Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Эколого-физиологические особенности микромицетов зоны радионуклидного загрязнения

ВАК РФ 03.00.07, Микробиология

Автореферат диссертации по теме "Эколого-физиологические особенности микромицетов зоны радионуклидного загрязнения"

ИНСТИТУТ МИКРОБИОЛОГИИ И ВИРУСОЛОГИИ ИМ. Д.К. ЗАБОЛОТИОГО НАЦИОНАЛЬНАЯ АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ 0 Д

1 § I - К гт\)

Вембер Валерия Владимировна

УДК 574.23 :582.288.4

ЭКОЛОГО-ФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ МИКРОМИЦЕТОВ ЗОНЫ РАДИОНУКЛИДНОГО ЗАГРЯЗНЕНИЯ

03.00.07 - микробиология

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Киев-2000

Диссертацией является рукопись

Работа выполнена в Институте микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного Национальной Академии Наук Украины

Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор Жданова Нелли Николаевна, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, заведующий отделом физиологии и систематики микромицетов

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Романовская Виктория Александровна, Институт микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины, ведущий научный сотрудник отдела биологии газоокисливагащих микроорганизмов

доктор биологических наук, старший научный сотрудник, Бухало Ася Сергеевна, Институт ботаники М.Г. Холодного HAH Украины, главный научный сотрудник отдела микологии

Ведущая организация: Одесский государственный университет им. И.И. Мечникова, кафедра микробиологии, Министерство образования Украины, г. Одесса

Защита состоится " 20 " декабря 2000 г. в 10°° на заседании специализированного ученого совета Д 26.233.01 Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины по адресу: г. Киев, 03143, ул. Заболотного, 154

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины по адресу: г. Киев, 03143, ул. Заболотного, 154

Автореферат разослан " RO " ноября 2000 г.

Ученый секретарь

специализированного ученого совета кандидат биологических наук

£ tjg^H 0.

р п у/, ¿/г. о

Пуриш JI.M.

Актуальность темы. Постоянное усиление антропогенного влияния на биоту (в том числе и микобиоту) вызывает все более глубокий интерес у биологов к организмам-экстремофилам. Особое место среди таких организмов занимают объекты 10-км зоны отчуждения и помещений 4-го блока ЧАЭС. Каждый из них по-своему уникален. Условия развития микроорганизмов, существующих в таких условиях, несомненно, можно отнести к экстремальным. Исследователями подобных объектов всегда предполагаются большие перспективы относительно существования в них пггаммов с уникальными свойствами. Именно поэтому, исследование микобиоты ряда помещений 4-го блока ЧАЭС является, безусловно, актуальным с двух позиций. Во-первых, это расширяет наши представления о пределах возможностей существования микробных объектов, а во-вторых - выделенные грибы - интересный материал для генетиков, биохимиков и биотехнологов.

Известна высокая радиоустойчивость микроскопических грибов по сравнению с бактериями, растениями и животными (Жданова, Василевська, 1988, Saleh et al., 1988, Magan, 1997). Но до последнего времени изучается, в основном, устойчивость к у- и УФ-излучению, тогда как устойчивость грибов к другим типам излучений изучена спорадически. Кроме того, обрастание микросокпическими грибами поверхности стен и строительных конструкций может нести дополнительную опасность разрушения (Коваль, Сидоренко, 1989). Все перечисленное выше дает основания для мониторинга внутренних помещений объекта «Укрытие» 4-го блока ЧАЭС с целью выявления и последующего изучения в них грибного поражения стен и железобетонных конструкций.

Возможность существования и роста микромицетов в условиях мощного облучения (особенно по а- и ß-составляющим), дает возможность допустить существование у этих микроорганизмов систем многоэшелоноровапной защиты, которые делают возможным выживание и активный рост грибов в этих условиях, поэтому целесообразно изучить у грибов, выделенных с высокорадиоактивных субстратов, эколого-физиологические особенности, которые позволяют им занимать антропогенные экотопы, экстремальные по условиям существования.

Связь работы с научными программами, плапами, темами. Работа выполнена в отделе физиологии и систематики микромицетов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины в соответствии с направлением научно-исследовательских работ Института, в частности с темами: «Эколого-систематическое и физиологическое изучение микромицетов как основа создания перспективных биотехнологий» (№ державной регистрации 0196U018115); «Изучение микромицетов экониш антропогенного происхождения; их видовой состав, эколого-физиологические свойства, биологическая активность при трансформации труднодоступных субстратов с целью получения высокоактивных штаммов и их метаболитов» (№ державной регистрации 0196U021674); «Исследовать эколого-физиологическуто активность микромицетов в

условиях экстремальных антропогенных нагрузок» (№ державной регистрации 0100U004338). Работа была поддержана грантами Державного фонда фундаментальных исследований «Усвоение техногенного радиоуглерода АЭС в локальных биогеоценозах» (№ 6.3/269); «Изучение роста грибов-экстремофилов на графитных средах» (№ 20/17-113), а также грантами фонда Дж. Сороса "Physiological-biochemical peculiarities of fungi growing in direction of ionization irradiation source" (№ UB9200) и ENTAS "Interaction between biota micromycetes and hot particlcs" (№ UA95-171). Нучная работа B.B. Вембер за 1999-2000 годы была отмечена стипендией Президиума НАН Украины.

Цель и задачи исследований. Целью данной работы было выделение микроскопических грибов с радиоактивно загрязненных субстратов 4-го блока ЧАЭС и изучение их экологических и физиолого-биохимических особенностей в сравнении с коллекционными штаммами, выделенными из радиоактивно чистых субстратов. Достижение поставленной цели реализовалось через решение следующих задач:

1. Выделить микроскопические грибы из различных экониш 10-км зоны отчуждения ЧАЭС и отобрать штаммы для дальнейшего углубленного изучения;

2. Дать экологическую оценку состоянию микобиоты помещений объекта «Укрытие», используя методы син- и аутэкологии;

3. Исследовать морфологические и физиологические особенности штаммов, которые длительное время существовали в условиях интенсивного а-, Р- и у-излучения;

4. Изучить p-радиоустойчивость штаммов, выделенных из внутренних помещений 4-го блока ЧАЭС;

5. Провести исследования, связанные с влиянием у-облучения малой интенсивности на биохимические особенности штаммов одного вида, которые различаются по признаку позитивного радиотропизма и пигментации. Научная новизна полученных результатов. Впервые проведен мониторинг

11-ти внутренних помещений объекта «Укрытие», которые значительно различались по уровню радионуклидного загрязнения и конструкционным особенностям. Разработаны подходы, которые позволяют прогнозировать нахождение грибных видов на высокорадиоактивных субстратах в активном или переживающем состоянии в случаях, когда прямое наблюдение невозможно. Они заключаются в последовательном определении и комплексной оценке: 1) частоты встречаемости видов в исследуемом экотопе; 2) радиальной скорости роста часто встречающихся видов в исследуемом экстремальном экотопе по сравненшо со штаммами того же вида, выделенными из чистых субстратов и 3) устойчивости видов по отношению к главной составляющей экстремальной нагрузки.

Впервые показана способность микроскопических грибов активно обрастать частицы реакторного графита и усваивать радиоуглерод из такого субстрата.

