Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
Экологическая роль антропогенного фактора в увеличении репродуктивного потенциала серебристо-черных лисиц
ВАК РФ 03.00.16, Экология

Автореферат диссертации по теме "Экологическая роль антропогенного фактора в увеличении репродуктивного потенциала серебристо-черных лисиц"

,с>- На правах рукописи

#

/

ЛОГАЧЕВА Ольга Александровна

ЭКОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ АНТРОПОГЕННОГО ФАКТОРА В УВЕЛИЧЕНИИ РЕПРОДУКТИВНОГО ПОТЕНЦИАЛА СЕРЕБРИСТО-ЧЕРНЫХ ЛИСИЦ

Специальность: 03.00.16 - экология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Красноярск-1998

Работа выполнена в Красноярском государственном аграрном университете.

Научные руководители: доктор биологических наук

профессор Е.М.Романова, кандидат сельскохозяйственных наук доцент НЛЗ.Кригер.

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

профессор Н.О.Сухова, кандидат биологических наук, профессор Н.И.Коростелева.

Ведущее учреждение. Красноярский государственный университет.

Защита диссертации состоится " 1998 года в час на

заседании диссертационного совета Д 120.45.01 при Красноярском государственном аграрном университете по адресу: 660049, Красноярск 49, проспект Мира 88.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Красноярского государственного аграрного университета

Автореферат разослан " о^сгл^Я 1998 года

Ученый секретарь диссертационного совета доктор сельскохозяйственных наук Р.М.Бабинцева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Диссертационная работа представляет собой целостный завершенный научный труд, основанный на обобщении исследований, проведенных лично автором или при его участии в процессе выполнения плановых научно-исследовательских работ Красноярского государственного агроуниверситета в период 1991-1997 гг. Изначально исследования проводились в рамках "Отраслевой научно-технической программы АПК" на период 1991-1995 г. N16. "Шерсть, меха и др. продукция животноводства" по разделу N2 'Технология производства шкурок пушных зверей", по теме "Поиск резервов производства пушнины в ведущих звероводческих хозяйствах Красноярского края и координировалась Главным управлением высших учебных заведений.

По характеру изучаемых явлений диссертационная работа относится к области аутэкологии и сочетает теоретические и экспериментальные аспекты, включая в спектр методических подходов обследование, наблюдение, эксперимент. При выполнении работы были использованы современные биологические, физиологические, морфологические, биометрические методы, биотехнологии in vitro и современные информационные технологии.

Актуальность работы. Аутэкология изучает взаимоотношения представителей вида с окружающей его средой, она главным образом определяет пределы устойчивости и предпочтения вида по отношению к различным экологическим факторам и исследует действие среды на морфологию, физиологию и поведение организма. Экологическим фактором является любой элемент среды, способный оказывать прямое влияние на живые организмы, хотя бы на протяжении одной из фаз их онтогенеза. Антропогенный фактор, относится к категории биотических средовых факторов. В данной работе нами исследовались различные аспекты антропогенного воздействия на проэмбриональный и постнатальные периоды онтогенеза серебристо-черных лисиц с целью повышения их репродуктивного потенциала.

В современном звероводстве процесс естественного размножения жестко контролируется антропогенным фактором. Видовые биологические особенности, полезные для видов в условиях их естественного существования, не удовлетворяют требованиям производства. В условиях неволи влияние факторов

окружающей среды, особенно, если они, в соответствии с технологическими потребностями, дозируются, приобретает специфические черты. Антропогенный фактор при этом приобретает роль управляющего фактора, по отношению к другим средовыми факторам, и в этой ситуации является доминирующим. Антропогенное воздействие в современном пушном звероводстве ориентировано на решение проблемы снятия природных ограничений для получения максимально возможного количества продукции. Это выражается в появлении биотехнологий in vivo и in vitro, позволяющих увеличить плодовитость зверей за счет естественного, нереализованного репродуктивного потенциала. Экологическая роль антропогенного воздействия, нацеленного на увеличение репродуктивного потенциала, в настоящее время изучена недостаточно.

Рабочая гипотеза. Основные проблемы современного звероводства, резко снижающие прибыль, обусловлены биологическими особенностями зверей, поскольку серебристо-черные лисицы в природе являются строго моноэс-тричными животными. У них процессы размножения, линьки и обмена веществ имеют сезонный характер и определяются факторами окружающей среды. После периода гона (по статистическим данным) около 30 % самок в зверосовхозах остаются неоплодотворенными, из-за чего звероводство несет значительные убытки, недополучая около 30 % приплода.

Учитывая биологические особенности репродуктивной системы и возможности современных биотехнологий размножения, можно не только свести к минимуму экономический ущерб, наносимый недополучением приплода, но и существенно расширить репродуктивный потенциал. Человек, разводя зверей в неволе, приобрел опыт направленного использования различных экологических факторов для изменения биоритмов, в частности, астральных циклов зверей. Безусловно, антропогенный фактор изменяет экологию изучаемого нами вида, но структура его экологической роли и формы ее выражения, а также возможные последствия в настоящее время нуждается в изучении.

Цель работы. Исследовать экологическую роль антропогенного фактора в увеличении репродуктивного потенциала серебристо-черных лисиц и перспективы дозированного использования других средовых факторов в современных биотехнологиях воспроизводства.

Задачи исследования:

- исследовать экологическую роль доместикации в популяциях серебристо-черных лисиц;

- изучить влияние дозированного использования светового фактора на рост и развитие яичников лисиц;

- исследовать индуцирующее влияние гормональной стимуляции на фол-ликулогенез и оогенез;

- провести сравнительные гисголопические исследования нормального и индуцированного оогенеза;

- выработать критерии отбора и оценки качества фолликулов и ооцитов для последующего культивирования in vitro;

- апробировать различные варианты культуральных сред для созревания ооцитов in v/fro;

- изучить влияние соматических клеток фолликулярного окружения на созревание ооцитов при культивировании in vitro.

Научная новизна исследований. В области аутэкологии впервые проведены параллельные исследования нормального и индуцированного оогенеза лисиц in vivo и in vitro при дозировании светового фактора и гормональной стимуляции. Исследована экологическая роль доместикации в наращивании репродуктивного потенциала зверей.

Выполнены исследования по оптимизации сред при культивировании ооцитов in vitro, исследовано влияние фолликулярного окружения на процесс созревания ооцитов, приведены результаты электронной микроскопии. Полученные результаты являются новыми; исследований по культивированию ооцитов серебристо-черных лисиц у нас в стране ранее не проводилось.

Новыми являются результаты сочетанного влияния светового фактора и гормональной стимуляции на оогенез в процессе полового созревания лисиц.

Практическая значимость. По материалам исследований в Красноярском государственном аграрном университете разработан и используется в учебном процессе на зооинженерном факультете с 1992 года лабораторный практикум по биотехнологии. В его основу положены методики, поставленные автором при выполнении диссертационной работы. Результаты работы ис-

пользуются при чтении курса "Биотехнология" на зооинженерном факультете и при проведении лабораторного практикума по эмбриоинженерии.

Результаты исследований внедрены в Зверосовхозе "Соболевском", ведущем звероводческом хозяйстве Красноярского края, и в зверосовхозе "Комсомольский" Ленинградской области.

Апробация работы. Материалы исследований представлялись и обсуждались на Международной конференции (Новосибирск, 1997); Всесоюзных конференциях (Целиноград, 1991; Горки, 1991); региональной (Абакан, 1997). Результаты работы ежегодно обсущались на НТС КрасГАУ, в 1992-1996 гг на HTQ Крайагропрома. Опубликованные результаты исследований участвовали в Краевом смотре-конкурсе публикации, в Краевом смотре-конкурсе НИР "Биотехнология и агроэкология" (Красноярск, 1994 г.), на краевых конференциях, производственных совещаниях главных специалистов племсовхозов, на конференциях профессорско-преподавательского состава Красноярского государственного агроуниверситета.

Публикации. Основные результаты опубликованы в 7 научных работах.

Структура и объем работы. Диссертация представляет рукопись объемом 154,стр. машинописного текста, содержит 16 рисунков, 8 таблиц, 32 фото и библиографию из 204 наименований. Она состоит из трех глав, заключения, выводов, библиографического списка, приложений. Краткое содержание работы приводится ниже.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объектом исследования являлись серебристо-черные лисицы зверосовхоза "Соболевский" Красноярского края, зверосовхоза Комсомольский Ленинградской области и экспериментального хозяйства ИЦиГ СО РАН (г. Новосибирск).

Изучение влияния светового фактора и гормональной стимуляции проводились на базе зверосовхоза "Комсомольский", исследование нормального фолликулогенеза и оогенеза на базе зверосовхоза "Соболевский", исследование экологической роли доместикации проводились на базе экспериментального хозяйства ИЦиГ СО РАН, гистологические исследования проводились на базе ВНИИРГЖ (г. Санкт-Петербург), электронная микросколия и цитометрия в

Биотехнологическом центре МГУ. В работе использовались самки серебристо-черных лисиц первого года жизни в период их полового созревания.

Полученные данные подвергнуты традиционной биометрической обработке на персональном компьютере с использованием электронных таблиц MS Excel.

В подразделе 2.1 приведены методики исследования влияния доместикации на репродуктивные ритмы и плодовитость лисиц.

Подраздел 2.2 посвящен описанию схемы эксперимента по изучению влияния света на репродуктивную функцию самок. Для проведения эксперимента всего было отобрано 185 самок первого года жизни.

Схема эксперимента была построена таким образом, чтобы первоначально достигался эффект искусственной временной транслокации зверей в конец декабря - период интенсивной подготовки к гону (посредством введения режима 18-ти часового затемнения), а затем - в начало февраля, то есть в фазу гона (при снятии режима затемнения).

В подразделе 2.3 приведены методики и схемы гормональной стимуляции. Гормональная стимуляция опытных групп проводилась по истечении недельного периода после снятия режима затемнения. Контрольные группы не подвергались гормональной обработке.

Подраздел 2.4 посвящен описанию методик гистологических исследований. Гистологические исследования проводились на базе ВНИИРГЖ (г.Санкг-Петербург) и в Биотехнологическом центре МГУ.

В подразделе 2.5 описаны методические приемы выделения фолликулов. В подразделе 2.6 описаны методики выделения ооцитов и их оценки, а в подразделе 2.7 - методики внефолликулярного и интрафолликулярного культивирования ооцитов. В подразделе 2.8 приводится состав сред, использовавшихся для манипуляций с ооцитами; в подразделе 2.9 описана методика приготовления тотальных препаратов ооцитов; в подразделе 2.10 приведено описание методики заключения гамет в агаровые блоки с последующей заливкой в парафин. Электронная микроскопия выполнялась на базе Биотехнологического центра МГУ. Подготовка к электронной микроскопии включала традиционные процедуры.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Экологическая роль доместикации

На начальном этапе данного раздела исследований нами была поставлена задача изучить взаимосвязь мезду плодовитостью, продолжительностью эстрального периода и поведенческими реакциями лисиц, которые в ходе доместикации, как известно, претерпевают существенные изменения.

В ходе проведенных нами исследований было установлено, что у доме-стицируемых ручных лисиц плодовитость с возрастом нарастала и достигала максимума к четвертому сезону размножения, затем начинала снижаться. В группе неручных лисиц прослеживалась аналогичная тенденция, но она была менее выраженной (рис.1).

При исследовании такого критерия как количество щенков в помете (на момент рождения) было показано, что в группах ручных и неручных лисиц, по нашим данным, достоверно большее количество щенков в гнезде у самок, принесших их во второй и в третий сезон щенения (рис.1). На следующем этапе исследовалась плодовитость в группах ручных и неручных лисиц, в зависимости от окраса меха. Мы отобрали две группы (ручных и неручных лисиц), имевших стандартный окрас меха. Было установлено, что во все сезоны размножения, у лисиц со стандартным окрасом меха, плодовитость доместицируемых ручных самок достоверно выше, по сравнению с неручными. Можно полагать, что у доместицируемых ручных лисиц ускоряется раннее по-стнатальное развитие гонад и увеличивается число одновременно созревающих яйцеклеток (рис.2).

Нами также было установлено, что существуют отличия в продолжительности периода спаривания у ручных самок по сравнению с агрессивными. Наблюдалось достоверное увеличение периода спаривания у ручных лисиц по сравнению с агрессивными (рис.3). Полученные нами результаты хорошо согласуются с существующей в литературе точкой зрения, что в процессе доместикации животных происходят глубокие изменения морфофункционального состояния их нейрогуморальной системы.

среднее

Рис.1. Плодовитость самок серебристо-черных лисиц

среднее

Рис. 2. Плодовитость самок серебристо-черных лисиц со стандартным окрасом.

сроки спари-

1 2 3 4 5 возраст самок, г

Рис. З.Сроки окончания спаривания основной массы самок

В заключение данного раздела исследований нами отмечено, что доместикация глубоко затрагивает экологию серебристо-черных лисиц, поскольку изменяет отношения этого вида с окружающей средой. Это выражается в повышении плодовитости, в расширении сезонных границ репродуктивной функции, сдвиге сроков спаривания.

3.2. Влияние светового фактора и гормональной стимуляции на развитие яичников

Фотопериодизм является одним из важных экологических факторов, стабилизировавших в ходе эволюции многие физиологические функции. Рабочая гипотеза данного этапа исследований предполагала, что если фотопериодическая информация реализуется через сложную нейрогуморапьную цепь, то в воздействиях света заложены огромные возможности управления важнейшими процессами в организме, в частности процессами репродукции.

На данном этапе исследований была предпринята попытка сдвинуть жестко стабилизированный репродуктивный цикл, сделать его управляемым. Для этого нами было использовано двойное воздействие: во-первых, это изменение продолжительности светового дня для транслокации зверей в период, соответствующий по долготе светового дня времени интенсивной подготовки к гону; во-вторых, гормональные обработки для создания определенного гормонального фона, соответствующего периоду гона. Оценочным критерием ре-, зультатов исследований являлись яичники: размеры, вес, морфология, состояние фолликулов и ооцитов.

Три экспериментальные группы были выделены на основе биологического возраста самок (в неделях) на начало эксперимента: 1-я группа - 24 (п=60), 2-я фуппа - 26 (п=10), 3-я группа - 28 (п=15). Схемы гормональной стимуляции предусматривали воздействие сраз^ на все три уровня гормональной регуляции в организме.

В результате проведенных йами исследований было показано, что все шесть разработанных во ВНИИРГЖ схем гормональной стимуляции оказались эффективными, хотя по выраженности эффекта имели индивидуальные отличия.

Полученные нами результаты свидетельствовали, что введение режима искусственного освещения в возрасте 30-31 недели стимулировало развитие

яичников, последующее использование гормональной стимуляции давало также дополнительный импульс их развитию. Вклад в ускорение развития яичников за счет введения искусственного фотопериода в возрасте 30-31 недели в среднем составил 67,5 %, вклад гормональной стимуляции - 134.7 и 154,5 % соответственно (табл. 1).

Таблица 1

Увеличение веса яичников за счет светового и гормонального воздействия

Экспериментальные группы Возраст, нед.

30 31 32 33 34 35 38

К1-ЕСТ 0,098 0,11 0,144 0,158 0,201 0,289 0,364

К2-ЗАТ 0,165 0,184 0,216 0,256 0,286 0,362 0,386

(68,0)' (67,3) (50,0) (62,0) (41,6) (25,0) (6,0)

1ГС 0,174 0,246

(77.6) (123,6)

2ГС 0,250 0,290

О ¡5,1) (163,5)

ЗГС 0,148 0,244

(51,0) (121,8)

4ГС 0,270 0,296

(175,6) (169,3)

5ГС 0,258 0,294

(163,3) (167,3)

6ГС 0,264 0,300

(169,4) (172,7)

1-ЭКС 0,230 0,280

(134,7) (154,5)

2-ЭКС 0,350 0,374

(143,1) (136,7)

3-ЭКС 0,394 0,447 0,543

(95,1) (54,5) (49,1)

(...)* - по отношению к К1-ЕСТ, %.

Вклад в ускорение развитая яичников за счет введения режима искусственного освещения в возрасте 32-33 недель в среднем составил 50.0 и 62,0 % соответственно, вклад гормональной стимуляции - 143.1 и 136,7 % соответственно (табл. 1).

Полученные результаты подтверждают, что режим искусственного освещения во всех обследованных нами возрастных группах стимулирует развитие

яичников, а последующее введение гормональной стимуляции дает также дополнительный импульс их развитию. Однако, начиная с 32-й недели по направлению к 38-й неделе влияние светового фактора и эффект гормональной стимуляции на развитие яичников начинал прогрессивно снижаться, поскольку вступали в действие естественные нейрогуморальные механизмы подготовки зверей к гону и вес яичников в контрольных группах нарастал, разница между контрольными и опытными группами уменьшалась (рис. 4).

Встал закономерный вопрос: как продвигает во времени развитие яичников лисиц каждый из воздействующих факторов, и они оба в совокупности?

Полученные нами результаты обнаружили заметное смещение сроков развития яичников в экспериментальных группах самок по сравнению с обеими контрольными. Оценка степени различий между экспериментальными и контрольными фуппами проводилась по критерию Стьюдента.

Анализ расчетных значений 1с>расч позволил сделать вывод о том, что изменение светового режима и применение гормональной стимуляции оказывало достоверное влияние на процесс развития яичников (значения 1с1расч для равновозрастных групп самок контрольных и экспериментальных групп превышали табличное значение 1с1=2,78 для р=0,95). При этом меньшие, чем 2,78 различия мезду выборками, свидетельствовали об отсутствии достоверной разницы в полученных результатах.

Этот момент являлся наиболее существенным, поскольку на основании отсутствия достоверной разницы ^расч«1с1таб) между рядами данных, можно сделать заключение, что различия между отдельными сравниваемыми разновозрастными группами нивелируются. В этом случае можно говорить о наличии временного тренда в процессах, протекающих в них.

Нами установлено, что у 30-ти недельных самок 1-й экспериментальной группы (кроме первой и третьей подгрупп) и 33-х недельных самок контрольной группы искусственного светового режима критерий достоверности разницы близок к нулю, следовательно, в этом случае существует временной тренд в три недели (рис.5).

В группе самок в возрасте 31-й недели 1-й экспериментальной группы (кроме первой и третьей подгрупп) и 34-х недельных самок контрольной группы с искусственным световым режимом, критерий достоверности разницы также

32 33 34 Возраст, нед.

Рис.4. Развитее яичников самок серебристо-черных лисиц.

32 33 34

Возраст, нед.

1ГС_30 2ГС_30

згс_зо 4ГС_30 6ГС_30 6ГС_30 ТаблМ

Рис.5. Кривые, отображающие изменение критерия Стьюдента (расчетного) меяеду экспериментальными подгруппами (30-я неделя) и контролем

(К2-ЗАТ).

близок к нулю. Это свидетельствует, что гормональная стимуляция на фоне искусственного светового режима обеспечивала временной сдвиг в три недели, как и в первом случае (рис. 6).

Временной сдвиг в две недели (рис. 6) на фоне режима искусственного освещения обеспечивали гормональные схемы первой и третьей подфупл первой экспериментальной группы.

о. а

с ®

ш

32 33 34 Возраст, нед

—♦— 1ГС.31 -0-2ГС.31

згс_з1

-К-4ГС_31 —К—5ГС_31 —О— 6ГС.31 ■ ■ I габл

Рис. 6. Кривые, отображающие изменение критерия Стыодента (расчетного) между экспериментальными подгруппами (31-я неделя) и контролем (К2-ЗАТ).

Наибольший временной тренд в 5 недель обеспечивало сочетанное влияние гормональной стимуляции и искусственного светового режима, это наглядно демонстрируется отсутствием достоверных различий между группами 30-31-недельными самками (кроме гормональных схем 1-й и 3-й подгрупп) и 35-ти недельных самок контрольной группы, содержавшейся в режиме естественного освещения (рис.7-8).

Достоверные отличия в развитии яичников наблюдались у самок 2-й и 3-й экспериментальных групп по сравнению с развитием яичников в обеих контрольных группах. Эти результаты также подтвердили эффективность исполь-

33 34

Возраст, нед

Рис.7. Кривые, отображающие изменение критерия Стьюдента (расчетного) между экспериментальными подгруппами (30-я неделя) и

контролем

32 33 34 Возраст, нед.

—•—1гс_31 —О—2ГС_31 —4— ЗГС.31 -Х-4ГС.31 —*—5ГС_31 -О—бГС.31 —I—Табл

Рис.8. Кривые, отображающие изменение критерия Стьюдента (расчетного) между экспериментальными подгруппами (31-я неделя) и контролем

зования искусственного светового режима и гормональной стимуляции для регуляции репродуктивных циклов самок.

Нельзя не отметить, что в возрасте 38-ти недель различия в развитии яичников контрольных и экспериментальных групп уменьшались, поскольку в этот возрастной период в силу вступали естественные нейрогуморальные механизмы регуляции подготовки к гону и это сказывалось на развитии яичников в контрольных группах.

Основываясь на полученных результатах можно заключить, что за счет применения искусственного светового режима и гормональной стимуляции в экспериментальных группах процесс развития яичников опережает их развитие в контрольных в среднем на 3-4 недели.

У лисиц после гормональной стимуляции отмечалось значительное увеличение массы рогов матки и яйцеводов, интенсивно пронизанных кровеносными сосудами.

3.3. Гистология нормального и гормональноиндуцированного оогенеза

Морфологическое изучение гонад и оценка их развития по массе яичников не давала ясной картины о характере влияния гормональных препаратов в сочетании с искусственным световым режимом на гаметогенез. Поэтому следующим этапом нашей работы явилось гистологическое исследование гонад.

Полученные при забое самок яичники после проведения соответствующей обработки направлялись на гистологический анализ. При гистологическом исследовании было установлено, что в возрасте 24-х недель половые клетки представлены ооцитами на стадии диплотены. Оогонии и ооциты на ранних стадиях профазы мейоза в них отсутствовали. Ооциты были сосредоточены в примордиальных фолликулах. Встречались однослойные, многослойные и ан-тральные фолликулы. В числе примордиальных фолликулов встречались ат-ретаческие, в то время как среди растущих и антральных фолликулов атрезия была выражена в меньшей степени.

Полученные результаты позволили заключить, что в яичниках лисиц число антральных фолликулов является индивидуальной характеристикой и ее величина может отличаеться более чем в два раза. Среди антральных фолликулов в среднем 10 % содержали по 2 ооцита.

Также нами было установлено, что антрапьные фолликулы на поверхности яичников отсутствовали, чтобы они вышли на поверхность, очевидно, требовалось дополнительное время для завершения полового созревания.

Динамику процесса роста фолликулов принято исследовать в период полового созревания самок, так как в каждом возрастном периоде имеются определенные, преобладающие в данном конкретном возрасте стадии развитая фолликула.

Существуют реальные потенциальные возможности наращивания репродуктивного потенциала зверей, поскольку к периоду половозрелости в яичниках млекопитающих содержатся сотни тысяч половых клеток, из которых впоследствии овулирует только несколько десятков ооцитов, остальные претерпевают процесс физиологической дегенерации или атрезии. Поэтому наращивание репродуктивного потенциала зверей, учитывая их биологические особенности, определяется антропогенным фактором, вмешательство которого способно сохранить половые клетки от дегенерации за счет использования биотехнологий культивирования ооцитов in vitro. Но, в настоящее время, процессы происходящие в период полового созревания в яичниках серебристо-черных лисиц изучены недостаточно, поэтому отсутствуют критерии, по которым можно отбирать ооциты для дальнейшего культивирования. Мы поставили перед собой задачу разработать цитологические критерии отбора ооцитов, пригодных к культивированию.

В данном разделе исследований нами было установлено, что основным критерием атрезии в антральных фолликулах являлось наличие пикноза в клетках гранулезы. Также было установлено, что при атрезии крупных фолликулов в строме яичника образуется соединительная ткань гиалинового рубца; при дегенерации фолликулов разрушается его базальная мембрана и в фолликулы проникают клеточные элементы, окружающие фолликулы (фото 1, 2).

Дегенерация менее продвинутых в развитии фолликулов происходила без образования гиалинового рубца. Нами обнаружены два варианта этой дегенерации. В первом случае наблюдалась индукция мейоза при еще не сформированном фолликулярном окружении, это приводило к гибели ооцитов. Такие ооциты постепенно мигрировали в мозговой слой, как и нормально развивающиеся. У серебристо-черных лисиц данный тип дегенерации широко распрост-

Фото '¿. Дегенерирующий фолликул

ранен. Второй тип дегенерации первичных или бесполостных фолликулов выражался в агломерации хромосом, это приводило к пикнотическим изменениям ядра ооцита (фото 3,4).

По результатам наших исследований гормональная стимуляция самок вызывала именно эти два типа дегенерации, которые проявлялись в гораздо более выраженной форме и значительно чаще, чем в контрольных группах.

В заключение можно сделать вывод, что половому созреванию яичников самок предшествует пик ювенильной атрезии, который на ранних и поздних стадиях подготовки к гону имеет отличительные особенности.

3.4. Исследование нормального оогенеза in vitro

В яичниках животных закладываются десятки тысяч гамет, но только незначительная их часть дает начало новым организмам. Влияние антропогенного фактора на процессы размножения зверей, содержащихся в неволе, достигло своего апогея при создании биотехнологий культивирования ооцитов и оплодотворения in vitro.

В настоящее время для некоторых биологических видов уже разработаны биотехнологии, позволяющие недозревшие яйцеклетки извлекать из яичников и культивировать до стадии метафазы I или II, то есть до стадии зрелости, при которой оплодотворение уже возможно. Для серебристо-черных лисиц такие технологии пока не разработаны, и это порождает много проблем.

В данном разделе рассматриваются результаты работы по подбору и оптимизации сред для культивирования ооцитов.

В наших исследованиях изучалось влияние сыворотки крови и альбумина на созревание ооцитов. Наиболее благоприятная картина, с точки зрения сохранения жизнеспособности гамет, наблюдалась при использовании аутоло-гичной сыворотки, по сравнению с использованием альбумина. Однако, оставался открытым вопрос в какой дозе гомологичная сыворотка способна оказывать благоприятный эффект in vitro. Во второй серии экспериментов было показано, что лучшие результаты дает использование сыворотки в концентрации от 10-ти до 20-ти объемных процентов (фото 5,6).

Культивирование ооцитов внутри фолликулов позволяет обеспечить условия, близкие к созреванию ооцитов in vivo, поэтому мы использовали этот методический прием in vitro.

Фотоз.Дегенерирующий бесполостной фолликул; сплющенный ооцит, пикноз в клетках гранулёзы

Фото^»Растущий ооцит без нормального фолликулярного окружения

Фото Ъ. Ооцит после культивирования е среде с фолликулином и сывороткой крови лисиц

Фото 6. Ооциг после культивирования в среде без альбумина (ооцит-дегекерирувлдай, разрыв зоны леллюцвда, слипскеся липидкие гранула, неравномерно расположенные б цитоплазме

В этой серии опытов решался вопрос о целесообразности использования гормональных добавок и их оптимальных дозах. Нами было установлено, что жизнеспособность ооцитов при интрафолликулярном варианте культивирования хорошо сохранялась вне зависимости от уровня гормона в среде, поскольку эстрадиол-17, необходимый для завершения созревания ооцитов, секретируется фолликулярными клетками.

В наших исследованиях была предпринята попытка определить степень влияния кумулюсного окружения и фолликулярных клеток на развитие ооцитов лисиц при культивировании in vitro: 1) без кумулюса, 2) с фолликулярными клетками, 3) с кумулюсом и фолликулярными клетками.-,-

Было установлено, что наилучший результат получен при культивирование ооцитов с кумулюсом и фолликулярными клетками. Это, очевидно, объясняется тем, что in vivo фолликулярные клетки питают ооцит, обеспечивая ему энергетические субстраты.

В ряде случаев, при культивировании ооцитов in vitro, функциональное созревание достигалось и без соматического окружения, но у многих видов млекопитающих это невозможно.

В заключение следует отметить, что использование при культивировании ооцитов гомологичной сыворотки и элементов соматического окружения обеспечивало лучшую выживаемость клеток.

3.5. Культивирование и электронная микроскопия ооцитов гормонально-стимулированных лисиц

Культивирование ооцитов серебристо-черных лисиц возможно, поскольку ооциты млекопитающих при извлечении их из фолликулов в культурапьную среду сохраняют способность к спонтанному возобновлению мейоза. После извлечения ооцитов из фолликула, в культурапьной среде они высвобождаются из состояния мейотического торможения, возобновляют мейоз, достигая метафазы И.

Литературные данные свидетельствуют, что при оплодотворении ооцитов, культивированных in vitro высок процент неудач. Сперматозоиды либо не проходят через цитоплазматическую мембрану, либо не формируют в цитоплазме мужской пронуклеус. Существует гипотеза, что причиной тому является непол-

ное созревание цитоплазмы из-за недостатка гонадотропных и половых стероидных гормонов.

Мы предприняли попытку проверки этой гипотезы, используя предварительную гормональную стимуляцию самок, по схеме описанной в главе 2, и среды для культивирования с гормональными добавками.

Полученные нами электронно-микроскопические снимки результатов эксперимента, наглядно продемонстрировали повреждение клеток; дегенеративные процессы в ооцитах лисиц сопровождались укрупнением липидных гранул, содержащихся в цитоплазме.

Исследование состояния фолликулярных клеток ооцит-кумулюсных комплексов из контрольных групп методами электронной микроскопии обнаружило, что значительная часть этих клеток погибла, их цитоплазма лизирована, кариоплазма светлая, практически не содержащая хроматина.

У серебристо-черных лисиц, при приготовлении ооцитов для культивирования in vitro, ооциты часто самопроизвольно освобождались от клеток куму-люса. Такие ооциты после культивирования имели все признаки ядерного созревания (разрыв зародышевого пузырька, наступление метафазы 1 и мета-фазы 2, выделение первого полярного тельца).

Ооциты всех групп, культивировавшиеся в среде без белка, имели значительные дегенеративные изменения, которые выражались в разрыве зоны пеллюцида, агломерации липидных гранул, полной потере фолликулярных клеток.

В яичниках гормональностимулированных самок, все обследованные ооциты принадлежали к категории дегенерирующих. Поскольку дегенерация была характерна для всей группы ооцитов, можно полагать, что гормональная стимуляция до наступления полового созревания приводит к дегенерации созревающей в этот период популяции ооцитов.

ВЫВОДЫ

1. Доместикация, как одна из сильнейших форм антропогенных воздействий, изменяет взаимоотношения вида с окружающей средой.

2. Доместикация способствует увеличению репродуктивного потенциала самок серебристо-черных лисиц, это выражается в увеличении плодовитости, расширении сезонных границ репродукции, расширении периода спаривания и изменении их частоты.

3. Искусственный световой режим, разработанный нами, обеспечивал прогрессивный временной сдвиг в развитии яичников на две-три недели.

4. Сочетание искусственного светового режима и гормональной стимуляции обеспечивало опережающее развитие гонад на 4- 5 недель.

5. Половому созреванию яичников самок предшествовал пик ювенильной атрезии, который на разных стадиях подготовки к гону имел отличительные особенности.

6. Основным критерием атрезии в антральных фолликулах являлось наличие ликноза в клетках гранулезы;

7. При атрезии крупных фолликулов в строме яичника образовывалась соединительная ткань гиалинового рубца, дегенерация менее продвинутых в развитии фолликулов происходила без образования гиалинового рубца.

8. Дегенерация фолликулов выражалась в разрушении их базальной мембраны и в проникновении в фолликулы окружающих клеточных элементов.

9. Гормональная стимуляция самок, как одна из форм антропогенного воздействия, вызывала массовую дегенерацию ооцитов in vivo.

, 10. Дегенеративные процессы при гормональной стимуляции затрагивали первичные фолликулы, это выражалось массово в индукции деления ооцитов при несформированном фолликулярном окружении или же в агломерации хромосом половых клеток.

11. При гормональноиндуцированном оогенезе антральные фолликулы на поверхности яичника отсутствовали.

12. При культивировании ооцитов лисиц in vitro положительный эффект наблюдался в присутствии элементов соматического окружения и при добавлении в культуральную среду гомологичной сыворотки от 10 до 20 %.

13. Дегенеративные процессы в ооцитах лисиц при культивировании in vitro сопровождались укрупнением липидных гранул в цитоплазме.

14. Введение в культуральную среду фолликулостимулирующего гормона задерживало развитие атретических процессов в ооцитах и способствовало просветлению липидных гранул.

Для целей культивирования целесообразно использовать яичники, в которых миновал пик ювенильной атрезии.

1. Романова Е.М., Мыскова O.A. Культивирование доимплантационных эмбрионов in vitro: Материалы науч. конф. по сельскохозяйственной биотехнологии. -Целиноград, 1991.-С.142-143.

2. Романова Е.М., Мыскова O.A. Малый практикум по змбриоинженерии в сельскохозяйственном ВУЗе: Тез. докладов науч.-праюич. конф. по биотехнологии и воспроизводству в животноводстве. -Горки, 1991.-С.77-78.

3.Романова Е.М., Мыскова А.О., Кригер Н.В., Бобрешова Е.А. Созревание ооцитов лис вне организма: Тез. науч.конф. проф.-препод. состава Крас ГАУ «Наука - сельскохозяйственному производству». -Красноярск: Изд-во Крас-ГАУ, 1993.-С.60-61.

4. Логачева O.A., Шатурина Л.П. Криобанк гамет пушных зверей: Материалы. науч.конф. проф.-препод. состава Крас ГАУ «Технологии неистощи-тельного землепользования. -Красноярск: Изд-во КрасГАУ, 1997.-С.62-63.

5. Логачева O.A. Экологические аспекты доместикации: Материалы Южносибирской региональной науч. конф.-Абакан, 1997.-0.45.

6. Шатурина Л.П., Логачева O.A. Трансплантация эмбрионов как элемент сохранения генофонда: Материалы, науч.конф. проф.-препод. состава Крас ГАУ «Технологии неистощительного землепользования. -Красноярск: Изд-во КрасГАУ, 1997.-С.66-67.

7. Логачева O.A. Цитологический анализ ооцитов лисиц: Материалы XXXV Международной конф. «Студент и науч.-технический прогресс. -Новосибирск,

ПРЕДЛОЖЕНИЯ

Список работ, опубликованных по теме диссертации.

1997.-С.98-99.

Отпечатано в типографии ООО "ПРИНТ" т.45-46-34 тираж 100 экз.