Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами

Нечаева, Ирина Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами
ВАК РФ 03.00.23, Биотехнология

Автореферат диссертации по теме "Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами"

на правах рукописи

НЕЧАЕВА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА

БИОДЕГРАДАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ ПСИХРОТРОФНЫМИ МИКРООРГАНИЗМАМИ-ДЕСТРУКТОРАМИ

03.00.23 - биотехнология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

I / „ /

Пущино - 2009

003459382

Работа выполнена в лаборатории биологии плазмид Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН, г. Пущино

Научный руководитель:

кандидат биологических наук, А.Е. Филонов

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, Н.Д. Ананьева кандидат биологических наук, В.А. Чугунов

Ведущая организация:

Московский государственный университет, биологический факультет, г. Москва

Защита диссертации состоится «

мин. на

заседании Диссертационного совета Д 002.121.01 в Институте биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН по адресу: 142290, Московская область, г. Пущино, Проспект Науки, 5.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН.

Автореферат размещён на сайте http://www.ibpm.ru

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Среди многочисленных вредных веществ антропогенного происхождения, попадающих в окружающую среду, нефтепродуктам принадлежит одно из первых мест. Работа автотранспорта и предприятий нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности, газообразные выбросы и сточные воды промышленных предприятий, многочисленные разливы нефти и нефтепродуктов в результате аварий трубопроводов и нефтеналивных судов (танкеров), аварий и пожаров на нефтехранилищах и нефтеперегонных заводах приводят к загрязнению воздуха, воды и почвы значительными количествами сырой нефти и продуктов её переработки и создают серьёзную угрозу экологии регионов России (Ревелль П. и Ревелль Ч.,

Процесс естественного восстановления загрязненной окружающей среды является очень длительным. Ауторемедиация нефтезагрязненных почв при уровне загрязнения 5 г/кг длится от 2 до 30 лет и более. В северных регионах скорость этих процессов еще ниже. В России эта экологическая проблема имеет особое значение вследствие масштабов загрязнения, при которых экскавация почв и их восстановление ex situ (вне места загрязнения) невозможны. Основную роль в ремедиации in situ (на месте загрязнения) играет биологический фактор - активность микроорганизмов, участвующих в процессах утилизации и трансформации углеводородов нефти. Препятствиями для эффективной очистки окружающей среды являются низкая температура, повышенная концентрация соли, низкое содержание питательных веществ, отсутствие или низкая деградативная активность природных микробных популяций. Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется изучению процессов биоремедиации в регионах с холодным климатом.

Однако большинство проводимых исследований посвящено влиянию нефтезагрязнения на изменение состава природных популяций микроорганизмов различных экологических ниш (Prince et al., 1997; Delille et al., 2002; Margesin et al., 2003; 2007). Работ, посвященных селекции микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при низких положительных температурах, крайне мало. В связи с этим особенно актуально исследование психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.

1995).

Цель ii задачи исследования

Целью данной работы являлось создание ассоциации активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти как основы биопрепарата для биоремедиации нефтезагрязнённых почв и определение её эффективности в лабораторных и полевых условиях. Для выполнения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти.

2. Составление микробных ассоциаций на основании комбинирования физиологических и метаболических характеристик, а также путём селекции в условиях периодического культивирования с нефтью в качестве субстрата.

3. Определение эффективности деградации нефти ассоциациями в жидкой среде и её адсорбции растительным сорбентом.

4. Разработка метода мониторинга интродуцированных в почву штаммов-деструкторов, с использованием культурально-морфологических признаков, маркеров антибиотикорезистентности и метода геномных фингерпринтов.

5. Исследование процессов деструкции нефти и численности микробных популяций в почве в лабораторных и полевых условиях.

6. Разработка опытного образца биопрепарата и проведение полевых испытаний по очистке почв от нефтяных загрязнений.

Научная новизна

С помощью двух различных подходов - эмпирического на основании физиологических и метаболических характеристик штаммов и селекции микроорганизмов-деструкторов при периодическом культивировании с нефтью при пониженной температуре - составлены две микробные ассоциации, состоящие из четырёх штаммов, причём три из них являются одинаковыми для каждой ассоциации: Rhodococcus sp. Х5, Rhodococcus sp. S67, Pseudomonas sp. 142NF(pNF142). При периодическом культивировании в минеральной среде с добавлением нефти в качестве источника углерода и энергии при 4-6°С показана более высокая степень деструкции нефти отселектированной ассоциацией по сравнению с эмпирически составленной ассоциацией.

Разработан метод мониторинга интродуцированных в почву штаммов-деструкторов родов Rhodococcus и Pseudomonas. На основании культурально-морфологических признаков, маркеров антибиотикорезистентности и с использованием метода геномных фингерпринтов впервые удалось проследить за судьбой интродуцированных микроорганизмов-деструкторов нефти в

открытой окружающей ереле и показать их выживаемость и конкурентоспособность.

При проведении полевого эксперимента температура почвы изменялась в диапазоне от 0°С до 23°С, по несмотря на это численность интродуцированной микробной ассоциации оставалась на достаточно высоком уровне. Таким образом, интродукция пенхротрофных микроорганизмов (с диапазоном роста 2-32°С) продемонстрировала их выживаемость в почве в зимний период времени, кроме того, процесс деградации нефти происходил даже при низкой температуре.

Научно-практическая значимость работы

На основании скрининга коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН, способных к деградации различных углеводородов, отобраны и охарактеризованы активные психротрофные штаммы-деструкторы нефти и нефтепродуктов и на их основе составлена ассоциация как основа биопрепарата.

Получен патент РФ №2312891 «Ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде». Подана заявка №2007125403 на изобретение «Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения».

Эффективность опытного образца биопрепарата доказана в полевых испытаниях по очистке грунта от загрязнений смесью нефтепродуктов в Тульской области на протяжении осенне-зимнего периода.

Апробация работы

Основные положения работы были представлены на 9-10-й школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 20052006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), 13th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Madrid, 2005), International Conference on Alpine and Polar Microbiology (Innsbruck, 2006), International Conference on Environmental Biotechnology (Leipzig, 2006), 4th Moscow International Congress «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development» (Moscow, 2007), 30th Arctic and Marine Oil Spill Program (AMOP) Technical Seminar (Edmonton, 2007), 10th International Conference on Soil-Water Systems (Milan, 2008), III Международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 работы, в том числе 6 статей (из них 4 статьи по списку ВАК), патент РФ №2312891, заявка на получение патента РФ на изобретение №2007125403 и 16 тезисов.

Crpyicrypa и объем диссертации

Диссертация состоит из разделов «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты», «Обсуждение», «Выводы», «Список литературы» и «Приложение». Работа изложена на 174 страницах машинописного текста, включает 16 таблиц и 33 рисунка. Библиография насчитывает 236 наименований, из них 71 отечественных и 165 зарубежных работ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Бактериальные штаммы. В работе использовали 165 штаммов бактерий из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ РАН им. Г. К. Скрябина г. Пущино, выделенных из почвенных образцов, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, с территории Московской, Тульской, Тверской, Кировской, Нижегородской и Тюменской областей.

Среды. В качестве полноценной среды использовали среду Лурия-Бертани (ЛБ, Carhart, Hegeman, 1975), Кинга Б (КБ, King et al„ 1954), триптозно-соевый агар (ТСА, «Difco», США), в качестве минимальной - среду Эванса (Evans, 1970) и среду Э-1 (Ylihonko et а!., 1994).

Сорбент. В качестве сорбента использовали биодеградабельный сорбент на основе пушицы (Eriophorwn vaginatum), разработанный в Университете Хельсинки.

Культивирование штаммов проводили в колбах Эрленмейера со 100 мл минимальной среды Эванса с добавлением нефти до конечной концентрации 2% весовых (по объему). Инокулирование колб проводили суспензией микроорганизмов (посевная доза 1-5х107кл/мл). После засева колбы помещали на круговую качалку (120 об/мин) и выращивали микроорганизмы в течение 710 сут при 24°С и в течение 10, 20 или 30 сут при 4-6°С.

Эмульгирующую активность определяли визуально согласно методике (Francy et al., 1991) по четырёхбалльной шкале и по изменению оптической плотности супернатанта культуры, выращенной на среде с гексадеканом, согласно методике (Cirigliano et al., 1984) в нашей модификации.

Индекс эмульгирования определяли по методике, описанной в работе (Cooper and Goldenberg, 1987).

Определение степени деструкции нефти. Деградацию нефти исследуемыми штаммами оценивали по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде, определяемому весовым методом (гравиметрия) (Другов и Родин, 2007).

Флуориметрический метод измерения массовой доли нефтепродуктов в почве. Выполнение измерений массовой доли остаточных нефтепродуктов в пробах почв осуществляли на анализаторе жидкости «Флюорат-02» по методике ПНД Ф 16.1.21-98.

Определение степени адсорбции нефти. Количество адсорбированной неф in биодеградабельпым сорбентом на основе пушицы оценивали по суммарному показателю убыли нефти в жидкой среде после удаления сорбента с поверхности минеральной среды.

Выделение тотальной ДНК микроорганизмов проводили согласно методике, описанной в (Wise et al., 2006).

Полимеразную цепную реакцию (Г1ЦР) осуществляли в амплификаторе GeneAmp PCR System 2400 ("Perkin-Elmer", США) согласно протоколу (Dombek et al., 2000). Для амплификации гена 16S рДНК использовали праймеры 63f (5'-CAG GCC ТАА САС ATG САА GTC-3') и 1387г (5'-GGG CGG WGT GTA САА GGC-3') (Marchesi et al., 1998). Геномный фингерпринт (rep-PCR) проводили с использованием праймера BOXA1R (5'-CTACGGCAAGGCGACGCTGACG-3"). ПЦР - реакцию для RAPD анализа проводили в ДНК-амплификаторе GeneAmp PCR System 2400 («Perkin-Elmer», США) с использованием праймеров ОА20 (GTTGCGATCC), OG06 (GTGCCTAACC), OS09 (TCCTGGTCCC) и OS 14 (AAAGGGGTCC) по программе (Tiago et al., 2004).

Реетрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК (ARDRA). В работе использовали буферный раствор Y+ и эндонуклеазы рестрикции Hpall и Rsal. Для гидролиза 100 нг продукта амплификации гена 16S рРНК в реакционную смесь вносили по 0,5 ед. активности каждого фермента.

Для приготовления модельных почвенных систем использовали лугово-аллювиальную почву, взятую у р. Ока вблизи г. Пущино Московской области. Перед использованием почву просеивали через сито с диаметром отверстий 2,0 мм диаметра. Затем навеску почвы массой 1 кг тщательно перемешивали с нефтью (20 г). Приготовленную таким образом почву с нефтью помещали в пластиковые горшки (толщина слоя почвы 10 см). Модельные почвенные системы инкубировали при температуре 18-25°С.

Внесение ннокулята в почву. Бактерии выращивали в жидкой среде ЛБ до конца экспоненциальной фазы роста (1хЮ9 кл/мл среды). Затем, используя стандарт мутности, суспензию бактерий разводили фосфатным буфером до концентрации 1-5х108 кл/мл. Количество вносимой бактериальной суспензии рассчитывали так, чтобы конечная концентрация составляла 6х105 микроорганизмов на 1 г сухой почвы.

В качестве биогенных источников азота, фосфора и калия использовали минеральное удобрение «Нитроаммофоска» (ООО «Фаско+», Россия), которое вносили в количестве 3 г на 1 кг почвы.

Отбор проб почвы. Для определения общей численности микроорганизмов и содержания нефти отбирали усредненные пробы (1 г и 5 г, соответственно) из 3-4 разных участков почвы. Пробы весом 1 г суспендировали в 9 мл фосфатного буфера и перемешивали на миксере "Paramix 2" (Германия) в течении 1 минуты при комнатной температуре и после соответствующих стандартных разведений высевали на соответствующие агаризованные среды.

Мониторинг штаммов в почве осуществляли но культурально-морфологическим признакам, маркерам антибиотикорезистентности и флюоресценции под ультрафиолетом на агаризованной среде КБ.

Условия полевого эксперимента. Эксперимент в открытой окружающей среде проводили на территории очистных сооружений г. Пущино. Экспериментальная площадка была разделена на четыре участка каждый размером 1м х 1м. Толщина экспериментального слоя составляла 1015 см. Перед началом эксперимента почву перекапывали и тщательно перемешивали с внесённым песком (20 кг на один участок). Нефть вносили в количестве 3 л на участок, т.е. 3 л на 1м2.

Ферментации для наращивания биомассы микроорганизмов Pseudomonas sp. 142NF(pNF142), Pseudomonas putida BS3701(pBSl 141, pBS1142), Rhodococcus sp. S67 и Rhodococcus sp. X5 проводили в ферментёре АНКУМ-2М объёмом 10 л с коэффициентом заполнения 0,6-0,7. Длительность ферментации для псевдомонад и родококков составляла от 14 до 23 часов и от 21 до 25 часов, соответственно.

Световую микроскопию чистых культур штаммов-деструкторов при росте на минеральной среде с нефтью проводили с помощью светового микроскопа «Axio Imager Al» (Zeiss, Германия).

Электронно-мнкроскопическне методы. Для электронно-микроскопических исследований клетки предварительно фиксировали 2% глутаровым альдегидом в какодилатном буфере (pH 7,2) в течение 1 ч при 4°С и затем дополнительно фиксировали в 2% 0s04 в какодилатном буфере (pH 7,2) в течение 12 ч при 4°С. Для контрастирования полисахаридных компонентов клеток использовали методику фиксации с рутением красным по Лафту (Luft, 1966). После обезвоживания материал заливали в Эпон-812. Срезы получали на ультрамикротоме LKB-11I и просматривали в электронном микроскопе JEM-100B и контрастировали цитратом свинца по Рейнольдсу (Reynolds, 1963).

Статистическую обработка результатов осуществляли с помощью встроенного статистического пакета Excel (MS Office 2007).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

1. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти.

В процессе работы были изучены 165 штаммов-деструкторов углеводородов нефти из коллекции лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г. К. Скрябина РАН на способность утилизировать дизельное топливо или нефть в качестве единственного источника углерода и энергии при 24 и 4-6°С. Выбор наиболее активных штаммов-деструкторов был проведён по следующим критериям: способность к росту на дизельном топливе и/или нефти как при нормальных (24-32°С), так и при пониженных температурах (2-6°С), в присутствии 3-5% NaCI, продукция биоэмульгаторов при росте на гидрофобных субстратах. На основании полученных результатов были отобраны 9 психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов

нефти - Rhodococcns sp. S25. Rhodococcus sp. S26. Rhodococcus sp. S67, Rhodococcus sp. X5, Rhodococcus sp. X25, Rhodococcus sp. Ars38, hficrobacrerium sp. Ars25. Pseudomonas sp. 142NI-(pNI" 142), Pseudomonas pulida BS3701(pBSl 141, pBS1142). Микроорганизмы-деструкторы

различались по способности к росту на дизельном топливе, нефти, мазуте, гексадекане, бензоате, бензоле, толуоле или нафталине в качестве единственного источника углерода и энергии в диапазоне температур от 2 до 32°С. Все штаммы способны к росту в жидкой минеральной среде в присутствии 3% NaCl, два из них - при 5% и только один штамм (Rhodococcus sp. Х5) - при 7 и 10%. Все микроорганизмы способны к росту в диапазоне pH 5-8 и широком температурном диапазоне - от 2 до 32°С. Известно, что продукция биоэмульгаторов является важным свойством бактерий, обеспечивающим доступность трудноразлагаемых малорастворимых углеводородов (Desai and Banat, 1997). Исследованные бактерии обладали высокой эмульгирующей активностью. Ранее показано, что максимальная эмульгирующая способность микроорганизмов проявлялась через 12-30 часов культивирования (Maneerat and Dikit, 2007; Lee et al., 2006). Поэтому, в нашей работе для оценки эмульгирующей активности штаммов определяли индекс эмульгирования при росте на гидрофобном субстрате (гексадекане) через 24 часа. Наибольшие значения индекса эмульгирования были получены для родококков и составляли 75 и 77,5% для штаммов Rhodococcus sp. -Х5 и Rhodococcus sp. S67, соответственно. На основании анализа полученных результатов по оптической плотности супернатанта большинство микроорганизмов-деструкторов было отнесено к экзо-типу, т.е. продуцируемые ими биоэмульгаторы выделяются в культуральную жидкость и поэтому оптическая плотность культуралыюй жидкости после центрифугирования в присутствии гексадекана была высокой (более 0,1). Для оценки способности микроорганизмов продуцировать внеклеточные биоэмульгаторы также использовали метод определения поверхностного натяжения. Все представители рода Rhodococcus и Microbaclerium sp. Ars25 показали заметное снижение поверхностного натяжения в бесклеточном супернатанте. Присутствие клеток в культуралыюй жидкости (КЖ) усиливало эффект снижения поверхностного натяжения в разной степени в зависимости от конкретного штамма. Что же касается микроорганизмов рода Pseudomonas, то для них основной эффект снижения поверхностного натяжения был связан с поверхностно-активными веществами клеточной стенки, поскольку в бесклеточном супернатанте снижение поверхностного натяжения было незначительным.

С помощью световой и электронной микроскопии изучали поведение штаммов, принадлежащих к разным родам и имеющих отличное друг от друга строение клеточной стенки, при росте в среде с сырой нефтью. По характеру взаимодействия с нефтью грамотрицательные клетки псевдомонад и грамположительные клетки родококков существенно различаются. Светооптические исследования этих культур после трёх дней культивирования в среде с нефтью показали, что клетки родококков находятся внутри капель нефти, а псевдомонады локализованы на их поверхности (Рис. 1). Показано

(Звягинцева с соавт.. 2001). что при культивировании Ююс/исоссих егуМгороПя в течение недели происходит адгезия клеток на поверхности капли нефтяного масла и колонизация внутреннего объема капли. Наши данные также демонстрируют, что клетки КИос1ососсш Бр. Б67 и Х5, обладающие

локализуются внутри нефтяных калель.

А Б

Рис. 1. Чистые культуры микроорганизмов в процессе деструкции нефти (световаямикроскопия). А - Р. pulida BS3701(pBSl 141, pBSl 142), Б- Rhodococcus sp. S67.

MK - микробные клетки, НК— нефтяная капля.

Электронно-микроскопические исследования показали, что клетки псевдомонад и родококков при росте на глюкозе и нефти имеют значительные различия. При культивировании на нефти это выражается в образовании на поверхности клеток и во внеклеточном пространстве значительного количества фибриллярных компонентов. Совершенно очевидно, что экзоцеллюлярные вещества имеют отношение к эмульгаторам, которые образуются у клеток при росте на таких гидрофобных субстратах, как гексадекан, дизельное топливо, нефть (Desai et al., 1993). Электронно-цитохимическая реакция на полисахариды (взаимодействие с рутением красным) показала, что основой этих веществ являются полисахариды (Рис.

Рис. 2. Электронная микроскопия. Цитохимическая реакция на полисахариды с рутением красным. А - Rhodococcus sp. S67 рост на глюкозе, Б-Р. pulida BS370I(pBSl 141, pBSl 142) рост на глюкозе, В - Rhodococcus sp. S67 рост на нефти, Г - Р. putida BS370I(pBSl 141, pBS1142) рост на нефти. Стрелкой показано формирование экзоцеллюлярной пленки (ЭЦП). ЦВМ цитоппазматическая мембрана, ВМ -внешняя мембрана, КС - клеточная стенка, Н - нуклеоид.

Причём полисахариды как основа биоэмульгаторов были образованы не только штаммом Rhodococcus sp. S67, но и Pseudomonas putida BS3701.

Накопление полисахарида внугри клеток псевдомонады было выражено в большей степени по сравнению с клетками родококка. Это може i быть связано с тем. что штамм BS3701 образует биоэмульгаторы эндо- и экзо-типов, а для штамма S67 характерно образование только экзоэмульгатора. В работе Вайта с соавт. (Whyte et al., 1999) продемонстрировано, что штамм Rhodococcus sp. Q15 при росте на гексадекане или дизельном топливе продуцировал биоэмульгатор(ы). Авторы выделяют три фактора, обеспечивающих процессы поступления и дальнейшей трансформации углеводородов в клетках родококков. Это продукция внеклеточных биоэмульгаторов, увеличение гидрофобности клеточной поверхности и появление внутриклеточных включений. Гидрофобные свойства бактериальных клеток и уменьшение межфазного натяжения авторы связывают с синтезом экзополисахарида,

который в виде слизистых капсул окружает клетки родококков. В процессе деструкции нефти ассоциацией Pseudomonas — Rhodococcus, продуцирующей эмульгаторы в культуральную жидкость, также образуются экзоцеллюлярные плёнки (ЭЦП) микроскопия. (Рис- 3)- Однако в данном случае Цитохимическая реакция на полисахариды. ЭЦП ЯВЛЯЮТСЯ более

Рост на нефти ассоциации, состоящей из структурированными и образуют штаммов Rhodococcus sp. S67 и Р. putida капсулы вокруг микробных клеток. BS3701(pBSl 141, pBSl 142). Стрелкой показано Таким Qg Mj включенИе в формирование ъггп г irr и

Электронная

ЭЦП.

цим

цитопчазматическая мембрана, ВМ - внешняя

состав микробной ассоциации

мембрана, КС - клеточная стенка. именно представителем родов

Pseudomonas и Rodococcus за счёт различных биохимических механизмов потребления гидрофобных субстратов может повысить эффективность деградации нефти и нефтепродуктов. После определения основных физиолого-морфологических характеристик штаммов, была проведена идентификация наиболее активных микроорганизмов-нефтедеструкторов. Семь грамположительных штаммов-деструкторов нефти Х5, Х25, S25, S26, S67 и Ars38 на основании определения частичной нуклеотидной последовательности генов 16S рРНК были идентифицированы как представители рода Rhodococcus, а Ars25 - как Microbacterium.

Деградацию нефти исследованными штаммами оценивали по суммарному показателю её убыли в жидкой среде, определяемому весовым методом (гравиметрия).

Исследование степени деструкции нефти в жидкой минеральной среде показало, что жидкой индивидуальные штаммы способны разлагать от 15 до 26% нефти при 24°С в течение 7-10 сут и от 28 до 47% при 4-6°С в течение 10-20 сут. У 8 из 9 отобранных микроорганизмов степень

деструкции нефти при 4-6°С оказалась выше, чем при 24°С (Рис. 4). В настоящее время известно лишь несколько работ, посвященных выделению и изучению психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов,

способных к эффективной деградации нефти и нефтепродуктов при пониженной температуре.

Ранее Белоусовой с соавт. (Белоусова и др., 2002) было показано, что степень деструкции нефти отдельными штаммами микроорганизмов при 4-6°С может быть выше, чем при 24°С. В работе (Whyte et al., 1997) изучали способность двух штаммов псевдомонад к деградации С5-С12 алканов, толуола и нафталина при 5 и 25°С. Было установлено, что только один штамм способен утилизировать октан и толуол лучше при 5°С, чем при 25°С. Таким образом, отобранные нами микроорганизмы, перспективные для биоремедиации в условиях холодного климата, были использованы в дальнейшей работе при составлении ассоциаций штаммов нефтедеструкторов.

В табл. 1 представлены данные по фракционированию нефти на микроколонках с оксидом алюминия после биотрансформации бактериями с различной деструктивной способностью. Для большинства штаммов микроорганизмов отмечена способность к деструкции в первую очередь лёгких фракций нефти и твёрдых парафинов. Естественно, что при этом изменялось относительное содержание в остаточной нефти фракций полиароматических углеводородов, бензольных и спирто-бензольных смол. Так, штаммы Rhodococcus sp. Х25, Rhodococcus sp. X5, Rhodococcus sp. S25 и Rhodococciis sp. S26 наиболее эффективны в качестве деструкторов парафино-нафтеновых и ароматических углеводородов. Штаммы Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) и Rhodococcus sp. S25 наряду с парафино-нафтеновыми, моно-и полиароматическими углеводородами эффективно разлагали асфальтено-смолистые компоненты нефти. Полученные данные иллюстрируют избирательную способность изучаемых микроорганизмов-деструкторов в отношении деградации отдельных фракций нефти, что необходимо учитывать в процессе отбора эффективных штаммов при составлении ассоциаций микроорганизмов-деструкторов как основы биопрепаратов для очистки от нефтяных загрязнений.

S M4-6V

Рис. 4. Деградация нефти отдельными штаммами микроорганизмов при 24°С в течение 7 дней и при 4-6°С в течение 20 дней.

2. Составление Ii отбор ассоциаций мпкрооргашпмов, способных к~ деградации углеводородов нефти прп пониженной температуре.

Для выбора ассоциации штаммов-деструкторов углеводородов нефти были использованы два различных подхода: составление ассоциации штаммов-деструкторов эмпирическим путём на основании анализа их физиологических, метаболических и деструктивных свойств, а также селекция при периодическом культивировании смешанной ассоциации микроорганизмов в жидкой минеральной среде с нефтью в качестве единственного источника углерода и энергии в присутствии сорбента и без него.

2.1. Подбор ассоциации штаммов-деструкторов эмпирическим путём.

На основании анализа физиологических и метаболических характеристик отобранных наиболее активных деструкторов был предложен следующий вариант эмпирически составленной ассоциации, состоящей из четырёх штаммов: Rhodococcus sp. S25, Rhodococcus sp. X5, Rhodococcus sp. S67 и Pseudomonas sp. 142NF(pNF142). Штамм Rhodococcus sp. S25 - обладал высоким значением оптической плотности культуральной жидкости после центрифугирования, следовательно выделял достаточное количество эмульгатора. Rhodococcus sp. Х5 - способен к деградации дизельного топлива в присутствии 5-10% NaCl. Rhodococcus sp. S67 - имел наибольшее значение индекса эмульгирования, наиболее интенсивно снижал поверхностное натяжение и имел наибольшее значение степени деградации нефти при 4-6°С. Pseudomonas sp. 142NF(pNF 142) - проявлял галотолерантные свойства даже при пониженной температуре. Кроме того, вышеописанные микроорганизмы с разной эффективностью утилизируют различные фракции нефти, взаимно дополняя друг друга.

2.2. Селекция ассоциации штаммов-деструкторов в жидкой минеральной среде и адсорбция нефти биодеградабельным сорбентом.

Процессы биодеструкции, а также адсорбции нефти исследовались при 24°С и 4-6°С в условиях периодического культивирования в жидкой минеральной среде Эванса.

Эффективность удаления нефти изучали с помощью биодеградабельного сорбента на основе пушицы {Eriophorum vaginatum) и девяти отобранных психротрофных микроорганизмов-деструкторов, а именно: Rhodococcus sp. Х25, Rhodococcus sp. X5, Rhodococcus sp. S25, Rhodococcus sp. S26, Rhodococcus sp. S67, Pseudomonas sp. 142NF(pNF142), Pseudomonas putida BS3701(pBSl 141, pBSl 142), Microbaclerium sp. Ars25 и Rhodococcus sp. Ars38.

Как видно из данных рис. 5, нефть адсорбировалась на сорбенте лучше при 4-6°С (96%), чем при 24°С (86%), возможно, за счёт увеличения её вязкости. При 24°С эффективность удаления нефти с использованием сорбента и микроорганизмов в качестве деструкторов (70%) ниже, чем только сорбентом за 10 суток (86%). Такая же закономерность наблюдалась при 4-6°С.

Рис. 5. Степень удаления нефти сорбентом с добавлением и без добавления микроорганизмов з,а 10 суток в жидкой минеральной среде.

Анализ результатов по изменению численности девяти интродуцированных микроорганизмов-деструкторов в КЖ показал, что в присутствии сорбента численность родококков выше при 24°С и 4-6°С по сравнению с экспериментами без применения сорбента.

Для определения доминирующих штаммов родококков и псевдомонад был проведён анализ отселектированпой популяции после окончания культивирования в жидкой среде. Представителей рода Pseudomonas различали по культурально-морфологическим признакам (размер и форма колоний), а также устойчивости к различным антибиотиками: для 142NF -ампициллину 500, для BS3701 - рифампицину 100. Дополнительным маркером для штамма BS3701 было ярко-зелёное свечение колоний в ультрафиолетовом свете (Я.=254 нм) при росте на агаризованной среде КБ. Для определения доминирующих представителей родококков было проведено генотипирование отселектированных штаммов, поскольку штаммы родококков.

использованные в экспериментах, были идентичны друг другу по культурально-морфологическим признакам. С этой целью применяли RAPD анализ с использованием 4 праймеров: ОА20 (GTTGCGATCC), 0006 (GTGCCTAACC), OS09 (TCCTGGTCCC) и OS14 (AAAGGGGTCC). Наибольшие различия между штаммами были выявлены при использовании праймера ОА20 (Рис. 6).

М 14 Ц1> i ¡1

Jijo 1 ! • •• • т I' í ' I \ 1 f i 1 i

SS ' w Н \ И V-V у. f* ш

ШШШШш~ iitfii щ PW f* pe, w <m m m* m>

ШтшШ»^ ' i- Ü.

• ш

I 2 3 4 Í 6 7 S 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18

1 2 3 4 5 6 7 S 19 20 21 22 23 24 25 26 27

Рис. 6. RAPD анализ штаммов родококков. 1-50 pb Ladder (Fermentas); 2- Rhodococcus sp. S25; 3- Rhodococcus sp. S26; 4- Rhodococcus sp. S67; 5- Rhodococcus sp. X5; 6 - Rhodococcus sp. X25; 7- Microbacterium sp. Ars25; 8- Rhodococcus sp. Ars38; 9-27- клоны, составляющие большую часть популяции после культивирования в жидкой минеральной среде.

Было обнаружено, что после 10 суток культивирования на нефти 80% общей популяции родококков было представлено штаммами Rhodococcus sp.S67 и Rhodococcus sp.X5 при 24°С, а при 4-6°С эти же два штамма составляли 70% общей популяции родококков.

В результате проведённых

экспериментов в жилкой

минеральной среде с нефтью в

качестве единственного источника

углерода и энергии без

использования сорбента была

отеелектирована ассоциация

микроорганизмов, состоящая из

Rhodococcus sp. Х5. Rhodococcus sp.

S67, Pseudomonas sp. 142NF(pNFI42).

Pseudomonas putida BS3701(pBSl 141,

pBSl 142) (Рис. 7).

Таким образом, с помощью

двух различных подходов составлены

микробные ассоциации, состоящие

каждая из четырёх штаммов-Рис. 7. Схема составления микробной

И деструкторов. Причем три из четырех

ассоциации путем селекции при г г г г

периодическом культивировании. микроорганизмов, ВХОДЯЩИХ В

состав каждой из ассоциации, являются одинаковыми.

При сравнении способности каждой ассоциации деградировать нефть в условиях периодического культивирования в жидкой минеральной среде Эванса при пониженной температуре в течение 10, 20 и 30 суток показано, что степень деградации нефти отселектированной ассоциацией была выше (16%) по сравнению с эмпирически составленной (11%). При одновременном применении сорбента и отселектированной ассоциации психротрофных микроорганизмов на 10 сутки эксперимента степень удаления нефти составляла 77% и была, в основном, обусловлена адсорбцией нефти и адгезией микроорганизмов к поверхности сорбента (Табл. 1).

Табл. 1. Степень удаления нефти сорбентом и при совместном применении сорбента и отселектированной ассоциации в жидкой минеральной среде при 4-б°С.

Сутки Степень удаления нефти, %

сорбент отселектированная ассоциация + сорбент

10 96,2 ±1,1 77,7+ 3,6

20 95,6+3,4 91,7± 4,5

30 95,7± 0,7 96,7+ 0,7

Следовательно, для эффективного удаления разливов нефти при низкой температуре целесообразно последовательное применение биоутилизируемого сорбента и ассоциаций микроорганизмов-деструкторов для минерализации остаточного количества углеводородов нефти. Сравнение степени деструкции нефти отселектированной и эмпирически составленной ассоциациями показало, что ассоциация, отобранная в процессе селекции активных микроорганизмов-деструкторов нефти и ПАУ, и состоящая из Rhodococcus sp. Х5, Rhodococcus sp. S67, Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) и Р. putida

BS3701 (pBS 1141. pBS 1142) более эффективно утилизирует углеводороды нефти. Омичигельными особенностями микробной ассоциации является сочетание следующих свойств, во-первых, исихротрофность, т.е. способность к росту и развитию в широком температурном диапазоне (от 2 до 32°С), что позволяет использовать их при биоремедиации иефтезагрязнённых территорий в различных регионах России; во-вторых, деградация нефти и нефтепродуктов в присутствии 3-5% NaCl; в-третьих, при культивировании в минеральных средах с использованием в качестве источника углерода и энергии нефтепродуктов микроорганизмы синтезируют биоэмульгаторы и обладают высокой эмульгирующей активностью; в-четвёртых, бактерии рода Pseudomonas несут в своём составе катаболические плазмиды биодеградации полициклических ароматических углеводородов. Наличие конъюгативных плазмид, содержащих гены биодеградации ПАУ, способствует увеличению деградативного потенциала за счет распространения генов среди аборигенных микроорганизмов. Поэтому использование катаболических генов является альтернативной стратегией обычной биоремедиации. Даже в том случае, если интродуценты неконкурентоспособны и постепенно элиминируются, тем не менее, они могут быть донорами данных генов вследствие конъюгационного переноса плазмид. К тому же, возможен другой путь распространения катаболических генов: клетка-хозяин погибает и лизируется, после чего ДНК с катаболическими генами попадает в окружающую среду и некоторое время может в ней находиться, в определенный момент при контакте с подходящим новым хозяином путем трансформации встраиваясь в генетическую систему микробной клетки (Прозоров, 2000). Вследствие чего, включение в состав биопрепарата штаммов, содержащих конъюгативные плазмиды биодеградации представляется новым и перспективным аспектом при разработке новых стратегий биоремедиации.

3. Биодеградация нефти и динамика численности интродуцированиых и аборигенных микроорганизмов в модельных почвенных системах в лабораторных условиях.

Изучение процесса

биодеградации нефти, популяционной динамики штаммов-деструкторов в почве проводили в лабораторных модельных почвенных системах (микрокосмах) по схеме (Рис. 8).

Как видно из рис. 9, на процесс биодеградации нефти в модельной почвенной системе значительный эффект оказывало внесение минерального удобрения в виде нитроаммофоски. При этом наибольшая степень деструкции наблюдалась после 63 суток инкубирования и при дальнейшем

Рис 8. Схема модельного почвенного эксперимента.

продолжении жеперимента не изменялась, и составляла 22.8 и 24.2% для микрокосм 2 и 3. соответственно, что демонстрирует эффект внесения удобрений и интродукции микроорганизмов.

1 зо -

•в-

2 25 -

I 10

£ 5

о о

21 42 63 84

Время, сутки

Рис. 9. Динамика степени деструкции нефти в почве.

Следует отметить, что убыль нефти после 21 и 42 суток была выше в микрокосме 4 по сравнению с микрокосмом 1, т.е. интродуцированная ассоциация увеличивала скорость деструкции углеводородов нефти. В почве, используемой при проведении лабораторного эксперимента, численность аборигенных нефтедеструкторов составляла менее 1% от общей численности микроорганизмов.

В ходе эксперимента общая численность нефтедеструкторов сначала увеличилась, затем немного снизилась и осталась на уровне Зх105-1х106 КОЕ/г почвы, что составляло от 2,5 до 62% от численности гетеротрофов. В работе Деллиля с соавт. (ОеППе й а1., 2002) показано резкое возрастание численности микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти (менее 1% и 95% до и после внесения поллютанта, соответственно) по сравнению с численностью сапрофитных микроорганизмов в течение одного месяца после загрязнения. Доля интродуцированных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти в нашей работе на протяжении всего эксперимента варьировала от 17 до 61% от общей численности нефтедеструкторов. Таким образом, внесение микроорганизмов-нефтедеструкторов в количестве 6><105 КОЕ/г почвы (1% от общей численности почвенной популяции) было достаточным для поддержания численности вносимых бактерий на уровне, необходимом для их выживаемости, и для осуществления процесса биодеградации нефти. Увеличение численности интродуцированных микроорганизмов до 61% к 64 суткам демонстрирует их конкурентоспособность в отношении аборигенных почвенных микроорганизмов.

4. Биоремедиация почвы, загрязнённой нефтью, в условиях полевого эксперимента.

Эксперимент в открытой окружающей среде проводили на территории очистных сооружений г. Пущино с сентября 2006 г. по сентябрь 2007 г.

Опытная площадка представляла собой 4 отделённых друг от друга участка площадью 1м" каждый (Рис. 10).

Участок 1 Контроль Участок 3 Макроовая зсояшдоия Мннеральвог удоор^нт'

Участок 2 Контроль с вефтью Участок 4 Нефть .Мвкроонэя ассоциация Минерально* удобрение

Рис. 10. Схема полевого эксперимента.

4.1. Мониторинг за численностью гетеротрофов и нефтедестру кторов. В течение первого месяца эксперимента общая численность (Рис.11А) и численность микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти (Рис.ПБ) постоянно увеличивалась. Это может быть связано с тем, что во время подготовки к данному эксперименту были улучшены такие характеристики почвы, как её структура, воздухо- и влагообмен за счёт удаления дёрна и рыхления. Кроме того, увеличение численности микробной популяции может быть вызвано внесением нефти, как было показано в работе Делилля с соавт. (Ое1Ше е1 а1., 2007).

В этот период времени максимальная численность гетеротрофов была отмечена для участков 2 и 4 и составляла 2,2><109 и 1,8* 109 КОЕ/г почвы, соответственно (Рис. ПА). Наибольшая численность нефтедеструкторов была в участках 3 и 4 - 7,4x107 и 3,6х]08 КОЕ/г почвы, соответственно, т.е. в интродукцией микробной ассоциацией (Рис. 11 Б).

Исходная численность

деструкторов углеводородов была 2,2* 105 КОЕ/г почвы. Численность и гетеротрофов, и нефтедеструкторов с октября месяца постепенно снижалась, а начиная с марта повышалась во всех экспериментальных

участках. Причём в участках 1, 2 и 3 общая численность микроорганизмов после двух месяцев эксперимента

отличалась от участка 4 на порядок, а численность штаммов-деструкторов углеводородов нефти - на один порядок через месяц и на полтора-два порядка через два о зо бо 120 1ао 240 360 месяца и далее. Как видно из

время, сутки данных рисунка 12 после

Б зимнего времени года

Рис. 11. Общая численность микроорганизмов (А) численность микроорганизмов и численность нефтедеструкторов (Б). возросла ВО всех участках

и составила для гетеротрофов от 2,8* 106 до 6,8х107 КОЕ/г почвы и для нефтедеструкторов - от 1,3* 105 до 3,3* Ю6 КОЕ/г почвы. Наименьшая общая

участках

I Е С

О о.

1 I:,

---Участок 1

Участок 2

----Участок 3

-Участок4

Ю 120 180 240 360

Время, сутки

£ 8 2

£ £ ® 1.00Е+07 1*0 ; ¡с

о ¡1 и 1,ООЕ+О6

3 Й-8 1.00Е+05

А Йк

.......

— Участок 1

...........Участок2

----Участок 3

-Участок 4

численность бактерии (6.7* 106 КОЕ/г почвы) наблюдалась в участке 1. который был контролем без внесения нефти.

4.2. Мониторинг интродуцированной микробной ассоциации.

В нашей работе с помощью разработанного метода мониторинга впервые удалось проследить за судьбой интродуцированпых микроорганизмов при проведении полевого эксперимента. Исходная численность интродуцированной ассоциации составляла 1*107 КОЕ/г почвы. На протяжении всего эксперимента в открытой окружающей среде общая численность внесённых микроорганизмов не опускалась ниже, чем 2,6х106 КОЕ/г почвы. Такая численность интродуцированпых микроорганизмов поддерживалась в течение первых двух месяцев эксперимента, затем происходило уменьшение их численности на один порядок. Однако аналогичная картина была и для общей численности нефтедеструкторов в этот промежуток времени (октябрь 2006 - март 2007 гг.), но доля интродуцированной ассоциации была на достаточно высоком уровне, и что самое главное, была максимальной для участка 4 после 120 дней (т.е. в январе 2007 г.) - 29,4%, т.е. именно интродукция психротрофных микроорганизмов привела к таким результатам (Табл. 3). Особого внимания заслуживает тот факт, что численность интродуцированной ассоциации по отношению к общей численности нефтедеструкторов возрастала от 1 до 79% на протяжении 6 месяцев эксперимента, что свидетельствует о выживаемости внесённых микроорганизмов в почве в открытой окружающей среде и было ранее нами продемонстрировано только в лабораторных микрокосмах (1ч1опо\' й а1., 2007).

Табл. 3. Динамика численности интродуцированной микробной ассоциации.

Номер участка Интродуцированная ассоциация % от общей численности нефтедеструкторов

В начале эксперимента

3 (почва без нефти) 5,2x103 11,1

4 (почва с нефтью) 6,0x10' 0,9

Через 30 дней (октябрь 2006 г.)

3 1x10'' 1,4

4 3x10" 0,8

Через 60 дней (ноябрь 2006 г.)

3 8,3x10° 19,8

4 3,1х106 12,4

Через 120 дней (январь 2007 г.)

3 5,3x10" 29,4

4 3,5x10' 18,6

Через 180 дней (март 2007 г.)

3 1х104 21,9

4 2,6x106 78,8

4.3. Убыль нефти.

Степень деградации нефти определяли в участках 2 (контроль) и 4 (интродуцированная ассоциация + удобрение). Только через две недели после внесения в почву загрязнителя (нефти) произошло его равномерное распределение в почвенном слое на глубине 10-15 см. В участке 2 деградация не происходила в течение первого месяца эксперимента. Напротив, в участке 4 снижение концентрации нефти началось сразу и уже после первых двух недель составляла 6,6% (Рис. 12). На протяжении всех месяцев исследований степень деградации нефти в участке с интродукцией микроорганизмов и удобрения была выше, чем в контрольном участке. При обработке загрязнённых участков микробной ассоциацией совместно с удобрением наблюдалось значительное снижение содержания остаточной нефти, что связано в первую очередь с увеличением числа углеводородокисляющих микроорганизмов на 4 порядка (Рис. 11). Большая часть нефти была утилизирована после первых двух месяцев эксперимента, где степень деградации составила 33,9% и 21,6% - в контроле.

13 21 27 3-1 42 47 60 120 180 240 360 Время, сутки

Рис. 12. Убыль нефти в полевом эксперименте.

Добавка азота и фосфора, увлажнение, достаточная аэрация стимулировали активный процесс биодеградации нефти. В тоже время следует отметить, что эти же условия активировали и нефтеокисляющую микрофлору почвы, что способствовало интенсификации процессов самоочищения нефтезагрязнённой почвы.

Из данных рисунка 12 следует, что в дальнейшем также происходила убыль нефти во всех участках и после 1 года составляла 49,1% и 37,5% для участков 4 и 2, соответственно. Снижение температуры воздуха и почвы (Рис. 13) в ноябре-январе не привело к прекращению процесса

деградации нефти, что, возможно, связано с интродукцией ассоциации

психротрофных микроорганиз-

'7V

1 2 5 13 21 27 34 42 4У/55 60 120 1S0 240 360

--- температура

воздуха —— температура почвы_

Время, сутки

Рис. 13. Динамика изменения температуры воздуха и почвы при проведении полевого эксперимента.

мов-деструкторон. Однако, в нолевых (Mohn el al.. 2001) и лабораторных экспериментах (Mohn and Stewart. 2000) было продемонстрировано, что биоаугментация с использованием накопительной культуры с плотностью микробных клеток 10s КОЕ/г почвы не увеличило скорость деградации нефти после 65 суток. Средняя дневная температура сайта изменялась в диапазоне от 10°С до -14°С на протяжении всего эксперимента.

Для установления степени восстановления качеств почвы после загрязнений сырой нефтью в полевом эксперимента использовали овёс в качестве биоиндикатора. Полученные через месяц результаты продемонстрировали снижение токсичности почвы после интродукции

ассоциации штаммов-дсструкторов (Рис. 14).

шйр» шшгшшшшшщ&щшш®

тш

Рис. 14. Снижение фитотоксичности почвы. Полевой эксперимент. Июнь 2007 года. А -контроль (почва с нефтью). Б - загрязнённый нефтью участок с интродукцией микробной ассоциации и внесением минерального удобрения.

5. Полевые испытания опытного образца биопрепарата для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

На основе полученной микробной ассоциации, состоящей из штаммов Rhodococcus sp. Х5, Rhodococcus sp. S67, Pseudomonas sp. 142NF(pNFl42) и Pseudomonas putida BS3701(pBSl 141, pBS1142), была приготовлена опытная партия жидкой формы биопрепарата. Эффективность опытного образца биопрепарата продемонстрировали при проведении полевых испытаний по очистке почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами на территории ОАО «Тульская Топливно-Энергетическая Компания» в период с сентября по ноябрь 2007 года.

Загрязнение грунта произошло во время аварийных разливов нефтепродуктов (газовый конденсат, дизельное топливо, бензин, мазут) и прорывов трубопроводов. Очистку производили путём интродукции микробной ассоциации (опытного образца биопрепарата), состоящей из природных микроорганизмов-нефтедеструкторов родов Pseudomonas и Rhodococcus. Одновременно с интродукцией биопрепарата вносили минеральное удобрение (Нитроаммофоска), содержащее источники азота, фосфора и калия.

Эффективность бморемедиации загрязнённого нефтепродуктами грунта оценивали но уменьшению общего содержания углеводородов нефти. Результаты проведённых полевых испытаний по очистке грунта, загрязнённого комплексным загрязнителем (дизельное топливо, газовый конденсат, мазут), представлены в табл.4. В течение одного месяца содержание остаточных углеводородов нефтепродуктов снизилось на 99,6% за счёт одновременного внесения биопрепарата и минерального удобрения, по сравнению с контрольным участком - 90,7%. Сравнительно небольшая разница в остаточной концентрации нефтепродуктов опытного участка по сравнению с контрольным связана, во-первых, с физико-химическими свойствами загрязнителя, который в значительной степени был подвержен абиотической деградации за счет испарения и фотоокисления. Во-вторых, результаты микробиологического анализа показали, что численность аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры составляла от 8,0х104до 1,8x106 КОЕ/г грунта, т.е. была на достаточно высоком уровне. В результате, после двух месяцев степень очистки контрольного участка составляла 99,8%.

Табл. 4. Убыль углеводородов нефтепродуктов.

Дата взятия пробы Остаточное содержание нефтепродуктов, мг/кг фунта Степень очистки, %

Контрольный участок Опытный участок Контрольный участок Опытный участок

14 сентября 2007 г. 13026±4559 11994±4198 - -

17 октября 2007 г. 1214±425 52,0±23,4 90,7 99,6

15 ноября 2007 г. 19,6±8,8 18,0±8,1 99,8 99,8

Кроме того, на протяжении двух месяцев полевых испытаний проводили мониторинг численности гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов. Из данных рис. 15 следует, что первоначальное перемешивание грунта на глубине 10-20 см привело к значительному увеличению численности микроорганизмов - на два порядка. Затем происходило незначительное изменение численности микробных популяций, однако численность бактерий в опытном участке была всегда больше, чем в контрольном.

ли

УВ/ОК

0248 0248 Время, недели

¡1 ^контрольный I участок

1 ВОПЫТНЫЙ Ц участок

Рис. 15. Динамика численности микробных популяций (ГТ - гетеротрофные микроорганизмы, УВ/ОК - углеводородоокисляющие микроорганизмы).

Таким образом, при проведении нолевых испытании показана эффективное п> и возможность осуществления биоремедиации in situ с помощью данного биопрепарата даже при низкой температуре окружающей среды (8-15"С).

6. Депонирование штаммов, изучение их патогенностн, патентование ассоциации и биопрепарата для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами.

6.1. Депонирование штаммов.

Изученные культуры наиболее активных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти были депонированы во Всероссийскую Коллекцию Микроорганизмов на базе Института биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г. К. Скрябина РАН под следующими номерами:

Rhodococcus sp. Х5 - ВКМ Ас-2532Д,

Rhodococcus sp. S67 - ВКМ Ас-2533Д,

Pseudomonas sp. 142NF(pNF142) - ВКМ В-2387Д,

Pseudomonas putida BS3701(pBSl 141, pBSl 142) - В KM В-2380Д.

6.2. Изучение патогенностн микроорганизмов.

Штаммы, входящие в состав данной ассоциации, прошли санитарно-гигиеническую оценку в Научно-Исследовательском Центре Токсикологии и Гигиенической Регламентации Биопрепаратов, в опытах на лабораторных животных были оценены показатели вирулентности, токсичности, токсигеиности и диссеминации, на основании чего штаммы были отнесены к 4 классу опасности микроорганизмов (не патогенные) и удовлетворяют требованиям, предъявляемым к промышленным микроорганизмам.

6.3. Патентование ассоциации и биопрепарата для очистки почв от загрязнений пефтыо и нефтепродуктами.

На ассоциацию, состоящую из вышеописанных микроорганизмов, получен патент на изобретение РФ №2312891 «Ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде».

Подана патентная заявка в Российское агентство по патентам и товарным знакам на биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения.

выводы

1. На основании скрининга коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид, способных к деградации различных углеводородов, отобраны активные психротрофные штаммы-деструкторы нефти и нефтепродуктов и на их основе составлена ассоциация.

2. Впервые в составе ассоциации, как основы биопрепарата использованы психротрофные, галотолерантные микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти родов Rhodococcus и Pseudomonas, продуцирующие биоэмульгаторы, кроме того, псевдомонады несут в своём составе конъюгативные плазмиды биодеградации.

3. По характеру первичного взаимодействия микроорганизмов с нефтяными каплями родококки и псевдомонады различаются - родококки проникают во внутрь нефтяной капли, а псевдомонады локализуются на её поверхности. Структурной особенностью взаимодействия нефти с микроорганизмами является образование экзоцеллюлярных плёнок полисахаридной природы.

4. С помощью разработанного метода мониторинга впервые удалось проследить за судьбой интродуцированных микроорганизмов-деструкторов нефти в открытой окружающей среде и показать конкурентоспособность. На протяжении 6 месяцев эксперимента доля интродуцированных штаммов составляла до 78 % от общей численности почвенных микроорганизмов-деструкторов. В полевом эксперименте продемонстрирована способность микробной ассоциации к деградации сырой нефти в широком температурном диапазоне, при этом степень очистки почвы составила 49% за 12 месяцев эксперимента.

5. Получен патент РФ №2312891 «Ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде». Подана заявка №2007125403 на изобретение «Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения». Эффективность опытного образца биопрепарата доказана в полевых испытаниях в Тульской области. Степень очистки почвы от нефтепродуктов составила 99,6% за один месяц.

Благодарности

Автор выражает благодарность сотрудникам центра инструментальных методов анализа ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН Одиноковой A.M. и Аринбасарову М.У. за проведение химического анализа остаточных нефтепродуктов, Дмитриеву В.В. и Колесниковой С.А. за совместную работу по электронной микроскопии. Сотрудникам лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина Гафарову А.Б. за помощь в генотипировании штаммов-деструкторов, к.б.н. Пунтус И.Ф. и к.б.н. Ахметову Л.И. за обсуждение полученных результатов, ст.лаб. Петрухиной В.А., Ветровой A.A. и Овчинниковой A.A. за помощь в постановке экспериментов, а также всем сотрудникам лаборатории за внимание и помощь в работе.

Особую благодарность автор приносит своему руководителю к.б.н. Филонову А.Е, а также зав. лабораторией лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, чл.-корр. Воронину A.M.

ClIIICOK IH fi. IllK";lIII■ If 110 I CMC /НКЧЧ'р I MintII

1. Пырченкова (Почасна) П.Л., Гафаров Л.Б., Пунтус И.Ф.. Филонов А.Е., Бороиин A.M. Выбор м характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти. Прикладная биохимия и микробиология. 2006. 'Г.42. №3. С. 298-305.

2. II. А. Нечаева, Л. Б. Гафаров, А. Е. Филонов, И.Ф. Пумтус. Л. М. Бороним. Составление и отбор ассоциаций микроорганизмов, способных к деградации углеводородов нефти при пониженной температуре. Известия Тульского государственного университета. Серия Химия. 2006. Выпуск 6. С.179-188.

3. Н.Л. Лагунова, С.А. Скачков, О.Н. Понаморева, И В. Россинская, А.Е. Филонов, II.A. Нечаева. Сравнительная оценка дыхательной активности иммобилизованных микроорганизмов-деструторов углеводородов нефти и их искусственных ассоциаций. Известия Тульского государственного университета. 2006. Серия Химия. Выпуск 6. С. 124-130.

4. Филонов А.Е., Нечаева П.А., Гафаров А.Б., Аринбасаров М.У., Пунтус И.Ф., Сунн С., Романчук М., Воронин A.M. Биодеградация нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами и её адсорбция растительным сорбентом в жидкой минеральной среде. Биотехнология. 2007. №2. С. 31-39.

5. Филонов А.., Кошелева И.А., Шкидченко А.Н., Пырчснкова (Нечаева) И.А., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Воронин A.M. Ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде. Патент Российской Федерации на изобретение №2312891. Приоритет изобретения 10.03.2006.

6. Филонов А.Е., Кошелева И.А., Самойленко В.А., Шкидченко А.Н., Нечаева II.A., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Якшина Т.В., Воронин A.M. Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения. Заявка №2007125403 о выдаче патента Российской Федерации на изобретение, 05.07.2007.

7. Filonov А.Е., Nechaeva 1.Л., Aklimetov L.I., Gafarov А.В., Puntus I.F., Boronin A.M. Biodégradation of Crude Oil by Introduced Psychrotrophic and Indigenous Microbial Association under Laboratory and Field Conditions in Soils of Moscow Region, Russia. Proceeding of the Thirtieth Arctic and Marine Oil Spill Program (AMOP) Technical Seminar. June 5-7,2007, Edmonton, Canada, v. 1, p. 319-329.

8. A. Filonov, I. Nechaeva, Vetrova A., A. Ovehinnikova, A. Gafarov., 1. Puntus, L. Akhnietov. Psychrotrpphic Microorgsnisms and Catabolic Plasmids for Oil Spills Bioremediation. ISTC Workshop at the International Conference on Contamination Soil, ConSoil 2008. 3-6 June 2008, Milan, Italy, 2008, p. 61-69.

9. Пырченкова (Нечаева) И.А., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Филонов А.Е. Скрининг и селекция активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти. Биология-наука 21 века. 9-международная Путинская школа-конференция молодых учёных. 18-22 апреля 2005 г., Пущино, с.361-362.

10. Филонов А.Е., Suni S., Koskinen К., Kauppi S., Пырченкова (Нечаева) И.А., Пунтус И.Ф., Гафаров А.Б., Соколов С.Л., Кошелева И.А., Romantschuk M., Воронин A.M. Очистка нефтезагрязнений с использованием психротрофных микроорганизмов и сорбента на основе пушицы. Наука-бизнес-образование. 2-я международная конференция. 10-13 мая 2005 г., Пущино, с. 149-150.

11. А.Е. Filonov, I.A. Pyrchenkova (Nechaeva), I.F. Puntus, А.В. Gapharov, A.M. Boronin. Screening and selection of activ psychotrophic oil degrading microorganisms. 13 International Biodeterioration and Biodégradation Symposium. 4-9 September 2005, Madrid, p. 230.

12. Пырченкова (Нечаева) И.А., Филонов A.E., Suni S., Koskinen К., Kauppi S., Гафаров А.Б.,Пунтус И.Ф., Romantschuk M., Воронин A.M. Сорбция и биодеградация нефтепродуктов с использованием растительного сорбента и психротрофных микроорганизмов. Биотехнология - 2005. 8-ой Международный Семинар-Презентация инновационных научно-технических проектов. 18-19 ноября 2005, Пущино, с.93-95.

13. A.E. Filonov. 1.Л. ГугсЬспкоуя (Nechaeva), А.В. Gapliarov, I.F. Puntus. S. Suni. M. Romantschuk, A.M. Boronin Microorganisms and cotton grass sorbents lor oil spil bioremediation in cold climates. International Conference on Alpine and Polar Microbiology. 2731 March, 2006, Innsbruck, p. 93.

14 Ветрова A.A., Пырченкова (Нечаева) ПЛ., Игнатова А.А., Филонов А I". Изучение влияния катаболических плазмид на физиологические параметры псевдомонад и эффективность биодеструкции нефти. Биология-наука 21 века. 10-я Путинская школа-конференция молодых учёных. 17-21 апреля 2006 г., Пущино, с.360.

15. Pyrchenkova (Nechaeva) I.A., Gapliarov А.В., Filonov А.Е., Suni S., Romantschuk M., Boronin A.M. Study of the efficiency of crude oil degradation and adsorption by selected microbial associations and cotton grass sorbent at low temperature. 3rd International Conference on Science and Business. June 19-21,2006, Pushchino, p. 132.

16. Andrey Filonov, Irina Pyrchenkova (Nechaeva), Arslan Gafarov, Irina Puntus, Sonja Suni, Martin Romantschuk, Alexander Boronin. Elaboration of associations of psychrotrophic degrader microorganisms for oil spill removal. International Conference on Environmental Biotechnology. 9-14 July, 2006, Leipzig, p. 153.

17. Скачков СЛ., Лагунова Н.Л., Понаморёва О Н., Пырченкова (Нечаева) И.А., Филонов А.Е. Скрининг микроорганизмов-деструкторов углеводородов для биоремедиации территорий, загрязнённых нефтью. Вторая Всероссийская научно-техническая интернет-конференция «Современные проблемы экологии и безопасности». 2006 г., Тула, с. 13-15.

18. Нечаева И.А., Филонов А.Е. Психротрофные микроорганизмы для биоремедиации нефтяных загрязнений в условиях холодного климата // Сборник статей. Российская школа-конференция молодых ученых «Экотоксикология-современные биоаналитические системы, методы и технологии». 28 октября-3 ноября 2006 г., Пущино, с.56.

19. I.A. Ncchaeva, А.Е. Filonov, A.M. Boronin. Microbial association for oil spill bioremediation. The Fourth Moscow International Congress «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development». 12-16 March, 2007, Moscow. Congress proceedings, part 3, p. 5.

20. Нечаева II.A. Разработка условий совместного культивирования клеток Pseudomonas и Rhodococcus как основы биопрепарата для очистки нефтезагрязнённых почв. Материалы I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты». 24-25 мая 2007 г., Пущино, с. 50.

21. Петриков К.В., Власова Е.П., Нечаева И.А., Понаморёва О Н., Филонов А.Е., Алферов В.А., Воронин A.M. Получение биомассы и сохранение активности микроорганизмов-деструкторов нефти при раздельном и совместном периодтическом культивировании. Материалы четвертой международной конференции из серии «Наука -Бизнес». 15-18 октября, 2007 г., Пушино. С.126-129.

22. К.В. Петриков, Т.В. Якшина, Е.П. Власова, И.Ф. Пунтус, И.А. Нечаева, В.А. Самойленко, А.Е. Филонов Изучение выживаемости микроорганизмов-деструкторов нефти родов Pseudomonas и Rhodococcus при различных способах хранения. Материалы международной конференции «Современное состояние и перспективы развития микробиологии и биотехнологии», 2-6 июня 2008, Минск, с.223-225.

23. Филонов А.Е., Нечаева И.А., Ветрова А.А., Овчинникова А.А., Власова Е.П., Петриков К.В., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Ахметов Л.И. Биоремедиация нефтеразливов в условиях холодного климата: разработка биопрепаратов и их применение. III Международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал». 28 сентября - 5 октября 2008 г., Пермь - Н. Новгород -Пермь. С. 105-106.

24. L. Akhmetov, S. Kolesnikova, I. Nechaeva, T. Rusakova, P. Petrov, I. Puntus, V. Dmitriev, A. Filonov, A. Boronin. Structural and morphological peculiarities of two strains of Pseudomonas and Rhodococcus genera in oil biodégradation process. 14th International Biodeterioration and Biodégradation Symposium. 6-11 Octobre 2008, Messina, Italy, p. 91.

Подписано в печать:

22.12.2008

Заказ № 1424 Тираж -100 экз. Печать трафаретная. Типография «11-й ФОРМАТ» ИНН 7726330900 115230, Москва, Варшавское ш., 36 (499) 788-78-56 www.autoreferat.ru

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Нечаева, Ирина Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ И УСЛОВНЫХ ОБОЗНАЧЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ б

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. НЕФТЬ КАК ИСТОЧНИК ЗАГРЯЗНЕНИЙ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ

Глава 2. ДЕГРАДАЦИЯ НЕФТИ

2.1. АБИОТИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ НЕФТИ

2.2. МИКРОБНАЯ УТИЛИЗАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ

2.2.1. МЕТАБОЛИЗМ АЛИФАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ

2.2.1.1. Окисление линейных углеводородов

2.2.1.2. Окисление циклических углеводородов

2.2.2. МЕТАБОЛИЗМ АРОМАТИЧЕСКИХ УГЛЕВОДОРОДОВ 25 2.2.2.1 .Окисление моноароматических углеводородов 26 2.2.2.2. Окисление полиароматических углеводородов

2.2.3. МЕТАБОЛИЗМ АСФАЛЬТЕНОВ

2.2.4.БИОДЕГРАДАЦИЯ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ В ЭКСТРЕМАЛЬНЫХ 37 ПРИРОДНЫХ УСЛОВИЯХ

2.2.4.1 .При пониженных температурах

2.2.4.2.При повышенных температурах

2.2.4.3.В кислой и щелочной среде

2.2.4.4.В условиях повышенного содержания соли

Глава 3. МЕТОДЫ БИОРЕМЕДИАЦИИ ТЕРРИТОРИЙ, ЗАГРЯЗНЁННЫХ 50 НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ

3.1. СТИМУЛЯЦИЯ АБОРИГЕННОЙ МИКРОФЛОРЫ

3.2. ИНТРОДУКЦИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ

3.3. БИОПРЕПАРАТЫ: ПРИНЦИПЫ ИХ РАЗРАБОТКИ И ПРИМЕНЕНИЯ

3.3.1. РАЗРАБОТКА БИОПРЕПАРАТОВ

3.3.2. ПРИМЕНЕНИЕ БИОПРЕПАРАТОВ

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

2.1. Бактериальные штаммы

2.2. Питательные среды, источники углерода и энергии, антибиотики

2.3. Сорбент

2.4. Условия культивирования

2.5. Определение эмульгирующей активности

2.6. Измерение индекса эмульгирования

2.7. Определение поверхностного натяжения

2.8. Определение степени деструкции нефти

2.9. Флуориметрический метод измерения массовой доли нефтепродуктов в почве

2.10. Определение фракционного состава остаточной нефти в пробах

2.11. Определение степени адсорбции нефти

2.12. Выделение тотальной ДНК микроорганизмов

2.13. Полимеразная цепная реакция

2.14. Рестрикционный анализ амплифицированной рибосомальной ДНК (метод 74 ARDRA)

2.15. RAPD (randomly amplified polymorphic DNA) анализ

2.16. Разделение амплифицированных фрагментов ДНК

2.17. Определение влагоёмкости почвы

2.18. Определение рН почвы

2.19. Приготовление модельных почвенных систем

2.20. Внесение инокулята в почву

2.21. Отбор проб

2.22. Мониторинг штаммов-деструкторов в процессе деградации нефти в почве

2.23. Условия полевого эксперимента

2.24. Условия проведения ферментаций

2.25. Световая микроскопия

2.26. Электронно-микроскопические методы

2.27. Статистическая обработка результатов 78 3.РЕЗУЛЬТАТЫ

3.1. ВЫБОР И ХАРАКТЕРИСТИКА АКТИВНЫХ ПСИХРОТРОФНЫХ 79 МИКРООРГАНИЗМОВ-ДЕСТРУКТОРОВ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ

3.1.1. Характеристика штаммов-деструкторов углеводородов нефти

3.1.2. Изучение взаимодействия микроорганизмов-деструкторов с нефтью с 85 помощью световой и электронной микроскопии

3.1.3. Идентификация и генотипирование штаммов-деструкторов нефти

3.1.4. Биодеструкция нефти исследованными микроорганизмами

3.1.5. Изменение фракционного состава нефти после биодеградации

3.2. СОСТАВЛЕНИЕ И ОТБОР АССОЦИАЦИЙ МИКРООРГАНИЗМОВ, 93 СПОСОБНЫХ К ДЕГРАДАЦИИ УГЛЕВОДОРОДОВ НЕФТИ ПРИ ПОНИЖЕННОЙ ТЕМПЕРАТУРЕ

3.2.1. Подбор ассоциации штаммов-деструкторов эмпирическим путём

3.2.2. Селекция ассоциации пггаммов-деструкторов в жидкой минеральной среде и 93 адсорбция нефти биодеградабельным сорбентом

3.2.3. Эффективность деградации нефти отселектированной и эмпирически 98 составленной ассоциацией и её адсорбции сорбентом

3.3. СТИМУЛЯЦИЯ МИКРОБНОЙ ДЕСТРУКЦИИ НЕФТИ В ПОЧВЕ ПУТЁМ 100 ВНЕСЕНИЯ БАКТЕРИАЛЬНОЙ АССОЦИАЦИИ И МИНЕРАЛЬНОГО УДОБРЕНИЯ В ЛАБОРАТОРНЫХ УСЛОВИЯХ

3.3.1. Динамика общей численности микроорганизмов и бактерий-деструкторов 101 нефти в модельной почве

3.3.2. Мониторинг интродуцированных штаммов-деструкторов углеводородов нефти

3.3.3. Динамика убыли нефти в почве

3.4. БИОРЕМЕДИАЦИЯ ПОЧВЫ, ЗАГРЯЗНЁННОЙ НЕФТЬЮ, В УСЛОВИЯХ 105 ПОЛЕВОГО ЭКСПЕРИМЕНТА

3.4.1. Изменение динамики численности микробной популяции в почве 105 •

3.4.2. Мониторинг интродуцированной микробной ассоциации

3.4.3. Убыль нефти

3.5. ПОЛЕВЫЕ ИСПЫТАНИЯ ОПЫТНОГО ОБРАЗЦА БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ 110 ОЧИСТКИ ПОЧВ ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЙ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ

3.6. ДЕПОНИРОВАНИЕ ШТАММОВ, ИЗУЧЕНИЕ ИХ ПАТОГЕННОСТИ, 112 ПАТЕНТОВАНИЕ АССОЦИАЦИИ И БИОПРЕПАРАТА ДЛЯ ОЧИСТКИ ПОЧВ

ОТ ЗАГРЯЗНЕНИЙ НЕФТЬЮ И НЕФТЕПРОДУКТАМИ

3.6.1. Депонирование штаммов

3.6.2. Изучение патогенности микроорганизмов

3.6.3. Патентование ассоциации и биопрепарата для очистки почв от загрязнений 113 нефтью и нефтепродуктами

4. ОБСУЖДЕНИЕ

ВЫВОДЫ

Введение Диссертация по биологии, на тему "Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами"

Среди многочисленных вредных веществ антропогенного происхождения, попадающих в окружающую среду, нефтепродуктам принадлежит одно из первых мест. По степени вредного влияния на экосистемы нефть, нефтепродукты и нефтесодержащие промышленные отходы занимают второе место после радиоактивного загрязнения (Черняховский и др., 2004). Работа автотранспорта и предприятий нефтеперерабатывающей и нефтехимической промышленности, газообразные выбросы и сточные воды промышленных предприятий, многочисленные разливы нефти и нефтепродуктов в результате аварий трубопроводов и нефтеналивных судов (танкеров), аварий и пожаров на нефтехранилищах и нефтеперегонных заводах приводят к загрязнению воздуха, воды и почвы значительными количествами сырой нефти и продуктов её переработки и создают серьёзную угрозу экологии регионов России (Ревелль и Ревелль, 1995).

В России большинство месторождений нефти расположено в северных регионах европейской части страны и Западной Сибири. Поэтому именно в регионах с холодным климатом часто происходит загрязнение нефтью наземных и водных экосистем. Потери нефти и нефтепродуктов в нашей стране при добыче, транспортировке, переработке и хранении, по официальным данным, оцениваются в 8-9 млн. тонн в год. Большая протяженность магистральных нефтепроводов (более 50 тыс км), объем 1 транспортированной по ним нефти (1,2 млрд м в год) являются причиной различных аварий, количество которых достигает 70000 в год. В местах освоения нефтегазовых месторождений в западносибирском регионе выявлено свыше 800 тыс га нефтезагрязненных земель. Если оценивать потери нефти в 1,5% от добычи, то они превысят 5 млн т ежегодно, а по мнению специалистов «Гринпис» аварийные потери нефти в России превышают 25 млн т ежегодно. Один грамм нефти делает непригодной для биоты 100 л воды, тонна нефти загрязняет 12 кв. км водной поверхности, а один литр нефти лишает кислорода 40 тыс л воды. При концентрации нефти в воде 0,1-0,01 мг/л икринки рыб погибают за несколько суток (Булатов и др., 1997).

Попадание нефти и её компонентов в окружающую среду вызывает изменение физических, химических и биологических свойств и характеристик природной среды обитания, нарушает ход естественных биохимических процессов. При трансформации углеводородов нефти могут образоваться стойкие к микробиологическому расщеплению и ещё более токсичные соединения, обладающие канцерогенными и мутагенными свойствами (Ревелль и Ревелль, 1995; Корте и др., 1997).

В России эта экологическая проблема имеет особое значение вследствие масштабов загрязнения, при которых экскавация почв и их восстановление ex situ (вне места загрязнения) невозможны. Основную роль в ремедиации in situ (на месте загрязнения) играет биологический фактор — активность микроорганизмов, участвующих в процессах утилизации и трансформации углеводородов нефти. Микробиологичекие методы являются неотъемлемым компонентом современной биотехнологии очистки окружающей среды от нефти и нефтепродуктов. Биоремедиация обеспечивает экономически выгодную, высокоспецифичную очистку, приводящую к уменьшению концентрации как отдельного загрязнителя, так и смеси поллютантов. Препятствиями в достижении этой цели являются низкая температура, повышенная концентрация соли, низкое содержание питательных веществ, отсутствие или низкая деградативная активность природных микробных популяций. Короткий летний период — основной лимитирующий фактор при биоремедиации в северных регионах. Поэтому в настоящее время большое внимание уделяется изучению процессов биоремедиации в регионах с холодным климатом. При разработке стратегий биоремедиации загрязненных территорий и акваторий необходимо учитывать существование аборигенных нефтеокисляющих микроорганизмов с разным сродством в отношении различных фракций нефти и возможность активации их метаболизма за счёт добавления биогенных элементов (источников азота, фосфора и калия). Внесение эффективных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти в почву совершенно необходимо в северных районах, где тёплый период года непродолжителен и природная микрофлора не успевает адаптироваться к изменяющимся условиям окружающей среды. Штаммы родов Acinetobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Brevibacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Pseudomonas, Rhodococcus, Serratia, Bacillus и некоторые другие бактерии обладают значительным деградативным потенциалом; показано, что они способны утилизировать устойчивые загрязнители и ксенобиотики. Эти микроорганизмы часто выделяют из нефтезагрязненных мест, культивируют и используют для очистки при разливах нефти. Необходимость очистки загрязненных почв и морских акваторий предполагает изучение разнообразия микроорганизмов данной среды обитания, способностей отдельных микроорганизмов и их ассоциаций к деградации различных поллютантов в присутствии повышенного содержания соли (Ventosa et al., 1998; Van Hamme et al., 2003). В последнее время в биоремедиации используют микробные ассоциации, состоящие из двух и более штаммов, поскольку интродукция монокультуры углеводородокисляющих микроорганизмов в нефтезагрязнённую среду не может полностью решить проблему очистки.

Разработка и совершенствование технологий биоремедиации, особенно почв, загрязнённых нефтью и нефтепродуктами, является областью прикладных исследований. Наиболее широкое распространение получили методы биоремедиации, основанные на активации аборигенной микробной популяции (биостимуляция) за счёт применения ряда агротехнических мероприятий (рыхление почвы, увлажнение, внесение удобрений), а также интродукции в место загрязнения специально отобранных микроорганизмов, активно утилизирующих загрязнитель (биоаугментация), что значительно ускоряет процессы восстановления почв (Градова и др., 2003).

В настоящее время большинство проводимых исследований посвящено влиянию нефтезагрязнения на изменение состава природных популяций микроорганизмов различных экологических ниш (Prince et al., 1997; Delille et al., 2002; Margesin et al., 2003; 2007). Работ, посвященных селекции микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при низких положительных температурах, крайне мало. В связи с этим особенно актуально исследование психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти и нефтепродуктов.

1. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов углеводородов нефти.

2. Составление микробных ассоциаций на основании комбинирования свойств микроорганизмов (психротрофность, галотолерантность, эмульгирующая способность), а также путём селекции в условиях периодического культивирования с нефтью в качестве субстрата.

4. Разработка метода мониторинга интродуцировапных в почву штаммов-деструкторов, с использованием культурально-морфологических признаков, маркеров антибиотикорезистентности и метода геномных фингерпринтов.

Научная новизна

Получена микробная ассоциация как основа биопрепарата для биоремедиации почв, загрязненных нефтью и нефтепродуктами. Впервые в её составе использованы психротрофные, галотолерантные микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти родов Rhodococcus и Pseudomonas, продуцирующие биоэмульгаторы. Кроме того, впервые в ассоциации для деструкции нефти присутствуют конъюгативные плазмиды биодеградации. Таким образом, они являются потенциальными донорами катаболических плазмид, которые за счёт горизонтального переноса могут расширять деградативный потенциал аборигенных почвенных микроорганизмов и ускорять биодеградацию углеводородов.

С помощью двух различных подходов - эмпирического на основании физиологических и метаболических характеристик штаммов и селекции микроорганизмов-деструкторов при периодическом культивировании с нефтью при пониженной температуре — составлены две микробные ассоциации, состоящие из четырёх штаммов, причём три из них являются одинаковыми для каждой ассоциации: Rhodococcus sp. Х5, Rhodococcus sp. S67, Pseudomonas sp. 142NF(pNF142). При периодическом культивировании в минеральной среде с добавлением нефти в качестве источника углерода и энергии при 4-6°С показана более высокая степень деструкции нефти отселектированной ассоциацией по сравнению с эмпирически составленной ассоциацией.

При проведении полевого эксперимента температура почвы изменялась в диапазоне от 0°С до 23°С, но несмотря на это численность интродуцированной микробной ассоциации оставалась на достаточно высоком уровне. Таким образом, тот факт, что интродуцированные микроорганизмы являются психротрофными (с диапазоном роста 2-32°С) привело к тому, что они выжили в почве в зимний период времени и процесс деградации нефти происходил даже в этот период времени, только с меньшей скоростью.

Научно-практическая значимость работы

На основании скрининга коллекции микроорганизмов лаборатории биологии плазмид ИБФМ им. Г.К. Скрябина РАН, способных к деградации различных углеводородов, отобраны и охарактеризованы активные психротрофные штаммы-деструкторы нефти и нефтепродуктов и на их основе составлена ассоциация как основа биопрепарата.

В условиях лабораторных и полевых экспериментов показана высокая эффективность применения созданной микробной ассоциации для очистки почвы от нефти и разработаны практические рекомендации по применению метода in situ для биоремедиации почв. В полевом эксперименте продемонстрирована способность микробной ассоциации к деградации нефти в широком температурном диапазоне. С помощью разработанного метода мониторинга впервые удалось проследить за судьбой интродуцированных микроорганизмов-деструкторов нефти в открытой окружающей среде.

При ликвидации нефтезагрязнений с водных поверхностей целесообразно сначала использовать плавучий и биодеградабельный сорбент, который способен адсорбировать до 95% нефти в течение 1 часа. Ассоциация психротрофных микроорганизмов может быть использована для деградации остаточного количества нефтепродуктов на водной поверхности после адсорбции нефти сорбентом.

Полученные в работе результаты по изучению био деградации нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами и их ассоциациями в модельных почвенных системах и открытой окружающей среде создают предпосылки для дальнейших более детальных исследований особенностей биодеградации углеводородов нефти при низких температурах.

Апробация работы

Материалы диссертации были представлены на 9-10-й школах-конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2005-2006), 2-ой Всероссийской научно-технической интернет-конференции «Современные проблемы экологии и безопасности» (Тула, 2006), Российской школе-конференции молодых ученых «Экотоксикология-современные биоаналитические системы, методы и технологии» (Тула -Пущино, 2006), I Всероссийской научно-практической конференции «Питательные среды и методы культивирования клеток для биологии, медицины и биоиндустрии: фундаментальные и прикладные аспекты» (Пущино, 2007), международных съездах и конференциях: 2nd-4th International Conference on «Science and Business» (Pushchino, 20052007), 8th International Семинар-Презентация инновационных научно-технических проектов «Biotechnology - 2005» (Pushchino, 2005), 13th International Biodeterioration and Biodegradation Symposium (Madrid, 2005), International Conference on Alpine and Polar Microbiology (Insbruck, 2006), International Conference on Environmental Biotechnology (Leipzig, 2006), 4Ш Moscow International Congress «Biotechnology: State of the Art and Prospects of Development» (Moscow, 2007), Thirtieth Arctic and Marine Oil Spill Technical Seminar (Edmonton, Canada, 2007), International Conference on Contamination Soil (Milan, Italy, 2008), III Международная конференция «Микробное разнообразие: состояние, стратегия сохранения, биотехнологический потенциал» (Пермь, 2008).

Публикации

По материалам диссертации опубликована 23 работы, в том числе 6 статей (из них 4 по списку ВАК), патент РФ №2312891, заявка на получение патента РФ на изобретение и 15 тезисов.

Структура и объем диссертации

Заключение Диссертация по теме "Биотехнология", Нечаева, Ирина Александровна

ВЫВОДЫ

2. Впервые в составе ассоциации, как основы биопрепарата, использованы психротрофные, галотолерантные микроорганизмы-деструкторы углеводородов нефти родов Rhodococcus и Pseudomonas, продуцирующие биоэмульгаторы, кроме того, псевдомонады несут в своём составе конъюгативные плазмиды биодеградации.

4. С помощью разработанного метода мониторинга впервые удалось проследить за судьбой интродуцированных микроорганизмов-деструкторов нефти в почве в открытой окружающей среде и показать их конкурентоспособность. Доля интродуцированных штаммов составляла до 78% от общей численности почвенных микроорганизмов-деструкторов. В полевом эксперименте в течение 12 месяцев продемонстрирована способность микробной ассоциации к деградации нефти в широком температурном диапазоне, при этом степень очистки почвы составила 49%.

5. Получен патент РФ №2312891 «Ассоциация штаммов бактерий, продуцирующих биоэмульгаторы, для деградации нефти и нефтепродуктов в почвах, пресной и морской воде». Подана заявка №2007125403 на изобретение «Биопрепарат для очистки почв от загрязнений нефтью и нефтепродуктами, способ его получения и применения». Эффективность опытного образца биопрепарата продемонстрирована в полевых испытаниях в Тульской области. Степень очистки почвы от нефтепродуктов составила 99,6% за один месяц.

136

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Нечаева, Ирина Александровна, Пущино

1. Алексеева Т.П., Бурмистрова Т.Н., Терещенко H.H., Стахина Л.Д., Панова И.И. Перспективы использования торфа для очистки нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2000. № 1. С. 58-64.

2. Ананько Г.Г., Пугачёв В.Г., Тотменина О.Д., Репин В.Е. Устойчивость нефтеокисляющих микроорганизмов к низким температурам // Биотехнология. 2005. № 5. С. 63-69.

3. Андреева И.С., Емельянова Е.К., Загребельный С.Н., Олькин С.Е., Резникова И.К., Репин В.Е. Психротолерантные штаммы-нефтедеструкторы для биремедиации почв и водной среды // Биотехнология. 2006. № 1. С. 43-52.

4. Арчегова И.Б. Рекомендации по рекультивации земель на Крайнем Севере / И.Б. Арчегова, Т.В. Евдокимова, Н.С. Котелина и др. // Рекультивация земель на Севере. Сыктывкар, 1997. Вып. 1. С. 34.

5. Барышникова Л.М., Грищенков В.Г., Аринбасаров М.У., Шкидченко А.Н., Воронин A.M. Биодеградация нефтепродуктов штаммами-деструкторами и их ассоциациями в жидкой среде // Прикл. биохимия и микробиология. 2001. Т. 37. №5. С. 542-548.

6. Белоусова Н.И., Барышникова Л.М., Шкидченко А.Н. Отбор микроорганизмов, способных к деструкции нефти и нефтепродуктов при пониженных температурах // Прикл. бихимияи микробиология. 2002. Т.38. № 5. С. 513-517.

7. Белоусова Н.И., Шкидченко А.Н. Деструкция нефтепродуктов различной степени конденсации микроорганизмами при пониженных температурах // Прикл. биохимия и микробиология. 2004. Т. 40. №3. С. 312-316.

8. Биотехнология защиты окружающей среды. Учебное пособие / Понаморёва О.Н., Решетилов А.Н., Решетилова Т.А., Шкидченко А.Н., Кошелева И.А., Иванова Е.С., Блохин И.В. Изд-во ТулГУ Тула, 2006. - 114 с.

9. Ю.Богомолов А.И., Гайле A.A., Громова В.В. и др. Химия нефти и газа: Учебное пособие для вузов. СПб: Химия, 1995. - 448 с.

10. Борзенков И.А., Милехина Е.И., Готоева М.Т., Розанова Е.П., Беляев С.С. Свойства углеводородокисляющих бактерий, изолированных из нефтяных месторождений Татарстана, Западной Сибири, Вьетнама//Микробиология. 2006. Т.75. №1. С.82-89.

11. Бузмаков С.А., Ладыгин И.В. К влиянию нефтепромыслов на растительный иживотный мир Камского Предуралья: Тез. докл. межгос. научн. конф. / Пермь. 1993. Ч. 1 С. 201-205.

12. Булатов А.И., Макаренко П.П., Шеметов В.Ю. Охрана окружающей среды в нефтегазовой промышленности. М.: Недра, 1997. 483 с.

13. Растительность земного шара: Эколого-физиологическая характеристика. Тундры, луга, степи, внетропические пустыни: Пер. с нем./Вальтер Г.; Ред. Т.А. Работнов. М.: Прогресс, 1975.- 428с.

14. Вадюнина А.Ф., Корчагина З.А. Методы определения физических свойств почв и грунтов. М.: Высшая школа, 1961.

15. Бельков В.В. Биоремедиация: принципы, проблемы, подходы // Биотехнология. 1995. № 3-4. С. 20-27.

16. Габбасова И.М., Сулейманов P.P., Бойко Т.Ф. Галимзянова Н.Ф. Использование биогенных добавок совместно с биопрепаратом «Деворойл» для рекультивации нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2002. №2. С. 57-65.

17. Гайнутдинов М.З., Самосова С.М., Артемьева Т.И., Гилязов М.Ю., Храмов И.Т., Гайсин И.А., Фильченкова В.И., Жеребцова А.К. Рекультивация нефтезагрязненных земель лесостепной зоны Татарии // Восст. нефтезагр. почв. экое. М.: Наука, 1988. С. 177-197.

18. Головлёв E.JI. Экологическая стратегия бактерий: специфика проблемы // Микробиология. 2001. Т. 70. № 4. с. 437-443.

19. Градова Н.Б., Горнова И.Б., Эддауди Р., Салина Р.Н. Использование бактерий рода Azotobacter при биоремедиации нефтезагрязненных почв // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. № 3. С. 318-321.

20. Грищенков В.Г., Шишмаков Д.А., Кошелева И.А., Воронин A.M. Рост бактерий-деструкторов нафталина и салицилата при пониженных температурах // Прикл. биохим. и микробиол. 2003. Т. 39. № 3. С. 322-328.

21. Демидиенко А.Я., Демурджан В.М. Пути восстановления нефтезагрязненных почв черноземной зоны Украины/ А.Я. Демиденко, В.М. Демурджан// Восст. нефтезагр. почв. экое. М.: Наука, 1988. С. 197-206.

22. Деткова E.H., Пушева М.А. Энергетический метаболизм галофильных и алкалофильных ацетогенных бактерий // Прикл. биохим. и микробиол. 2006. Т. 75. № 1.С. 5-17.

23. Дмитриев В.В., Файзутдинова Р.Н., Офицеров E.H., Фихте Б.А. Реиммобилизация чужеродных гидролаз у дрожжей в смешанных популяциях // Микробиология. 1993. Т.62. Вып. 5. С. 944-949.

24. Другов Ю.С., Родин A.A. Экологические анализы при разливах нефти и нефтепродуктов. Практическое руководство. М.: БИНОМ. Лаборатория знаний, 2007. - 270 с.

25. Жуков Д.В., Мурыгина В.П., Калюжный C.B. Механизмы деградации углеводородов нефти микроорганизмами // Прикл. биохим. и микробиол. 2006. Т. 126. № 3. С. 285-296.

26. Звягинцева И.С., Суровцева Э.Г., Поглазова М.Н., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Деградация нефтяных масел нокардиоподобными бактериями // Прикл. биохим. и микробиол. 2001а. Т. 70. № 3. С. 321-328.

27. Звягинцева И.С., Поглазова М.Н., Готоева М.Т., Беляев С.С. Влияние солёности среды на деструкцию нефтяных масел нокардиоподобными бактериями // Прикл. биохим. и микробиол. 20016. Т. 70. № 6. С. 759-764.

28. Зимон А.Д., Лещенко Н.Ф. Коллоидная химия. М.: Агар, 2001. 320 с.

29. Ившина И.Б., Пшеничков P.A., Оборонин A.A. Пропанокисляющие родококки. -Свердловск: УНЦ АН СССР, 1987. 125 с.

30. Изъюрова А.И. Скорость распада нефтепродуктов в воде и почве // Гигиена и санитария. 1950. № 9. С. 9-15.

31. Исмаилов Н.М. Микробиология и ферментативная активность нефтезагрязненных почв//Восст. нефтезагр. почв. экое. М.: Наука, 1988. С. 42-57.

32. Калюжный C.B. Биотехнология защиты окружающей среды: единство биокаталитических и инженерных подходов // Известия академии наук. Серия химическая. 2001. №10. С. 1735-1742.

33. Кашнер Д. Жизнь микробов в экстремальных условиях. М.: Мир, 1981. - 520 с.

34. Кобзев E.H. Биодеструкция нефти и нефтепродуктов микробными ассоциациями в модельных системах. Дис. канд. биол. наук. 2003. Оболенск. 179 с.

35. Козлова Г.М., Медведева Г.А., Мейсель М.Н., Рылкин С.С., Шульга A.B. Непосредственное обнаружение прохождения н-парафина через клеточную стенку дрожжей // Микробиология. 1973. Т. 42. № 5. С. 937 939.

36. Коронелли Т.В. Микробиологическая деградация углеводородов и ее экологические последствия // Биологические науки. 1982в. №3. С. 5-12.

37. Коронелли Т.В. 1984. Липиды микобактерий и родственных микроорганизмов. М.:1. Из-во МГУ. 413 с.

38. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Коротаева Е.В. Выживаемость углеводородокисляющих бактерий в условиях полного голодания // Микробиология. 19886. Т. 57. № 2. С. 298 302.

39. Коронелли Т.В., Дермичева С.Г., Ильинский В.В., Комарова Т.И., Поршнева О.В. Видовая структура углеводородокисляющих бактериоценозов водных экосистем разных климатических зон // Микробиология. 1994. Т. 63. № 5. С. 917-923.

40. Коронелли Т.В. Принципы и методы интенсификации биологического разрушения углеводородов в окружающей среде // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. № 6. С. 579-585.

41. Корте Ф., Бахадир М., Клайн В., Лай Я. П., Парлар Г., Шойнерт И. Экологическая химия. Основы и концепции. М.: Мир, 1997, с. 396.

42. Кочетков В.В. Плазмиды биодеградации нафталина у бактерий рода Pseudomonas. II Дисс. канд. биол. наук. Пущино, 1985.

43. Красильников H.A., Степанова Л.Н., Коронелли Т.В., Дуда В.И. О новом виде парафинокисляющих микобактерий // Микробиология. 1971. Т. 40. № 6. С. 1040 -1045.

44. Кузнецов А.Е., Градова Н.Б. Научные основы экобиотехнологии / Учебное пособие для студентов. М.: Мир, 2006. - 504 с.

45. Кузнецов В.Д., Зайцева Т.А., Вакуленко Л.В., Филиппова С.Н. Streptomyces albiaxalis sp. nov. : новый деструктор углеводородов нефти тером- и галотолерантного вида Streptomyces //Микробиология. 1992. Т. 61. С. 62-67.

46. Куличевская Й.С., Милёхина Е.И., Борзенков И.А., Звягинцева И.С., Беляев С.С. Окисление углеводородов нефти экстремально галофильными архебактериями // Микробиология. 1992. Т. 60. С. 596-601.

47. Логинов О.Н., Нуртдинова Л.А., Бойко Т.Ф., Четвериков С.П., Силищев H.H. Оценка эффективности нового биопрепарата Ленойл для ремедиации нефтезагрязненных почв // Биотехнология. 2004. № 1. С. 77-82.

48. Малахов A.A., Гирич И.Е., Нечитайло Т.Ю., Карасева Э.В. Роль нефтеокисляющей микрофлоры в биоремедиации почв и почвогрунтов, загрязненных нефтью. Экология 2000: Эстафета поколений. I Международная школа-семинар по экологии. 2000. С. 23 24.

49. Маркарова М. Опыт применения биопрепарата «Универсал» для рекультивации нефтезагрязненных земель // Вестник Института биологии Коми НЦТУрО РАН. 2004. Вып. 84.

50. Оборин A.A., Калачникова И.Г., Масливец Т.А., Базенкова Е.И., Плещева О.В., Оглоблина А.И. // Восстановление нефтезагрязнённых почвенных экосистем. — М.: Наука, 1988. С. 140-159.

51. Петров A.A. Углеводороды нефти. М.: Наука, 1984. - 264 с.

52. Плешакова Е.В., Позднякова H.H., Турковская О.В. Получение нефтеокисляющего биопрепарата путём стимуляции аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры // Прикл. биохим. и микробиол. 2005. Т. 41. № 6. С. 634-639.

53. Пиковская Ю.И. Природные и техногенные потоки углеводородов в окружающей среде. -М.: Изд-во МГУ, 1993.

54. ПНД Ф 16.1.21-98. Количественный химический анализ почв. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в пробах почв на анализаторе жидкости «Флюорат-02». М., 1998.

55. Практикум по микробиологии: Учеб. Пособие для студ. высш. учеб. заведений / Под ред. Нетрусова А.И. М.: Издательский центр «Академия», 2005. - 608 с.

56. Пырченкова И.А., Гафаров А.Б., Пунтус И.Ф., Филонов А.Е., Воронин A.M. Выбор и характеристика активных психротрофных микроорганизмов-деструкторов нефти // Прикл. биохимия и микробиология. 2006. Т. 42. №3. С. 298-305.

57. Ревелль П., Ревелль Ч. Среда нашего обитания. Загрязнение воды и воздуха. М.: Мир, 1995, с. 296.

58. Скрябин Г.К., Головлёва JI.A. Использование микроорганизмов в органическом синтезе. М.: Наука, 1976. - 336 с.

59. Стабникова Е.В., Селезнева М.В., Дульгенов А.Н., Иванов В.М. Применение препарата "Лестран" для очистки почвы от углеводородов нефти // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. № 2. С. 219-223.

60. Стадницкий Г.В. Экология: Учеб. Пособие / Г.В. Стадницкий, А.И. Радионов. М.: Высш. шк., 1988. 272 с.

61. Степаненко Б.Н. Курс органической химии: Учеб. пособие/ Б.Н. Степаненко. М.: Высш. шк., 1974.440 с.

62. Суровцева Э.Г., Ивойлов B.C., Беляев С.С. Разрушение ароматической фракции нефти ассоциацией грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов // Микробиология. 1997. Т. 66. № 1. С. 78-83.

63. Фомченков В.М., Холоденко В.П., Ирхина И.А., Петрунина Т.А. Влияние загрязнения водной среды нефтью и нефтепродуктами на барьерные свойства цитоплазматических мембран бактериальных клеток // Микробиология. 1998. Т. 67. № 3. С. 333-337.

64. Штина Э.А., Некрасова К. А. Водоросли загрязненных нефтью почв: состояние вопроса и задачи исследования / Э.А. Штина, К.А. Некрасова // Восст. нефтезагр. почв. экое. М.: Наука, 1988. С. 57-81.

65. Ягафарова Г.Г., Скворцова И.И. Новый нефтеокисляющий штамм бактерий Rhodoccocus erythropolis // Прикл. биохим. и микробиол. 1996. Т. 32. № 2. С. 224227.

66. Ягафарова Г.Г., Сафаров А.Х., Ильина Е.Г., Ягафаров И.Р., Барахнина В.Б., Сухаревич М.Э. Влияние продуктов окисления керогенов сланцев на биодеструкцию нефти и нефтепродуктов в почве и воде // Прикл. биохим. и микробиол. 2002. Т. 38. № 5. С. 518-522.

67. Aislabie J., McLeod M., Fraser R. Potential for biodégradation of hydrocarbons in soil from the Ross Dependency, Antarctica // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1998. V. 49. P. 210-214.

68. Aislabie J., Foght J., Saul D. Aromatic hydrocarbon-degrading bacteria from soil near Scott Base, Antarctica // Polar. Biol. 2000. V. 23. P. 183-188.

69. Alexander В., Leach S., Ingledew W.J. The relationship between chemiosmotic parameters and sensitivity to anions and organic acids in the acidophile Thiobacillus ferrooxidans. J. Gen. Microbiol. 1987. V. 133. P. 1171-1179

70. Alva V. A., Peyton В. M. Phenol and catechol biodégradation by the haloalkaliphile Halomonas campisalis: influence of pH and salinity // Environ Sci. Technol. 2003. V. 37. №19. P. 4397-402.

71. Atlas R.M. Microbial degradation of petroleum hydrocarbons. An environmental perspective // Microbiol. Reviews. 1981. №45. P. 180-209.

72. Atlas R.M. Bioremediation of petroleum pollutants // International Biodeterioration and Biodégradation. 1995. P. 317-327.

73. Baird C. Polynuclear Aromatic Hydrocarbons (PAHs). In: Environmental chemistry. University of Western Ontario. W.N. Freeman and Company. New York. 1995. P. 272274.

74. Bakermans C. Genetic approaches to determining psychrotolerance mechanisms // 108-th General Meeting, ASM, Toronto, Canada. 2007. P. 56.

75. Balba M.T., Al-Daher R., Al-Awadhi N., Chino T., Tsuji H. Bioremediation of oil-contaminated desert soil: the Kuwaiti experience // Environ. Int. 1998. V. 24. P. 163-173

76. Barkay T., Navon-Veneria S., Ron E.Z., Rosenberg E. Enhancement of solubilisation and biodégradation of polyaromatic hydrocarbons by the bioemulsifier alas an // Appl. environ. Microbiol. 1999. V. 65. P. 2697-2702.

77. Bento F.M., Camargo F.A., Okeke B.C., Frankenberger W.T. Comparative bioremediation of soils contaminated with diesel oil by natural attenuation, biostimulation and bioaugmentation // Bioresour Technol. 2005. V. 96. №9. P. 1049-1055.

78. Bertrand J.-C., Bonin P., Goutx M., Gauthier M., Mille G. The potential application of biosurfactants in combatting hydrocarbon pollution in marine environments // Bioremediation: Scientific and Technological Issues. 1994. P. 53-56.

79. Braddock J.F., Ruth M.L., Walworth J.L., McCarthy K.A. Enhancement and inhibition of microbial activity in hydrocarbon-contaminated arctic soils: implications for nutrient-amended bioremediation//Environ. Sci. Technol. 1997. V. 31. P. 2078-2084.

80. Bragg J.R., Prince R.C., Wilkinson J.B., Atlas R.M. Bioremediation for shoreline cleanup in Alaska // Exxon research and engineering company, Florham Park, NJ. 1994.

81. Brakstad O.G., Bonaunet K., Nordtug T., Johansen O. Biotransformation and dissolution of petroleum hydrocarbons in natural flowing seawater at low temperature // Biodégradation. 2004. V. 15. P. 337-346.

82. Brakstad O.G., Bonaunet K. Biodégradation of petroleum hydrocarbons in seawater at low temperatures (0-5°C) and bacterial communities associated with degradation //

83. Biodégradation. 2006. V. 17. P. 71-82.

84. Carberry J.B., Wik J. Comparison of ex situ and in situ bioremediation of unsaturated soils contaminated by petroleum // J. Environ. Sci. Health A Tox. Hazard. Subst. Environ. Eng. 2001. V. 36. № 8. P. 1491-503.

85. Cerniglia C.E. Microbial Metabolism of Polycyclic Aromatic Hydrocarbons // Laskin A (Ed) Advances in Applied Microbiology. Academic Press. New York. 1984. V. 30. P.31-37.

86. Chuvilin E.M., Naletova N.S., Miklyaeva E.C., Kozlova E.V. Factors affecting spreadibility and trasportation of oil in regions of frozen ground // Polar Rec. 2001. V. 37. P. 229-238.

87. Cirigliano M.C., Carman G.M. Isolation of bioemulsifier from Candida lipolitica // Appl. And Environ. Microbiol. 1984. P. 747-750.

88. Cooper D.G. and Goldenberg B. G. Surface-active agents from two Bacillus species // Appl. Environ. Microbiol. 1987. V.53. P. 224-229.

89. Coulon F., Pelletier E., Gourhant L., Delille D. Effects of nutrient and temperature on degradation of petroleum hydrocarbons in contaminated sub-Antarctic soil // Chemosphere. 2005. V. 58. P. 1439-1448.

90. Davies J.I. and Evans W.C. Oxidative metabolism of naphthalene by soil Pseudomonads: the ring-fission mechanism // Biochem. J. 1964. V.91. P.251 -261.

91. Delille D., Basseres A„ Dessommess A. Effectiveness of bioremediation for oil-pollutted Antarctic seawater // Polar Biol. 1998. V. 19. P. 237-241.

92. Delille D. Response of Antarctic soil bacrerial assemblages to contamination by diesel fuel and crude oil // Microb. Ecol. 2000. V. 40. P. 159-168.

93. Delille D., Delille D. Field observations on the variability of crude oil impact in indigenous hydrocarbon-degrading bacteria from sub-Antarctic intertidal sediments // Mar. Environ. Res. 2000. V. 49. P. 403-417.

94. Delille D., Delille B., Pelletier E. Effectiveness of bioremediation of crude oil contaminated subantarctic intertidal sediment: the microbial response // Microb. Ecol. 2002. V.44. № 2. P. 118-126.

95. Delille D., Coulon F., Pelletier E. Biostimulation of narural microbial assemblages in oil-amended vegetated and desert sub-antarctic soils // Microb. Ecol. 2004. V. 47. P. 407

96. Delille D., Pelletier E., Coulon F. The influence of temperature on bacterial assemblages during bioremediation of a diesel fuel contaminated subAntarctic soil // Cold Regions Science and Technology. 2007. V. 48. P. 74-83.

97. Delille D. and Coulon F. Comparative mesocosm study of biostimulation efficiency in two different oil-amended sub-Antarctic soils // Microb. Ecol. 2007. V. 9. P. 1-10.

98. Deppe U., Richnow H.H., Michaelis W., Antranikian G. Degradation of crude oil by an arctic microbial consortium // Extremophiles. 2005. V.9. №6. P.461-470.

99. Desai J.D., Desai A.J. Production of biosurfactants. 1993. P.65-97. In N.Kosaric (ed.), Biosurfactants: production, properties, applications. Marcel Dekker, Inc., New York, N.Y.

100. Desai D.J., Banat I.M. Microbial production of surfactants and their commercial potential//Microbiology and molecular biology reviews. 1997. V.61. P.47-64.

101. Dombek P.E., Jonson L.K., Zimmrley S.T., Sadowsky M. J. // Appl. and Environ. Microbiol. 2000. V. 66. № 6. P. 2572-2577.

102. Dutta K.T. and Harayama S. Fate of crude oil by the combination of photooxidation and biodégradation//Environ. Sci. Technol. 2000. V. 34. P. 1500-1505.

103. Eriksson M., Ka J.O., Mohn W.W. Effects of low temperature and freeze-thaw cycles on hydrocarbon biodégradation in Arctic tundra soil // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. P. 5107-5112.

104. Evans CGT, Herbert D, Tempest DW. The continuous cultivation of microorganisms: II. Construction of a chemostas // Methods Microbio. 1970. V.2. P. 277 327.

105. Fedorak P.M., Payzant J.D., Montgomery D.S., Westlake D.W.S. Microbial degradation of n-alkyl tetrahydrothiophenes found in petroleum // Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 1243-1248.

106. Ferguson S.H., Franzmann P.D., Snape I., Revil A.T., Trefry M.G., Zappia L.R. Effects of tempersture on mineralisation of petroleum in contaminated Antarctic terrestrialsediments. //Chemosphere. 2003. V52. P. 975-987.

107. Filonov A.E., Puntus I.F., Karpov A.V., Gaiazov R.R., Kosheleva I.A., Boronin A.M. Growth and survial of Pseudomonas putida strains degrading naphthalene in soil model systems with different moisture levels // Process Biochem. 1999. V. 34. P. 303-308.

108. Forsyth J.V., Tsao Y.M., Blem R.D. Bioremediation: when is augmentation needed? // In Hinchee R.E. et al. (eds) Bioaugmentation for site remediation. Battelle Press, Columbus, OH. 1995. P. 1-14.

109. Francy D., Thomas J., Raymond R., Ward C. // J. Industrial Microbiol. 1991. V. 8. № 3. P. 237-246.

110. Frassinetti S., Setti L., Corti A., Farinelli P., Montevecchi P., Vallini G. Biodégradation of dibenzothiophene by a nodulating isolate of Rhizobium meliloti II Can. J. Microbiol. 1998. V. 48. P. 289-297.

111. Gallego J.L., Loredo J., Llamas J.F., Vázquez F., Sánchez J. Bioremediation of diesel-contaminated soils: evalution of potential in situ techniques by study of bacterial degradation//Biodégradation. 2001. V. 12. №5. P. 325-335.

112. Gerday C. and Glansdorff N. Physiology and biochemistry of extremophiles // ASM Press. Washington D.C. USA. 2007.

113. Gibson D.T., Koch J.R. and Kallio R.E. Oxidative degradation of aromatic hydrocarbons by microorganisms. I. Enzymatic formation of catechol from benzene // Biochemistry. 1968. V. 7. P. 2653-2661.

114. Gibson D.T., Subramanian V. Microbial degradation of aromatic hydrocarbons. In: Gibson D.T. (ed) Microbial degradation to organic compounds. Marcel Dekker Inc, New York, p. 181-252.

115. Goldstein R.M., Mallory L.M., Alexander M. Reasons for possible failure of inoculation to enhance biodégradation // Appl. And Environ. Microbiol. 1985. V. 50. P. 977-983.

116. Hambrick G.A., DeLaune R.D., Patrick W.H. Effect of estuarine sediment pH and oxidation-reduction potential on microbial hydrocarbon degradation // Appl. Environ. Microbiol. 1980. V. 40. P. 365-369

117. Hart S. In situ bioremediation: defining the limites // Environ. Sci. and Technol. 1996. V. 30. № 9. P. 398A-401A.

118. Heitkamp A.M., Freeman J.P., Miller D.W., Cerniglia E.C. Pyrene degradation by Mycobacterium sp.: identification of ring oxidation and ring fission products // Appl. Environ. Microbiol. 1988. V. 54. P. 2556-2565.

119. Herrick J.B., Stuart-Keil K.G., Ghiorse W.C., Madsen E.L. Natural horizontal transfer of a naphtalene dioxygenase gene between bacteria native to a coal tar-cotaminated field site // Appl. Environ. Microbiol. 1997. V. 63. № 6. P. 2330-2337.

120. Hoff R. Bioremediation: an overview of its development and use for oil spill cleanup // Marine Pollution Bulletin. 1993. V. 26. №9. P. 476-481.

121. Huesemann M. H. Predictive model for estimating the extent of petroleum hydrocarbon biodégradation in contaminated soils // Environ. Sci. Technol. 1995. № 29. P. 7-18.

122. Jackson W.A., Pardue J.H. Potential for enhancement of biodégradation of crude oil in Louisiana salt marshes using nutrient amendments // Water Air Soil Pollut. 1997. V. 109. P. 343-355.

123. Kampfer P., Steiof M., Becker P.M. Characterization of chemoheterotrophic bacteria associated with the in situ bioremediation of waste oil contaminated site // Microbial Ecology. 1993. V. 26. № 2. P. 161-188.

124. Kato T., Haruki M., Imanaka T., Morikawa M., Kanaya S. Isolation and characterization of psychrotrophic bacteria from oil-reservoir water and oil sands // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 55. P. 794-800.

125. Kazunga Ch. and Aitken D.M. Products from the incomplete metabolism of pyrene by polycyclic aromatic hydrocarbon-degrading bacteria // Appl. Environ. Microbiol. 2000. V. 66. P. 1919-1922.

126. Khan N.Y., Al-Ajmi D. Post-war imperatives for the sustainable management of the Gulf ecosystem // Environ. Int. 2001. V. 24. P. 239-248

127. King E., Ward M., Raney D. Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin // J. Lab. Clin. Med. 1954. V. 44. № 2. P. 301-307.

128. Leahy J.G. and Colwell R.R. Microbial degradation of hydrocarbons in the environment // Microbial Reviews. 1990. V. 53. №3. P. 305-315.

129. Lee J.G. and Levy E.M. Enhancement of the natural biodégradation of condensate and crude oil on beaches of Atlantic Canada // Proceeding of 1989 oil spill conference. American Petroleum Institute, Washington DC. 1989. P. 479-486.

130. Lee K., Trembley G.H., Cobanli S.E. Bioremediation of oiled beach sediments: assessment of inorganic and organic fertilizers // Proceeding of 1995 International oil spill conference. American Petroleum Institute, Washington DC. 1995. P. 107-113.

131. Lee K. and Trembley G.H. Bioremediation: application of slow-release fertilizers on low energy shorelines // Proceeding of 2003 oil spill conference. American Petroleum Institute, Washington DC. 2003. P. 449-454.

132. Le Floch S., MerlinF.X., Guillerme M., Tozzolino P., Ballerini D., Dalmazzone C., Lundh T. Bioren: recent experiment on oil polluted shoreline in temperate climate // In: In-Situ and On-Site Bioremediation. 1997. V. 4. P. 411-417.

133. Le Floch S., MerlinF.X., Guillerme M., Dalmazzone C., Le Corre P. A field experimentation on bioremediation: Bioren. // Environ. Technol. 1999. V. 20. P. 897-907.

134. Lin Q., Mendelssohn I.A., Henry C.B., Roberts P.O., Walsh M.M., Overton E.B., Portier R.J. Effects of bioremediation on oil degradation in mineral and sandy salt marsh sediments // Environ. Tchnol. 2005. V. 20. P. 825-837.

135. Lufit J.H. Fine structure of capillary and endocapillary layer as revealed by ruthenium red // Feder. Proc. 1966. V.25. P.1773-1783.

136. Maneerat S. and Dikit P. Characterization of cell-associated bioemulsifier from Myroides sp. SMI, a marine bacterium // J. Sci. Technol. 2007. V. 29. №3. P. 769-779.

137. Marchesi J.R., Sato T., Weightman A.J. Design and evaluation of useful bacterium-specific PCR primers that amplify genes coding for bacterial 16S rRNA // Applied And Environ. Microbiol. 1998. V. 64, №2. P. 795-799.

138. Margesin R., Shinner F. Cold-adapted organisms, (eds). Springer, Berlin Heidelberg New York. 1999a.

139. Margesin R., Shinner F. Biological decontamination of oil spills in cold environments // J. Chem. Technol. Biotechnol. 1999b. V. 74. P. 381-389.

140. Margesin R. Potential of cold-adapted microorganisms for bioremediation of oil-polluted alpine soils // Int. Biodeter. Biodegr. 2000. V. 46. P. 3-10.

141. Margesin R. and Schinner F. Bioremediation (natural attenuation and biostimulation) of diesl-oil-contaminated soil in an alpine glacier skiing area // Appl. Environ. Microbiol. 2001. V. 67. № 7. P. 3127-3133.

142. Margesin R., Feller G., Gerday C., Russell NJ. Cold-adapted microorganisms: adaptation strategies and biotechnological potential. In: Bitton G (ed) The encyclopedia ofenvironmental microbiology. Wiley, New York. 2002. V. 2. P. 871-885.

143. Margesin R., Labbe D., Schinner F., Greer C., Whyte L. Characterization of hydrocarbon-degrading microbial populations in contaminated and pristine alpine soils // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69. № 3. P. 3085-3092.

144. Margesin R., Hammerle M., Tscherko D. Microbial activity and community composition during bioremediation of diesel-oil-contaminated soil: effects of hydrocarbon concentration, fertilizers, and incubation time // Microb. Ecol. 2007. V. 53. P. 259-269.

145. Margesin R., Schinner F., Marx J.C., Gerday C. Psychrophiles: from biodiversity to biotechnology // Eds. Springer Verlag, Berlin Heidelberg. 2008. P. 245-278.

146. Michaud L., Lo Giudice A., Saitta M., De Domenico M., Bruni V. The biodégradation efficiency on diesel oil by two psychrotrophic Antarctic marine bacteria during a two-month-long experiment // Mar. Pollut. Bull. 2004. V. 49. № 5-6. P. 405-409.

147. Marquez-Rocha F.J., Hernandez-Rodriguez V., Teresa Lamela M. Biodégradation of diesel oil in soil by a microbial consortium // Water, Air, and Soil Poll. 2001. V. 128. P. 313-320.

148. McFarland M.J., Qiu X.L., Sims J.L. Remediation of petroleum impacted soils in fungal compost bioreactors // Water Sci. Technol. 1992. V. 25. № 3. P. 197-206.

149. McMeekin, T. A., P. D. Nichols, S. D. Nichols. A. Juhasz, and P. D. Franzmann. Biology and biotechnological potential of halotolerant bacteria from Antarctic saline lakes //Experientia. 1993. V. 49. P. 1042-1046.

150. Mille G., Almallah M., Bianchi M., Wambeke F. van., Bertrand J.C. Effects of salinity on petroleum biodégradation // Fresenius J. Anal. Chem. 1991. V. 339. P. 788-791.

151. Mitra-Kirtly S., Mullins C.O., Elp J.V., GeorgJ.S., Chen J., Cramer P.S. Determination of the nitrogen chemical structures in petroleum asphaltenes using XANES spectroscopy //J. Am. Chem. Soc. 1993. V.115. P. 252-258.

152. Mishra S., Jyot J., Kuhad, R., and Lai B. Evaluation of inoculum addition to stimulate in situ bioremediation of oily sludge contaminated soil // Applied and Environmental Microbiology. 2001. V.67. P.1675-1682.

153. Mohn W.W., Stewart G.R. Limiting factors for hydrocarbon biodégradation at low temperature in Arctic soils // So.il Boilogy&Biochemistry. 2000. V. 32. P. 1161-1172.

154. Mohn W.W., Radziminski C.Z., Fortin M.C., Reimer K.J. On site bioremediation of hydrocarbons-contaminated Arctic tundra soils in inoculated biopiles // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 57. P. 242-247.

155. Morgan P. and Watkinson R.J. Biodégradation of components of petroleum // In C. Ratledge (eds). Biochemistry of microbial degradation. Kluwer Academic Publisher, The

156. Netherlands. 1994. P. 1-31.

157. Morita R.Y. Psychrophilie bacteria // Bacterid. Rev. 1975. V. 39. P. 144-167.

158. Muller R., Antranikian G., Maloney S., Sharp R. Thermophilic degradation of environmental pollutants. In: Antranikian G. (eds) Biotechnology of extremophiles. 1998. Springer, Berlin Heidelberg New York, pp. 155-169

159. Murygina V., Arinbasarov M., Kalyuzhnyi S. Bioremediation of oil polluted aquatic systems and soils with novel preparation «Rhoder» // Biodégradation. 2000. V. 11. P. 385389.

160. Murygina V., Markarova M., Kalyuzhnyi S. Application preparation «Rhoder» for remediation of oil polluted polar marshy wetlands in Komi Republic // Environment International. 2005. V. 31. P. 163-166.

161. Nichols W.J. The U.S. Environmental Protect Agency: national oil and hazardous substances pollution contingency plan // Proceeding of 2001 oil spill conference. American Petroleum Institute, Washington DC. 2001. P. 1479-1483.

162. Oren A., Gurevich P., Azachi M., Hents Y. Microbial degradation of pollutants at high salt concentrations // Biodégradation. 1992. V. 3. P. 387-398.

163. Pineda-Fores G. and Mesta-Howard A.M. Petroleum asphaltenes: generated problematic and possible biodégradation mechanisms // Rev. Latinoam. Microbiol. 2001. V.43. №3. P. 143-150.

164. Plaza G.A., Ulfig K., Brigmon R.L. Surface active properties of bacterial strains isolated from petroleum hydrocarbon-bioremediated soil // Pol. Journal Microbiol. 2005. V. 52. №2. P. 161-167.

165. Prince R., Bragg J. Shoreline bioremediation following the Exxon Valdez oil spill in Alaska // Bioremed. J. 1997. V.l. P. 97-104.

166. Radwan S.S., Al-Awadhi H., Sorkhoh N.A., El-Nemr I.M. Rhizospheric hydrocarbon-utilizing microorganisms as potential contributors to phytoremediation for the oily Kuwaiti desert // Microbiol. Res. 1998. V. 153. P. 247-251

167. Radwan S.S., Al-Mailem D., EI-Nemr I., Salamah S. Enhanced remediation of hydrocarbon contaminated desert soil fertilized with organic carbons // Int. Biodeterior. Biodegrad. 2000. V. 46. P. 129-132

168. Reynolds M.D. and Friedell G.H. Further observations on tumor extracts causinghemolysis in vitro // Proc Soc Exp Biol Med. 1963. V.l 14. P.798-801.

169. Rhykerd R.L., Weaver R.W., Mclnnes K.J. Influence of salinity on bioremediation of oil in siol // Environ. Pollut. 1995. V. 90. P. 127-130.

170. Richmond S.A., Lindstrom J.E., Braddock J.F. Effects of chitin on microbial emulsification, mineralization potential, and toxicity of Bunker C oil // Mar. Pollut. Bull. 2001. V. 42. P. 773-779.

171. Rogel E. Theorical estimation of the solubility parameter distribution of asphaltenes, resins and oil from crude oils and related materials // Energ. Fuel. 1997. V. 11. P. 920-925.

172. Romano, I., B. Nicolaus, L. Lama, M. C. Manca, and A. Gambacorta. Characterization of a haloalkalophilic strictly aerobic bacterium, isolated from Pantelleria island // Syst. Appl. Microbiol. 1996. V. 19. P. 326-333.

173. Ron E.Z., Rosenberg E. High- and low-molecular-mass microbial surfactants // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2001. V. 52. P. 154-162.

174. Rouviere P.E. and Chen M.W. Isolation of Brachymonas petroleovorans CHX, a novel cyclohexane-degrading beta-proteobacterium // FEMS Microbiol Lett. 2003. V.227. №1. P.101-106.

175. Sambrook J., Fernley H., Maniatis T. Molecular Cloning: a Laboratory Manual. / 2nd ed. N.Y.: Cold Spring Harbor, 1989. P. 480.

176. Sanseverino J., Applegate B.M., King J.M.H., Sayler G.S. Plasmid-mediated mineralisation of naphtalene, phenanthrene and untracene // Appl. Environ. Microbiol. 1993. V. 59. P. 1931-1937.