Выявлены существенные изменения в морфологии и физиологии штаммов микромицетов, способных существовать во внутренних помещениях объекта «Укрытие» под влиянием значительных доз облучения, по сравнению с контрольными (коллекционными) штаммами.

Впервые исследована устойчивость к р-лучам видов Cladosporium sphaerospermum Penz. и Alternaría alternata (Fr.) Keissler и показана ее зависимость от места, из которого были выделены культуры, и возраста последних.

Выявлена зависимость уровня глутатионтрансферазной активности и скорости белоксинтезирующих процессов от наличия пигментации у штаммов Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries.

Теоретическая и практическая значимость. Коллекция микромицетов-экстремофилов отдела физиологии и систематики микромицетов ИМВ НАН Украины пополнилась 214 штаммами, которые относятся к 47 видов 24 родов грибов.

Примененные результаты и методические подходы могут быть использованы при создании долгосрочных экологических прогнозов в отношении экотопов, которые были подвержены влиянию радиоактивного загрязнения или другой антропогенной нагрузки.

Выявленная способность микроскопических грибов накапливать радиоуглерод из реакторного графита, обрастать и разрушать последний может быть использована для создания биотехнологий, направленных на реабилитацию территорий хранилищ ядерного топлива, АЭС и мест усиленного радиационного загрязнения.

Полученные результаты используются в курсе лекций по общей микологии на биологическом факультете в Киевском Национальном университете имени Тараса Шевченко.

Личный вклад соискателя. Работа проведена в отделе физиологии и систематики микромицетов Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного НАН Украины. Основная часть экспериментального материала, изложенного в диссертации, получена автором самостоятельно. Прямое определение радиоуглерода в биомассе микромицетов проведено совместно с Отделением радиогеохимии и охраны окружающей среды Института геохимии, минералогии и рудообразования НАН Украины при участии канд. геол.-мин. наук А.В. Пушкарева, канд. геол.-мин. наук Н.Н. Ковалюка и канд. геол.-мин. наук В.В. Скрипкина, за что мы им искренне признательны.

Апробация результатов диссертации. Результаты исследований были представлены, докладывались и обсуждались на: IV Международной научно-технической конференции по проблемам ликвидации последствий аварии на ЧАЭС (пос. Зеленый Мыс, г. Чернобыль, декабрь 1994 г.); Advanced Course on Radioecology (NATO Advanced Study Institute) (пос. Заречный, Россия, июнь 1995 г.); микологической секции Украинского Ботанического Общества (1996 г.); V

Международной научно-технической конференции «Итоги 10 лет работ по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС» (пос. Зеленый Мыс, г. Чернобыль, декабрь 1994 г.); First International Congress on Extremophiles (Estoril, Portugal, June 1996); International Regional Seminar "Environment Protection: Modern Studies in Microbiology and Ecology" (г. Ужгород, Украина, май 1997 г.); конференциях по фундаментальным исследованиям Института микробиологии и вирусологии им. Д.К. Заболотного HAH Украины (1997,1999 гг.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 научных работ, из которых - 5 статей в научных журналах, патент на изобретение и 5 тезисов.

Структура и объем работы. Общий объем работы составляет 157 страниц машинописного текста и состоит из вступления, обзора литературы, экспериментальной части, заключения, выводов, списка литературных источников (250 наименований, 95 из которых - иностранные). Работа иллюстрирована 16 таблицами и 29 рисунками.

РАЗДЕЛ 1. Обзор литературы

Состоит из 3 подразделов, в которых рассмотрены вопросы распространения микроскопических грибов в местах с неблагоприятными условиями существования, в частности при экстремальном уровне радионуклидного загрязнения. Детально рассмотрены адаптационные приспособления микроскопических грибов к неблагоприятным условиям окружающей среды на различных уровнях: морфологическом, физиологическом, биохимическом, а также типы жизненных стратегий у грибов.

РАЗДЕЛ 2. Материалы и методы исследований

В качестве объектов исследования использовали 214 штаммов 48 видов 24 родов микромицетов, которые были выделены нами из различных радиоактивно загрязненных субстратов 10-км зоны ЧАЭС. 54 штамма 14 видов 9 родов, полученные из коллекции отдела физиологии и систематики микромицетов Института микробиологии и вирусолгии НАНУ, использовали в процессе скрининга грибов, способных усваивать радиоуглерод из реакторного графита. 23 штамма 10 видов 8 родов из той же коллекции были использованы в работе как контрольные - с ними сравнивали штаммы, выделенные из радиоактивно загрязненных субстратов. Со временем, на основании частот встречаемости, рассчитанных для каждого вида, для дальнейших исследований морфологических и физиолого-биохимических особенностей мшфомицетов, выделенных из радиоактивно загрязненных субстратов, были отобраны отдельные виды и штаммы, соответствующие задачам исследования.

Методы исследований. В зависимости от цели исследования штаммы грибов культивировали на твердых агаризованных (сусло-агаре, катрофельно-глюкозном агаре, агаризованной среде Чапека, голодном агаре) и на жидких питательных

средах на основании среды Чапека с различным содержанием органического источника углерода или же с высокорадиоактивным реакторным графитом в качестве источника углерода.

При изучении экологической характеристики внутренних помещений объекта «Укрытие» определяли: частоту встречаемости выделенных видов (Методы..., 1982); коэффициент доминирования по Симпсону (Simpson, 1949, Одум, 1975); коэффициент биологического разнообразия по Шеннону (Shannon, Weaver, 1949, Margalef, 1968); коэффициент подобия по Сьоренсену (Грейг-CMti, 1967); уровень меланизации микобиоты изученных экотопов по О думу (Одум, 1975).

Морфологические особенности штаммов изучали с использованием методов световой микроскопии (Методи..., 1982) и метода культивирования грибов на предметном стекле (Щцотпчко, 1953).

Определение скорости линейного роста проводили, используя общеизвестные методы (Перт, 1978, Метода..., 1982, Шемшур и др., 1989). При изучении ростовых процессов учитывали также максимальную величину колонии к окончанию времени наблюдения, продолжительность лаг-фазы изученных штаммов, предельные значения скорости линейного роста, а также характер ритмического роста на каждой из использованных сред: оптимальной (сусло-агар) и голодной (голодный агар).

Изучение ß-устойчивости проводили по методу Ли (Lea, 1963, Christensen Holm, 1964, Вальд-Штейн, 1966), облучая монослой конидий (или мицелиальных фрагментов), закрепленных на желатиновой подложке. Для большей наглядности данные, полученные нами по ß-устойчивости, представлены в виде накопительных диаграмм и сгруппированы по: а) возрасту культур; б) каждому из штаммов, учитывая вклад разных возрастных категорий.

Биохимические показатели изучали в бесклеточных экстрактах, которые получали по Фихте (Фихте с соавт., 1978). Белок определяли по методу Лоури (Lowryetal., 1951).

Уровне перекисного окисления липидов (ПОЛ) определяли по накоплению в клетках первичных молекулярных продуктов ПОЛ - диеновых конъюгатов (Гаврилов, Мишкорудная, 1983), которые экстрагировали, используя систему растворителей гексан-изопропанол (1:1). Оптическую плотность гексановой фазы определяли на спектрофотометре при длинне волны 233 нм.

Состояние глутатионзависимой антиокислительной системы оценивали, определяя спектрофотометрическим методом ферментативные активности эндогенных каталазы при длине волны 240 нм (Higashi, Peters, 1963) и глутатионтрансферазы при длине волны 346 нм (Habig et al., 1974). Удельную ферментативную активность рассчитывали по количеству превращенного за 1 мин субстрата отнесенного к содержанию белка в реакционной смеси.

О синтезе белка судили по включению 14С-лейцина (1,0 мкКи/мл) во фракцию, нерастворимую в трихлоруксусной кислоте (Рязанова с соавт., 1982). Уровень

включения выражали в (имп./мин)хмга скорость включения - в (имп./мин)х(мгхмин)"'. Процесс включения изучали в динамике, инкубируя мицелий с 14С-лейцином 5, 10,20 и 30 мин.

На разных этапах работы использовали закрытые источники у- и Р-излучения. Мощность дозы на расстоянии 6 мм от источника р-излучения на основании радионуклидов 90Sr+90Ir составляла 60 Р/час. Мощность дозы облучения источника у-излучения на основании 60Со на расстоянии 7,5 см от источника - 6,5 мР/час.

Полученные в работе результаты обработаны статистически [Лакин, 1968] с использованием методов статистической обработки результатов измерений для малых выборок [Кассандрова, Лебедев, 1970] с привлечением пакетов программ Microsoft Exel_97 и SigmaStat_2.0.

РАЗДЕЛ 3. Оценка экологического состояния микобиоты внутренних помещений объекта «Укрытие» 4-го блока ЧАЭС

Видовой состав грибов, которые поражают стены и другие строительные конструкции исследуемых помещений 4-го блока, был представлен 48 видами 24 родов. Среди них преобладали представители митоспоровых грибов. Доминирующее положение занимали только два вида - Cladosporium sphaerospermum Penz. и Pénicillium hirsutum Dierckx.

Подавляющее большинство видов (66,7%) встречалась в единичных случаях, что, так же как и небольшое количество доминирующих видов, свидетельствует о крайне неблагополучном экологическом состоянии исследуемого объекта. Об этом же свидетельствует и абсолютное доминирование в составе микобиоты пигментированных видов, которые составляли 85,4% от общего количества выделенных. Вклад меланинсодержащих видов составил 41,7%.

Коэффициент биоразнообразия H колебался от 2,49 до 3,17, что свидетельствует о наличии значительного видового разнообразия микобиоты помещений 4-го блока ЧАЭС.

РАЗДЕЛ 4. Морфолого-физиологические показатели микроскопических грибов как критерий их жизненной стратегии в условиях радионуклидного загрязнения

Анализируя видовой состав и экологические показатели микобиоты исследуемых внутренних помещений объекта «Укрытие» был сделан вывод о занесении спор и конидий грибов воздушными потоками. Невыясненным оставался вопрос о том, в каком состоянии могут существовать микроскопические грибы в жестких условиях сочетанного действия ионизирующего излучения, лимиторования по органическим источникам углерода, а также влияния дезактивирующих пылеподавляющих растворов. Такие условия предполагает возможность существования микромицетов в двух состояниях: состоянии активного роста,

который приводит к образованию больших характерных пятен грибного поражения в помещениях, и в переживающем состоянии — в виде спор и конидий.

Косвенным доказательством активного роста микромицетов может быть, также, их доминирование или постоянная встречаемость в изучаемых экотопах. Кроме того, для грибов, которые активно растут в экстремальных условиях, характерны определенные адаптационные изменение в морфологии и физиологии, которые позволяют видам-экстремофилам приспосабливаться к неблагоприятным условиям окружающей среды.

В морфологии ряда видов, выделенных из радиоактивно загрязненных помещений 4-го блока ЧАЭС, мы наблюдали изменения, которые сводились, главным образом, к редукции спороношений, утоньшению мицелия и его повышенной септации. У видов, частота встречаемости которых в помещениях 4-го блока ЧАЭС была наименьшей - Stachybotrys chartarum (Ehrenb.:Lk) Hughes и Botritis cinerea Pers.: Nocca et Balb. - не наблюдалось морфологических отличий от контрольных штаммов. Это может служить доказательством существования этих видов в радиоактивно загрязненных помещениях только в переживающем состоянии. Про активный рост в условиях высокой радиоактивности свидетельствуют серйозные морфологические изменения, которые были обнаружены нами у всех изученных доминирующих и часто встречающихся в помещениях 4-го блока ЧАЭС видов.

Экстремальные условия существования должны способствовать накоплению видов, реализующих .fif-тип жизненной стратегии в условиях активного роста грибов (Pianka, 1970, Pugh, 1980, Panikov et al., 1987, Grime, 1988, Zhdanova et al., 1990). В числе признаков, характеризующих такие виды, упоминается их замедленный рост (Кочкина с соавт., 1978, Grime, 1988). Поэтому для подтверждения факта активного роста микроскопических грибов в помещениях 4-го блока ЧАЭС изучали скорость линейного роста мицелиальных грибов. По этому показателю было изучено 2 вида микромицетов, выделенных с поверхности пятен грибного поражения внутренних помещений 4-го блока ЧАЭС: Cladosporium sphaerospermum Penz. та Alternaría alternata (Fr.) Keissler. Эти виды были избраны для исследований из-за высокой частоты встречаемости в помещениях с различным уровнем радионуклидного загрязнения.

Среди исследованных штаммов A. alternata не было обнаружено существенной разницы между штаммами-экстремофилами и контрольными штаммами по каждому из изученных параметров линейного роста.

Скорость линейного роста изученных штаммов С. sphaerospermum была на порядок меньше, чем у штаммов A. alternata. очень выделялись по этому параметру штаммы С. sphaerospermum 60 и 5-1, которые находились под усиленной радиоактивной нагрузкой: скорость роста последних была в 2—4 раза меньше, чем у контрольных штаммов этого вида (табл. 1).

Показатели линейного роста штаммов СШйоБрогшт хрИаегозрегтит Репг.

№ штамма Продолжительность лаг-фазы, час Максимальная величина колония, Я, мм Предельные показатели радиальной скорости роста (А7П + К™), мм/час Радиальная скорость роста, (М ± т),Кп мм/час Продолжительность биоритмов, сут.

СА ГА СА ГА СА ГА СА ГА СА ГА

3176 25 44 27,7 25,4 0,0211 -5- 0,0911 0,0151 + 0,1065 0,0436 ± 0,0064 0,0439 ± 0,0121 2 2

852 25 25 .2<М> 21,0 . : Л. ... 0,0139 + 0,1333 0,0098 + 0,0922 0,0446 ±0,0101 0,0378 ±0,0103 1,5-2 1-1,5

740 25 37 16,8 • ¿У ' ' -,-Ц ' 0,0288 + 0,0873 0,0085 + 0,0972 0,0432 ± 0,0062 0,0326 ±0,0111 1,5 1,5

34 25 25 Ь с. ¡. 20,0 0,0254 + 0,1023 0,0102 + 0,0875 0,0444 ± 0,0066 0,0348 ± 0,0099 • /г 1. :•.• Ч'. 2

60 25 25 6,3 0,0006 + 0,0611 0,0006 + 0,1141 0,019810,0075 0,0161 ±0,0114 ■ 1,5 : ' 2

5-1 25 25 93 5,9 0,0010 + 0,0889 0,0006 + 0,0440 0,0190 ± 0,0080 0,0113 ±0,0050 1 1,5

Примечание: серым цветом в таблице выделены ячейки, значения в которых достоверно отличаются между оптимальной (сусло-агар) и голодной средами.

Очень важным в вопросах выживания живых организмов в неблагоприятных условиях существования является определение главной компоненты экстремальной нагрузки. Относительно объекта «Укрытие» основным экстремальным фактором, который влияет на биоту внутренних помещений, признается уровень радионуклидного загрязнения. И если в первые послеаварийные годы основными дозообразователями были элементы с преобладанием у-излучения, то сейчас во внутренних помещениях 4-го блока ЧАЭС именно (3-излучение является главной составляющей ионизирующего излучения. Поэтому уровень р-устойчивости штаммов является еще одним критерием способности к активному росту микромицетов в исследуемом нами экотопе.

Облучение р-лучами проводили в течение 7 суток при мощности дозы 60 Р/час (доза, полученная облученным материалом составяла 102 Гр). Такая доза была избрана нами в результате предварительного построения дозных кривых выживаемости различных культур обоих видов: она наиболее соответствовала [Ли, 1963, Ярмоненко, 1977] для наиболее чувствительных к Р-облучению культур 20-суточного возраста.

Для штаммов С. зрЪаегозрегт ит максимальная устойчивость к Р-излучению наблюдается среди 20-суточных культур, а затем постепенно снижается с их возрастом (рис. 1, а). Наибольшей р-устойчивостью отличались два штамма: 5-1 (выделенный из помещения объекта «Укрытие» с наивысшим уровнем радионуклидного загрязнения) и 852 (контрольный) (рис. 1, б). Выживание этих культур разного возраста после хронического Р-облучения в дозе 104 бэр колебалось около 100%.

5-1 60 34 852 740 3176

Возрвст (ПуЧвННЫХ культур

Номер штамма

Рис. 1. Устойчивость штаммов С. БрИавгозрегтит к Р-облучению: а) сгруппированная по возрасту культур; б) общая стойкость штаммов, учитывая вклад каждой возрастной категории.

Факт одинаковой устойчивости к облучению у контрольных штаммов и штаммов, выделенных из высокорадиоактивных помещений объекта «Укрытие» согласуется с обобщением (Шальнов, 1977, Корогодин, 1982) относительно

взаимосвязи между радиорезистентностью и общей резистентностью организмов. Мы придерживаемся мнения, что высокая устойчивость к экстремальным экологическим факторам потенциально заложена у ряда штаммов, которые существуют и в обычных условиях (так называемая «резервная группа»). При создании в экотопе экстремальных условий выживают организмы, имеющие высокий уровень общей устойчивости к экстремальным факторам (Карасевич, 1975, Назим, Джеймс, 1981).

Для грибов вида А. аШгпаиг максимальная устойчивость к р-облучению наблюдается среди 40-суточных культур, несколько уступают ей 60-суточные, а у 20-суточных штаммов А. аЬегпШа она наименьшая (рис. 2, а). Это может быть связано с процессом медленного образования конидий у этого вида. Стойкость же мицелиальных фрагментов значительно меньше. Именно поэтому, по нашему мнению, и наблюдается такое явление.

Среди штаммов вида А. аЛетаХа наивысшая устойчивость к Р-облучению наблюдалась у штаммов, выделенных из внутренних помещений объекта «Укрытие» (рис. 2,

Возраст изученных культур Номер штамм»

Рис. 2. Устойчивость штаммов А. аКегпаШ к р-облучению: а) сгруппированная по возрасту культур; б) общая стойкость штаммов, учитывая вклад каждой возрастной категории.

Максимальная общая Р-устойчивость вида А. аНегпМа (культуры 40-суточного возраста) по абсолютной величине фактически равна масимальной р-устойчивости вида С. ьркаегоьрегтит (культуры 20-суточного возраста) (рис. 1,2, а).

По нашему мнению, результаты проведенных исследований свидетельсвуют о способности обоих изученных видов грибов к активному росту в помещениях 4-го блока ЧАЭС, которая достигается за счет различных жизненных стратегий: штаммы С. врЬаегозрегтит, несмотря на очень медленный рост, захватывают территорию за счет быстрого и обильного конидиеобразования, а штаммы вида А. аИегпаШ - за счет относительно быстрого апикального роста. Конидии этого вида образуются

медленно, но они обладают большим преимуществом при существовании в условиях облучения за счет многоклеточное™ и крупных размеров.

Подитоживая полученные нами данные, можна утверждать, что наивысшая общая резистентность видов в исследованном экотопе достигается за счет объединения видом отдельных признаков г- и /^-стратегии, что и наблюдалось у изученных нами видов С. sphaerospermum и A. alternate.

РАЗДЕЛ 5. Особенности роста грибов на высокорадиоактивном реакторном графите

На начальном этапе развития аварии на 4-ом блоке ЧАЭС в результате взрыва диспергированию подверглось не только ядерное топливо, сконцентрированное в ТВЭЛах, но и графитный замедлитель нейтронов. Включенный в динамическую систему современных ландшафтов диспергированный радиоактивный графит подвергается влиянию химических и биогенных факторов.

Нами были проведены эксперименты по взаимодействию микроскопических грибов с частицами реакторного графита. Из 7 исследованных видов грибов обрастание графитных частиц было присуще только четырем. Обрастание графитных частиц у разных видов и штаммов одного вида происходило в различные сроки (рис. 3).

В ряду уменьшения активности обрастания изученные нами виды грибов можно расположить в ряду: Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries, Aspergillus versicolor (Vuill.) Tiraboschi, Cladosporium sphaerospermum Penz., Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud. Виды Alternaría altemata (Fr.) Keissl., Chrysosporium pannorum (Lk) Hughes i Penicillium roseo-purpureum Dierckx практически не росли в присутствии графитных частиц и не вызывали обрастания последних.

При проведении опытов с радиоактивным графитом было установлено, что этот материал подвергается диспергированию за счет взаимодействия с микромицетами. Так, частицы реакторного графита, которые на протяжении шести месяцев хранились под слоем дистиллированной воды, были полностью дезинтегрированы скоплением грибного мицелия. Прорастание было настолько интенсивным, что разделение грибной биомассы и диспергированного графита с использованием обычных методов оказалось невозможным. Выделенные из него микромицеты были отнесены к видам Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries, Phialophora fastigiata (Lagerberg et Melin) Conant та Penicillium spinulosum Thom.

Для выяснения способности микроскопических грибов к накоплению радиоуглерода из реакторного графита нами была проведена серия лабораторных испытаний, где в качестве единственного источника углерода в жидкую среду Чапека добавляли смесь реакторного и инертного графита с активностью по 14С 2100 Бк/г. Рост на такой среде был изучен на 54 штаммах 14 видов 9 родов (Acremonium, Arthrinium, Aureobasidium, Cladosporium, Humicola, Paecilomyces,

Рис. 3. Обростание графитных частиц разного размера (на них указывают стрелки) штаммами: а) С. cladosporioides 30 (16-ые сутки наблюдения); б) А. versicolor 3-6 (28-ые сутки наблюдения); в) С. sphaerospormum 34 (24-ые сутки наблюдения); г) скопление конидий штамма A. pullulons 49а возле поверхности частицы на 24-ые сутки эксперимента.

Phialophora, Scopulariopsis), выделенных из радиоактивно загрязненных субстратов 30-км зоны ЧАЭС. Контрольным считали рост грибов на среде с необлученным графитом. В контроле рост всех исследованных штаммов был слабым. На среде же с реакторным графитом в конце эксперимента наблюдали хорошо выраженные грибные колонии.

Используя специально разработанную в Институте геохимии, минералогии и рудообразования методику, была определена активность радиоуглерода в грибном мицелии. Все отобранные в результате скрининга виды: Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries, Paecilomyces lilacinus (Thom) Sams., Acremonium murorum (Cda) W. Gams, Aureobasidium pullulons (de Baiy) Arnaud, Pénicillium roseo-purpureum Dierckx, Pénicillium spinulosum Thom, Phialophora fastigiata (Lagerberg et Melin) Conant -активно усваивали 14C таким образом, что активность по этому нуклиду субстрата [Бк/г субстрата] и грибов [Бк/ г сухой биомассы] была практически идентичной. С. cladosporioides 5, выделенный с реакторного графита выделялся наиболее интенсивным усвоением 14С.

РАЗДЕЛ 6. Влияние у-облучения малой интенсивности на биохимические показатели штаммов С. сЫйоьрогШйеь

Исследования по влиянию у-облучения малой интенсивности актуальны, так как именно такому воздействию подвергаются живые организмы, существующие на поставарийных территориях и не значительной площади территорий хранилищ радиоактивных отходов и атомных полигонов.

Высокая активность штамма С. с1ас1о$рогю1с1ев 5 относительно усвоения радиоуглерода из реакторного графита дала основание для включения его в число штаммов, у которых изучались биохимические изменения в условиях хронического у-облучения малой интенсивности. Учитывая существование в отделе коллекции штаммов-экстремофилов, намы были ообраны еще 3 штамма С. с1а.(1о$ропо'к1е$, различающиеся уровнем радиоактивности субстрата, из которого они были выделены (табл. 2). Половина из исследованных штаммов проявила свойство позитивного радиотропизма. а1Ь-Мутант С. с1а(1о$рог'ш'к1е$ был включен в этот ряд для выявления вклада меланиновой защитной системы на изученные процессы. Кроме того, на данных штаммах ранее достаточно подробно были изучены меланиногенез и физиология.

Таблица 2

Штаммы Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries, используемые для изучения реакции биохимических клеточных систем микромицетов на у_облучение малой интенсивности_

Штамм Место выделения Радиоактивность субстрата выделения Наличие нелапииового пигмента Наличие признака позитивного радиотропизма

396 Львовская область, ризосфера кукурузы, 1957 г. радиоактивность почвы на фоновом уровне присутствует не зарегистрировано

а1Ь-мутант Получен путем облучения в дозе 9.000 Гр в условиях гипоксии штам-ма С. с1ас1о$рогю\(1е$ 396 — отсутствует то же

4 Территория ЧАЭС, осень 1986 г. 3,7x102 Бк/г присутствует зарегистрировано

5 Поверхность реакторного графита, 1993 г. 3,2х104 Бк/г « « « «

Для исследований было избрано изменения в системе перекисного окисления липидов (ПОЛ), так как именно они являются тонким индикатором гомеостаза как на уровне всего организма, так и на уровне отдельных мембранных структур.

Все исследования проводились на 7-суточных культурах. Именно в этот период отмечено максимальное накопление меланина клетками. Штаммы облучали

у-лучами в течение 7 суток (общая полученная доза составляла 10" Гр). Контрольными были штаммы, выращенные без облучения.

В контроле по показателям ПОЛ достоверных различий между штаммами С. сХайоБропогйе^ 396, 4 и 5 не наблюдалось, а а1Ь-мутант С. с\айовропохйе$

превосходил по этому показателю исходный родительский штамм на 31% (рис. 4). «•

Рис. 4. Уровни накопления диеновых конъюгатов штаммами СЫйоьрог 'шт с1айо$р-гтйеь после 7-суточного культивирования: I I -без облучения (контроль); ЕШИ - под влиянием у-облу-чения малой интенсивности.

<

X

о •

ы ы

К С

з г з

в 1 1

а. «

ч о

о п

396

4 5

Ш г а м м ы

»1Ь-мутант

После роста в течение 7 суток в условиях у-облучения малой интенсивности уровень ПОЛ у С. с1ас!озрогМ<1ей 396 повысился по сравнению с контролем на 38%, а у С. clad.osporioid.es 4, 5 и а1Ь-мутанта он достоверно не отличался от соответствующих контрольных уровней (рис. 4).

Исследование состояния системы переокисления липидов четырех штаммов С. cladosporioides свидетельствует о чувствительности этой системы у штамма С. cladosporioides 396, не обладающего признаком позитивного радиотропизма, к действию хронического у-облучения (даже такой малой интенсивности как 6,5 мР/час). Штаммы С. cladosporioides 4 и 5, выделенные из радиоактивных субстратов и проявившие признак положительного радиотропизма, после у-облучения по уровню ПОЛ существенно не отличались от контроля. Этот факт может объясняться тем, что граница чувствительности к хроническому у-облучению для штаммов, выделенных из высокорадиоактивных субстратов, лежит выше исследованной дозы (10'2 Гр). а1Ь-Мутант, несмотря на отсутствие в его клеточных стенках меланинового пигмента, при облучении также проявил способность поддерживать уровень ПОЛ в пределах нормы.

В организме существует ряд противоокислительных систем, которые противодействуют биологическому окислению разнообразных веществ. Одной из таких систем является глутатионзависимая антиокислительная система, которая непосредственно противодействует перекисному окислению. Таким образом, взаимодействие ПОЛ и антиокислительной системы глутатиона приводит к гомеостатическому равновесию в клетке содержания окисленных и неокисленных форм жирных кислот, именно поэтому исследования системы ПОЛ целесообразно

проводить вместе с изучением состояния антиокислительнои глутатионзависимой системы.

Одним из ключевых ферментов антиокислительной глутатионзависимой системы является каталаза, которая непосредственно нейтрализует разнообразные перекиси в клетке. Глутатионтрансфераза также важный для нашего исследования фермент, так как она отвечает за нейтрализацию повреждающих электрофильных соединений. Одной из функций меланинового пигмента в клетке является перехват таких соединений, поэтому интересно сравнить глутатионтрансферазную активность в меланинсодержащих штаммах и апигментном мутанте.

Уровни каталазной активности С. с\ас1о$рогю'1с1ев 5 и а1Ь-мутанта в контроле были почти в 2 раза выше, чем аналогичные показатели у штаммов 4 и 396 (рис. 5). Заметное снижение каталазной активности у штаммов С. с1ас1о$рогю1с1ез 396, 4 и особенно у а1Ь-мутанта С. cladosporioid.es после 7-суточного у-облучения малой интенсивности позволяет допустить активное ее использование при защите клеток от действия перекисей. Кроме того, не исключена определенная инактивация ферментных систем под действием липоперекисей. У интенсивно пигментированного С. cladosporioides 5 (который был выделен с обломка аварийного высокорадиоактивного графита) после 7-суточного роста под действием у-облучения малой интенсивности не наблюдали изменения каталазной активности по сравнению с контролем. Нужно отметить, что уровень каталазной активности в ряду изученных нами штаммов не коррелировал ни с признаком позитивного радиотропизма, ни с наявностью пигментации у штаммов.

ю ■

•а ^

гЬ

ь

Рис. 5. Каталазная активность в бесклеточных экстрактах штаммов Оайоърогшт с1айо-sporioides после 7-суточного культивирования: - без облучения; I , I - под влиянием у-облучения низкой интенсивности.

396

4 5

Штаммы

а1Ь-мутант

Что касается глутатионтрансферазной активности, то у С. cladosporioides 396, 4 и 5, которые росли без облучения, она была приблизительно на одном уровне, а у а1Ь-мутанта С. cladosporioides - в 3,5 раза выше (рис. 6). После 7-суточного роста в условиях облучения у-лучами изменения глутатионтрансферазной активности у меланинсодержащих штаммов С. cladosporioides были незначительными, а у а1Ь-мутанта С. cladosporioides этот показатель уменьшался в 2 раза.

700 -<00 • 800 •

я

£ 400 • -]»

с 300 • о 3 X

200 • 190 •

Ы;

А-

&!Ь-муты|т

Рис. 6. Глутатионтрансфераз-ная активность в бесклеточных экстрактах штаммов СЫйозро-пит сЫЛоъротшйеь носля 7-суточного культивирования: - без облучения; - под влиянием у-облучения низкой интенсивности.

4

5

Ш

Обнаруженные различия в ферментативных активностях глутатионтрансферазы у исследованных штаммов были связаны с наличием меланина в их клеточных стенках. Как и в случае с каталазной активностью, глутатионтрансферазная активность у необлученного а1Ь-мутанта С. с^оврогШйея значительно превышала таковую у его исходного штамма С. с1ад.о$ропо1с1е$ 396 (в 2,2 и 3,5 раза соответственно). Высокая удельная активность антиокислительных ферментов у а1Ь-мутанта С. с1ас1о$рогЫс1е$ может рассматриваться как биохимическая адаптация, позволяющая штамму скомпенсировать отсутствие меланинового пигмента.

Значительный интерес представляют исследования нарушений белкового обмена при действии на организм ионизирующего излучения разнообразной интенсивности, в частности изменений в процессах белкового синтеза как в одном из центральных биохимических процессов, которые протекают в каждой живой клетке.

В первые 5 мин. инкубации грибного мицелия с аминокислотой уровень и скорость включения 14С-лейцина у всех изученных меланинсодержащих штаммов С. с1ас1о5рогю1с1ез в контроле были практически одинаковыми, в то время как у а1Ь-мутанта эти величины были выше приблизительно в три раза (рис. 7).

В процессе изучения динамики включения меченой аминокислоты в белковую фракцию выяснилось, что для всех темнопигментированных штаммов С. с1айо$рогШйев под влиянием у-облучения было характерно увеличение уровня включения 14С-лейцина по отношению к контролю. Наиболее выраженное увеличение уровня и скорости включения 14С-лейцина под влиянием у-облучения малой интенсивности в первые 5 мин. экспозиции наблюдали у штамма С. с1а(1о$рогш<1еь 396, а штаммы, выделенные из радиоактивно загрязненных субстратов, характеризовались меньшей реакцией по этим параметрам на действие облучения.

У а1Ь-мутанта под влиянием у-облучения малой интенсивности, в отличие от темнопигментированных штаммов, наблюдали угнетение белоксинтезирующей активности.

Рис. 7. Уровень включения 14С-лейцина в биомассу штаммов С. с1айозрогШ(1е$> которые выращивали в условиях у-облучения малой интенсивности (—о—) и без него (- - А- - ): а - штамм 396, б - штамм 4, в - штамм 5, г - а1Ь-мутант.

Полученные нами данные позволяют сделать первые обобщения относительно характеристики экстремофилов, способных активно расти в условиях экстремального радиоактивного загрязнения. По нашему мнению это, прежде всего, организмы, имеющие многоэшелонированную защитную систему от природных и антропогенных факторов в их экстремальной дозировке. Принято считать, что в экстремальных экотопах способны выживать и расти виды, реализующие К-тш жизненной стратегии, однако полученные нами данные свидетельствуют о доминировании в помещениях исследованного нами объекта «Укрытие» видов, которые объединяют в себе отдельные черты г- и А'-типов жизненных стратегий, (что по современной классификации наиболее отвечает /'-стратегам, или патиентам).

ВЫВОДЫ

1. Видовой состав грибов внутренних помещений объекта «Укрытие» представлен 48 видами 24 родов. Доминирующее положение среди них занимают виды Cladosporium sphaerospermum Penz. и Penicillium hirsutum Dierckx. Подавляющее большинство видов встречается в единичных случаях (32 вида 20 родов). 41,7% от общего числа видов составляют меланинсодержащие и 43,8% - виды грибов, имеющие другие типы пигментов, что является надежным биоиндикационным показателем неблагоприятного экологического состояния исследованного объекта.

2. В морфологии доминирующих и часто встречающихся видов, выделенных из радиоактивно загрязненных помещений 4-го блока ЧАЭС, наблюдали изменения, которые сводились, главным образом, к редукции спороношений, утоныпению мицелия и его повышенной септации.

3. У грибов, выделенных из мест высокого радионуклидного загрязнения, обнаружена способность активно накапливать радиоуглерод из реакторного графита. Наиболее интенсивно усваивает радиоуглерод Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries 5.

4. Определены виды микроскопических грибов, способных обрастать частицы реакторного графита. По уменьшению активности обрастания исследованные виды можна расположить в ряду: Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries, Aspergillus versicolor (Vuill.) Tiraboschi, Cladosporium sphaerospermum Penz., Aureobasidium pullulans (de Bary) Arnaud.

5. Впервые исследована устойчивость к р-лучам видов Cladosporium sphaerospermum Penz. и Alternaria alternata (Fr.) Keissler и показана ее зависимость от места, из которого были выделены культуры, и возраста последних.

6. Чувствительность системы ПОЛ к хроническому у-облучению малой интенсивности (6,5 мР/час) обнаружена только у С. cladosporioides 396, выделенного из радиоактивно чистых почв, тогда как штаммы С. cladosporioides 4 и 5, выделенные из радиоактивных субстратов, после у-облучения малой интенсивности по уровню ПОЛ существенно не отличались от контроля.

7. Уровень каталазной активности в ряду изученных нами штаммов С. cladosporioides не коррелирует с их пигментацией и признаком положительного радиотропизма. Уровень глутатионтрансферазной активности зависит от наявности пигментации у штаммов С. cladosporioides.

8. Отмечена активация синтеза белка под влиянием хронического у-облучения малой интенсивности (6,5 мР/час) у темнопигментированных штаммов С. cladosporioides и угнетение его у а1Ь-мутанта. Скорость включения 14С-лейцина в биомассу изученных штаммов зависит от наличия у них признака положительного радиотропизма. Она медленнее снижается со временем у

штаммов С. cladosporioides 4 и 5, проявивших данный признак, чем у С. cladosporioides 396 и его а1Ь-мутанта, у которых он отсутствовал.

9. Установлено, что без влияния у-облучения почти по всем изученным физиолого-биохимическим показателям: уровнем ПОЛ, глутатионтрансферазной активностью, начальным уровнем и скоростью включения 14С-лейцина в грибную биомассу - темнопигментированные штаммы С. cladosporioides находятся на одном уровне, тогда как а1Ь-мутант С. cladosporioides превышает по соответствующим показателям меланинсодержащие штаммы в 1,3-3,9 раза.

10. Штаммам Cladosporium sphaerospermum Penz. та Alternaría alternata (Fr.) Keissler, выделенным из помещений 4-го блока ЧАЭС, присущ смешанный тип жизненной стратегии, объединяющий в себе отдельные черты г- и /sT-стратегов (Р — патиенты).

Список основных опубликованных работ

1. Соботович Э.В., Скрипкин В.В., Жданова Н.Н., Пушкарев А.В. Ковалюх Н.Н., Захарченко В.А., Наконечная Л.Т., Вембер В.В., Пушкарева Р.А. Трансформация реакторного графита Чернобыльского аварийного выброса в биогеохимических системах // Доклады Академии Наук Украины. - 1996. - № 11.-С. 173-176.

2. Вембер В.В., Тугай Т.И., Жданова Н.Н. Белоксинтезирующая активность ряда штаммов Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries, выращенных в условиях непрерывного у-облучения малой интенсивности // Микробиол. журн. - 1998. -60(2).-С. 38-^4.

3. Вембер В.В., Жданова Н.Н., Тугай Т.И. Влияние у-излучения на физиолого-биохимические свойства штаммов Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries, различающихся по признаку радиотропизма // Микробиол. журн. - 1999. - 61 (2).-С. 25-32.

4. Жданова Н.Н., Василевская А.И., Захарченко В.А., Редчиц Т.И., Вембер В.В. Микобиота и биологическая активность грибов, развивающихся в условиях высокой радиационной нагрузки // Бюлетень 1нституту сшьськогосподарськоТ мкробюлога УААН. - 2000. - № 6. - С. 31-36.

5. Zhdanova N.N., Zakharchenko V.A., Vember V.V., Nakonechnaya L.T. Fungi from Chornobyl: mycobiota of the inner regions of the containment structures of the damaged nuclear reactor // Mycological research, 2000. -104 (12). -P. 1421-1426.

6. Жданова H.M., Захарченко B.O., Наконечна Л.Т., Вембер В.В., Пушкарьов О.В., Саботович Е.В., Ковалюк М.М. Штам гриба Cladosporium cladosporioides (Fres.) de Vries для трансформацй' радиоактивного графггу // Патент на винах i д UA 14730 вщ 27.04.95.

7. Жданова Н.Н., Гаврилюк В.И., Редчиц Т.Н., Тугай Т.Н., Музалев П.Н., Щербаченко А.М., Вембер В.В. Радиоустойчивость почвенных микромицетов,

выделенных из почв районов усиленного радиоактивного загрязнения // Тезисы IV Междунар. научн.-техн. конф. по проблемам ЛПА на ЧАЭС.- пос. Зеленый Мыс, г. Чернобыль (5-10 декабря 1994 г.). -С. 151-152.

8. Соботович ЭЛЗ., Пушкарев A3., Жданова Н.Н., Скрипкин В.В., Ковалюк Н.Н., Захарченко В.А., Наконечная JI.T, Вембер В.В., Пушкарева Р.А. Грибная деструкция реакторного графита, выброшенного из четвертого блока ЧАЭС // Сб. тез. V Межд. научн.-техн. конф. "Итоги 10 лет работ по ликвидации последствий аварии на ЧАЭС". - пос. Зеленый мыс, г. Чернобыль (апрель 1996 г.). - С. 234-235.

9. Zhdanova N.N., Pushkarev A.V., Zakharchenko V.A., Vember V.V., Tugay T.I. Micromycetes growing on the difficult accessible radioactive substrares // "Book of Abstract" of the First International Congress on Extremophiles. - Estoril, Portugal (June 1996).-P. 258-259.

10. Vember V.V., Tugay T.I., Redchitz T.I., Zhdanova N.N. Physiologo-biochemical activity of micromycetes, growing on the radioactive substrates // Abstract of the Intern. Regional Seminar "Environment Protection: Modern Stusies in Microbiology and Ecology".-Uzhgorod, Ukraine (13-16 May 1997).-V. II.-P. 81.

11. Жданова H.H., Жидков A.B., Вембер B.B., Редчиц Т.И., Захарченко В.А., Василевская А.И., Лашко Т.Н. Биологические особенности микромицетов, выделенных из высокорадиоактивных субстратов // Сб. трудов Межд. конф. "Современные проблемы микологии, альгологии и фитопатологии". - Москва, Россия (апрель 1998 г.). - С. 199-200.

Вембер Валер1я Володимир1вна. Еколого-ф1зюлопчш особлнвосп мжромщетав зони радшнуклщного забруднення. - Рукопис.

Дисертащя на здобуття наукового ступеня кандидата бюлопчних наук за спещалыпстю 03.00.07 - мкробюлопя. - 1нститут мкробюлогп i в1русолоп1 НАН Укра'ши, Кшв, 2000.

Дисертащя присвячена вивченню м1кроскошчних гриб1в, пристосованих до ¡снування на радюактивно забруднених субстратах, на морфолопчному, ф!Зюлопчному та 6ioxiMi4HOMy р1внях. На основ! розрахованих для м1коб1оти BHyrpinmix примпцень об'екту "Укриття" коефвденпв, зроблена ощнка його еколопчного стану. Виявлено значш морфолопчш 3MiHH у м1кромщетав, що пост1йно траплялися у цьому екотот.

Вивчення швидкосп л1ншного росту та |3-стшкосп показало, що найвшца резистентшсть у досл1дженому eKOTOni досягаеться за рахунок поеднання видами окремих ознак г- та /f-тигпв життевоТ стратепУ.

Вперше виявлена здатн1сть м!кроскоп1чних rpn6iB, вилучених з радюактивно забруднених субстратв, активно накопичувати рад1овуглець з реакторного графггу та обростати його. Найбшьшу активн!сть за цим параметром виявив штам

Cladosporium cladosporioides 5, який було вилучено з уламку реакторного графиту Чорнобильського походження.

Вивчено вплив у-опромшення мало!" ¡нтенсивност1 на р1вень перекисного окисления лшдав, каталазну та глутатюнтрансферазну aKTHBHOCTi, nepeGir бшоксинтезуючих процеав у ряду нггам1в С. cladosporioides, що р1зняться за ступенем радюнуклщного забруднення м^сця вилучення, наявшстю тгментацп та ознаки радштрошзму.

Ключовг слова: лнкромщети-екстремофши, радюнуктдне забруднення, адаптацшш пристосування, житгев1 стратеги.

Вембер Валерия Владимировна. Эколого-физиологические особенности микромицетов зоны радионуклидного загрязнения. — Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.07 — микробиология. - Институт микробиологии и вирусологии НАН Украины, Киев, 2000.

Диссертация посвящена изучению свойств и особенностей микроскопических грибов, приспособленных к существованию на радиоактивно загрязненных субстратах на морфологическом, физиологическом и биохимическом уровнях. Дана оценка экологического состояния микобиоты внутренних помещений объекта «Укрытие».

Видовой состав грибов, поражающих стены и строительные конструкции исследованных помещений объекта «Укрытие», представлен 48 видами 24 родов. Среди них преобладают представители митоспоровых грибов. Доминирующее положение занимают только два вида - Cladosporium sphaerospermum Penz. та Pénicillium hirsutum Dierckx. Подавляющее большинство видов (66,7%) встречаются в единичных случаях, что, как и малое количество доминирующих видов свидетельствует про экологически крайне неблагоприятное состояние исследованного объекта. Об этом же свидетельствует и абсолютное доминирование в составе микобиоты пигментированных, особенно меланинсодержащих, видов грибов. Обнаружено значительное биоразнообразие в составе микобиоты исследованных помещений.

В морфологии доминирующих и постоянно встречающихся в помещениях 4-го блока ЧАЭС видов обнаружены серьезные морфологические изменения, сводящиеся к редукции спороношений, утоныпению мицелия и уплотнению его септации. У видов, частота встречаемости которых в изученных помещениях была наименьшей, не обнаружено морфологических отличий от контрольных штаммов. Это может служить доказательством существования таких видов в радиоактивно загрязненных помещениях только в переживающем состоянии.

Изучение скорости линейного роста и устойчивости к р-облучению видов, которые постоянно выделялись из помещений с разным уровнем радионуклидного загрязнения, позволило сформулировать положение о том, что наивысшая степень

резистентности у изученных нами видов достигается за счет объединения видом отдельных признаков г- и К-типов жизненных стратегий, что по современной классификации наиболее соответствует патиентам (Р-стратегам).

Впервые обнаружена способность микроскопических грибов, выделенных с радиоактивно загрязненных субстратов, активно накапливать радиоуглерод из реакторного графита, а также обрастать его. Наибольшей активностью по этому параметру отличался штамм Cladosporium cladosporíoides (Fres.) de Vries 5, который был выделен нами с обломка реакторного графита Чернобыльского происхождения.

Исследовано пролонгированное влияния у-излучения малой интенсивности на состояние системы перекисного окисления липидов и на протекание белоксинтезирующих процессов в клетках штаммов одного вида, различающихся уровнем радиоактивности субстрата выделения, наличием меланинового пигмента в клеточной стенке и признаком радиотропизма. Подобные исследования актуальны, так как именно такому воздействию подвергаются микроорганизмы, существующие на поставарийных территориях, на значительной части территорий хранилищ радиоактивных отходов и атомных полигонов.

Чувствительность системы ПОЛ к хроническому у-облученшо малой интенсивности обнаружена только у С. cladosporíoides 396, выделенного из чистых относительно радионуклидов почв, тогда как штаммы, выделенные из радиоактивно загрязненных субстратов не реагировали на пролонгированное облучения такой интенсивности. Обнаружена зависимость уровня глутатионтрансферазной активности от наличия пигментации у штаммов С. cladosporíoides. Уровень каталазной активности в ряду изученных нами штаммов не коррелировал с их пигментацией или признаком позитивного радиотропизма.

Отмечена активация белкового синтеза под действием хронического у-излучения малой интенсивности (6,5 мР/час) у темнопигаентированных штаммов С. cladosporíoides и угнетение этого процесса у а1Ь-мутанта. Скорость включения ,4С-лейцина в биомассу штаммов, изученная в динамике, зависит от наявности у них признака позитивного радиотропизма. Она медленнее снижается у штаммов С. cladosporíoides 4 и 5, проявивших этот признак, чем у С. cladosporíoides 396 и его а1Ь-мутанта, у которых он отсутствует.

Установлено, что без влияния у-облучения (в контроле) почти по всем изученным физиолого-биохимическим показателям: уровню ПОЛ, глутатионтрансферазной активности, начальными уровнем и скоростью включения 14С-лейцина в грибную биомассу - темнопигментированные штаммы находятся на одном уровне, тогда как у а1Ь-мутанта С. cladosporíoides соответствующие показатели были выше в 1,3-3,9 раза.

Полученные данные позволили сделать обобщения, какими признаками должны обладать микромицеты-экстремофилы для существования в условиях радионуклидного загрязнения: многоэшелонированная система защиты от

природных и антропогенных факторов в их экстремальной дозировке; способность реализовать ЛТ-тип жизненной стратегии, или объединять в себе отдельные признаки г- и ЛТ-типов стратегий (патиенты); повышенная у- и Р-устойчивости.

Ключевые слова: микромицеты-экстремофилы, радионуклидное загрязнение, адаптационные приспособления, жизненные стратегии.

Vember Valeriya Volodimirivna. Ecologically-physiological peculiarities of micromycetes from radionuclide polluted zone. - Manuscript.

Thesis for a candidate's degree by speciality 03.00.07 — microbiology. - Institute of microbiology and virology of National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2000.

The work is devoted to investigation of the micromycetes, adapted to life on the radioactive contaminated substrates, on the morphological, physiological and biochemical levels. On the basis of coefficients calculated for the mycobiota of the inner locations of "Shelter" object ecological characteristic of this object was made. The considerable morphological changes were established for the micromycetes, which were commonly spread in this ecotope.

The study of the linear growth velocity and P-resistance shown that highly resistance of micromycetes in investigated object was due to the combination of certain features of r- and .K-types of the life strategy.

The ability of micromycetes isolated from radioactive polluted substrates to accumulate intensively radiocarbon from reactor graphite and to overgrow it was discovered for the first time. Cladosporium cladosporioides 5 isolated from the fragment of reactor graphite by Chornobyl origin displayed the highest activity by this parameter.

The influence of low intensity of y-irradiation on the lipid peroxidation level, catalases, glutathion-transferases activities, passing of protein synthesis was investigated at the number of Cladosporium cladosporioides strains, isolated from the habitats with different degree of radionuclide contamination. Studied indexes was analyzed by presence or absence of the radiotropism property and by presence of the melanin pigment in the cell walls of these strains.

Key words: micromycetes-extremophiles, radionuclide contamination, adaptive features, living strategy.

Благодарность. Автор выражает искреннюю благодарность канд. физ.-мат. наук А.В. Жидкову за оказание технической и консультативной помощи в исследованиях, посвященных особенностям микобиоты объекта "Укрытие" и роста микроскопических грибов на графитных частицах. Особую благодарность за помощь в идентификации микроскопических грибов и за предоставление в наше распоряжение штаммов из коллекции отдела физиологии и систематики микромицетов высказываем к.б.н. В.А. Захарченко и ведущим инженерам отдела JI.B. Артышковой и JI.T. Наконечной.