ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке

Невзорова, Татьяна Александровна

Бесплатный автореферат и диссертация по биологии на тему
ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке
ВАК РФ 03.00.04, Биохимия

Автореферат диссертации по теме "ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке"

На правах рукописи

Невзорова Татьяна Александровна

ДНК-ГИДРОЛИЗУЮЩАЯ АКТИВНОСТЬ АНТИТЕЛ К ДНК ПРИ СИСТЕМНОЙ КРАСНОЙ ВОЛЧАНКЕ

03.00.04-биохимия

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Казань-2005

Работа выполнена на кафедре биохимии Казанского государственного университета им. В.И. Ульянова-Ленина

Научный руководитель:

доктор биологических наук, профессор Винтер Виктор Георгиевич

Официальные оппоненты:

Академик АН РТ,

доктор медицинских наук, профессор Зубаиров Дилявер Мирзаабдуллович

доктор биологических наук, Чернова Ольга Александровна

Ведущая организация:

Казанский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии

Защита состоится «_24_»_марта_2005 года в_13°°_часов на заседании

диссертационного совета Д 212.081.08 при Казанском государственном университете (420008, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, главное здание, ауд. 209)

С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке имени Н.И.Лобачевского при КГУ

Автореферат разослан февраля 2005 года

Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук

Аскарова А.Н.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. В исследованиях последнего двадцатилетия открыта новая функция антител (AT) - способность катализировать различные биохимические реакции, то есть выступать в роли биологических катализаторов (Tramontano et al., 1986; Pollack et al., 1986; Paul et al., 1989). По аналогии с энзимами такие AT были названы абзимы (от англ. antibody enzyme) или каталитические AT. Согласно сложившимся представлениям, наличие в крови абзимов является чётким признаком протекания в организме аутоиммунных процессов.

Системная красная волчанка (СКВ) - одно из наиболее тяжёлых аутоиммунных воспалительных заболеваний соединительной ткани неясной этиологии. Заболеваемость СКВ по различным данным варьирует от 1:10000 до 1:1000 населения (Bongu et al., 2002; Gill et al., 2003). Ежегодно регистрируют до 7 новых случаев СКВ на 100000 населения. В ряде исследований получены данные о существенном повышении уровня распространённости СКВ (более чем в 3 раза) за последние четыре десятилетия: заболеваемость СКВ в 1950-1979 гг. составляла 1.51 случая на 100000 населения, а в 1980-1992 гг. - 5.56 случая на 100000 населения (Scolding and Joseph, 2002).

В патогенезе СКВ важное место отводится иммунным механизмам, многие аспекты которых, несмотря на интенсивное изучение, остаются невыясненными и ряд вопросов, касающихся этиологии, патогенеза и лечения СКВ требуют изучения. Поэтому СКВ к настоящему времени уже является не только медицинской, но биологической и социальной проблемой.

Характерным признаком СКВ является высокий уровень содержания в сыворотках крови больных по сравнению с нормой AT к нативной ДНК (нДНК) класса IgG, и определение титра которых имеет важное прогностическое и диагностическое значение. Среди этих AT к нДНК были обнаружены AT, которые обладают ДНК-гидролизующей активностью (Shuster et al., 1992).

Изучению как ДНК-связывающих, так и ДНК-гидролизующих AT посвящено большое количество работ. Многими исследователями признаётся тот факт, что именно IgG-AT к нДНК ответственны за развитие заболевания, тогда как относительно роли ДНК-гидролизующих AT к ДНК однозначного ответа нет. Механизмы реализации патологических свойств ДНК-абзимов и их клиническое значение пока остаются невыясненными. До сих пор среди исследователей нет единого мнения о происхождении, свойствах, структуре, механизмах действия, биологической роли AT к нДНК при СКВ, в том числе обладающих нуклеазной активностью. Все полученные данные (иммунохимические, ферментативные свойства AT) говорят в пользу того, что популяция IgG-AT к нДНК гетерогенна, однако о составе этих фракций среди авторов также нет общего мнения.

электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем ДНК-субстрат), однако они позволяют определять только конечные продукты реакции гидролиза ДНК абзимами, но не промежуточные. Изобретение в 1986 г. атомно-силового микроскопа (АСМ) (Binnig et al., 1986) позволило биологам не только визуализировать отдельные макромолекулы, но и получить информацию о кинетике взаимодействия нескольких макромолекул, что, как правило, недоступно при других методах исследования.

Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилось изучение ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК при системной красной волчанке. Были поставлены следующие задачи:

• выделить из сыворотки крови больных системной красной волчанкой субфракции антител к нативной ДНК класса IgG;

• изучить физико-химические свойства и ДНКазную активность полученных препаратов субфракций антител к нативной ДНК;

• изучить взаимодействие ДНК-гидролизующих антител к нативной ДНК с ДНК методом атомно-силовой микроскопии.

Научная новизна. Установлено, что популяция антител к ДНК у больных с дебютом СКВ гетерогенна и состоит из четырёх субфракций IgG-антител к нативной ДНК, различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе и проявляющих различное сродство к аффинному сорбенту нДНК-целлюлозе. Показано, что ДНК-гидролизующие антитела к нативной ДНК являются металлозависимыми эндонук-леазами, вносят в ДНК преимущественно одноцепочечные разрывы и проявляют активность в широком диапазоне значений рН.

Установлено, что активные формы кислорода при СКВ активируют термолабильную ДНКазную активность сывороточных нуклеаз в отличие от термостабильной ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК, которая не изменяется или ингибируется под действием активных форм кислорода.

Методом атомно-силовой микроскопии получены трёхмерные изображения комплексов ДНК-ДНК-гидролизующее антитело к нативной ДНК с нанометровым разрешением и продемонстрировано, что для ДНКазной активности антител характерен непроцессивный механизм действия.

Установлено, что в активном антигенсвязывающем центре абзимы имеют два участка: первый - «якорная площадка», которая обуславливает специфичность взаимодействия антител с молекулой ДНК, и второй - активный центр, ответственный за проявление энзиматической активности.

Практическая значимость. Разработана методика фракционирования антител к нативной ДНК класса IgG из сыворотки крови больных СКВ, которая позволяет получать четыре субфракции антител к нативной ДНК, различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе, сродству к аффинному сорбенту нДНК-целлюлозе, и содержащих ДНК-гидролизующие антитела. Оптимизирован метод изучения ДНК-гидролизующей активности антител к нДНК на атомно-силовом микроскопе Solver Р47Н со сканирующей измерительной головкой типа «Смена-Б» («НТ-МТД», Россия). Полученные результаты могут служить теоретической и методической основой для исследований проблем ферментативной активности антител при аутоиммунных заболеваниях человека.

Апробация работы. Основные результаты исследований докладывались на IX

международной конференции молодых учёных «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» (Казань, 1998); V Международной конференции «Biochemistry of Health and Diseases» (Israel, 1998); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1998); Всероссийской научной конференции III Вавиловские чтения «Социум в преддверии XXI века: итоги пройденного пути, проблемы настоящего и контуры будущего» (Йошкар-Ола, 1999); XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт-Петербург, 1999); XII юбилейной всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); II Российской конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); III съезда биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003); VII Всероссийской молодёжной научной школы «Когерентная оптика и спектроскопия» (Казань, 2003); XXI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2004); VIII Международной молодёжной научной школы «Когерентная оптика и спектроскопия» (Казань, 2004), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета в 1997-2005 гг.

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 20 работ.

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения результатов работы, обсуждения результатов, выводов и списка литературы. Работа изложена на 170 страницах машинописного текста, содержит 4 таблицы и 35 рисунков. Список использованной литературы включает 259 наименований, из них 57 отечественных.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Объектом исследования явились AT к нДНК, выделенные из крови 7 первично выявленных больных СКВ, находящихся в острой фазе с различной степенью тяжести заболевания и на момент забора крови не получавших лечения преднизолоном (5 женщин в возрасте от 17 до 52 лет и 2 мужчин - 48 и 62 года). В качестве контроля использовали сыворотки крови клинически здоровых доноров.

Выделение из сыворотки крови субфракций AT к нДНК влючало в себя высаливание IgG сульфатом аммония, гель-фильтрацию на акрилексе Р-6, фракционирование AT методом ионообменной хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе и аффинную хроматографию на нДНК-целлюлозе микрокристаллической - аффинном сорбенте, который подобрали экспериментально и готовили по методу Litman (1968) с некоторыми модификациями. Все стадии очистки AT проводили при +4°С в холодильной камере MiniColdLab (LKB, Sweden) с использованием стерильных буферных растворов.

На колонку с нДНК-целлюлозой, промытой от несвязавшейся нДНК и уравновешенной 10-кратным объемом буфера Б (0.02 М трис-HCl, рН 7.5, 0.05 М NaCl, 0.002 М ЭДТА), наносили по отдельности фракции IgG-AT: несвязавшуюся с ДЭАЭ-целлюлозой (фракция I) и фракцию IgG, связавшуюся с сорбентом (фракция II). Белки, не взаимодействующие при посадке с сорбентом, отмывали буфером Б до полного исчезновения оптического поглощения при 280 и 260 нм. AT, связавшиеся с нДНК-целлюлозой, элюировали 1 М NaCl в буфере Б (субфракции 1а и Па), Gly-HCl (0.1 М глицин-HCl, рН 2.3) (субфракции 16 и 116) и посадочным буфером Б. Полу-

ченные Gly-HCl субфракции AT сразу же нейтрализовали 1 М трис-HCl, рН 8.0.

Все собранные субфракции AT концентрировали струёй воздуха, диализовали против 10 мМ трис-НС1-буфера, рН 7.5 в течение 48 ч при +4°С с периодической сменой буфера и спектрофотометрически рассчитывали концентрацию белка.

Гомогенность препаратов IgG на каждой стадии их очистки исследовали Ds-Na-ПААГ-электрофорезом с последующим окрашиванием белков AgNOj (Laemmli, 1970; Остерман, 1981). Значения pi препаратов IgG определяли изоэлектрофокуси-рованнем на приборе Multiphor (Остерман, 1983; Ригетти, 1986). Оценку уровня содержания и взаимодействия AT с нДНК изучали методом иммуноферментного анализа (ИФА) в модификации, предложенной Саттаровой и др. (1994).

Выделение и очистку плазмидной ДНК pBR-322 из клеток Е. coli HB-101 после амплификации осуществляли методом щелочной экстракции без ультрацентрифугирования. Плазмидную ДНК очищали от белков и РНК методом гель-фильтрации на колонке с сефарозой CL-4B (Маниатис и др., 1984; Кузнецова и Винтер, 1997).

ДНК-гидролизующую активность AT к ДНК оценивали по превращению су-перскрученной ДНК плазмиды pBR-322 в кольцевую и линейную формы.

Зависимость ДНК-гидролизующей активности AT от состава инкубационной среды изучали, варьируя рН реакционной смеси (от 5.0 до 9.8) и концентрации различных ионов двухвалентных металлов.

Гидролиз плазмидной ДНК pBR-322 и ДНК эритроцитов цыплёнка антителами к ДНК сывороток крови здоровых и больных СКВ людей, после обессоливания, ионообменной и аффинных хроматографии осуществляли в реакционной смеси, содержащей 25 мМ трис-НС1-буфер, рН 7.5,5 мМ MgCl2, (или 25 мМ трис-НС1-буфер, рН 7.5, 50 мМ NaCl, 5 мМ MgCl2,0.5 мМ ЭДТА) 20-75 мкг/мл плазмидной ДНК pBR-322 (содержащей 60-80% суперскрученной формы ДНК) или 20 мкг/мл ДНК эритроцитов цыплёнка. Реакцию начинали добавлением AT (в различных вариантах): а) до конечной концентрации белка 0.01-0.5 мг/мл, прогретого при +57°С в течение 45 минут или не подвергавшегося такому воздействию; б) 0.04-0.1 мг/мл AT к нДНК; в) двухэтапным внесением AT к нДНК через определённые временные интервалы, и г) одновременным внесением IgG-AT к нДНК с конечными концентрациями в смеси 0.08-0.15 мг/мл.

Во время инкубации при +37°С из реакционных смесей отбирали аликвоты по 10 мкл через фиксированные временные интервалы в течение 1-24 часов, которые моментально замораживали для предотвращения дальнейшего гидролиза.

Значения величин кинетических параметров реакции гидролиза плазмидной ДНК pBR-322 антителами к ДНК определяли графическими

методами (Варфоломеев и Гуревич, 1999; Келети, 1990) с использованием программы Prism 4. Начальные скорости гидролиза ДНК определяли методом электрофореза в агарозном геле. Для оценки приблизительной максимальной концентрации ДНК-абзимов в общем пуле препаратов субфракций AT к нДНК использовали кинетические методы, предложение Brocklehurst и др. (2001; Topham et al., 2000).

Оценку влияния активных форм кислорода (АФК) на ДНК-гидролизующую активность AT к ДНК проводили в реакционной смеси, содержащей: 25 мМ трис-НС1-буфер, рН 7.5, 5 мМ MgCl2, 20 мкг/мл плазмидной ДНК pBR-322. Реакцию начинали добавлением АФК (7.0 мкМ Н2О2, 0.4 мкМ аскорбата, 125 мкМ Fe(II), 2.5 мкМ ЭДТА - концентрации, подобранные экспериментально), 0.1 мг/мл препаратов AT к нДНК.

Во время инкубации при +37°С из реакционных смесей отбирали аликвоты по 10 мкл в определённые временные интервалы в течение 1-20 ч и добавляли перехватчик электронов - K3Fe(CN)6 до концентрации 0.5 мМ. Влияние АФК на взаимодействие AT с ДНК исследовали методом ИФА, где в качестве антигенов использовали: нДНК из эритроцитов цыплят, дДНК, полученную методом тепловой денатурации, и нДНК, модифицированную АФК (АФК-ДНК) (Cooke et al., 1997; Ashok and АИ, 1998). Препараты AT вносили в лунки планшета с адсорбированными ДНК и в одном из вариантов к нДНК одновременно с AT, вносили АФК. Планшет интенсивно встряхивали на качалке в течение 1-2 мин и далее реакцию ИФА проводили по схеме.

Оценку результатов гидролиза плазмидной ДНК pBR-322 осуществляли методами: электрофореза в 0.7% агарозном геле с окрашиванием ДНК этидий бромидом и получением денситограмм, используя программу Scion Image 4.0.2 (beta), флуоресцентной спектроскопией на спектрофотометре MPF-4 «Hitachi» и атомно-силовой микроскопией (АСМ). Гидролиз ДНК эритроцитов цыплёнка оценивали АСМ.

Атомно-силовая микроскопия (АСМ). После подбора и оптимизации методики приготовления образцов ДНК для АСМ процедуру приготовления исследуемых образцов проводили по следующей схеме. Перед сканированием на АСМ исследуемые пробы разводили 25 мМ трис-НС1-буфером, рН 7.5, 5 мМ MgCl2 до концентрации 0.125-1.0 мкг/мл ДНК эритроцитов цыплёнка, 2.5-5.0 мкг/мл плазмидной ДНК или 25 мкг/мл AT. 2 Мкл исследуемого образца наносили на свежесколотую.пластинку слюды (1x1 см), инкубировали 3-5 мин при комнатной температуре, промывали 1 мл бидистиллированной деионизованной стерильной воды и высушивали на воздухе, а далее над силикагелем.

Визуализацию ДНК и AT проводили в полуконтактном режиме на воздухе при комнатной температуре на АСМ Solver P47H со сканирующей измерительной головкой «Смена-Б» и использовали кремниевые кантилеверы NSG11 длиной 100 мкм, радиусом иглы около 10 нм, коэффициентом упругости 11.5 Н/м, резонансной частотой 190 и 255 kHz («НТ-МТД», Россия). Параллельно с измерением топографии поверхности (высоты) фиксировали изменения амплитуды колебаний кантилевера. Сканирование проводили с разрешением 512x512 точек и рабочей амплитудой колебаний кантилевера 9-23 нм, подобранной экспериментально.

Обработку АСМ-изображений и определение размеров сканированных объектов проводили с помощью программного обеспечения Nova RC 1.0.26.578 для зондовых микроскопов компании «НТ-МТД», Россия. Для подсчёта длины (нм) молекул ДНК использовали программу DNA Processing Application 2.6. Характер распределения данных в полученных выборках индивидуальных значений длины молекул ДНК анализировали с применением структурного среднего - медианы. Достоверность различий оценивали с использованием непараметрических ранговых критериев: Краскелла-Уоллиса, Т-критерий Манна-Уитни и Дана (Лакин, 1990; Акберова, 2004а; Акберова, 20046).

Объём каждой выборки (численность группы) более 100 молекул ДНК.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Выделение и характеристика субфракций антител к нативной ДНК, обладающих ДНК-гидролизующей активностью, из сывороток крови больных СКВ

Так как AT к нДНК являются одной из фракций IgQ то для получения образцов AT к нДНК на первых этапах уделяли основное внимание обнаружению и выделению

IgG, содержащих AT к нДНК с ДНК-гидролизующей активностью, из сывороток крови больных СКВ. Выделение и очистку IgG-AT к нДНК из сывороток крови проводили согласно схеме, представленной на рис. 1.

Как было установлено, при хроматографическом разделении белков сыворотки крови на ДЭАЭ-целлюлозе, 50-60% нанесённого белка не сорбируется, 30-50% фиксируется на колонке. Фракция белка, несорбируемая на ионообменнике, выходящая одним пиком, обозначена как фракция I. Применение градиента концентраций №0 позволило разделить белки, связавшиеся с анионообменником, на четыре пика. Белки, связавшиеся с анионообменником, были названы фракцией 11.

Рис. 1. Схема выделения AT к нДНК из сыворотки крови больных СКВ

Для анализа состава отдельных пиков обеих фракций с целью определения содержания в них максимального количества IgG-AT к нДНК с ДНК-гидролизующей активностью использовали препараты белков, соответствующие максимальному значению оптической плотности при длине волны 280 нм каждого пика.

Согласно данным электрофоретического анализа в ПААГе, обе фракции после хроматографии на ДЭАЭ-целлюлозе содержат IgG с молекулярной массой ~ 150 кДа. Пик фракции I - только IgG и не содержит примесей других сывороточных белков. Электрофоретическое разделение белков пиков фракции II приводит к окраске серебром нескольких белков, в том числе и IgG, концентрация которого по мере увеличения градиента №0 в элюирующем буфере уменьшается. Три первых пика фракции II содержат максимальное количество IgG

Методом ИФА нДНК-связывающие IgG-AT были обнаружены в обеих фракциях АТ, но уровень содержания AT к нДНК во фракции I выше, чем в пиках фракции II.

Для выяснения, обладают ли обнаруженные и полученные фракции АТ к нДНК ДНК-гидролизующей активностью, провели оценку способности IgG-AT пиков гид-ролизовать суперскрученную плазмидную ДНК рБК-322.

Известно, что в сыворотке крови человека содержатся собственные ДНКазы. Мы провели сравнительные исследования термостабильности ДНКаз сыворотки крови и нуклеазной активности антител. Прогревание сыворотки крови здоровых доноров при +57°С в течение 45 мин ведёт к полной инактивации сывороточных нуклеаз. ДНК-гидролизующая активность АТ к нДНК в сыворотке крови больных СКВ сохранялась высокой после предварительной температурной обработки сыворотки при +57°С в течение 45 мин.

На основании полученных данных при дальнейших исследованиях ДНКазной активности АТ к нДНК все препараты АТ, полученные на различных этапах выделения и фракционирования, предварительно прогревали 45 мин при +57°С.

Было обнаружено, что обе фракции после ионообменной хроматографии содержат ДНК-гидролизующие АТ, что сопровождается переходом суперскрученной ДНК рБК-322 в открытую кольцевую форму. Однако пики АТ фракции II имели более выраженную ДНКазную активность, чем пик фракции I.

Для дальнейшего выделения из обеих фракций IgG антител к нДНК пик фракции I объединяли в один первый препарат, а первые три пика фракции II, которые характеризуются максимальным содержанием IgG с ДНК-связывающей и ДНК-гидролизующей активностями, объединяли в суммарный второй препарат. Полученные препараты в дальнейшем названы как фракция I и фракция II соответственно.

По данным изоэлектрофокусирования IgG фракции I имеют р1 7.16-8.3, то есть обладают основными свойствами. Белки суммарной фракции II, которая обогащена IgG-AT к нДНК с ДНКазной активностью, фокусируются в областях до р1 7.0. Следовательно, объединённая фракция II содержит белки, проявляющие кислые свойства.

Таким образом, в результате фракционирования СКВ-АТ сывороток крови на ДЭАЭ-целлюлозе было получено две фракции IgG, содержащих ДНК-связывающие и термостабильные ДНК-гидролизующие АТ, отличающиеся по сорбции на анионооб-меннике и являющиеся основными (фракция I) и кислыми (фракция И) белками.

Заключительным этапом выделения и фракционирования АТ к нДНК по степени сродства к нативной ДНК является аффинная хроматография на нДНК-сорбенте. Перед нами стояла проблема выбора надёжного аффинного ДНК-сорбента, который позволил бы эффективно отделить IgG-AT, взаимодействующие с нДНК, от других АТ. Были опробованы методы ковалентной посадки нДНК на разные эпоксиактивированные матрицы: сефарозу и целлюлозу, и нековалентной посадки нДНК на целлюлозные матрицы (волокнистую и микрокристаллическую) по методу Литман с некоторыми модификациями. Полученные результаты показали, что нековалентный способ закрепления нДНК на матрице является наиболее эффективным, поскольку при этом методе посадки с носителем связывается большее количество ДНК (до 90%), чем при ковалентном связывании. В результате предварительных аффинных хроматографии АТ на приготовленных нековалентным способом закрепления ДНК на разных целлюлозных матрицах было установлено, что на нДНК-целлюлозе волокнистой

происходит сильное расширение хроматографических зон. Таким образом, был выбран аффинный сорбент нДНК-целлюлоза микрокристаллическая и в дальнейшем для окончательной очистки АТ к нДНК из обеих фракций ^О проводили аффинную хроматографию на нДНК-целлюлозе микрокристаллической.

Рис. 2. Профиль аффинной хроматографии АТ на нДНК-целлюлозе,

уравновешенной буфером с рН 7.5

а -АТк нДНК, элюированные с сорбента буферам, содержащим 1МИаС1, б-АТк »ДНК, элюиро-ванные с сорбента гтцш-НС1-буферам, рЙ2.3, с - белки, несвязавшиеся с нДНК-сорбентш

На рис. 2 приведён типичный профиль фракционирования ^О-АТ на нДНК-целлюлозе. Из таблицы 1 видно, что из фракции I с нДНК-целлюлозой связывается большее количество АТ, чем из фракции II, что может быть объяснено тем, что во фракции II кроме ^О содержатся и другие белки. Установлено, что количество субфракции АТ к нДНК, элюируемой 1М №С1, составляет наибольшую часть АТ во фракции I, тогда как во фракции II незначительно преобладает субфракция АТ, элюируемых буфером с рН 2.3.

Таблица 1. Количественное соотношение субфракций АТ (в %), полученных аффинной хроматографией фракций I и II сывороток крови больных СКВ на нДНК-целлюлозе

фракция, использованная для выделения АТ условия элюции АТ с нДНК-целлюлозы

посадка препарата буфере 1МЫаС1 ё1у-НС1,рН2.3

фракция I 57.0-74.0 7.5-21.0 3.0-12.0

фракция II 52.5-86.0 2.5-4.5 3.4-7.4

Электрофорез в ПААГе показал, что все полученные субфракции АТ к нДНК из фракции I - ^О с молекулярной массой 150 кДа. АТ к ДНК из фракции II, элюированные буфером с 1М №С1, содержат кроме ^О другие белки. Субфракция АТ к нДНК из фракции II, элюированных глицин-НС1-буфером, рН 2.3 -только ^О

Наиболее активно с нДНК в реакции ИФА взаимодействовали субфракции аффинных АТ, элюированные буфером с 1М №01. Активность реакции ИФА субфракций АТ к нДНК, элюированных глицин-НС1-буфером с рН 2.3, невысока, что, возможно, объясняется частичной потерей активности в данных условиях элюции. Аналогичная закономерность была отмечена и в работе Леках И.В. и др. (1991; Леках и Поверенный, 1996). ДНК-связывающая активность образцов субпопуляций АТ к нДНК, полученных из фракции I была выше, по сравнению с аналогичными образцами АТ к нДНК, полученных из фракции II.

Все полученные препараты субфракций АТ к нДНК обладали термостабильной ДНК-гидролизующей активностью. Полученные данные согласуются с литературными об элюции ДНК-связывающих и ДНК-гидролизующих АТ из сывороток больных аутоиммунными заболеваниями с нДНК-носителей буфером с высокой ионной силой (Леках и др., 1991; Гололобов и др., 1993; Оо1о1оЪоу е!. а1., 1995). Согласно литературным данным, при использовании буфера с сильно пониженным значением рН 2.0-2.5 с аффинных сорбентов полностью элюируется основной пул ДНК-гидролизующих АТ (Власов и др., 1998; Козырь, 1996).

Препараты АТ, полученные при посадке на нДНК-целлюлозу и не связавшиеся с нДНК-сорбентом из обеих фракций ^О, обладали только ДНК-связывающей активностью. Эти АТ характеризуются низкой аффинностью к нДНК, поэтому при проведении хроматографии не связываются с аффинным сорбентом.

Таким образом, оптимизированный нами метод выделения ^О-АТ к нДНК из сыворотки крови больных с дебютом СКВ, позволил получить препараты четырёх субфракций ^О-АТ к нДНК, проявляющих сродство к аффинному сорбенту нДНК-целлюлозе, обладающих ДНК-гидролизующей активностью, гетерогенных по заряду и различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе.

Несмотря на достаточно жёсткие условия выделения АТ к нДНК, мы учитывали потенциальную возможность совыделения незначительных количеств ферментов с исследуемыми АТ, поэтому все последующие исследования проводили после преин-кубации АТ при +57°С в течение 45 минут. Наше внимание привлёк тот факт, что некоторыми авторами обнаружено снижение активности ДНКазы I в сыворотке крови больных СКВ (№рие1 е! а1., 2000; Тйикито апё Уабийото, 2004). С другой стороны ДНКазная активность полученных препаратов ^О-АТ к нДНК сохранялась после всех стадий очистки. Если принять во внимание эти факты, то можно предположить, что полученные препараты АТ к нДНК свободны от сывороточных нуклеаз и ДНКазная активность АТ полностью определяется их собственной гидролитической функцией.

Исследование ДНК-гидролизующей активности антител к ДНК

При изучении ДНКазной активности полученных субфракций ^О-АТ к нДНК (влияние состава реакционной среды и условий инкубации) были выявлены некоторые отличия между АТ и от свойств сывороточных ДНКаз, описанных в литературе. Известно, что ДНКазы проявляют активность при рН 7.3-7.6 для ДНКазы I, а ДНКазы крови II - 5.2 (Шапот, 1968); ионы металлов по активирующему влиянию на активность ДНКазы I можно расположить в следующий ряд: Мп >Со >М§ (её. Вште11, 1993; Барановский и др., 2004).

АТ к нДНК полученных субфракций проявляли активность в широком диапазоне значений рН, то есть ДНК-гидролизующая активность АТ не зависит от рН инку-

бационной среды. Тем не менее, для АТ к нДНК субфракции 16 можно отметить увеличение ДНКазной активности при рН около 6.6 и 7.4, а АТ из фракции II при рН около 7.4 с незначительными максимумами активности в низкой и высокой области спектра рН. Полученные данные могут указывать на то, что субфракции АТ к нДНК, в свою очередь, гетерогенны и отличия могут быть связаны со строением антиген-связывающего центра АТ, а также ДНК-гидролизующие АТ к нДНК не только термостабильны, но и устойчивы к неспецифической денатурации при воздействии рН.

Все исследованные ионы металлов ускоряли АТ-зависимое расщепление ДНК, но в разной степени. Установлено, что ионы Mg2+ (и меньше Мп2+) активируют гидролиз плазмидной ДНК рБК-322 антителами, полученными из фракций I и II в концентрации 5 и 10 мМ соответственно. Однако увеличение концентрации ионов Mg2+ и Мп2+ до 10 мМ ингибирует активность АТ субфракции 16. Ионы 2п2+ и Са2+ слабо активируют гидролиз ДНК антителами. Увеличение концентрации Са2+ приводит к ингибированию реакции, катализируемой антителами из фракции I, однако ускоряют гидролиз ДНК антителами подфракции На аналогично ионам Мп2+. Возможно, что в ДНКазной активности ^О-АТ имеет место нуклеофильная атака гидроксил-ионом, активируемым ионами Mg2+. Однако максимальную активность в реакции гидролиза суперскрученной ДНК проявляли АТ к нДНК всех субфракций в присутствии ионов Со2+. Аналогичных результатов в литературе не описано, что, возможно, связано с отсутствием подобных исследований. Обнаруженный эффект косвенно указывает на то, что в ДНКазной активности ^О-АТ также может иметь место нуклеофильная атака гидроксил-ионом, только активируемым ионами Со2+.

В литературе накапливаются данные о повышенном содержании в различных органах и тканях у больных СКВ АФК, которые так же как и АТ к нДНК могут принимать участие в развитии патологического процесса (Атев е! а1., 1999; "№а2сгукош$ка е! а1., 1999; 8штогагтащ] е! а1., 2001). Поэтому мы провели оценку влияния АФК на активность АТ к нДНК и ДНКаз сывороток крови больных СКВ.

При исследовании влияния АФК (гидроксил-радикала, что было установлено экспериментально) на ДНКазную активность сывороток крови больных СКВ без температурной преинкубации, было установлено, что АФК активируют расщепление суперскрученной ДНК сывороточными ДНКазами (рис. 3). Однако, в зависимости от пациента, АФК или ингибировали, так как содержание суперскрученной ДНК было больше по сравнению с вариантом гидролиза ДНК антителами без АФК (рис. ЗА), или не влияли на активность АТ (рис. ЗБ), так как отличий от результатов ДНКазной активности АТ без добавления АФК не наблюдалось.

Из литературы известно, что в сыворотке крови больных СКВ снижена активность ДНКазы I, поэтому можно предположить, что АФК-зависимое повышение активности ДНКаз может выступать как компенсаторный механизм низкой активности сывороточных ДНКаз. ДНКазы в организме выполняют ряд функций, в том числе инициации апоптоза, поэтому наблюдаемый эффект влияния АФК может способствовать появлению большого количества апоптотических клеток. Так, показано, что у больных СКВ скорость апоптоза лимфоцитов, нейтрофилов, эндотелиальных клеток выше, чем у здоровых людей, и коррелирует с активностью заболевания и уровнем АТ к нДНК (Сошйпеу е! а1., 1999; 81е1апес, 2004). Локализованные на мембране апоп-тотических клеток нуклеосомы могут выступать в качестве аутоантигена, приводящего к гиперпродукции АТ к ДНК, которые могут обладать нуклеазной активностью.

О 5 10 15 20 0 5 10 15 20

Рис. 3. Влияние АФК на ДНКазную активность двух сывороток СКВ

1 - ДНКрВЯ-322, инкубированная с сывороткой СКВ, 2 -ДНК инкубированная с сывороткой СКВ и АФК 3 -ДНК, инкубированная с сывороткой СКВ прогретой при +5/С 45 мин, 4 -ДНК инкубированная с сывороткой СКВ, прогретой при +57С АФК 5 -ДНК инкубированная с АФК

Особое внимание обращает на себя обнаруженный нами факт, что АФК ингиби-ровали как связывание с нДНК в реакции ИФА, так и её гидролиз антителами к нДНК из фракции I (АТ с основными свойствами). Обнаружено, что при увеличении времени инкубации суперскрученной ДНК рБЯ-322 с АТ субфракции !а более 6 ч наблюдается уменьшение гидролиза суперскрученной формы ДНК приблизительно на 5%, по сравнению с вариантом, где АФК не были добавлены. При инкубации ДНК с АТ субфракции 16 уже через 3 часа заметно уменьшение активности АТ к нДНК и к окончанию инкубации (15 ч) разница в количестве кольцевой ДНК между вариантами с добавлением АФК и без составила приблизительно 10.5%. Однако в отличие от АТ из фракции I, АФК не влияли на катализ и взаимодействие АТ с нДНК из фракции II (АТ с кислыми свойствами) и, в некоторых случаях, в реакции ИФА даже отмечалось незначительное увеличение взаимодействия АТ с нДНК. Однако остаётся неясным механизм влияния АФК на взаимодействие и гидролиз ДНК антителами, так как подобных исследований в мире не проводилось. Выявленные нами эффекты, возможно, обусловлены тем, что АФК являются регуляторами активности антител, модифицируя белковую молекулу, или непосредственно вмешиваются во взаимодействие АТ с ДНК, но не влияют только на молекулу ДНК. Такое предположение подкрепляется тем, что уровень ответа АТ к нДНК обеих фракций при взаимодействии с АФК-модифицированной ДНК в реакции ИФА выше, чем с нДНК. Различный эффект влияния АФК на активность АТ, вероятно, обусловлен тем, что мы исследовали отдельные субфракции АТ к нДНК.

Для более полной характеристики ДНК-гидролизующей активности АТ к нДНК исследовали кинетически параметры гидролиза плазмидной ДНК рБЯ-322 антителами четырёх субфракций. У всех исследованных препаратов АТ величины Км изменялись в основном от 10"8 ДО 10"7 М, что на несколько порядков меньше величины Км для известных ДНКаз человека (Шапот, 1968), близко к значению для некоторых рестриктаз (например, ЕсоЫ, №г1 и др.) (её. Бште11, 1993) и к значению Км для

ДНК-абзимов, полученных другими авторами. Таким образом, сродство IgG-AT с ДНКазной активностью к ДНК очень высоко и характерно для взаимодействий «антиген-антитело». Тем не менее, AT из фракции I характеризуется большим значением К, чем AT из фракции II, и Км AT подфракции 1а выше, чем подфракции 16. Следует обратить внимание на то, что, несмотря на близкие значения Км, эти субпопуляции AT отличаются по способности их вытеснения с аффинной матрицы различными элюентами. Вероятно, эти субпопуляции AT к нДНК различаются силой электростатического и гидрофобного взаимодействий с нДНК-целлюлозой. Однако скорости гидролиза (Fmax-0.02-0.48 нМ/мин), константы с к о (igat «IQ:3 ни ш1) и эффективности гидролиза были на несколько порядков

меньше, чем ДНКазы, ЕсоЫ. и даже некоторых описанных абзимов к ДНК, но в то же время сопоставимыми с таковыми для некоторых из описанных ранее абзимов (Канышкова и др., 1997; Andrievskaya et al., 2002). Необходимо отметить определённую условность приведённых значений кса И кт/Км, поскольку в их определении использовали максимальное рассчитанное содержание ДНК-абзимов в полученных поликлональных препаратах AT к нДНК, которое составило приблизительно 1.7424.88%, так как в настоящее время не известен метод разделения ДНК-гидролизующих и ДНК-связывающих AT без каталитической активности. Вероятно, содержание каталитически активных IgG в полученных поликлональных препаратах AT к нДНК может быть значительно меньше. Таким образом, реальная эффективность гидролиза ДНК антителами может быть выше.

Таким образом, анализ литературных данных и полученных нами результатов свидетельствует о том, что реакцию гидролиза катализируют AT и в реакции расщепления ДНК AT разных субфракций больных СКВ существенно отличаются от ДНКаз человека.

При сравнении кинетики гидролиза суперскрученной ДНК антителами к нДНК разных субфракций выявлены некоторые сходства и различия между ними. Субфракции AT к нДНК характеризуются продолжительным временем реакции гидро-лизаДНК - 12-15 ч (рис. 4, внесение одной порции А Тодновременно). При дальнейшей инкубации достоверных количественных конформационных изменений ДНК не происходит. Исследуемые субфракции IgG-AT к ДНК не гидролизуют всю суперск-рученную ДНК даже при длительной инкубации AT с ДНК в течение 22 часов и более. Вероятно, AT к ДНК являются эндонуклеазами и проводят однонитевые разрывы в суперскрученных молекулах ДНК, переводя их в открытые кольцевые молекулы, которые устойчивы к дальнейшему действию AT, так как накопления линейных форм ДНК не происходит. Из литературы известно, что AT, как и ферменты, являются конформационно активными и их взаимодействие с ДНК протекает по механизму индуцированного соответствия (Miyazaki et al., 1997; Jang and Stollar, 2003). Возможными конформационными изменениями можно объяснить продолжительный период гидролиза суперскрученной молекулы ДНК плазмиды pBR-322 антителами к ДНК при СКВ.

Антитела субфракций !а и Па, полученные элюцией с нДНК-целлюлозы буфером с 1 М NaCl, гидролизуют суперскрученную ДНК более активно, чем AT субфракций 16 и Иб, которые были элюированы с аффинного сорбента глицин-HCl с рН 2.3, что приводит к накоплению в продуктах реакции кольцевой формы ДНК на 13-15% больше. При инкубации плазмидной ДНК с AT субфракций !а и 16 (рис. 4А, Б), внесёнными в два

Рис. 4. Кинетические кривые гидролиза плазмидной ДНК рБЯ-322 антителами к ДНК субфракций 1а (А), 16 (Б), На (В) и Пб (Г):

внесение одной порции АТ одновременно - (4, □) суперскрученнаяДНК, (3, О) кольцевая ДНК; поэтапное внесение двух порций АТ (стрелкой указано время повторного введения антител в инкубационную среду)— (6, ♦) суперскрученнаяДНК, (1, ■) кольцевая ДНК; внесение двух порций АТ одновременно — (5, *)суперскрученнаяД Н К(2кол ь ц е в аяДНК

раза большей концентрации (внесение двух порций AT одновременно), приводит к увеличению гидролиза молекул суперскрученной ДНК с переходом в кольцевую форму. Однако для АТ к нДНК субфракций На и Пб подобного эффекта не обнаружено (рис. 4В, Г).

Учитывая, что в проведённых исследованиях АТ к ДНК не гидролизуют всю су-перскрученную ДНК, провели повторное добавление в реакционную среду равной порции IgО-AT к нДНК через 15 ч инкубации (поэтапное внесение двух порций AT). Как видно из графиков, повторное внесение АТ в инкубационную среду приводит к дополнительному уменьшению количества суперскрученной ДНК и увеличению количества открытой кольцевой формы, и этот эффект сильнее даже при сравнении с результатами гидролиза ДНК антителами, внесёнными в инкубационную среду в начале эксперимента в той же суммарной концентрации (внесение двух порций Л Тодновремен-но). Однако, если для субфракций !а и К повторное внесение АТ приводит к полному гидролизу суперскрученной ДНК через 6 и 9 часов инкубации соответственно, то для АТ к нДНК субфракций На и П6 наблюдается увеличение гидролиза суперскрученной ДНК только на 4-10.5% через 1 час после добавления второй порции АТ и дальнейшая инкубация не приводит к изменениям в содержании конформаций плазмидной ДНК.

Обнаруженные эффекты необычной кинетики гидролиза ДНК антителами к нДНК при СКВ позволили предположить, что АТ с ДНКазной активностью обладают непроцессивным характером действия. Для визуального доказательства механизма действия ДНК-гидролизующих АТ к нДНК и оценки их влияния на молекулу ДНК различных видов и конформаций впервые применили новый метод - атомно-силовой микроскопии (АСМ).

Визуализация взаимодействия и активности антител к нДНК с ДНК методом атомно-силовой микроскопии

При исследовании взаимодействия препаратов ДНК-гидролизующих АТ к нДНК с ДНК эритроцитов цыплят было обнаружено, что с увеличением времени инкубации ДНК с антителами количество низкомолекулярных фрагментов ДНК увеличивается.

Распределения количества длины молекул ДНК проявляли выраженную асси-метрию (рис. 5), поэтому, для сравнения и характеристики полученных данных использовали непараметрические методы. Оценку среднего значения длины молекул ДНК проводили с использованием медианы, а для характеристики разброса данных использовали 25-й и 75-й перцентили, а также 5-й и 95-й перцентили. Вычисленные таким образом средние значения длины молекул ДНК двух контрольных препаратов ДНК без АТ, один из которых инкубировали при +37°С, другой - не подвергали такому воздействию, составили 724.5 нм и 706.6 нм соответственно и различий между двумя образцами ДНК нет

С увеличением времени инкубации ДНК эритроцитов цыплят с АТ к нДНК субфракций 1а и 1б (рис. 6А, Б) значительно увеличивается количество коротких фрагментов ДНК. Дтя образцов ДНК после инкубации в течение 9 ч и 24 ч с АТ к нДНК субфракций 1а и 16 среднее значение длины молекул достоверно (Р>0.95) уменьшается (509.6 нм до 273.3 нм и 566.3 нм до 238.7 нм для субфракций 1а и 1б соответственно).

Инкубация ДНК с АТ к нДНК подфракций Иа и Иб также приводит к накоплению низкомолекулярной ДНК, но более умеренному (рис. 6В, Г). Инкубация ДНК с

Рис. 5. Распределение по длине (нм) молекул ДНК контрольных образцов без АТ

Рис. 6. Зависимость длины молекул ДНК (нм), инкубированной при+37°С с АТ к нДНК субфракции 1а (А), 16 (Б), Па (В) И Пб (Г), от времени инкубации

AT субфракции На приводит к достоверному снижению (Р>0.95) среднего значения длины молекул ДНК, которые составили 649.8 нм и 469.7 нм на 9 ч и 24 ч инкубации соответственно. Однако для AT подфракции Иб достоверное понижение среднего значения длины молекул ДНК в течение инкубации (685.7 нм до 548.8 нм) было отмечено только при попарном сравнении выборок Т-критерием Манна-Уитни, тогда как другими критериями различий между ними обнаружено не было.

Типичные АСМ-изображения контрольных препаратов ДНК эритроцитов цыплят, плазмидной ДНК pBR-322 и выделенных AT к нДНК представлены на рис. 7А-В. Экспериментально определённая ширина на полувысоте АСМ-изображений ДНК варьирует в зависимости от зонда от 8.3 до 19.8 нм и имеет среднее значение приблизительно 12.6 нм, а высота 0.22-0.97 нм со средним значением 0.5 нм. Молекулы IgG-AT имеют шарообразную или овальную форму (которая, вероятно, зависит от посадки Y-образной молекулы на подложку) с диаметрами от 11.2 до 33 нм, и высотой от 0.4 до 1.4 нм со средним значением 0.8 нм. Однако, известно, что диаметр одиночной молекулы ДНК около 2 нм. Завышение латеральных размеров (ширины) полученных изображений макромолекул происходит из-за наложения формы зонда на изображение, а занижение вертикальных (высоты) - из-за деформации молекулы под действием зонда. Следует подчеркнуть, что эти артефакты являются типичными при АСМ-исследованиях макромолекул. Кроме того, значения высоты ДНК, сканируемой на воздухе из-за дегидратации, как правило, ниже, чем ДНК, сканируемой в жидкости (Moreno-Herrero et al., 2003).

После инкубации IgG-AT с ДНК эритроцитов цыплят было обнаружено, что антитела к нДНК локализовались на молекулах ДНК (рис. 7Г-Ж). В большинстве случаев после 9 ч инкубации AT к нДНК располагались в середине длинных молекул ДНК. Антитела также были визуализированы на концах коротких и средних по длине молекул, но такие молекулы ДНК встречались гораздо реже. После 24 ч инкубации при +37°С количество коротких молекул ДНК с антителами, локализованными на одном или обоих свободных концах ДНК было значительно больше. Антитела, связавшиеся с ДНК, были также визуализированы в центре и на концах средних по размеру и длинных молекулах ДНК. Место локализации AT на ДНК характеризуется большими, чем свободные молекулы ДНК и AT, значениями: диаметром 13.5-36.8 нм и высотой 0.27-1.93 нм.

При изучении влияния ДНК-гадролизующих AT на конформацию ДНК плаз-миды pBR-322 (рис. 73-К) было обнаружено, что через 9 ч инкубации увеличилось количество молекул кольцевой ДНК, связанных с одной или несколькими молекулами IgG-AT. Следует отметить, что было обнаружено несколько (около 5) молекул линейной ДНК с AT на одном конце. После 24 ч инкубации встречаемость суперскру-ченной ДНК значительно уменьшилась, сильно возросло количество кольцевой ДНК с локализованными несколькими AT, а также незначительно увеличилась встречаемость линейной ДНК, связанной с AT к нДНК.

Образование коротких фрагментов ДНК эритроцитов цыплят после инкубации с AT может быть связано с тем, что, возможно, исходный препарат ДНК содержал одно-цепочечные разрывы. С другой стороны, известно, что суперскрученные молекулы плазмидной ДНК содержат денатурированный участок, который исчезает при переходе в кольцевую форму.

Рис. 7. Исследование взаимодействия АТ к нДНК с ДНК

Контроль: А -ДНКэритроцитов цыплят, Б - плазмиднаяДНКрБК-322 после инкубации

при +37°СбезЛТ, В-ЛТк нДНК- серо-белая стрелка Опыт: Г - Ж - ДНК эритроцитов цыплят после инкубации с ЛТ к нДНК, 3 - К - плазмидная ДНКрБК-322 после инкубации с ЛТ к нДНК Белая стрелка - место локализации АТ на ДНК А - И - длина отрезка 200 им, К - длина отрезка 100 им

Таким образом, в результате проведённых исследований было обнаружено, что IgG-AT к нДНК с ДНК-гидролизующей активностью являются эндонуклеазами и имеют предпочтение к гидролизу денатурированной ДНК, тогда как связывание AT с ДНК происходит в двунитевых участках и место посадки AT на нДНК, вероятно, может зависеть от нуклеотидной последовательности. Кроме того, возможно, что полученные препараты AT содержат абзимы, осуществляющие расщепление обеих цепей ДНК, что приводит к появлению в продуктах реакции небольшого количества линейной формы плазмидной ДНК, которую методом электрофореза зарегистрировать не удалось.

Наибольшую активность проявляли препараты абзимов к ДНК из фракции I. Эти AT субфракции 1а и 1б имеют высокое значение изоэлектрической точки (pi 7.16-8.3) и, вероятно, за счёт электростатических сил могут взаимодействовать с ДНК. Вопрос о заряде патологических AT к нДНК остаётся спорным, тем не менее, в литературе сложилось общее мнение о том, что патологические IgG к нДНК являются положительно заряженными антителами.

Методом АСМ зарегистрировано образование стабильного иммунного комплекса AT-ДНК. Вероятно, при взаимодействии абзимов к ДНК с ДНК сначала происходит взаимодействие по механизмам, характерным для образования иммунных комплексов антиген-АТ, а в дальнейшем проявляются ферментативные свойства AT. Однако, в отличие от обычных ДНКаз, после акта гидролиза фосфодиэфирной связи не происходит освобождения AT от молекулы ДНК. Таким образом, установлен механизм действия абзимов к ДНК на нДНК и доказан непроцессивный характер действия AT.

Данные литературы свидетельствуют о том, что в большинстве случаев каталитически активные центры различных абзимов расположены в вариабельной части лёгких цепей Ig (Барановский и др., 1998; Andrievskaya et al., 2002; Дубровская и др., 2003). У многих AT, связывающихся с ДНК, способность взаимодействовать с ДНК присуща тяжёлой цепи (Vargas et al., 1997; Radic and Seal, 1997). Возможно, что в активном антигенсвязывающем центре абзимы имеют два центра: первый - «якорная площадка», которая обуславливает специфичность взаимодействия AT с молекулой нДНК, и второй - активный центр, ответственный за прояавление энзиматической активности.

Большинство авторов придерживаются мнения о том, что патологические IgG-AT к нДНК обладают широкой перекрёстной реактивностью. Однако в некоторых исследованиях было отмечено, что не всегда перекрёстно реагирующий антиген ин-гибирует связывание AT с ДНК (Sharraa et al., 2001; Caponi et al., 2002). Эти данные дают возможность предположить, что перекрёстное взаимодействие AT с разными антигенами может происходит в различных участках антигенсвязывающего центра. Именно наличием двух центров взаимодействия AT с ДНК, находящихся в различных участках молекулы IgG можно объяснить наблюдаемый нами непроцессивный характер действия AT к ДНК, когда после акта гидролиза фосфодиэфирной связи молекула AT остаётся связанной с нДНК.

Гетерогенность AT может быть связана с происхождением ДНК-абзимов: препараты могут содержать как абзимы антиидиотипической природы к активным центрам ферментам (нуклеаз, топоизомераз), так и ДНК-гидролизующие AT к нуклеиновым кислотам и их комплексам. Принимая во внимание полученные нами результаты и литературные данные можно высказать предположение о том, что разные

субпопуляции AT к нДНК с ДНК-гидролизующей активностью могут иметь разное происхождение и выполнять разные функции, которые могут зависеть от окружающих условий. Так как при СКВ снижена активность сывороточных ДНКаз, то вероятно некоторые из них могут выполнять компенсаторную функцию, взяв на себя роль нуклеаз. AT могут выполнять метаболическую и защитную функцию в организме при СКВ. Абзимы к ДНК могут участвовать в утилизации нуклеосомной ДНК апоптозных клеток после их поглощения макрофагами. Учитывая тот факт, что AT могут проникать в клетку и ядро, абзимы могут участвовать в процессах репликации, репарации и рекомбинации ДНК. Не исключено, что в отличие от обычных ферментов, природные IgG-абзимы могут быть антителами с уникальным гидролитическим центром.

ВЫВОДЫ

1. Из сыворотки крови больных СКВ выделены четыре субфракции IgG-антител к нативной ДНК, проявляющих различное сродство к аффинному сорбенту нДНК-целлюлозе, обладающих термостабильной ДНК-гидролизующей активностью, и различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе.

2. ДНК-гидролизующие антитела к нативной ДНК являются металлозависимыми эндонуклеазами, вносят в ДНК преимущественно одноцепочечные разрывы и проявляют активность в широком диапазоне значений рН. Определены константы ферментативной реакции антителами к нативной ДНК (Км 10-8-10-7 М), которые на несколько порядков меньше величины Км для известных ДНКаз человека.

3. Установлено, что при СКВ термолабильная ДНКазная активность сывороточных нуклеаз активируется активными формами кислорода в отличие от термостабильной ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК, которая не изменяется или ингибируется под действием активных форм кислорода.

4. Впервые методом атомно-силовой микроскопии получены трехмерные изображения комплексов ДНК-ДНК-гидролизующее антитело к нативной ДНК с нано-метровым разрешением и показано, что для ДНКазной активности антител к на-тивной ДНК характерен непроцессивный механизм действия, то есть после разрыва фосфодиэфирной связи антитело-фермент остается связанным с ДНК.

5. Установлено, что в активном антигенсвязывающем центре абзимы имеют два участка: первый - «якорная площадка», которая обуславливает специфичность взаимодействия антител с молекулой ДНК, и второй - активный центр, ответственный за проявление энзиматической активности.

СПИСОК ПУБЛИКАЦИЙ

1. Темников, Д.А. Фракционирование белков сыворотки крови методом ионообменной хроматографии / Д.А. Темников, Т.А. Невзорова, В.Г. Винтер // Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений: сб. тез. докл. / IX международная конф. молодых учёных. - Казань, 1998. -С. 72,269.

2. Temnikov, DA. Different fractions of anti-DNA antibodies can affect growth of cultured cells / DA. Temnikov, T.A Nevzorova, L.V. Nevzorova, Vinter V.G // abstracts / 5th IUBMB Conference on the Biochemistry of Health and Diseases. - Jerusalem (Israel), 1998. - P. 89.

3. Темников, ДА Влияние антител к ДНК на рост клеточной культуры in vitro / ДА Темников, ТА Невзорова, В.Г. Винтер // Сп. б. Цитология. - 1999. - Т.41. -№3/4.-С. 316-317.

4. Темников, Д.А. Характеристика антител к ДНК как маркеров аутоиммунного процесса / Д.А. Темников, Т.А. Невзорова, В.Г. Винтер // Социум в преддверии XXI века: итоги пройденного пути, проблемы настоящего и контуры будущего: сб. материалов / Всероссийская междисциплинарная науч. конф. III Вавиловские чтения. - Йошкар-Ола, 1999. - 4.2. - С.8-11.

5. Невзорова, Т.А. Выделение аутоантител к ядерной ДНК из сыворотки крови больных системной красной волчанкой и исследование характера действия этих аутоантител на ДНК / ТА Невзорова, Д.А. Темников, В.Г. Винтер // Сп. б. Цитология. - 2000. - Т.42. - №3. - С. 299.

6. Невзорова, Т.А. Аутоантитела к ДНК при системной красной волчанке (Обзор) / Т.А. Невзорова, В.Г. Винтер; Казан, ун-т. - Казань, 2000. - 28 с. - Деп. в ВИНИТИ 13.10.00, №2628-В00.

7. Невзорова, Т.А. Каталитические антитела. Нуклеазная активность антител / Т.А. Невзорова, В.Г. Винтер; Казан, ун-т. - Казань, 2000. - 16 с. - Деп. в ВИНИТИ 13.10.00; №2627-В00.

8. Невзорова, Т.А. Нуклеазная активность антител при системной красной волчанке / ТА Невзорова, В.Г. Винтер // Ферменты микроорганизмов: сб. докл. / XII юбилейная всероссийская конф. - Казань, 2001. - С.79-80.

9. Невзорова, Т.А. Особенности дезоксирибонуклеазной активности антител к ДНК при системной красной волчанке / Т.А. Невзорова, Д.А. Темников, В.Г. Винтер // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: сб. материалов / II Российская конф. молодых учёных России с международным участием. - Москва,

2001.-Т. 1-С.187-188.

10.Темников, Д.А. Аутоантитела к ДНК теряют способность гидролизовать ДНК под действием преднизолона / Д.А. Темников, В.Г. Винтер, М.М. Куренёва, Д.И. Тем-никова, Т.А. Невзорова // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: сб. материалов / II Российская конф. молодых учёных России с международным участием. - Москва, 2001. - Т. 2 - С. 163-164.

11.Невзорова, Т.А. Некоторые особенности абзимов к ДНК при системной красной волчанке / ТА Невзорова, Д.А. Темников, В.Г. Винтер; Казан, ун-т. - Казань,

2002. -19 с Деп. в ВИНИТИ 05.03.02; № 425-В2002.

12.Темников, ДА Антитела к ДНК сохраняют способность гидролизовать ДНК после инкубации при повышенной температуре / Д.А. Темников, Т.А. Невзорова, В.Г. Винтер; Казан, ун-т. - Казань, 2002. -12 с. - Деп. в ВИНИТИ 05.03.02; № 424-В2002.

13.Невзорова, Т.А. Гетерогенность аутоантител к ДНК с ДНК-гидролизующей активностью у больных системной красной волчанкой / Т.А. Невзорова, Ю.С. Кулагина, В.Г. Винтер // сб. тез. науч. докл. / III съезд биохимического общества. - Санкт-Петербург, 2002. - С.598.

14.Темников, ДА Пролиферация культивируемых клеток почки под действием аутоантител к ДНК / Д.А. Темников, Т.А. Невзорова, В.Г. Винтер // Клеточные культуры. - 2003. - №18. - С. 14-21.

15.Невзорова, ТА Влияние активных форм кислорода на ДНК-гидролизующую

активность сывороток крови при системной красной волчанке / ТА. Невзорова, В.Г. Винтер // Новая Геометрия Природы: сб. науч. тр. / Международная науч. конф. - Казань. - 2003. - Т.2. - С. 257-260.

16.Невзорова, Т.А. Выделение и фракционирование аутоантител к ДНК при системной красной волчанке / ТА Невзорова, Ю.С. Кулапина, В.Г. Винтер // Новая Геометрия Природы: сб. науч. тр. / Международная науч. конф. - Казань. - 2003. -Т.2.-С. 422-427.

17.Невзорова, ТА. Особенности ДНК-гидролизующей активности антител при системной красной волчанке / ТА Невзорова, Д.А. Темников, В.Г. Винтер // Биохимия. - 2003. - Т.68. - №12. - С. 1616 -1623.

18.Коновалова, ОА. Атомно-силовая микроскопия для визуализации ДНК в биохимических исследованиях / ОА Коновалова, ТА Невзорова, М.Х. Салахов, В.Г. Винтер // Когерентная оптика и спектроскопия: сб. науч. ст. / VII Всероссийская молодёжная научная школа. - Казань. - 2003. - С. 312-318.

19.Невзорова, ТА Оптимизация режимов сканирования молекул ДНК методом атомно-силовой микроскопии / Т.А. Невзорова, О.А. Коновалова, В.Г. Винтер, М.Х. Салахов // Структура и динамика молекулярных систем: сб. тез. докл. / XXI Всероссийская конф. -Яльчик, 2004. - С. 187.

20.Коновалова, ОА. Сканирование молекул ДНК полуконтактным методом атомно-силовой микроскопии / О.А. Коновалова, Т.А. Невзорова, В.Г. Винтер, М.Х. Са-лахов // Когерентная оптика и спектроскопия: сб. науч. тр. / VIII Международная молодёжная науч. школа. - Казань. - 2004. - С. 89-94.

Отпечатано в 000«Печатный двор» г. Казань,ул. Журналистов, 1/16, оф. 207 Тел.72-74-59,41-76-41,41- 76-51. ЛицензияПД№7-0215от 01.11.01 ВыданаПоволжскиммежрегиональным территориальнымуправлением МПТРРФ. 4

Подписано впечать21.02.2005г. Усл.п.л1,0. ^

Г• Г ; » г*

Заказ№К-2626. Тираж 100экз. Формат 60x841/16

I I н м

X ?: у/

Бумага офсетная. Печать-ризография [ 4 1 Т

I 13 ь

I \

2 2МАР2С'35"....." 355

Содержание диссертации, кандидата биологических наук, Невзорова, Татьяна Александровна

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Системная красная волчанка.

1.2. Аутоантитела к ДНК.

1.2.1. Обнаружение аутоантител к ДНК.

1.2.2. Биологическая роль аутоантител к ДНК в норме и патогенезе СКВ.

1.2.3. Получение препаратов аутоантител к ДНК.

1.2.4. Иммунохимические свойства патологических аутоантител к ДНК.

1.2.5. Структура патологических аутоантител к нДНК.

1.2.6. Взаимодействие аутоантител с ДНК.

1.3. Каталитические антитела.

1.3.1. Открытие новых функций антител.

1.3.2. Механизмы каталитического действия антител.

1.3.3. Причины возникновения природных аутоантител с нуклеазной активностью.

1.3.4. Биологическая роль природных абзимов.

1.3.5. Получение препаратов природных каталитических антител с нуклеазной активностью.

1.3.6. Нуклеазная активность природных каталитических антител.

1.4. Атомно-силовая микроскопия.

Введение Диссертация по биологии, на тему "ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке"

Актуальность проблемы

Одним из направлений современной иммунологии является учение об аутоиммунизации, то есть иммунных процессах, обусловленных антигенами собственных тканей (аутоантигенами), сопровождающихся появлением аутоантител (ААТ) или/и аутореактивных лимфоцитов (Christen and von Herrath, 2004). Аутоантитела - Ig, которые взаимодействуют, хотя бы с одним аутоантигеном как в норме, так и при патологии (Lacroix-Desmazes et al., 1998). Один из путей, приведших к возникновению и развитию такого учения, - изучение аутоиммунных заболеваний, при которых иммунная система атакует нормальные, здоровые ткани собственного организма, то есть организм утрачивает толерантность к собственным тканевым антигенам. Общим признаком большинства аутоиммунных заболеваний является В-клеточная активация, приводящая к гиперглобулинемии и избыточному образованию ААТ с разной специфичностью. На сегодняшний день идентифицировано большое количество индивидуальных аутоантигенов, к которым чаще всего обнаруживаются ААТ: белки цитоскелета и другие внутриклеточные компоненты, ДНК, РНК и нуклеопротеины, фосфолипиды, различные ферменты, гормоны, рецепторы различных клеток и т.д. (Сидорик, 1992; Dighiero and Rose, 1999). Большинство исследователей признают в основном агрессивную роль ААТ. Поэтому выявляемые ААТ могут быть показателем иммунологической перестройки и при определённых условиях могут реализовать свои патогенетические возможности.

В исследованиях' последнего двадцатилетия открыта новая функция антител (AT) - способность катализировать различные биохимические реакции, то есть выступать в роли биологических катализаторов (Tramontano et al., 1986; Pollack et al., 1986; Paul et al., 1989). По аналогии с энзимами (англ. enzyme) такие AT были названы абзимы (от англ. antibody enzyme) или каталитические AT. Согласно сложившимся представлениям, наличие в крови абзимов является чётким признаком протекания в организме аутоиммунных процессов.

При СКВ наблюдают разноплановые В-клеточные нарушения, обуславливающие гиперактивность В-лимфоцитов, что является одной из характерных особенностей заболевания (Liossis and Zouali, 2004). Эти лимфоциты продуцируют ААТ с широким спектром специфичностей. Характерным признаком СКВ является высокий уровень содержания в сыворотках крови больных по сравнению с нормой AT к нативной ДНК (нДНК) класса IgG, и определение титра которых имеет важное прогностическое и диагностическое значение. Среди этих AT к нДНК были обнаружены AT, которые обладают ДНК-гидролизующей активностью (Shuster et al., 1992).

Изучению как ДНК-связывающих, так и ДНК-гидролизующих AT посвящено большое количество работ. Многими исследователями признаётся тот факт, что именно IgG-AT к нДНК ответственны за развитие заболевания, тогда как относительно роли ДНК-гидролизующих AT к ДНК однозначного ответа нет. Механизмы реализации патологических свойств ДНК-абзимов и их клиническое значение пока остаются невыясненными. Нельзя исключать того, что при одних заболеваниях КАТ могут играть положительную роль, а при других - отрицательную. Также до сих пор среди исследователей нет единого мнения о происхождении, свойствах, структуре, механизмах действия, биологической роли AT к нДНК при СКВ, в том числе обладающих нуклеазной активностью. Все полученные данные (иммунохимические, ферментативные свойства AT) говорят в пользу того, что популяция IgG-AT к нДНК гетерогенна и с увеличением истории заболевания субпопуляционный состав этих AT может расширяться, однако о составе этих фракций среди авторов также нет общего мнения.

Одним из основных препятствий на пути к выяснению проблемы взаимосвязи каталитической активности AT к нДНК с патогенезом и клиническими проявлениями заболевания является отсутствие единого методического подхода к выделению и очистке разных субпопуляций AT к ДНК из сыворотки крови больных, а это, вероятно, и сказывается на противоречиях в характеристике и биологической роли ДНК-гидролизующих и ДНК-связывающих AT к нДНК при системной красной волчанке.

Кроме того, используемые в настоящее время методы изучения нуклеазной активности AT только косвенно указывают на возможные механизмы реализации их ферментативной активности и не позволяют наглядно обосновать полученные данные. Для изучения механизма действия ДНК-гидролизующих AT используются различные методы (электрофорез ДНК в агарозном геле, флуоресцентная спектроскопия, метод линейного дихроизма, электрофорез в полиакриламидном геле, содержащем ДНК-субстрат), однако они позволяют определять только конечные продукты реакции гидролиза ДНК абзимами, но не промежуточные. Изобретение в 1986 г. атомно-силового микроскопа (Binnig et al., 1986) позволило биологам не только визуализировать отдельные макромолекулы, но и получить информацию о кинетике взаимодействия нескольких макромолекул, что, как правило, недоступно при других методах исследования.

Цель и задачи исследования

Целью настоящей работы явилось изучение ДНК-гидролизующей активности антител к нативной ДНК при системной красной волчанке. Были поставлены следующие задачи:

• изучить взаимодействие ДНК-гидролизующих антител к нативной ДНК с ДНК методом атомно-силовой микроскопии.

Научная новизна

Установлено, что популяция антител к ДНК у больных с дебютом СКВ гетерогенна и состоит из четырёх субфракций IgG-антител к нативной ДНК, различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе и проявляющих различное сродство к аффинному сорбенту нДНК-целлюлозе. Показано, что ДНК-гидролизующие антитела к нативной ДНК являются металлозависимыми эндонуклеазами, вносят в ДНК преимущественно одноцепочечные разрывы и проявляют активность в широком диапазоне значений рН.

ДНКазной активности антител характерен непроцессивный механизм действия.

Установлено, что в активном антигенсвязывающем центре абзимы имеют два участка: первый - «якорная площадка», которая обуславливает специфичность взаимодействия антител с молекулой ДНК, и второй -активный центр, ответственный за проявление энзиматической активности.

Практическая значимость

Разработана методика фракционирования антител к нативной ДНК класса IgG из сыворотки крови больных СКВ, которая позволяет получать четыре субфракции антител к нативной ДНК, различающихся по сорбции на ДЭАЭ-целлюлозе, сродству к аффинному сорбенту нДНК-целлюлозе, и содержащих ДНК-гидролизующие антитела. Оптимизирован метод изучения ДНК-гидролизующей активности антител к нДНК на атомно-силовом микроскопе Solver Р47Н со сканирующей измерительной головкой типа «Смена-Б» (ЗАО «НТ-МТД», Россия). Полученные результаты могут служить теоретической и методической основой для исследований проблем ферментативной активности антител при аутоиммунных заболеваниях человека.

Апробация работы

Основные результаты исследований докладывались на IX международной конференции молодых учёных «Синтез, исследование свойств, модификация и переработка высокомолекулярных соединений» (Казань, 1998); V Международной конференции «Biochemistry of Health and Diseases» (Israel, 1998); Всероссийском симпозиуме «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 1998); Всероссийской научной конференции III Вавиловские чтения «Социум в преддверии XXI века: итоги пройденного пути, проблемы настоящего и контуры будущего» (Йошкар-Ола, 1999); XIII Всероссийском симпозиуме «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт

Петербург, 1999); XII юбилейной всероссийской конференции «Ферменты микроорганизмов» (Казань, 2001); II Российской конференции молодых учёных России с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2001); III съезда биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Международной научной конференции «Новая геометрия природы» (Казань, 2003); VII Всероссийской молодёжной научной школы «Когерентная оптика и спектроскопия» (Казань, 2003); XXI Всероссийской конференции «Структура и динамика молекулярных систем» (Яльчик, 2004); VIII Международной молодёжной научной школы «Когерентная оптика и спектроскопия» (Казань, 2004), а также на ежегодных итоговых научных конференциях Казанского государственного университета в 1997-2005 гг.

По материалам диссертации опубликовано 20 работ.

Заключение Диссертация по теме "Биохимия", Невзорова, Татьяна Александровна

ВЫВОДЫ

2. ДНК-гидролизующие антитела к нативной ДНК являются металлозависимыми эндонуклеазами, вносят в ДНК преимущественно одноцепочечные разрывы и проявляют активность в широком диапазоне значений рН. Определены константы ферментативной реакции Q антителами к нативной ДНК (Км 10" -10" М), которые на несколько порядков меньше величины Км для известных ДНКаз человека.

4. Впервые методом атомно-силовой микроскопии получены трехмерные изображения комплексов ДНК-ДНК-гидролизующее антитело к нативной ДНК с нанометровым разрешением и показано, что для ДНКазной активности антител к нативной ДНК характерен непроцессивный механизм действия, то есть после разрыва фосфодиэфирной связи антитело-фермент остается связанным с ДНК.

146

Библиография Диссертация по биологии, кандидата биологических наук, Невзорова, Татьяна Александровна, Казань

1. Акберова, Н.И. Сравнение данных. 1.. Непараметрические критерии значимости / Н.И. Акберова. - Казань: Издательство КГУ, 2004а. - 50 с.

2. Акберова, Н.И. Описательная статистика. Интервальные оценки / Н.И. Акберова. Казань: Издательство КГУ, 20046. - 40 с.

3. Андриевская, О.А. Иммуноглобулины класса М из сыворотки крови больных системной красной волчанкой эффективно расщепляют РНК / О.А. Андриевская, В.Н. Бунева, В.Г. Забара и др. // Молекуляр. биология. 1998. - Т.32. - №5. - С. 908-915.

4. Антитела. Методы / под ред. Д. Кэтти. М.: Мир, 1991. - 287 с.

5. Барановский, А.Г. Дезоксирибонуклеазы человека / А.Г. Барановский, В.Н. Бунева, Г.А. Невинский // Биохимия. 2004. - Т.69. - №6. - С. 725-742.

6. Барановский, А.Г. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из крови больных различными формами вирусного гепатита / А.Г. Барановский, В.Г. Матюшин, А.В. Власов и др. // Биохимия. 1997. - Т.62. - №12. - С. 1590-1599.

7. Барановский, А.Г. Поликлональные антитела из крови и спинномозговой жидкости больных рассеянным склерозом эффективно гидролизуют ДНК и РНК / А.Г. Барановский, Т.Г. Канышкова, А.С. Могельницкий и др. // Биохимия. 1998. - Т.63. - №11. - С. 1459-1469.

8. Бунева, В.Н. Взаимодействие каталитически активных антител с олиго-рибонуклеотидами / В.Н. Бунева, О.А. Андриевская, И.В. Романникова и др. // Молекуляр. биология. 1994. - Т.28. - №4. - С. 738-743.1. Щ 147

9. Бунева, В.Н. Динамика уровня нуклеазной активности антител крови женщины во время беременности и лактации / В.Н. Бунева, А.Н. Кудрявцева, А.В. Гальвита и др. // Биохимия. 2003. - Т.68. - №8. - С. 1088-1100.

10. Варфоломеев, С.Д. Биокинетика / С.Д. Варфоломеев, К.Г. Гуревич. М.: ФАИР-ПРЕСС, 1999. - 720 с.

11. Власов, А.В. Субстратная специфичность ДНК- и РНК-гидролизующих антител из крови больных полиартритом и аутоиммунным тиреоидитом / А.В. Власов, А.Г. Барановский, Т.Г. Канышкова и др. // Молекуляр. биология. 1998. - Т.32. - №3. - С. 559-569.

12. Воробьёва, С.И. Аутоиммунные реакции как показатель неблагоприятного воздействия промышленных ядов / С.И. Воробьёва // Журн. гигиены,Щэпидемиол. микробиол. иммунол. 1980. - №4. - С. 438-444.

13. Генералов, И.И. Комплексная оценка абзимной активности поликлональных IgG при аутоиммунных, вирусных и онкологических заболеваниях / И.И.Генералов // Иммунопатология, аллергология, инфекгология. 2000. - №3. - С. 7-12.

14. Генералов, И.И. Поликлональные каталитические антитела и их возможное биологическое значение / И.И. Генералов, Д.К. Новиков // Успехи соврем, биологии. 1998. - Т.118. -№.2. - С. 178-193.

15. Генералов, И.И. Усиление абзимной активности поликлональных IgGпри взаимодействии с катионами металлов / И.И. Генералов, Е.В. Сидор-ская, А.Г. Генералова и др. // Иммунопатология, аллергология, инфек-тология. 2000. - №1. - С. 40-43.

16. Гололобов, Г.В. Выделение и характеристика каталитических антител к ДНК при системной красной волчанке / Г.В. Гололобов, А.Э. Богомолова, Р.П. Ядав и др. // Биохимия. 1993. - Т.58. - №2. - С. 313-318.

17. Дубровская, В.В. ДНК-гидролизующие антитела из крови аутоиммунныхмышей MRL/MpJ-//?r / В.В. Дубровская, А.С. Андрюшкова, И.А. Кузнецова и др. //Биохимия. 2003. - Т.68. -№10. - С. 1323-1332.

18. Ермекова, В.М. Обнаружение в сыворотках интактных кроликов фракции IgG, взаимодействующей с хроматином / В.М. Ермекова, О.С. Мелконян, Л.Ф. Назарова и др. // Биохимия. 1981а. - Т.46. - №.5. - С. 890-896.

19. Ермекова, В.М. Получение и характеристика антител против хроматина и негистоновых белков тимоцитов крыс / В.М. Ермекова, О.С. Мелконян, Л.Ф. Назарова и др. // Биохимия. 19816. - Т.46. - №.6. - С. 1073-1079.

20. Канышкова, Т.Г. ДНК- и РНК-гидролизующие антитела из молока человека и их возможная биологическая роль / Т.Г. Канышкова, Д.В. Семёнов, А.В. Власов и др. //Молекуляр. биология. 1997. - Т.31. - №6. - С. 1082-1091.

21. Келети, Т. Основы ферментативной кинетики / Т.Келети. М: Мир, 1990. - 350 с.

22. Кит, Ю.Я. Существуют ли каталитически активные антитела у здоровых людей? (Протеинкиназная активность slgA антител из молока человека) / Ю.Я. Кит, Д.В. Семёнов, Г.А. Невинский // Молекуляр. биология. 1995. -Т.29. - №4. - С. 893-905.

23. Козырь, А.В. ДНК-гидролизующие антитела при лимфопролифератив-ных заболеваниях / А.В. Козырь, А.В. Колесников, Е.И. Яхнина и др. // Бюлл. эксп. биол. мед. 1996. - №2. - С. 204-206.

24. Кочетов, Г.А. Практическое руководство по энзимологии / Г.А. Кочетов. -М.: Высшая школа, 1971. 352 с.

25. Кузнецова, Н.Н. Методы генной инженерии / Н.Н. Кузнецова, В.Г. Винтер. -М.: Биоинформсервис, 1997. 180 с.

26. Лакин, Г.Ф. Биометрия / Г.Ф. Лакин. М.: Высшая школа, 1990. - 352 с.

27. Леках, И.В. Антитела к ДНК в препаратах иммуноглобулинов и сыворотках крови здоровых людей находятся в свободном и связанном состояниях / И.В. Леках, A.M. Поверенный // Молекуляр. биология. 1996. -Т.30. -№3. - С. 707-713.

28. Леках, И.В. Гетерогенность и авидность аутоантител, реагирующих с ДНК / И.В. Леках, Г.М. Ротг, A.M. Поверенный // Молекуляр. биология.1991. Т.25. -№5. - С. 1391-1399.

29. Малюченко, Н.В. Исследование структурных особенностей белков прерывисто-контактным методом атомно-силовой микроскопии / Н.В. Малюченко, А.Г. Тоневицкий, М.Н. Савватеев и др. // Биофизика. 2003. -Т.48. - №5. - С. 830-836.

30. Маниатис, Т. Молекулярное клонирование. Методы генетической инженерии / Т. Маниатис, Э. Фрич, Дж. Сэмбрук. -М.: Мир, 1984. 479 с.

31. Миронов, B.JI. Основы сканирующей зондовой микроскопии / ВЛ.Миронов. Нижний Новгород: РАН Институт физики микроструктур, 2004. - 114 с.

32. Невзорова, Т.А. Особенности ДНК-гидролизующей активности антител при системной красной волчанке / Т.А. Невзорова, Д.А. Темников, В.Г. Винтер // Биохимия. 2003. - Т.68. - №12. - С. 1616-1623.

33. Невинский, Г.А. Каталитически активные антитела (абзимы), индуцированные химически стабильными аналогами переходных состояний / Г.А. Невинский, Д.В. Семёнов, В.Н. Бунева // Биохимия. 2000а. - Т.65. -№11.-С. 1459-1472.

34. Невинский, Г.А. Природные каталитически активные антитела (абзимы) в норме и при патологии / Г.А. Невинский, Т.Г. Канышкова, В.Н. Бунева //Биохимия. -20006. Т.65. - №11. - С. 1473-1487.

35. Остерман, ДА Методы исследования белков и нуклеиновых кислот: электрофорез и ультрацентрифугирование / Л.А.Остерман. М.: Наука, 1981. - 286 с.

36. Остерман, Л.А. Исследование биологических макромолекул электрофокусированием, иммуноэлектрофорезом и радиоизотопными методами / Л.АОстерман. М.: Наука, 1983. - 304 с.

37. Остерман, Л.А. Хроматография белков и нуклеиновых кислот / Л.А.Остерман. М.: Наука, 1985. - 536 с.• 150

38. Подгородниченко, В.К. ДНК-связывающие белки сыворотки человека / В.К. Подгородниченко, A.M. Поверенный, Д.Б. Джумаев и др. // Вопросы мед. химии. 1982. - Т.28. - №5. - С. 63-67.

39. Практическая химия белка / отв. ред. А. Дарбре. М.: Мир, 1989. - 621 с.

40. Ригетти, П. Изоэлектрическое фокусирование. Теория, методы и применение / П. Ригетти. М.: Мир, 1986. - 398 с.

41. Ройт, А. Основы иммунологии / А. Ройт, Дж. Бростофф, Д. Мейл. М.: Мир, 2000. - 592 с.

42. Руководство по медицине. Диагностика и терапия: в 2 т. Т. 1. / отв. ред. Р. Беркоу. М.: Мир, 1997. - С. 895-897.

43. Сатгарова, Л.И. Оптимизация иммуноферментной тест системы для определения антител к ДНК / Л.И. Саттарова, Л.А. Гафиятуллина, Д.Г. Аг-лиуллина,В.Г. Винтер//Биотехнология.- 1994.-№11-12.-С. 38-41.

44. Семёнов, Д.В. Иммуноглобулины класса G молока человека гидролизу-ют нуклеотиды / Д.В. Семёнов, Т.Г. Канышкова, Ю.Я. Кит и др. // Биохимия. 1998. - Т.63. - №8. - С. 1097-1106.

45. Семёнов, М.В. Антигены ядра, выявляемые человеческими аутоантите-лами / М.В. Семёнов // Цитология. 1990. - Т.32. - №10. - С. 965-976.

46. Сидорик, Л.Л. Белковой синтез и аутоиммунитет / Л.Л. Сидорик // Биополимеры и клетка. 1992. - Т.8. - №4. - С. 3-19.

47. Сидорская, Е.В. Каталитическая активность препаратов иммуноглобулинов G при заболеваниях щитовидной железы / Е.В. Сидорская, И.И. Генералов, А.Н. Окороков // Иммунопатология, аллергология, инфектоло-гия. 2000. - №1. - С. 57-61.

48. Сулаева, Н.И. Иммуноглобулины приобретают способность взаимодействовать с ДНК после хроматографирования на QAE-сефадексе / Н.И. Сулаева,1. Щ 151

49. И.В. Леках, А.М. Поверенный // Биохимия. -1986. Т.51. - №4. - С. 574-578.

50. Терещенко, О.Д. ДНК-топоизомеразы эукариотов: свойства и возможные функции / О.Д. Терещенко, Н.В. Хайдарова // Успехи соврем, биологии. -1983. Т.96. - №1(4). - С. 28-45.

51. Шапот, B.C. Нуклеазы / B.C. Шапот. М.: Медицина, 1968. - 212 с.

52. Шустер, А.М. Антиидиотипические и природные каталитически активные антитела / A.M. Шустер, Г.В. Гололобов, О.А. Квашук, А.Г. Габибов // Молекуляр. биология. 1991. - Т.25. -№3. - С. 593-602.

53. Щуров, Д.В. Каталитические антитела / Д.В. Щуров // Молекуляр. биология. 1997.-Т.31. -№1. -С. 5-15.

54. Abedi-Valugerdi, М. Mercury-induced anti-nucleolar autoantibodies can transgress the membrane of living cells in vivo and in vitro / M. Abedi-Valugerdi, H. Hu, G. Moller//Int. Immunol. 1999. - V.ll. -№5. -P. 605-615.

55. Adib-Conquy, M. Effect of amino acid substitutions in the heavy chain CDR3 of an autoantibody on its reactivity / M. Adib-Conquy, M. Gilbert, S. Avrameas // Int. Immunol. 1998. - V.10. - №3. - P. 341-346.

56. Ahmad, J. Reactive oxygen species modified thymine and poly(dT) present unique epitope for human anti-DNA autoantibodies / J. Ahmad, B.T. Ashok, R. Ali // Immunol. Lett. 1997. - V.58. - P. 69-74.

57. Ahmad, J. Detection of oxidative DNA damage by a monoclonal antibody: role of lysyl residues in antigen binding / J. Ahmad, B.T. Ashok, R. Ali // Immunol. Lett. 1998. - V.62. - P. 87-92.

58. Ahsan, H. Oxygen free radicals and systemic autoimmunity / H. Ahsan, A. Ali, R. Ali // Clin. Exp. Immunol. 2003. - V. 131. - P. 398-404.

59. Alarcon-Segovia, D. Antibody to nuclear ribonucleo-protein penetrates live human mononuclear cells through Fc receptors / D. Alarcon-Segovia, A. Ruiz-Arguelles, E. Fishbein // Nature. 1978. - V.271. - №5640. - P. 67-69.

60. Ambroz, H.B. Role of iron ions in damage to DNA: influence of ionizing radiation, UV light and H202 / H.B. Ambroz, Т.К. Bradshaw, T.J. Kemp et al. //J. Photochem. Photobiol. A: Chemistry. 2001. - V.142. - P. 9-18.

61. Ames, P.R.J. Oxidative stress in systemic lupus erythematosus and allied conditions with vascular involvement / P.R.J. Ames, J. Alves, I. Muret et al. // Rheumatology. 1999. - V.38. - P. 529-534.

62. Andrews, B.S. Spontaneous murine lupus-like syndromes. Clinical and im-munopathological manifestations in several strains / B.S. Andrews, R.A. Eisenberg, A.N.Theofilopoulos etal. //J. Exp. Med.-1978.-V.148.-P. 1198-1215.

63. Andrievskaya, O.A. Catalytic diversity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgG antibodies from the sera of patients with lupus erythematosus / O.A. Andrievskaya, V.N. Buneva, A.G. Baranovskii et al. // Immunol. Lett.-2002.-V.81.-P. 191-198.

64. Andrievskaya, O.A. Catalytic heterogenity of polyclonal RNA-hydrolyzing IgM from sera of patients with lupus erythematosus / O.A.Andrievskaya, V.N.Buneva, V.A. Naumov, G.A. Nevinsky // Med. Sci. Monit. 2000. - V.6. - P. 460-470.

65. Arbuckle, M.R. Development of anti-dsDNA autoantibodies prior to clinical diagnosis of systemic lupus erythematosus / M.R. Arbuckle, J.A. James, K.F. Kohlhase et al. // Scand. J. Immunol. 2001. - V.54. - P. 211-219.

66. Ashok, B.T. Immunochemical detection of oxidative DNA damage in cancer and aging using anti-reactive oxygen species modified DNA monoclonal antibody / B.T. Ashok, J. Ahmad, R. Ali // Int. J. Biochem. Cell Biol. 1998. -V.30.-P. 1367-1377.

67. Avalle, B. Enzymes and abzymes relationships / B. Avalle, A. Friboulet, D. Thomas // J. Mol. Catal. B: Enzymatic. 2000. - V.10. - P. 39-45.

68. Baranovskii, A.G. Catalytic heterogeneity of polyclonal DNA-hydrolyzing antibodies from the sera of patients with multiple sclerosis / A.G. Baranovskii, N. A. Ershova, V.N. Buneva et al. // Immunol. Lett. 2001. - V.76. - P. 163-167.

69. Barbas, S.M. Human autoantibody recognition of DNA/ S.M. Barbas, H.J. Ditzel, EMSaloneh et al. //Proc. Natl. Acad. Sci. USA.-1995.-V.92.-№7.-P. 2529-2533.

70. Behrendt, M. The role of somatic mutation in determining the affinity of anti-DNA antibodies / M. Behrendt, L.J. Partridge, B. Griffiths et al. // Clin. Exp. Immunol.-2003.-V.131.-P. 182-189.

71. Binnig, G. Atomic force microscope / G. Binnig, C.F. Quate, Ch. Gerber // Phys. Rev. Lett. 1986. - V.56. - №9. - P. 930-933.

72. Bohm, I. LE cell phenomenon: nuclear IgG deposits inhibit enzymatic cleavage of the nucleus of damaged cells and support its phagocytic clearance by PMN /1. Bohm // Biomedicine & Pharmacotherapy. 2004. - V.58. - P. 196-201.

73. Bongu, A. Can morbidity and mortality of SLE be improved? / A. Bongu, E. Chang, R. Ramsey-Goldman // Best Pract. Res. Clin. Rheumatol. 2002. -V.16. -№2.-P. 313-332.

74. Brocklehurst, K. Kinetic and titration methods for determinatuin of active site contents of enzyme and catalytic antibody preparations / K. Brocklehurst, M. Resmini, C.M. Topham // Methods. 2001. - V.24. - P. 153-167.

75. Budhai, L. An in vitro assay for detection of glomerular binding IgG autoantibodies in patients with systemic lupus erythematosus / L. Budhai, K. Oh, A. Davidson //J. Clin. Invest. 1996. - V.98. - P. 1585-1593.

76. Cameron, J.S. Lupus nephritis / J.S. Cameron // J. Am. Soc. Nephrol. 1999. -V.10.-P. 413-424.

77. Caponi, L. Anti-ribosomal antibodies from lupus patients bind DNA / L. Ca-poni, D. Chimenti, R Pratesi, P. Migliorini // Clin. Exp. Immunol. 2002. -V.130.-P. 541-547.

78. Casperson, G.R Specificity of anti-DNA antibodies in SLE-I. Definition and gross specificity of antibody populations in human SLE plasma / G.R Casperson, E.W. Voss Jr. // Mol. Immunol. 1983a. - V.20. - №6. - P. 573-580.

79. Casperson, G.F. Specificity of anti-DNA antibodies in SLE-II. Relative contribution of backbone, secondary structure and nucleotide sequence to DNA binding / GF. Casperson, E.W. Voss Jr. // Mol. Immunol. 1983b. - V.20. - P. 581-588.

80. Ceppellini, R. A DNA-reacting factor in serum of a patient with lupus erythematosus diffuses / R. Ceppellini, E. Polli, F. Celada // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. - V.96. - P. 572-574.

81. Cerutti, M.L. Generation of sequence-specific, high affinity anti-DNA antibodies / M.L. Cerutti, J.M. Centeno, F.A. Goldbaum, G. de Prat-Gay // J. Biol. Chem. 2001. - V.16. - P. 12769-12773.

82. Chan, T.M. Identification of endothelial cell membrane proteins that bind anti-DNA antibodies from patients with systemic lupus erythematosus by direct or indirect mechanisms / T.M. Chan, I.K.P. Cheng // J. Autoimmun. -1997. V.10. - P.433-439.

83. Chen, Y. DNA binding by the VH domain of anti-Z-DNA antibody and its modulation by association of the VL domain / Y. Chen, B.D. Stollar // J. Immunol. 1999. - V.162. - P. 4663-4670.

84. Christen, U. Initiation of autoimmunity / U. Christen, M.G. von Herrath // Curr. Opin. Immunol. 2004. - V. 16. - P. 759-767.

85. Cidade, G.A.G. Atomic force microscopy as a tool for biomedical and bio-technological studies / G.A.G. Cidade, L.T. Costa, G. Weissmiiller et al. // Artificial Organs. 2003. - V.27. - P. 447-451.

86. Cooke, M.S. Immunogenicity of DNA damaged by reactive oxygen species -implications for anti-DNA antibodies in lupus /M.S. Cooke, N. Mistry, C. Wood et al. // Free Radic. Biol. Med. 1997. - V.22. - P. 151-159.

87. Copeland, R.A. ENZYMES: A practical introduction to structure, mechanism, and data analysis / R.A. Copeland. New York. NY Wiley-VCH, 2000. 397 P.

88. Cortes-Hernandez, J. Antihistone and anti-double-stranded deoxyribonucleic acid antibodies are associated with renal disease in systemic lupus erythematosus / J. Cortes-Hernandez, J. Ordi-Ros, M. Labrador et al. // Am. J. Med. -2004.-V.116.-P. 165-173.

89. Deocharan, B. a-Actinin is a cross-reactive renal target for pathogenic anti-DNA antibodies / B. Deocharan, X. Qing, J. Lichauco, C. Putterman // J. Immunol. 2002. - V.168. - P. 3072-3078.

90. Dighiero, G. Critical self-epitopes are key to the understanding of self-tolerance and autoimmunity / G. Dighiero, N.R. Rose // Immunol. Today. -1999. V.20. - №9. - P. 423-428.

91. Edberg, J.C. Quantitative aspects of lupus anti-DNA autoantibody specificity / J.C. Edberg, R.P. Taylor // J. Immunol. 1986. - V.136. - №12. - P. 4581-4587.

92. Ehrenstein, M.R. Antinuclear antibodies and lupus: causes and consequences / M.R. Ehrenstein // Rheumatology. 1999. - V.38. - P. 691-693.

93. Ehrenstein, M.R. Deficiency in serum immunoglobulin (Ig)M predisposes to development of IgG autoantibodies / M.R. Ehrenstein, H.T. Cook, M.S. Neu-berger // J. Exp. Med. 2000. - V.191. - №7. - P. 1253-1257.

94. Eivazova, E.R. Specificity and binding kinetics of murine lupus anti-DNA monoclonal antibodies implicate different stimuli for their production / E.R. Eivazova, J.M. McDonnell, B.J. Sutton, N.A. Staines // Immunology. 2000. -V.101.-P. 371-377.

95. Evans, M.D. Oxidative DNA damage and disease: induction, repair and significance / M.D. Evans, M. Dizdaroglu, M.S. Cooke // Mutat. Res. 2004. -V.567.-P. 1-61.

96. Foster, M.H. Molecular and structural analysis of nuclear localizing anti-DNA lupus antibodies / M.H. Foster, T. Kieber-Emmons, M. Ohliger, M.P. Madaio //Immunol. Res. 1994. -V. 13. - P. 186-206.

97. Fournel, S. Peptides as DNA mimics: cross-reactivity and mimicry in systemic autoimmune diseases / S. Fournel, S. Muller // CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 2002. - V.59. - P. 1280-1284.

98. Friboulet, A. A possible role of catalytic antibodies in metabolism / A. Fribou-let, B. Avalle, H. Debat, D. Thomas // Immunol. Today. 1999. - V.20. -№10.-P. 474-475.

99. Gadgil, H. Affinity purification of DNA-binding proteins / H. Gadgil, S.A. Oak, H.W. Jarrett // J. Biochem. Biophys. Methods. 2001. - V.49. - P. 607-624.

100. Gao, Y. Physical and biological studies on DNA/anti-DNA immune complex formed in vitro / Y. Gao, P. Wang, A. Tajima, M. Matsumura // Cytotechno-logy. 1997. - V.25. - P. 165-171.

101. Garcia, R. Dynamic atomic force microscopy methods / R. Garcia, R. Perez // Surface Science Reports. 2002. - V.47. - P. 197-301.

102. Garg, D.K. Reactive oxygen species modified polyguanylic acid: immuno-genicity and implications for systemic autoimmunity / D.K. Garg, R. Ali // J. Autoimmun. 1998. - V.ll. - P. 371-378.

103. Gaubitz, M. Immunoadsorption in systemic lupus erythematosus: different techniques and their current role in medical therapy / M. Gaubitz, K.M. Schneider // Therapeutic Apheresis and Dialysis. 2003. - V.7. - P. 183-188.

104. Gaynor, B. Peptide inhibition of glomerular deposition of an anti-DNA antibody / B. Gaynor, C. Putterman, P. Valadon et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. - V.94. - P. 1955-1960.

105. Gilbert, D. Do naturally occurring autoantibodies participate in the constitution of the pathological B-cell repertoire in systemic lupus erythematosus / D. Gilbert, F. Brard, F. Jovelin, F. Tron // J. Autoimmun. 1996. - V.9. - P. 247-257.

106. Gill, J.M. Diagnosis of systemic lupus erythematosus / J.M. Gill, A.M. Quisel, P.V. Rocca, D.T. Walters //Am. Fam. Physician. 2003. - V.68. - P. 2179-2186.

107. Gololobov, G.V. Cleavage of supercoiled plasmid DNA by autoantibody Fab fragment: application of the flow linear dichroism technique / G.V. Gololobov, E.A. Chernova, D.V. Schourov et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1995. -V.92.-P. 254-257.

108. Gololobov, G.V. DNA-protein complexes. Natural targets for DNA-hydrolyzing antibodies / G.V. Gololobov, S.Y. Mikhalap, A.V. Starov et al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 1994. - V.47. - P. 305-315.

109. Gololobov, G.V. DNA hydrolysis by monoclonal anti-ssDNA autoantibody BV 04-01: origins of catalytic activity / G.V. Gololobov, C.A. Rumbley, J.N. Rumbley et al. // Mol. Immunol. 1997. - V.34. - №15. - P. 1083-1093.

110. Hahn, B.H. Antibodies to DNA / B.H. Hahn // New Engl. J. Med. 1998. -V.338. -№7. -P. 1359-1368.

111. Hansma, H.G. Surface biology of DNA by atomic force microscopy / H.G. Hansma // Annu. Rev. Phys. Chem. 2001. - V.52. - P. 71-92.

112. Hatakeyama, A. Are the clonotypes of serum IgG anti-DNA antibodies associated with lupus nephritis in humans? / A. Hatakeyama, T. Sasaki, T. Muryoi et al. // J. Clin. Lab. Immunol. 1990. - V.31. - P. 93-97.

113. Hilvert, D. Critical analysis of antibody catalysis / D. Hilvert // Annu. Rev. Biochem. 2000. - V.69. - P. 751-793.• 158

114. Hochberg, M.C. Updating the American College of Rheumatology revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus / M.C. Hochberg // Arthritis Rheum. 1997. - V.40. - P. 1725.

115. Holborow, J. A serum factor in lupus erythematosus with affinity for tissue nuclei / J. Holborow, D.M. Weir, G.D. Johnson // BMJ. -1957. V.2. - P. 732-724.

116. Huck, S. Abnormal DNA methylation and deoxycytosine-deoxyguanine content in nucleosomes from lymphocytes undergoing apoptosis / Huck S., Deftveaud E., Namane A., Zouali M. // FASEB J. 1999. - V.13. - P. 1415-1422.

117. Huse, K. Purification of antibodies by affinity chromatography / K. Huse, H.-J. Bohme, G.H. Scholz // J. Biochem. Biophys. Methods.-2002.-V.51.-P. 217-231.

118. Jang, Y.J. Anti-DNA antibodies: aspects of structure and pathogenicity / Y.J. Jang, B.D. Stollar // CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 2003. - V.60. - P. 309-320.

119. Jenks, W.P. Catalysis in Chemistry and Enzymology / W.P. Jenks. New York: McGraw-Hill, 1969. - P. 288.

120. Jerne, N.K. Towards a network theory of the immune system / N.K. Jerne //

121. Ann. Immunol. (Paris). 1974. - V.125. - P. 373-389.

122. Kanyshkova, T.G. DNA-hydrolyzing activity of the light chain of IgG antibodies from milk of healthy human mothers / T.G. Kanyshkova, D.V. Se-menov, D.Yu. Khlimankov et al. // FEBS Lett. 1997. - V.416. - P. 23-26.

123. Kasjanov, A. Antibodies against ss-DNA in persons of various age / A. Kasja-nov, L. Cebecauer, V. Balaz // Mech. Ageing Dev. 1984. - V.28. - P. 289-295.

124. Keane, M.P. Pleuropulmonary manifestations of systemic lupus erythematosus / M.P. Keane, J.P. Lynch III // Thorax. 2000. - V.55. - P. 159-166.

125. Kohler, G. Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity / G. Kohler, C. Milstein // Nature. 1975. - V.256. - P. 495-497.

126. Koren, E. Murine and human antibodies to native DNA that cross-react with the A and D SnRNP polypeptides cause direct injury of cultured kidney cells / E. Koren, M. Koscec, M. Wolfson-Reichlin et al. // J. Immunol. 1995. -V.154.-P. 4857-4864.

127. Kozyr, A.V. A novel method for purification of catalytic antibodies toward DNA from sera of patients with lymphoproliferative diseases / A.V. Kozyr // Biochem. Mol. Biol. Int. 1996. - V.39. - №2. - P. 403-413.

128. Kozyr, A.V. Anti-DNA autoantibodies reveal toxicity to tumor cell lines / A.V. Kozyr, L.P. Sashchenko, A.V. Kolesnikov et al. // Immunol. Lett. 2002. -V.80.-P. 41-47.

129. Krishnan, M.R. Comparison of the frequencies of arginines in heavy chain CDR3 of antibodies expressed in the primary B-cell repertoires of autoimmune-prone and normal mice / M.R. Krishnan, T.N. Marion // Scand. J. Immunol. 1998. - V.48. - P. 223-232.

130. Kubota, T. DNA affinity column chromatography: application in the isolation of distinct antibody populations from SLE sera / T. Kubota, T. Akatsuka, Y. Kanai // Clin. Exp. Immunol. 1985. - V.62. - №2. - P. 321-328.

131. Kubota, T. Mechanisms of anti-DNA antibody production / T. Kubota // Mod. Rheumatol. 2002. - V. 12. - P. 300-304.

132. Kubota, T. Enhancement of oxidative cleavage of DNA by the binding sites of two anti-double-stranded DNA antibodies / T. Kubota, N. Watanabe, Y. Kanai, B.D. Stollar//J. Biol. Chem. 1996. - V.271. -№11. - P. 6555-6561.

133. Kumar, S. Molecular expression systems for anti-DNA antibodies 2 / S. Kumar, J.K. Kalsi, C.T. Ravirajan et al. // Lupus. - 2002. - V.l 1. - P. 833-842.

134. Lacroix-Desmazes, S. The prevalence of proteolytic antibodies against factor VIII in hemophilia A / S. Lacroix-Desmazes, J. Bayry, N. Misra et al. // New Engl. J. Med. 2002. - V.346. №9. - P. 662-667.

135. Lacroix-Desmazes, S. Self-reactive antibodies (natural autoantibodies) in healthy individuals / S. Lacroix-Desmazes, S.V. Kaveri, L. Mouthon et al. // J. Immunol. Methods. 1998. - V.216. - P. 117-137.

136. Lacroix-Desmazes, S. Stability of natural self-reactive antibody repertoires during aging / S. Lacroix-Desmazes, L. Mouthon, S.V. Kaveri et al. // J. Clin. Immunol. 1999. - V.19. - №1. - P. 26-34.

137. Laemmli, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4 / U.K. Laemmli // Nature. 1970. - V.227. - P. 680-685.

138. Lafer, E.M. Z-DNA-specific antibodies in human systemic lupus erythematosus / E.M. Lafer, R.P. Valle, A. Moller et al. // J. Clin. Invest. 1983. - V.71. -№2.-P. 314-321.

139. Lefkowith, J.B. Heterogeneity and clinical significance of glomerular-binding antibodies in systemic lupus erythematosus / J.B. Lefkowith, M. Kiehl, J. Rubenstein et al. // J. Clin. Invest. 1996. - V.98. - P. 1373-1380.

140. Limaye, N. Pathogenicity of anti-DNA/glomerular autoantibodies weighing the evidence / N. Limaye, C. Mohan // Drug Discovery Today: Disease Models. - 2004. - V.l. - №4. - P. 395-403.

141. Liossis, S.-N.C. В lymphocyte selection and survival in systemic lupus / S.-N.C. Liossis, M. Zouali // Int. Arch. Allergy Immunol. 2004. - V.133. - P. 72-83.

142. Litman, R.M. A deoxyribonucleic acid polymerase from Micrococcus luteus (Micrococcus lysodeikticus) isolated on deoxyribonucleic acid-cellulose / R.M. Litman // J. Biol. Chem. 1968. - V.243. - P. 6222-6233.

143. Lunec, J. 8-Hydroxydeoxyguanosine. A marker of oxidative DNA damage in systemic lupus erythematosus / J. Lunec, K. Herbert, S. Blount et al. // FEBS Lett. 1994. - V.348. - P. 131-138.

144. Madaio, M.P. Cellular penetration and nuclear localization of anti-DNA antibodies: mechanisms, consequences, implications and applications / M.P. Madaio, K. Yanase // J. Autoimmun. 1998. - V.l 1. - P. 535-538.

145. Madaio, M.P. Nuclear localization of antibodies. Novel insights into protein4 161translocation and cellular function / M.P. Madaio, K. Yanase, M.H. Foster et al. //Ann. N. Y. Acad. Sci. 1997. - V.815. - P. 263-266.

146. Mageed, R.A. Cross-reactivity and pathogenicity of anti-DNA autoantibodies in systemic lupus erythematosus / R.A. Mageed, D.J. Zack // Lupus. 2002. -V.ll.-P. 783-786.

147. Mannik, M. Immune complexes with cationic antibodies deposit in glomeruli more effectively than cationic antibodies alone / M. Mannik, V.J. Gauthier, S.A. Stapleton, L.Y. Agodoa // J. Immunol.- 1987.- V.138.- №12. P. 4209-4217.

148. Marchalonis, J.J. Natural recognition repertoire and the evolutionary emergence of the combinatorial immune system / J.J. Marchalonis, S. Kaveri, S. Lacroix-Desmazes, M.D. Kazatchkine // FASEB J. 2002. - V. 16. - P. 842-848.

149. Mason, L.J. A human anti-dsDNA monoclonal antibody caused hyaline thrombi formation in kidneys of "leaky" SCID mice / L.J. Mason, C.T. Ravi-rajan, D.S. Latchman, D.A. Isenberg // Clin. Exp. Immunol. 2001. - V.126. -P. 137-142.

150. Methods in molecular biology. Enzymes of molecular biology / Ed. M.M. Burrell. Totowa, New Jersey: Humana Press, 1993. - 356 p.

151. Mets, B. A catalytic antibody against cocaine prevents cocaine's reinforcing and toxic effects in rats / B. Mets, G. Winger, C. Cabrera et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998. - V.95.-P. 10176-10181.

152. Miyazaki, S. Is structural flexibility of antigen-binding loops involved in the affinity maturation of anti-DNA antibodies? / S. Miyazaki, J. Shimura, S. Hi-rose et al. // Int. Immunol. 1997. - V.9. - P. 771-777.

153. Mohan, C. Anti-subnucleosome reactivities in systemic lupus erythematosus (SLE) patients and their first-degree relatives / C. Mohan, F. Liu, C. Xie, R.C. Williams jr. // Clin. Exp. Immunol. 2001. - V.123. - P. 119-126.

154. Mohan, C. Genetic dissection of lupus pathogenesis: a recipe for nephrophilic autoantibodies / C. Mohan, L. Morel, P. Yang et al. // J. Clin. Invest. 1999. -V.103. -№12.-P. 1685-1695.

155. Мок, C.C. Pathogenesis of systemic lupus erythematosus / C.C. Мок, C.S.1621.u // J. Clin. Pathol. 2003. - V.56. - P. 481-490.

156. Moreno-Herrero, F. DNA height in scanning force microscopy / F. Moreno-Herrero, J. Colchero, A.M. Baro // Ultramicroscopy. 2003. - V.96. - P. 167-174.

157. Moscato, S. Endothelial cell binding by systemic lupus antibodies: functional properties and relationship with anti-DNA activity / S. Moscato, F. Pratesi, F. Bongiorni et al. // J. Autoimmun. 2002. - V. 18. - P. 231-238.

158. Moss, L.G. A simple, efficient method for coupling DNA to cellulose / L.G. Moss, J.P. Moore, L. Chan // J. Biol. Chem. 1981. - V.256. - P. 12655-12658.

159. Muller, D.J. Preparation techniques for the observation of native biological systems with the atomic force microscope / D.J. Muller, A. Engel, M. Amrein // Biosensors & Bioelectronics. 1997. - V. 12. - P. 867-877.

160. Napirei, M. Features of systemic lupus erythematosus in Dnasel-deficient mice / M. Napirei, H. Karsunky, B. Zevnik et al. // Nature Genetics. 2000.- V.25. №2. - P. 177-181.

161. Nevinsky, G.A. Human catalytic RNA- and DNA-hydrolyzing antibodies / G.A.Nevinsky, V.N.Buneva // J. Immunol. Methods.- 2002.- V.269.- P. 235-249.

162. Nevinsky, G.A. Catalytic antibodies in healthy humans and patients with autoimmune and viral diseases / G.A. Nevinsky, V.N. Buneva // J. Cell. Mol. Med.- 2003. V.7. - №3. - P. 265-276.

163. Nevinsky, G.A. Secretory immunoglobulin A from healthy human mothers' milk catalyzes nucleic acid hydrolysis / G.A. Nevinsky, T.G. Kanyshkova, D.V. Semenov et al. // Appl. Biochem. Biotechnol. 2000. - V.83. - P. 115-129.

164. Nezlin, R. A quantitative approach to the determination of antigen in immune complexes / R. Nezlin // J. Immunol. Methods. 2000. - V.237. - P. 1-17.

165. Nguyen, C. Susceptibility genes in the pathogenesis of murine lupus / C. Nguyen, N.Limaye, E.K.Wakeland // Arthritis Res 2002 - V.4.- P. S255-S263.

166. Nguyen, H.T.T. DNA-specific autoantibody cleaves DNA by hydrolysis of phosphodiester and glycosidic bond / H.T.T. Nguyen, Y.-J. Jang, S. Jeong, J. Yu // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. - V. 311. - P. 767-773.

167. Paul, S. Catalytic hydrolysis of vasoactive intestinal peptide by human autoantibody / S. Paul, D.J. Voile, C.M. Beach et al. // Science. 1989. -V.244.-P. 1158-1162.

168. Paul, S. Characterization of thyroglobulin-detected and polyreactive catalytic antibodies in autoimmune disease / S. Paul, L. Li, R. Kalaga et al. // J. Immunol. 1997. - V.l 59.-P. 1530-1536.

169. Pauling, L. Molecular architecture and biological reactions / L. Pauling // Chem. Eng. News. 1946. - V.24. - P. 1375-1377.

170. Pauling, L. Chemical achievement and hope for the future / L. Pauling // Am. Sci.-1948.-V.36.-P. 51-58.

171. Pisetsky, D.S. Specificity and immunochemical properties of antibodies to bacterial DNA/ D.S. Pisetsky // Methods. 1997. - V.ll. - P. 55-61.

172. Pisetsky, D.S. Antibody responses to DNA in normal immunity and aberrant immunity / D.S.Pisetsky // Clin. Diagn. Lab. Immunol. -1998.- V.5.-№1.-P. 1-6.

173. Pollack, S.J. Selective chemical catalysis by an antibody / S.J. Pollack, J.W. Jacobs, P.G. Schultz // Science. 1986. - V.234. - P. 1570-1573.

174. Ponomarenko, N.A. Catalytic antibodies in clinical and experimental pathology: human and mouse models / N.A. Ponomarenko, O.M. Durova, I.I. Vorobiev et al. // J. Immunol. Methods. 2002. - V.269. - №1-2. - P. 197-211.

175. Pope, L.H. Atomic force microscopy studies of intercalation-induced changes in plasmid DNA tertiary structure / L.H. Pope, M.C. Davies, C.A. Laughton et al. // J. Microscopy 2000. - V.l99. - P. 68-78.

176. Poverenny, A.M. Interactions of protein (antibodies) with the deoxyribonu164cleic acid molecule / A.M. Poverenny, A.S. Sainko, V.G. Kreier, V.A. Na-sonova I I Nature. 1966. - V.211. - №55. - P. 1297-1298.

177. Puccetti, A. Anti-DNA antibodies bind to DNase I / A. Puccetti, M.P. Madaio, G. Bellese, P. Migliorini // J. Exp. Med. 1995. - V.181. - P. 1797-1804.

178. Putterman, C. The double edged sword of the immune response. Mutational analysis of a murine anti-pneumococcal, anti-DNA antibody / C. Putterman, W. Limpanasithikul, M. Edelman, B. Diamond // J. Clin. Invest. 1996. -У.91. - №10. - P. 2251-2259.

179. Quan, C.P. Different dysregulations of the natural antibody repertoire in treated and untreated HIV-1 patients / C.P. Quan, S. Watanabe, P. Pamonsinla-patham, J-P. Bouvet // J. Autoimmun. 2001. - V. 17. - P. 81-87.

180. Radic, M.Z. Selection of recurrent V genes and somatic mutations in autoantibodies to DNA/ M.Z. Radic, S.N. Seal // Methods. 1997. - V. 11. - P. 20-26.

181. Rahman, A. Molecular expression systems for anti-DNA antibodies 1 / A. Rahman, J. Haley, D.S. Latchman // Lupus. - 2002a. - V.l 1 - P. 824-832.■

182. Rahman, A. Systematic analysis of sequences of anti-DNA antibodies relevance to theories of origin and pathogenicity / A. Rahman, I. Giles, J. Haley, D. Isenberg // Lupus. - 2002b. - V. 11. - P. 807-823.

183. Rahman, A. Anti-DNA antibodies overview of assays and clinical correlations/A. Rahman, F. Hiepe // Lupus. - 2002. - V.l 1. - P. 770-773.

184. Ravirajan, C.T. An analysis of clinical disease activity and nephritis-associated serum autoantibody profiles in patients with systemic lupus erythematosus: a cross-sectional study / C.T. Ravirajan, L. Rowse, J.R.

185. MacGowan, D.A. Isenberg // Rheumatology. 2001. - V.40. - P. 1405-1412.

186. Reichlin, M. Characterization of anti-dsDNA antibodies: cross-reaction with SnRNP polypeptides and cell-binding abilities / M. Reichlin, B. Hahn, E. Ko-ren // The Immunologist. 1995. - V.3. - №3. - P. 84-88.

187. Robbins, W.C. Complement fixation with cell nuclei and DNA in lupus erythematosus / W.C. Robbins, H.R. Holman, H. Deicher, H.G. Kunkel // Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1957. - V.96. - P. 575-579.1. Ъ 165

188. Rubin, R.L. Anti-DNA activity of IgG F(ab)'2 from normal human serum / R.L. Rubin, R.I. Carr//J. Immunol. 1979. - V.122. - P. 1604-1607.

189. Ruiz-Arguelles, A. Novel facts about an old marker: the LE cell / A. Ruiz-Arguelles, D. Alarcon-Segovia // Scand. J. Clin. Lab. Invest. 2001. - V.61. -P. 31-37.

190. Ruiz-Arguelles, A. Penetration of anti-DNA antibodies into immature live cells / A. Ruiz-Arguelles, B. Perez-Romano, L. Llorente et al. // J. Autoim-mun. 1998. - V. 11. - P. 547-556.

191. Sano, H. DNA isolated from DNA/anti-DNA antibody immune complexes in systemic lupus erythematosus is rich in guanine-cytosine content / H. Sano, C. Morimoto //J. Immunol. 1982. - V.128. - №3. - P. 1341-1345.

192. Sano, H. Binding properties of human anti-DNA antibodies to cloned human DNA fragments / H. Sano, O. Takai, N. Harata et al. // Scand. J. Immunol. -1989.-V.30.-№1.-P. 51-63.

193. Sashchenko, L.P. Caspase-dependent cytotoxicity of anti-DNA autoantibodies / L.P. Sashchenko, S.V. Khaidukov, A.V. Kozyr et al. // Doklady Biochem. Biophys. -2001. V.380. - P. 313-315.

194. Schmidt-Acevedo, S. 'LE cells' result from phagocytosis of apoptotic bodies induced by antinuclear antibodies / S. Schmidt-Acevedo, B. Perez-Romano, A. Ruiz-Arguelles // J. Autoimmun. 2000. - V. 15. - P. 15-20.

195. Scolding, N.J. The neuropathology and pathogenesis of systemic lupus erythematosus / N.J. Scolding, F.G. Joseph // Neuropathology & Applied Neurobiology. 2002. - V.28. - №3.-P. 173-189.

196. Seddiki, N. Calreticulin, a potential cell surface receptor involved in cell penetration of anti-DNA antibodies / N. Seddiki, F. Nato, P. Lafaye et al. // J. Immunol. 2001. - V.166. - P. 6423-6429.

197. Sedrak, P. Molecular signatures of anti-nuclear antibodies contribution of heavy chain framework residues / P. Sedrak, K. Hsu, C. Mohan // Mol. Immunol. - 2004. - V.40. - P. 491-499.

198. Sehgal, V. Naturally occurring anti-native DNA antibodies in SLE binding Zf 166

199. DNA / V. Sehgal, R. Ali // Indian J. Med. Res. 1990. - V.92. - P. 158-162.

200. Sharma, A. Crossreactivity of human anti-dsDNA antibodies to phosphoryl-choline: clues to their origin / A. Sharma, D.A. Isenberg, B. Diamond // J. Autoimmun. 2001. - V.l6. - P. 479-484.

201. Sharma, A. Studies of human polyclonal and monoclonal antibodies binding to lupus autoantigens and cross-reactive antigens / A. Sharma, D.A. Isenberg, B. Diamond // Rheumatology. 2003. - V.42. - P. 453-463.

202. Sherer, Y. Autoantibody explosion in systemic lupus erythematosus: more than 100 different antibodies found in SLE patients / Y. Sherer, A. Gorstein, M.J. Fritzler, Y. Shoenfeld // Semin. Arthritis Rheum. 2004. - V.34. - P. 501-537.

203. Shuster, A.M. DNA hydrolyzing autoantibodies / A.M. Shuster, G.V. Gololo-bov, O.A. Kvashuk et al. // Science. 1992. - V.256. - P. 665-667.

204. Sibille, P. Mimotopes of polyreactive anti-DNA antibodies identified using phage-display peptide libraries / P. Sibille, T.Ternynck, R Nato et al. // Eur. J. Immunol. 1997. - V.27. - P. 1221-1228.

205. Singh, S. Autoantibodies in cryptogenic fibrosing alveolitis / S. Singh, R. du Bois // Respir. Res. 2001. - V.2. - P. 61-63.

206. Smeenk, R.J.T. Dissociation studies of DNA/anti-DNA complexes in relation to anti-DNA avidity / R.J.T. Smeenk, A. Van Rooijen, T.J.G. Swaak // J. Immunol. Methods. 1988. - V.l09. - P. 27-35.

207. Stefanec, T. Endothelial apoptosis: the missing link between atherosclerosis and SLE? / T. Stefanec // Blood. 2004. - V.103. - №10. - P. 3608-3609.

208. Stevenson, J.D. Catalytic antibodies and other biomimetic catalysts / J.D. Stevenson, N.R. Thomas //Nat. Prod. Rep. 2000. - V.l7. - P. 535-577.

209. Stoll, M.L. Systemic lupus erythematosus messages from experimental models / M.L. Stoll, J. Gavalchin // Rheumatology. - 2000. - V.39. - P. 18-27.

210. Suchkov, S.V. A phenomenon of DNA-abzyme cross-reactivity and its significance for the mechanisms of cytoxicity and apoptosis / S.V. Suchkov, A.G. Gabi-bov, N. V. Gnuchev // Rus. J. Develop. Biol. 2001. - V.32. - №5. - P. 287-291.

211. Suenaga, R. Cationic and high affinity serum IgG anti-dsDNA antibodies inactive lupus nephritis / R. Suenaga, N.I. Abdou // Clin. Exp. Immunol. -1993. -V.94. №3. - R418-422.

212. Suwannaroj, S. Antioxidants suppress mortality in the female NZBxNZW F1 mouse model of systemic lupus erythematosus (SLE) / S. Suwannaroj, A. La-goo, D. Keisler, R.W. McMurray // Lupus. 2001. - V.10. - P. 258-265.

213. Suzuki, N. Possible pathogenic role of cationic anti-DNA autoantibodies in the development of nephritis in patients with systemic lupus erythematosus / N. Suzuki, T. Harada, Y. Mizushima, T. Sakane // J. Immunol. 1993. -V.151. - №2. - P. 1128-1136.

214. Swanson, P.C. Ligand recognition by murine anti-DNA autoantibodies. II. Genetic analysis and pathogenicity / P.C. Swanson, R.L. Yung, N.B. Blatt et al. // J. Clin. Invest. 1996. - V.97. - P. 1748-1760.

215. Tan, E.M. The 1982 revised criteria for the classification of systemic lupus erythematosus / E.M. Tan, A.S. Cohen, J.F. Fries et al. // Arthritis Rheum. -1982.-V.25.-P. 1271-1277.

216. The protein protocols handbook: second edition / ed. J.M. Walker. Totowa, New Jersey: Humana Press, 2002. - 1146 p.

217. Tramontano, A. Catalytic antibodies / A. Tramontano, K.D. Janda, R.A. Lerner // Science. 1986. - V.234. - P. 1566-1570.

218. Tsukumo, S.-i. DNasel in pathogenesis of systemic lupus erythematosus / S.-i. Tsukumo, K. Yasutomo // Clin. Immunol. 2004. - V 113. - P. 14-18.

219. Tsuzaka, K. Lupus autoantibodies to double-stranded DNA cross-react withribosomal protein SI / K. Tsuzaka, A.K. Leu, M.B. Frank et al. // J. Immunol. 1996a. - V.156. - №4. - P. 1668-1675.

220. Udenfriend, S. Ascorbic acid in aromatic hydroxylation. I. A model system for aromatic hydroxylation / S. Udenfriend, C.T. Clark, J. Axelrod, B.B. Brodie // J. Biol. Chem. 1954. - V.208. - P. 731-739.

221. Van Bruggen, M.C.J. Nucleosomes and histones are present in glomerular deposits in human lupus nephritis / M.C.J. Van Bruggen, C. Kramers, B. Walgreen et al. // Nephrol. Dial. Transplant. 1997. - V.12. - P. 57-66.

222. Vargas, M.T. Structural features of nephritogenic lupus autoantibodies / M.T. Vargas, K.G. Gustilo, D.M. D'Andrea et al. // Methods: A Companion to Methods in Enzymology. 1997. - V.l 1. - P. 62-69.

223. Villalta, D. Anti-dsDNA antibody avidity determination by a simple reliable ELISA method for SLE diagnosis and monitoring / D. Villalta, P.B. Romelli, C. Savina et al. // Lupus. 2003. - V.12. - P. 31-36.

224. Vlahakos, D. Murine monoclonal anti-DNA antibodies penetrate cells, bind to nuclei, and induce glomerular proliferation and proteinuria in vivo / D. Vlahakos, M.H. Foster, A.A. Ucci et al. // J. Am. Soc. Nephrol. 1992. - V.2. -P. 1345-1354.

225. Von Muhlen, C.A. Advances in autoantibodies in SLE / C.A. Von Muhlen, E.K.L. Chan, E. Angles-Cano et al. // Lupus. 1998. - V.7. - P. 507-514.

226. Wajed, J. Prevention of cardiovascular disease in systemic lupus erythematosus proposed guidelines for risk factor management / J. Wajed, Y. Ahmad,

227. P.N. Durrington, I.N. Bruce // Rheumatology. 2004. - V.43. - P. 7-12.

228. Wang, Y. Anti-DNA antibodies exhibit different binding motif preferences for single stranded or double stranded DNA / Y. Wang, J. Mi, X. Cao // Immunol. Lett. 2000. - V.73. - P. 29-34.

229. Waris, G. Immunogenicity of superoxide radical modified-DNA: studies on induced antibodies and SLE anti-DNA autoantibodies / G. Waris, K. Alam // Life Sciences. 2004. - V.75. - P. 2633-2642.

230. Waszczykowska, E. Estimation of SLE activity based on the serum level of chosen cytokines and superoxide radical generation / E. Waszczykowska, E. Robak, A. Wozniacka et al. // Med. Inflamm. 1999. - V.8. - P. 93-100.

231. Watanabe, N. Enhancement of hydroxyl radical DNA cleavage by serum anti-dsDNA antibodies in SLE / N. Watanabe, T. Kubota, N. Miyasaka, Y. Kanai // Lupus.- 1998.-V.7.-P. 108-112.

232. Witte, T. Association of IgA anti-dsDNA antibodies with vasculitis and disease activity in systemic lupus erythematosus / T. Witte, K. Hartung, T. Matthias et al. // Rheumatol. Int. 1998a. - V.18. - P. 63-69.

233. Witte, T. IgM anti-dsDNA antibodies in systemic lupus erythematosus: negative association with nephritis / T. Witte, K. Hartung, C. Sachse et al. //

234. Rheumatol. Int. 1998b. - V. 18. - P. 85-91.

235. Xavier. R.M. Antinuclear antibodies in healthy aging people: a prospective study / R.M. Xavier, Y. Yamauchi, M. Nakamura et al. // Mech. Ageing Dev. 1995.-V.78.-P. 145-154.

236. Yanase, K. Receptor-mediated cellular entry of nuclear localizing anti-DNA antibodies via myosin 1 / K. Yanase, R.M. Smith, A. Puccetti et al. // J. Clin. Invest. 1997. - V.100. -№1. - P. 25-31.

237. Yeh, T.-M. Deoxyribonuclease-inhibitory antibodies in systemic lupus erythematosus / T.-M. Yeh, H.-C. Chang, C.-C. Liang et al. // J. Biomed. Sci. -2003.-V.10.-P. 544-551.

238. Zeng, F-Q. Characterization of DNA antigens from immune complexes deposited in the skin of patients with systemic lupus erythematosus / F-Q. Zeng, R-F. Yin, G-Z. Tan et al. // Chin. Med. J. 2004. - V.117. - P. 1066-1071.

239. Zimmerman, R. Advances in the treatment of lupus nephritis / R. Zimmerman, J. Radhakrishnan, A. Valeri, G. Appel // Annu. Rev. Med. 2001. - V.52. - P. 63-78.

Информация о работе

Невзорова, Татьяна Александровна
кандидата биологических наук
Казань, 2005
ВАК 03.00.04

Диссертация

ДНК-гидролизующая активность антител к ДНК при системной красной волчанке - тема диссертации по биологии, скачайте бесплатно

Автореферат

Похожие работы