма Dietzia maris //Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой: Мат. Ill межрегиональной конференции молодых ученых. - Саратов, 2006. - С. 50.

58. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязненную почву: проблемы и перспективы // Микроорганизмы и биосфера: Мат. Международной научной конференции. - Москва, 2007. - С. 97-98.

59. Pleshakova Е., Dubrovskaya Е., Turkovskaya О. Dynamics of dehydrogenase and catalase activities in oil-polluted soil, as studied with two bioremediation techniques // Abst. Book of EGU General Assembly. - Vienna, Austria, 2008. - V. 10. - EGU2008-A-07857.

60. Плешакова E.B., Кабанцева Е.Г., Черновол B.C. Использование дегидрогеназной активности нефтезагрязнекных почв для мониторинга биоремедиации // Актуальные проблемы биоэкологии: Мат. Международной научно-практической конференции. - Москва, 2008. - С. 177-179.

61. Нежинская Е.Г., Финогеев Д., Варюшип А.В., Плешакова Е.В. Биодиагностика нефтезагрязнённой почвы при ее самоочищении и использовании технологии биостимуляции // Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии: Тез. докл. XXII зимней молодежной научной школы. - Москва, 2010. - С. 109.

62. Нежинская Е.Г., Плешакова Е.В. Оценка эффективности приёмов биоремедиации нефтезагрязнённых почв по изменению активности дегидрогеназ // Биотехнология: экология крупных городов: Мат. Московской международной научно-практической конференции. -Москва, 2010.-С. 134-135.

Подписано в печать 27.10.2010. Формат 60x84 1/16. Бумага офсетная. Гарнитура Times New Roman. Печать RISO. Объем 3 печ. л. Тираж 100 экз. Заказ № 448.

Отпечатано с готового оригинал-макета Центр полиграфических и копировальных услуг Предприниматель Серман Ю.Б. Свидетельство № 3117 410600, Саратов, ул. Московская, д. 152, офис 19, тел. 26-18-19,51-16-28

Содержание диссертации, доктора биологических наук, Плешакова, Екатерина Владимировна

СОДЕРЖАНИЕ.

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Загрязнение окружающей среды нефтяными углеводородами.

1.2. Микробная деградация нефтяных углеводородов.

1.2.1. Микроорганизмы-деструкторы нефтяных углеводородов и их физиологические особенности.

1.2.2. Бактерии рода Шос1ососст, их экологическое значение и генетическая организация.

1.2.3. Пути микробной деструкции нефтяных углеводородов.

1.3. Технологии ремедиации нефтезагрязнённых почв.

1.3.1. Микробная очистка почв от углеводородного загрязнения.

1.3.2. Интродукция нефтеокисляющих микроорганизмов в загрязнённую почву: проблемы и перспективы.

1.3.3. Методы контроля биоремедиации.

1.4. Влияние нефтяного загрязнения на ферментативную активность почв. Использование показателей активности почвенных ферментов для мониторинга технологий биоремедиации.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

2.1. Микроорганизмы.

2.2. Среды.

2.3. Методы изучения биологических и деструктивных свойств штаммов.

2.4. Методы генетических исследований.

2.5. Условия проведения лабораторных и микрополевого экспериментов по биоремедиации нефтезагрязнённых почв и методы исследований, применяемые в этих экспериментах.

2.6. Методы оценки токсичности почвы.

2.6.1. Определение токсичности почвы по дегидрогеназной активности бактерий.

2.6.2. Метод определения фитотоксичности почвы.

2.7. Методы мониторинга и количественной оценки бактерий

D. maris АМЗ, интродуцированных в нефтезагрязнённую почву.

ГЛАВА 3. ИЗУЧЕНИЕ РЯДА БИОЛОГИЧЕСКИХ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ УГЛЕВО ДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ ШТАММОВ.

3.1. Морфологические и физиолого-биохимические характеристики исследованных штаммов.

3.1.1. Морфологические и физиолого-биохимические характеристики штамма D. maris АМЗ.

3.1.2. Оценка чувствительности штамма!), maris АМЗ к различным антибиотикам.

3.2. Рост исследованных штаммов в жидкой питательной среде в интервале pH.

3.3. Субстратный'спектр штаммов-деструкторов нефтяных углеводородов.

ГЛАВА 4. ИССЛЕДОВАНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКИХ ОСОБЕННОСТЕЙ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ ШТАММОВ.

4.1. Плазмидный скрининг углеводородокисляющих штаммов

4.2. Генетическая природа свойства биодеградации углеводородов нефти у штамма D. maris АМЗ.

4.2.1. Стабильность свойства биодеградации нефтяных углеводородов у штамма D. maris АМЗ в условиях культивирования на неселективных питательных средах и при действии элиминирующих агентов.

4.2.2. Генетический перенос признака деструкции нефтяных углеводородов у штамма D. maris АМЗ.

4.3. Генетические особенности ацидотолерантности и деструктивной активности у исследованных штаммов.

ГЛАВА 5. ИССЛЕДОВАНИЕ ВОЗМОЖНОСТИ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩИХ КИСЛОТОУСТОЙЧИВЫХ ШТАММОВ ДЛЯ РЕМЕДИАЦИИ НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННОЙ ПОЧВЫ.

5.1. Изучение процессов ремедиации нефтезагрязнённой почвы на основе интродукции штамма Bacillus sp. УН2/5.

5.2. Микробиологические аспекты интродукции штамма!), maris АМЗ в нефтезагрязнённую почву.

5.2.1. Определение конкурентной способности штамма!), maris АМЗ по отношению к аборигенным УОМ.

5.2.2. Динамика развития нефтеокисляющего штамма!), maris АМЗ в почве в процессе биоаугментации.

5.2.2.1. Разработка метода слежения за интродуцированными бактериями в почве.

5.2.2.2. Оценка возможности применения иммуноферментного анализа для количественного определения содержания штамма!), maris АМЗ, внесённого в почву.

5.2.2.3. Изучение динамики численности интродуцированного штамма в почве в процессе биоаугментации методом твердофазного иммуноферментного анализа и микробиологическим методом.

5.3. Изучение реизолятов штамма D. maris АМЗ после его культивирования на углеводородных субстратах.

5.3.1. Оценка показателя гидрофобности клеток и эмульгирующей активности у реизолятов штамма D. maris АМЗ.

5.3.2. Деструкция нефтяных углеводородов реизолятами штамма

D. maris АМЗ.

5.3.3. Исследование ряда биологических свойств у реизолятов штамма

D. maris АМЗ.

ГЛАВА 6. СРАВНЕНИЕ ЭФФЕКТИВНОСТИ САМООЧИЩЕНИЯ НЕФТЕЗАГРЯЗНЁННОЙ ПОЧВЫ И ТЕХНОЛОГИЙ БИОРЕМЕ ДИАЦИИ НА ОСНОВЕ ИНТРОДУКЦИИ ШТАММА D. maris АМЗ И СТИМУЛЯЦИИ ЕСТЕСТВЕННЫХ МИКРОБНЫХ

СООБЩЕСТВ.

6.1. Динамика развития микробных сообществ в нефтезагрязнённой почве в процессе самоочищения, стимуляции и аугментации.

6.1.1. Изменение общей численности гетеротрофных микроорганизмов в процессах очистки нефтезагрязнённой почвы.

6.1.2. Изменение численности углеводородокисляющих микроорганизмов в процессах очистки нефтезагрязнённой почвы.

6.1.3. Динамика численности микроорганизмов азотного цикла в процессах очистки нефтезагрязнённой почвы.

6.2. Изменение показателей биологической активности почвы в процессе ремедиации. Оценка возможности использования этих показателей для мониторинга процессов очистки.

6.2.1. Динамика почвенного дыхания.

6.2.2. Динамика активности ферментов в нефтезагрязнённой почве при самоочищении и при использовании биоремедиационных приёмов.

6.3. Оценка токсичности почвы после ремедиации.

6.4. Изменение содержания нефтепродуктов в ходе ремедиации.

6.5. Изменение ряда агрохимических показателей в процессе ремедиации загрязнённого грунта.•.

ГЛАВА 7. ПОЛУЧЕНИЕ НЕФТЕОКИСЛЯЮЩЕГО БИОПРЕПАРАТА ПУТЁМ СТИМУЛЯЦИИ АБОРИГЕННОЙ

УГЛЕВОДОРОДОКИСЛЯЮЩЕЙ МИКРОФЛОРЫ.

7.1. Условия проведения экспериментов.

7.2. Получение жидкой и твёрдой обогащённой культуры.

7.3. Апробация эффективности полученных «биопрепаратов» для ускорения очистки загрязнённых объектов.

Введение Диссертация по биологии, на тему "Эколого-функциональные аспекты микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв"

В настоящее время в результате антропогенной деятельности происходит широкомасштабное загрязнение окружающей среды токсичными веществами. Нефть и нефтепродукты признаны основными загрязнителями окружающей среды (Eurosoil 2008., 2008). Потери нефти и нефтепродуктов в России при добыче, транспортировке, переработке и хранении по официальным данным оцениваются в 8-9 млн т в год. Особую нагрузку при этом испытывает почва, что проявляется в ухудшении её морфологических и физико-химических свойств, угнетении самоочищающей способности и негативных изменениях развития и функциональной активности организмов почвенного биоценоза (Ииковскийи др., 2003; Stroud et al., 2007). Аварийные и хронические разливы нефти приводят к быстрой потере продуктивности земель или полной деградации ландшафтов; Ограниченность, земельных ресурсов! ставит неотложную задачу возврата в хозяйственное использование, всех нарушенных и деградированных почв (Ьурмистрова, 2003).

Поскольку на современном уровне развития нефтяной промышленности; не. представляется; возможным; полностью исключить её негативное воздействие на, окружающую среду, возникает необходимость разработки методов и технологий восстановления почв,, загрязнённых нефтяными углеводородами (Сулейманов и др;, 2005).

Экологически перспективными являются микробиологические способы очистки от нефтезагрязнений. Углеводородокисляющие микроорганизмы (УОМ), к которым относятся . представители многих родов бактерий; дрожжей и мицелиальных грибов, отличаются от других членов гетеротрофного микробоценоза способностью к поглощению гидрофобных соединений и наличием углеводородокисляющих ферментов (Balba, 1998; Quatrini et al., 2008). Основные направления микробной ремедиации почв: биостимуляция — обработка почвы ^ля обеспечения оптимальных условий развития собственной почвенной микрофлоры (внесение азотно-фосфорных удобрений, аэрация и др.) и биоаугментация. - внесение в почву г

1 1 микроорганизмов-деструкторов загрязнений наряду с добавками солей азота и фосфора (Хабибуллина и др., 2002; Нечаева и др., 2009; Киреева и др., 2009; Ouyang et al., 2005).

При выборе способа очистки загрязнённых почв всё чаще отдают предпочтение биостимуляции аборигенной микробной популяции in situ, например, при больших масштабах загрязнения. Важным этапом при этом является подбор приёмов для интенсификации функциональной активности природных микробных ценозов, и особенно группы углеводородокисляющих микроорганизмов. В ряде случаев, когда физико-химические характеристики ' места загрязнения делают невозможным рост естественной микрофлоры или загрязнитель устойчив к её воздействию, а также, если концентрация загрязнителя в почве относительно высока или низка — биоаугментация оказывается более эффективной (Mishra et al., 2001; Wilkinson et al., 2002). В то же время вопросы целесообразности использования и преимуществ технологий биостимуляции и биоаугментации остаются спорными.

Учитывая, что деструкция нефти в окружающей среде - сложный многофакторный процесс, на который оказывают влияние физико-химический состав, концентрация и срок действия загрязнителя, почвенно-климатические и биологические особенности экосистемы и другие факторы, сведения по этой проблеме нередко противоречивы. В связи с этим, проблема i поиска оптимальных и адаптированных к конкретным условиям методов остаётся весьма актуальной.

Очистку нефтезагрязнённых -„территорий затрудняют пониженная , температура и низкая биодоступность гидрофобных углеводородов нефти, повышенное содержание соли или повышенная кислотность почв. Большинство известных бактерий-деструкторов нефти, как правило, устойчивы к различным неблагоприятным условиям окружающей среды и i стабильно сохраняют свои биодеградирующие свойства (Стабникова, 1995; Киреева, 1996; Vasudevan, 2001). Несмотря на многочисленные исследования ■< микроорганизмов-деструкторов нефтяных углеводородов в окружающей среде, механизмы их функционирования в экстремальных условиях, например, в кислых почвах, изучены недостаточно. Хотя на территории России и других стран существует немало почв, в том числе и нефтезагрязнённых, с повышенной кислотностью, которая обусловлена естественными или антропогенными факторами (Широких, 2004; Орлов и др., 2005; Rothschild, Mancinelli, 2001).

Для эффективной реализации технологий биоаугментации большое значение имеет поиск и селекция микроорганизмов с высокой деструктивной активностью, а также всестороннее их изучение, в том числе, исследование генетической регуляции процессов деструкции. Изучение генетики штаммов-деструкторов, накопление знаний о функционировании плазмид и генов биодеградации, их экспрессии и передаче, применение генетических методов к этим бактериям необходимо для их длительной биотехнологической эксплуатации (Larkin et al., 1998; van Hamme et al., 2003).

Многие экологические аспекты проблемы биоаугментации, касающиеся жизнеспособности и активности интродуцированных микроорганизмов в почве, их взаимоотношений с аборигенным микробоценозом, требуют всестороннего изучения. В связи с этим, разработка высокоспецифичных и чувствительных мониторинговых методов для идентификации внесённых в почву бактерий особенно актуальна.

Эффективность приёмов биоремедиации загрязнённых почв традиционно оценивают с помощью химико-аналитических методов, нередко дорогих и трудоёмких. Биотестирование, наряду с методами аналитической химии, позволяет получить интегральную токсикологическую характеристику загрязнённой среды, построить наиболее полную картину деградации почв, т.к. уменьшение концентрации загрязнителя в почве не всегда отражает снижение его токсичности для живых организмов (Киреева и др., 2004). В связи с этим, активно продолжается поиск оптимальных методов биотестирования для оценки степени загрязнённости и токсичности почвы и уровня её очистки после применения биоремедиационных технологий.

Понимание общих принципов функционирования микробных сообществ нефтезагрязнённых почв и выявление ключевых биологических факторов и механизмов, определяющих эффективность биоремедиации, о1 , создаст, в свою очередь, основу для разработки и улучшения способов очистки.

Цель настоящей работы — выявление особенностей функционирования естественных микробных сообществ нефтезагрязнённых почв и интродуцированных в почву специализированных микроорганизмов при использовании приёмов биоремедиации.

Для достижения поставленной цели были определены задачи:

3. Исследовать влияние интродукции нефтеокисляющих микроорганизмов на характер микробиологических и биохимических процессов в загрязнённой почве и деструкцию-рефтяных углеводородов.

7. Разработать и апробировать оригинальный способ активизации-аборигенных .углеводородокисля'ющих микроорганизмов для очистки нефтезагрязнённой почвы и воды.

Научная новизна. Впервые из микробного сообщества, существующего в экстремальных условиях нефтешлама (pH 1,1.5), выделены и изучены 13 штаммов бактерий, идентифицированные как (Sorynebacterium spp:,, D. maris и Bacillus sp.,. способные к деструкции углеводородов в широком диапазоне pH. Получены доказательства плазмидной локализации генов, детерминирующих свойства? биодеградации? нефтяных углеводородов и ацидотолерантности у данных -.штаммов, что может обеспечить.,: преимущества? микроорганизмов сообщества при существовании в экстремальных условиях.

Впервые подробно изучен и охарактеризован-штамм £).- maris АМЗ как, эффективный и стабильный деструктор алкановых и- ароматических углеводородов в широком« диапазоне pH (4-9) ш температуры (10-40°G),. обладающий эмульгирующей активностью по отношению; к нефтепродуктам и содержащий г трансмиссивную плазмидную ДНК. Установлено,, что после культивирования штамма на. углеводородных субстратах увеличивается гидрофобность его клеток и нефтеокйсляющаятктивность.

Разработаны иммунохимические. методы анализа для выявления, и количественной оценки штамма D. maris АМЗ в-нефтезагрязнённой почве в процессе биоремедиацйи: Установлены особенности. развития интродуцированных микроорганизмов D. maris АМЗ и Bacillus sp; УН 2/5 в нефтезагрязнённых кислых и нейтральных почвах, подтверждена их высокая* конкурентная способность по отношению, к: микроорганизмам- естественных почвенных сообществ, жизнеспособность и нефтеокисляющая активность. С помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа (ИФА) показано, что максимальное развитие штамма D. maris АМЗ в почве происходит через 7-14 сут. интродукции и зависит от свойств почвы и загрязнителя.

Установлено, что' эффективность ремедиации при стимуляции естественного микробного сообщества почвы со свежим нефтяным загрязнением выше, чем при самоочищении, что выражается в увеличении степени, деструкции нефтяных углеводородов и биологической- активности почвы и снижении её токсичности. В случае* многолетнего загрязнения показана одинаковая убыль нефтяных углеводородов при стимуляции аборигенной микрофлоры,й интродукции штамма!), maris АМЗ, который на определённых этапах ремедиации повышает биологическую активность и 1 снижает токсичность почвы.

Выявлены диагностические показатели по ферментативной активности для оценки эффективности апробируемых биоремедиационных приёмов. Разработан метод определения токсичности нефтезагрязнённой почвы после биоремедиации по дегидрогеназной активности бактерий. Предложена новая комбинация добавок, . стимулирующих развитие аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы, для получения биопрепаратов в виде почвенной суспензии.

Практическая значимость. Выделенные и охарактеризованные ацидотолерантные нефтеокисляющие бактерии Corynebacterium spp., D. maris и Bacillus sp. могут быть использованы для ремедиации нефтезагрязнённых почв с повышенной кислотностью. Бактериальные культуры D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 могут быть рекомендованы для ускорения и улучшения очистки почвы от свежего нефтяного загрязнения. Высокая жизнеспособность, " ' конкурентоспособность и углеводородокисляющая активность позволяет применять эти штаммы в условиях, когда естественное микробное сообщество почвы малочисленно или не способно полноценно функционировать. Для очистки почв с многолетним загрязнением разработан, способ- стимуляции аборигенной микрофлоры путём внесения минерального удобрения, структуратора, ПАВ и использования агротехнических приёмов. Результаты- по способам, очистки почвы,от нефтяных загрязнений защищены,двумя патентами РФ:

Метод твёрдофазного ■ ИФА может4 быть рекомендован* для практического применения при проведении > биоремедиационных работ в1 качестве способа учёта численности интродуцированных микроорганизмов. Анализ показателей активности почвенных ферментов: дегидрогеназ, каталаз, липаз и уреаз может быть использован для оценки эффективности приёмов биоремедиации. Предложен метод определения токсичности нефтезагрязнённой почвы после биоремедиации по дегидрогеназной активности бактерий.

Разработан способ получения, и использования, биопрепаратов в виде почвенной суспензии, основанный на активизации аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы.

Результаты применяются при проведении лекционных и практических занятий по курсу «Экологическая токсикология», «Механизмы обезвреживания токсичных соединений», подготовке курсовых и дипломных работ в ГОУ ВПО «Саратовский государственный университет имени

H.Г. Чернышевского» и ИБФРМ РАН. Материалы диссертации использованы при подготовке учебно-методических пособий «Руководство к практическим занятиям по экологической токсикологии» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2006); «Общая биология: Материалы к гос. аттестации выпускников по спец. 011600 - «Биология»» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2006); «Экология. Материалы к государственной аттестации выпускников по специальности -«Экология»» (Саратов, изд-во Сарат. ун-та, 2009).

Основные положения, выносимые на защиту:

I. В состав микробного сообщества нефтешлама с экстремальной кислотностью (pH 1,15) входят микроорганизмы. Gorynebacterium spp., D. maris и Bacillus sp., осуществляющие деструкцию нефтяных углеводородов в кислой и нейтральной среде. Свойства' ацидотолерантности у бактерий Corynebacterium< spp. и деградации нефтяных углеводородов у D. maris АМЗ, детерминируемые1 плазмидными генами, способствуют устойчивому функционированию микробного сообщества- нефтешлама.

2. Штамм D. maris АМЗ обладает рядом функциональных и экологических преимуществ, связанных со способностью к существованию» в широком диапазоне pH и температуры, наличием биоэмульгирующей и деструктивной'активности по отношению к алкановым и ароматическим углеводородам нефти и присутствием трансмиссивной катаболической плазмиды, характеризующейся высокой стабильностью. Адаптационным механизмом при культивировании D. maris АМЗ на углеводородах является увеличение гидрофобности его клеток.

3. Интродуцированные микроорганизмы D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН 2/5 характеризуются высокой жизнеспособностью в нефтезагрязнённых кислых и нейтральных почвах, они ускоряют очистку почв от свежего нефтяного загрязнения, повышая численность гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов в естественном сообществе, интенсифицируя биологическую активность почвы и снижая ее токсичность.

4. Для выявления D. maris АМЗ в почве в процессе биоремедиации и; количественной оценки динамики его численности применимы иммунохимические методы анализа. С помощью метода твердофазного иммуноферментного анализа установлено, что при интродукции штамма D. maris АМЗ в почву, его максимальное развитие происходит через 714 суток (на 1-3 порядка в зависимости от свойств почвы и загрязнителя).

5. Способ стимуляции естественного микробного сообщества в чернозёме южном со свежим, нефтяным: загрязнением имеет существенные преимущества по сравнению с самоочищением. В случае многолетнего загрязнения; показана одинаковая убыль нефтяных углеводородов при стимуляции аборигенной микрофлоры и интродукции, штамма D. maris АМЗ .

6. Показатели активности почвенных ферментов: дегидрогеназ, каталаз, липаз и уреаз отражают направленность процессов- биодеградации нефтяных углеводородов, обусловленных- развитием и активизацией аборигенных и интродуцированных микроорганизмов в почве, и могут, быть использованы для оценки эффективности приёмов биоремедиации. Показатель дегидрогеназной активности бактерий может использоваться для тестирования токсичности очищенной почвы.

7. Активизация аборигенных углеводородокисляющих микроорганизмов в образцах загрязнённой почвы . с помощью стимулирующих добавок обеспечивает получение эффективных биопрепаратов в виде почвенной суспензии для использования в процессе биоремедиации. I

Апробация работы. Основные положения диссертации представлены в виде стендовых и устных сообщений на Международной конференции

Микробное разнообразие: состояние, стратегия, экология, проблемы»

Пермь, 1996); II International Symposium on Biosorption and Bioremediation

Prague, Czech Republic, 1998);. 9th European Congress on Biotechnology ч / .

Brussels, Belgium, 1999); 7th и 8th International FZK/TNO Conference on Contaminated Soil (Leipzig, Germany, 2000; Gent, Belgium, 2003); II и V съездах Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2009); 9th International Symposium on Microbial Ecology (Amsterdam, The Netherlands, 2001); конференции «Экобиотехнология: борьба с нефтяным загрязнением окружающей среды» (Пущино, 2001); X International Congress of Bacteriology and Applied Microbiology (Paris, France, 2002); 3rd International Conference OIL POLLUTION: Prevention, Characterization, Clean Technology (Gdansk, Poland, 2002); I-IV межрегиональных конференциях молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с, окружающей средой» (Саратов,, 2002, 2004, 2006, 2008); Всероссийских научно-практических конференциях, посвящённых 115-летию и 117-летию со дня; рождения академика Н.И. Вавилова: (Саратов, 2002, 2004); I-III Международных конгрессах «Биотехнология, — состояние и перспективы развития» (Москва, 2002, 2003, 2005); International Symposium Biochemical Interactions of Microorganisms and Plants with Technogenic Environmental Pollutants (Saratov, Russia, 2003); II Международной научной конференции «Биотехнология -охране окружающей среды» (Москва, 2004); Международной научной конференции «Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды» (Саратов, 2005); II Международной конференции «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биологический потенциал» (Пермь-Казань, 2005); Всероссийской Молодёжной школе-конференции «Актуальные проблемы современной . микробиологии» (Москва, 2005); Международной научной конференции «Микробные биотехнологии» (Одесса, 2006); Международной научной конференции «Микроорганизмы и биосфера» (Москва,. 2007); EGU General Assembly

Vienna, Austria, 2008); Международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы биоэкологии» (Москва, 2008); IV Всероссийской научно-практической конференции» «Проблемы экологии Южного Урала» (Оренбург, 2009); IV Всероссийской научно-практической' конференции с международным участием «Экологические проблемы промышленных городов» (Саратов; 2009); Первых Международных научно-практических Беккеровских чтениях (Волгоград, 2010); XXII зимней молодёжной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии» (Москва, 2010); Московской международной научно-практической конференции^ «Биотехнология: экология крупных городов». (Москва, 2010); II Всероссийской научной интернет-конференции «Научное творчество XXI века» с международным участием (2010).

Публикации. По. теме- диссертации опубликовано^ 62 научные работы, из них 10 публикаций в изданиях, рекомендованных Перечнем ВАК РФ, включая!два патента РФ.

Структура и объём' диссертации: Диссертация, состоит из введения, обзора литературы, описания-материалов и методов исследования, 5 глав с изложением результатов работы и их обсуждением, заключения; выводов, списка цитируемой литературы, включающего 443 источника. Диссертация изложена на 358 страницах машинописного текста,, включая приложение, содержит 85-рисунков и 29 таблиц.

Заключение Диссертация по теме "Экология (по отраслям)", Плешакова, Екатерина Владимировна

выводы

2. Новый штамм D. maris АМЗ обладает рядом функциональных и экологических преимуществ, к которым относятся: рост в широком 1 диапазоне pH (4-9) и температур (10-40°С), в присутствии 10% NaCl, способность к деструкции алкановых и ароматических углеводородов нефти, биоэмульгирующая активность по отношению к нефти, наличие трансмиссивной катаболической плазмиды с высокой стабильностью. После культивирования на углеводородных субстратах увеличивается гидрофобность клеток и нефтеокисляющая активность штамма D. maris АМЗ. Ч

D. maris АМЗ в почву, его максимальное развитие происходит через 7-14 ч t суток (на 1-3 порядка в зависимости от почвы и загрязнителя).

7. Показатели активности почвенных ферментов: дегидрогеназ, катал аз, липаз и уреаз, отражающие направленность процессов биодеградации 1 нефтяных углеводородов в почве, обусловленных развитием и активизацией аборигенных и интродуцированных микроорганизмов, а также показатели токсичности очищенной почвы, определяемые по дегидрогеназной активности тест-микроорганизма, являются индикаторными для мониторинга процессов биоремедиации.

8. Оптимальная комбинация стимулирующих добавок, включающая нефть, минеральные компоненты и % CMC, активизируя аборигенные углеводородокисляющие микроорганизмы в образцах загрязнённой почвы, способствует получению биопрепаратов в виде почвенной суспензии, которые эффективно очищают нефтезагрязнённую почву и воду.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В результате проведенных исследований были выявлены особенности функционирования естественных микробных сообществ нефтезагрязнённых почв и интродуцированных в почву специализированных микроорганизмов при использовании приёмов биоремедиации

При изучении уникального микробного сообщества нефтешлама с рН 1,15 нами были выделены микроорганизмы, которые не только обладали кислотоустойчивостью, но и отличались способностью к деструкции нефтяных углеводородов в условиях повышенной кислотности. Выделенные бактерии были отнесены к родам Corynebacterium, Dietzia и Bacillus.

Известно, что большинство бактерий-деструкторов нефти относятся к родам наиболее типичных обитателей почвы: Pseudomonas, Bacillus,

Arthrobacter, Micrococcus, Achromobacter, Nocardia и Rhodococcus (Ившина и др., 1995; Стабникова и др., 1995; Гирич и др., 2001; Vasudevan, Rajaram,

2001; Hamzah et al., 2010). Как правило, представители этих родов к отличаются высокой жизнеспособностью при действии неблагоприятных факторов, в том числе, могут переносить кислую среду. Это, главным образом, нокардиоформные и коринеподобные бактерии. В связи с этим, в состав изученного нами экстремального микробного сообщества также входили вышеназванные микроорганизмы. Несмотря на известные свойства кислотоустойчивости у отдельных почвенных микроорганизмов, изучению деградации органических загрязнителей, в том числе нефти, бактериями в кислых почвах до последнего времени уделялось недостаточно внимания. Корректировка рН в закисленных объектах достигалась добавлением извести.

На основе выделенных микроорганизмов нами была создана оригинальная коллекция ацидотолерантных нефтеокисляющих штаммов. Бактерии были охарактеризованы как умеренные ацидофилы, способные к утилизации спектра углеводородных субстратов, которая у большинства штаммов происходила более эффективно в кислой среде, чем в нейтральной. Из 13 штаммов, выделенных из микробного сообщества нефтешлама, 12 содержали плазмидные ДНК: у 10 штаммов.Corynebacterium spp. выявлены плазмиды размером около 45-50 т.п.н., у 2 штаммов D. maris — близко расположенные 2 плазмидные ДНК размером около 54 т.п.н. Это указывало, во-первых, на вероятную локализацию на плазмидах генов, способных обеспечивать преимущества данных микробных штаммов при существовании в экстремальных условиях (например, использование более широкого круга субстратов, возможность расти в кислой среде), а во-вторых, на возможный горизонтальный перенос плазмид в микробном сообществе нефтешлама.

На основании высокой (12,5%) частоты индуцированной элиминации свойства ацидотолерантности и корреляции между исчезновением этого свойства и утратой плазмидной молекулы из штаммов Corynebacterium spp. нами высказано предположение о контроле функции ацидотолерантности у данных бактерий плазмидными генами. Таким образом, устойчивость бактерий сообщества нефтешлама к низким значениям рН, связанная, вероятно, с резистентностью их белоксинтезирующей системы, контролируется, как впервые показано; плазмидными генами.

При изучении наиболее перспективных штаммов было установлено, что D: maris АМЗ способен к деструкции как алкановых, так и ароматических углеводородов нефти, что является редким сочетанием ферментативных систем в одном микроорганизме-деструкторе. Как показали эксперименты, штамм D. maris АМЗ был способен деградировать гексадекан на 53% и толуол на 80,6% за 7 сут. культивирования в жидкой среде. Также данный штамм обладал биоэмульгирующей активностью по отношению к нефти (экзогенная Е24=49,3% и Е48=37,3%), что свидетельствовало о возможных преимуществах штамма в процессах утилизации нефтепродуктов, т.к. биоэмульгирующая активность микроорганизма в сочетании с биодеградирующей способностью может обеспечить большую биодоступность углеводородов в различных условиях.

К особым свойствам у D. maris АМЗ добавляется также возможность осуществления деструкции нефтяных углеводородов в условиях повышенной кислотности. Так, по данным газовой'хроматографии деструкция гептадекана (25 г/л) в жидкой среде за 7 сут. культивирования составила 53,6% при pH 7,0 и 51,5% при pH 4,6. В то время как по данным других исследователей (Жуков и др., 2007) процессы разложения дизельного топлива и роста бактерий для штаммов Rhodococcus erythropolis и R. rubber практически останавливались при достижении в среде культивирования значений pH 4,75 и 5,65 соответственно.

Кроме широкого диапазона pH, D. maris АМЗ хорошо рос в диапазоне температуры: 10-40°С как на полноценной питательной среде, так на агаризованной минеральной среде" с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии, и в присутствии 10% NaCl.

Были получены доказательства участия плазмидных генов

D. maris АМЗ в процессе биодеградации нефтяных углеводородов. Это высокая (14%) частота индуцированной элиминации свойства деградации нефти, корреляция между утратой экстрахромосомных элементов в элиминантных клонах и снижением их способности к деструкции сырой нефти (в 2-5 раз), толуола (в 3-7 раз) и декалина (в 2-3 раза) по сравнению с исходным штаммом. В ходе экспериментов установлена высокая стабильность плазмидных ДНК штамма D. maris АМЗ, а также показана их конъюгативность. Показано, что признак деструкции толуола передавался при конъюгативном переносе плазмидных молекул D. maris АМЗ в реципиентные бесплазмидные штаммы Rhodococcus sp. 261 и R. terrae А73 и при передаче плазмидных ДНК с помощью трансформации в бесплазмидные клетки D. maris АМЗ. Результаты этих экспериментов указывали на детерминацию признака деструкции толуола плазмидными генами

D. maris АМЗ. Обнаруженная у штамма D. maris АМЗ трансмиссивная плазмида биодеградации углеводородов позволяет рассматривать данный it штамм как источник распространения генетических элементов, ответственных за процессы разрушения ксенобиотиков, что может способствовать повышению метаболического потенциала микробного сообщества нефтешлама.

Генетическая и функциональная стабильность D. maris АМЗ была подтверждена; при исследовании характеристик его реизолятов после культивирования штамма на углеводородных субстратах в жидкой минеральной среде, а также почве и грунте. У реизолятов показана высокая стабильность плазмидных молекул и эмульгирующей активности по отношению к нефти. Было обнаружено увеличение гидрофобности клеток, коррелирующее с повышением деструктивной активности в отношении нефтяных углеводородов, а также повышение неспецифической антибиотикорезистентности D. maris АМЗ. Эти изменения связаны, скорее всего, с модификациями-в гидрофобном липидном слое клеточной оболочки штамма при культивировании его на углеводородах и благоприятны, для штамма; являющегося-активным нефтеокисляющим микроорганизмом:

Вышеперечисленные физиологйческие, биохимические и генетические особенности делают штамм D. maris АМЗ чрезвычайно ¡ перспективным для его практического использования в биоремедиации нефтезагрязнённых природных объектов. В целом, вся коллекция ацидотолерантных нефтеокисляющих штаммов, выделенных из микробного сообщества нефтешлама, представляет несомненный интерес для очистки нефтезагрязнённых объектов окружающей среды, характеризующихся повышенной кислотностью. Полученные новые сведения о генетической регуляции свойств деградации нефтяных углеводородов и ацидотолерантности у данных микроорганизмов могут применяться для улучшения основных параметров: биотехнологического процесса микробной очистки, в том числе, путём направленных генетических модификаций.

В связи с вышесказанным, в дальнейших экспериментах (4 лабораторных и 1 микрополевой) исследовали возможность использования D: maris АМЗ для ремедиации нефтезагрязнённой почвы и грунта. В исследованиях было показано, что нефтеокисляющий штамм D. maris АМЗ обладал высокой конкурентной'. .способностью по отношению к микроорганизмам естественных почвенных сообществ.

Эффективность очистки напрямую связана с поведением штамма-интродуцента в природной среде, поэтому в ходе настоящих исследований были апробированы иммунохимические методы для мониторинга D. maris АМЗ в очищаемой почве. Продемонстрировано, что иммунохимический тест на основе полученных поликлональных кроличьих антител, специфичных к углеводным антигенам клеточной поверхности данного штамма, позволяет быстро и однозначно идентифицировать интродуцированный в почву D. ' maris АМЗ. Было показано, что поверхностный антиген, на который получены антитела, экстрагируется бактериями в окружающую среду, что позволило разработать высокочувствительный метод мониторинга данного штамма на основе иммуноферментного анализа.

Данные, полученные с помощью двух методов исследования численности D. maris АМЗ (ИФА и микробиологический анализ), существенным образом коррелировали независимо от типа почв, особенностей углеводородного загрязнения и условий ремедиации. При этом обнаружено, что' максимальная численность штамма регистрировалась с помощью микробиологического анализа через 7 сут., а с помощью ИФА -через 14 сут., что, на наш взгляд, связано с периодом накопления специфического антигена в почве. Результаты этих экспериментов позволяют рекомендовать метод ИФА для практического использования при проведении биоремедиационных работ для мониторинга интродуцированных микроорганизмов, что существенно улучшит прогнозируемость хода и эффективности очистки.

В целом, динамика развития D. maris АМЗ в чернозёме южном, тёмно-серой лесной почве со свежим нефтяным загрязнением и смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами имела сходные тенденции. I

Максимальное развитие штамма происходило через 7-14 сут., затем наблюдалось снижение его численности до исходного уровня внесения. Тот факт, что во всех проведённых экспериментах титр D. maris АМЗ до конца обработки сохранялся на достаточно высоком уровне (около 107 кл/г почвы), свидетельствовал о жизнеспособности данного интродуцента в различных загрязнённых почвах. На развитие 'штамма влияли, как было показано, свойства почвы, скорее всего, содержание доступных органических и минеральных элементов, так, в чернозёме южном численность D. maris АМЗ максимально увеличилась в 373 раза через 14 сут. после внесения, в других почвах увеличение численности происходило лишь на порядок, наименьшее развитие D. maris АМЗ наблюдалось в смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами.

Численность D. maris АМЗ влияла, в свою очередь, на количество ОГМ и УОМ, особенно в период максимального развития интродуцента (первый месяц ремедиации). Этот период отличался также максимальным развитием аборигенной и интродуцированной микрофлоры в почве, активностью почвенных дегидрогеназ и максимальной скоростью деструкции нефтяных углеводородов.

Увеличение численности ОГМ и УОМ в нефтезагрязнённой почве при использовании биотехнологий, как было показано, зависит от стимулирующих добавок, свойств почвы, типа и срока действия загрязнителя. В чернозёме южном при стимуляции и аугментации содержание ОГМ и УОМ увеличивалось более отчётливо, чем в других ч почвах.

В процессе биоремедиации увеличивалась интенсивность почвенной респирации, являющейся интегральным показателем общей биологической активности почвы, активность дегидрогеназ в почве и грунте, принимающих непосредственное участие в разложении углеводородов, особенно в период максимального развития микроорганизмов почвенного сообщества и высокой интенсивности процессов биодеградации нефтяных углеводородов.

Активность почвенных каталаз также увеличивалась при очистке почвы и грунта от нефтяных ингредиентов, что связано, как мы полагаем, с активизацией аэробных процессов в ходе ремедиации. Увеличение липазной активности в почве и грунте происходило на последних этапах ремедиации. Это связано, по нашему мнению, с индукцией активности почвенных липаз продуктами распада нефтяных углеводородов и увеличением метаболической активности и биомассы микроорганизмов, утилизирующих липиды. Активность уреаз в почве повышалась с ходом очистки, что может свидетельствовать о более высокой интенсивности гидролитических процессов в очищаемой почве и, следовательно, о биодеградационных процессах.

Таким образом, динамика исследованных показателей биологической активности нефтезагрязнённой почвы и грунта отражала характер процессов очистки, выявляла преимущества различных технологий ремедиации, что даёт возможность использовать эти показатели для мониторинга процессов очистки почв от углеводородных загрязнителей.

В настоящих исследованиях была не только доказана применимость ферментативных показателей для оценки биоремедиационных процессов, но разработан и апробирован новый' метод определения токсичности ' нефтезагрязнённой почвы по дегидрогеназной активности тест-микроорганизма D. maris АМЗ, который отличался высокой чувствительностью, простотой исполнения и возможностью анализировать в почве токсичные продукты биоразложения углеводородов. Проведённое биотестирование с помощью разработанного метода показало наличие сходных тенденций с результатами фитотестирования: средняя степень токсичности почвы через 30 сут. ремедиации, распределение степени токсичности почвы в ряду способов очистки: аугментация<стимуляция<самоочищение. Различия обнаруживались на < последнем этапе ремедиации: почва была нетоксичной для растений, но ещё токсичной для микробных ферментов, что свидетельствует о необходимости использования нескольких оптимальных биотестов для достоверной оценки токсичности почвы после биоремедиации.

В ходе экспериментов обнаружено, что при самоочищении почвы от свежего нефтяного загрязнения не происходило существенного увеличения содержания ОГМ и УОМ, активности дегидрогеназ и каталаз, численность денитрификаторов и нитрификаторов, активность липаз и уреаз в почве была меньше, чем при использовании приёма стимуляции. Токсичность этой почвы, напротив, была выше, чем при стимуляции. В связи с этим, убыль нефтяных углеводородов при самоочищении почвы на всём протяжении эксперимента была ниже на 13-15%, чем при стимуляции естественного микробного сообщества. Таким образом, на основании эффективности очистки почвы от свежего нефтяного загрязнения показано преимущество приёма стимуляции аборигенной микрофлоры перед самоочищением.

Внесение штамма D. maris А'МЗ в почву со свежим нефтяным загрязнением способствовало убыли общих нефтяных углеводородов на 39% в почве за 30 сут. и на 66% за 60 сут., в смешанный грунт с многолетним загрязнением нефтепродуктами - на 48% за 90 сут. Такая степень разложения углеводородов, согласно известным литературным данным, наблюдается у ряда микроорганизмов, входящих в состав биопрепаратов (Логинов и др., 2004; Мурыгина, Калюжный, 2005). В то же время, было установлено, что по сравнению с приёмом стимуляции аборигенного микробного сообщества, интродукция D. maris АМЗ ускоряла процесс очистки чернозёма южного от свежего нефтяного загрязнения в 2 раза в течение первого месяца ремедиации. Это преимущество D. maris АМЗ при необходимости может использоваться специалистами-биотехнологами для ускорения ремедиации в климатических зонах с коротким тёплым сезоном.

Убыль нефтепродуктов при использовании технологий ремедиации происходила в основном за счёт разложения парафино-нафтеновых углеводородов, хорошо разрушались моно- и бициклические ароматические соединения. При внесении D. maris АМЗ в почву со свежим нефтяным загрязнением эффективнее разрушалась фракция ПАУ (41 против 18% при стимуляции) и спирто-бензольных смол (41. против 23% при стимуляции). Кроме того, D. maris АМЗ на всём протяжении ремедиации улучшал по сравнению со стимуляцией такие показатели биологической активности свежезагрязнённой почвы как: численность ОГМ, УОМ, почвенное дыхание, активность дегидрогеназ, липаз и уреаз и более эффективно способствовал снижению токсичности почвы.

Ускорение и улучшение качества очистки загрязнённой почвы под влиянием штамма D. maris АМЗ позволяет рекомендовать его для ремедиации почв от свежего нефтяного загрязнения.

В смешанном грунте с многолетним загрязнением нефтепродуктами внесение D. maris АМЗ не ускоряло очистку, при использовании приёмов стимуляции и аугментации наблюдалась одинаковая, степень разложения нефтяных углеводородов. Мы полагаем, что в условиях свежего загрязнения нефтью аборигенной микрофлоре необходимо время для адаптации к загрязнителю, поэтому внесение активного штамма-деструктора ускоряло процесс очистки в первый месяц. Многолетнее загрязнение, выступающее в роли селективного фактора для УОМ,' создало повышенный деструктивный потенциал микробных сообществ, который реализовался при использовании

Vf оптимального.комплекса стимулирующих мероприятий. f

В то же время, положительное влияние штамма-интродуцента проявлялось на биологической активности грунта, на определённых этапах ; ремедиации такие показатели как: численность ОГМ и УОМ, почвенное дыхание, активность каталаз и липаз были выше в варианте с аугментацией, чем со стимуляцией. Также существенным было снижение фитотоксичности очищенного грунта под влиянием D. maris АМЗ, что связано, вероятно, с t ингибирующим действием данного штамма на фитопатогенные ' микромицеты.

Таким образом, полученные результаты показали, что в случае многолетнего загрязнения использование приёмов стимуляции аборигенной микрофлоры и интродукции нефтеокисляющего штамма D. maris АМЗ способствует одинаковой скорости и степени разложения нефтяных углеводородов. И при выборе способа очистки приём стимуляции может быть рекомендован как экономически более выгодный. Однако, как показали исследования, штамм-интродуцент D. maris АМЗ влияет на качество очистки, что отражается на повышении биологической активности и снижении токсичности почвы, что, в свою очередь, является немаловажным для восстановления плодородия почв. Поэтому не исключается применение штамма D. maris АМЗ для очистки почвы или грунта от многолетнего нефтяного загрязнения.

К несомненным преимуществам D. maris АМЗ при использовании его в практике биоремедиационных работ следует также отнести высокую жизнеспособность, данного микроорганизма в различных почвах и способность к деструкции нефтяных углеводородов при повышенной кислотности среды, что позволяет применять 'D. maris АМЗ в условиях, когда естественные микробные сообщества малочисленны или не способны полноценно функционировать.

Из коллекции ацидотолерантных нефтеокисляющих микроорганизмов был выбран ещё один перспективный штамм Bacillus sp. УН2/5, жизнеспособность и деструктивная активность которого исследована в почве. Данный микроорганизм, как было установлено, отличался высокой 4 жизнеспособностью в нейтральной и кислой почве в условиях нефтяного загрязнения. Его развитие в нефтезагрязнённом чернозёме южном без дополнительных стимулирующих мероприятий происходило примерно на порядок, что сравнимо с ростом D. maris АМЗ в чернозёме южном, используемом вторично после экспериментов с растениями, и смешанном грунте с многолетним нефтяным загрязнением при дополнительном внесении различных добавок. Интродукция Bacillus sp. УН2/5 способствовала более высокой численности ОГМ и УОМ, чем стимуляция естественного микробного сообщества и степени деградации нефти (49,5% за 15 сут.), которая в 2 раза превышала степень деградации при стимуляции. Эти данные также совпадали с результатами, полученными при изучении эффективности очистки почвы со свежим нефтяным загрязнением с помощью штамма D. maris АМЗ.

Таким образом, оба исследованных штамма хорошо развивались в нефтезагрязнённой почве в зависимости от свойств почвы и сопутствующих агротехнических приёмов и эффективно разлагали нефтяные углеводороды в кислой и нейтральной почве.

В ходе проведенных исследований была отработана ещё одна из технологий биоремедиации, основанная' на обогащении образцов загрязнённой почвы в лабораторных условиях аборигенными УОМ и индукции их ферментативных систем, катализирующих деградацию углеводородов нефти. Было установлено, что для стимуляции развития почвенных УОМ при культивировании их в виде почвенной суспензии оптимальным является следующий комплекс добавок, г/л: нефть (5,0), минеральные компоненты (10,0) и CMC (0,2). Количество УОМ возрастало на пять порядков (до величин кратных 109 клеток) по сравнению с исходным содержанием. Повторное внесение питательных субстратов, особенно L-бульона и мелассы по отдельности и' в различных комбинациях, стимулировало увеличение в среде УОМ в среднем на два порядка. Эффективность использования биопрепарата на основе почвенной суспензии, подготовленного вышеописанными стимулирующими добавками, подтверждена в экспериментах по очистке загрязнённой почвы и воды. Степень очистки с помощью биопрепарата была выше по сравнению с контролем в 4-8 раз в почве и в 18-24 раза в воде в зависимости от концентрации в них нефти (5 и 50 г/л(кг)). Такой способ может иметь большие перспективы для практического использования, он экологически безопасен, достаточно экономичен и легко осуществим для очистки загрязнённых объектов даже большого масштаба.

Таким образом, проведённые исследования, основанные на комплексной оценке изменений, происходящих в почве и её микробных сообществах в условиях нефтяного загрязнения при использовании технологий биоремедиации, продемонстрировали пути повышения эффективности различных приёмов микробной очистки нефтезагрязнённых почв. Одним из них является внесение исследованных уникальных нефтеокисляющих микроорганизмов D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН2/5, способных ускорять очистку и улучшать её качество. Использование специализированных углеводородокисляющих бактерий для ликвидации нефтяного загрязнения в кислых почвах отличается научной новизной. Установленная в ходе исследований целесообразность применения штаммов

D. maris АМЗ и Bacillus sp. УН2/5. для очистки почв, различающихся по своим свойствам и по срокам нефтяного загрязнения, значительно расширила современные представления о возможностях нефтеокисляющих t микроорганизмов.

Библиография Диссертация по биологии, доктора биологических наук, Плешакова, Екатерина Владимировна, Саратов

1. Агроэкология. Методология, технология, экономика / Под ред. В.А. Черникова, А.И. Чекереса. Ш: КолосС, 2004. - 400 с.

2. Азнаурьян Д.К. Изменение эколого-биологических свойств почв Юга России при загрязнении нефтью: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Ростов н/Д, 2009. 22 с.

3. Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.И., Терещенко H.H. и др. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2000. - № 1. - С. 58-64.

4. Андреева И.С., Емельянова Е.К., Загребельный С.Н. и др. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биоремедиации почв и водной среды // Биотехнология. 2006. - № 1. - С. 43-52.

5. Андреюк Е.И., Иутинская Г.П., Дульгеров П.Н. Почвенные микроорганизмы и интенсивное землепользование. — Киев: Наукова думка, 1988.- 192 с.

6. Андронов Е.Е., Петрова С.Н., Чижевская Е.П. и др. Влияние внесения генетически модифицированного штамма Sinorhizobium meliloti АСН-5, на структуру почвенного сообщества микроорганизмов // Микробиология. -2009. Т. 78, № 4. - С. 525-534.

7. Анохина Т.О., Кочетков В.В., Зеленкова Н.Ф. и др. Биодеградация фенантрена ризосферными плазмидосодержащими бактериями рода Pseudomonas в модельных растительно-микробных ассоциациях // Прикл. биохим. и микробиол. 2004. - Т. 40, № 6. - С. 654-658:

8. Арзамасцев А.П. Основы экологии и охрана природы. М.: Медицина. -416 с.

9. Аристархова В.И. Нокардиоподобные микроорганизмы. М.: Наука, 1989.-248 с.

10. A.c. №1629319 СССР, МКИ С12 Ql/06, С12 N 1/20. Способ определения численности углеводородокисляющих бактерий / В.П. Чекалов. — Опубл. Бюл. № 7. 1991. - С. 63.

11. Ахметов Л.И., Иванова Е.С., Пунтус И.Ф. и др. Горизонтальный переносtплазмиды биодеградации нафталина в процессе микробной1 деструкции дизельного топлива и нефти в открытом проточном биореакторе // Биотехнология. 2006. - № 4. - С. 19-Ш

12. Безбородов A.M. Биотехнология продуктов микробного синтеза. -М.: Агропромиздат, 1991. С. 6-31.

13. Белоусова Н.И., Барышникова Л.М., Шкидченко А.Н. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах // Прикл. биохим. и микробиол. 2002. -Т. 38, № 5.-С. 513-517.

14. Беляков В.Д., Ряпис Л.А., Илюхин В.И. Псевдомонады и псевдомонозы. М.: Медицина, 1990. - 224 с.

15. Бердичевская М.В. Особенности' физиологии родококков разрабатываемых нефтяных залежей // Микробиология. — 1989. -Т. 58, № 1. С. 60-65.

16. Биодиагностика экологического состояния почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами / С.И. Колесников, К.Ш. Казеев, В.Ф. Вальков и др. — Ростов н/Д: Изд-во Ростиздат, 2007. 192 с.

17. Биологическая диагностика и индикация почв: Кр. курс лекций / Под ред. И.Н. Безкоровайной. Красноярск: Краснояр. гос. аграр. ун-т., 2001. -40 с.

18. Болдырев В.А., Пискунов В.В. Полевые исследования морфологических признаков почв: Учеб. пособие. — Саратов: Изд-во Сарат. ун-та, 2006. — 60 с.

19. Бондаренко А.Н. Оценка нефтяного загрязнения почв аридных территорий (на примере Астраханской области): Автореф. дис. канд. географ, наук. Астрахань, 2008. - 23 с.

20. Борзенков И.А., Милехина Е.И., Готоева М.Т. и др. Свойства углеводородокисляющих бактерий, изолированных из нефтяных месторождений Татарстана, 'Западной Сибири и Вьетнама // Микробиология. 2006. - Т. 75, № 1. - С. 82-89.

21. Браун Д., Флойд А., Сейнзбери М.' Спектроскопия органических веществ. М.: Мир, 1992. - 300 с.

22. Бреус И.П., Мищенко A.A., Неклюдов С.А. и др. Сорбция углеводородов черноземом выщелоченным // Почвоведение. 2003. - №3. - С. 317-327.

23. Буланова A.B., Грецкова И.В., Муратова О.В. Исследование сорбционных свойств сорбентов, применяемых для очистки почв от нефтяных загрязнений // Вестник СамГУ. Естественнонаучная серия. — 2005.-№3(37).-С. 150-158.

24. Бурмистрова Т.И., Алексеева Т.П., Перфильева В.Д. и др. Биодеградация нефти и нефтепродуктов в почве с использованием мелиорантов на основе активированного торфа // Химия растительного сырья. — 2003. — №3. — С. 69-72.

25. Бельков B.B. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. 1995. - №3-4. - С. 20-27.

26. Ветрова A.A., Овчинникова A.A.; Пунтус И.Ф. и др. Интенсификация биодеградации нефти плазмидосодержащими штаммами Pseudomonas в модельных почвенных системах // Биотехнология.—2009. — №4. — С.82-90.

27. Возняковская Ю.М., Курдюков Ю.Ф., Попова Ж.П., Лощинина Л.П. Оценка биологического состояния южного чернозема под разными севооборотами // Почвоведение. — 1996. — № 9. — С. 1107-1111.

28. Войно Л.И. Биодеградация нефтезагрязнений почв и акваторий // Фундаментальные исследования. — 2006. № 5. - С. 48.

29. Волченко Н.Н Влияние условий культивирования на поверхностно-активные свойства углеводородокисляющих актинобактерий: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Ставрополь, 2006. 20 с.

30. Вопросы метаболизма почвенных микроорганизмов / Под ред. И.Л. Клевенской. Новосибирск: Наука, 1981. - 191 с.

31. Восстановление нефтезагрязненных почвенных экосистем: Сб. науч. тр. / Под ред. М.А. Глазовской. М.: Наука, 1988. - 254 с.

32. Временные методические рекомендации по контролю загрязнения почв: В 2 ч. Ч. 2. / Под ред. С.Г. Малахова. М.: Московское отделение гидрометеоиздата, 1984. - 61 с.

33. Габбасова И.М., Абдрахманов Р.Ф., Хабиров И.К. Хазиев Ф.Х. Изменение свойств почв и состава грунтовых вод при загрязнении нефтью и нефтепромысловыми сточными водами в Башкирии //Почвоведение. — 1997.-№ 11.-С. 1362-1372.

34. Габбасова И.М., Хазиев Ф.Х., Сулейманов P.P. Оценка состояния почв с давними сроками загрязнения сырой нефтью после биологической рекультивации // Почвоведение. 2002. - № 10. - С. 1259-1273.

35. Габбасова И.М. Деградация и рекультивация почв Башкортостана. -Уфа: Гилем, 2004. 284 с.

36. Галиев P.A. Фиторемедиация нефтешлама: Автореф. дис. канд. биол. наук. Казань, 2007. - 19 с.

37. Галимов P.A., Харлампиди Х.Э., Гайфуллин A.A. Окисление алканов до синтетических жирных кислот: Учеб. пособие. — Казань: КГТУ, 2007. — 143 с.

38. Галиулин Р.В., Башкин В.Н., Галиулина P.A., Лебедева А.Т. Оценка загрязнения почв бенз(а)пиреном и их биологической активности// Агрохимия. 1993. - № 12. - С. 62-65.

39. Галстян А.Ш. Ферментативная активность почв Армении. Ереван: Айастан, 1974.-276 с.

40. Гафарова Е.В., Зарипова С.К. Влияние цеолитсодержащей породы и эспарцета на биологические параметры выщелоченного чернозема, загрязненного смесью углеводородов // Вестник СамГУ — Естественнонаучная серия. 2005. - № 6(40). - С. 146-157.

41. Голодяев Г.П., Костенков Н.М., Ознобихин В.И. Биоремедиация нефтезагрязненных почв методом компостирования // Почвоведение. -2009.-№8.-С. 996-1006.

42. Голубев С.Н. Криптические миниплазмиды азоспирилл: разработка эффективных методов выделения и характеристика репликонов: Дис.л.канд. биол. наук. Саратов, 2002. - 209 с.

43. ГОСТ 26483-85. Почвы. Приготовление солевой вытяжки и определение ее pH по методу ЦИНАО.

44. Государственный контроль качества воды. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ИПК Издательство стандартов, 2003. - 776 с.

45. Градова Н.Б., Диканская Э.М., Михалева В.В. Использование углеводородов дрожжами: Обзор.'— М.: ОНТИТЭИ микробиологической промышленности, 1971. — 120 с.

46. Градова Н.Б., Горнова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.Н. Использование бактерий Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных почв // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39, № 3. - С. 318-321.

47. Грищенков В.Г., Гаязов P.P. Бактериальные штаммы-деструкторы топочного мазута: характер деградации в лабораторных условиях // Прикл. биохим. и микробиол. — 1997. Т. 33, № 4. - С. 423-427.

48. Громов Б.В., Павленко Г.В. Экология бактерий: Учеб. пособие. Л.:ч,

49. Изд-во Ленинградского университета, 1989. — 248 с.

50. Гузев B.C., Левенцев C.B., Селецкий Г.И. Роль почвенной микробиоты в рекультивации' нефтезагрязненных почв // Микроорганизмы и охрана почв / Под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во МГУ, 1989. - С. 129-151.

51. Гузев B.C., Левин C.B. Перспективы эколого-микробиологической экспертизы состояния почв при антропогенном воздействии // Почвоведение. 1991. - № 9. - С. 50-62.

52. Гузев B.C., Халимов Э.М., Волде М.И., Куличевская И.С. Регуляторное действие глюкозы на активность углеводородокисляющих микроорганизмов в почве // Микробиология. 1997. — Т. 66, № 2. - С. 154159.

53. Джамбетова П.М., Реутова Н.В., Ситников М.Н. Влияние нефтезагрязнений на морфологические и цитогенетические характеристики растений // Экологическая генетика. 2005 - Т. Ill, № 4. — С. 5-10.

54. Донец A.A. Физико-химические аспекты десорбции нефти из пор песчаника и известняка: Автореф. дис. канд.хим.наук.- Тверь,2007. — 19с.

55. Донец Е.В. Влияние нефти на прорастание семян основных лесообразующих видов древесных растений подзоны южной тайги Омской области: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Омск:, 2008. — 22 с.

56. Драчук C.B. Фотогетеротрофные пурпурные бактерии в почвах, загрязнённых углеводородами: Автореф. дис. канд. биол. наук. -Тюмень, 2004. 17 с.

57. Другов Ю.С., Родин A.A. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов, практическое руководство. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. - 270 с.

58. Дуган И.Н., Головлев Е.Л. Индукция диоксигеназ ароматических субстратов у родококков при лимите питательных веществ // Микробиология. 1983. - Т. 52, № 6. - С. 951-955.

59. Евдокимова Г.А., Мозгова Н.П., Корнейкова М.В. и др. Воздействие загрязнения почв дизельным топливом на растения и ризосферную микробиоту на Кольском Севере // Агрохимия. 2007. - № 12. - С. 49-55.

60. Егеревская Л.В., Яранцева Л.Д. О влиянии на растения загрязнений почвы при бурении и разведке на нефть и газ // Растения и промышленная среда. Киев: Наукова думка, 1976. — С. 73-75.

61. Егорова Д.О., Плотникова Е.Г. Грамположительные бактерии -деструкторы хлорированных бифенилов, перспективные для использования при биоремедиации загрязненных почв // Биотехнология. — 2009.-№3.-С. 72-79.

62. Ермоленко З.М., Холоденко В.П., Чугунов В.А. и др. Биологическая характеристика штамма микобактерий, выделенного из нефти Ухтинского месторождения // Микробиология. 1997. - Т. 66, № 5. - С. 650-654.

63. Ермоленко З.М., Чугунов В.А., Герасимов В.Н. и др. Влияние некоторых>факторов окружающей среды на выживаемость внесенных бактерий, разрушающих нефтяные углеводороды // Биотехнология. 1997. - № 5. -С. 33-38.

64. Жариков Г.А., Соколов М.С., Дядищев Н.Р. Эколого-токсикологическая оценка мероприятий по ремедиации почв //Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Матер. Междунар. конф. Саратов, 2005. - С. 128-130.

65. Жданова Н.В., Киреева H.A.; Матыцина О.И. Некоторые пути интенсификации биодеструкции нефти в почве // Нефтепромысловое дело. 1994. -№ 5. -С. 31-32.

66. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный C.B. Кинетические закономерности биодеградации алифатических углеводородов бактериями Rhodococcus rubber и Rhodococcus erythropolis II Прикл. биохим. и микробиол. 2007. - Т. 43, № 6. - С. 657-663.

67. Зеленкова Н.Ф., Аринбасаров М.У. Анализ продуктов микробиологической деградации толуола методом обращено-фазной жидкостной хроматографии // Прикл. биохим. и микробиол. — 2003. —1. Т. 39, №2.-С. 199-201.

68. Звягинцев Д.Г., Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ,2005.-448 с.

69. Иванова Е.С., Есикова Т.З., Гафаров А.Б., Шкидченко А.Н. Мониторинг интродуцированных микроорганизмов-нефтедеструкторов в открытых системах // Биотехнология. 2006. - № 3. - С. 74-78.

70. Иванченко О.Б., Ильинская О.Н., Карамова Н.С., Костюкевич И.И. Мутагенный потенциал как комплексный показатель загрязненности почванефтепродуктами // Почвоведение. — 1996. — № 11. — С. 1394-1398.

71. Ившина И.Б., Бердичевская М.В., Зверева JI.B. и др. Фенотипическая характеристика алканотрофных родококков из различных экосистем // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 4. - С. 507-513.

72. Ившина И.Б., Пешкур Т.А., Коробов В.П. Эффективное извлечение цезия клетками бактерий рода Rhodococcus II Микробиология. — 2002. — Т. 71, №3.-С. 418-423.

73. Игнатова A.A., Ветрова A.A., Лисов A.B. и др. Динамика численности ивзаимодействия псевдомонад, стимулирующих рост растений иразрушающих нафталин в ризосфере горчицы белой // Биотехнология. 2006.-№6.-С. 35-43.

74. Измалкова Т.Ю., Сазонова О.И., Соколов C.JT. и др. Разнообразие генетических систем биодеградации нафталина у штаммов Pseudomonas ßuorescens II Микробиология. 2005. - Т. 74, № 1. - С. 70-78.

75. Иларионов С.А., Иларионова С.Ю., Назаров A.B., Калачникова И.Г. Восстановление почвенного бйоценоза, подвергнутого нефтяному загрязнению // Письма в Международный научный журнал «Альтернативная энергетика и экология». — 2005. № 1. - С. 56-59.

76. Ильина А., Кастилю Санчес М.И., Винареаль Санчес Х.А. и др. Получение препарата на основе бактерий, выделенных из почвы, для биоремедиации нефтяных загрязнений // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2003. - Т. 44, № 1. - С. 88-91.

77. Иммуноферментный анализ / Под ред. Т. Нго и Г. Ленхоффа. — М.: Мир, 1988.-446 с.

78. Исмаилов Н.М. Нефтяное загрязнение и биологическая активность почв

79. Добыча полезных ископаемых и геохимия природных экосистем. — М.:i1. Наука, 1982.-С. 227-235.

80. Исмаилов Н.М. Влияние нефтяного загрязнения на круговорот азота в почве // Микробиология. 1983. - Т. 52, № 6. - С. 227-235.

81. Исмаилов Н.М. Ремедиация нефтезагрязненных почво-грунтов и буровых шламов. Баку: Элм, 2006. - 142 с.

82. Калюжин В.А, Лушников С.В., Завгороднев К.Н. Очистка воды и почвыот нефти и нефтепродуктов с помощью культуры микробов-деструкторов>http://www.priborservice.ru/ecology031 .html.

83. Карасевич Ю.Н. Основы селекции микроорганизмов, утилизирующих синтетические органические соединения. — М.: Наука, 1982. — 144 с.

84. Каталог штаммов региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов / Под ред. И.Б. Ившиной. М.: Наука, 1994.-163 с.

85. Квасников Е.И., Айзенман Б.Е., Соломко Э.Ф. и др. Рост и образование антибиотиков бактериями рода Pseudomonas на среде с низкомолекулярными н-алканами // Микробиология. — 1975. Т. 44, № 1. -С. 55-60.

86. Квасников В.И., Клюшникова Т.М. Трансформация углеводородов нефти в биосфере // Структура и функции микробных сообществ почв с различной антропогенной нагрузкой. — Киев: Наукова думка, 1982. — С. 5-8.

87. Квеситадзе Г.И., Хатисашвили 'Г.А., Садунишвили Т.А., Евстигнеева З.Г. Метаболизм антропогенных токсикантов в высших растениях. -М.: Наука, 2005. 199 с.

88. Киреева H.A. Микробиологические процессы в нефтезагрязненных почвах. Уфа: БашГУ, 1994. - 172 с.

89. Киреева H.A. Биодеструкция нефти в почве культурами углеводородокисляющих микроорганизмов // Биотехнология. — 1996. — №1.-С. 51-54.

90. Киреева H.A. Биохимическая индикация почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Защита от коррозии и охрана окружающей среды. -1998.-№3.-С. 11-14.

91. Киреева H.A., Водопьянов В.В., Мифтахова A.M. Биологическая активность нефтезагрязненных почв. Уфа: Гилем, 2001. — 376 с.

92. Киреева H.A., Новоселова Е.И., Ямалетдинова Г.Ф. Активность оксиредуктаз в нефтезагрязненных и рекультивируемых почвах // Агрохимия. 2001. - № 4. - С. 53-59.и

93. Киреева H.A., Мифтахова A.M., Кузяхметов Г. Влияние загрязнения нефтью на фитотоксичность серой лесной почвы // Агрохимия. — 2001. — №5. С. 64-69.

94. Киреева H.A., Новоселова Е.И., Онегова Т.С. Активность каталазы и дегидрогеназы в почвах, загрязненных нефтью и нефтепродуктами // Агрохимия. 2002. - № 8. - С. 64-72.

95. Киреева H.A., Тарасенко Е.М., Онегова Т.С., Бакаева М.Д. Комплексная биоремедиация нефтезагрязненных почв для снижения токсичности // Биотехнология. 2004. - № 6. - С. 63-70.

96. Киреева H.A., Бакаева М.Д., Водопьянов В.В. Комплексы почвенных микромицетов в условиях техногенеза. — Уфа: Гилем, 2005. — 360 с.

97. Киреева H.A., Мифтахова A.M., Салахова Г.М. Рост и развитие растений яровой пшеницы на нефтезагрязненных почвах и при биоремедиации // Агрохимия. 2006. - № 1. - С. 85-90.

98. Киреева H.A., Тарасенко Е.М., Шамаева A.A., Новоселова Е.И. Влияниеч tнефти и нефтепродуктов на активность липазы серой лесной почвы //Почвоведение. 2006. - № 8.-С. 1005-1011.

99. Классификация и диагностика почв СССР. М.: Колос, 1977. - 220 с.

100. Клонирование ДНК. Методы: Пер. с англ. / Под ред. Д. Гловера. М.: Мир, 1988 -538 с.

101. Колесников С.И., Казеев К.Ш., Велигонова Н.В. и др. Изменение комплекса почвенных микроорганизмов при загрязнении чернозема обыкновенного нефтью и нефтепродуктами // Агрохимия. — 2007. — № 12. -С. 44-48.

102. Колодяжный A.B., Ковальчук Т.Н., Коровин Ю.В. Антонович В.П. Определение микроэлементного состава нефтей и нефтепродуктов. Состояние и проблемы (Обзор) // Методы и объекты химического анализа.- 2006. Т. 1, № 2. - С. 90-104. '•Ч t

103. Коломынцева М.П., Соляникова И.П., Головлев Е.Л., Головлева Л.А. Гетерогенность Rhodococcus opacus 1СР как ответ на стрессовое воздействие хлорфенолов // Прикл. микробиол. и биохим. 2005. — Т. 41, №5.-С. 541-546.

104. Коробкин В.И. Экология: учебник для вузов. Ростов/Д: Феникс, 2008.- 602 с.

105. Коронелли Т.В. Поступление углеводородов в клетки микроорганизмов // Успехи микробиологии. 1980. - Вып. 15. - С. 99-111.

106. Коронелли Т.В. Микробиологическая деградация углеводородов и еёч tэкологические последствия // Науч. докл. Высш. шк. Биол. Науки. — 1982. -№3. -С. 5-13.

107. Коронелли Т.В. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. М.: Изд-во МГУ, 1984. - 160 с.

108. Коронели Т.В., Комарова Т.И., Игнатченко A.B. Взаимодействие бактерий в культуре, содержащей Pseudomonas и Micobacterium в связи с окислением углеводородов // Микробиология. — 1984. — Т. 53,№2.—С. 213-217.

109. Коронелли Т.В., Нестерова Е.Д. Экологическая стратегия бактерий, использующих гидрофобный субстрат // Микробиология. 1990. — Т. 59, вып. 6. - С. 993-997.

110. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Батраков С.Г. Образование миколатов трегалозы родококками в зависимости от возраста клеток и источника углерода // Микробиология. 1990. - Т. 59, Вып. 5. - С. 777-781.

111. Коронелли Т.В., Ильинский В.В., Семененко М.Н. Нефтяное загрязнение и стабильность морских экосистем // Экология (Владивосток). 1993. - № 4. - С. 78-91.

112. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В. и др. Видовая структура углеводородокисляющих бактёриоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. — 1994. — Т. 63, № 5. — С. 917-922.

113. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде //Прикл. биохим. и микробиол. 1996. - Т. 32, № 6. - С. 579-586.

114. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Ильинский В.В. и др. Интродукциял tбактерий рода Rhodococcus в тундровую почву, загрязненную нефтью

115. Прикл. биохим. и микробиол. 1997. - Т. 33, № 2. - С. 198-201.- 1

116. Коронелли Т.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В., Дермичева С.Г. Изменение липидного состава клеток R- и S-вариантов Rhodococcus erythropolis при длительном хранении на лабораторной среде // Микробиология. 1998. - Т. 67, №5. - С. 718-720.

117. Критерии отнесения отходов к классам опасности для окружающей природной среды. Приказ МПР РФ № 511 от 15.06.2001. 13 с.

118. Кувшинская JI.B. Изменение свойств дерновоподзолистых почв при загрязнении нефтью // Вестник Пермского госуд. ун-та. Биология. — 2001.- Вып. 4. С. 63-70.

119. Кузнецов А.Е., Градова Н.Б. Научные основы экобиотехнологии. — М.: Мир, 2006. 504 с.

120. Кузякина Т.И., Хайнасова Т.С., Левенец О.О. Биотехнология извлечения металлов из сульфидных руд // Вестник КРАУНЦ. Серия: Науки о Земле.- 2008. Т. 2, № 12. - С. 76-86.

121. Куличевская И.С., Гузев B.C., Паников Н.С. Популяционная динамика углеводородокисляющих дрожжей, интродуцированных в нефтезагрязненную почву // Микробиология. 1995. - Т. 64, № 5. — С. 668-673.

122. Куценко С.А. Основы токсикологии: Разделы: токсикометрия, токсикокинетика, токсикодинамика, экотоксикология и др.: Учеб. пособие для мед. вузов Санкт-Петербурга, 2004. 720 с.

123. Куюкина М.С., Ившина И.Б., Рычкова М.И., Чумаков О.Б. Влияние состава клеточных липидов на формирование неспецифической антибиотикорезистентности алканотрофных родококков // Микробиология. 2000. - Т. 69, № 1. - С. 62-69.

124. Ларионова H.A., Семенова E.H., Бреус В.А. и др. Экстракция и анализ углеводородов, содержащихся в загрязненных почвах // Технология нефти и газа. 2005. - № 4. - С. 39-49.

125. Ленёва H.A., Коломынцева М.П., Баскунов Б.П., Головлёва Л.А. Деградация фенантрена и антрацена бактериями рода Rhodococcus II Прикл. биохим. и микробиол. 2009. - Т. 45, № 2. - С. 188-194.

126. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф. и др. Оценка эффективности нового биопрепарата Ленойл для ремедиации нефтезагрязненных почв // Биотехнология. — 2004. № 1. - С. 77-82.

127. Лозановская И.Н., Орлов Д.С, Садовникова Л.К. Экология и охрана биосферы при химическом загрязнении. -М: Высшая школа, 1998. 120 с.

128. Лысак Л.В., Сидоренко H.H. О видовом разнообразии родококков в городских почвах // Микробиология. — 1997. Т. 66, № 4. - С. 574-575.

129. Маниатис Т., Фрич Э., Сэмбрук Д. Молекулярное клонирование: Пер. с англ. М.: Мир, 1984. - 480 с.

130. Маркарова М.Ю. Использование углеводородокисляющих бактерий для восстановления нефтезагрязненных земель в условиях Крайнего Севера: Автореф. дис. канд. биол. наук. Пермь, 1999. - 26 с.

131. Марченко С.А., Кожевин П.А. Функциональная реакция микробного сообщества почвы как индикатор загрязнения стойкими органическими загрязнителями // Arpo XXI. 2008. - № 7-9. - С. 31-33.

132. Маячкина Н.В., Чугунова М.В. Особенности биотестирования почв с целью их экотоксикологической оценки // Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского. 2009. - № 1. - С. 84-93.

133. Методические рекомендации по выявлению деградированных и загрязненных земель. М.: Изд-во РЭФИА, 1995. - 50 с.

134. Методические указания МУК 4.2. 1890-04. Определениеiчувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам — М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.—74 с.

135. Методические указания по санитарно-микробиологическому исследованию почвы. Утв. Минздравом СССР 19.02.1981 № 2293-81.

136. Методы анализа органического вещества пород, нефти и газа / Под ред. A.B. Рылькова. Тюмень: Западно-Сибирский НИГНИ, 1977. - 122 с.

137. Методы контроля качёства почвы. Учебно-методическое пособие для вузов / Под ред. Д.Л. Котова и др. — 2007. Воронеж. - 106 с.

138. Методы молекулярной генетики и генной инженерии / A.B. Мазин, К.Д. Кузнеделов, A.C. Краев. Новосибирск: Наука, 1990. - 248 с.

139. Методы общей бактериологии. В 3-х Т. / Под ред. Ф. Герхардта. — .у>: Мир, 1984.

140. Микробиологическая рекультивация нефтезагрязненных почв / H.A. Киреева, В.В. Водопьянов, Е.И. Новоселова и др. — М.: ОАО «ВНИИОЭНГ», 2001. 40 с.

141. Микроорганизмы и охрана почв / Под ред. Д.Г. Звягинцева. M.: IVETY, 1989.-206 с.

142. Милехина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С. и др. Эколого-физиологические особенности аэробных эубактерий из нефтяных месторождений Татарстана // Микробиология. — 1998. Т. 67, № 2. — С. 208-214.

143. Миллер Дж. Эксперименты в молекулярной генетике. — М.: Мир, 1976. -440 с.

144. Мирошниченко H.H. Принципы регламентации углеводородного загрязнения почв Украины // Почвоведение. — 2008. № 5. - С. 614-622.

145. Мишустин E.H., Перцовская М.И., Горбов В.А. Санитарная микробиология почвы. М.: Наука, 1979. - 304 с.

146. Мурыгина В.П., Калюжный C.B. Применение биопрепарата-нефтедеструктора «Родер» в северных регионах России // Проблемы биодеструкции техногенных загрязнителей окружающей среды: Матер. Междунар. конф. — Саратов: Изд-во Науч. книга, 2005. — С. 82-83.

147. Назаров A.B., Иларионов С.А. Изучение причин фитотоксичностинефтезагрязненных почв // Письма в Международный научный журнал1

148. Альтернативная энергетика и экология». 2005. - № 1. - С. 60-65.

149. Назарько М.Д., Романова К.Н. Трансферные технологии в биоремедиации нефтезагрязненных почв // Вестник ОГУ. Материалы IV Всероссийской научно-практической конференции «Проблемы экологии Южного Урала».- 2009. Ч. III. - С. 469-470.

150. Назина Т.Н., Шестакова Н.М., Еригорьян A.A. и др. Филогенетическое разнообразие и активность анаэробных микроорганизмов высокотемпературных горизонтов нефтяного месторождения Даган (КНР) // Микробиология. 2006. - Т. 75, № 1. - С. 70-81.

151. Нестеренко O.A., Квасников Е.И., Ногина Т.М. Нокардиоподобные и коринеподобные бактерии. — Киев: Наукова думка, 1985. — 336 с.

152. Нефтяные и синтетические нафтеновые кислоты, их свойства и производные / Зейналов Б.К, Сидорчук И.И., Кошелева JI.M., Бродская Е.С.; Баку, ИНХП АНАзССР, 1980. 118 с. - Деп. в ВИНИТИ, № 605-80.

153. Нечаева И.А., Филонов А.Е., Ахметов Л.И. и др. Стимуляция микробной деструкции нефти в почве путем внесения бактериальной ассоциации и минерального удобрения в лабораторных и полевых условиях // Биотехнология. 2009. - № 1. - С. 64-70.

154. Никитина Е.В., Якушева О.И., Гарусов A.B., Наумова Р.П. Биоремедиация отходов нефтехимического производства с использованием компостирования // Биотехнология. 2006. - № 1. - С. 5361.

155. Николаев А.Я. Биологическая химия. 3-е изд., перераб. и доп. — М.: Медицинское информационное агентство, 2004. 566 с.

156. Новоселова Е.И. Экологические аспекты трансформации ферментного пула почвы при нефтяном загрязнении и рекультивации: Автореф. дис. докт. биол. наук. Воронеж, 2008. - 41 с.

157. Новоселова Е.И., Тухватуллина А.Ф. Роль ферментативной активности в осуществлении почвой трофической функции в условиях нефтяного загрязнения // Вестник ОГУ. 2009. - №6(100). - С. 592-593.

158. Определитель бактерий Берджи: В 2 т. / Дж. Хоулт., Н. Криг, П. Снит и др. М.: Мир, 1997. - 1232 с.

159. Орлов Д.С., Садовникова Л.К., Суханова Н.И. Химия почв. — М.: Высшая школа, 2005. 560 с.

160. Осипов В.М., Белова Т.Д. Спектрофотометрический метод определения содержания нефтепродуктов в сточной воде // Химия и технология топлив и масел. 1968. — №1. — С. 58-59.

161. Основные микробиологические и биохимические методы исследования» почвы. Методические рекомендацйи / Под ред. Ю.М. Возняковской. -Ленинград, 1987. 16 с.

162. ОСТ 38.01378-85 Охрана природы. Гидросфера. Определение содержания нефтепродуктов в сточных водах методом ИК-спектроскопии. -М.: Изд-во стандартов, 1991. 6 с.

163. Остроумов С.А. Некоторые аспекты оценки биологической активности ксенобиотиков // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 16, Биология. 1990. — № 2. -С. 27-34.

164. Очистка окружающей среды от углеводородных загрязнений / В.Ж. Арене, А.З. Саушин, О.М. Гридин, А.О. Гридин. — М.: Интербук, 1999.-370 с.

165. Патент на изобретение РФ № 2129604, МПК: C12N1/20 C02F3/34 В09С1/10 C12N1/20 C12R1:06 C12R1:38 / Закрытое акционерное общество «Экогеос-1».

166. Патент на изобретение РФ №2174496, МПК: 7 C02F3/34, В09С1/10, C12N1/26, C12N1/26 / Мурыгина В.П.

167. Патент на изобретение РФ № 2115727, МПК: C12N 1/26, C02F 3/34, В09С1/10, C12N1/26, C12R1:00, C12R1:06 / Капотина Л.Н., Морщакова Г.Н., Дедовец С.А.

168. Патент на изобретение РФ № 2193533, МПК: C02F3/34 C12R1:32 В09С1/10 C12N1/20 C12N1/20 C12Rl:0r C12N1/20 / Государственный научный центр прикладной микробиологии.

169. Патент на изобретение РФ № 2191643, МПК: В09С1/10 C12N1/20 C12N1/20 C12R1:01 / Закрытое акционерное общество "Полиинформ".

170. Петрикевич С.Б., Кобзев E.H., Шкидченко А.Н. Оценка углеводородокисляющей активности микроорганизмов // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. - Т. 39, № 1. - С. 25-30.

171. Петухов В.Н., Фомченков В.М., Чугунов В.А., Холоденко В.П. Биотестирование почвы и воды, загрязненных нефтью и нефтепродуктами, с помощью растений // Прикл. биохим. и микробиол. — 2000. Т. 36, № 6. - С. 652-655.

172. Пиковский Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. М.: Изд-во МГУ, 1993. - 208 с.

173. Пиковский Ю.И., Геннадиев А.Г., Чернянский С.С., Сахаров Г.Н.

174. Проблема диагностики и нормирования загрязнения почв нефтью инефтепродуктами // Почвоведение. — 2003. — № 9. С. 1132-1140.

175. Плешакова Е.В., Муратова А.Ю., Турковская О.В. Деградациякминерального масла штаммом Acinetobacter calcoaceticus II Прикл. биохим. и микробиол. 2001. - Т. 37, № 4. - С. 398-405.

176. Плешакова Е.В., Дубровская Е.В., Турковская О.В. Приемы стимуляции аборигенной нефтеокисляющей микрофлоры // Биотехнология. — 2005. — №1.-С. 42-50.

177. Пономарева JI.B., Крунчак В.Г., Торгованова В.А. и др. Биоремедиация нефтезагрязненной почвы с использованием биопрепарата "БИОСЭТ" и пероксида кальция // Биотехнология. — 1998. № 1. - С. 79-84.

178. Почва. Город. Экология. / Под ред. Г.В. Добровольского. М.: Фонд «За экономическую.грамотность», 1997. — 320 с.

179. Почвы мегаполисов, их экологическая оценка, использование и создание (на примере г. Москвы) / В.И. Савич, Ю.В. Федорин, Е.Г. Химина и др. М.: Агробизнесцентр, 2007. - 660 с.

180. Практикум по агрохимии / Под ред. Б.А. Ягодина. — М.: Агропромиздат, 1987.-512 с.

181. Практикум по микробиологии: Учеб. пособие для студ. высш. учеб. заведений / А.И. Нетрусов, М.А. Егорова, JI.M. Захарчук и др. — М.: Академия, 2005. 608 с.

182. Практикум по микробиологии 7' Под ред. Н.С. Егорова. М.: Изд-во МГУ, 1976.-307 с.

183. Пырченкова И.А., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф. и др. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти // Прикл. биохим. и микробиол. 2006. — Т. 42, № 3. - С. 298-305.

184. Рахимова Э.Р., Осипова A.JL, Зарипова С.К. Очистка почвы от нефтяного загрязнения с использованием денитрифицирующих углеводородокислюящих микроорганизмов // Прикл. биохим. и микробиол. 2004. - Т. 40, № 6. - С. 649-653.

185. РД 52.18.647-2003. Методические указания определение массовой доли нефтепродуктов в почвах. Методика выполнения измерений гравиметрическим методом / Разр. «Тайфун». Утв. Росгидрометом 18.03.2003. Введен. 01.06.2003. 16 с.

186. Рогозина Е.А., Шиманский В.К. Некоторые теоретические аспекты восстановления нефтзагрязненных почвенных экосистем //Нефтегазовая геология. Теория и практика. 2007. - № 2. - 16 с.

187. Рубан E.JI. Физиология и биохимия представителей рода Pseudomonas. -M.: Наука, 1986.-200 с.

188. Ручай Н.С., Конев C.B. Биохимия и микробиология. М.: Экология, 1992.-237 с.

189. Рэуце Н., Кырста С. Борьба с загрязнением почвы. М.: Агропромиздат, 1986.-241 с.

190. Сахарова З.В., Ибрагимова С.И. Влияние низкого значения pH на химический состав хемостатной культуры Bacillus megaterium II Микробиология. 1975. - T. 44, № 1. - С. 91-96.

191. Сваровская Л.И., Алтунина Л.К. Активность почвенной микрофлоры в условиях нефтяных загрязнений // Биотехнология. 2004.- №3. - С. 63-69.1. Ч I

192. Седых В.Н., Игнатьев JI.A. Влияние отходов бурения и нефти на физиологическое состояние растений // Сибирский экологический журнал. 2002. - № 1.-С. 47-53.

193. Селивановская С.Ю., Латыпова В.З. Создание тест-системы для оценки токсичности многокомпонентных образований, размещаемых в природной среде // Экология. 2004. - № 1. - С. 21-24.

194. Селифанов С.А., Слепенький A.B., Аданин В.М. и др. Катаболизм аценафтена штаммами Alcaligenes eutrophus и Alkaligenes paradoxus //Микробиология. 1993. - Т. 62, № 1. - С. 120-128.

195. Семенов A.M., Куличевская И.С., Халимов Э.М. и др. Лабораторные тесты для оптимизации интродукции в почву микроорганизмов-деструкторов нефти // Прикл. биохим. и микробиол. — 1998. — Т. 34, № 5. — С. 576-582.

196. Серебрякова Е.В., Дармов И.В., Медведев Н.П. и др. Оценка гидрофобных свойств бактериальных клеток по адсорбции на поверхности капель хлороформа // Микробиология. 2002. - Т. 71, № 2. - С. 237-239.

197. Сидоров Д.Г., Борзенков И.А1, Ибатуллин P.P. и др. Полевой эксперимент по очистке почвы от нефтяного загрязнения с использованием углеводородокисляющих микроорганизмов // Прикл. биохим. и микробиол. 1997. - Т. 33, № 5. - С. 497-502.

198. Сморкалов И.А. Роль фотогетеротрофных пурпурных бактерий в самоочищении почв от углеводородов: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Уфа, 2009. 25 с.

199. Соловьев В.И., Пушкина В.А., Кожанова Г.А., Гудзенко Т.В.

200. Медицинские аспекты и санитарно-гигиеническая оценка бактериальных 'к.

201. Справочник биохимика / Под ред. Р. Досон, Д. Элиот. М.: Мир, 1991. -543 с.

202. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Рева О.Н., Иванов В.Н. Выбор активного микроорганизма-деструктора углеводородов для очистки нефтезагрязненных почв // Прикл; биохим. и микробиол. 1995. — Т. 31, №5.-С. 534-539.

203. Стом Д.И., Потапов Д.С., Балаян А.Я., Матвеева О.Н. Трансформация нефти в почве микробиологическим препаратом и дождевыми червями // Почвоведение. 2003. - № 3. - С. 359-361.

204. Сулейманов P.P., Ситдиков Р.Н. Рекультивация нефтезагрязнённых почв и грунтов с использованием моющего средства промышленного назначения // Нефтяное хозяйство. 2003. - № 12. - С. 115-117.

205. Сулейманов P.P., Габбасова И.М., Ситдиков Р.Н. Изменение свойств1. V»нефтезагрязнённой серой лесной' почвы в процессе биологической рекультивации // Известия РАН. Серия биологическая. 2005. - JSfo i. С. 109-115.

206. Сулейманов P.P., Абдрахманов Т.А., Жаббаров З.А., Турсунов JI.T. Ферментативная активность и агрохимические свойства лугово-аллювиальной почвы в условиях нефтяного загрязнения // Самарская Лука. 2007. - Т. 16, № 3(21). - С. 575-580.

207. Тен Хак Мун, Кириенко O.A., Имранова Е.Л. Влияние фотосинтезирующих бактерий и компоста на деградацию нефтепродуктов в почве // Прикл. биохим. и микробиол. 2004. - Т. 40, № 2. - С. 214-219.

208. Теппер Е.З., Шильникова В.К., Переверзева Г.И. Практикум по микробиологии. — М.: Колос, 1993. 175 с.

209. Терехова В.А., Арчегова И.Б., Хабибуллина Ф.М. и др. Экотоксикологическая оценка биосорбента нефти с целью сертификации // Экология и промышленность России. 2006. — № 3. - С. 34-37.

210. Терещенко H.H., Лушников C.B., Пышьева Е.В. Рекультивация нефтезагрязненных почв // Экология и промышленность. 2002. — № ю. -С. 17-20.

211. Тлехас З.Р. Изменение биологических свойств почв республики Адыгея при химическом загрязнении: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Ростов-на-Дону, 2008. 26 с.

212. Токсикологическая химия: учеб:,для вузов / Под ред. Т.В. Плетеневой. — 2-е изд., исп. -М.: ГЭОТАР-Медиа, 2005. 512 с.

213. Уткин И.Б., Якимов М.М., Козляк Е.И., Рогожин И.С. Деструкция токсичных органических соединений микроорганизмами // Итоги науки и техники ВИНИТИ. Сер. Биологическая химия. — 1991. С. 1-100.

214. Учебно-методическое пособие по генетике бактерий / Саратов: СГУ. -1979.- 17 с.

215. Фатеев А.И., Мирошниченко H.H., Панасенко Е.В., Христенко С.И. Изменение агрохимических и микробиологических свойств нефтезагрязненного чернозема в рекультивационный период // Агрохимия. 2004. - № 10. - С. 53-60.

216. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» от 30 марта 1999 г. № 52-ФЗ с изменениями от 30.12.2001 г., 10.01.2003 г., 30.06.2003 г., 22.0.2004 г., 09.05.2005 г. С.-Пб.: Изд-во Деан, 2005.

217. Финкельштейн З.И., Баскунов Б.П., Головлев E.JI. и др. Зависимость превращения хлорфенолов родококками от положения и числа атомов хлора в 1 ароматическом кольце // Микробиология. 2000. - Т 69, № 1. — С. 49-57.

218. Фитотоксичность антропогенно'загрязненных почв / H.A. Киреева, Г.Г. Кузяхметов, A.M. Мифтахова, В.В. Водопьянов Уфа: Гилем, 2003. — 266 с.

219. Фомченков В.М., Ирхина И.А., Новиков И.А. и др. Исследование интегральной токсичности водной среды, загрязненной нефтью и нефтепродуктами, с использованием бактериальных тестов // Прикл. биохим. и микробиол. — 2000. Т. 36, № 6. — С. 656-660.

220. Фримантл М. Химия в действии: В 2 ч. — Москва: Мир, 1998. 620 с.

221. Хабибуллина Ф.М., Шубаков A.A., Арчегова И.Б., Романов Г.Г. Исследование способности нефтёокисляющих бактерий утилизировать углеводороды нефти // Биотехнология. — 2002. — № 6. — С. 57-62.

222. Халимов Э.М., Левин C.B., Гузев B.C. Экологические и микробиологические аспекты повреждающего действия нефти нач свойства почвы // Вест. Моск. ун-та. Сер. 17. Почвоведение. 1996. - № 2. - С. 5964.

223. Хазиев Ф.Х. Методы почвенной энзимологии. М.: Наука, 2005. -252 с.

224. Химия нефти и газа: Учеб. пособие для вузов / А.И. Богомолов, A.A. Гайле, В.В. Громова; Под ред. В.А. Проскурякова, А.Е. Драбкина. -Л.: Химия, 1989.-424 с.

225. Хоменков В.Г., Шевелёв А.Б., Жуков В.Г. и др. Организация метаболических путей и молекулярно-генетические механизмы биодеградации ксенобиотиков у микроорганизмов (обзор) // Прикл. биохим. и микробиол. 2008. - Т. 44, № 2. - С. 133-152.

226. Хомякова Д.В., Ботвинко И.В., Нетрусов А.И. Выделение психроактивных углеводородокисляющих,бактерий из нефтезагрязненных почв // Прикл. биохим. и микробиол. — 2003. — Т. 39, № 6. — С. 661-664.

227. Хроматографический анализ окружающей среды: Пер. с англ. / Под ред. В.Г. Березкина. М.: Химия, 1979. - 608 с.

228. Шамаева A.A. Исследование процессов биоремедиации почв и объектов, загрязненных нефтяными углеводородами: Автореф. дис. канд. биол. наук. — Уфа, 2007. 23 с.

229. Широких И.Г. Микробные сообщества кислых почв Северо-Востока Европейской части России: Дис. д-ра биол. наук. Москва, 2004. — 394 с.

230. Шорина Т.С. Влияние нефтяного загрязнения на биологическую активность черноземов Оренбургской области // Вестник ОГУ. — 2009. — №6(100).-С. 651-653.

231. Экологическая химия. Основы и концепции. Пер. с нем. / Ф. Корте, М. Бахадир, В. Клайн и др. М.: Мир, 1997 - 204 с.

232. Экология микроорганизмов / Под ред. А.И. Нетрусова. М.: Наука, 2004.- 165 с.

233. Янкевич М.И. Формирование ремедиационных биоценозов для снижения антропогенной нагрузки на водные и почвенные экосистемы: Автореф. дис. д-ра биол. наук. М., 2002. - 50 с.

234. Ягафарова Г.Г., Скворцова И.Н. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodococcus erythropolis II Прикл. биохим. и микробиол. — 1996. Т. 32, № 2. - С. 224-227.7 I

235. Ягафарова Г.Г. Экологическая биотехнология. Уфа: Изд-во УГНТУ, 2001.-213 с.

236. Яранцева М.М., Фахрутдинов • А.И. Антагонистические взаимоотношения культур прокариотных и эукариотных микроорганизмов // Экология. 2007. - С.243-244.

237. Яскович Г.А., Елькин Г.Э. Характеристика гидрофобности поверхности клеток микроорганизмов // Микробиология. -1995.- Т. 64,№ 1. С. 137-139.

238. Яскович Г.А., Яковлева Е.П. Изучение гидрофобности поверхности штаммов клеток бактерий // Микробиология. —1996.- Т. 65, №4. С. 569-571.

239. Adam G., Duncan H J. Effect of diesel fuel on growth of selected plant species // Environ. Geochem. and Health. 1999. - Vol. 21. - P. 353-357.

240. Aldrett S., Bonner J.S., McDonald T.J. et al. Degradation of crude oil enhanced by commercial microbial cultures // Proc. of Intern, oil spill conference. American Petroleum Institute, 1997. - P. 995-996.

241. Alexander M. Biodégradation and bioremediation. San Diego, California, USA: Academic Press, Inc., 1999. - 302 p. '

242. Allard A-S., Neilson A.H. Bioremediation of organic waste sites: A critical review of microbiological aspects // Intern. Biodeteriorat. and Biodégradation. -1997. Vol. 39, N 4. - P. 253-285.

243. Arthurs P., Stiver W.H., Zytner R.G. Passive volatilisation of gasoline from soil;// J. Soil Contaminai. 1995. - Vol. 4. - P. 123-135.

244. AssadiM.M., Mathur R.P. Applicability of an HPLS system in the analysis of biodegraded crude oil components// J. Liquid chromatogr: — 1991. Vol. 14, N 19.-P. 3623-3629.

245. Barkay T., Nazaret S., Jeffrey W". Degradative genes in the environment //Microbials transformation and degradation5 of toxic organic chemicals / Eds. L.Y. Young, C.E. Cerniglia. Wiley-Liss., 1995. - P. 545-577.

246. Becker B., Lechevalier M .P., Gordon- R.E., Lechevalier H.A. Rapiddifferentiation betweQn Nocarciia and Streptomyces by paper chromatography*of whole-cell hydrolysates // Appl. Microbiol. —1964. Vol. 12. - P. 421-423;

247. Belkin S.M., Stieber A., Tiehm F.H. et al. Toxicity and genotoxicity enhancement during polycyclic aromatic hydrocarbons biodégradation //Environ; Toxicol; and Water Quality. 1994.- Vol. 9. -P. 303-309;

248. Benitez E., Melgar R, Nogales R. Estimating soil resilience to a toxic organic waste by measuring enzyme activities // Soil Biol, and Biochem. — 2004. — Vol. 36.-P. 1615-1623.

249. Bento F.M., Camargo F., Okeke B., Frankenberger-Junior W. Bioremediation of soil contaminated by diesel oil // Brazil. J. Microbiol. 2003. — Vol. 34. — P. 17-20.

250. Bento F., Camargo F., Okeke B., Frankenberger W. Comparative bioremediation of soils contaminated with diesel oil by natural attenuation, biostimulation and bioaugmentation // Bioresourse Technol. — 2005. — Vol. 96, N 9. -P.1049-1055.

251. Bergey's manual, systematic bacteriology. — Baltimore, London: Williams, Wilkins, 1984-1986. 1599 p.

252. Bernick F.C, Stafford D.A. Waste oil disposal by microbial technology // Process Biochem. 1985. - Vol. 20, N 6. - P. 175-180.

253. Beyer L., Wachendorf C., Eisner D., Knabe R. Suitability of dehydrogenase activity as an index of soil-biological activity // Biol. Fert. Soils. — 1993. — Vol. 16. —N 1. — P. 52-56.

254. Birnboim H.C., Doly J. A rapid alcaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA // Nucl. Acids Res. -1979. Vol. 7. - P. 11513-1523.

255. Blankenship D.W., Larson R.A. Plant growth inhibition,by the water extract of a crude oil // Water, Air and Soil Pollut. -1978. Vol. 10; N4. - P.47M73.

256. Bollag J.M., Mertz T., Otjen I. Role of microorganisms in soil bioremediation // Bioremediation through rhizosphere technology. 1994. - P. 2-10.

257. Bosecher K., Teschner M., Wehner H. Biodégradation of crude oils // Schiftenr, Ver. Wasser, Boden und Lufthyg. 1998. - № 80. - P. 91-117.

258. Broadway N.M., Dickinson F.M., Ratledge C. The enzymology of dicarboxylic acid formation by Corynebacterium sp. strain 7E1C grown on n-alkanes //J. Gen. Microbiol. 1993. - Vol. 139. - P. 1337-1344.

259. Broughton L.C., Gross K.L. Patterns of diversity in a plant and soil microbial communities along a productivity gradient in a Michigan old-field // Oecologia. -2000.-Vol. 125.-P. 420-427.

260. Bundy J.G., Paton G.I., Campbell C.D. Microbial communities in different soil types do not converge after diesel contamination // J. Appl. Microbiol. -2002. Vol. 92. - P. 276-288.1. A t

261. Caldwell B.A. Enzyme activities as a component of soil biodiversity:

262. A review // Pedobiologia. 2005. - Vol. 49, N 6. - P. 637-644.i

263. Cameron D.R., Cooper D.G., Neufeld R.J. The mannoprotein Saccharomyces cerevisiae is an effective bioemulsifier // Appl. Environ. Microbiol. 1988. — N6.-P. 1420-1425.

264. Carberry J.B., Wik J. Comparison of ex situ and in situ bioremediation of unsaturated soils contaminated by petroleum // J. Environ. Sci. Health. Part A Tox. Hazard Subst. Environ. Eng. -2001. Vol. 36; N 8. - P. 1491-1503.

265. Garcia C., Hernandez T., Costa F:.Potential use of dehydrogenase activity as an index of microbial activity in degraded soils // Commun. Soil Sci. Plant Anal. 1997. - Vol". 28. - P. 123-134.

266. Casellas M., Grifoll M., Sabate J., Solanas A.M. Isolation and characterization of a 9-fluorenoned-degrading bacterial strain and its role in synergistic degradation of fluorine by a consortium // Can. J. Microbiol. — 1998.- Vol. 44. P. 734-742.

267. Cerna M. Vliv organickych Latek a pomeru C:N na dehydrogenazovon activitu v pude // Rostl. Vyr. 1973. - Vol. 19, N 9. - P. 923- 930.

268. Cerniglia C.E., Yang S.K. Stereoselective metabolism of anthracene and phenanthrene by Cunnningbatella elegans II Appl. Environ. Microbiol. — Vol. 47, N 1.- P. 119-124.

269. Chakrabarty A.M. Genetic engineering applied aspects // Ind. J. Microbiol.- 1980.-Vol. 20, N 1. — P. 103-108.

270. Christofi N., Ivshina I.B. Microbial surfactants and their use in field studies of soil remediation // J. Appl. Microbiol. 2002. - Vol. 93. - P. 915-929.

271. Churchill S.A., Harper J.P., Churchill P.F. Isolation and characterization of a Mycobacterium species capable of degrading three- and four-ring aromatic and aliphatic hydrocarbons // Appl. Environ. Microbiol.- 1999.- Vol.65. P.549-552.

272. Cooper D.G., Zajic J.E., Gracey D.E.F. Analysis of corynomycolic acids and other fatty acids produced by Corynebacterium lepus grown on kerosene // J. Bacteriol. 1979. - Vol. 137. - P. 795-801.

273. Cooper D.G., Goldenberg B.G. Surface active agents from two Bacillus species // Appl. Environ. Microbiol. 1987. - Vol. 53, N 2. - P. 224-229.

274. Cunningham C.J., Philp J.C. Comparison of bioaugmentation and biostimulation in ex situ treatment of diesel contaminated soil // Contamination & Reclamation. 2000. - Vol. 8, N 4. - P. 261-269.

275. Dehorter B., Blondeau R. Extracellular enzyme activities during humic acid degradation by the whiterot fungi Phanerochaete chrysosporium and Trametes versicolor // FEMS Microbiol. Lett. 1992. - Vol. 94. - P. 209-216.

276. Del Arco J.P., Franca F.P. Influence of oil contamination levels on hydrocarbon biodégradation in sandy sediment // Environ. Pollut. — 2001. — Vol. 110.-P. 515-519.

277. Demque D.E., Biggar K.W., Kèroux J.A. Land treatment of diesel contaminated soil // Can. Geotech. J. 1997. - Vol. 34. - P. 421-431.

278. Déni J., Penninckx M.J. Nitrification and autotrophic bacteria in a hydrocarbon-polluted soil // Appl. Environ. Microbiol. 1999. - Vol. 65. — P. 4008-4013.

279. Dibble J.T., Bartha R. The effect of environmental parameters on thebiodégradation of oil sludge // Appl. Environ. Microbiol. 1979. - Vol. 37. —i1. P. 729-739.

280. Directive 2004/54/EC on the protection of workers from risks related totexposure to biological agents at work // Official J. European Communities. — 2000.-Vol. 262.-P. 21-33.

281. Dobler R., Saner M., Bachofen R. Population changes of soil microbial communities induced by hydrocarbon and metal contamination // Biorem. J. — 2000.-Vol. 4.-P. 41-56.

282. Dorn P.B., Salanitro J.P. Temporal ecological assessment of oil contaminated soils before and after bioremediation // Chemosphere. 2000. - Vol. 40. — P. 419-426.

283. Dott W., Feidieker D., Kampfer P. Comparison of autochthonous bacteria and commercially available cultures with respect to their effectiveness in fuel oil degradation // J. Ind. Microbiol. 1989. - Vol. 4, N 5. - P. 365-374.

284. Douglas L.A., Bremner J.M. A rapid method of evaluting different compounds as inhibitors of urease activity in soils // Soil Biol. Biochem. — 1971. Vol. 3, N 4. -P. 309-315.

285. Eurosoil 2008: soil society - environment / Eds. W.H. Blum, M.H. Gerzabek, M. Vodrazka. - Vienna: BOKU, 2008. - 400 p.

286. Falatko D.M., Novak J.T. Effect of biologically produced surfactants on the mobility and biodégradation of petroleum hydrocarbons // Water Environ. Res. 1992. - Vol. 64. - P. 163-169.

287. Fleck L.C., Bicca F.C., Ayub M.A.Z. Physiological aspects of hydrocarbon emulsification, metal resistance and DNA profile of biodegrading bacteria isolated from oil polluted sites // Biotechnol. Lett. 2000. - Vol. 22, N 4. -P. 1573-6776.

288. Foght J.M., Westlake D.W.S. Bioremediation of oil spills // Spill Technol. Newslett. 1992. - Vol. 17, N 3. - P. 1-10.

289. Foght J., Semple K., Gauthier C. et al. Effect of nitrogen source on biodégradation of crude oil by a defined bacterial; consortium incubated under cold, marine conditions // Environ. Technol. 1999. - Vol. 20. - P. 839-849.

290. Frankenberger W.T., Johanson Jr., Johanson J.B. Influence of crude oil and refined petroleum products on soil dehydrogenase activity // J. Environ. Qual. -1982. Vol. 11, N 4. - P. 602-607.

291. Freijer J.I. Mineralization of hydrocarbon in soils under decreasing oxygen availability // J. Environ. Qual. 1996. - Vol. 25. - P. 296-304.

292. Eritsche W., Hofrichter M. Aerobic degradation by microorganisms //Biotechnology. Environmental Processes / Eds. H.-J. Rehm, G. Reed. -Wiley-VCI-I, Weinheim, 1999.-Vol. lib. P. 145-167.

293. Gallego J.L.R., Loredo J., Llamas J.F. et al. Bioremediation of diesel-contaminated soils: Evaluation of potential in situ techniques by study of bacterial degradation // Biodégradation. 2001. - Vol. 12.- P. 325-335.

294. Genovese M., Denaro R., Cappello S. et al. Bioremediation of benzene, toluene, ethylbenzene, xylenes-contaminated soil: a biopile pilot experiment //J. Appl. Microbiol.-2008:-Vol. 105,N5.-P. 1694-1702.

295. Gianfreda L., Rao M:A. Potential of extra cellular enzymes in remediation of polluted soils: a review // Enz. Microb. Technol: -2004. Vol.35.- P.339-354.

296. Gianfreda L., Mora M.L., Diez M.C. Restoration of polluted soils by means of microbial and enzymatic processes / R.C. Suelo Nutr. Veg. 2006. — Vol. 6, N1.-P. 20-40.

297. Goodfellow M., Orchard V.A. Antibiotic sensitivity of some nocardioform bacteria and its value as a criteria for taxonomy // J. Gen. Microbiol. — 1974. — Vol. 83, N2.-P. 375-387.

298. Goodfellow M., Minikin D.E. The'genera Nocardia and Rhodococcus II The Procaryotes. A Handbook on habitats, isolation and identification of bacteria /Eds. P. Starr et al. Berlin, Heidelberg, New York: Springer-Verlag, 1981. -Vol. 2.-P. 2016-2027.

299. Gramms G., Voigt K.D., Kirsche B. Oxidoreductase enzymes liberated by plant roots and their effects on soil humic material // Chemosphere. — 1998. -Vol. 38.- 1481-1506.

300. Habe H., Omori T. Genetics of polycyclic aromatic hydrocarbon metabolism in diverse aerobic bacteria // Biosci. Biotechnol. Biochem. — 2003. — Vol. 67, N2.-P. 225-243.

301. Haddock J.D. Aerobic degradation of aromatic hydrocarbons: enzyme structures and catalytic mechanisms // Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology / Ed. Kenneth N. Timmis. Springer Berlin Heidelberg, 2010. -P. 1057-1069.

302. Hamamura N., Olson S.H., Ward D.M., Inskeep W.P. Microbial population dynamics associated with crude-oil biodégradation in diverse soils // Appl. and Environ. Microbiol. 2006. - Vol. 72, N 9. - P. 6316-6324.

303. Hamzah A., Rabu A., Farzarul R. et al. Isolation and characterization of bacteria degrading Sumandak and South Angsi oils // Sains Malaysiana. — 2010. -Vol. 39, N2.-P. 161-168.

304. Harvey P.J., Xiang M., Palmer J.M. Extracellular enzymes in the rhizosphere // Proc. of Inter-Cost Workshop on Soil-microbe-root interactions: maximizing phytoremediation/bioremediation. — Grainau, Germany, 2002. — P. 23-25.

305. Hawle-Ambrosch E., Riepe W., Dornmayr-Pfaffenhuemer M. et al. Biodégradation of fuel oil hydrocarbons by a mixed bacterial consortium in sandy and loamy soils // Biotechnol. J. 2007. - Vol. 2. - P. 1564-1568.

306. Heath D.J., Lewis C.A., Rowland S.J. The use of high temperature gas chromatography to study the biodégradation of high molecular weight hydrocarbons // Org. Geochem. 1997. - Vol. 26, N 11-12. - P. 769-785.

307. Holland H.L. Khan S.H., Richards D., Riemlands E. Biotransformation of polycyclic aromatic compounds by fungi // Xenobiotica. 1986. — Vol. 16, N 8. -P. 733-741.

308. Hund K., Traunspurger W. Ecotox-evaluation strategy for soil bioremediation exemplified for a PAH-contaminated' site // Chemosphere. 1994. - Vol. 29. -P. 371-390.

309. Pollut: 2000. - Vol. 107. - P. 217-223.

310. Iwamoto T., Tani K., Nakamura K. et ai. Monitoring impact of in situ biostimulation treatment on groundwater bacterial community by DGGE // FEMS Microbiol: Ecol. 2000. - Vol. 32. - P. 129-141.

311. Jing W., Hongke X., Shaohui G. Isolation and characteristics of a microbial consortium for effectively degrading phenanthrene // Petroleum Sci. — 2007. — Vol. 4, N3.-P. 68-75.

312. Jorgensen K.S., Puustinen J., Suortti A.-M. Bioremediation of petroleum hydrocarbon-contaminated soil by composting in biopiles // Environ. Pollut. — 2000. Vol. 107. - P. 245-254.

313. Juteau P., Bisaillon J.-G., L'epine F. et al. Improving the biotreatment ofhydrocarbons-contaminated soils by addition of activated sludge taken from theiwastewater treatment facilities of an oil refinery // Biodégradation. — 2003. -Vol. 14.-P. 31-40.

314. Kandeler E., Pennerstorfer C., Bauer E., Braun R. Microbiological control of the biological decontamination of soils // Zeitschr. Pflanzenernähr, und Bodenk. 1994. - Bd. 157. - P. 345-350.

315. Kao C.M., Chen S.C., Liu J.K., Wang Y.S. Application of microbial enumeration technique evaluate the occurrence of natural bioremediation //Wat. Res.-2001.-Vol. 35, N8.-P. 1951-1960.

316. Kim S.-J., Choi D.H., Sim D.S., Oh Y.-S. Evaluation of bioremediation effectiveness on crude oil contaminated soil // Chemosphere. 2005. —Vol. 59. -P. 845-852.

317. Kim Y., Ingran L.O., Shanmugan K.T. Dihydrolipoamide dehydrogenase mutation alters the NADY sensitivity of pyruvate dehydrogenase complex of Escherichia coli K-12 // J. Bacteriol. 2008. - Vol. 190. - N 11. - P. 18313858.

318. Kucharski J., Jastrzebska E. Effect of heating oil on the activity of soil enzymes and the yield of yellow lupine // Plant Soil Environ. 2006. - Vol. 52, N5.-P. 220-226.

319. Kurola J. Microbial activities in boreal soils: Biodegradation of organic contaminants at low temperature and ammonia oxidation: AcademicI

320. Dissertation in Environmental Ecology. Helsinki, 2006. - 53 p.

321. Larkin M.J., De Mot R., Kulakov L.A., Nagy I. Applied aspects of Rhodococcus genetics // Antonie van Leeuwenhoek. J. 1998. - Vol. 74. — 133-153.

322. Larkin M.J., Kulakov L.A., Allen C.R. Biodegradation and Rhodococcus -masters of catabolic versatility // Curr. Opinion in Biotechnol. 2005. -Vol. 16.-P. 282-290./

323. Leahy J.G., Colwell R.R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment // Microbiol. Rev. 1990. - Vol. 54. - P. 305-315.

324. Lechevalier M.P. Lechevalier H. Chemical composition as a criterion in the classification of aerobic Actinomycetes / Intern. J. Syst. Bacteriol. 1970. -Vol. 20, N. 4.-P. 435-443.

325. Loibner A.P., Szolar O.H.J., Braun R., Hirmann D. Toxicity testing of 16 priority polycyclic aromatic hydrocarbons using Lumistox II Environ. Toxicol, and Chem. 2004. - Vol. 23, N 3. P. 557-564.

326. Locci R., Sharpies G.P Morphology // The Biology of the Actinomycetes /Eds. M. Goodfellow, M. Mordarski, S.T. Williams. New York: Academic Press, 1984.-P. 165-199.

327. Magor A., Warburton J., Trower'M., Griffin M. Comparative study of the ability of three Xanthobacter species to metabolize cycloalkanes // Appl. and Environ. Microbiol. 1986. - Vol. 52, N 4. - P. 665-671.

328. Maila M.P., Cloete T.E. The use of biological activities to monitor the removal of fuel contaminants — perspective for monitoring hydrocarbon contamination: a review // Intern. Biodeterioration & Biodégradation. 2005. — Vol. 55.-P. 1-8.

329. Margesin R., Schinner F. Bioremediation of diesel-oilcontaminated alpine soil at low temperatures // Appl. Microbiol, and Biotechnol. 1997. - Vol. 47. -P. 462-468.

330. Margesin'R., Zimmerbauer A., Schinner F. Soil lipase activity a useful indicator of oil biodégradation // Biotechnol.'Techniques. - 1999. — Vol. 13. — P. 859-863.

331. Margesin R., Zimmerbauer A., Schinner F. Monitoring of bioremediation by soil biological activities // Chemosphere. 2000. - Vol. 40, N 4. - P. 339-346.

332. Margesin R., Walder G., Schinner F. The impact of hydrocarbon remediationv,diesel oil and polycyclic aromatic hydrocarbons) on enzyme activities and microbial properties of soil // Acta Biotechnol. 2000. - Vol. 20. - P. 313-333.

333. Martinkovâ L., Uhnâkovâ B., Pâteka M. et al. Biodégradation potential of the genus Rhodococcus II Environ. Intern. — 2009. Vol. 35, N 1. - P. 162-177.

334. Martinho E., Abreu M.M., Pampulha M.E. et al. An experimental study of the diesel biodégradation effects on soil biogeophysical parameters // Water, Air and Soil Pollut. 2009. - Vol. 206, N 1-4. - P. 139-154.

335. Masai E., Sugiyama K., Iwashita N. et al. The bphDEF metacleavage pathwaygenes involved in biphenyl/polychlorinated biphenyl degradation are located oni.

336. Mercade E., Koberti Mï, Espyny M.I. et. al. New surfactant isolated from Pseudomonas 42A2 // J. Amer. Oil Chem. Soc. 1988. - Vol. 65, N 12. -P. 1915-1916.

337. Minai-Tehrani D., Shahriari M-H., Savaghebi-Firoozabadi G. et al. Effect of light crude oil-contaminated soil on growth and germination of Festuca arundinaceae II J. Appl. Sci. 2007. - Vol! 7, N 18. - P. 2623-2628.

338. Minnikin D.E., Alshamaony L., Goodfellow M. Differentiation of14

339. Mycobacterium, Nocardia and related taxa by thin-layer chromatographic analysis of whole-organism methanolysates // J. Gen. Microbiol. — 1975. -Vol. 88.-P. 200-204.

340. Mishra S., Jyot J., Kuhad R.C., Lai B. Evalution of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily-sludge-contaminated soil // Appl. and Environ. Microbiol.-2001.-Vol. 67, N4.-P. 1675-1681.

341. Moller J., Gaarn H., Steckel T. et al. Inhibitory effects on degradation of diesel oil in soil microcosms by a commercial bioaugmentation product//Bull. Environ. Contaminat. and Toxicol. 1995. - Vol. 54. - P. 913-918.

342. Murygina V.P., Markarova M.Y., Kalyuzhnyi S.V. Application of biopreparation Rhoder for remediation of oil polluted polar marshy wetlands in Komi Republic // Environ. Intern. 2005. - Vol. 31. - P. 163-166.

343. Ouchterlony O., Nilsson L.-A. Immunodiffusion and' immunoelectrophoresis // Handbook of experimental immunology. Vol. I. Immunochemistry / Ed. D.M. Weiz. Oxford: Alden Press, 1979. - P. 19-33:

344. Obuekwe C.O., Al-Muttawa E.M: Self-immobilized bacterial cultures with potential for application as ready-to-use seeds for petroleum bioremediation //Biotechnol. Lett. -2001. -N. 23. P. 1025-1032.

345. Ouyang W., Liu H., Murygina V. et al. Comparison of bio-augmentation and composting., for remediation of oily sludge: A field-scale study in China //Process Biochem. —2005. Vol. 40: - P. 3763-3768.

346. Park S-H., Ko Y-J:, Kim C-K. Toxic effects of catechol and 4-chlorobenzoate stresses on bacterial cells// J. Microbiol. 2001. - Vol. 39; N 3. - P. 206-212.

347. Pascual J.A, García C., Hernandez T. et al. Soil microbial activity as a biomarker of degradation and remediation processes // Soil Biol. Biochem. -2000.-Vol. 32.-P. 1877-1883.

348. Pepper I.L., Gentry T.J., Newby D.T. et. al The role of cell bioaugmentation and gene bioaugmentation in the remediation of co-contaminated soils // Environ. Health Perspect. Suppl. 2002. - Vol. 110, N 6. - P. 943-946.

349. Phillips T.M., Liu D., Seech A.G., Lee H., Trevors J.T. Monitoring bioremediation in creosote-contaminated soils using chemical analysis and toxicity tests // J. Industrial Microbiol, and Biotechnol. 2000. - Vol. 24. -P. 132-139.

350. Philp J.C., Kuyukina M.S., Ivshina L.B. et al. Alkanotrophic Rhodococcus ruber as a biosurfactant producer // Appl. Microbiol. Biotechnol. — 2002. — Vol. 59.-P. 318-324.

351. Pignatello J., Xing B. Mechanisms of slow sorption of organic chemicals to natural particles // Environ. Sci. and Technol. 1996. - Vol. 30. - P. 1-11.

352. Pineda-Flores G., Boll-Argiiello G., Lira-Galeana C., Mesta-Howard A.M. A microbial consortium isolated from a crude oil sample that uses asphaltenes as a carbon and energy source // Biodegrádation. 2004. - Vol. 15. - P. 145-151.

353. Plaza G, Ulfig K, Hazen T.C, Brigmon R.L. Use of molecular techniques in bioremediation // Acta Microbiol. Pol. 2001-. - Vol. 50, N 3-4. - P. 205-218.

354. Pritchard P.H. Use of inoculation in bioremediation // Curr. Opinion in Biotechnol. 1992. - Vol. 3. - P. 232-243.

355. Quatrini P., Scaglione G., De Pasquale C. et al. Isolation of Gram-positive n-alkane degraders from a hydrocarbon-contaminated Mediterranean shoreline // J. Appl. Microbiol. 2008. - Vol. 104, N 1. - P. 251-259.

356. Radwan S.S., Sorkoh N.A., El-Nemr I.M., El-Desouky A.F. A feasibility study on seeding as a bioremediation practice for the oil Kuwaiti desert // J. Appl. Microbiol. 1997. - Vol. 83. - P. 353-358.

357. Radwan S. Microbiology of oil-contaminatéd desert soils and coastal areas in the Arabian Gulf Region // Soil Biology. Microbiology of extreme soils / Eds.

358. P. Dion, C.S. Nautiyai. Berlin, Heidelberg: Springer, 2008. - Vol. 13. -P. 275-298.

359. Rainey F.A., Klatte S., Kroppenstedt R.M., Stackebrandt E. Dietzia, a new genus including Dietzia maris comb, nov., formerly Rhodococcus maris II Intern. J. Syst. Bacteriol. 1995. - Vol. 45, N 1. - P. 32-36.

360. Rajaram P. Bioremediation of oil sludge-contaminated soil // Environ. Intern. -2001.-N26.-P. 409-411.

361. Ramsay M.A., Swannell R.P.J., Shipton W.A. et al. Hill effect of bioremediation on the microbial community in oiled mangrove sediments //Marine Pollut. Bull. 2000. - Vol. 41/-N 7. - P. 413-419.

362. Rao M., Sannino F., Nocerino G. et al. Effect of air-drying treatment on enzymatic activities of soils affected by anthropogenic activities // Biol. Fert. Soils. 2003. - Vol. 38. - P. 327-332.

363. Romantschuk M., Sarand I., Petanen T. et al. Means to improve the effect of in situ bioremediation of contaminated soil: an overview of novel approaches // Environ. Pollut. 2000. - Vol. 107. - P. 179-185.

364. Rosenberg E., Gutnick D.L. The hydrocarbon-oxidising bacteria // The Prokaryotes. A Handbook on Habitats, Isolation, and Identification of Bacteria / Eds. M.P. Starr, H. Stolp, H.G. Truper et al. Heidelberg: Springer-Verlag, 1986.-P. 903-912.

365. Rosenberg E., Legman R., Kushmaro A. et al. Oil bioremediation using insoluble nitrogen source // J. Biotechnol. 1996. - Vol. 51, N 3. - P. 273-278.

366. Roy R., Greer Ch.W. Hexadecane mineralization and denitrification in two diesel fuel-contaminated soils // FEMS Microbiol. Ecol. 2000: - Vol. 32. -P. 17-23.

367. Rothschild L.J., Mancinelli R.L. Life in extreme environments // Nature. — Vol. 409.-P. 1092-1101.

368. Rusansky S., Avigal R., Michaeli S., Gutnick D. Involvement of a plasmid in growth and dispersion of crude oil by Acinetobacter calcoaceticus RA57 //Appl. and Environ. Microbiol. 1987. - Vol. 53, N 8. - P. 1918-1923.

369. Sabate J., Grifoll M., Vinas M., Solanas A.M. Isolation and characterization of a 2-methylphenantrene utilizing bacterium: identification of ring cleavage metabolites // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1999. - Vol. 52. - P. 704-712.

370. Sayler G.S., Layton A.C. Environmental application of nucleic acid hybridization // Annu. Rev. Microbiol. 1990. - Vol. 44. - P. 625-648.

371. Schaebber T.L., Cantwell S.G., Brown J.L. et al. Microbial growth on hydrocarbons: terminal branching inhibits biodégradation // Appl. and Environ. Microbiol. 1979. - Vol. 38, N 4. - P. 742-746.

372. Schmidt S.K., Colores G.M., Hess T.F., Radehaus P.M. A simple method for quantifying activity and survival of microorganisms involved in bioremediation processes // Appl. Biochem. Biotechnol. 1995. - Vol. 54, N 1-3. - P. 259-270.

373. Schwartz E., Scow K.M. Repeated inoculation as a strategy for the remediation of low concentrations of phenanthrene in soil // Biodégradation. — 2001.-Vol. 12.-P. 201-207.

374. Shakir H., Safwat H., Weaver R.W. Earworm survival in oil contaminated soil // Plant and Soil. 2002. - Vol. 240, N 1. - P. 127-132.

375. Sharma S.L., Pant A. Biodégradation and conversion of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus sp. // Biodégradation: -2000. Vol. 11.- P.289-294.

376. Shen G., Cao L., Lu Y., Hong j: Influence of phenanthrene on cadmium toxicity to soil enzymes and? microbial growth // ESPR — Environ Sci. & Pollut. Res. 2005. - Vol. 12, N 5. - P. 259-263.

377. Siciliano S.D., Germida J.J., Headley J.V. Evaluation of,prairie grass species as bioindicators of halogenated aromatics in soil //Environ. Toxicol, and Chèm. 1997. - Vol. 16. - P. 521-527.

378. Siciliano S.D., Germida*, J.J; Mechanism of phytoremediation: biochemical. ' and'ecological interactions between plants and bacteria // Environ. Rev. — 1998.-Vol. 6.-P. 65-79. .

379. Sikkema J., de Bont J .A.M., Pool man B. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons // Microbiol: Rev. 1995; - Vol. 59. - P. 201-222.408; Singh A., Ward O.P. Biodégradation and bioremediation (V.2). — Berlin,.

380. Heidelberg: Springer-Verlag, 2004. -309 p. 409: Skujins-J:.History of abiotic soil enzyme research // Soil-Enzymes / Ed. Burns R.G. San Diego: Academic Press Inc., 1978. - P. 1-49.

381. Smith M.R. The biodégradation of aromatic hydrocarbons by bacteria //Biodégradation; 1990: - Voh 1. - P: 191-206;

382. Soil pollutioniand soiFprotection / M:G; Keizer, R. de Goede. — Wageningen:k t

383. Wageningen University, 2007. 320. p.

384. Soil quality / Th.W. Kuyper, W.H. van Riemsdijk, E.J.M. Temminghoff. — Wageningen: Wageningen University, 2008. — 320 p.

385. Souta L, Sada M. Isolation of acid- and aluminium-tolerant bacteria and theiralleviating acidification. // Abstr. of ISEB 97-meeting bioremediation. 11.ipzig, Germany, 1997.-P: 135.

386. Stapleton R.D., Savage D.C., Sayler G.S., Stacey G. Biodégradation of aromatic hydrocarbons in an extremely acidic environment // Appl. and Environ. Microbiol: 1998.-Vol. 64, N. 11. - P. 4180-4184.

387. Steffen K.T., Hatakka A., Hofrichter M. Removal and mineralization of polycyclic aromatic hydrocarbons by litter-decomposing basidiomycetous fungi // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. - Vol. 60, N 1-2. - P. 212-217.u t

388. Steinberg S.M., Poziomek E.J., Englemann W.H., Rogers K.R. A review of environmental application of bioluminescent measurement // Chemosphere. -1995. Vol. 30, N 11. - P. 2155-2197.

389. Stroud J.L., Paton G.I. Semple K.T. Microbe-aliphatic hydrocarbon interactions in soil: implications for biodégradation and bioremediation //J. Appl. Microbiol. 2007. - Vol. 102, N 5. - P. 1239-1253.

390. Trindade P:V.O., Sobral E.G., Rizzo A.C.L. et al. Evalution of the biostimulation and bioaugmentation techniques in the bioremediation process of petroleum hydrocarbons contaminated soil // http: ipec.utulsa.edu/ lpec/Conf 2002.

391. Vasudevan N., Rajaram P. Bioremediation of oil sludge-contaminated soil // Environ. Intern. 2001. - N 26. - P. 409-411.

392. Verstaeten L.M.J. Interaction between urease activity and soil characteristics // Agrochimica. 1978. - Vol. 22, N5/6. - P. 455-464.

393. Vinas M., Grifoll M., Sabate J., Solanas A.M. Biodégradation of a crude oilby three microbial consortia of different origins and metabolic capabilitiesi

394. J. Industrial Microbiol, and Biotechnol. 2002. - Vol. 28. - P. 252-260.

395. Vitale AA, Viale AA. A decalin-consuming bacterial community // Rev. Argent Microbiol. 1994. - Vol. 26, N 1. - P. 28-35.

396. Vogel T.M. Bioaugmentation as a soil bioremediation approach // Curr. Opinion in Biotechnol. 1996. - Vol. 7. - P. 311-316.

397. Volkering F., Breure A.M., Rulkens W.H. Microbiological aspects of surfactant use for biological soil remediation // Biodégradation. 1998. — Vol. 8.-P. 401-417.

398. Wackett L.P. Pseudomonas putida — a versatile biocatalyst // Nature Biotech. -2003.-Vol. 21.-P. 136-138.

399. Wallace W.H., Sayler G.S. Catabolic plasmids in the environment // Encyclopedia of Microbiology. 1992. - Vol. 1. - P.417-430.

400. Wang X., Bartha R. Effects of bioremediation on residues, activity and toxicity in soil contaminated by fuel spills // Soil Biol. Biochem. 1990. -Vol. 22.-P. 501-505.

401. Wang W., Freemark K. The use of .plants for environmental monitoring and assessment // Ecotoxicol. and Environ. Safety. 1995. — Vol. 30. - P. 289-301.

402. Wenderoth D.F, Rosenbrock P, Abraham W.R et al. Bacterial community dynamics during biostimulation and bioaugmentation experiments aiming at chlorobenzene degradation in groundwater // Microbial Ecol. 2003. — N 6. — P. 137-148.

403. Whyte L.G., Hawari J., Zhou E-., et al. Biodégradation of variable-chain-length alkanes at low temperatures by a psychrotrophic Rhodococcus sp. // Appl. and Environ. Microbiol. 1998. - Vol. 64, N 7. - P. 2578-2584.

404. Wyszkowska J., Kucharski J. Biochemical properties of soil contaminated by petroleum // Pol. J. Environ. Stud. 2000. - Vol. 9, N 6. - P. 479-485.

405. Wyszkowska J., Wyszkowski M. Activity of soil dehydrogenases, urease, and' acid and alkaline phosphatases in soil polluted with petroleum // J. Toxicol. Environ. Health. Part A. 2010. - Vol. 73, ^ 17. - P. 1202-1210.

406. Xu R., Obbard J. Effect of nutrient amendments on indigenous hydrocarbon biodégradation in oil-contaminated beach sediments // J. Environ. Qual. — 2003. -Vol. 32.-P. 1234-1243.

407. Yemashova N.A, Murygina V.P., Zhukov D.V. et al. Biodeterioration of crude oil and oil derived products: a review // Rev. Environ. Sci. Biotechnol. — 2007. -Vol. 6, N 4. P. 1569-1705.

408. Zhang Y., Miller R.M. Effect of rliamnolipid (biosurfactant) on solubilization and biodégradation of n-alkanes // Appl. and Environ. Microbiol. 1995. -Vol. 61.-P. 2247-2251.

Информация о работе

Плешакова, Екатерина Владимировна
доктора биологических наук
Саратов, 2010
ВАК 03.02.08

Диссертация

Эколого-функциональные аспекты микробной ремедиации нефтезагрязнённых почв - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы