Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Две новые сериновые эндопептидазы головного мозга

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Две новые сериновые эндопептидазы головного мозга"

ЕРЕВАНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ

"1 3 3

- На'правах "рукописи

АСАТРЯН РУЗАН МАНВЕЮВНА

ЛВЕ НОВЫЕ ОЕРИНОБЫЕ ЭНДОПЕПТИДАШ ШОВНОГО МОЗГА

03.00.04 - Биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Ереван - 1992

Работа выполнена в Отделе биохимии нейрогормонов Института биохимии АН Армении (директор - академик АН РА, профессор А.А.Г&лоян).

Научные руководители: академик АН РА, профессор

А.А.Галоян

доктор биологических наук А.В.Азарян

Официальные оппоненты: член-корр. АН РА, доктор бяол.

наук, профессор К.Г.Карагезян

доктор биол. наук, профессор Г.С.Хачатрян

Ведущее учреждение: Ереванский Зоотехническо-ветери-наряый институт (кафедра биохимии).

Защита состоится "/о " / ^¿/{¿.Р 1993 г. на заседании специализированного совета К 055.01.08 по присуждению ученой степени кандидата биологических наук при кафедрах биохимии и биофизики Ереванского государственного университета по адресу: 375049, Ереван, Алек Манукян, I.

С диссертацией мсжно ознакомиться в библиотеке Ергосун-

та.

Автореферат разослан "/У" ¿Г/ссК 199^ г.

Ученый секретарь специализированного совета, кандидат биологических наук

Л.Г.АНАНЯН

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность теми. Изучению метаболических путей превращения белков я пептидов, образования активных фрагментов и метаболически стабильных интермедиа!пп способствуют исследования специфичности действия эндо- и экзопеитвдаз ЦНС. Интерес к изучению пептидгидролаз нервной тч».на, ч та::™" :; зсцрэсам образования и деградация непродеатидов под действием индивидуальных ферментов и ферментных систем ЦНС вызван осознанием роли пептидгидролаз в биогенезе и биоинактивапии нейропептидов и образовании олигопептидных фрагментов, обладающих специфическим центральным действием. Использование энзимологического подхода для выявления роли определенного пептида или целой группы в норме и при патологии может быть осуществлено применением ингибиторов соответствующих ферментов.

3 работах акад. Галояна, Азарян и соавт. был охарактеризован весь спектр аспартильных и пистоиновых пептидгидролаз головного мозга (кора больших полушарий и гипоталамус), активных при кислых значениях рН. Было показано, что катепсин в я высокомолекулярная аспартильная протеиназа обладают способностью образовзвать анниотензин I из ренин субстрат тетрадекапептида и расщеплять вещество Р, а пистеиновая протеиназа катепсин В катализирует образование ангиотензана II из ангиотензина I, что монет иметь принципиальное значение для биогенеза вазопрес-сорного ангиотензина II в мозговой ткани, а следовательно -в патогенезе мозговой гппертечзия.

Из семейства внутриклеточных сериновых пептидгидролаз в нервной ткани описаны пролилэндопептвдаза, эндоолгипептидаза К, $-липотропин-активирующая сериновая пептидгидролаза, КОМ-

- 4 - ....

сериновая протеиназа I. К началу наших исследований сериновые пептидазы с низкой мол. массой в головном мозге не были известны.

Настоящая работа посвящена выделению и очистке, а также изучению физико-химических и энзиматическях свойств двух сери-новых эндопептидаз с низкой мол. массой, в ходе работы идентифицированных как катепсин и эластаза - сериновые пептидгид-ролазы, описанные ранее в разных тканях.

Цель и задачи исследований. Целью настоящей работы являлось:

1. Разработка методов выделения и очистки эластазы и ка-тепсина с из коры больших полушарий головного мозга быка.

2. Определение физико-химических и энзиматических характеристик - мол. массы, оптимума действия рН, чувствительности к ингибиторам и активаторам разных классов протеиназ, специфических субстратов катепсина в и эластазы, их сравнительная характеристика.

3. Выявление возможных тканевых особенностей этих эндопептидаз по сравнению с катепсином с и эластазой из других источников.

Научная новизна. Впервые в нервной ткани млекопитающих об- . наружены две сериновые эндопептидазы с низкой мол. массой, активные при слабощелочных значениях рН, которые идентифицированы как катепсин а и эластаза. Разработана высокоэффективная процедура выделения и хроматографической очистки этих эндопептидаз из коры больших полушарий головного мозга быка. Впервые получены высокоочищенные препараты эластазы и катепсина с из головного мозга. Изучены их субстратная специфичность, определена мол. масса, чувствительность к ингибиторам разных

классов протеиназ, оптимум рН. Показано, что наряду с общими_______

характеристиками", они различаются друг от друга по заряду и субстратной специфичности.

Публикации и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 6 научных работ. Результаты диссертационной работы были представлены на 6-й научно-технической конференции района им. 26-^и Комиссаров (Цахкадзор^ 1990), Всесоюзной конференция "Методы получение, анализа л применения ферментов" (Ргга, 1990}, на 8-ом Общем Собрании »Европейских нейрохимических обществ (Лейпциг, 1990), на Собрании Американского Общества Нейрохимии (1992, Хьюстон, США.), на заседании ученого совета Института биохимии АН РА, на объединенном заседании кафедры биохимия и научно-исследовательской лаборатории сравнительной и эволюционной бяохжззи биологического факультета ЕГУ.

Объем работы. Диссертация изложена на 74 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, посвященного сериновым эндопептидазам головного мозга и физико-химическим свойствам, локализации и функциональной роли эдастазы и катепсинао из различных источников, экспериментальной части, выводов и списка цитированной литературы из 140 наименований.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Активность Ферментов по гидраЗГизу азоказеина в ходе очистки измеряли спектрофотометрически по методу Старки и Еаррета. Инкубационная смесь (1,0 мл) содержала 0,4 мл 1,25 М трис/НС1 буфера, рН 8,0, 0,35 мл фермента в 0,05$ Вг1о -35 и 0,25 мл <Ь% азоказеина. Инкубировали 30 мин при 50°С.

О ферментативном гидролизе судили по приросту оптической

плотности при 366 нм в фильтрате после осавдения 3 мл 5% ТХУ. Активность выражали в единицах оптической плотности при 366 нм на I мг фермента в I мин.

Активность по гидролизу п-нитроанилидов аминокислот определяли по методу Баррета. Активность измеряли в инкубационной смеси (2,0 мл), содержащей 1,5 мл 0,1 М трис/НС1 буфера рН 8,0, 0,5 мл фермента в 0,05% Вг1,1_35 и 0,02 мл Зис-А1а-А1а_А1а-рТТА (5 мг/в I мл диметил сульфоксида) или 0,02 мл г-Иу-Иу-РПе-рНА

(5 мг в I мл диметил сульфоксида). После инкубации I ч при 37°С добавляли 0,2 мл I Ы НС1. Образовавшийся п-нитро-анилин детектировали спектрофотометрически по поглощению при 410 нм на спектрофотометре ишсат ( Англия), начальную скорость гидролиза п-нитроанилидных субстратов рассчитывали, принимая молярную экстянгашо при 410 нм равной 9800.

рН-зависимость активности Ферментов определяли в стандартной реакционной смеси, содержащий 0,1 М трис/НС1 буфера в интервале рН от 6,0 до 10,0.

Мол, массу Ферментов определяли по методу Эндрьюса гель-фильтрацией на колонке с сефадексом в-100 (объем колонки -5 х 55 см, 1л), уравновешенной 0,05 М трис/НС1 буфером, рН 8,0, содержащим 0,1 М ЫаС1, колонку калибровали БСА (Мв 67000), овальбумином (Мв 45000), химотрипсиногеном (Мв 25000), миогло-бином (Мв 7800).

Содержание белка в препаратах ферментов определяли по методу Лоури и соавт. и спектрофотометрически, принимая значение Е280 1^-ного раствора пептидаз равным 10,5.

ДСН-злектройорез. Во избежание аутолиза пробы ферментов осаждали 10$-ным ТХУ при 4°С. Осадок промывали дважды 1% ТХУ и снова растворяли при 100 °С в буфере, содержащем 50% глицерол,

2% ДСН и 150 мМ jî-меркаптоэтанол. Электрофоретическое разделение проводили в 10^-ном полйакршамидном геле в течение 5-6 часов при комнатной температуре и силе тока 8 мА на трубку. Для окрашивания белки инкубироваии при 55°С в течение I часа в 1$-ом Голубом кумаеси R-250 в среде метанол/укс. к-та/вода (5:2:3 по объему).

МАТЕРИАЛЫ

В экспериментах использовали кору больших иолушарий головного мозга быка, который отделяли от целого мозга сразу после забоя животных, очищали от мягкой оболочки и хранили при -20°С. Головной мозг крыс извлекали после декапитации животных и сразу использовали. Все стадии очистки ферментов проводили при 0-4 °С.

РЕАКТИВЫ

В работе бьши использованы следующие реактивы (в скобках указана фирма): сефадекс a -100, КМ-сефадекс, C-5Q, гепарин-агароза ('Pharmacia',' Швеция), диасорб-баиитрацин, диасорб-грамицидин (" Диагностику м", Львов), диизопропилфторфоофат, ди-тиотреитол, азоказеин, бычий сывороточный альбумин ( sigma',' США), Suc-Ala-Ala-Ala-pHA И 2-Gly-Gly-Phe-pNA ("Serva",

ФРГ), Bz-Гуг-рЯА, Bz-Phe-pNA ("Биолар", Рига). Все остальные реактивы отечественного производства марок ОСЧ, ХЧ и ЧДА.

ОБНАРУЖЕНИЕ КАТЕПСИН G- И ЭДАСТАЗОГОДОБНОЙ АКТИВНОСТЕЙ В ГОЛОВНОМ МОЗГЕ КРЫС

Перфузированный головной мозг 6-месячной крысы гомогенизировали в гомогенизаторе типа Поттера, используя 6 мл 0,05 М трис/HCI рН 8,0, содержащий 0,8 М ЫаИ, 0,1% Brij- 35 0,1% Ыа2ЭДТА. Гомогенат центрифугировали 30 мин на центрифуге YAC -601 в среднем роторе при 20000g. Брали супернатант и измеряли Suc-Ala-Ala-Ala-pNA и Z-Gly-Gly-Phe-pffA- гидролаз-ную активность в стандартных условиях.

Для выявления действия диизопропилфторфосфата, парахлор-меркурибензоата и ЭДТА фермент (супернатант 20000g ) преинку- ■ бировали с этими эффекторами в течение, 20 мин при комнатной температуре, а затем измеряли Suc-Aia-Aia-Ala-piiA- и Z-Giy-Giy-Phe-pNA- гидролазную активности в стандартных условиях. 0,1 мМ ДГО почти полностью ингибировал обе активности. Остаточ-' ная активность к Suc-Ala-Ala-Aia-pHA составляла 6%, а к Z-Gly-Gly-Phe-pNA - 10%. Выяснилось также, что обе активности малочувствительны к ЭДТА и парахлормеркурибензоату. Suc-Aia-Aia-Aia-püA- гидролазная активность после воздействия обоих эффекторов сохраняется на 94%, a Z-Gly-Gly-Phe-pHA -гидролазная активность сохраняется соответственно на 95 и 90$.

ВЫДЕЛЕНИЕ И ОЧИСТКА ФЕРМЕНТОВ

100 г коры больших полушарий головного мозга быка гомогенизировали в гомогенизаторе типа Поттера с тефдоновым пестиком, используя 200 мл 0,05 М трис-HCI буфер, рН 8,0, содержащий 0,8 М NaCI, 0,1% Вг13-35 и 0,1% Ыаз ЭДТА. Гомогенат центрифугировали при 20000g 30 мин.в среднем роторе на центри-

фуге vАС-601. Осадок растворяли в гомогенизапионном буфере и ---------

центрифугировали при IOOOOOg , Супернатант подвергали дробному осаждению сульфатом аммония (40-805?) и снова центрифугировали при IOOOOOg , Осадок растворяли в 0,05 М трис-HGI буфере рН 8,0, содержащем 0,8 М Na"I, диализовали против того же буфера в течение 40 часов и наносили на колонку с гепарин-ага-розой (0,8 х 12,5 мл), уравновешенную тем же буфером. Элюпию проводили 0,05 М Ыа-апетатным буфером, рН 6,4 (рис.1). В результате аффинной хроматография на гепарин-агарозе получены два пика азоказеин-расщепляющей активности. Suc-Aia-Aia-Alá-ptfA и Z-Giy-Giy-Phe-pNA - гидролазная активность содержались только в первом пике, то есть не происходило специфического связывания наших ферментов на гепарин-агарозу, а связывались и затем элюировались лишь примесные белки.

Фракции, составляющие первый пик, объединяли и проводили гель-хроматографию на Сефадексе G-I00. Колонку с Сефадексом G -100 (5 х 55 см, I л) уравновешивали 0,05 М трис-HGI, рН 8,0 и на нее наносили фракции, собранные с гепарин-агарозы (первый пик). Получали два пика азоказеин-гидролазной активности при рН 8,0; при этом активность, содержащаяся в первом пике нечувствительна к ДПФ, тогда как активность второго полностью инги-бируется ДПФ. Активность и к suc-(Aia)-piTA- и к Z-Gly-Gly--Phe-pNA была полностью сосредоточена во втором пике. Составляющие этот пик фракции объединяли, диализовали против 0,05 М Ыа-ацетата, рН 5,5 и 0,15 М ЫаС1 и проводили ионообменную хроматографию на колонке с СМ-сефадексом С-50 (3 х 10 см, 60 мл), уравновешенную 0,05 М Ыа-ацетатным буфером, рН-5,5. Для элюции использовали градиент концентрации NaCI (0,2-1,0 М). Элюиравали два пика азоказеинолитической активности - при 0,4

----- .» TvT-нт- тп ,« ' ••'• . саата-гга^СгоС-аУ

." raa.-Aj a -_;?а*"а;а:кг:::ат; акта'Баа. ;ь, :•/•--

Г.--;.-; , •: • ." - a, a :;,paKuK:'; оООТаЬЛ.ТО^е втора;: п.a: -

^-'¿.-j-„с-i,:."— раочбслльщуа активность, характерную

а целях дальнейшего усовершенствования очистки этих сери-

иишл ол-цинен 1-И11П.-1 мы ипимииипи нггтг/uuyin тппчотпттл*™-

на сорбентах, содержащих в качестве специфических лигандов ба-цитрашш и грамицидин - диасорб-баиитраиин и диасорб-грамици-дин. Для десорбции ферментов было необходимо применение 0,8 М NaCI с 25$ изопропиловым спиртом. В результате аффинной хроматографии активность катепсина G и эластазы возрастала п " 4.Р. (ттртг.Л—'лц л ..т.... j». >ч. » || s f я уГ;,^

,:ап;:-гга;.а:;а':;:г;); ::а jtü дааткг^; ПС', а

ян,:;."..: .v;-, :aa;uJa ; уд~лс.каукаа,: г,:атер:;,:. . а -

Ска ^ключека :з -какаата." куа акема очиС7'к;: гаа.:а-з:; :: кателална с; . так как капкак;: полного удален;;; ::за-"фопачола ;:з получо;;;;:;:; препаратов оказались н^личиы:-;:.

Ose фракада, полученные после КМ-Сефздекса 0-Ö0 по-отдель-

-^-pt-r.TcrpaiizpoT"-^-: а- -„л^нке : Зоч-аде-оа:,: а-ънааеака: ;ак :с,л~аС. pi! а,С ¡Случеккиа

лиофилизировали и хранили при -15°С

<гг

-I-1-г-

"й"1— Концентрация НабХ

I I-1

о—а

-1-1—;—I .„

Активность К Зио-.(А1а)3-рНА . V—7

—г--г-! |-г—|-г-1-—|——I—1—1

ю, >

Активность к г-Иу-Огу-ЗРЬе-рЯА

I-1-1-Го

ы

—1— о V

о ю о

и

о

I

, Е-<

•о Й

. о» »

и

о

со

ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ ЭЛАСТАЗЫ И КАТЕПСИНА О

Эластаза. Удельная активность использованных в нашей работе препаратов эластазы составляла 3,8 мкмоль/мин/Е^дд по гидролизу Зио-(А1а)-,-рКА (табл.1). Фермент был очищен в 678,5 раза по сравнс-пию с супернатантом 100000 в, выход по активности составлял 33,6%.

Из 100 г коры больших полушарий головного мозга быка было получено 0,42 иг фсрг.-онта (табл.1).

Мол. масса эластазы определялась гель-фильтрацией на Се-фадексе в-ЮО по методу Эндрюса. Ферментативная активность элюировалась одним острым симметричным пиком, соответствующим белкам с мол. массой 28000 (рис.3).

Кривая, описывающая зависимость активности фермента от рН имеет колоколообразную форму. Оптимум действия эластазы по расщеплению азоказеина и специфического трипелтида Зис-А1а-А1а-А1а-рИА находится в интервале рН 7,5-8,0.

При электрофорезе в 105» ПААГ в присутствии додецилсульфа-та натрия обнаруживается одна азоказеинрасщепляющая полоса в зоне белков с мол. массой 28000. Это свидетельствует об отсутствии субъединичной структуры у эластазы из головного мозга быка.

При тестировании чувствительности препарата относительно ряда ингибиторов, специфичных для разных классов пептидгидролаз оказалось, что активяоо-ь эластазы не ингибируется п-ХМБ, а также цистеином, уЗ-^еркэптзэтанолом и ЭДТА. В то же время активность эластазы высокотгувствительна к ДПФ - 0,1 мМ ДПФ подавляет активность эластазы на 95% (табл.3).

Удельная активность препаратов эластазы при трехмесячном

Очистка эластазы головного мозга быка

Стадия очистки Общий Общая Выход, Специфич. Очистка,

белок, активность, в % активность раз

Е/280 мкМоль/мин мгадоль/мин/Е^зд

I. Супернатант 100000 g 450,0 2,5 - 0,0056 1,0

2. Фракционирование 40-80$ сульфатом аммония 98,0 2,1 84,0 0,021 3,75

3. Гепарин-агароза 30,5 1.8 72,0 0,06 10,7

4. Сефадекс G-I00 13,7 1,4 56,0 0,101 18,2

5. КМ-Сефадекс С50 0,4 0,98 39,2 2,45 437,5

6. Сефадекс G-I00 0,22 0,84 33,6 3,8 678,5

Фермент бия очищен из 100 г коры больших полушарий головного мозга быка. Приведены данные двух отдельных очисток.

Энзиматическая активность измерялась к Suc-Aia-AJ.a-Ala-.piJA , рН 8,0.

Рис.3. Определение мол. массы эластазы и катепсинай

гель-фильтрапией-на колонке с сефадексом а -100.

1. БСА (мол. масса 67000)

2. Овальбумин (мол. масса 45000)

3. Хшотряпсин А (мол. масса 25000)

4. Миоглобин (мол. масса 17800)

5. Эластаза и катепсин«} (мол. масса 28000).

хранений при -15°С теряется на 20$, при 18-часовой экспозиции фермента при комнатной температуре эластаза теряет не более 30$ своей азоказеинолитической активности.

Катепсин о . Катепсин й был очищен в 450 раз по сравнению с супернатантом 100000 % (табл.2). Из 100 г коры больших полушарий головного мозга быка получено 0,22 мг фермента. Удельная активность полученных препаратов составляла по гидролизу Ъ-_а!у-С1у-РЬе-рЫА 4,5 мкмо^/мин^дц (табл.2), выход по активности - 40,4$.

Мол. масса катепсина й определялась гель-фильтрапией на Сефадексе в-ЮО. Так же, как в случае эластазы, ферментативная активность элюировалась одним острым симметричным пиком, соответствующим белкам с мол. массой 28000 ( рис.3).

Очистка катепсина о головного мозга быка

Степень очистки Общий белок, Е/280 Общая активность, мкмоль/мин Вы|од, Специфич. активность Очистка, раз

I. Супернатант 100000 g 450 4,7 • - 0,01 1,0

2. Фракционирование 40-80% сульфатом аммония 98 4,0 85,1 0,041 4,1

3. Гепарин-агароза 30,5 3,4 72,3 0,11 П.,1 _

4. Сефадекс G -100 13,7 2,8 59,5 0,21 21,0

5. КМ-Сефадекс С50 0,8 2,0 42,5 2,5 250,0

6. Сефадекс G-I00 0,42 1,9 40,4 4,5 . 450

Фермент был очищен из 100 г коры больших полушарий головного мозга быка. Приведены данные двух отдельных очисток.

Энзиматическая активность измерялась к Z-Gly-Gly-Phe-pNA , pH 8,0.

- - — - — --------- - - - Таблица 3

ивойства эластазы и катепсина g мозга

Эластаза Катепсин G

(1Э 3.4.21.11) (3.4.21.20)

Рекомендуемый субстрат

Suc-Ale-Aia-Ala-pNA Z-Gly-Gly-Phe-pNA

Оптимум рН 7,5-8,0

Молекулярная масса 28000

Субъединичная структура нет

Чувствительность к эффекторам (остаточная активность, %):

Цястеин (I мМ) " 100

уВ-ЫЭ (2 мМ) ' 100

n-ХМБ (I мМ) 100

ЭДТА (ОД мМ) 100

Ш(.1Ш) 5

7,5-8,0 28000 нет

100

100 100 95 О

, Оптимум действия катепсива в по расщеплению азоказеина и специфического субстрата г-аху-йху-ихв-рнл. находится, в интервале рН 7,5-8,0, а ?фивая, описывающая зависимость активности катепсйна о от рН имеет калояолообразную форму.

ДСН-электрофорез в 10%-ном ШАГ обнаруживает одну азока-зеин-расщепляйщую полосу, соответствующую белкам с мол. массой 28000, что говорит об отсутствия субъединичной структуры у катепсйна й из головного мозга быка.

.Тестирование чувствительности катепсйна а к специфическим ингибиторам разных классов ярагейваз показало, что при полном ингибирований ДПФ, ее активность абсолютно нечувствительна к

- 18 -

п-ХМБ, цистеину, ^Й-МЭ и ЭДТА (табл.3).

После трехмесячного хранения при -15°С катепсин б теряет 25$ своей азоказеинолитической активности, а при 18-часовой экспозиции при комнатной температуре - не более 20%.

ОБОУВДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ

Обнаружение Suc-Aj.a-Ala-Ala-.pNA- и г-С1у-С1у-Рйе-рЫА-

гидролазной активности в супернатанте 100000g гомогената перфузированногэ мозга крыс ' дало нам основание для то-

го, чтобы сделать предположение о существовании в головном мозге млекопитающих сериновых пептидгидролаз, активных при рН 8,0, не описанных ранее в нервной ткани. О том, что они сериновые, говорит то, что их активность практически- полностью ингибирова-лась ДШ - универсальным ингибитором семейства сериновых пептидгидролаз и была нечувствительна к п-ХМБ - специфическому ингибитору цистеиновых пептидаз, блокирующему зн -группу, к ЭДТА, хе-латирующему агенту, инактивирующему металлопротеиназы. Ни один из известных к началу наших исследований сериновых пептидаз ГОЛОВНОГО МОЗГа Не ПРОЯВЛЯЛ СПеЦИфИЧНОСТИ К УиС-А1а-А1а-А1а-рШ и г-Му-СЛу—Рйе-рИА - субстратам, специфическим соответственно для эластазы и катепсина в.

Впервые Старки и Баррет одновременно с эластазой выделили и очистили химотрипсиноподобный фермент, ими же впоследствии названный катепсиномс . После экстракции из селезенки человека ферменты разделялись на колонке с ДЕАЕ-пеллюлозой, затем отдельно дочищались: эластаза - на СМ-целлюлозе и сефадексе о-75, а катепсин 6 - на гидроксиапатите и сефадексе а -75.

В последние годы разными авторами были предложены методы очистки эластазы и катепсина из нейтрофилов и селезенки чело-

века,-мыши, свиньи с применением хроматографии на карбоксиме----

тилтрисакриле, Moho S , апротинин-агарозе, трасилол-сефарозе, контрикал-сефарэзе.

Предложенная нами схема одновременного выделения и очистки эластазы и катепсина g включает гомогенизацию коры больших полушарий головного мозга быка, дробное осаждение 40-80% сульфатом аммония и четырехступенчатую процедуру колоночной хроматографии на гепарин-агарозе, сефадексе g -100, КМ-сефадексе С-50 и повторную хроматографию на сефадексе g-100 (схема I).

На первом этапе очистки - аффинной хроматографии на гепарин-агарозе, не происходит специфического связывания ферментов, обладающих Sue-AAa-Aia-Al«-pWA - и Z-Giy-Gly-Pae-pNA -ГИД-ролазной активностью с лягандом: на этой стадии прирост удельной активности ферментов достигается за счет связывания с носителем примесных белков (рис.1).

На второй стадии очистки - гелъ-фильтрании на се||адексе g-I00, где получаются два пика азоказеинолитической активности, один из которых нечувствителен к ЕПФ, удаляются протеина-зы несериновой природы.

Ключевой является третья стадия очистки ферментов - ионообменная хроматография на КМ-сефадексе С-50, когда при помощи градиентной элюции раствором NaCI удается отделить друг от друга Suc-Ala-Ala-Ala-pNA- и Z-Gly-Giy-i>ne-pNA -гидролаз-ную активности, т.е. - эластазу и катепсинG (рис.2). Эласта-за элюируется с колонки концентрацией KaCI, равной 0,4 М, тогда как катепсин g связывается с катионообменником более прочно, и для его элюции необходима I М концентрация ЫаС1. Это говорит о том, что катепсинG и эластаза головного мозга быка различаются друг от друга по заряду: катепсин G более эсно'вный

белой, чем эластаза, что согласуется с имеющимися в литературе данными о сильновыраженных основных свойствах катепсина о из других источников.

Проведенная после разделения друг от друга эластазы и катепсина в рехроматография на сефадексе в -100 позволила не только сконцентрировать очищенные белки, но и добиться существенного прироста в их активности.

Мол. массу очищенных нами ферментов определяли по методу Эндрюса (гель-фильтрацией на колонке с сефадексом (Ы00). Оба фермента . элюировалясь в объеме, соответствующем белкам с мол. массой 28000. Ни один из описанных до этого сериновых пептид-гидр олаз нервной системы не имеет столь низкой мол. массы (рис. 3).

Мол. масса эластазы и катепсина б , очищенных из селезенки человека Старки и Барретом, определенная гель-фильтрацией на сефадексе й-75 составляла 20000 и 17000 соответственно. Мол. масса панкреатической эластазы оценивается в 25900 у свиньи, в 27000 у трески, а нейтрофильной эластазы у разных животных в 25-30000. Мол. масса катепсина о из разных источников составляет от 17000 до 28000.

Таким образом, мол. масса очищенных нами двух эндопепти-даз соответствует общим представлениям о мол. массах эластазы и катепсина й

М 9

рН-зависимость активности ферментов определялась в щелочной области рН - от рН 6,0' до рН 10,0. Оптимум рН действия этих ферментов находится в области рН 7,5-8,0, что исключает возможность вклада в детектируемую активность пептидгидролаз, относящихся к суперсемейству аспартильных, так как известно, что их активность проявлятся только цри кислых значениях рН.

- -- ----------------------" ГОМОГЕНИЗАЦИЯ

(2 объема 0,05 М трис-НС1, рН 8,0, 0,8 М ЫаС1, 0,1% -35,

0,1% Ыа^ДТА)

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ

(20000 в, 30 мин)

ФРАКЦИОНИРОВАНИЕ 40-80$ СУЛШТОМ АММОНИЯ

ЦЕНТРИФУГИРОВАНИЕ (100000 е , I час)

ДИАЛИЗ СУПЕРНАТАНТА

(против 0,05 М трис-Н01, рН 8,0, 0,8 М ЫаС1, 40 ч)

1

ГЕПАРИН-АГАРОЗА

I

СЕМДЕКС й-100

I

КМ-СЕФАЛЕКС С50

I—

ЭЛКЦИЯ 0,4 М ЫаС1 ЗЛЮЦИЯ I М ЫаС1

СЕФАДЕКС О-100 СЕФАДЕКС й-100

I 1

ЭЛАСТАЗА КАТЕПСИН С

Схема I. Выделение и очистка эластазы и катепсина О из головного мозга.

- 22 -

Изучение чувствительности очищенных нами ферментов к ингибиторам разных классов пептидгидролаз показало, что их активность не ингибируется п-ХМБ - реагентом, блокирующим зн-группу, являющимся универсальным ингибитором ферментов семейства цистеи новых пептидгидролаз, так же ЭДТА - хелатирующим агентом, обладающим способностью янаятивировать металлопротеиназы. Активность этих ферментов одинаково нечувствительна также к тиояо-вым соединениям - цистеину и у-МЭ, активаторам пистеяновых пептидгидролаз, но практически полностью ингибируется ДПФ. Это не оставляет сомнений в том, что оба очищенных фермента относят ся к семейству сериновых пептидгидролаз.

Так как известно, что катепсин о проявляет высокую специфичность к пептидным связям, в которых карбонильная группа принадлежит остаткам ароматических аминокислот, было тестировано еще два модельных пептвда, а именно Вг-Туг-рИа и Ви-РЬе-рш Оба они оказались худшими субстратами, нежели 2-(51у-Оу1-

-Мге-рКА.

Вышесказанное позволяет идентифицировать впервые очищенные из головного мозга низкомолекулярные сериновые протеиназы как эластазу и катепсин О. '

ВЫВОДЫ

1. Впервые'в нервной ткани млекопитающих - головном мозге крысы и быка обнаружены две низкомолекулярные сериновые пеп тидгидролазы, активные при. слабощелочных значениях рН, которые впоследствии были идентифицированы как эластаза (КФ 3,4.21.11) и катепсин о (КФ 3.4.21.20).

2. Разработана процедура выделения и одновременной очистки эластазы и катепсина й из головного мозга быка (кора

больших полушарий). Предложенная нами схема очистки эндопепти-даз включает фракционирование супернатанта ЮООООв сульфатом аммония (40-80$).с последующей аффвнной'хроматографией на гепа-ркк-агарозе, гель-фильтрапией на сефадексе О -100, ионообменной хроматографией на КГЛ сефадексе С50 и повторной хроматографией на сефадексе й-ЮО. Впервые из данного источника получены шсокоэчвщенные препараты эластазы и катепсина б . Эласта-за была очищена в 678,5 раза, а катепсин 0 - в 450 раз.

3. Сопоставление физико-химических и энзи?.;ат:ггсск;:х сво«ств этих двух сериновых эндопептидаз показало, что они имеют ряд общих параметров - мол. масса 28000, чувствительность к ДПФ, нечувствительность к ЭДТА, тиоловым соединениям и реагентам, блокирующим БН -группу, отсутствие субъединичной структуры, способность расщеплять как белковые (азоказеин), так и синтетические модельные пептидные субстраты при слабощелочных значениях рН с оптимумом действия при 7,5-8,0.

4. Выделенные из коры больших полушарий головного мозга быка эластаза я катепсин о различаются по заряду - катепсин с более основный белок, нежели эластаза, и на этом основано разделение этих ферментов с помощью ИОХ на КМ-сефадексе С50:

при градиентном элюировании с колонки эластаза злюируется 0,4 М концентрацией НаС1, тогда как катепсин о можно выделить, если будет достигнута I М концентрация раствора Ыа01.

5. Эластаза и катепсино проявляют разную субстратную специфичность - для эластазы специфичным субстратом является Зис-А1а-АГа-А1а-рЯА, тогда как катепсин с проявляет специфичность, сходную с химэтрипсином и эффективно расщепляет 2-01у-01у-УЬе-р1ТА, Вг-Туг-рИА, Ви-РЬе-рИА,

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Азарян А.В., Асатрян P.M. Аффинная хроматография катепсина G и эластазы головного мозга на сорбентах, содержащих различные специфические лиганды, - В сб.: Всосоюзн.конф. "Методы получения, анализа и применения ферментов", Тезисы докладов, Рига*- 1990, с.59

2. Азарян А.В., Асатрян P.M. Катепсин G и эластаза головного мозга быка. Очистка и некоторые свойства, - В сб.: У) научно-техническая конференция молодых ученых и специалистов р-на 26-и комиссаров, Тезисы докладов, Ереван, 1990, с.43

3. Azaryan А,, Asatryan К. Two low-molecular-weight serine endo-peptldaaes in bovine brain, - ESH, 8-th Gen.Meet., Leipzig, 1УУО, P. 14b

4. Azaryan A,, Asatryan R. Angiotensin-coaverting potency of a chymotrypain-liJce protease from mamaslian brain, J?roo. 1st Summer Heuropeptide Confeeence, 1991, Cape Code, MA, USA, p. 2

5. Асатрян P.M., Галоян A.A., Азарян A.B. Некоторые физико-химические характеристики катепсина G и эластазы головного мозга быка, "Нейрохимия", 1992, 14, с.

Ь. Azaryan A., Asatryan R, Effect of Са*+ on the activity of a chimotrypsin-lilce protease in brain , American Society for Neurochemistry, Houaton, Texas, p. 266