177. Seklemenova E., Pavlova A., Kovacheva K. Biostimulation-based bioremediation of diesel fuel: field demonstration // Biodégradation. 2001. V.12. P. 311-316.

178. Sendstad E. Accelerated biodégradation of crude oil on Antarctic shorelines // Proceeding of the third arctic and marine oil spill program technical seminar, Ottawa, Canada. 1980. P. 1-8.

179. Schneider J., Grosser J.R., Jayasimhulu K., Xue W., Kinkle B., Warshawsky D. // Biodégradation of carbazole by Ralstonia sp. RJGII isolated from a hydrocarbon contaminated soil // Can. J. Microbiol. 2000. V. 46. P. 269-277.

180. Simon M., Autenrieth R.L., McDonald T.J., Bonner J.S. Evalution of bioaugmentation for remediation of petroleum in a wetland // Proceeding of 1999 International oil spill conference. American Petroleum Institute, Washington DC. 1999. P. 1279-1293.

181. Sims J.L., Sims R.N., Matthews J.E. Appoach to bioremediation of contaminated soil // Haz. Waste Haz. Matter. 1990. V. 7. P.l 17-149.

182. Shukla O.P. Biodégradation for environmental management // Everyman's Sci. 1990. V.25. №2. P. 46-50.

183. Shuttleworth K.L., Cerniglia C.E. Bacterial Degradation of Low Concentration of Phenanthtrene and Inhibition by Naphthalene // Microb. Ecol. 1996. V. 31. P. 305-317.

184. Sikkema J., De Bout J.A.M., Poolman B. Mechanisms of membrane toxicity of hydrocarbons // Microbiol. Rev .1995. V. 59. № 2. P. 201-222.

185. Siron R., Pelletier E„ Brochu C. Environmental factors influencing the biodégradation of petroleum hydrocarbons in cold seawater // Arch. Env. 1995. V.2. P.7-10.

186. Smith R.M. The physiology of aromatic hydrocarbon degrading bacteria // In C. Ratledge (eds). Biochemistry of microbial degradation. Kluvver Academic Publisher, The Netherlands. 1994. P. 365-367.

187. Soloway D.A., Nahir M., Billowits M.E., Whyte L.G. In situ bioremediation of diesel-contaminated soil in Canada Arctic territory // Polar Rec. 2001. V. 37. P. 267-272.

188. Sorkhoh N.A., Ibrahim A.S., Ghannoum M.A., Radwan S.S High-temperature hydrocarbon degradation by Bacillus strearothermophilis from oil-polluted Kuwait desert // Appl. Microbiol. Biotechnol. 1993. V. 39. P. 123-126

189. Speight J.G. and Moschopedis S.E. On the molecular nature of petroleum asphaltenes // In Bunger J.W. and Li N.C. (eds). Chemistry of asphaltenes. American Chemical Society, Washington D.C. 1981. P. 1-15.

190. Stallwood B., Shears J., Williams P.A., Hugues K.A. Low temperature bioremediation of oil-contaminated soil using biostimulation and bioaugmentation with Psendomonas sp. from maritime Antarctica // J. Appl. Microbiol. 2005. V. 99. P. 794-802.

191. Stapleton R.D., Savage D.C., Sayler G.S., Stacey G. Biodégradation of aromatic hydrocarbons in a extremely acidic environment // Appl. Environ. Microbiol. 1998. V. 64. P. 4180-4184

192. Strausz P.O., Mojelsky W.T., Faraji F., Lown M.E., Peng P. Additional structural details on Athabasca asphaltene and their ramifications // Energ. Fuel. 1999. V.13. P. 207227.

193. Suni S., Kosunen A.-L., Hautala M., Pasila A., Romantschuk M. Use of a by-product of peat excavation, cotton grass fibre, as a sorbent for oil-spills // Mar. Pol. Bulletin. 2004. V. 49. P. 916-921.

194. Suni S., Koskinen K., Kauppi S., Boronin A., Filonov A., Kosheleva I., Gafarov A.,

195. Sokolov S., Romantschuk M. Biodégradation of oily cotton grass sorbents // Unitas Congress Centre. Helsinki. Feb. 9-11, 2005.

196. Sutherland J.B., Rafll F„ Khan A.A., Cerniglia C.E. Mechanisms of polycyclic aromatic hydrocarbon degradation // In: Microbial Transformation and Degradation of Toxic Organic Chemicals. Willey-Liss, Inc. 1995. P. 269-306.

197. Swannell R.P.J., Lee K., McDonagh M. Field evaluations of marine oil spill bioremediation// Microbiological Reviews. 1996. V.60. №2. P. 342-365.

198. Tam N.F., Guo C.L., Yau W.Y., Wong Y.S. Preliminary study on biodégradation of phenanthrene by bacteria isolated from mangrove sediments in Hong Kong // Mar Pollut Bull. 2002. V. 45. №1-12. P. 316-24.

199. Teas Ch., Kalligeros S., Zanikos F., Stournas S., Lois E., Anastopoulos G. Investigation of the effectiveness of absorbent materials in oil spill clean up // Desalination. 2001. V. 140. P. 259-264.

200. Thomassin-Lacroix E.J.M., Eriksson M., Reimer K.J., Mohn W.W. Biostimulation and bioaugmentation for on-site treatment of weathered diesel fuel in Arctic soil // Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 59. P. 551-556.

201. Thouand G., Bauda P., Oudot J., Kirsch G., Sutton C., Vidalie S. Laboratory evaluation of crude oil biodégradation with commercial or natural microbial inocula // Can. J. Microbiol. 1999. V.45. P.106-115.

202. Tiago I., Paula Chung A., Veryssimo An. Bacterial diversity in a nonsaline alkaline environment: heterotrophic aerobic populations // Appl. and Environ. Microbiol. 2004. V. 70. № 12. P. 7378-7387.

203. Top E.M., Moenne-Loccoz Y., Pembroke T., Thomas C.M. (eds) Phenotypic traits conferred by plasmids // The horizontal gene pool. Harwood Academic Publishers, Amsterdam, 2000. P. 199-208.

204. Tresse O., Lorrain M.-J., Rho D. Population dynamics of free-floating and attached bacteria in a styrene-degrading biotricking filter analyzed by denaturing gradient gel electrophoresis //Appl. Microbiol. Biotechnol. 2002. V. 59. P. 585-590.

205. Trolio R., Grice K., Fisher J.S., Alexander R., Kagi I.R. Alkylbiphenyls and alkyldiphenylmeyhanes as indicators of petroleum biodégradation // Org. Geochem. 1999. V. 30. P. 1241-1253.

206. Walworth J., Braddock J., Woolard C. Nutrient and temperature interactions in bioremediation of crytic soils // Cold regions Sci. Technol. 2001. V. 32. P. 85-91.

207. Ward D. M., Brock T. D. hydrocarbon degradation in hypersaline environments // Appl. Environ. Microbiol. 1978. V. 35. P. 353-359.

208. Whyte L., Bourbonniere L., Greer Ch. Biodégradation of petroleum hydrocarbons by psychrotrophic Pseudomonas strains possesing both alkane (alk) and naphthalene (nah) catabolic pathways // Appl. and Environ. Microbiol. 1997. V.63. №9. P.3719-3723.

209. Whyte L., Hawari J., Zhou E., Bourbonniere L., Inniss W., Greer Ch. Biodégradation of variable-chain-length alkanes at low temperatures by a psychrotrophic Rhodococcus sp. // Appl. and Environ. Microbiol. 1998. V.64. №7. P.2578-2584.

210. Whyte L.G., Bourbonniere L., Bellerose C., Greer C.W. Bioremediation assessment of hydrocarbon-contaminated soils from the High Arctic // Bioremediation J. 1999. V. 3. P. 69-79.

211. Whyte L.G., Goalen B., Hawari J., Labbe D., Greer C.W., Nahir M. Bioremediation treatability assessment of hydrocarbon-contaminated soils from Eureka, Nunavut // Cold Regions Sci. Technol. 2001. V. 32. P. 121-132.

212. Wright A.L., Weaver R.W., Webb J.W. Oil bioremediation in salt marsh mesocosms as influenced by n and P fertilization, flooding, and season // Water Air Soil Pollut. 1997. V. 95. P. 179-191.

213. Van Hamme J.D. and Ward O.P. Volatile hydrocarbon biodégradation by a mixed-bacterial culture during growth on crude oil // J Ind Microbiol Biotechnol. 2001. V. 26. №6. P. 356-62.

214. Van Hamme J. D., Singh A., Ward P. Recent Advances in Petroleum Microbiology // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 2003. V. 67. № 4. P. 503-549.

215. Ventosa A., Joaquhn J., Oren A. Degradation of phenol in synthetic and industrial wastewater by Rhodococcus erythropolis UPV-1 immobilized in an air-stirred reactor with clarifier // Microbiol. Mol. Biol. Rev. 1998. V. 62. № 2. P. 504-544.

216. Vogel T.M., Gribic-Galic D. Incorporation of oxygen from water into toluene and benzene during anaerobic fermentative transformation 11 Apl. Environ. Microbiol. 2002. V. 52. P. 200-202.

217. Yang L., Lai C.T., Shieh W.K. Biodégradation of dispersed diesel fuel under high saline conditions // Water Res. 2000. V.34. P. 3303-3314.

218. Ylihonko K., Hakala J., Niemi J., Lundell J., Mantsala P. Isolation and characterization of aclacinomycin A-non-producing Streptomyces galilaeus (ATCC 31615) mutants // Microbiology. 1994. V. 140. P. 1359-1365.

219. СВИДЕТЕЛЬСТВО о депонировании1. Кому.

220. Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН 142290. Пущино. Московская обл. проспект Науки, д. 5 /римя депозитора и наименование организации, адрес)1. Микроорганизм

221. Pseudomonas futiid*f-BS3962наименование микроорганизма и опознавательная ссылка, присвоенная депозитором номер, символ и т.д.)

222. Регистрационный номер, присвоенный ВКМ ВКМ В-2387 Р

223. Микроорганизм, поименованный в графе!, сопровождался Ходатайством о депонировании, включавшем:научное описание таксономическое определение научное описание и таксономическое определение справку о непатогенности

224. СВИДЕТЕЛЬСТВО о депонировании

225. Кому Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г'.К. Скрябина РАН 142290. Пущино. Московская обл. проспект Науки, д. 5имя депозитора и наименование организации, адрес)1. Микроорганизм

226. Pseudomonas puf 'tda BS3961наименование микроорганизма и опознавательная ссылка, присвоенная депозитором номер, символ и т.д.)

227. Регистрационный номер, присвоенный ВКМ ВКМ В-2380 Р

228. Микроорганизм, поименованный в графе 1, сопровождался Ходатайством о депонировании, включавшем:научное описаниетаксономическое определениенаучное описание и таксономическое определениесправку о непатогенности

229. Настоящим подтверждается, что микроорганизм, поименованный в графе 1, депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ЙБФМ им. Г.К.Скрябина РАН в связи с подачей заявки на оформление национального патента.1. Дата депонирования1. Акименко В.К.

230. Заместитель директората •''yii.

231. Доктор биол.наук, npofceS^ri,<:;V -; , . ss

232. ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВим. Г. К. Скрябина ♦142290 г.Пущино, Московской обл. просп. Науки 5, ИНН 5039000146, ОКПО 02699702, ОКОНХ95110,

233. Среднерусский банк Сбербанка РФ г.Москва, Серпуховское ОСБ 1554, р/с 4(6б38Ш340402000013. БИК 044552323, корр. счет ЗОЮШ090000000б323

234. ОАО МАКБ "Возрождение г.Пущино, р/с 40503 810704200140346, БИК 044525181, корр. счет 30101810900000000181 Телефон: (095) 925-74-48, факс: (095) 95633-70. INTERNET E-mail SORONIN@IBPM.SERPUKHOV.SU№ 12310лда№

235. СВИДЕТЕЛЬСТВО о- депонировании штамма

236. Кому: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН лаборатория биологии плязмид

237. Россия, Московская обл., г. Пущине, 142290, пр. Науки, 5, ИБФМ им. Г.*К. Скрябина РАН

238. Микроорганизм: Rhodococcus sp. штамм S 67

239. Регистрационный номер, присвоенный ВКМ: ВКМ Ас-2533 Д

240. Микроорганизм, поименованный в графе i, сопровождался Ходатайством о депонировании, включавшем:научное описание и таксонономическоеопределение |представлено|справку о нелатогенности .нст|

241. Настоящим подтверждается, что микроорганизм, поименованный в графе 1, депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН. Депонирование проведено с целью патентования микроорганизма »Российской Федерации.

242. Дата депонирования: 27 февраля 2006 г.

243. Заместитель директа проф., доктор1. В.К. Акименко

244. ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ФИЗИОЛОГИИ МИКРООРГАНИЗМОВ им. Г. К. Скрябина142290 г.Пуншно, Московской обл.,лросп. Науки 5, ИНН 5039000146, ОКПО 02699702, ОКОНХ95110,

245. Среднерусский банк Сбербанка РФ г.Москва, Серпуховское ОСБ 1554. р/с4СГ5038Г0340402000013. БИК 044552323, корр. счет 30101810900000000323

246. ОАО МАКБ "Возрождение г Пущино, р/с40503810704200140346, БИК 044525181, корр. счег 30101810900000000181 Телефон: (095) 925-74-48, факс: (095) 956^33-70. INTERNET E-mail BORONIN@IBPM.SERPUKJ-IOV.SU

247. Кому: Институт биохимии и физиологии микроорганизмов им. Г.К. Скрябина РАН лаборатория биологии плазмид

248. Россия, Московская обл., г. Иу щи но, 142290, пр. Науки, 5, ИБФМ им. ПК. Скрябина РАН Микроорганизм: ЛкоАкоссш яр. штамм X 5 Регистрационный номер, присвоенный ВКМ: ВКМ Ас-2532 Д

249. Микроорганизм, поименованный в графе I, сопровождался Ходатайством о депонировании, включавшем:научное описание и таксонономическоеопределение ¡представлено!справку о непатогенности пет!

250. Настоящим подтверждается, что микроорганизм, поименованный в графе 1, депонирован Всероссийской коллекцией микроорганизмов ИБФМ РАН. Депонирование проведено с целью патентования микроорганизмав Российской Федерации.

251. Дата депонирования: 27 февраля 2006 г.12310на№1. СВИДЕТЕЛЬСТВОо. депонировании штамма

252. ГеЦFax (4867)759733 code from Moeccw-27 E-maJl:toxl(^onl!ne.jtKk.netf£z$tc0iirehь' диpeXropa no научной Зг/ДщЛ-ор м'сдиадвН:к§| наук,1. ЗАКЛЮЧЕНИЕо патогашостп штамма Ююйососсю ер. шталш Я 67 (ВКМ Ас2533Д) для теплокровных животных

253. Начальник лаборатории санбакконтролн Негрнй Н.В

254. ФЕДЕРАЛЬНОЕ ГОСУДАРСТВЕННОЕ УЧРЕЖДЕНИЕ НАУКИ «НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКИЙ ЦЕНТР ТОКСИКОЛОГИИ И ГИГИЕНИЧЕСКОЙ РЕГЛАМЕНТАЦИИ БИОПРЕПАРАТОВ» ФЕДЕРАЛЬНОГО МВДИКО-БИОЛОШЧЕСКОГО АГЕНТСТВА (ФГУ11 НИЦ ТПП ФМВА РОССИИ)

255. MJ2S3 РОССИЯ Моаисаая область Сгрпуговсий jm Ыс Дшдаа ул Леша 102А тЫфгв (4967) 75S7JJ (од xi Моавы-Я E-fnältoxicgonllnüloctnef

256. STATE FEDERAL ENTERPRISE FOR SCIENCE «RESEARCH CENTER FORTOX1COLOCY AND HYGIENIC REGULATION OF EIOPREPARATIONS* AT FEDERAL MEDICO-BIOLOGICAL AGENCY (SEES RCT& 1KB OF KMBA OF RF)1Rreiypai (4367)759738 code from Hoseow-27 Е-ш111ох1с@опШю.5|оск.пе1

257. Чк^п-елhPjfupeßrfima по научной11. Длднщси1. ЗАКЛЮЧЕНИЕо пэтогспиости штамма Pseudomonasputida BS3961 (BKM В-2380 D) для теплокровных ЖИВОТНЫХ"

258. Начальник лаборатории санбакконтроля Нсгрий H.B.1. ИЮШШЖАЖ #ВДШРАЩШШв bbbjbb к т вв-ч * W S1. S2 »1. В В В1. О ® ^ вв в вв

Информация о работе

Нечаева, Ирина Александровна
кандидата биологических наук
Пущино, 2009
ВАК 03.00.23

Диссертация

Биодеградация углеводородов нефти психротрофными микроорганизмами-деструкторами - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы