Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему

Дослiження фосфоiнозитидспецифiчноi фосфолiпази с в лiмфоiдних клiтинах при дii iонiзуючого опромiнения

ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "Дослiження фосфоiнозитидспецифiчноi фосфолiпази с в лiмфоiдних клiтинах при дii iонiзуючого опромiнения"

2 1ф

АКАДЕМ1Я НАУК УКРА1НИ ШСТШУГ Б10Х1МП 1М. 0. В. ПАЛЛАД1НА

На правах рукопису

СИРОВЕЦЬ ТЕТЯНА ОЛЕКСПВНА

Д0СЛ1ДЖЕННЯ ФОСФОШОЗИТИДСПЕЦШЧНО! Ф0СФ0ЛШАЗИ С В Л1МФ01ДНИХ КЛ1ТИНАХ ЩУРГВ ПРИ ДЛ 1(ШЗУЮЧОГО 0ПР0М1НШЯ

03.00.04 - С10Х1М1Я

Автореферат дисертацП на здобуття наукового ступеня кандидата 61олог1чних наук

КИ1В-1992

'Робота виконана в лабораторН ф1зико-х1м1чно1 61олог11 кафедри 6ioxiMix. 6iологхчного факультету Кихвського ушверситету in. Тараса Шевченка

Науковий кергвник - чл.-кор. АН Украхни,

доктор бголог1чних наук, професор М.6. Кучеренко

Офгцхйш опоненти:_ доктор бхологхчних наук, проф. Серкгз ЯЛ.

Провадна оргашзашя: Украшський державний медичний ушверситет хм. 0.0. Богомольця

/Захист вхдбудеться " -Ф " gUj 1993 р о год на

засхданш спец1ал1зовано1 вчено5 ради Д 016.07.01 . в 1нститут1 6ioxiMii хм. О.В. Палладхна АН Украхни /252601, м.Ки!в-30, вул. Леонтовича, 9/

Автореферат розiеланий « ¿¿^f 1993 р.

Вчений секретар спец:ал13овано1 вченот ради

доктор бхолог1чних наук Тугай В.А.

г

О.В.Кирсенко

ЗАГАЛЬНА -ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальн1сть проблеми. В наш час загальновизнана фундаментальна роль бЮлоПчних мембран у забезпеченн! Щл1сност1 кл!тини 1 регуляцН обм1ну речовин, енергИ. ■ 1нФормац11. Головну роль у цих процесах вШграе лШдний .матрикс, котркй складаетъся в гначн!й м1р! з фосфол1п1д1в. остакн!. як в1домо, е даерелом 61олог1чно актиЕяих речовин.

Досягнення осташйх рок1в в галуз1 вивчення л1п!д1в мембран висувають на переднХй план наукових досл1даень проблему мета-бол1зму фосфо1нозитид1в. Безпосередня участь фосфо1нозитид1в в процесах кл!тинно1 активац11, продукцП' мед1атор1в 1мунно1 В1дпов1д1 визначае важливе значения 1х обм1ну в стабШзацП.

; 1мунних реакцШ орган1зму (Утещев , 1991. Nelet.et.al, 1987). ФункцЮнування фосфо1нозитидно1 скстеми т1сно пов'язане з1 структурною орган1зац1ею мембран, пошкодження яко! п1д д1ек> рад!ацП моне бути причиною порушення нормального функЩонуваяня кл!тин та 1х 1нтерфазно1 загибел1 (Ейдус._ 1989).

Безпосередаьою м!шенню сигнал-залежного г1дрол1зу пол1фосфо!нозитид1в е фосфатидил1нозитолб1фосфат (Ф1Ф2). г1дрол1з якого зд1йснюеться високоспециф1чним ферментом - фосфол1пазою С (ФЛС. КФ 3.1.4.10. монофосфатадил1нозитфосфог1дролаза). Фосфол1паза С г1дрол1зус Ф1Ф2 з утворенням вторинних месенджер1в: 1нозитолтрифосфату (1ФЗ) 1 д1ацйлгл1церолу. як! зм1нюють концент-рац1и цитозольного Са*1 в певних напрямках х1д метабол1чних процесс в кл1тин1 (Утешев. 1991; Beггldge 1987). ФЛС. -таким чином, функцюнально пов'язана з механ1змами, як1 регулюють метабол1чн1 процеси в л1мфо1дних тканинах.-

0станн1м часом ' стае особливо актуальним вивчення б1олог1чно1 д11 1он1зуйчог<* вштром1нювання. Зм1нам. що в1дбува-сться в 1мунн1й систем!, як особливо чутлив1й. належить особлива роль у розвитку патогенезу променевого ураження. До цього часу остаточно не визначена природа ф1зико-х1м1чних процес1в, що приз-водять до б1ох1м1чних 1 морфолог1чних ЗМ1Н л1мфо!дних КЛ1ТИН 1 подал1 до розвитку 1мунодеф1циту1 1мунодепрес11 (Ярмоненко. . 1984}. Дози опром1нення , Шд впливом яких спостер1гасться ура-ження 1мунокомпетентних кл1тин пор!вняно невисок! - до 1 Гр

- г -

(0.026 Кл/кг)(Бородкевич, 198Э;Ярил1н, 1988; Hoppe, 1S89). У наш час вважаеться загальновизнаним , що 1он1зуюче випром!нювання в цих дозах д!е переважно на т! процеси, що п1ддаються регулюван-ню , мод1ф!куючи внутр!шньокл!тинн1 процеси управл1ння ними (Ей-дус, 1989; Ярил1н. 1988). Таким чином, д!я 1он1зуючого випром!юо-вання трансформуеться в б1олог1чно-важливий сигнал, який моке ма-ти м1сце в нормальних умовах. Щлком можливо, що одн1ею з таких систем регуляц1й с фосфатидил1нозитольний цикл .

В л!тератур1 практично в1дсутн! дан! про вплив 1он1зуючого Б1шром1нювання на активнЮть фосфол!пази С 1 метабол!зм фосфо!но-зитид1в в л!мфо!дних кл1тинах.

У зв'язку з. зазначеним вище, вивчення' активност! фосфол1пази С л1мфоцит!в, а такок метабол1зму фосфо!нозитид1в в динамЩ1 променевого ' ураження може в1д1грати важливу роль у ^з'ясуванн! шлях!в формування пострад!ац1йних порушень мета-бол1зму. що можуть призвести до зм!ни функцЮнально! активност! л1мфо!дних кл1тин . '

Мета 1 завдання дослШення, Иетою дано1 робота стало вивчення вплыву рентген1вського опром!нення в доз1 0,5 1 1,0 Гр на функц1онування Са-зале&но1 пол1фосфо1нозитидно1 системи л1мфо-цит1в тимусу 1 селез1нки щур1в . Для досягнення Ще! мети не-обхХдно було розв'язати так! завдання:.

1.Вивчити включения 32-Р. в пул фосфо1нозитид!в л!мфоцит!в тимусу 1 селез1нки щур1в в норм1 1 через 6,12 годин п1сля оп-ром1нення тварин в доз1 0.5 1 1.0 Гр.

2.Вивчити субкл1тинний розпод1л активност! 1 власхивост1 фосфол1пази С л1мфоцит1е тимусу ! селез1нки щур!в в норм1.

3. Провести пор!вняльне досл!дження активност! ! властивостей фосфол1пази С л1мфоцит1в тимусу 1 селез1нки щур!в в норм! 1 в

пострад1ац!йний пер!од ( п!сля опром!нення в доз!:'0,5 1 1,0 Гр).

2*

4-Вивчити динам!ку надходження Ca в л1мфоцити тимусу i се-лез!нки 1дур1в в норм1 1 п!сля опром1нения.

б.Визначити р!вень утворення 1нозитолфосфат1в-продукт1в г!дрол!зу пол!фосфо1нозитид1в фосфол1пазою С, в л!мфоцитах се-лез1нки ! тимусу в норм! 1 через 1,3,6,12 г п!сля. опром1нення в доз1 0.5 1 1,0 Гр. •

Наукова новизна робота. Вперше проведено пор1вняльне вивчення властивостей фосфол1пази С в цитозольн!й 1 мембранн!й фракЩях л1мфоиит!в селез!нки 1 тимусу. Отриман! дан! дозволяють. припусти-

та про наявн1сть- в цитозолыШ фракцПл1мфоцит1в тимусу 1 се-лезХнки двох форм фосфол1пази С. Фермент л1мфоцит!в селез1нки проявляв б1льшу активы 1сть у пор1внянн! з ферментом тимоцит1в. •

Встановлено, що в л1мфоцитах тимусу 1 селез1нки щур!в, оп-ромШених в дозах 0.5 та 1,0 . Гр. . вШуваються порушення мета-"бол!эму фосфол1п1д!в 1 в значн!й м1р'1 фосфо1нозитид1в, що в!доб-ражаеться у зм!н! включения 32-Р у 1х склад. Вперше встановлено, що зм1ни метабол1зму фосфо1нозитид1в л!мфо1дних кл1тин опром1не-них щур1в в- значн1й м1р1 обумовлен1 зм1нами активное?I фосфолша-зи С. Вперше показано, що рентген1вське опром!нювання щур!в вик-ликае Шдвищення активност! фосфол1пази С л1мфоцит1в тимусу 1 се-лез1нки вже в перш1 години п1сля опром1нення. Шдвищення активност! ФЛС призводить до зростання утворення 1нозитолфосфат1в 1 в тому числ1 ЛФЗ. Ц1 зм1ни передугать у час1 зростанню початково! швидкост1 надходження кальц1ю 1 його вм1сту в л1мфоцитах се-Л831НКЙ. .Через 12, 24 . години п1сля опром!нення .активнють, фосфол1пази С пригн1чуеться,. що призводить до зменшення утворення 1ФЗ. "

Виявлено, що зм1ни метабол1зму фосфо!нозитид1в. що в!дбува-ються внасл1док опром!нення. в л1мфоцитах селез1нки мають б!льш виявлений характер пор1вняно з тимоцитами.

Показано, що зм!ни в фосфо1нозитидн1й сигнальн!й систем! мо-жуть бути сп!льною ланкою у реал1зац!1 дЦ митоген!в 1 опрсм1ню~ вання на л1мфо1дн1 кл!тини.

Теоретична 1 практична знатам1сть роботи. Отриман! результата сприяють б1льш повному розум1нню 61ох1М1чних механ1зм1в розвитку променевого ураженняорган1зму. ■ Виявлен! ланки метабол! зму фосфо1нозитид1в в Л1Мф01ДКИХ кл!тинах, як1 чутлив! до ДП 1он1зу-ючого випром1нювання. 0триман1 дан! доповнюють 1снуюч1 положения про неодаакову д!ю р1зних доз опром1нювання. . та про наявнЮть сп1лышх механ1зм1в у процесах активацИ л!мФо1дних' кл1тин та ре-ал"1зац11 променевого ураяення. На основ1 визначених молекулярних механ1зм1в порушення функц1онування фосфо1нозитидно1 системи мож-на зд1йснити розробку м!р ц1ленаправленого впливу на Щ зм1ни для 1х корекцй. Результата досл1даення можуть бути корисними п1д час розробки нових рад1опроф1лактичних та рад1отерапевтичиих засоб1в. Заходи по пригн1ченню актавност1 фосфол1пази С 1 зниженню проник-ност1 мембрани л1мфоцит!в . для Са** можуть сприяти нормал1зац11 функц1онування 1кунокомпетентних кл!тин 1 сприяти зменшеннп 1х

" 1-108« '

ураження п1сля випром1нювання. Зм1ни метабол1зму фосфо1нозитид1в можуть бути основою.для розробки тест1в для оц!нки д11 1он1зуючо-го опроШнення .

Апробаи1я роботи. Результата робота були викладен1 на Y1 Ук-ра1нському б1ох!м1чному з*1зд1 (Ки1в, 1992). Всесоюзн1й ' науковШ конференцП "1мунний статус людини i рад1ащя" (Гомель, 1991), на ун!верситетськ1й конференцП професорсько - викладацького складу, на зас!данн1 кафедри 61ох1м11 Ки1вського ун1верситету,

Публ1каШ1. По тем1 диссертацп опубл1ковано 4 роботи. Об'ем 1 структура дисертаяИ. Дисертац1йна робота скла-дасться з вступу,- огляду л1тератури. матер1ал1в 1 метод1в досл!дження, результат^ роботи та 1х обговорення. заключения, bhchobkíb, списку л1тератури, що складаеться з 234 роб1т. Дисер-таЩя викладена на 152 стор, мае у своему склад! 14 рисунк1в та 9 таблиць.

4

МАТЕРИЛИ I- МЕТОДИ Д0СЛ1ДЖЕННЯ

В досл1дженнях використовували б1лих щур1в л1н11 В1стар р1зно1 стат1 вагою 130-150Г. Тварин опром1нювали на установи! РУМ -17 в дозах 0.013 1 0,026 Кл/кг (що в1дпов1дае поглинут1й, доз! 0.5 1 1.0 Гр) за умов: потужн!сть дози в пов1тр1 24.5 сГр/хв, Ф1льтри 0,5 мм (Al+Cu), напруга 200 кВ, сила : струму 5 , мА. в1дстань до поверхн1 шк1ри тварин - 50 см.

Тварин декап1тували 1 добували тимус 1 селез1нку. Фракц1ю л1мфоцит1в селез!нки отримували ; центрифугуванням кл1тинно1 суспензП на град!ент1 Flcoll-Paque (густана 1,077) за методом (Boyum; 1968). Субкл1тинн1 фракц11 л1мфо1дних кл1тин отримували методом диференц1йного центрифугування без'ядерного супернатанту л1мфоцит1в в 25 мМ трис-HCl буфер!. рН 7,4 при 100000 g 1 використовували як ферментний препарат фосфол1пази С:

Кл1тини (2 ■ 10 кл/мл) 1нкубуаали на протяз1 р1зних пром1жк!в часу з такими м1тогенами (Sigma) : конканавал1н А (Кон А). ф1то-гемаглютШн • (ФГА). л1посахарид E.coll (ЛИС) у концентрат 1 0.5 мкг/мл, чи кальц1свим 1нофором А12387 у концентрац11 0.5 мкМ. .

Надходження визначали за методом (Авдон1н. : 1985:

Kale, 1987).Суспенз1ю л1мфоцит1в (0,5-107кл) 1нкубували пр.и.30йС в середовщ! 199, що м1 стило 1 mkKÍ [45-Са]-CaCl¿. РеакЩю зупиняли швидкою ф!льтрац1сю проб через Ф1льтри "Синпор "N6 0.9% NaCl з

IreM ЕГТА (pH 7.0). Ллл визначення-неспр11иф1чного зв'язуванн^ кальцйэ суспенз1ю л?т.;?сцит1в накосили на ф!льтри одразу ж гисля "додаванни ¡45-Ca"U

Включения 32-? в фосфояШ"; л!мФо'1дних кл!тин вивчали в сере довиц! 199 . що М1СТЙЛ0 8-IOmkKI С32-Р] -H^POi, (Boon. 19«5). ЕкстракцЮ фос£ол1пШв проводим за методом (Прохорова. U32). фосфо!нозитил1в- fDT./scn, 1965). ФосфолШди роздЗляли лрохатог-раф1св в тонкому шзр1 на пластинах Silufol (Хемапол) за методом (Шталь, 107*) У систем! хлороформ: метанол- 25% аьцак (65:2С;4>. 1дентиф1кац1ю провп^лп s napsv »оду за допомогою стандарт1в Е1тчиэнянг>гс ьирооя?цтпа . Фосфо1нозитиди розд1ляли в тонкому с1л1кагелю RH 40/5 (Хемапол). що м1стив 1% оксалату кал1ю , s систем! хлороформ: метанол: уксусна кислота: вода (40:7:22:5) за методом (Müller, 1986) 1 1дентиф!кували з врахуванням Rf стандарт1в-св!дк1в (Шрагин.1988).

"Визначення активност! ФЛС в л1мфоцитах щур1в проводили за методом (Carter, 1987) . Середовнще 1нкубац11 (0.5 мл) м1с-"~о мМ трис-НСГ (pH 7,2-8,0) або трис-япггвт (рн •:.: ".с-

СаСЬ- Як г-у"::гу-л ~::уу::;у:овуг-у< чг.ссаткднл- i2-^ Hi - i -■■.<:- ~ (•: • .s,rch£v;;, 2'j СУО COM HZ npc-Cy) :: V.nri ■'...:•:

у -У :;.". T^uryi': д;д::плькь:: :0 .Уу-

мсл; препарату <УЛ0, зуплнл-п додаг.а.ч;!:;м мл су^У;! ;:.".-. у: -l'■:: этанол: HCl (100:200:0,3). Про акткийсть фгрмелту судили за рал1оактивк1стэ водррозчинккх кетабод1т1в.

ли-уоиити , прехнкубовак! з f32-P]-Н3Р0ц,використовуЕЗДи для ккшьч&шя :.тсоре:-.ня 1нсз;:толФос^а11в. До есаду а1дмитих в1д за-.ушк'з нугхи juslTJia додавали 1 мл середовшца 199 , «'с ~ :о

мй L1C1 для пригн1чення йосфатзз, 1 ш.уСу-'&ли 5 хе- кр;: ;.г о. T4o?::ToXiIoC''.'v;:i ;>;с;,;агу. 1;:и за метгугм (Cartt;-. iöo'u 1 розд!ля-ли antPHccOrwioB :<го.ча-;^-раФ1со . на колонках Partiell 10 SAX (Amcrsnam) з врахуванням рекомендацш Ф1рми-розро'блшача . Розд1лення проводили в три стадЦ: 2 мл 0.2 и го« ' z;:r.n елющю Июзитолфосфату 7 мл D.4K KHÄF0<,- Зк ;

2 ::л 0.0 М КН,У0._-г-:лтрифо',?:.ту (Sigtу.,,1007.).

П1лрзхуг:о1с ... 1чг:гност1 про;;од-.:л:; :>;■:-■ у: НО-СДОНТ1 ляДО-оку .ЧУ-.::--. :-,жу "Delta" (С2А) У: .л;.;-:-. оороОку ;г .у.ътс". U- пр-воякл: г-з ПЕК' "¿скра-226" (СРСР) з використакням cibHjvy^Uiüiij пакету прикладних програм на мен! "Basic" (Брандт,1987).

1*-10вв '

РЕЗУЛЬТАТИ ТА IX ОБГОВОРЕННЯ

Один з показник!в метабол!зму фосфолШд!в . 1 в тому числ1 фосфо!нозитид1в - включення в ix склад рад1оактивного ортофосфа-ту. Р1вень включення м1тки дозволяс визначити . 1нтенсивн1сть б1осинтетичних ■ процес!в нав1ть у тому випадку. коли вм1ст фосфол1п!д1в не зм1юоеться внасл1док активного розпаду фосфолШд1в, що в!дбуваеться паралельно синтезу (TaylorЛ984):

В1домо,. що протягом 6 г п1сля.опром1нювання тварин в дозах, що не перевищують 1. Гр, не спостер1гасться статистично в1рог1дно1 зм1ни чисельност! л1мфо!дних кл1тин тимусу 1 селез1нки . Проте у цей час в1дбуваються р1зноман1тн1 порушення метабол1чних процес1в в даних кл1тинах (Кучеренко, 1991). Виходячи з цього ми досл1дили включення 1 32-Р ортофосфату в фосфол!п1ди л1мфо1дних кл!тин щур1в через 6 г п1сля опромйення тварин в дозах 0,5 1 1,0 Гр (рис.1).

Час, на протяз! якого встановлюеться максимальний р1вень включення 32-Р в фосфолШди тимусу - 2 г, л1мфоцит1в селезШки I- 30 хв. t Максимальний р1вень включення 32-Р в фосфолШди тимусу приблизно у 2 рази вищи'й Hla у л1мфоцити селез1нки.

Нами не в1дм1чено р1зниц1 у включенн1 32-Р в фосфолШди ти~ моцит1в щур1в, . опром1нених в доз1 0,5 Гр у пор1внянн1 з контролем. Включення м!тки в фосфолШди л1мфоцит1в селез1нки щур1в, опром!нених у ц1й доз1, проходило з упов1льненням, проте" макси-мальне включення м1тки дор1внювало включению 11 в контрол!. При опром1ненн1 тварин в доз1 1,0 Гр включення 32-Р в фосфолШди л1мфоцит!в тимусу 1 особливо селез1нки було б!льш пов!льним 1 . максимальне включення м1тки складало приблизно'70% в1д контролю. Через 12 г п1сля впливу, зм!ни були в1дпов1дними там., що спостер1галися через 6 г Шсля опром1нювання.

При вивченн! - включення 32-Р у фракЩю фосфтидшйнози-тол+фосфатидилсерин (Ф1+ФС) було виявлено, що в л1мфоцитах се-лез1нки та тимоцитах тварин опром1нених в доа1 0,5 Гр спостер1гаеться зб!льшення пор1вняного включення 32-Р по в!дно-шешю до вклачення в 1нш1 фракцИ фосфол1п1д1в. Зм1ни включення 32-Р у фракцио Ф1+ФС можуть бути обумовлен1 зм1нами метабол!зму ФосФатидил1нозитолу 1 пол!фосфо1нозитид1в (Теппермен. 1989)..

Через 6 г п!сля опром!нення тварин в доз1 0,5 Гр (рис.2) ми спостер!гали значне зб!льшення включення 32-Р в фосфо!нозитиди

Рис. I. ДинамГка включения Р^ в фосфол1п1ди л1мфоцит1в тимусу /А/ I селез1нки /В/ опром1нених щур1в: I - контроль, 2 - 0,5 Гр, 3 - 1,0 Гр.

I особливо в,Ф1Ф2 тимощгПв. Це св1дчить про активний синтез да-них фосфол!п1д1в 1 про активн1сть к!наз. що фосфорилюють Ф1 1 фосфатидилмонофосфат (Ф1Ф) з утворенням Ф1Ф2 (Taylor, 1984). Через 1? годин п!сля опром1нення включения м1тки в фосфо1нозитида зни-жуеться.' що можна пояснити зменшенням 1х синтезу або зб1льшенням г!дрол1зу, який ноже в1дбуватися п1д д!ею фосфол!пази С (Taylor. 1984). При опром1ненн1 тварин в доз! *1,0 Гр мк не спостер1гали фази зб1льшення включения м1тки в фосфо1нозитиди: вже через 6 г п1сля опром!нення вЦбуваеться знихення включения 32-Р в Ф1Ф2. яке збер!гаеться через 12 годин.

Шд час 1нкубац11 л1мфоцит1в тимусу з Кон А. спостер1гаеться зб1льшення включения 32-Р в Ф1Ф2 1. значне зменшення м1тки у

2-1088

F*.

1мп хв«107кд

2000-

1500

1000-

1400 1200 1000 800600 •400 200 о

Конгрсий 0прои1нення

0.5 Гр 1.0 Гр

вГ 12 Г 6 Г 12 Г

Рис. 2. Включения

р32

в фосфо1ноэитиди л!мфоцит1в тимусу /А/ 1 селез1нки /Б/ щур1в п1сля опроы1нення: Ш " фосфатидил1нозитолб1фосфат,

- фосфатидилмонофосфат, . Щ- фосфатидил1нозитол, * р< 0,05,

еклад1 Ф1.

В л1мфоцитах селез1нки щур!в, опром1нених в доз! 0,5 Гр, не спостер!галось суттево! зм!ни включення 32-Р в пол1фосфо!нозити-ди, проте значно зб!льшувалось включення в Ф1. На 6 г п!сля сп-ром1нення тварин в доз! 1,0 Гр ми спостер!гали зменшення включення м!тки в Ф1Ф2 1 зб!льшення 11 включення в Ф1Ф 1 Ф1. яке ще б!льи зростало через 12 г. Можливо, це викликано пострад!ац!йними порушеннямн в системах яосл!довного фосфорилювання 1 дефосфорилю-вання пол1фосфо1нозитид1в, що моке призвести до деф!циту ендоген-ного субстрату для фосфол1пази С.

Подальшою нашою метою було встановити, в як!й м1р1 зм1ни ме-табол!зму фосфо!нозитид1в можуть бути викликан! зм1нами актив-ност! фосфол!пази С л!мфо!дних кл!тин опром1нен'их тварин.

Для цього було вивчено катал!тичн1. та регуляторн1 власти-вост! даного ферменту з використанням ендогенного м!ченого субстрату. 3 л1тератури в1домо, що в клИинах багатьох орган!зм]в фосфол1паза С ' 1енуе у вигляд! цитозольно'1 1 мембранозв'язано! Форм, як! мають р!зн! властивост! (ВаЫаззаге. 1989; ВеЫ, 1938).

РН-оптимум цитозольно! 1 мембранозв'язано! форм фосфол!пази С зсунутий в область кислих рН (рис.3). активнють цитозольно! ! мембранозв'язано1 форм фосфол!пази С л1мфоцит!в селез1нки при вс!х значениях рН була вища пор1вняно з ферментом тимоцит1в. Для цитозольно! форми фосфол1пази С л!мфоцит1в тимусу 1 селез!нки була показана наявн1сть широкого оптимума рН: в!д 5,0 до 6,5. Иемб-ранозв'язан! форми фермента мали оптимум рН при 6,0-6,5.

Показано, що активн1сть цитозольного 1 мембранозв'язакого ферменту л!мфоцит1в селез1нки зростаяа, досягаючи максимуму за 75 ккМоль, а фосфол1пази-тшоцит1в - за 150 мкМоль Ф1 (рис.4.). К1-нетичн1 параметри даних кривих суттевих в!дм1н- не мали.

Для активацП фосфол1пази необх1дна наявнють' 1он!в к.альц!ю (Каеуег, 1985). Активн!сть ферменту визначали при р1зних концент-рац!ях хелатуючого агенту (ЕГТА). без додазакня в середовище 1нкубац11 1он1в Са 1 при зростанн1 кснцентрацП кальщю в!д 0,1 до 2,0 кМ (рис.5), При додаванн1 ЕГТА споетер!галося пригн1ченкя активност! фосфол1пази С. Дитозольна форма ферменту кл1тин, що досл1двуються. виявляла два оптимуми активност1: у в!дсутност1 в середовищ! 1нкубац11 екзогенного кальц1ю 1 при мшмолярних кон-центраци1ях кальЩю. Наявн1сть широкого оптимума рН-зале;кност1 1

2Х-!Ов»

Активн1сть, ЬтЙП 50 Ч^Х А

хв-ыг б1лка 30 10 » 2

ТО 5,0 ¿1 ¿0 рН Л—I

50 Б

30

5,0 6,0 ?,0 8,0 рй

Рис. 3. Залежн1сть активност1 фосфол1пазя С л1м$одит1в тимусу /А/ I селез1нки /Б/ в1д рН: I - цитозольна ©1С, 2 - мембрано-зв'язана ФЛС. .

Активн1сть, хв-иг б1лка

25 15

6 18 35 150 Ф1, шыоль

Рис. 4 . Залезш1ст'ь активност1 фосфол!пази С л1ифоцит1в щур1в в1д ЕонцентрацИ субстрату /Б/ /рН 6,5; 0,5 СаС^/:

1 - д1ифоцити тимусу, цитозольна форма ФЛС;

2 - лЬфцити тимусу; ыембранозв'язана форма ФЛС}

3 ~ ¿1м|одити седез1нки, цитозольна форма ФЛС;

4 _ л1мфоцитя селеэ1нки, ыембранозп'язана фориа ФЛС,

- 11 - - - -

двох оптимум!в -Са-залежяост1 дозволяв припустити про наявнють в цитозольн1й фракцИ л1.мфо!дних хл1тин б!льш н!ж одн1е1 форми ферменту. - -

Мембранозв'язана форма фосфолшази С тимоциПв 1 л1мфоцит!в селез!нки мала одан максимум активност! - в област1 мШмолярних концентрац1й Са. Проте значка активнЮть спостер1галась у середо-вищ1 1нкубац11 без додавання екзогенного кальцАю.

За оптимальних умов приблизно 80-85% активност! фосфолшази С визначалося в цитозодьн!й Фрэкци кл1тин 1 лише 15-202 активност! було зв'язано з мембранами.

Активн1сть цитозольно1 форми ферменту була досл1джена в ди-намШ.п1сля опром!нення тварин (рис.6.). АктавнЮть фосфол1пази С л!мфоцит!в селез1нки була п!двищена вже в перш1 години п!сля опром1нення.! досягала максимального значения через 3 години. Через 12-24 г пюля опром1нення спостер1галося' пригн1чення активност! ферменту. АктиваЩя ферменту л1мфоцит1в селез1нки тварин,-що опром1нен1 в б1лып1й доз!, мала б!лыл виразний характер.

АналоПчн! коливакня активност! фосфол!пази С ми спостер!га-ли в л!мфоцитах тимусу. АктиваЩя ферменту при опром!ненн! в доз! 1.0 Гр наставала дещо ран!ше (через 3 г) 1 була б1льш виразною, н1ж при опром!ненн1 в доз! 0,-5 Гр. а припПчення активност! фосфолшази С через 12 г п!сля опром!нення в доз1 1,0 Гр було б1льш значним.

Таким чином. фосфол1паза С вкявляе ранню радЮчутливЮть, зрсстакня активност1 ферменту л1мфоцит1в селез1нки в пост-рад!ац1йний пер!од б1льш - значке 1 в1дбувасться ранке у пор!внянн1 з ферментом тимоцит!в.

Пре1нкубац1я л1мфоцит1в тамусу з Кон А ! л!мфоцит1в се-лез1нки з ФГА та ЛПС викликала активац!ю фосфол1пази'С.'

Ахтивн1сть ферменту у в!дсутност! в середовищ! 1нкубац11 екзогенного кальц1ю в л1мфоцитах тимусу ,1 селез!нки була п1двищена через 6. 12 г п1сля слром!нення. Цитозольна фосфол1паза с л!мфо-цит!в тимусу, до активуеться 0,5 мМ Са*. також проявляла Шдвищену активн1сть через 6. 12 г пюля опром!нення. Зм!ни активное?! Фосфол1пази С.що активусться 0,5 мМ са2г. в цитозол! л!мфоцит!в селез1нки мали зовс1м протилехний характер : пригн1чення активност! спостер!галося вже через 6 г П1сля опром!нення 1 значно посилввалось через 12 г.

3 данях наведених вище можна зробити висновок, що ак-

АктивнГсть,

Im [%1

w • . - CaCIo iM

3,1 0,5 1,0 2,0 2,

I Б

ETTA,. iM

CaCI2, ыМ

4 2 0,1 0,5 1,0 2,0 Рис. 5. Залежн1сть активност1 цитозольно1 /А/ та мембранозв'язано! /Б/ форми фосфол1пази С л1мфоцит1в аоф1в в1д концентрацП кальц1ю /рй 5,5/: I - л1мфодити са лезЬши, 2 - л1мфоцити тимусу.

.Актавн1сть, нмоль

XS-UT б1лка

101

Рйс.б. Активн1сть цитозольно1 форш фосфол1пази С л1мфоцит!в опромХнених щурХв: I - лХмфоцити тимусу, доза 0,5 Гр; Z - я1мфоцити тимусу, доза 1,0 Гр; 3 - л!мфоцити селе-з1нкк, доза 0,5Гр; 4 - л1мфоцнти селез!нки, доза 1,0 Гр.

Таблиця 1.

Активн1сть цитозольно'1 и мембранозв'зано! форм фосфол!пази С щур1в.в постпр'ом1невий перюд (М*т,п=5-8).

ТИП КЛ1ТИНИ,

АктивнЮть ФЛС (пмоль гШ -1Ф/ хв х мг. б!лка)

форма ФЛС,

доза

без добавок

екзогенного Са

що активусться м1л!молярною (0,5) концентрацию Са

опром1нення(Гр) 6

час п1сля опром1нення (г)

12

12

Л1мфоцита тимусу цитозольна контроль 0,5 1.0

мембраноэв'зана контроль 0.5 1.0 .

5247*461

6025*130 3821-243* 7551*279* 3038*439«

2557*112

3216*283 5219*471* 4868*373* 4758*274*

1246*459

1445*134 2299*351*

1256*192 1413*205

738*. 92

. 470* 42 974* 31

532* 89 1760*109*

Л1мфоциты селез1нки цитозольна.

контроль. 5960*381 .

0.5 ' 8470*401* 7521*739*

1.0 10585*885* 7872*635*

мембранозв'язана контроль 6345*426

0.5 - 7531*477 8937*671*

1,0

9192*842* 7812*848*

4619*491

3509*481 900*122* 1484*142* 1160*233*

5692*379

4581*632 285* 55* 3620*344* 3327*691*

6

* р<0,05

Перетворюван1 крив1 входу и1тки в координатах I/o в1д Р /А/.

TüBHicfb" фосфоМпази С л!мфоцит1в селез!нки значною м!рою зале-жить в1д концентрацИ кальц1ю , як.в1льного цитозольного, так 1 зв'язаного з мембракними пол1фосфо!нозитидами. Як показано в да-боратори ран!ше, в л1мфоцитах селезХнки. щур1в опром1нених в доз! 0.5 та .1,0 Гр- спостер1гаеться п1двищення внутр!шньокл!тинного кальц!ю (Ручко, 1991).

У той же час.. на зм!ну концентрацИ внутр1шньокл1тинного кальЩю щдяхом його мобШзацИ 1з внутр!шньокл!тинних депо, а також з:.Лну пронтшост! кл!тинких мембран для 1она може впливати продут д1яльност! фосфол1пази С - 1нозитолтрифосфат (Chow. 1990; Putney. 1990).

Зручним методом для зизначення проникност1 мембран для кальщю 8 вивчення входу 45-Са в кл1тини. В тимоцитах опром!нених тварин не спостер!галося зм1ни входу 45-Са у пор1внянн! з контролем (рис.7.). В лЗДюцитах селез1шш'щур1в через 12 г п!сля еп-ром1нення в доз1 0.5 Гр спостер!галося зкачне п!двищення початко-во1 шзидкост! надходження 45-Са. Зб!льшення концентрацИ внутр1шньокл1тинного кальц!ю в л!мфоцитах селез!нки щур!в у цей перЮд можна частково пояснити зб!льшенням прснккност! кл!тинних мембран для даного 1ону.

При опром!ненн! тварин в доз1 1.0 Гр р!вень максимального вмЗсту 45-Са пивищусться вже через 6 г п!сля впливу ! мае найб!льше значения через 12 г. Але при опром!ненн! в Щй доз! не було в!дм1чено суттевого зб!льшення початково!. швидкост! ' надходження 45-Са в л!мфоцити селез1нки через 12 г п1сля вшшву. Можли-во це пояснюеться поручениям у цей пер1од часу п!сля опром!нення ц1л!скост! клИинних мембран л!мфоцит!в селез1нки.

Таким чином, активац1я фосфол!пази С - л1мфоцит1в селез1нки передувала у. час1 п!двищенню концентрацИ внутр1шньокл!тинного кальщю 1 зм!н1' прокикност! для 1ону клИкнних мембран. Виходячи з того, що 1ФЗ впливас на зм1ну концентрацИ внутр!шньокл1тинного кальщю 1 е такоя показником активност! фосфол!пази с, що г!дрол!зуе ендогенний субстрат в кл!тин1 (Taylor. 1984), ми бив-, чшет утворення 1нозитолфосфат1в в л!мфо1дних кл!тинах щур1в за нормальних умов i при опром1ненн!.

Через 1 г п!сля опром!нення тварин в доз1 0.5 Гр в1дбу-вастьея незначне зб1льшення утвореняя 1ФЗ в: тимоцитах. яке нор-мал!зуеться через 3 години п!сля опром!нення. Максимальне

1нозитолфосфат1в в1д контролю

0,5 Гр

д,

1,0 Гр

Рлс. 8. Динам1ка утворення 1нозитолфосфгт1в в' л1кфоцитах

казусу /А/ I селеэГнки /Б/ щур1в опром1нених в доз1 0,5 та 1,0 Гр: Щ - 1нозкголтрифосфат, Щ - 1нозитолдифосфат, Js|j - 1ноэктолфосфат.

1нозйтолфосфати, % в!д контроля

ш

Кон А А 23187

ФГА А 23187

Рис. 9. Утворення 1нозитол$осфат1в в л1ифо1дних кл1тинах тимусу /А/ I селез1нки /Б/ щур1в при прз1нкубац11 клГгин з митогенами: Щ - Хнозитолтрифосфат, ||| - 1нозитолдифосфат, Щ - 1нозитолфосфат,.

зросташтя утворення 1ФЗ спостер1гаеться через 6 г п!сля впливу (рис. 8.).Через 12 г утворення 1ФЗ знижувалось, проте перевищува-ло контроль. Аналог1чн1 зм1ни в утворенн! 1ФЗ ми спостер1гали при оцром!ненн1 тварин у доз1 1.0 Гр. Р!вень • утвореного 1ФЗ був п1 движений протягом 3-6 г п1сля опром1нення 1 нормал1зувався через 12 г.

В л1мфоцитах еелез!нки Шдвищення утворення 1ФЗ спостер1гаеться через 2 г п1сля опромШення. Через 3. 6 г п!сля опрон1нення в доз! 0,5 Гр утворення 1ФЗ в1дпов1дав контролю, а через 12 г зменшене на 4055. Аналог1чн1 зм!ни в!дбуваються 1 в кл1тинах тварин. що опром1нен1 в доз! 1.0 Гр.Проте п1двищене утворення 1нозитолфосфат1в тривае довше {1-6 г) !б!льи яскраво ви-■ явлене.

-г ,18 -

Зм1ни вм1сту 1нозитолфосфат1в в л!мфовдтах тимусу 1 се-лез!нки корелюють з1 зм1нами активност1 фосфол1пази С в моделыЦй систем1 In vitro .

Таким чином. активац1я фосфолШази С л1мфоцит1в тимусу 1 се-лез1нки в початков1 строки п1сля опром1нення в доз1 0.5 1 1.0 Гр призводить до зб1льшення утворення вторинного месендаера 1нози-толтрифосфату .

В1дм1чено зб1льшення утворення 1нозитолфосфат1в 1 особливо 1нозитолтрифосфату в л1мфоцитах тимусу, пре1нкубованих з Кон А 1 л1мфоцитах селезДнки, пре1нкубованих з ЛПС (рис.9.). Це може св1дчити про.наявнЮть сп1льних механ1зм1в в реал1заци д11 м1то-: ген1в 1 променевого ураження в л1мфо!дних кл!тинах щур1в.

Таким чином, р1зн1 .компонента фосфо1нозитидно! .сигнально! системи виявляють ранню рад1очутлив1сть. причому;в б1льш!й Mlpl в л1мфоцитах селез1нки пор1вняно з л1мфоцитами тимусу. Зм1ни в фосфо1нозитидн1й сигнальн1й систем1 можуть бути 1н1ц1юючим фактором розвитку. променевого ураження. 1мунокомпетентних кл1тин.

ВЙСНОВКИ

1. Тотальне опром1газвання щур1в в доз! 1.0 Гр викликае змен-шення включения 32-Р в фосфолШди л1мфоцит1в тимусу 1. селез1нки через 6 1 12 г п1сля впливу. Опром1нення в доз!. 0.5 Гр не зм1нюе максимальне включения 32-Р в фосфолШди, проте викликае, перероз-под1л м1тки серед найвашшв1ших груп фосфол1п1д1в у аапрямку зб1льшення включения У Фракц1юФосфатидил1нозитол 1 фосфатидилсе-

рин. ' . : г -С'.-О":-.' ''v

2. При опром1ненн1 щур1в в доз 1 0.5 та 1.0 Гр зб1льшуеться включения 32-Р в фосфатидил1нозитол л1мфоцит1в селезтки. В л1мфоцитах тимусу через 6 г п1сля опром1иення тварин в доз1 0. 5 Гр спостер1гаеться зб1льшення включения 32-Р в фосфо1нозитиди 1 зниження вм1сту 32-Р у склад1 фосфатидил1нозитолб1фосфату при п!двищенн1 дози до 1 Гр. • . у.. . .. :

3. 80-8535 активное« ферменту присутня в цитозольн1й форм1. Для цитозольно1 форми фосфолШази С л1мФоцит1в .тимусу 1 селез1нки характерна наявн1сть широкого оптимума рН-залеадост1". 1 двох опти-муи1з Са-залежност1. -"у l-'.C.."'

4. Активнють фосфолШази с л1мфоцит1в селез1нки п1двищена напротяз! 3 год п1сля опром1нення, л1мфоцит1в тимусу -- на-протяз1

3-6 годин п1сдй Бнлнву. ГИдвищення активиост! фосфол1паэи С -зм1нюеться пригн!ченням актизност! 'через 12,24 г п1сля опроьпнен-ня. Зм1ни актиькост! фосфолшази С тимоцит!в мають ненш выявлений, характер пор!вкяно з ферментом л1мфоцит!в сслез1нки 1 залезать в1д дози опром1нения.

5. Показано, що через 6.12 г пХсля опром!нення в доз! 0,5 1 1,0 Гр активы 1сть фосфолшази С л!мфощт!в селез!яки 1 тлчусу при В1дсутност1 екзогеняогоч.кальфв п1двищена.' У цей час актавнЮть ферменту . що активувться 0,5 мМ СаСЦв л1мфоцитах селез1нки. пригн1чуеться. а в л1мфодатах. тимусу - п1двищуеться..

6. Показано, що опром1нення не призводить до зм!ни входу 45-Са в л1мфоцити тимусу . ' Через 12 г п1сля опром1нення тварин в доз! 0,5 Гр та через 6 г. - в доз! 1,0 Гр спостер!гаеться значне зростайня початково1 швидкост! надходження калъц!к> 1 його вм1сту в л!мфоцитах селез!нки . •

7. П1слп опрш!нення щур1в спостер1гаеться зб!льшення утво-рекня 1нозитолтрнфосфату з л1мфоцитах селез1нки через 1,3 г , в л!мФоцитах тимусу - через 3,6 г гЛсля зпливу.

8. Показано, що зм1ни. як! в!дбуваються в л1мфо1дних титанах при пре!нкубац!1 1х з Кон А, ЛПС викликають активац!в фосфолШази С ! зростання утворення !нозитолфосфат!в аналоПчно зм1нгм, що мають м1сце в кл1тинах в початков1 строки п!сля д!1 опром!нення.

9. Фосфо1лозитадна еигнальна система л1мфо1дних кл!тин щур1в виявляе ранни рад!очутлив1сть, прнчому в б!льш!й м1р! в л1мфоци-тах селез!нки пор1вняно з л1мфоцитами тимусу. Зм1ни в фосфо!нози-тидн1й сигнальн1й систем! л!мфо1дних кл!тин можуть бути !н!ц!юю~ чим фактором розвитку променевого урааення даного типу кл!тин.

- 2Q -

СПИСОК РОБ1Т, НАДРУКОВАНИХ ПО TEMI ДИСЕРТАЦИ

1. Сировець Т.О.. Пархомець Т.I., Кучеренко М.С. Власти-вост!,фосфол1пази С в л1мфоцитах селез1нки щур1в // Дой. АН Укра1ни.- 1992.-'Н 4.-С. 132-136.

2. Пархоыец Т. И., Сыровец Т. А.. Кучеренко Н. Е. Активность фосфолипазы С тимоцитов. в условиях во .здействия невысоких, доз рентгеновского облучения // Иммунный статус человека и радиация . Всес.' научн. конф./ Гомель, сент. 1991 г./: Сб. тез. -

М..1991.- С. 51. ' " ^ :

3. Сировець Т.О.. Пархомець ТЛ.." Кучеренко М.С. Власти-вост1 фосфол1пази С в 1мунокомпетентних кл1тинах щур1в у нору1 та в умовах д!1 невеликих доз 1он1зуючого оп-ром1нення // YI Укр. бЮх. з'1зд / Ки1в, трав. 1992 р. /: Сб. тез. - К.. 1992. - С. 178.

4.Сировець Т.о.. Пархомець ТЛ., Кучеренко М.С. Власти-вост! фосфол1пази С в тамоцитах щур1в.-"//■ В1сник Ки1вського ун1верситету. - 1992.- Ы 2.- С. 25-27.

Шдписано до друку 28.12.92. Формат 60x84 I/Ifi. Пап1р офсвткий. Офсёгний друк. Унлфук.арк. 1Л6. Тираж 120 приы. Зам. 108в

ВШ корпораиИ УкрНТ!» 2521?!, Ки!в, вул* Горького, 180.