Бесплатный автореферат и диссертация по сельскому хозяйству на тему

Эффективность тестирования качества клейковины яровой мягкой и твердой пшеницы на основе гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе

ВАК РФ 06.01.05, Селекция и семеноводство

Автореферат диссертации по теме "Эффективность тестирования качества клейковины яровой мягкой и твердой пшеницы на основе гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе"

РГБ ОД

На правах рукописи

4

КИБКАЛО Илья Анатольевич

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕСТИРОВАНИЯ КАЧЕСТВА КЛЕЙКОВИНЫ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ И ТВЁРДОЙ ПШЕНИЦЫ НА ОСНОВЕ ГИДРОФОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В БЕЛКОВОМ КОМПЛЕКСЕ

06.01.05 - Селекция и семеноводство

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата сельскохозяйственных наук

Саратов - 2000

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте сельского хозяйства Юго-Востока.

Научные руководители:

доктор биологических наук В.М.Бебякин,

кандидат биологических наук С.В.Тучин.

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор, заслуженный деятель науки РФ В.А. Крупнов

кандидат сельскохозяйственных наук Г.И. Костина

Ведущая организация - Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И. Вавилова.

Защита диссертации состоится «11 » мая 2000 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета К 020. 29. 01. Научно-исследовательского института сельского хозяйства Юго-Востока но адресу: 410020, Саратов, ул. Тулайкова 7, НИИСХ Юго-Востока

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке института Автореферат разослан «Ii___» апреля 2000 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

кандидат биологических наук O.A. Евдокимова

© НИИСХ Юго-Востока, 2000 г.

У- iTW, ,7

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. С повышением требований к качеству зерна вновь создаваемых сортов важную роль приобретает разработка принципиально новых методов и подходов к оценке селекционного материала. Для тестирования различных свойств клейковины предложено сравнительно большое количество критериев, оценка которых, как правило, трудоемка и требует значительного расхода зерна на анализ.

К настоящему времени накоплено достаточное количество данных, указывающих на важную роль гидрофобных взаимодействий в определении структурных различий клейковины разного качества (Княгиничев М.И., Ма-рушев А.И., Черняк Б.И, 1972; Конарев В.Г., 1980; Созинов A.A., 1985; Павлов А.Н., 1992; Труфанов В.А., 1994).

Использование флуоресцентных зондов, нашедших свое применение в различных отраслях биологии (Daliner G., Azzi А., 1972; Мецлер Д., 1980; Владимиров Ю.А., Добрецов P.E., 1980 и др.), позволяет изучить гидрофобные взаимодействия в белковом комплексе клейковины в прикладном аспекте.

Цель и задачи исследований. Целыо исследований являлось разработать и изучить принципиально новые критерии качества яровой мягкой и твердой пшеницы. Исходя из этого, ставились следующие задачи:

- изучить гидрофобные взаимодействия в белковом комплексе клейковины и разработать на их основе методику оценки качества клейковины по предельно минимальным пробам зерна;

- оценить тесноту и направление фенотипической и генотипической

• корреляции между показателями флуоресцентного анализа и традиционными критериями различных свойств клейковины и теста;

- выявить воспроизводимость и дифференцирующую способность показателей флуоресцентного зондирования;

- изучить информативность показателей гидрофобных взаимодействий и минимизировать на этой основе флуоресцентную оценку качества клейковины;

- изучить возможность оценки устойчивости генотипов яровой мягкой пшеницы к изменению условий внешней среды в период формирования, налива и созревания зерна по данным флуоресцентного анализа.

Научная новизна. Разработана микрометодика оценки качества клейковины яровой мягкой и твердой пшеницы, не имеющая отечественных и зарубежных аналогов.

Изучены корреляционные отношения между новыми критериями и традиционными показателями различных свойств клейковины и теста на фснотипическом и генотипическом уровнях. Выявлены наиболее информативные показатели гидрофобных взаимодействий для оценки качества клейковины.

Впервые показана принципиальная возможность отбора генотипов яровой мягкой пшеницы по реакции на изменение условий произрастания в наиболее ответственный для формирования качества урожая период (формирование, налив и созревание зерна).

Практическая ценность работы. Разработана ускоренная микрометодика оценки качества клейковины (до 50 образцов за смену) по минимальным навескам зерна (~ 2г) и обоснована минимальная система показателей гидрофобных взаимодействий, позволяющая оптимизировать проработку ранних поколений яровой мягкой и твердой пшеницы. Некоторые параметры флуоресцентного анализа (Ф24) могут быть использованы для графического отображения «поведения» генотипов яровой мягкой пшеницы по качеству клейковины в период налива и созревания зерна.

Апробация работы. Результаты исследований, изложенные в диссертации, докладывались на научно-практической конференции по вопросам

повышения устойчивости зернового хозяйства в условиях Поволжского региона (Кинель, 1997г.), международной научной конференции "Развитие научного наследия академика Н.И. Вавилова" (Саратов, 1997г.), Всероссийской научно-практической конференции "Проблемы повышения качества зерна" (Саратов, 1997г.), Первой международной конференции "Качество-98" (Москва, 1998г.) и на научной сессии Северо-Восточного научно-методического центра Россельхозакадемии по проблемам селекции и созданию адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результатам и перспективам (Киров, 1998г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, предложений и рекомендаций, списка литературы и приложений. Текст изложен на 207 машинописных страницах и иллюстрирован 56 таблицами и 10 графиками. Список использованной литературы содержит 146 источников, в том числе 51 на иностранных языках.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ ИССЛЕДОВАНИЙ

В качестве экспериментального материала привлекали 35 разнокачественных сортов и линий яровой мягкой пшеницы (Лютесценс 62, Альби-дум 43, Саратовская 29, Саратовская 38, Саратовская 42, Саратовская 46, Саратовская 52, Саратовская 55, Саратовская 58, Саратовская 60, Саратовская 62, Ершовская 32, Целинная 20, Тулайковская степная, Диамант, Акмо-линка 1 и др.), а также 24 сорта и линии Triticum durum (Целиноградская 85, Безенчугская 139, Гордеиформе 2946, Алмаз, Саратовская 57, Саратовская 59, Саратовская золотистая, Краснокутка 6, Светлана, Харьковская 46, Оренбургская 10, Людмила и др.). В опытах по изучению возможностей тес-

тирования адаптивных свойств яровой мягкой пшеницы в период налива и созревания зерна использовали разнокачественные сорта местной селекции (Альбидум 43, Саратовская 52, Саратовская 55). Плевые опыты проводили в селекционном севообороте НИИСХ Юго-Востока (Саратов). Повторность опытов трехкратная, размещение сортов и линий в блоках рендомизирован-ное, норма высева - 358 семян на 1 м2.

Упруго-вязкие свойства клейковины тестировали на ИДК - 1. Оценивали также ее растяжимость (Козьмина Н.П., Любарский Л.Н.,1962), рас-плываемость (Беркутова Н.С., 1991), набухание - Qh (Майстренко О.И., Трошина A.B., Лысенко Р.Г., 1964) и растворимость - Qp (Бебякин В.М., Пискунова Г.В., Романова O.A., 1976). Седиментационный анализ проводили по микрометодам, разработанным в НИИСХ Юго-Встока (Бебякин В.М., Бунтина М.В., Васильчук Н.С., 1987; Бебякин В.М., Бунтина М.В., 1991). Содержание белка в зерне определяли на анализаторе фирмы "Technicon" (США). Количество сухой клейковины оценивали по Н.С. Бср-кутовой (1991), а ее гидротационную способность - по А.Б. Вакару (1961). Реологические свойства теста яровой мягкой пшеницы исследовали на мик-рофаринографе (Германия), а твердой - на миксографе (США) в соответствии с прилагаемыми к ним инструкциями.

Флуоресцентный анализ проводили по методике, разработанной автором в процессе исследований совместно с C.B. Тучиным и В.М. Бебякиным (методика патентуется). Интенсивность флуоресценции регистрировали с помощью флуориметра, собранного на базе фотоэлектроколориметра КФК - 2. В качестве флуоресцентного зонда использовали 1-анилинонафталин - 8-сульфанат (АНС).

Воспроизводимость показателей гидрофобных взаимодействий оценивали по степени варьирования (а, V) их значений при 25-кратном и независимом анализе зерна сорта Саратовская 29. О дифференцирующей способности критериев судили по коэффициенту межсортовой вариации (CV), за

вычетом ошибки измерения признака. Сопряженность показателей флуоресцентного зондирования с характеристиками качества клейковины и теста на фенотипическом и генотипическом уровнях определяли с помощью корреляционного (rg) и ковариационного (Sxy) анализов. Для оценки информативности показателей гидрофобных взаимодействий и их вклада в физические свойства клейковины и теста использовали факторный и путевой анализы. Экспериментальные данные обрабатывали по комплексу программ AGROS.

Погодные условия в период вегетации растений в годы проведения полевых опытов были различными: 1996 - умеренно засушливый, 1997 -очень влажный, 1998 - остро засушливый.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

ПОКАЗАТЕЛИ ГИДРОФОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В БЕЛКОВОМ КОМПЛЕКСЕ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ КАК КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА КЛЕЙКОВИНЫ

Методика флуоресцентного анализа, основные принципы и подходы к ее разработке

Различия между сильной и слабой клейковиной обусловлены внутренней структурой белка: количеством и прочностью внутри- и межмолекулярных связей в белковой глобуле, т.е. плотностью упаковки белковой макромолекулы (Стрельникова М.М., 1961; Труфанов В.А., 1994 и др.). Гидрота-ция белковго комплекса в процессе его взаимодействия с водой - основополагающее свойство при образовании клейковины (Кретович В.Л., 1991; Труфанов В.А.,1994). Механизм этого взаимодействия обеспечивается за счет наличия у белковой макромолекулы гидрофильных и гидрофобных участков (Вакар А.Б., 1961; Шибата К., 1974; Козьмина Н.П., 1976 и др.). Полипептидная цепь в водном растворе спонтанно скручивается так, что ее

гидрофобные боковые цепи оказываются спрятанными внутри, образующейся глобулы, а полярные - на поверхности (Стайер Л., 1984). Молекула флуоресцентного зонда, благодаря своим физико-химическим свойствам способная проникать внутрь исследуемого объекта, например, такого, как белковая макромолекула, не связываясь с ним химически, после облучения ультрафиолетом способна излучать свет, т.е. флуоресцировать, причем, по изменению параметров этого излучения можно судить о физико-химическом состоянии исследуемого объекта (Шибата К., 1974; Мецлер Д., 1980; Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980).

Первый этап исследований заключался в том, чтобы на основе этих и других известных из литературы теоретических предпосылок разработать методику флуоресцентного зондирования клейковинных белков, что требовало осуществления поиска оптимальных физико-химических параметров рабочего раствора, концентраций красителя, афегатного состояния изучаемого объекта.

В ходе многочисленных экспериментов была разработана методика флуоресцентного зондирования, основанная на титровании мучной взвеси по концентрации АНС. С помощью ее определяли: скорость связывания красителя (Ву), интенсивность флуоресценции при максимальном насыщении мест связывания красителя на частицах продуктов размола зерна (а), константа связывания красителя (Кс), интенсивность флуоресценции при концентрации красителя 24 мк моль/л (Ф24). Дальнейшие эксперименты, направленные на повышение воспроизводимости и дифференцирующей способности данных, привели к созданию динамического способа флуоресцентного зондирования, учитывающего временные характеристики флуоресценции, который и был принят за основной. С помощью этого метода определяли следующие показатели: интенсивность флуоресценции (Фо), падение интенсивности флуоресценции за 1 мин. (Р1), интенсивность флуоресценции после 5 мин. отстаивания взвеси (Фз), падение интенсивности флуо-

ресценцни за 5 мин. (Р5), точку замедленного осаждения (ТЗО), скорость осаждения взвеси муки (Кос), интенсивность флуоресценции при бесконечном отстаивании взвеси (Ф=о ), константу осаждения взвеси (Кос) и соотношения Ф0/Р1, Ф0/Р5. Показатели динамического способа зондирования неплохо воспроизводятся и в достаточной степени дифференцируют анализируемый материл (табл. 1).

Таблица 1.

Воспроизводимость показателей флуоресцентного зондирования и

Показатель Воспроизводимость значений (У25) Коэффициент межсортовой вариации (СУ) Дифференцирующая способность

Фо 2,92 5,81 5,25

Р1 12,77 49,94 47,39

Ф0/Р1 11,90 94,99 92,61

Фз 4,01 11,33 10,53

Рз 8,78 28,50 26,74

Ф0/Р5 8,22 30,75 29,11

ТЗО 13,44 32,88 30,19

Сое 11,69 43,02 40,86

Фоо 4,04 13,12 12,31

Кос 8,87 30,83 29,06

Взаимосвязь между показателями гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе и критериями качества клейковины на феноти-пическом и генотииическом уровнях

С упруго-вязкими свойствами клейковины, тестируемыми по показателю ИДК-1, на фенотипическом уровне (г) тесно коррелируют Ф0/Р1, Ф5, Ф0/Р5, Кос (0,52**-0,71**) и Р|, Р5, Сое (-0,52**...-0,72**). С растяжимостью клейковины в большей степени спряжены Ф0/Р1, Фо/Рз, Кос (0, 40*-0,88**), а с ее расплываемостью - Ф5, Ф24, и Фсо (-0,42*...-0,81**). В стрессовых ус-

ловиях (1998 г.) ни один из критериев гидрофобных взаимодействий значимо не коррелировал с расплываемостью клейковины (0,17-..-0,22). Однако в этом году, в отличие от показателей флуоресцентного зондирования, достоверно дифференцирующих экспериментальный материал (1;=2,2+*-16,5**), расплываемость клейковины совершенно не разграничивала его (Р=1,3). Данные флуоресцентной оценки (Р1, Р5, Ф0/Р1, Кос) дстоверно связаны и с растворимостью клейковины (-0,50**...-0,70**; 0,42*-0,82**). Сопряженность характеристик гидрофобных взаимодействий с критериями качества клейковины на генотипическом уровне (гё, Бху) проявляется более четко. Наиболее тесно с растяжимостью клейковины коррелируют Р1 (гЁ = -0,45**...-0,71**; Бху =-0,77**...-0,99*) и Ф5, Ф/Р1, Ф/Р5 (гё =0,42*-0,80*; 8ху =0,66*-1,19*). С набуханием клейковины сопряжены Фоо, Сое (гё =0,59**- 0,73**; Эху =0,64*-0,89*) и Ф5, ТЗО (г2 =-0,60**...-0,75**; Бху =-0,64*...-0,91*). Показатели флуоресцентного зондирования (Ф0/Р1, Ф5, Ф0/Р5, Фоо) на генотипическом уровне хорошо согласуются и с расплываемостью клейковины (гё =0,54**-0,60**; =-0,51**...-0,72**). Величина и направление генотипической корреляции между показателями гидрофобных взаимодействий, с одной стороны, и данными ИДК-1, числом растворения клейковины в СНзСООН - с другой, показаны в таблице 2. Характеристики флуоресцентного анализа в той или иной степени сопряжены и с содержанием клейковины в муке. Неблагоприятный характер взаимодействий между ними особенно сильно проявляется в условиях остро засушливого года (гЁ =0,67**-0,83**). Критерий Р1 в меньшей степени подвержен влиянию количественного фактора (г„ =-0,20...-0,67**). С содержанием белка в зерне данные флуоресцентной оценки сбалансированы в меньшей степени (Го =0,07-0,56* *; тё =-0,01.. .-0,3 7*).

Таблица 2.

Взаимосвязь между показателями флуоресцентного зондирования и критериями качества клейковины на генотипическом уровне ( га)_

Показатель Показатель ИДК-1 Растворимость (С?)р

гидрофобных взаимодействий 1996 г. 1997 г. 1998 г. 1996 г. 1997 г. 1998 г.

Р1 -0,66** -0,52** -0,80** -0,56** -0,68** -0,67**

Ф0/Р1 0,61** 0,63** 0,79** 0,56** 0,88** 0,70**

Ф5 0,63** 0,64** 0,81** 0,59** 0,60** 0,62**

Р5 -0,72** -0,60** -0,83** -0,55** -0,70** -0,72**

Ф0/Р5 0,68** 0,68** 0,82** 0,61** 0,81** 0,74**

ТЗО 0,68** 0,61** 0,77** 0,62** 0,77** 0,76**

Сое -0,65** -0,59** -0,80** -0,54** -0,61** -0,64**

Фа) -0,66** -0,60** -0,79** -0,55** -0,57** -0,59**

Кос 0,68** 0,66** 0,70** 0,62** 0,81** 0,65**

Ф24 0,54** 0,60** 0,51** 0,48** 0,54** 0,47**

*, **- Значимо на 1% -ном уровне.

Сопряженность данных флуоресцентного анализа с показателями фарннографнческон оценки, тестирующими реологические свойства

теста

Тестирование реологических свойств теста с помощью фаринографа широко используется в отечественных и зарубежных программах селекции. В связи с этим, представлялось необходимым изучить корреляционные отношения (г Гр) между критериями гидрофобных взаимодействий и данными

фаринографической оценки.

Установлено, что на фенотипическом уровне (г) показатели гидрофобных взаимодействий связны и с реологическими свойствами теста. Так, с его сопротивляемостью в процессе замеса коррелируют Р1 (0,49**-0,70**),

Фо/Р| (-0,51**...-0,59**), Рз (0,50**-0,68**) и Кос (-0,50**...-0,65**). Обнаружилась тесная корреляция (г) между стабильностью теста с одной стороны и Р1, Рз (0,60**- 0,96**), Ф0/Р1, Ф0/Р5, Кос (-0,54**...-0,93**) - с другой. Показатели гидрофобных взаимодействий (Р1, Р5, Ф0/Р1, Ф0/Р5, Кос) сбалансированы и с валриметрической оценкой (0,60**-0,70**; -0,54**...-0,71**). На гснотипическом уровне (г8, Бху) данные флуоресцентной и фариногра-фической оценок также тесно сопряжены. Однако неоднозначность коэффициентов корреляции в зависимости от условий года у отдельных показателей сохранилась (тбл.З).

Таблица 3.

Взаимосвязь между показателями флуоресцентного зондирования и характеристиками реологических свойств теста на гснотипическом

уровне (гк)

Показатели гидрофобных взаимодействий Сопротивляемость теста Показатель валориметра

1996 г. 1997 Р. 1998 г. 1996 г. 1997 г. 1998 г.

Р1 0,49** 0,63** 0,76** 0,55** 0,65** 0,73**

Ф0/Р1 -0,50** -0,71** -0,69** -0,56** -0,78** -0,68**

Ф5 -0,48** -0,62** -0,68** -0,51** -0,67** -0,64**

Р5 0,55** 0,67** 0,77** 0,59** 0,67** 0,75**

ФО/Р5 -0,57** -0,71** -0,73** -0,60** -0,75** -0,71**

130 -0,45** -0,62** -0,70** -0,46** -0,65** -0,70**

Сое 0,44** 0,63** 0,72** 0,47** 0,60** 0,68**

Фао 0,39* 0,59** 0,66** 0,42* 0,56** 0,62**

Кос -0,56** -0,70** -0,67** -0,60** -0,74** -0,61**

Ф24 -0,32 -0,58** -0,37* -0,35* -0,57** -0,40*

*, ** - Значимо соответственно на 5 и 1% -ном уровнях.

Прямые и косвенные вклады показателей гидрофобных взаимодействий в физические свойства теста и клейковины на генотнпиче-ском уровне

Для статистического анализа причин и следствия в системе коррелирующих признаков был проведен путевой анализ показателя ИДК-1 и характеристик реологических свойств теста, оцениваемых с помощью фарино-графа. Положительный и прямой эффект на упруго-вязкие свойства клейковины оказывают в условиях умеренно засушливого года Ф0/Р5, Ф24, влажного - Р1, Ф/Р5, Фсо и острозасушшвого - Р1, Ф0/Р1 и Сое. Основной вклад в реологические свойства теста вносят Р1, Р5, Сое и Кос. В условиях жесткой засухи (1998 г.) положительное влияние оказывали и другие критерии (Ф5, Ф0/Р5).

Информативность показателей флуоресцентного зондирования

Факторный анализ, как известно, позволяет выделить наиболее существенные признаки, объединить некоторые из них в группы, обладающие общей внутренней сущностью (Макогонов Е.И., 1978; Казакова И.Е., 1979). Он позволяет выяснить независимые и избыточные критерии и на этой основе минимизировать систему оценки качества зерна (Бебякин В.М., Мартынов С.П., 1983).

Показатели флуоресцентного зондирования несут, в основном, аналогичную традиционным характеристикам качества клейковины и теста информацию. В условиях умеренно-засушливого года (1996) максимальные нагрузки (0,91-0,94) в первом факторе, определяющим 50,6% дисперсий имели Фз, Ф/Р5, Сое и Кос. Во влажном году (1997) показатели гидрофобных взаимодействий сохранили высокие нагрузки в первом факторе (56,1% дисперсии). В этом же факторе максимальные нагрузки были и у результирующих признаков. В экстремальных условиях 1998 года первый фактор, описывающий 55,8% суммарной дисперсии, был по-прежнему представлен

большинством показателей флуоресцентного зондирования. Здесь же зафиксированы и высокие нагрузки по содержанию клейковины в муке. Из признаков, несущих независимую информацию, можно назвать лишь один -константу связывания зонда (Кс).

Эффективность флуоресцентной оценки качества клейковины в период формирования, налива и созревания зерна

Одной из основных задач селекции пшеницы является создание сортов, стабильно формирующих качество зерна на высоком уровне. В условиях Поволжья, отличающихся контрастностью вегетационного периода яровой пшеницы в зависимости от особенностей года, решение этой задачи особенно актуально.

При флуоресцентном зондировании незрелого зерна трех сортов яровой мягкой пшеницы (Альбидум 43, Саратовская 52 и Саратовская 55) в период его налива и созревания в условиях двух контрастных лет (1997, 1998) установлено следующее. Показатель интенсивности флуоресценции (Ф24) изменялся примерно в той же последовательности, что и температура воздуха (^а). В условиях влажного года (1997) повышение 1:0а положительно влияло на качество клейковины, тестируемое по Ф24. Статистически доказанная взаимосвязь между ними имела место у сорта Саратовская 52 (г=-0,63*). В экстремальных условиях 1998 года значения Ф24 у всех трех изучаемых сортов изменялись практически адекватно изменению температуры воздуха (г=0,68*-0,85**). Повышение при этом негативно отражалось на качестве клейковины. Отношения между Ф24 и температурой почвы на поверхности существенно не отличались от выше описанных. В условиях влажного года наблюдалась обратная взаимосвязь между ними (г=-0,46...-0,79*), а в условиях острозасушливого - прямая (1=0,62-0,73*). В период засухи согласованность между Ф24 и 1:0П повышалась, а ее зависимость от генотипа сни-

жалась. В условиях влажного года (1997) повышение относительной влажности воздуха (г), как правило, влекло за собой повышение значений Ф24, то есть, снижение качества клейковины. В острозасушливом же году повышение влажности воздуха положительно отражалось на качестве клейковины. При этом сопряженность между Ф24 и г оказалась более тесной (-0,77*... -0,90**). В условиях 1997 года между дефицитом влажности воздуха (с!) и интенсивностью флуоресценции (Ф24) наблюдалась отрицательная корреляция (г=-0,40...-0,73*), тогда как в условиях 1998 года - положительная (г=0,83**-0,88**). В итоге, можно констатировать, что критерий Ф24, характеризующий качество клейковины, может быть использован для тестирования устойчивости генотипов яровой мягкой пшеницы к изменению условий среды в период налива и созревания зерна.

ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕСТИРОВАНИЯ КАЧЕСТВА КЛЕЙКОВИНЫ ЯРОВОЙ ТВЕРДОЙ ПШЕНИЦЫ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО

АНАЛИЗА

Степень согласованности показателен гидрофобных взаимодействий с характеристиками качества клейковины.

Клейковина ТпПсшп с!игит по своему строению и качеству существенно отличается от клейковины мягкой пшеницы (Княгиничев М.И., Марушев А.И., Черняк Б.И., 1972). В связи с этим представлялось необходимым изучить влияние гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе и па качество клейковины твердой пшеницы.

Корреляционный анализ результатов технологической и флуоресцентной оценок (1996-1998) на фенотипическом уровне показал, что большинство показателей гидрофобных взаимодействий тесно связаны с упруго-вязкими свойствами клейковины. В лучшей степени тестируют эти свойства критерии Фз, Ф0/Р5, Кос (г=0,61**-0,82**) и Сое, Фсо (г=-0,67**...-0,81**).

Сбалансированность данных флуоресцентного анализа с растяжимостью клейковины проявилась менее четко (0,06-0,78**; -0,02...-0,75**).

Поскольку, показатели качества зерна в разной степени модифицируются под влиянием условий внешней среды, то естественно ожидать, что при сопоставлении их фенотипических значений связь между ними может быть в сильной степени искажена. В связи с этим, в процессе работы уделялось большое внимание изучению корреляционных отношений на генотипи-ческом уровне. Установлено, что показатели флуоресцентной оценки наиболее тесно коррелируют с данными ИДК-1 (табл.4).

Таблица 4.

Взаимосвязь между показателями флуоресцентного зондирования и

критериями качества клейковины на генотипическом уровне ( ге)

Показатели гидрофобных взаимодействий Показатель ИДК-1 Растяжимость клейковины

1996 г. 1997 г. 1998 г. 1996 г. 1997 г. 1998 г.

Р: -0,48* -0,87** -0,59** -0,16 -0,49* -0,58**

Ф0/Р1 0,42 0,85** 0,75** 0,16 0,43* 0,77**

Ф5 0,73** 0,77** 0,62** 0,59** 0,35 0,60**

Р5 -0,51* -0,88** -0,53** -0,08 -0,52** -0,51**

Фо/Рз 0,66** 0,89** 0,60** 0,31 0,46* 0,54**

ТЗО 0,54* 0,79** 0,60** 0,33 0,36 0,76**

Сое -0,79** -0,84** -0,46* -0,56* -0,43* -0,48*

Фоо -0,77** -0,76** -0,53** -0,63** -0,35 -0,54**

Кос 0,60** 0,87** 0,57** 0,27 0,47* 0,53**

*, **- Значимо соответственно на 5 и 1% -ном уровнях.

Неустойчивая по годам сопряженность имела место и с показателями набухания (Он) и растворимости (<3р) клейковины. Характеристики гидрофобных взаимодействий слабо или совсем не коррелируют с содержанием

клейковины в муке. При отсутствии контроля по этому признаку наиболее приемлемы для тестирования качества клейковины критерии Р1 и Р5.

Эффективность оценки реологических свойств теста с помощью флуоресцентного анализа

Для выработки высококачественных макаронных изделий важное значение имеет качество теста, его реологические свойства. Учитывая необходимость совершенствования оценки физических свойств теста на самых ранних этапах создания сорта, необходимо было изучить эффективность тестирования их с помощью флуоресцентных зондов.

Корреляционный анализ результатов флуоресцентной и миксографи-ческой оценок (1996-1997) показал, что некоторые критерии гидрофобных взаимодействий (Ф5, Ф0/Р5, Сое, Фсо, Кс) на фенотипическом уровне (г) достоверно сопряжены с тестообразующей способностью (0,61**-0,66**; -0,54**...-0,65**). Со стабильностью теста лучше сбалансированы Р1, Ф5 (-0,50*...-0,71**) и Сое, Фоо (0,53*-0,78**), а с эластичностью - Р1,Сос, Фоо, (0,53*-0,70**) и Ф0/Р1, Ф0/Р5 (-0,53*...-0,62**). Сопряженность между показателями флуоресцентного зондирования, с одной стороны, и тестообразующей способностью и стабильностью теста - с другой, на генотипическом уровне показана в табл. 5. С эластичностью теста тесно связаны Р1,Сос (гц Ю,57**-0,79**) и Ф5, Ф0/Р5 (г„ =-0,54**...-0,78**).

В итоге можно констатировать, что характеристики динамического способа флуоресцентного зондирования в достаточной мере сопряжены с показателями миксографа. Наиболее информативны критерии Ф5, Сое, Фоо, Кос и Ф0/Р5.

Таблица 5.

Взаимосвязь между показателями флуоресцентного зондирования и характеристиками реологических свойств теста на генотипическом уровне (гй)__

Показатели гидрофобных взаимодействий Тестообразующая способность Стабильность теста

1996 г. ■ 1997 г. 1996 г. 1997 г.

Р1 0,36 0,75** 0,52** 0,69**

Ф0/Р1 -0,31 -0,71** -0,43* -0,65**

Ф5 -0,66** -0,64** -0,58** -0,61**

Р5 0,29 0,77** 0,48* 0,71**

Ф0/Р5 -0,49* -0,73** -0,56** -0,70**

ТЗО -0,39 -0,71** -0,53* -0,59**

Сое 0,67** 0,72** 0,64** -0,68**

фсо 0,70** 0,63** 0,58** 0,61**

Кос -0,43* -0,73** -0,56** -0,71**

*,** - Значимо соответственно на 5 и 1%-ном уровнях.

Факторный анализ показателей гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе клейковины.

С целью минимизации флуоресцентной оценки и отбора критериев, несущих максимум полезной информации, факторному анализу подверглись 14 показателей гидрофобного анализа в совокупности с признаками тестирующими содержание и качество клейковины, реологические свойств теста. Первый фактор, обусловливающий в зависимости от условий года испытаний (1996-1998) от 46,8 до 52,0% дисперсии, представляют характеристики флуоресцентной оценки (Р1,Фо/Р1, Ф5, Р5, Ф0/Р5, ТЗО, Сое, Кос, Ф24), показатель ИДК-1 и параметры миксограммы (тестообразующая способность, стабильность и эластичность теста). Оценка какого-либо одного из этих показателей независимо от условий, складывающихся в период вегетации рас-

тений, позволяет получать примерно половину всей необходимой информации о качестве клейковины и теста яровой твердой пшеницы. В условиях умеренно засушливого года (1996) второй по значимости фактор (15,4%) обусловливала максимальная высота миксограммы (рН), связанная с содержанием белка и клейковины в муке. Во влажном году (1997) максимальные нагрузки во втором факторе имели место у показателей содержания сырой и сухой клейковины. Третий фактор (8,1%) определяла совокупность показателей титровалыюго способа зондирования (Ву, Кс, а). При резком дефиците влаги в период формирования и налива зерна (1998 г.) максимальные нагрузки во втором факторе, контролирующим 11,4% суммарной дисперсии, зафиксированы у показателей физико-химических свойств клейковины (<3р С)н), а также у БОБ-критерия. Третий по значимости фактор обусловливал один признак - интенсивность флуоресценции при максимальном насыщении мест связывания красителя на частицах продуктов размола зерна (а). И так, минимальная система признаков, обеспечивающая эффективную оценку количества и качества клейковины яровой твердой пшеницы независимо от условий года включает Фз, БОБ-критерий и рН или содержание клейковины в муке.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ Разработан принципиально новый, не имеющий аналогов, микрометод тестирования качества клейковины мягкой и твердой пшеницы по небольшим пробам зерна (2г) на основе гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе, с помощью которого могут одновременно регистрироваться более 10 показателей. Микрометод, в отличии от традиционных оценок качества клейковины, характеризуется экспрессностью (до 50 образцов за смену), хорошей воспроизводимостью данных и высокой дифференцирующей (разрешающей) способностью.

Показатели флуоресцентного зондирования, измеряемые по разработанной микрометодике, тесно взаимосвязаны на фенотипическом и геноти-пическом уровнях с характеристиками физических и физико-химических свойств клейковины яровой мягкой и твердой пшеницы. С растворимостью и набуханием клейковины ТгШсит с!игит сопряженность менее выраженная. Гидрофобные взаимодействия в белковом комплексе клейковины оказывают существенное влияние на физические свойства теста, что подтверждается высокой значимостью коэффициентов фенотипической и генотипи-ческой корреляции между данными флуоресцентной и фаринографической оценок.

Наибольший прямой вклад в упруго-вязкие свойства клейковины мягкой пшеницы вносят показатель падения интенсивности флуоресценции за 1 минуту (Р1), критерий Ф0/Р5, а в реологические свойства теста - показатели падения интенсивности флуоресценции за 1 и 5 минут (Р], Р5), интенсивность флуоресценции после 5-минутного отстаивания взвеси муки (Ф5) и константа осаждения взвеси (Кос).

При тестировании качества клейковины и теста яровой мягкой пшеницы с помощью флуоресцентного зондирования можно ограничиться измерением какого-либо одного из следующих критериев: падение интенсивности флуоресценции за 1 и 5 минут (Р1, Рб), скорость осаждения взвеси муки (Сое), константа осаждения взвеси (Кос), Ф0/Р1 и Ф0/Р5. Качество клейковины и теста яровой твердой пшеницы целесообразнее оценивать но Фэ или по другим характеристикам (Ф0/Р5, Сое).

При оценках зерна, сформированного в условиях жесткой засухи, качество клейковины при флуоресцентном анализе эффективнее тестировать по показателям падения интенсивности флуоресценции (Р1, Р5), которые в меньшей степени, по сравнению с другими критериями, связаны с содержанием клейковины в муке.

Показатель интенсивности флуоресценции при концентрации красителя 24 мк моль/л (Ф24) может быть использован для тестирования устойчивости генотипов яровой мягкой пшеницы по качеству клейковины к изменению условий среды в период формирования и налива зерна. В практической работе при этом могут найти применение как графические оценки, так и статистические характеристики (о, V).

ПРЕДЛОЖЕНИЯ И РЕКОМЕНДАЦИИ ДЛЯ СЕЛЕКЦИОННОЙ

ПРАКТИКИ

Показатели гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе клейковины использовать при генетических исследованиях и при оценке селекционного материала яровой мягкой и твердой пшеницы в условиях Поволжья.

Качество клейковины и теста яровой мягкой пшеницы тестировать по степени падения интенсивности флуоресценции за 1мин. (Pi), Ф0/Р1 и по константе осаждения взвеси муки (Кос), яровой твердой - по скорости осаждения взвеси (Сое), интенсивности флуоресценции после 5 мин. отстаивания взвеси (Ф5) и по Ф0/Р5.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Кибкало И.А., Тучин C.B., Бебякин В.М. Сопряженность между традиционными показателями качества клейковины и характеристиками гидрофобных взаимодействий в «группах качества» яровой мягкой пшеницы.// Тез. докл. науч.-практ. конф. «Вопросы повышения устойчивости зернового хозяйства в условиях Поволжского региона».-Кинель.- 1997.- С. 17-19.

2. Кибкало И.А., Тучин C.B., Бебякин В.М. Сопряженность между характеристиками гидрофобных взаимодействий в белковом ком-

плексе клейковины и признаками ее качества.// Тез. Междунар. науч. конф. «Развитие научного наследия академика Н.И. Вавилова»,-Ч.1.- Саратов,- 1997.- С. 67-69.

3. Кибкало И.А., Бебякин В.М. Разрешающая способность традиционных показателей качества и новых биохимических тестов.// Тез. докл. науч.-практ. конф. «Проблемы повышения качества зерна».-2-3 июля 1997 г.- Саратов,- 1997.- С.22-23.

4. Тучин C.B., Кибкало И.А. Взаимодействие флуоресцентного красителя 1-анилинонафталин-8-сульфанат с белкаами пшеницы.// Тез. докл. науч.-практ. конф. «Проблемы повышения качества зерна».-2-3 июля 1997 г.- Саратов,- 1997,- С. 36-37.

5. Бебякин В.М., Тучин C.B., Кибкало И.А. Тестирование качества клейковины: традиционные методы и новые разработки.// Тез. док. Первой Междунар. конф. «Качество зерна , муки и хлеба (Качесуво 98)». -Россия. -Москва. - 4-8 мая 1998 г.-М.-1998,- С. 95-96.

6. Бебякин В.М., Еременко JI.B., Злобина JI.H., Кибкало И.А. Адаптивность и сомаклональная изменчивость в связи с селекцией пшеницы.// Тез. док. науч. сессии «Новые методы селекции и создание адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результаты и перспективы».-1-3 июля 1998 г.- Киров.-1998,- С. 178-179.

7. Бебякин В.М., Кибкало И.А., Тучин C.B. Корреляционный анализ новых критериев качества клейковины.// Зерновые культуры.-1999.-№6,- С. 20-21.

8. Бебякин В.М., Звягина Ю.Ю., Кибкало И.А. Эффективность новых и традиционных оценок качества клейковины по малым пробам в связи с селекцией.// В сб. «Вопросы семеноводства, селекции и генетики с.-х. культур в засушливом Поволжье».- Саратов.- СГАУ.-1999.- С.73-81.

Содержание диссертации, кандидата сельскохозяйственных наук, Кибкало, Илья Анатольевич

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Традиционные методы и подходы к оценке качества клейковины.

1.2. Белки и гидрофобные взаимодействия в белковом комплексе клейковины.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ, МЕТОДИКА И УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ

ИССЛЕДОВАНИЙ.

2.1. Материал и методика проведения исследований.

2.2. Метеорологические условия вегетационного периода в годы проведения полевых опытов.

ГЛАВА 3. ПОКАЗАТЕЛИ ГИДРОФОБНЫХ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ В БЕЖОВОМ КОМПЛЕКСЕ ЯРОВОЙ МЯГКОЙ ПШЕНИЦЫ КАК КРИТЕРИИ КАЧЕСТВА КЛЕЙКОВИНЫ.

3.1. Методика флуоресцентного анализа, основные принципы и подходы к ее разработке.

3.2. Взаимосвязь между показателями гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе и критериями качества клейковины на фено-типическом и генотипическом уровнях.

3.3. Сопряженность данных флуоресцентного анализа с показателями фаринографической оценки, тестирующими реологические свойства теста.

3.4. Прямые и косвенные вклады показателей гидрофобных взаимодействий в физические свойства теста и клейковины на генотипическом уровне.

3.5. Информативность показателей флуоресцентного зондирования.

3.6. Эффективность флуоресцентной оценки качества клейковины в период формирования, налива и созревания зерна.

Выводы.

ГЛАВА 4. ЭФФЕКТИВНОСТЬ ТЕСТИРОВАНИЯ КАЧЕСТВА ЯРОВОЙ ТВЕРДОЙ ПШЕНИЦЫ С ПОМОЩЬЮ ФЛУОРЕСЦЕНТНОГО АНАЛИЗА.

4.1. Степень согласованности показателей гидрофобных взаимодействий с характеристиками качества клейковины.

4.2. Эффективность оценки реологических свойств теста с помощью флуоресцентного анализа.

4.3. Факторный анализ показателей гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе клейковины.

Выводы.

Введение Диссертация по сельскому хозяйству, на тему "Эффективность тестирования качества клейковины яровой мягкой и твердой пшеницы на основе гидрофобных взаимодействий в белковом комплексе"

Актуальность работы

В условиях интенсификации селекции и повышенных требований к качеству зерна вновь создаваемых сортов важную роль приобретает разработка принципиально новых подходов к оценке селекционного материала. Одним из важнейших показателей качества зерна пшеницы, над улучшением которого ведется интенсивная работа на всех этапах создания сорта, является качество клейковины. Традиционные методы тестирования этого признака дают не всегда, с точки зрения селекционера, удовлетворительные результаты. К этому следует добавить, что для оценки различных свойств клейковины предложено эолыиое количество критериев, измерение которых связано, как правило, с эолыними трудозатратами, расходом зерна на анализ и поэтому не всегда может быть приемлемым на ранних этапах селекции. Не смотря на многообразие токазателей, призванных оценивать физические и физико-химические свойства слейковины, большинство из них слабо изучено в селекционном аспекте.

Современная селекция нуждается в новых биохимических тестах, ли-денных полностью или, хотя бы, частично недостатков, которые несут рекомендованные для селекционных программ критерии качества клейковины. К настоящему времени установлено, что важное значение в структурных разли-шях клейковины разного качества имеют гидрофобные взаимодействия в ее белковом комплексе (Конарев В.Г.,1980;Созинов A.A., 1985;Павлов А.Н., 1992). В отличие от водородных связей они не являются строго направленными, однако обеспечивают создание систем, характеризующихся высокой стабильностью (Ленинджер А., 1974). За агрегацию клейковинных белков в вод-юй среде ответственны, прежде всего, глютенин и аминокислоты с неполяр ыми (гидрофобными) остатками (Козьмина Н.П., 1976; Конарев В.Г., 1980).С юявлением флуоресцентных зондов (флуоресцирующих красителей), позво-[яющих исследовать различные биологические объекты (Vanderkool J., 4artonosi А.Д969; Brocklehurst J.R., Freedman R.B., Hancock D.J.,e.a., 1970; Vanderkool J., Martonosi A., 1971; Добрецов P.E., 1979; Владимиров Ю.А., Доб->ецов P.E., 1980), появились реальные перспективы изучения гидрофобных ¡заимодействий в методическом и селекционном аспектах совершенно не изу-[ены, не найдены и пути их использования в практической селекции.

Цель и задачи исследований

Целью исследований являлось разработать и изучить принципиально но-ые критерии качества клейковины в связи с селекцией яровой мягкой и твер-;ой пшеницы. Исходя из этого, ставились следующие задачи:

- изучить гидрофобные взаимодействия в белковом комплексе клейковины и разработать на их основе методику оценки качества клейковины по предельно минимальным пробам зерна;

- оценить тесноту и направление фенотипической и генотипической корреляции между показателями флуоресцентного анализа и традиционными критериями различных свойств клейковины и теста;

- выявить воспроизводимость и дифференцирующую способность показателей флуоресцентного зондирования;

- изучить информативность показателей гидрофобных взаимодействий и минимизировать на этой основе флуоресцентную оценку качества клейковины;

- изучить возможность оценки устойчивости генотипов яровой мягкой пшеницы к изменению условий внешней среды в период формирования, налива и созревания зерна по данным флуоресцентного анализа.

Научная новизна

Разработана микрометодика оценки качества клейковины яровой мягкой [ твердой пшеницы в связи с селекцией, не имеющая отечественных и зару-¡ежных аналогов.

Изучены корреляционные отношения между новыми критериями и традиционными показателями различных свойств клейковины и теста на феноти-[ическом и генотипическом уровнях. Выявлены наиболее информативные податели гидрофобных взаимодействий для оценки качества клейковины в рангах поколениях.

Впервые показана принципиальная возможность отбора генотипов яро-ой мягкой пшеницы по реакции на изменение условий произрастания в наиболее ответственный для формирования качества урожая период (формирова-:ие, налив и созревание зерна).

Практическая ценность работы

Разработана ускоренная микрометодика оценки качества клейковины (до О образцов за смену) по минимальным навескам зерна 2т) и обоснована ми-имальная система показателей гидрофобных взаимодействий, позволяющая птимизировать проработку ранних поколений яровой мягкой и твердой пше-ицы. Некоторые параметры флуоресцентного анализа (Ф24) могут быть ис пользованы для графического отображения «поведения» генотипов яровой мягкой пшеницы по качеству клейковины в период налива и созревания зерна.

Апробация работы

Результаты исследований, изложенные в диссертации, докладывались на научно-практической конференции по вопросам повышения устойчивости зернового хозяйства в условиях Поволжского региона (Кинель, 1997г.), международной научной конференции "Развитие научного наследия академика Н.И. Вавилова" (Саратов, 1997г.), Всероссийской научно-практической конференции "Проблемы повышения качества зерна" (Саратов, 1997г.), Первой международной конференции "Качество-98" (Москва, 1998г.) и на научной сессии Северо-Восточного научно-методического центра Россельхозакадемии по проблемам селекции и созданию адаптивных сортов сельскохозяйственных культур: результатам и перспективам (Киров, 1998г.).

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 8 работ.

Структура и объем диссертации

Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, предложений и рекомендаций, списка литературы и приложений. Текст изложен на 207 машинописных страницах и иллюстрирован 56 таблицами и 10 графиками. Список использованной литературы содержит 146 источников, в том числе 51 на иностранных языках.